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1
Estructura y organización del h
Genética Médica – Tema 2
genoma humano: genes, familias génicas y
polimorfismos del DNABibliografía:
Inma Martín Burriel Genética Médica. Tema 2Curso 2009-10 Estructura y organización del genoma
Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp376-378Tamarin RH (1996) pp203-220, pp414-419Klug WS y Cummings MR (1999) pp277-298, pp528-539
Tema 2
• Estructura y organización del Genoma• Polimorfismos genéticos:
– Variaciones en el número de repeticiones– Mutaciones puntuales
• Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicinagenéticos en Medicina
2
Estructura en doble hélice del DNA:
10pb /vueltaDestrógiraBases apiladas perpendicularmente
Genoma
DNA eucariótico
Genes funcionales DNA de secuencia DNA separadorde copia única repetida DNA separador
Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida
Secuencias funcionalesNo codificantes
Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
Familias de genes en tándem
Repeticiones heterocromatinaDel centrómero
VNTR
Secuencias derivadasDe transposiciones
Familias de genes en tándemTransposones
Retrotransposones
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DNA eucariótico
Genes funcionales DNA de secuencia DNA separador
Genoma
de copia única repetida DNA separador
Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida
Secuencias funcionalesNo codificantes
Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
Familias de genes en tándem
Repeticiones heterocromatinaDel centrómero
VNTR
Secuencias derivadasDe transposiciones
Familias de genes en tándemTransposones
Retrotransposones
Genes de copia únicaInicio transcripción
FintranscripciónIntrón 1 Intrón 2 Intrón 3
Gen eucariota
Unidad de transcripción
Región reguladoraaguas arriba
Promotor
5’UTR
Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4
Región reguladorainterna
Región reguladoraaguas abajo
• Codifican para una única proteínaCodifican para una única proteína• Se encuentran en una única posición del
genoma (un individuo 2 copias)
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DNA eucariótico
Genes funcionales DNA de secuencia DNA separador
Genoma
de copia única repetida DNA separador
Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida
Secuencias funcionalesNo codificantes
Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
Familias de genes en tándem
Repeticiones heterocromatinaDel centrómero
VNTR
Secuencias derivadasDe transposiciones
Familias de genes en tándemTransposones
Retrotransposones
• Familia génica:– “grupo de genes de un genoma que derivan
d t ú ”
Familias génicas
de un ancestro común”
Familia de las globinas (beta globina):5 loci en HSA11Orden según la expresión en el desarrolloPosición y longitud de intrones similarEvolución concertada
5
–Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades:• Organizador Nucleolar (NO):
Familias de genes en tándem
g ( )– Localizado en los brazos cortos de cromosomas
acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque pueden traslocarse
– Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S + 28S)
• Genes del RNAt:– 50 sitios cromosómicos– 10 a 100 copias/sitio
• Genes de las Histonas–Se mantiene la identidad de secuencia
6
Familia de genes dispersos
• Familias de genes dispersos:– Actinas: de 5 a 30 genes– Queratinas: + de 20Queratinas: + de 20– Cadena pesada de la Miosina: 5-10– Tubulinas: 3-15– Globinas: hasta 5– Región variable de las inmunoglobulinas: 500– Histonas: 100-1000
• Las secuencias entre genes pueden variaró• Genes homólogos pueden tener funciones
diferentes• Algunos pierden la función pseudogenes
Genoma
DNA eucariótico
Genes funcionales de copia única
DNA de secuencia repetida DNA separadorde copia única repetida
Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida
Secuencias funcionalesNo codificantes
Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
Familias de genes en tándem
Repeticiones heterocromatinaDel centrómero
VNTR
Secuencias derivadasDe transposiciones
TTransposones
Retrotransposones
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DNA repetido
Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem
¿DNA basura?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Mecanismo de reparación?- ¿Puntos de recombinación?
