TEMA 6. CULTIVOS CELULARES

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………….…… 2

2. CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES ………………………………………….….. 3

2.1 Métodos de obtención de cultivos celulares …………………………………….. 3

2.2 Tipos de cultivos celulares ……………………………………………………… 4

2.4 Tipos especiales de cultivos celulares ……………………………………………6

2.4.1 Cultivos de células madres …….……………………………………… 6

2.4.2 Hibridomas …………………….……………………………………… 7

2.5 Ventajas e inconvenientes del uso de cultivos celulares en experimentación ……8

2.6 Morfología y tipos de crecimiento de las células de cultivo …………………….. 9

2.7 Fases de cultivo celular …………………………………………………………. 10

3. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS EN CULTIVO …………………………………... 10

4. FUENTES CONSULTADAS ………..………………………………………………… 11

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1- INTRODUCCIÓN

La técnica de cultivos celulares se comenzó a utilizar a principios de este siglo como un

método para estudiar el comportamiento de las células animales o vegetales sin la influencia

de las múltiples variables que implicaba un organismo entero. Desde entonces dichas técnicas

han sido mejoradas, extendidas y aplicadas por un número creciente de biólogos y

actualmente son muy utilizadas en investigación médica y biológica.

Se entiende por cultivo celular un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de

células in vitro, preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de

su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos, de explantes, cultivos

primarios o secundarios...

Podemos dividir el cultivo de tejidos en dos grupos de técnicas:

El cultivo de órganos: se puede definir como el mantenimiento de fragmentos de tejidos u

órganos completos in vitro. Este tipo de cultivos mantienen la estructura tridimensional

del tejido u órgano pero no proliferan, por lo tanto es necesario partir en cada

experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad.

Explantes primarios: son fragmento de tejidos u órganos que se adhieren a una superfície

y la que proliferan las células de la periferia del explante.

El cultivo de células: supone una disgregación celular del tejido u ógano original. La

suspensión celular obtenida puede ser cultivada tanto en suspensión como en monocapas

sobre cristal o plástico. Por lo tanto en este tipo de cultivos se pierde la organización

espacial tridimensional propia del tejido original, las interacciones entre distintos tipos

celulares y entre las células y la matriz extracelular y las células carecen de los

componentes sistémicos de regulación implicados en la regulación de la homeostasis “in

vivo”, especialmente los sistemas nervioso y endocrino. Además se pierde la

heterogeneidad celular de partida.

La mayoría de células animales y vegetales pueden vivir, proliferar e incluso diferenciarse si

se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. En estas condiciones

las células en cultivo se han convertido en una herramienta ampliamente utilizada en biología

molecular y celular, proporcionando un excelente sistema modelo para diferentes estudios,

como por ejemplo:

Investigar el comportamiento fisiológico y/o bioquímico de las células. Por ejemplo

estudios del metabolismo celular, envejecimiento, interacción y señalización celular.

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Testar el efecto de diferentes drogas o compuestos químicos sobre un tipo de células en

concreto (normales o tumorales) para analizar su posible efecto tóxico, carcinogénico o

terapéutico.

Estudios biotecnológicos de generación de tejidos artificiales.

Estudios de producción de agentes biológicos útiles, producidos por cultivos celulares a

gran escala (bioreactores), como por ejemplo: vacunas, anticuerpos monoclonales o

proteínas terapéuticas producidas por cultivos celulares genéticamente manipulados.

2. CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES

2.1 Métodos de obtención de cultivos celulares.

El primer paso para obtener células aisladas de un mismo tipo a partir de un tejido u órgano,

consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas. Para ello es necesario tratar

la muestra con diversas enzimas proteolíticas que degradarán las proteínas de la matriz (por

ej. tripsina y colagenasa) y con agentes quelantes que secuestran calcio (como el EDTA, acido

etilendiaminotetraacètico), del cual depende la adherencia celular. De esta forma y mediante

una agitación suave se conseguirá una suspensión de todas las células del tejido.

