Tema 14 intro genet

Tema 14. Principios de Genética Bacteriana. Variaciones Bacterianas. Mutaciones.

Tema 15. Recombinación.

Tema 16. Transferencia de material genético en bacterias: Transformación. Conjugación. Transducción.

Tema 17. Ingeniería genética. Técnicas y Aplicaciones.

BLOQUE III. MICROORGANISMOS PROCARIOTICOS

III.C. GENÉTICA BACTERIANA

1. Bases moleculares de la genética.1.1. Conceptos. 1.2. Funciones del ADN.1.3. Variaciones bacterianas.

2. Mutaciones. 2.1. Concepto. 2.2. Efectos fenotípicos2.3. Tipos de mutaciones a nivel molecular. . 2.4. Mutaciones inducidas: agentes mutagénicos. 2.5. Reversibilidad de la mutación2.6. Sistemas de reparación de daños del ADN. 2.7.Métodos de detección de mutantes.

Tema 14. Principios de Genética Bacteriana.

CONCEPTOS•Genética

Estudio de la herencia y variación entre los microorganismos

segmento de DNA RNAm(transcripción) (traducción)

Cadena polipeptídica

lugar del genoma donde reside o se localiza un gen

•Gen

•Locus

• AleloCada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen

“forma” (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su hábitat natural o estirpes silvestres.

• Alelo silvestre

distintas “formas” o secuencias que resultan de mutaciones del alelo silvestre.

• Alelo mutante

• GenotipoInformación genética contenida en un organismo.

• Fenotipo Forma en que se expresa el genotipo o el conjunto de caracteres detectables.

Material genético (nucleoide)

Nucleoide = cromosoma + elementos extracromosómicos

Modelo clásico de Watson y Crick

ADNccc

Composición química, estructura y organización del nucleoide

- 1 solo cromosoma(ADN c.c.c.)

a) Plásmidos (ADNccc)b) Elementos transponibles

Composición química, estructura y organización del nucleoide

Material cromosómico Material extracromosómico

Excepciones:Borrelia y Streptomyces: cromosoma linealAgrobacterium tumefaciens: 1 circular y 1 lineal

1. Resistencia a antibióticos (plásmidos R). 2. Resistencia a metales pesados (Ej, mercurio). 3. Plásmidos de virulencia: producción de toxinas, factores de penetración en tejidos,

adherencia a tejidos del hospedador, etc., 4. Producción de bacteriocinas5. Producción de sideróforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+). 6. Utilización de determinados azúcares.7. Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos cíclicos recalcitrantes (degradación de

tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas. 8. Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens).9. Interacciones simbióticas y fijación de N2 en Rhizobium

Funciones de los plásmidos

Elementos genéticos extracromosómicoscon capacidad de replicación autónoma

a) Plásmidos

b) Elementos genéticos transponiblesEntidades genéticas insertadas en el cromosoma o en plásmidos y que poseen la habilidad de transponerse (saltar) a nuevos sitios de ese cromosoma o plásmido.

Secuencia de inserción (IS)

Transposón (Tn)




Replicación del cromosoma bacteriano

Semiconservativo y bidireccional

1.- MANTENIMIENTO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICAFUNCIONES DEL ADN

Modelo de replicación en theta (θ)

Origen de la replicación Bidireccional

2.- EXPRESIÓN GÉNICA

GEN RNAm(transcripción) (traducción)

Cadena polipeptídica

a) Transcripción

b) Traducción

c) Regulación génica

Etapas:

FUNCIONES DEL ADN

c) Regulación génica

Genes estructuralesGenes reguladores

Operón de expresión constitutivaOperón de expresión regulada

-inducible-reprimible-ADN polimerasas, ARN polimerasas

-proteínas cadena transporte electrones-proteínas ribosómicas

Condiciones ambientales

- Operón = unidad completa de expresión génica

Operón de expresión inducible Producción de β-galactosidasa

Operón de expresión reprimible




CONCEPTO:

cambios en el fenotipo, o genotipo de una población bacteriana

hereditarias No hereditarias

Variaciones bacterianas

1. Por adaptación al medio: regulación de la expresión génica

2. Asociadas a cambios en el genotipo:

Tipos de variaciones bacterianas

1. Por adaptación al medio: regulación de la expresión génica

2. Asociadas a cambios en el genotipo:

- sin transferencia de material genético: mutaciones

- asociadas al intercambio de material genético:

Transformación

Transducción

Conjugación

Tipos de variaciones bacterianas




Mutación

Alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un gen.

