TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA TEMELJENA NA HIDROFILNIM ... · Razvoj ove kromatografske tehnike uvelike je potaknut istraživanjima u području biofarmaceutskih lijekova, proteomike

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Kemijski odsjek Poslijediplomski sveučilišni studij Kemija

Kemijski seminar I

TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA TEMELJENA NA HIDROFILNIM INTERAKCIJAMA

(HILIC)

Seminar na temelju članka: P. Jandera, P. Janás, Anal. Chim. Acta 967 (2017) 12-32

Dubravka Stražić

lipanj, 2017.

Tekućinska kromatografija temeljena na hidrofilnim interakcijama (HILIC)

Kemijski seminar I 2

Sadržaj

1. Uvod ................................................................................................................................. 3

2. Razvoj HILIC kromatografije ....................................................................................... 5

3. Mehanizam razdvajanja i utjecaj sastava pokretne faze ............................................ 7 3.1. Adsorpcija vode na nepokretnoj fazi .......................................................................................... 7 3.2. Utjecaj sastava pokretne faze na zadržavanje analita ............................................................ 10

3.2.1. Utjecaj udjela vode u pokretnoj fazi na mehanizam razdvajanja ...................................... 10 3.2.2. Organska otapala u sastavu pokretne faze ......................................................................... 11 3.2.3. Puferi u sastavu pokretne faze i utjecaj pH vrijednosti ...................................................... 12

4. HILIC nepokretne faze ................................................................................................ 15 4.1.1. Neutralne nepokretne faze .................................................................................................. 15 4.1.2. Nabijene nepokretne faze ................................................................................................... 18 4.1.3. Zwitterionske nepokretne faze ............................................................................................ 18

5. Zaključak ....................................................................................................................... 19

6. Literaturna vrela ........................................................................................................... 20



1. Uvod

Već unatrag nekoliko godina tekućinska kromatografija temeljena na hidrofilnim

interakcijama (engl. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) privlači

mnogo pozornosti jer daje rješenja za neka ranije neodgovorena pitanja kromatografskih

separacija, posebice u analizi polarnih molekula. Razvoj ove kromatografske tehnike uvelike

je potaknut istraživanjima u području biofarmaceutskih lijekova, proteomike i metabolomike,

u kojima ovakav kromatografski sustav vrlo lako nalazi svoju primjenu, posebice ukoliko se

radi u sprezi sa spektrometrijom masa [1-6].

U većini današnjih laboratorija kada je u pitanju tekućinska kromatografija visoke

djelotvornosti (engl. High Performance Liquid Chromatography, HPLC) dominira

kromatografija obrnutih faza (engl. Reversed Phase, RP). RP-HPLC karakterizira nepolarna

nepokretna faza, najčešće silikagel s kemijski vezanom fazom, te polarna pokretna faza,

obično sačinjena od jednog ili više organskih otapala te vode, odnosno pufera. Na ovakvom

kromatografskom sustavu zadržavanje analita je to jače što je nepokretna faza hidrofobnija,

odnosno što je udio organskog otapala u pokretnoj fazi manji. Drugim riječima, redoslijed

izlazaka analita s kolone u RP-HPLC-u je od hidrofilnijih ka hidrofobnijim spojevima.

Nasuprot tome, kromatografija normalnih faza (engl. Normal Phase, NP) je sustav u kojem je

nepokretna faza polarna, a pokretna nepolarna, pri čemu je redoslijed izlazaka analita s kolone

obrnut u odnosu na RP-HPLC. Iz tog razloga NP-HPLC nalazi svoju primjenu u situacijama u

kojima je zadržavanje analita na RP-HPLC sustavu nedovoljno. No, NP-HPLC često

uključuje primjenu otapala, kao što je npr. heksan, čija nemješljivost s vodom predstavlja

problem za analizu hidrofilnih molekula te je time ograničena upotreba NP-HPLC sustava u

praksi [1-6].

Kada je u pitanju kromatografija hidrofilnih molekula upravo se HILIC često puta

nameće kao najučinkovitije rješenje. HILIC sustav karakterizira polarna nepokretna faza koja

je obično silikagel na koji mogu biti vezne različite faze (npr. amino, amido, diol), dok je

pokretna faza smjesa organskog otapala (najčešće acetonitrila) te manje količine vode. Sve

veća popularnost HILIC tehnike u nazad nekoliko godina počiva prvenstveno na činjenici da

HILIC predstavlja ortogonalnu selektivnost kromatografiji obrnutih faza, zbog čega je i često

puta najbolja metoda odabira ukoliko se radi o analitima čije je zadržavanje u uvjetima RP-

HPLC nedovoljno. Osim toga, HILIC je učinkovit i u slučajevima kada se radi o analitima



koji su nedovoljno nabijeni da bi se postiglo učinkovito razdvajanje ionskom

kromatografijom. Slika 1.1. shematski prikazuje područje koje HILIC zahvaća u tekućinskoj

kromatografiji [1-6].

