TELOMERI, TELOMERASI E

SENESCENZA

Corso di laurea specialistica in Biotecnologie molecolari Anno Accademico 2005

Stefania Graziano

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CENNI STORIOGRAFICI Nel 1961 Hayflick pubblic un lavoro nel quale riportava che fibroblasti umani in coltura smettevano di proliferare dopo circa 50 divisioni, tutte le cellule perdevano la capacit proliferativi dopo un uniforme e fissato numero di duplicazione, questa soglia stata chiamata Hayflick limit e assume che ogni tipo di cellula ha un limite del potenziale replicativi che intrinsecamente fissato.

Fig.1 Hayflick limit Nel 1980 Rohn pubblic un articolo indicando la correlazione diretta tra la durata della vita di una specie e lHayflick limit proprio delle cellule di quella specie, e la correlazione inversa tra let del donatore e il potenziale replicativi delle sue cellule. Inoltre si sono trasfettati fibroblasti umani con la subunit catalitica della telomerasi, che impedisce laccorciamento dei telomeri durante la replicazione, e si sono analizzate le caratteristiche di questi fibroblasti hTERT+ paragonandole con quelle di normali fibroblasti umani hTERT-.

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Entrambe le popolazioni di fibroblasti presentavano le stesse caratteristiche, in apparenza sembrava non esserci nessuna sostanziale differenza, ma i fibroblasti hTERT+ avevano un potenziale replicativi di gran lungo maggiore rispetto a quelli hTERT-..

Fig.2 e 3: Propriet di cellule normali paragonate con quelle delle cellule

esprimenti h-TERT.

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Il fatto che ogni telomero si accorci ad ogni divisione cellulare e che in presenza della telomerasi, che blocca tale accorciamento, le cellule diventino quasi immortali, ha suggerito che lunghezza del telomero agisca come orologio mitotico responsabile della limitata durata della vita della nostra e delle altre specie. Questa teoria dellorologio mitotico ha portato ad un periodo di grandeuforia, in quanto si pensava che se i telomeri fossero responsabili dellinvecchiamento, bloccando il loro accorciamento si sarebbe raggiunta limmortalit. Per questo motivo ci si subito buttati a studiare tutte quelle malattie che presentano come fenotipo una senilit precoce, come ad esempio la sindrome di Werner (le persone affette da questa patologia non raggiungono i quarantanni, a ventanni mostrano le caratteristiche di sessantenni). In realt si scoperto che tale patologia non imputabile ad un accorciamento precoce o pi veloce dei telomeri, ma ad una mutazione su un gene codificante una elicasi. Inoltre si sono riscontrate troppe eccezioni dellHayflick limit e da ulteriori esperimenti emerso che spesso due diverse popolazioni clonali, derivate da una singola divisione mitotica, mostravano diverso potenziale replicativi. Il modello proposto , quindi, pi complesso e articolato di quello che si credeva prima. Si parla quindi di REPLICATIVE SENESCENCE e si ha quando una normale cellula si divisa un certo numero di volte (questo numero varia a seconda del tipo di cellula e dalle condizioni esterne), i telomeri diventano cos corti che promuovono la stato di non divisione, la cellula permanentemente bloccata nella fase G1. Lo stato di replicative senescence porta a consistenti cambiamenti nellespressione genica e questo pattern di disregolazione dellespressione genica cellula-tipo specifico. Questirreversibile stato di non crescita continua per lunghi periodi senza che ci siano segni di morte cellulare, anzi la cellula in questo stato produce alti livelli di -galattosidasi e aumenta la produzione di metallo proteasi.

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COSE INDUCE LO STATO DI REPLICATIVE SENESCENCE?

Telomere Position Effect (TPE): questo primo modello combina laccorciamento dei telomeri e i cambiamenti nellespressione genica. I geni vicini ai telomeri potrebbero essere silenziati a causa della cromatina molto condensata vicino ai telomeri. Con linvecchiare della cellula e il progressivo accorciamento dei telomeri si ha una sorta di derepressione dei geni in prossimit dei telomeri che potrebbe portare ad una loro riattivazione. Questo apre furti approfondimenti di studio per riuscire ad identificare tali geni.

Fig.4 Schema per spiegare il modello Telomere Position effect .

Intrinsic senescence: i telomeri troppo corti sono riconosciuti come una rottura del DNA e ci porta alla formazione di foci contenenti H2AX (una variante foaforilata dellH2A), e al fenotipo senescente. Questo tipo di senescenza intrinseca e inevitabile.

Extrinsic senescence: si ha quando la senescenza indotta da fattori esterni quali stimoli oncogeni (Ras, E2F), danni al DNA (raggi-X, H2O2); per questo motivo spesso viene anche chiamata senescenza prematura.Dimostrata in cellule che subivano il processo di senescenza nonostante avessero telomerasi attiva e potenziale proliferativi.

