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Tema 3Tema 3. Análisis estructural de enzimas.
1.-Determinación de la Masa molecular.
2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria.
3.- Estructura secundaria y terciaria.
Determinación estructural: RMN, Cristalografia.
4.- Estructura cuaternaria.
Determinación sub-unidades, tipo
Funcionalidad
1.- Determinación de la Masa molecular.
Técnicas electroforéticas
Podemos estimar la masa molecular relativa con el uso de marcadores
Electroforesis en gel.
Dis
tanc
ia e
n cm
Controlar la pureza
Cromatografía por filtración en gel: Tamaño Las proteínas se separan por exclusión molecular mediante el uso de bolitas porosas de un polímero insoluble como dextrano o agarosa (Sephadex, Sepharosa).
Técnicas cromatográficas
Se determina Vo con Blue Dextran
Ve se determina para cada proteína
Vt se calcula de la fórmula r 2 x h
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo
Espectrometria de masas
MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight
Se determina el tiempo que tardan en ser detectados que
es función de su masa.
Se generan iones de las proteínas y se aceleran a través de un campo
eléctrico.
ESI: electrospray ionization mass spectrometry
MALDI-TOF
Resultado de una espectrometría de masas
Información del peso molecular
Permite la conversión en concentración de proteínas en solución a Molaridad
1. Composición:
¿cuántos aminoácidos de un tipo hay en la molécula?
2.- Actividad catalítica
¿cuántas moléculas de substrato son transformadas por una molécula de enzima por segundo?
3.- Uniones a ligandos
¿cuántas moléculas de ligando se une por molécula de enzima?
2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria.
Los aminoácidos se unen entre si mediante enlace covalente de tipo amida (R-CO-NH-R) para formar péptidos
Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos
Enlace peptídico
-El equilibrio está más desplazado hacia la hidrólisis, por ello la formación del enlace requiere un aporte de energía (ATP).
-Sin embargo el enlace peptídico es cinéticamente muy estable y en ausencia de un catalizador, el tiempo de vida en disolución acuosa es de 1000 años.
Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos
1. Ayuda a conocer su mecanismo de acción. Identificación de regiones funcionales en una enzima
2. Interpretar datos estructurales cristalográficos, RMN.
3. La secuencia determina la estructura tridimensional
Estructura primaria
Enlace peptídico
Corresponde a la posición de cada aminoácido en la secuencia codificada por el ADN
Cada proteína tiene una secuencia de aas única y definida con precisión
Reacciones del grupo amino:- Reacción de Edman: Fenilisotiocianato. Absorbancia a 254nm
- Reacción de Sanger: 1-fluoro,2,4 dinitrobenceno (FDNB). Ab. 360nm
- Reacción con el cloruro de dansilo: compuestos fluorescentes.
- Reacción con la ninhidrina o fluoroescamina. compuestos fluorescentes.
Composición aminoacídica de cadenas polipeptídicas
Identificación del extremo amino terminal
METODOS TRADICIONALES DE SECUENCIACIÓN
Degradación de EDMANHasta 50 residuos contiguos de un polipéptido
Polipéptidos de gran tamaño
1. Romper la proteína en fragmentos por métodos químicos o enzimáticos
2. Romper puentes disulfuros3. Purificar cada fragmento y secuenciarlo por Degradación de EDMAN4. Determinar el orden de los fragmentos y dónde se localizan, si los hay, los puentes disulfuros.
Rotura de puentes
disulfuros
Métodos para fragmentar las cadenas polipeptídicas
METODOS ACTUALES DE SECUENCIACIÓN
Secuenciación MS-MS
Sólo se permiten los giros alrededor de los enlaces C-N y C-CEl carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico limita la
capacidad de rotación del mismo
Los ángulos de giro (ángulos de torsión) se denominan: (fi) y (psi).
Estructura secundariaDisposición regular y repetida del esqueleto de la cadena
polipeptídica en una dirección determinada. No se tienen en cuenta las cadenas laterales
3.- Determinación de la estructura secundaria y terciaria.
Los valores para los giros fi y psi están comprendidos entre 180º y -180º
Estructura secundaria
Plot de Ramachandran
Las posibilidades de giro van a determinar en gran medida el plegamiento de las proteínas
Indica los valores de los ángulos fi y psi de conformaciones permitidas
Estructura secundaria
¿ Cuáles son los valores estéricamente permitidos ?
Estructura secundaria
Existen dos tipos de estructuras secundarias termodinámicamente favorables
-Hélice Hoja plegada
En principio un péptido puede adoptar muchas conformaciones diferentes según los ángulos phi y psi
Adopta la más favorable desde el punto de vista energético:
• menores impedimentos estéricos• menor repulsión electrostática
Estructura secundaria: -hélice
Puente de Hn y n+4
- 57º - 47º
Estructura secundaria: -hélice
Estructura secundaria: -hélice
Radicales hacia el exterior de la hélice
NO PARTICIPAN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA
1- Repulsión o atracción electrostática entre aminoácidos cargados.
Restricciones para la formación de una -hélice
2- Volumen de los grupos R adyacentes. No podrían ir seguidos varios aminoácidos voluminosos.
3- Interacciones entre cadenas laterales de aminoácidos separados por 3 ó 4 residuos.
4- Presencia de prolina. X-Pro.