Slika 1.1. Područje tekućinske kromatografije koje zahvaća HILIC.



2. Razvoj HILIC kromatografije

Premda je još 1975. u analizi šećera i oligosaharida korištena tekućinska kromatografija koja

se temeljila na hidrofilnim interakcijama [7, 8], rane inačice HILIC-a bile su poprilično

ograničene u primjeni, budući da je uz tada korišteni detektor indeksa loma bilo moguće

izvoditi isključivo izokratno eluiranje. Termin engl. Hydrophilic Interaction Liquid

Chromatography po prvi puta upotrijebio je Alpert 1990. godine za opis kromatografije u

kojoj analiti interreagiraju s hidrofilnom nepokretnom fazom te su eluirani s relativno

hidfrofobnom binarnom smjesom u kojoj voda predstavlja najjači eluens [9]. Redoslijed

eluiranja u HILIC sustavu obrnut je u odnosu na kromatografiju obrnutih faza te bi se na

HILIC moglo gledati kao na varijantu kromatografije normalnih faza. No, budući da je

mehanizam razdvajanja u HILIC sustavu u mnogočemu drugačiji u usporedbi s

kromatografijom normalnih faza, akronim HILIC predložen je kako bi se ova tehnika

razlikovala od NP kromatografije, koja se uglavnom izvodi s organskim i s vodom

nemješljivim otapalima, za razliku od HILIC-a koji koristi otapala mješljiva s vodom te se

eluiranje postiže gradijentom udjela vode [4, 9].

Posljednjih dvadesetak godina HILIC se pokazala kao izuzetno dobra alternativa

kromatografiji obrnutih faza. Teoretski najjednostavniji pristup ka rješavanju kromatografske

separacije hidrofilnih i neutralnih molekula jest metoda koja uključuje polarnu nepokretnu

fazu obogaćenu polarnijom komponentom pokretne faze, dok je istovremeno pokretna faza

sastavljena od otapala čija svojstva su takva da je omogućena brza i linearna distribucija

analita između dviju faza. Pokazalo se da je takva tehnika upravo HILIC, u kojem se

pretpostavlja kako je zadržavanje analita rezultat njegove raspodjele između vodom

obogaćenog sloja na polarnoj nepokretnoj fazi te relativno hidrofobne pokretne faze u čijem

sastavu je najčešće 5 – 40% vode. Činjenica da HILIC koristi vodu kao najjači eluens

predstavlja prednost ove metode pred kromatografijom normalnih faza iz razloga što HILIC

pokretna faza ne uključuje upotrebu otapala u kojima su hidrofilni analiti slabo topljivi, kao

što je to čest slučaj u NP kromatografiji [4, 9].

Znatan porast broja publikacija na temu HILIC kromatografije bilježi se od 2003.

godine [4]. Sve veća potreba za analizom polarnih ljekovitih supstanci, metabolita te biološki

važnih spojeva, kao što su peptidi i proteini, donijela je sa sobom i sve širu upotrebu ove

kromatografske tehnike [10-12]. Također, sve češća potreba za spregom tekućinske



kromatografije i spektrometrije masa (engl. Mass Spectrometry, MS) daje prednost HILIC u

odnosu na neke druge kromatografske tehnike, budući da je sastav pokretne faze izrazito

pogodan za ionizaciju elektroraspršenjem (engl. Electrospray, ESI). Visok udio organskog

otapala, najčešće acetonitrila, omogućuje visoku osjetljivost prilikom analize. Isto tako, visoki

udio acetonitrila donosi i manju viskoznost pokretne faze, odnosno generira se niži tlak što

pak omogućuje korištenje kolona s manjim česticama punila i/ili bržu analizu. Ova prednost

HILIC-a dolazi do izražaja posebice u sustavima s česticama punila nepokretne faze manjima

od 3 μm. Prve HILIC UPLC (engl. Ultra High Performance Liquid Chromatography)

primjene uslijedile su nakon 2006. godine nakon što su postale dostupne HILIC kolone s

česticama punila manjima od 2 μm, najprije kao engl. fully porous particles, a kasnije i kao

engl. superficially porous particles [6, 13-15].