Cambio en el genotipo estable y heredable

(del latín mutare, cambiar)




TIPOS DE MUTACIONES SEGÚN SU EFECTO FENOTÍPICO

no hay efecto fenotípico

SilenciosasLetales

alteración del fenotipo silvestre

No letalesCondicionalmente letales

Cambios morfológicosRequerimientos nutritivosResistencia a antibióticos y bacteriófagos




TIPOS DE MUTACIONES A NIVEL MOLECULAR

a) Mutaciones espontáneas

resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio natural.

b) Mutaciones inducidas

aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos

Frecuencia: 10-10 y 10-5

Errores en replicación, reparación o recombinación del ADN

Demostración de la espontaneidad de las mutaciones bacterianas

Las mutaciones son espontáneas, surgen al azar e independientemente de las condiciones ambientales

¿Se produce mutación como consecuencia de la exposición al antibiótico?

¿Mutaciones espontáneas, al azar?las células son resistentes antes de la exposiciónAdaptación ambiental

¿?

Antiguamente:Las adaptaciones ambientales se podían transmitir a la descendencia

Ej. resistencia en medio con antibióticos

PRUEBA DE FLUCTUACIÓN (LURIA Y DELBRÜCK, 1943)

Fago T1 infecta y mata a la mayoría de las células

Cultivo bacterias+

fagos

¿Mutación al azar?TonS TonR

¿Adaptación fisiológica en presencia del fago?


¿Mutación al azar?TonS TonR

¿Adaptación fisiológica en presencia del fago?

- Suceso poco frecuente

- Si se producía: -al principio del crecimiento ↑ TonR

-al final del crecimiento ↓ TonR

Muchos cultivos pequeños darían VARIABILIDAD en el número bacterias resistentes

Muchos cultivos pequeños darían POCA VARIABILIDADen el número bacterias resistentes

Constante


0,2 mlcultivo bacterias

103

0,2 mlcultivo bacterias

109

g x 20

X 20

capa de fagosNúmero de bacterias resistentes

103

g x 20 10 alícuotas de 0,2 mlcultivo bacterias

capa de fagos+

Número de bacterias resistentes

Control

Mutación al azar = gran variabilidadAdaptación = Nº resistentes igual


Max Delbrück

Salvadore E. Luria


Max Delbrück

Salvadore E. Luria

Carácter preadaptativo de la mutación

El fago T1 selecciona a las bacterias resistentesNO INDUCE SU APARICIÓN

¿ Es posible demostrar la existencia previa de los mutantes resistentes antes de introducir el agente selectivo?

Experimento de la Placa Replicada(Lederberg y Lederberg 1952)

El fago T1 selecciona a las bacterias resistentesNO INDUCE SU APARICIÓN

TIPOS DE MUTACIONES A NIVEL MOLECULAR


resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio natural.

Frecuencia: 10-10 y 10-5

Errores en replicación, reparación o recombinación del ADN

TransicionesPu:Py x Pu:Py (A:T por G:C)

TransversionesPu:Py x Py:Pu

(A:T por T:A ó G:C por C:G)SilvestreSilenciosaSin sentidoSentido

erróneo

1.- Mutaciones puntuales

Sustituciones de pares de bases


2.- Mutaciones por desplazamiento de la pauta de lectura

Por pérdida o ganancia de un pequeño número de nucleótidos

Deslizamieno en la cadena nueva

Deslizamiento que conduce a una adición Deslizamiento que conduce a una deleción

Deslizamiento en la cadena parental

3.- Grandes delecciones o borraduras- Eliminación de gran número de nucleótidos

bucles intracatenarios

delección

Mutación irreversible e inactivadora de uno o varios genes

Mutación pleiotrópica

4.- Mutaciones insercionalesOcasionadas por elementos genéticos transponibles

Secuencias de inserción (IS) Transposones (Tn)

NO HAY TRANSCRIPCION

Tienen regiones terminales idénticas y repetidas: promotor y terminador

NO HAY TRANSCRIPCIÓN

SI HAY TRANSCRIPCIÓN

Resultado: inactivación del gen debida a desplazamientos de la pauta de lectura

Mutantes resistentes a kanamicina

Duplicaciones en Tandem

5.- Otras mutaciones espontáneas

Reordenamientos causados por errores en la recombinación

Inversiones Translocaciones

a b

Giros de 180º Movimiento a zona diferente a

a

a b

Copia a continuación

a b a b

b ab

b

b




-AGENTES FÍSICOS *CALOR*RADIACIONES

-AGENTES QUÍMICOS

*Análogos de bases

*Agentes desaminantes o hidroxilantes

*Agentes alquilantes

*Agentes intercalantes

Agentes mutagénicos

Mutaciones inducidas

Efecto de las radiaciones

Mayor energía

Altamente mutagénicas

a) Radiaciones no ionizantes

a) Radiaciones ionizantes

a) Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta Letal o mutagénica según dosis