El siguiente paso consiste en la separación de los distintos tipos celulares del tejido. Para ello

se pueden usar varios métodos:

- Por centrifugación, que permite separar las células por tamaño.

- Según su capacidad de adherencia al vidrio o plástico.

- Mediante anticuerpos específicos contra determinados componentes celulares de membrana.

Estos anticuerpos pueden estar conjugados a una matriz o soporte sólido permitiendo su

separación por inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad, o bien con anticuerpos

marcados con fluorescencia permitiendo su selección

por citometría de flujo (ver Tema 55).

- Por microdisección de captura por láser (LCM). Esta

metodología consiste en la disección de un grupo de

células a partir de una sección de tejido preparada para

microscopía. La región que contienen las células de

interés es irradiada con un láser y posteriormente

trasnferidas a un contenedor para su posterior análisis.

Esta metodología es muy utilizada para el aislamiento

de células tumorales de un tejido.

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2.2 Tipos de cultivos celulares.

Se distinguen tres tipos principales de cultivos celulares:

Es importante diferenciar los siguientes conceptos:

Cultivo Primario: se denominan así aquellos cultivos obtenidos directamente por

tripsinización del tejido original. Pueden iniciarse sin o con fraccionamiento previo para

separar los distintos tipos celulares. En este tipo de cultivos las células aisladas se

mantienen vivas y conservan sus características originales pero su proliferación es

limitada. En estas condiciones las células pueden mantenerse hasta su confluencia

pudiendo entonces subcultivarse para la obtención de cultivos secundarios. Aunque

potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido,

normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a

que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

Es importante diferenciar entre:

Cultivo primario. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. Estas células

mantienen su viabilidad un período de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo.

Línea primaria. Cultivo a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de

tiempo limitado pero con capacidad de proliferar en el cultivo. Por ejemplo: fibrobalstos

dérmicos, células endoteliales del cordón umbilical (HUVEC), etc…

Cultivo Secundario: Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-

siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. En este caso

la heterogeneidad celular es menor y puede seleccionarse que células se desarrollarán

mediante el cultivo con medios selectivos.

Líneas celulares: son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos

secundarios.

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Las líneas celulares derivadas

de un cultivo primario son

finitas, es decir pueden

dividirse un número limitado

de veces y después pierden la

habilidad de proliferar (proceso

llamado senescencia celular).

Sin embargo un número de

células puede convertirse en

inmortal mediante un proceso

llamado transformación. Este proceso puede ser espontáneo o puede ser inducido

químicamente o mediante virus. Cuando una línea celular es sometida a un proceso de

transformación y adquiere la habilidad de dividirse indefinidamente se convierte en una línea

celular continua. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen entre 25 y 40

veces en cultivo, antes de detenerse. Esta capacidad limitada de proliferación es resultado de

un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los

extremos de los cromosomas). En las células somáticas el gen encargado de mantener la

integridad de los telómeros (telomerasa) está silenciado, por lo que los telómeros se acortan

en cada división celular. Las células en cultivo pueden ser forzadas a proliferar

indefinidamente si se les provee del gen que codifica para la telomerasa. Sin embargo no

todas las líneas celulares se convierten en inmortales por el mismo proceso. Algunas células a

pesar de que sus telómeros se mantienen íntegros, pueden frenar sus divisiones mediante

mecanismos de control del ciclo celular o check-points. Para inmortalizar estas células es

necesario introducir oncogenes mediante la utilización de virus (por ejemplo adenovirus).

Existen otros casos como las células de ratón, que no tienen silenciado el gen de la telomerasa

por lo que sus telómeros se mantienen íntegros a lo largo de las divisiones celulares. Pero

cuando son cultivadas, estas células experimentan unos cambios genéticos que inactivan los

mecanismos de control del ciclo celular check-point, produciendo líneas celulares inmortales

espontáneamente.

A pesar de la gran similitud que las células de una línea celular tienen entre sí, no son

idénticas. La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular a

partir de una sola célula que proliferará para formar una línea de células clonales idénticas.

Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas

celulares mutantes para ciertos genes en concreto.