3. Mehanizam razdvajanja i utjecaj sastava pokretne faze

Zadržavanje molekula u HILIC sustavu rezultat je mnogobrojnih doprinos te je cjelokupni

mehanizam razdvajanja, koji se općenito smatra poprilično kompleksnim, još uvijek čest

predmet diskusije. Tradicionalno se smatra kako separacija proizlazi iz raspodjele molekula

između vodenog sloja nakupljenog na polarnoj nepokretnoj fazi i pokretne faze s viskom

udjelom organskog otapala, najčešće acetonitrila. Hidrofilniji analiti dulje se zadržavaju u

vodenom sloju na nepokretnoj fazi te se razdvajanje temelji na polarnosti analita i stupnju

solvatacije nepokretne faze. Različite funkcionalne grupe nepokretne faze mogu s analitima

stupiti u različite interakcije, što pak rezultira različitom selektivnošću. Ovisno o kakvoj

molekuli se radi, neutralnoj ili nabijenoj, ovdje važnu ulogu mogu odigrati različite

interakcije, u prvom redu vodikove veze. Također, na zadržavanje utjecaj mogu imati i

interakcije analita s ioniziranim silanolnim grupama silikagela [1-3].

Razdvajanje ovisi, osim o svojstvima nepokretne faze i analita, i o sastavu pokretne

faze jer su doprinosi različitih interakcija na cjelokupni mehanizam razdvajanja velikim

djelom uvjetovani upravo sastavom pokretne faze. Primjerice, u HILIC sustavima u kojima je

pokretna faza izrazito bogata acetonitrilom najsnažniji utjecaj na razdvajanje imaju polarne

interakcije, dok u sustavima s pokretom fazom s visokim udjelom vode dominantne

interakcije u mehanizmu razdvajanja jesu one hidrofobne [3, 16].

Premda obično manji, utjecaj na razdvajanje može imati i temperatura. Pri povišenoj

temperaturi smanjuje se viskoznost pokretne faze, difuzija analita je brža te konstanta

razdjeljenja i faktor zadržavanja mogu biti drugačiji u odnosu na kromatografiju provedenu

pri primjerice sobnoj temperaturi [1].

3.1. Adsorpcija vode na nepokretnoj fazi

Polarna otapala, u prvom redu voda, iz pokretne faze snažno su adsorbirana na polarnu

nepokretnu fazu. Još je Alpert u svom radu iz 1990. godine predložio kako su polarni pojevi

zadržani na koloni preko sloja bogatog vodom formiranog na površini polarne nepokretne

faze [9] te je od tada ova ideja u fokusu mnogih istraživanja koja imaju za cilj opisati

mehanizam zadržavanja u HILIC sustavu. Minimalno 2 − 3% vode potrebno je u sastavu

pokretne faze kako bi došlo do formiranja vodom bogatog sloja na površini nepokretne faze,



tzv. pseudo-nepokretne adsorbirane vodene faze [1, 6]. Za razliku od NP kromatografije u

kojoj također može doći do nakupljanja vodenog sloja na površini nepokretne faze, u HILIC

sustavu organsko otapalo u sastavu pokretne faze je polarno (npr. acetonitril, aceton,

metanol), odnosno mješljivo s vodom te nema strogih granica između vodenog sloja i

organskog otapala. Adsorpcija je to jača što je udio vode pokretnoj fazi manji. Koncentracija

vode smanjuje se odmicanjem od površine nepokretne faze ka pokretnoj fazi bogatoj

organskim otapalom (slika 3.1). Hidrofilniji analiti većim se dijelom nalaze u sloju koji sadrži

više vode te su time jače zadržani na koloni [1, 16].

Slika 3.1. Shematski prikaz sloja adsorbirane vode na površini polarne nepokretne faze uz pokretnu fazu bogatu organskim otapalom [2].