Las hojas antiparalelas son más estables por la alineación de los
puentes de H
Los puentes de H conectan un residuo con dos residuos de la cadena
adyacente (grupo NH de R1 y el CO de R2 de la cadena adyacente y entre el grupo CO de R1 y el NH de
R3 de la cadena adyacente)
Estructura secundaria: hojas-
Proteína globular con alto contenido en estructura
Concanavalina A
Las diferentes estructuras secundarias co-existen en una misma proteína
Estructura secundaria: giros, codos o lazos
Permiten el giro de 180º en la dirección de las cadenas polipeptídicas
Estabilizado por puentes de H entre el aa1 y el aa4 (aai e aai+3)
Estructura suprasecundaria
Agrupaciones estables de estructuras secundarias frecuentes en las proteínas.
Motivos estructurales
Todo alfa Todo beta Alfa-beta
Unidades Meandro Barril Unidad
- Hélice-vuelta-hélice.- Siete hélices transmembrana. - Mano EF.- Cremallera de leucina.
- Horquilla - Meandro
- Barril
- Dedo de Zn.
Estructura supersecundaria o motivos
Todo alfa
Todo beta
Alfa-beta- Motivo
Dos -hélices cortas. Dos -hélices yuxtapuestas
Interaccionan entre sí mediante cadenas laterales de leucina
(cremallera de leucina)
Presente en proteínas que se unen a calcio
como calmodulina o troponina
Mano EF
Todo alfa
Siete hélices transmembran
abacteriorrodopsina
Proteínas de unión al ADN
reguladoras de la transcripción
(c-fos, c-jun)
Dos estructuras adyacentes orientadas de forma antiparalela
Horquilla beta
Barril beta
Proteína que se une al retinol humano
Todo beta
Meandro
Dedos de Zinc
Estructuras alfas y betas unidas por un átomo de Zinc que interacciona con Cys e His
Alfa-beta
Proteínas de unión a ADN
Dedo de Zn
Motivo
Estructura subterciaria
Dominio:
Parte de la cadena polipeptídica que tiene un plegamiento propioe independiente del resto de la proteína (Unidad de plegamiento).
La unión estable de varios motivos da lugar a los dominios.
Frecuentemente asociado a una función específica.
Proteínas de más de 200 residuos
Dominio
Dominio
Dominio
Regiones de 100 a 150 aminoácidos
Estructura subterciaria
Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteína
Estructura terciaria
Mioglobina
Estructura terciaria
Fuerzas que estabilizan la estructura terciaria
Interacciones débiles
• Iónicas (puentes salinos)• Hidrofóbicas• Enlaces de hidrógeno• Fuerzas de Van derWaals
Interacciones covalentesEntre restos de Cys
RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Núcleos en diferentes ambientes resonaran a frecuencias de radiación distintas
Proteína con 55 aminoácidos
B-sheet
Efecto de la proximidad de dos núcleos
NOESY “Nuclear Overhause Enhancement Spectroscopy”
Muestra pares de protones muy cercanos menor de 5 A
Magnetización se transfiere
Proteína de 55 aminoácidos
Diagonal
Primera dimensión
Genración de proteínas marcadas 13C, 15N y 2H
RMN en tres dimensiones
Dominio de dedo de Zn
CRISTALOGRAFÍA RAYOS X
Longitud de onda igual longitud que el enlace covalente
Proteínas cristalizan en la configuración biológica activa
Los electrones de los átomos dispersan los rayos X
La forma de dispersión dependen del ordenamiento atómico
Transformación de Fourier
Mapas de densidad electrónica
4. Estructura cuaternaria
Hace referencia al ordenamiento de diferentes subunidades en una
proteína multimérica
Uniones no covalentes
Interacciones débiles
• Iónicas (puentes salinos)• Hidrofóbicas• Enlaces de hidrógeno• Fuerzas de Van derWaals
1. ¿Cuantas sub-unidades y de que tipo?
Estudios de determinación de peso molecular. Agentes desnaturalizantes (Guanidina)
Tipos y número de subunidades (precaución trazas de proteasas, al disociar las sub-unidades)
Estudios de crosslinlinking
Agentes químicos: Dimetilsuberimidato
Desnaturalización SDS
4X 3X 2X XDeterminación
Peso molecular
SDS-PAGE
Estudios de evaluación Peso Molecular
Estudios de uniones a ligandos
Número de sitios de una enzima por un substrato indica el número de sub-unidades (Disposición de las sub-unidades)
Alcohol DH Levadura 2 moles de NADH/mol ADH (Dímero)
Hígado 4 moles de NADH/mol ADH (Tetramero)
Estudios de simetria
Estudios de Cristalografía Ejes de simetria
Aspartato carbamoiltransferasa 6 unidades catalíticas y 6 regulatorias
Estudios de identidad de sub-unidades
Secuenciación N-terminal y C-terminal
Espectrometría de masas de las sub-unidades
2.Enzimas oligoméricas: Funcionalidad 1. Aumenta la posibilidad de regulación catalítica
2. Variaciones en la propiedades catalíticas
Ej.Triptofano Sintasa Proteínas Multienzimáticas.
3. Estabilidad. Lactato DH
4. Generación de estructuras complejas con funciones biológicas. Economía información genética
Proteasoma