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Existen diferencias muy importantes entre una línea celular continua y una línia primaria o

cultivo primario tanto desde el punto de vista físico-químico (tumorogenicidad, ploídia,

anclaje, crecimiento, marcadores), como de requerimientos y rendimineto/eficiencia de

crecimiento.

2.3 Tipos especiales de cultivos celulares

2.3.1 Cultivos celulares de células madre

Entre los cultivos celulares más prometedores des del punto de vista terapéutico, se

encuentran las líneas de células madre. Denominamos Célula Madre (Stem Cell ,SC) a

aquella con capacidad de auto-renovación (habilidad ilimitada de regenerar células iguales a

ella) y pluripotencialidad (capaz de diferenciarse en cualquier tipo celular).

Las Células Madre (SC), en ausencia de condiciones de diferenciación específicas,

mantendrán su auto-renovación por un periodo infinito. Estas células, que poseen la habilidad

de diferenciarse en cualquier tipo celular presente en el organismo, se han convertido en un

foco de interés en diferentes campos de investigación. Actualmente el principal objetivo de la

investigación con SC consiste en su derivación (cultivo) como soporte para la creación de

células pre- o diferenciadas para su posterior aplicación en medicina regenerativa. Los

campos de aplicación incluyen ensayos clínicos y farmacológicos de enfermedades

neurodegenerativas, cardiovasculares y diabetes (entre otras), la generación de células

donantes universales y la ingeniaría tisular.

Existen diferentes tipos de células madre según su orígen

1- Células madre embrionárias (ESC) que derivan de la masa celular interna del blastocito.

Estas células pueden proliferar indefinidamente reteniendo su habilidad de diferenciarse en

cualquier tipo de célula en función de los estímulos externos a los que sean expuestas

(pluripotencia). Por ejemplo existen un gran número de líneas celulares embrionarias de ratón

(mESC) que representan una excelente herramienta para el estudio de modificaciones

genéticas, inducidas o seleccionadas para el análisis de du función en el animal entero. La

investigación con células madre embrionarias humanas (hESC) está regulada por directrices

europeas muy estrictas que controlan el seguimiento de las condiciones de derivación y

propagación.

2- Células madre adultas. Son células no diferenciadas que se encuentran en tejidos y órganos

adultos y que poseen la capacidad de diferenciarse para dar lugar a células adultas del tejido

en el que se encuentran, por lo tanto se consideran células multipotentes. Existen diferentes

fuentes de células madre adultas derivadas de diferentes tejidos, por ejemplo: células madre

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de la línea hematopoiéticas (en la médula ósea), células madre neurales, epiteliales o incluso

derivadas de las láminas basales de la epidermis.

3- Céluals madre fetales, aisladas a partir de embriones muertos y sangre del cordón

umbilical.

Para su derivación (mantenimiento en cultivo) las colonias formadas a apartir de células

madre aisladas o de la masa interna del blastocito (en el caso de ESC) son disgregadas y

sometidas a pases sucesivos hasta obtener líneas celulares estables que posteriormente podrán

diferenciarse mediante la activación o desactivación de determinados genes en resuesta a

distintos mecanismos celulares (miRNA, factores de crecimineto, receptores de membrana,

etc…). Durante este proceso de cultivo y diferenciación se producen cambios en la

composición antigénica de superfície, en proteínas intracelulares y factores de trasncripción.

La detección de estos cambios mediante marcadores es ampliamente utilizada para

caracterizar el estado de pluripotencia o diferenciación de las SC.

Una vez establecida la línea celular de SC, como cualquier tipo de línea celular será necesario

mantenerla en cultivo bajo condiciones controladas de crecimiento y cada tipo celular tendrá

unos requerimientos distintos de sustrato, nutrientes, hormonas y factores de crecimiento.