Udio vode adsorbirane na nepokretnu fazu može se opisati Langmuir modelom:

pri čemu je qi koncentracija adsorbirane vode, cm koncentracija vode u pokretnoj fazi, a a

konstanta distribucije vode u porama nepokretne faze između kolone i pokretne faze bogate

organskim otapalom. Plato adsorpcijskih izotermi koje su opisane gornjom jednadžbom daje

kapacitet kolone za adsorpciju vode, qs . Budući da granica adsorbiranog vodenog sloja ovisi

o sastavu pokretne faze te ju je teško točno utvrditi, količina adsorbirane vode može se opisati

kao postotak volumena pora nepokretne faze okupiranih vodom. Količina vode koja može biti

adsorbirana na kolonu ovisi uvelike o polarnosti i tipu kolone te među različitim kolonama

postoje i velike razlike u količini adsorbirane vode. Primjerice, kolona s vezanom nepolarnom



fazom kao što je dugi alkil lanac (YMC Carotenoid) te kolone Cogent Silica C te Cogent C18

Bidentate adsorbiraju malu količinu vode, u odnosu na polarne kolone (YMC Triart Diol

HILIC, ZIC HILIC, TSK gel amide 80) za koje se pokazalo kako imaju obično barem jedan

red veličine viši plato adsorpcijskih izotermi (slika 3.2) [1, 17].

Slika 3.2. Adsorpcijske izoterme vode adsorbirane na kolonama s različitim vezanim fazama. cs udio vode u porama nepokretne faze; cm udio vode u pokretnoj fazi [1, 17].



3.2. Utjecaj sastava pokretne faze na zadržavanje analita

3.2.1. Utjecaj udjela vode u pokretnoj fazi na mehanizam razdvajanja

U HILIC sustavima vrijeme zadržavanja analita na polarnim kolonama povećava se sa

smanjenjem udjela vode u pokretnoj fazi. Drugim riječima, zadržavanje molekula na koloni

obrnuto je proporcionalno polarnosti pokretne faze. Utjecaj sastava pokretne faze na

zadržavanje analita shematski je prikazan na slici 3.3. Povećanjem udjela vode, odnosno

smanjenjem udjela organskog otapala u pokretnoj fazi, smanjuje se razlika u polarnosti

pokretne faze i vodom bogatog sloja formiranog na polarnoj nepokretnoj fazi, čime dolazi do

eluiranja analita koji je pri manjoj količini vode bio snažno zadržan u adsorbiranom vodenom

sloju [4, 18].

Slika 3.3. Shematski prikaz utjecaja sastava pokretne faze na raspodjelu analita između pokretne faze i vodom bogatog sloja formiranog na površini nepokretne faze [18].

Utjecaj udjela vode na faktor zadržavanja, k, može se ponekad opisati sljedećim

jednadžbama:

log k = a1 – mHILIC x log φH2O (1)

log k = aʼ – mHILIC x φH2O (2)

pri čemu je φH2O volumni udio vode u pokretnoj fazi, a1 logaritam faktora zadržavanja analita

u vodi, a a’ logaritam faktora zadržavanja analita u organskom otapalu. Parametar mHILIC

predstavlja brzinu pada vremena zadržavanja s porastom sadržaja vode u pokretnoj fazi.

Općenito se smatra kako jednadžba (1) opisuje zadržavanje analita adsorpcijom na nepokretnu

fazu, dok jednadžba (2) karakterizira mehanizam razdjeljenja analita između pokretne faze i

vodom bogatog sloja na površini nepokretne faze. Graf ovisnosti log k o φH2O (linearna ili



logaritamska funkcija) trebao bi indicirati da li je dominantan mehanizam zadržavanja

adsorpcija ili razdjeljenje. Postoje eksperimentalni podaci koji odgovaraju samo jednoj od

ovih dviju jednadžbi, odnosno dokazuju ili adsorpciju ili razdjeljenje kao mehanizam

razdvajanja u HILIC sustavu. Međutim, u mnogim slučajevima pokazalo se kako niti jedna od

dviju jednadžbi ne odgovara eksperimentalnim podacima [1, 2, 19]. Najvjerojatnije je da

adsorpcija i razdjeljenje koegzistiraju u većini HILIC sustava, pri čemu doprinos pojedinog

mehanizma razdvajanja ovisi o više faktora, kao što su svojstva analita, naboj funkcionalne

grupe nepokretne faze te progam eluiranja. Trenutno prihvaćena jednadžba koja opisuje

razdvajanje u HILIC sustavu jest sljedeća:

ln k = a + b x ln φH2O – c x φH2O (3)

pri čemu parametri b i c opisuju doprinos mehanizma razdjeljenja, odnosno adsorpcije na

zadržavanje analita [1, 11]. U slučaju neutralnih analita, pokazalo se da uz pokretnu fazu koja

sadrži preko 75 − 80% acetonitrila (ovisno o stupnju solvatacije nepokretne faze) dolazi do

prelaska iz mehanizma razdjeljenja u adsorpcijski mehanizam razdvajanja. Pri ovako visokim

udjelima organskog otapala adsorpcija kao mehanizam zadržavanja ima značajan utjecaj

budući da je adsorbirani sloj vode tanak čime je moguća direktna interakcija analita s

nepokretnom fazom. Isto tako, u slučaju nabijenih molekula adsorpcija može biti dominantan

mehanizam zadržavanja čak i pri nižim količinama organskog otapala. Najvjerojatnije da do

prelaska iz adsorpcije u razdjeljenje dolazi u trenutku kada nepokretna faza biva zasićena

vodom [1, 4].