Variación en el número de repeticiones
Entrecruzamiento desigual Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación
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DNA repetido en tándem
• DNA satélite:– repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y
algunas Mb)– DNA no transcrito
Regiones de heterocromatina principalmente en – Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide)
Modelos de organización centromérica
DNA repetido en tándem
• DNA minisatélite (VNTR)– Repeticiones de tamaño moderado (60pb)– Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros– Normalmente no se transcriben– Tipos:
• DNA minisatélite hipervariable• DNA telomérico
F ió DNA t l é iFunción DNA telomérico:Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma
9
• DNA microsatélite (STR):– Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente <
150pb) de repeticiones en tándem de
DNA repetido en tándem
150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)
– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)
– Herencia mendeliana codominante
CA CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA
Alelo 1
Alelo 2
VNTR Tamaño (Kb)
Unidad repetición
Método detección
DNA repetido en tándem
Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados
Minisatélites(VNTR)
0,1-20 20-40 pb Elec. agarosa
Microsatélites(STR)
pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación
10
VNTR Tamaño (Kb)
Unidad repetición
Método detección
DNA repetido en tándem
Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados
Minisatélites(VNTR)
0,1-20 20-40 pb14-100 pb
Elec. agarosa
Microsatélites(STR)
pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación
Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población
Polimorfismos
• Polimorfismo genético:– Cuando un locus presenta al menos 2 alelos
y la frecuencia alélica del más raro es > 5% locus polimórfico.
– El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones
bi t l bi t dambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad.
11
DNA minisatélite hipervariable
• Localización dispersa en todos los cromosomas entre 0 1-20 kb de longitud cromosomas, entre 0,1 20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas
• Secuencia repetida común (core):GGGCAGGAXG
• Son muy polimórficas• Se encuentran principalmente en intronesSe encuentran principalmente en intrones• Estas secuencias se han empleado como
“huellas dactilares”
DNA minisatélite hipervariable
Detección del polimorfismo: Digestión del DNA con enzimas de restricción + Southern (hibridación con sonda)
12
4 5
7
9 10 11
8
6
INDIVIDUO 2
1
4
1
32
3 3’
32
1
32
4
1
32
4
3’3
2
4
1
3
1 1’
1
32
1
1
32
4
1’
1
32
4
1
32
2
4
1
3
2’2
1
3
1
32
2 2’
2
10 11 INDIVIDUO 1
10
4
6
8
INDIVIDUO 2
11
7
455
9
44
INDIVIDUO 1
4
6
8
5
7
9
3
5
7
4
6
5
7
4
6
8
5
7
4
6
8
54
6
4
65
7
5
7
9
54
10
4
6
8
13
• Funciones de los VNTRs:– Regulación de puntos activos de recombinación
DNA minisatélite hipervariable
– Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica)
– Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros)
– Podrían dar estabilidad a los cromosomas
Aplicaciones• Aplicaciones:– Identificación individual (medicina forense)
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DNA microsatélite
• Localización dispersa en todos los cromosomas
• Se encuentran en intrones • Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante.
• A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES).
• Secuencia repetida de 1 a 4 pb4 pb.
• Son muy polimórficas.• Las secuencias
flanqueantes a la repetición son únicas.
Detección del polimorfismo: PCR
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• Visualización de los microsatélites:– http://www.unizar.es/lagenbio/recursos/
DNA microsatélite
ACGT
Secuenciación: Genotipado:
• Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina:– Expansión de microsatélites de trinucleótidos:
DNA microsatélite
p• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar
(SCA)(SCA)–Expansión de tetranucleótidos: DM2–Expansión de pentanucleótidos: SCA10
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• Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites:
E f d d d h i i ió d
DNA microsatélite
– Enfermedades de herencia recesiva expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína)
– Enfermedades con herencia dominante expansión de tripletes produce una proteína alterada
– Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes expansiones en el ARN función celular alterada?
• Aplicaciones:– Identificación individual
DNA microsatélite
– Análisis evolutivo de poblaciones– Diagnóstico directo en enfermedades
genéticas causadas por expansión de trinucleótidos
– Diagnóstico indirecto de enfermedadesDiagnóstico indirecto de enfermedades genéticas:
• Ligamiento entre microsatélites polimórficos y genes causantes de enfermedad.
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Identificación individual
Análisis de 15 marcadoresmicrosatélites
Diagnóstico directoEjemplo: Diagnóstico corea de Huntington
Nº repet Clasificación E.H.<27 Normal No27 35 I t di N27-35 Intermedio No36-39 Penetrancia I +/->39 Penetrancia T Si
1 2
3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7
45
22201816
12
18
Diagnóstico indirecto
Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas
Fibrosis quística
HSA7
Ms1
CFTRMs2
Ms3
CFTR* CFTR*
127 125
?
222
152
220
154
?
1
123 125
CFTR*
220
150
220
154
2
123 125
CFTR*
220
150
220
154
3
127 129
?
222
152
218
152
?
4
123 129
?
220
150
218
152
?
5
127 129
?
222
152
218
152
?