• ADN formación de dímeros de pirimidinas T=T, C-C, T-C impiden la correcta replicación y transcripción del ADN

rayos X y rayos gamma

b) Radiaciones ionizantes

Letales

-Efecto directo: roturas y entrecruzamiento sobre el ADN no reparables

-Efecto indirecto debido a la ionización del agua

H20 H+ + OH-

ADN roturas muerte

Reacciones de autooxidación

02

·H+ O2 ·HO22 ·HO2 H2O2 + O2

Epóxidosperóxidos Efectos letales

corta longitud de onda y elevada energía

-AGENTES FÍSICOS *CALOR*RADIACIONES

-AGENTES QUÍMICOS

*Análogos de bases

*Agentes desaminantes o hidroxilantes

*Agentes alquilantes

*Agentes intercalantes

Agentes mutagénicos

Mutaciones inducidas

1. Análogos de bases

2-aminopurina

5-bromouracilo

Se incorporan durante la replicación del ADN

T:A G:Ctransición

2. Agentes desaminantes o hidroxilantes

- Ácido nitroso

Desaminación oxidativa de adenina y citosina

Adenina hipoxantinaA:T hipoxantina: C (transición)

- HidroxilaminaAñade un grupo hidroxilo al grupo amino de citosina

3. Agentes alquilantes

•Etil etano sulfonato (EES)

•Etil metano sulfonato (EMS)

•Nitrosoguanidina (NTG)

Introducen radicales alquílicos en las cadenas de ADN

C-G

G-(metilada)T-A

4. Agentes intercalantesSe introducen entre las pares de bases del ADN

pérdida o ganancia de nucleótidos

5. Agentes que bloquean totalmente el emparejamiento de bases

Benzo-α-pireno

Modifican purinas grandes lesiones ADN inducen sistema SOS

- Naranja de Acridina- Bromuro de etidio- Derivados de la flavina




2.5. Reversibilidad de las mutaciones bacterianas(excepto las grandes delecciones o borraduras)

Segunda mutaciónRestauración del fenotipo original

Restauración del Genotipo original

REVERSIÓN SUPRESIÓN

Restauración del Genotipo original

Bacteria con 2 mutaciones




Errores en la replicaciónAcción de mutágenos

Mutaciones

Reparación

1.Mecanismos prerreplicativos:-Reparación fotoenzimática o fotorreactivación-Reparación por escisión y resíntesis

2.Mecanismos posreplicativos:-Reparación por recombinación-Reparación inducible de emergencia (SOS)

Enzimas que comprueban la lectura

Reparación de fotoproductos (luz uv)

2.6. Sistemas de reparación de daños

1. Mecanismos prerreplicativos:

a) Reparación fotoenzimática o fotorreactivación

Fotoliasa: separa dímeros de timinaLuz UV

Dímero de Timina

Fotoliasa

Luz Visible

1. Mecanismos prerreplicativos:

Endonucleasa uvrABC: elimina bases dañadas

ADN polimerasa I: rellena el hueco

Ligasa

+

+

b) Reparación por escisión y resíntesis

Daño UV

Formación deldímero T-T

2. Mecanismos posreplicativos:

a) Reparación por recombinación

4

5

- Repara ADN que no tiene cadena molde

- Proteína recA: intercambia un fragmento del ADN molde similar

2. Mecanismos posreplicativos:

Daño intenso Parada en la síntesis ADN

SOSProteína recA

- Intercambio de cadenas- Destruye a la proteína represora lexA

b) Reparación inducible de emergencia (SOS)




2.7. Métodos de detección de mutantes

Método en placa

Mutantes resistentes a antimicrobianos, metales pesados, etc

Cultivo microorganismo Medio con agente mutagénico

Técnica de gradiente en placa

Método réplica en placaMutantes auxotrofos

Mutantes auxotrofos

Las bacterias como indicadores de sustancias mutagénicas y potencialmente carcinogénicas.

Bruce Ames, 1970

Establece el número de mutantes revertidos de una bacteria auxotrofa en presencia y

ausencia del agente mutagénico

Bacterias indicadoras: poseen mutaciones puntuales

2.8. Test de Ames

Test de AmesSalmonella typhimurium his(-)

Medios sin histidina

Agente mutagénico

Agente mutagénico = Nº mutantes revertidos en presencia del agente debe ser doble al del que existiría en ausencia del mismo

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