3.2.2. Organska otapala u sastavu pokretne faze

Općenito, HILIC kromatografija može se provoditi ili izokratno uz visoki udio organskog

otapala ili uz gradijentno eluiranje postupno povećavajući udio vode u pokretnoj fazi. Tipična

pokretna faza u HILIC sustavu uključuje 5 – 40% vode (odnosno pufera) te polarno organsko

otapalo mješljivo s vodom, najčešće acetonitril, uz koji se obično postiže najbolja

selektivnost. Teoretski moglo bi se koristiti bilo koje aprotično otapalo mješljivo s vodom.

No, druga otapala često puta rezultiraju nedovoljnim zadržavanjem analita ili širokim,

nesimetričnim pikovima. Mogu se koristiti i alkoholi, ali u tom je slučaju potrebna veća

količina otapala za postizanje zadržavanja ekvivalentnog onome kakvo se postiže uz

korištenje aprotičnih otapala [4, 9]. Uz metanol, a i druge alkohole male molekulske mase,



opaženo je kako značajan utjecaj na razdvajanje imaju vodikove veze. Također, ovakva

otapala natječu se s molekulama vode u adsorpciji na polarnoj nepokretnoj fazi, čime se sloj

adsorbirane vode smanjuje. Osim toga, acetonitril ne pokazuje proton-donorska svojstava,

odnosno razlika u prirodi otapala u odnosu na adsorbirani vodom bogati sloj je veća, nego što

je tu u slučaju npr. metanola. Teoretski je moguće vodu u potpunosti zamijeniti nekim drugim

otapalom te imati primjerice sustav metanol – acetonitril, no pokazalo se kako je u takvim

sustavima zadržavanje analita slabije. Općenito, u HILIC sustavima što je otapalo polarnije, to

je vrijeme zadržavanja kraće, ali jačinu otapala diktira isto tako i sposobnost da sudjeluje u

proton-donor/proton-akceptor interakcijama [1, 2, 20]. Relativna jakost eluiranja, odnosno

eluotropni niz može se u HILIC kormatografiji sumirati u sljedeće: aceton < acetonitril <

tetrahidrofuran < etanol < metanol < voda [3, 18].

3.2.3. Puferi u sastavu pokretne faze i utjecaj pH vrijednosti

Što se upotrebe pufera u HILIC sustavima tiče, općenito se preporuča provoditi eksperimente

uz prisutnost pufera kako bi se umanjio utjecaj elektrostatskih interakcija između nabijenih

analita i deprotoniranih silanolnih grupa na nepokretnoj fazi. U ovu svrhu mogu se koristiti

primjerice soli amonijev formijat ili amonijev acetat koje su dobro topljive u pokretnoj fazi s

visokim udjelom acetonitrila, uglavnom pokrivaju područje prikladno za većinu HILIC

aplikacija te su, zbog svoje lake hlapljivosti, ujedno prikladne i ukoliko se radi u sprezi sa

spektrometrijom masa [4].

Važnu ulogu u kromatografiji ima i pH vrijednost pokretne faze, odnosno pufera u

njezinom sastavu. Zbog visokog udjela organskog otapala u sastavu pokretne faze te mogućih

interakcija s funkcionalnom grupom nepokretne faze, utjecaj pH vrijednosti na zadržavanje

analita u HILIC sustavu teže je predvidjeti, nego što je to primjerice u slučaju RP

kromatografije. Općenito, nabijene molekule analita hidrofilnije su od neutralnih molekula

istog analita, odnosno jače su zadržane na HILIC koloni. Primjerice, vrijeme zadržavanja

acetilsalicilne kiseline na nederivatiziranom silikagelu, amido i sulfobetainskoj fazi mijenja

se s obzirom na pH vrijednost pokretne faze (slika 3.4a). Opaženo je kako se vrijeme

zadržavanja acetilsalicilne kiseline povećava s povećanjem pH vrijednosti pokretne faze od

3,3 do 4,8, nakon čega s daljnjim porastom pH do 6,5 nema značajnijeg produljenja vremena

zadržavanja. Acetilsalicilna kiselina ima pK vrijednost na oko 3,5, stoga je pri višem pH



deprotonirana, tj. negativno nabijena, što pak ima za posljedicu dulje zadržavanje na koloni

[5, 21].