2.3.2 Hibridomas

Por último una variante de cultivo celular son los hibridomas (ver Tema 55). Se sabe que es

posible fusionar dos células formando un heterocarionte, es decir una célula con dos núcleos

separados pero con los contenidos citoplasmáticos compartidos. Eventualmente este

heterocarionte puede entrar en mitosis produciendo una célula híbrida en la que las envolturas

de ambos núcleos se han disgregado permitiendo juntar su dotación cromosómica. Estos

hibridomas pueden clonarse y establecerse como línea celular continua aunque durante este

proceso parte del material genético puede perderse.

2.4 Ventajas e inconvenientes del uso de cultivos celulares en experimentación.

Ventajas:

1- Permiten un control preciso y fino del entorno. En un cultivo se puede controlar los

factores del entorno ya sea físico-químicos (O2, CO2, temperatura pH, osmolaridad, etc…) y

fisiológicas (factores de crecimeinto, hormonas, etc…).

2- La células en cultivo son fáciles de manipular y controlar.

3- La existencia de numerosas línias celulares internacionales en bancos de células de fácil

acceso ofrece una espectro muy amplio de variedad de células en cultivo fiables.

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4- La utilización de cultivos celulares permite economizar en el uso de reactivos o drogas ya

que las concentraciones y cantidades a usar son mucho menores.

5- Son una alternativa al uso de animales ya que ofrecen la posibilidad de realizar un

screening previo para su posterior análisis en un número más reducido de animales.

6- Las límeas celulares pueden mantenerse congeladas por largos periodos de tiempo sin

perder su viabilidad.

7- Es posible trabajar a pequeña, media y gran escala ya que, si es necesario, es posible

obtener grandes cantidades de cultivo.

Inconvenientes:

1- Validez del modelo “in vitro”. Hay que tener en cuenta que los resultados obtenidos con

cultivos celulares no siempre son extrapolables a los resultados esperados con animal entero

ya que el entorno es totalemente distinto: no existe interacción con otros tejidos, cambian la

organización tridimensional, las condiciones de crecimiento y carecen de componentes

sistémicos de regulación (especialmenet sistema nervioso y endocrino).

2- Inestabilidad genética. Probablemente la capacidad de una línea celular para crecer de

forma continua es un reflejo de su capacidad de variación genética sobre la que se puede

establecer una selección. Esto se corresponde con las observaciones de que líneas celulares

que nunca se establecen como estables se mantienen euploides mientras que otras líneas

frecuentemente se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas.

Además las células pueden adaptarse a las diferentes condiciones de cultivo (nutrientes,

temperatura, osmolaridad, etc…) modificando por ejemplo sus actividades enzimáticas.

3- Falta de diferenciación: se puede decir como norma que una línea celular será tanto más

fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada sea (con las excepciones de las líneas

tumorales de células diferenciadas).

4- La contaminación del cultivo por microorganismos (bacterias, hongos, levaduras, virus,

micoplasmas). Esto supene la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo

momento.

2.5 Morfología y tipos de crecimiento de las células de cultivo

Las células en cultivo pueden clasificarse en diferentes categorías en función de su

morfología:

Fibroblasticos (fibrobals-like): células bi- o multipolares de forma elongada y

crecimiento adherido al sustrato.

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Epiteliales (epithelial-like): células poligonales de dimensiones regulares y crecimiento

adherido al sustrato.

Linfoblàsticos (lymphoblast-like): células esféricas que normalmente crecen en

suspensión.

Además, existen dos sistemas de crecimiento de las células en cultivo: 1) crecimiento en

monocapa y 2) en suspensión.

1- El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esta

forma inician la proliferación hasta llegar a la confluencia, inhibiendose el crecimiento

por contacto. Muchas líneas celulares son anclaje dependientes, es decir, no inician la

proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Este es el modo normal de

proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células

hematopoyéticas maduras. Algunas células transformadas no se inhiben por contacto de

manera que pueden crecer en varias capas. Para obtener grandes producciones de células

adherentes se pueden utilizar microcarriers. Son unas esferas pequeñas que proveen un

soporte y facilitan la adhesión   y crecimiento de las células. Proveen una mayor ratio