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Fig.5 Senescenza Intrinseca e Estrinseca

Fig.6 Senescenza Replicativi e prematura

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Sebbene diversi stimoli possano indurre come risposta la senescenza, appaiono tutti convergere su uno (o entrambi) i due pathways che innescano e mantengano tale stato di non divisione:

1. p53 che un mediatore cruciale per la risposta ai danni del DNA

2. pRb che un tumor-suppressor. La down-regolazione dellespressione di questi due geni con metodi antisenso ha come conseguenza laumento della durata della vita delle cellule, la successiva reintroduzione del gene nella cellula causa il blocco della duplicazione e cambiamenti morfologici simili a quelli delle cellule mescenti. Bmi-1 un repressore trascrizionale che funziona come inibitore del programma di senescenza, la sua espressione down-regolata durante la senescenza. Agisce sul pathway di pRb reprimendo lespressione di p16; recentemente si dimostrato il suo coinvolgimento nel mantenimento del pool delle cellule staminali ematopoietiche inibendo il loro programma di senescenza.

Fig.7 Induzione della senescenza da parte di p53 (a) e da parte di pRb (b).

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Fig.8 Induzione della senescenza dovuta dai pathways di p53 e di pRb.

Laccumularsi di cellule senescenti che non si dividono in un tessuto, potrebbe compromettere il rinnovo del tessuto e la sua riparazione. Inoltre molte dei geni up-regolati durante la senescenza codificano per proteine secrete che possono alterare il microambiente circostante, modificandone cos la funzione e la struttura. I fattori secreti da cellule senescenti variano a seconda del tipo di cellule, ad esempio i fibroblasti secernono alti livelli di metalloproteasi, EGF e citochine infiammatorie, come se fossero sempre attivati dal pathway di riparazione delle ferite. Cellule senescenti possono, quindi, contribuire allinvecchiamento dellorganismo e alle patologie correlate allet stimolando il rimodellamento tissutale. Un'altra conseguenza, speculativa e potenzialmente rilevante, dellaccumularsi delle cellule senescenti il loro impatto sulle cellule staminali(o comunque sui precursori cellulari)e sulle loro nicchie. Tale accumulo potrebbe esaurire i tessuti dei pools delle cellule staminali, o delle cellule progenitrici, e distruggere il loro microambiente, alterandone la proliferazione, la differenziazione e la mobilizzazione.

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Fig.9 Connessione tra senescenza Cellulare e invecchiamento.

Una delle maggiori necessit di un ricercatore quella davere cellule che vivano il pi a lungo possibile, sia per esigenze economiche, sia per poter condurre gli esperimenti in modo ottimale. Per questo motivo le cellule vengono immortalizzate con diversi protocolli, finora i pi usati prevedono lutilizzo di geni virali EBV o HPV, di SV40 o di adenovirus. In tal modo le cellule divengono s immortali, ma anche geneticamente instabili e perdono alcune propriet fondamentali. Il paragone tra cosa avviene in vitro e cosa in vivo non cos affidabile e preciso. Con lapprofondimento delle conoscenze sulla telomerasi e sul suo ruolo nellimpedire laccorciamento dei telomeri e la senescenza o lapoptosi, si diffuso il metodo di immortalizzare le cellule in coltura con la trasfezione di hTERT(la subunit catalitica della telomerasi). In tal modo le cellule non diventano geneticamente instabili e il parallelismo in vitro-in vivo affidabile.

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Il solo mantenimento della telomerasi non , per, sufficiente per immortalizzare le cellule. Limmortalizzazione della colture necessita di due steps.

Bisogna innanzitutto raggiungere e superare la fase di senescenza, chiamata anche M1(mortality stage 1), e si ottiene usando oncogeni virali che inattivino i regolatori del ciclo cellulare, p53 e pRb

Le cellule che evitano la senescenza vanno in seguito incontro alla crisi in quanto i loro telomeri sono troppo corti, questa fase chiamata M2(mortality stage 2), per superarla si usano meccanismi che mantengono lunghi i telomeri, si usa lespressione ectopica di hTERT. In questo secondo step comunque ancora richiesta lespressione degli oncogeni virali per continuare la proliferazione.

Fig.10 e 11 Steps Immortalizzare

Le cellule e Superare la due

Fasi M1 e M2.

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Usando questo metodo si ottenuta limmortalizzazione di molte linee cellulari, tra cui fibroblasti e cellule epatiche. In alternativa a volte si anche usata una up-regolazione di Bmi-1 per inibire la senescenza. Recentemente si riusciti a trasfettare linee cellulari con un costrutto composto da hTERT tra due siti LoxP, in tal modo si pu ottenere unimmortalizzazione reversibile, quando la cellula deve essere riportata ad una normale attivit e ad un normale corso di vita, si usa una ricombinasi che taglia via hTERT, i telomeri riprenderanno ad accorciarsi nelle successive duplicazioni. Questo apre prospettive per il futuro molto interessanti soprattutto per le terapie cliniche, si pu immortalizare un pool di cellule in coltura e quando poi devono essere trapiantate in un paziente si fa in modo che ritornino mortali.

Fig.12 Immortalizzazione reversibile.

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