Slika 3.4. Utjecaj pH vrijednosti pokretne faze na vrijeme zadržavanja. Pokretna faza acetonitril/voda = 90/10 (V/V), pufer 10 mM amonijev formijat. (a) acetilsalicilna kiselina na nederivatiziranom silikagelu, amido i sulfobetainskoj fazi; (b) acetilsalicilna kiselina i citozin na amino fazi [5, 21].

Valja ovdje svakako imati na umu i činjenicu kako postoji mogućnost elektrostatskog

odbijanja (npr. negativno nabijen analit s negativno nabijenom vezanom fazom), što bi pak

onda rezultiralo smanjenjem vremena zadržavanja. pH vrijednost pokretne faze može imati

značajan utjecaj na naboj analita, ali isto tako i na naboj vezane funkcionalne grupe na koloni.

Ovisno o naboju analita i vezane funkcionalne faze snažan utjecaj na zadržavanje analita

može imati elektrostatsko odbijanje istovrsnih naboja, koje rezultira skraćenjem vremena

zadržavanja, ili elektrostatsko privlačenje pozitivno i negativno nabijenih vrsta, koje onda pak

može imati za posljedicu produljenje vremena zadržavanja analita. Slika 3.4b prikazuje

promjenu vremena zadržavanja acetilsalicilne kiseline i citozina na amino fazi. Vrijeme



zadržavanja citozina lagano se smanjuje pomicanjem pH vrijednosti s 6,5 na 4,8, a značajno

pada pri pH nižem od 4,8. pK vrijednosti citozina su oko 4,6 i oko 12,2 te je pri pH manjem

od 4,6 citozin pozitivno nabijen, što znači da dolazi do elektrostatskog odbijanja s također

pozitivno nabijenom amino fazom, odnosno do skraćivanja vremena zadržavanja ispod pH

4.8. Što se tiče acetilsalicilne kiseline na amino fazi, vrijeme zadržavanja otprilike je

podjednako u pH području 4−6,5, no značajno pada ispod pH 4. S pK vrijednošću na oko 3,5

acetilsalicilna kiselina je u pH području 4−6,5 deprotonirana tj. negativno nabijena te dolazi

do elektrostatskog privlačena molekula acetilsalicilne kiseline i pozitivno nabijene amino

faze, što ima za posljedicu produljenje vremena zadržavanja. S približavanjem pH vrijednosti

pokretne faze ka pK vrijednosti acetilsalicilne kiseline povećava se udio protonirane kiseline

čime se smanjuje privlačenje s pozitivno nabijenom fazom, odnosno skraćuje se vrijeme

zadržavanja. Također, protonirana kiselina manje je hidrofilna u odnosu na depotoniranu

vrstu, što isto tako doprinosi skraćenju vremena zadržavanja [5, 21].



4. HILIC nepokretne faze

Čestice punila HILIC kolona najčešće se temelje na silikagelu, koji može biti ili

nederivatiziran ili s vezanim različitim funkcionalnim grupama. Vezane grupe mogu biti

primjerice diol, amino, amido, cijano, ciklodekstrini, ionski izmjenjivači, Zwitterioni,

polimerne strukture (derivati poli(sukcinimida)), saharidi, dipeptidi, itd. S obzirom na

karakteristike vezane faze razlikujemo neutralne, nabijene i Zwiter-ionske HILIC nepokretne

faze. Neki od čestih primjera funkcionalnih grupa u HILIC kolonama dani su u tablici 4.1 [1,

21].

Djelotvornost kolona povećava se sa smanjenjem promjera čestica. Slično kao u

RP kromatografiji, i na tržištu HILIC kolona dostupne su fully porous particles te core-shell

particles manje od 2 μm koje se koriste u UPLC sustavima. Core shell čestice potencijalno

donose veću djelotvornost u odnosu na kolone punjene fully porous česticama, budući da je

zbog čvrste jezgre core shell čestica put molekula analita kraći, odnosno manji je otpor

prijenosu mase [1, 15].