área de superficie/volumen, incrementando la producción en un menor espacio.Este tipo

de cultivos requiere la disgregación de la unión sustrato-célula cada vez que es necesario

efectuar un pasaje. Para ello pueden usarse métodos mecánicos (rascado o “scrapping” de

la placa), químicos (iones divalenets o quelantes del calcio) o enzimáticos (proteasas

como tripsina)

2- El crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin

necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje y es propio de las células

hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células procedentes de

tumores. Estas células pueden crecer en frascos de cultivo normales pero cuando se

incrementa el volumen de cultivo puede ser necesaria la agitación del medio mediante

spinners. Este tipo de crecimiento presenta la ventaja que no es necesario disociar el

cultivo del sustrato cada vez que es necesario pasar las células.

2.6 Fases del cultivo celular

Una vez establecido el cultivo celular (sea primario, secundario o estable), este seguirá

diferentes fases:

Fase de latencia: durante este período se efectuará la fijación de las células al sustrato (en

el caso de crecimiento en monocapa), su adaptación al medio de cultivo e inicio del ciclo

celular.

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Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente cada

24-48 horas(dependiendo del tiempo de duplicación de cada cultivo).

Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse

(monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio).

Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una

fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

Para mantener el cultivo en condiciones óptimas es necsario subcultivar las células (pasaje o

pase). El subcultivo permitirá la renovación del medio de cultivo y llevar la relación nº de

células/medio de cultivo/sustrato a las condiciones iniciales.

3. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS EN CULTIVO

La transfección de células consiste en la introducción de ácidos nucléicos (por ejemplo ADN

o constructos de RNA de interferencia) exógenos dentro de una célula. La introducción de

este material genético heterólogo en las célualas permite analizar in vivo la función de un gen

o bien identificar las secuencias reguladoras que controlan su expresión. También puede

utilizarse como sistema de expresión de proteínas recombinantes.

Para la introducción del material a trasferir existen diferentes metodologías y su elección

dependerá de la naturaleza de las células empleadas. Todas estas metodologías buscan

facilitar la introducción del material genético dentro de las células, para ello pueden usarse

métodos químicos i físicos:

- Producir poros en la membrana celular a través de los cuales el material exógeno

podrá entrar. Ello puede conseguirse bien con fosfatocálcico o por electroporación.

- Producción de liposomas cargados con el material a transferir, que se fusionaran con

la membrana.

- Introducción del material por endocitosis del material mediante conjugación del ADN

con polimeros catiónicos (por ejemplo dextran-DEAE).

- Por microinyección. Esta metodología es más laboriosa pero muy efectiva y es la que

se emplea para la transfección de células embrionárias en el proceso de obtención de

animales transgénicos.

- Mediante la utilización de virus. Un ejemplo de ello es la transfección de células de

insecto por baculovirus para la producción a gran escala de proteínas recombinantes.

Esta metodología se ha revelado como una de las más potentes alternativas a la

expresión heteróloga de proteínas recombinantes en células de mamífero ya que las

células de insecto tienen un patrón enzimático para la modificación postraduccional de

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proteínas muy similar al de las de mamífero y además, su uso resuelve los problemas

de solubilidad de proteínas cuando son expresadas a gran escala.

La transfección puede ser transiente o estable. En el primer caso el DNA introducido es

eliminado por dilución durante la división celular o por degradación. Sin embargo en algunos

casos el DNA introducido puede integrase en el genoma de la célula transfectada, tratandose

entonces de una transfección estable. Estas células transfectadas establemente pueden ser

seleccionadas mediante la cotransfección de un gen marcador que le confiere alguna ventaja

para crecer en medios selectivos, por ejemplo resistencia a algún antibiótico (por ejemplo

higromicina) o toxina (por ejemplo geneticina que puede ser neutralizada con la expresión de

neomicina).

4. FUENTES CONSULTADAS

- Cell Cultire basics. Handbook. Invitrogen-Gibco. Life technologies.

- Cultivos celulares. Cultek

http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Cultivos_Celulares&opc=tecnicas

- Transfección. Cultek

http://www.cultek.com/inf/otros/Notas_tecnicas/transfeccion.pdf

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