6
Etiología Detección Frecuencia genómica
Resumen de polimorfismos genéticos
Etiología Detección Frecuencia genómica
Microsatélites errores de DNAp PCR 1/30.000 bp(short tandem slippagerepeats)
STRs
Minisatélites entrecruzamiento Southern variable, baja(variable no of no equilibradotandem repeats) unequal crossing over
VNTRs
RFLPs mutaciones Southern-PCR baja(restriction fragmentlength polymorphisms)
SNPs mutaciones PCR 1/1000 bp(Single nucleotide Polymorphisms)
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Mutaciones Puntuales
Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales:• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb
También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
En regiones codificantes:
Mutaciones con cambio aminoacídicoGCA (Ala) GTA (Val)
Alelo 1Alelo 2
TACGAGCTATACGGGCTA
Mutaciones:- Cambio de base- Inserción - Deleción
Mutaciones sin sentidoAAA (Lys) TAA (stop)
Mutaciones silentesGCA (Ala) GCC (Ala)
Deleción
Metodología para determinar mutaciones puntuales
• SNP:– Mutaciones puntuales
detectable por un variado número de técnicas:
• RFLPs:– Mutaciones puntuales que se
localizan en una secuencia reconocida por una enzima de
• Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte)
• Secuenciación• Minisecuenciación• Sondas específicas• SSCPs• PCR en tiempo real…
– Baja variabilidad (2 alelos)Localización:
restricción.– Detección mediante enzimas
de restricción y Southern Blotting
– PCR + enzima de restricción– Baja variabilidad (2 alelos).– Localización:
• Exones• Genes de copia única
– Localización:• Exones• DNA de copia única
20
RFLPs
Determinación mediante Southern
Diagnóstico genético por RFLPs
Polimorfismo debido amutaciones puntualesEn el gen de la globina normal lasecuencia correspondiente al 5th-RE RE RE RE RE
Ms t I I
RFLP(Restriction fragment lenght polymorfism)
p7th aminoácido del péptido beta-globina es CCTGAGGAG que esreconocida por la enzima derestricción MstII. En la variablepatológica de la anemia falciforme,eritrocitos en hoz-sickle, se produceuna mutación puntual de A a T,lo que invalida el reconocimientopor MstII. En la correspondientedi tió i áti
A a
A a
AA Aa aa
digestión enzimática se genera unúnico fragmento de 1,3 kb en lugarde los dos fragmentos de 0,2 kb y1,1 kb propios del gen normal. Losdiferentes fragmentos se detectanpor técnica de Southern blotting
Aa Aa aaAA
AaAa
aaaa aaAA
21
Determinación mediante PCR-RFLPs
Mutación:Alelo 1Alelo 2
TGGACGTCTTGGATGTCT
Aat II
PCR:TGGACGTCTTGGAGGTCT
Fragmento PCR
PCR Alelo 1 Alelo 2
Electroforesis
Genética Médica
• SNP:– Mutaciones puntuales
detectable por un variado número de técnicas:
• RFLPs:– Mutaciones puntuales que se
localizan en una secuencia reconocida por una enzima de
Según metodología de detección
• Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte)
• Secuenciación• Minisecuenciación• Sondas específicas• SSCPs• PCR en tiempo real…
– Baja variabilidad (2 alelos)Localización:
restricción.– Detección mediante enzimas
de restricción y Southern Blotting
– PCR + enzima de restricción– Baja variabilidad (2 alelos).– Localización:
• Exones• Genes de copia única
– Localización:• Exones• DNA de copia única
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SNPs
• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Presentación muy frecuente (1/300 pb)
10 30 ill d SNP l – 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano
– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de
mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)– Fácil estandarización– Aplicaciones en la determinación de
enfermedades y en farmacogenética
Determinación de SNPs
MCL1
Secuenciación:
PCR en tiempo real con sondas alelo específicas:
Minisecuenciación:
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• Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina:– Pueden originar diferencias muy sutiles o
Mutaciones puntuales
g yprovocar la muerte
– Mutaciones en líneas germinales:• Neurofibromatosis (dominante)• Acondroplasia (dominante)• Hemofilia (Factor VII, ligado al X)
– Mutaciones somáticas:Mutaciones somáticas:• Cáncer: mutaciones de protooncogenes
– Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos
• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA
Genética Médica
DNA:– Identificación individual (Medicina
forense)–Construcción de los mapas génicos–Ligamiento con fenotiposg p
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Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística
Nora Riveros Ka Juan Ríos Hb (2005) Detección indirecta deNora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: 648-654