4.1.1. Neutralne nepokretne faze

Funkcionalne grupe neutralnih nepokretnih faza ostaju nenabijene u pH području tipičnom za

HILIC kromatografiju (pH 3−8). U ovu grupu spada većina današnjih kolona koje se koriste u

HILIC sustavima, a jedna od najrasprostranjenijih nepokretnih faza jest amidna. Također, u

ovu skupinu ubrajaju se i diol te cijano faza, no njihova upotreba je nešto rjeđa. Nedostatak

cijano grupe predstavlja činjenica da je nedovoljno hidrofilna, što često puta vodi u preslabo

zadržavanje većine polarnih analita. Diol faze obično sadrže 2,3-dihidroksipropil ligand te,

zahvaljujući više izraženom hidrofilnom karakteru i sposobnosti da tvore vodikove veze,

nešto češće nalaze svoju primjenu u HILIC sustavima. Amido, diol i cijano faze, premda same

neutralne, zbog deprotoniranja slobodnih silanolnih grupa mogu ipak na koloni nositi

negativan naboj pri pH većem od 4-5. Slobodne silanolne grupe bolje su zaštićene uz tzv.

cross-linked diol. U ovakvim fazama dioli su povezani preko eterskog linkera i tvore sloj

polimera na površini silike koji sadrži i oksietilenske i hidroksilne skupine. Cross-linked diol

faze stabilnije su u odnosu na klasične diol, budući da polimerni sloj štiti slobodne silanolne



Tablica 4.1. Nepokretne faze često korištene u HILIC sustavima [21].



Tablica 3.1. (Nastavak)

grupe te su ove faze potpuno neovisne o pH vrijednosti pokretne faze. S druge strane, cross-

linked diol faze manje su hidrofilne te su polarni analiti slabije zadržani na koloni u odnosu na

klasične diol faze [18, 21].



4.1.2. Nabijene nepokretne faze

Funkcionalne grupe nabijenih nepokretnih faza mogu, ovisno o pH vrijednosti pokretne faze,

biti nabijene ili neutralne te stoga razdvajanje nabijenih analita na ovakvim kolonama ovisi,

između ostalog, i o ionskoj izmjeni. Tipičan primjer ove skupine jest amino faza. Poliamino

faze često puta sadrže i sekundarne i tercijarne amine, a osim amino, primjer pozitivno

nabijenih faza su i imidazolska te triazolska faza. Poli(2-sufoetilaspartamid), poli(aspartatna

kiselina) i poli(2-sulfoetil) primjeri su negativno nabijenih faza. Doduše, primjena negativno

nabijenih faza mnogo je rjeđa u odnosu na one pozitivno nabijene [21].

Također, u ovu grupu može se ubrojiti i nederivatizirani silikagel sa silanolnim i

siloksansim skupinama budući da su pri pH većem od 4-5 silanolne skupine deprotonirane te

ionska izmjena može imati važnu ulogu u zadržavanju nabijenih analita. Razdvajanje se u tom

slučaju temelji na kationskoj izmjeni pri kojoj su pozitivno nabijeni bazični analiti jače

zadržani u odnosu na negativno nabijene analite koji su zbog elektrostatskog odbijanja znatno

slabije zadržani na koloni [18].

4.1.3. Zwitterionske nepokretne faze

Zwitterionske nepokretne faze predstavljaju najmlađu skupinu HILIC nepokretnih faza.

Pokazalo se kako ove faze snažno vežu vodu na svoju površinu te kako kao mehanizam

zadržavanja analita dominira razdjeljenje. Tipičan primjerak ove skupine jest sulfobetainska

faza (tzv. ZIC-HILIC). Pozitivno nabijen kvarterni amin te negativano nabijena sulfo grupa

nalaze se u omjeru 1:1, čime bi ukupan naboj na koloni trebao biti nula. No, budući da je

sulfo grupa više isturena prema van, odnosno više odmaknuta od površine čestice, ZIC-HILIC

kolone su zapravo negativno nabijene. Nasuprot tome su fosforilkolinske faze (tzv. ZIC-

cHILIC) koje, premda se radi o Zwitterionu, nose pozitivan naboj. Fosfatne grupe odgovorne

za negativan naboj vezane su na siliku, dok su kvarterni amini, nosioci pozitivnog naboja,

istureni prema van. Elektrostatske interakcije koje se mogu javiti na Zwitterionskim kolonama

slabije su u odnosu na interakcije na nabijenim nepokretnim fazama te molekule koje imaju

bilo pozitivan ili negativan naboj mogu biti zadržane na oba tipa Zwitterionskih kolona. Pri

tome uz sulfobetainsku fazu jače je zadržavanje bazičnih analita, dok je za kisele analite

zabilježeno jače zadržavanje na fosforilkolinskoj fazi [2, 22, 23].



5. Zaključak

U situacijama u kojima RP kromatografija ne polučuje zadovoljavajući rezultat kao sljedeća

metoda izbora nameće se HILIC, s kojim je moguće postići bolje zadržavanje polarnih i

nabijenih spojeva. Izbor pojedine komponente HILIC sustava ovisi o cilju analize te

karakteristikama analita. Razdvajanje u HILIC sustavu pod utjecajem je mnogobrojnih

faktora, među kojima izbor nepokretne faze nosi jednu od najznačajnijih uloga. Nadalje, izbor

pH vrijednosti i otapala za pokretnu fazu, kao i program eluiranja mogu imati značajan utjecaj

na ishod analize. Odabir pH vrijednosti mobilne faze od posebne je važnosti poglavito u

analizi nabijenih analita. HILIC je moguće lako kombinirati s različitim detektorima, a

posebnu prednost pred ostalim kromatografskim tehnikama ima kad je u pitanju sprega LC-

MS, budući da visoki udio organskog otapala u pokretnoj fazi donosi brzu evaporaciju otapala

tijekom ionizacije elektroraspšenjem. Također, zbog visokog udjela organskog otapala

generira se manji tlak, čime je omogućena brža analiza, odnosno analiza uz veći protok

pokretne faze ili pak upotreba kolona punjenih manjim česticama. HILIC najčešće svoju

primjenu nalazi u analizi malih polarnih molekula, kao što su nukleozidi, nukleotidi,

oligonukleotidi, amino kiseline, ali isto tako i u analizi proteina, peptida, oligosaharida,

glikana, itd.



6. Literaturna vrela

1. P. Jandera, P. Janás, Anal. Chim. Acta 967 (2017) 12-32

2. P. Jandera, Anal. Chim. Acta 692 (2011) 1-25

3. B. Buszewski, S. Noga, Anal. Bioanal. Chem. 402 ( 2012) 231-247

4. P. Hemström, K. Irgum, J. Sep. Sci. 29 (2006) 1784-1821

5. Y. Guo, S. Gaiki, J. Chromatogr. A 1074 (2005) 71-80

6. D. V. McCalley, J. Chromatogr. A 1171 (2007) 46-55

7. J. C. Linden, C. L. Lawhead, J. Chromatogr. 105 (1975) 125-133

8. J. K. Palmer, Anal. Lett. 8 (1975) 215-224

9. A. J. Alpert, J. Chromatogr. 499 (1990) 177-196

10. P. J. Boersma, S. Mohammed, A. J. R.. Heck, Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008) 151-

159

11. Q. Zhang, F. Yang, L. Ge, Y. Hu, Z. Xia, J. Sep. Sci. 40 (2017) 49-80

12. A. Periat, I. S. Krull, D. Guillarme, J. Sep. Sci. 38 (2015) 357-367

13. W. Naidong, J. Chromatogr. B 796 (2003) 209-224

14. W. Shou, Y. Chen, A. Eerkes, Y. Tang, et al., Rapid Comun. Mass Spectrom. 16

(2002) 1613-1621

15. L. Novakova, L. Havlikova, H. Vlčkova, Trends Anal. Chem. 63 (2014) 55-64

16. D. V. McCalley, U. D. Neue, J. Chromatogr. A 1192 (2008) 225-229

17. J. Soukup, P. Jandera, J. Chromatogr. A 1374 (2014) 102-111

18. G. Greco, T. Letzel, J. Chromatogr. Sci. 51 (2013) 684-693

19. H. Vlckova, K. Jezkova, K. Stetkova, H. Tomisikova, P. Solich, L. Novakova, J. Sep.

Sci. 00 (2014) 1-11

20. J. Soukup, P. Jandera, J. Sep. Sci. 36 (2013) 2753-2759

21. Y. Guo, S. Gaiki, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 5920-5938

22. G. Weber, N. von Wiren, H. Hayen, J. Sep. Sci. 31 (2008) 1615-1622

23. G. Greco, S. Grosse, T. Letzel, J. Chromatogr. A 1235 (2012) 60-67

Documents

TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA TEMELJENA NA HIDROFILNIM ... · Razvoj ove kromatografske tehnike uvelike je potaknut istraživanjima u području biofarmaceutskih lijekova, proteomike