Tema 7. Estructura y organizaci n del ADN - darwin.uvigo.esdarwin.uvigo.es/docencia/2005/genccmar05/7.ADN.2x1.pdfhereditario de algunos virus. 1957 Fraenkel-Conrat y Singer conÞrman

Tema 7. Estructura y organización delADN

Genética CC. Mar 2005-06

Genética CC Mar 2005/6 • D. Posada, Universidad de Vigo 2

Objetivos

•Examinar las propiedades que debetener el material hereditario.

•Comprender la estructura yorganización del material hereditario.

•Entender la replicación del ADN.


Material hereditario

• El material hereditario debe …– Contener de una forma estable la información

genética.– Transmitir la información fielmente.– Poder cambiar, permitiendo la variación,

adaptación y evolución.

• El material hereditario lo forman:– ¿Proteínas?– ¿Ácidos nucleicos (ADN y ARN)?


Búsqueda del material hereditario

1890 August Weismann propone que hay una sustancia en elnúcleo que controla las características de los individuos.

1900 Los cromosomas contienen la información hereditaria. Mástarde se comprueba que los cromosomas están hechos deácidos nucleicos (ADN y ARN) y proteínas.

1928 Experimento de transformación de Griffith.1944 Experimento de transformación de Avery, MacLeod y

McCarty.1953 Experimento del bacteriófago de Hershey y Chase.1953 Watson y Crick proponen la estructura en doble hélice del

ADN.1956 Gierer y Schramm demuestran que el ARN es el material

hereditario de algunos virus.1957 Fraenkel-Conrat y Singer confirman el experimento de

Gierer y Schramm.


Experimento de transformación deGriffith

• Streptococcus pneumoniae: agente transforma cepaIIR (no virulenta) en IIIS (virulenta).

Figura. Experimento de transformación de Griffith (1928).


Experimento de transformación deAvery, MacLeod y McCarty

• Lisaron bacterias IIIS y aislaron sus componentes.• El ADN es el agente transformante.

Figura. Oswald Avery

Figura. Experimento de transformación de Avery, MacLeod y McCarty (1944).


Bacteriófagos

Figura. Fago T2.

Figura. Ciclo lítico del fago T2.


Experimento de Hershey y Chase

• Marcan fagos T2– DNA (32P)– Proteínas (35S)

• Infectan E. coli.

• 32P aparece en lasbacterias y progenie.

Figura. Experimento de Hershey y Chase (1953)

Alfred Hershey, Nobel 1969


Virus ARN

• Gierer y Schramm (1956): ARN provoca enfermedaddel virus del mosaico del tabaco (TMV).

• Fraenkel-Conrat y Singer (1957): TMV (RNA A,proteínas B) + TMV (RNA B, proteínas A) = TMV A.

Figura. Experimento de Fraenkel-Conrat y Singer.


Estructura ADN (I)

• ADN y ARN son polímeros formados porcadenas de nucleótidos:– azúcar pentosa: desoxirribosa (ADN) o

ribosa (ARN).– base nitrogenada.– grupo fosfato.

Figura. Estructura de la desoxirribosa y ribosa. Figura. Grupo fosfato.


Estructura ADN (II)

• Purinas: adenina (A) y guanina (G).• Pirimidinas: citosina (C), timina (T) y

uracilo (U).• ADN: A, C, G y T.• ARN: A, C, G y U.

Figura. Bases nitrogenadas.


Estructura ADN (III)

• Nucleósido = pentosa(C1) –enlace covalente–base (purina N9,pirimidina N1).

• Nucleótido = pentosa(C5) + grupo fosfato.

• Cadenaspolinucleotídicas:nucleótido (fosfato)–enlace fosfodiéster 5’-3’–nucleótido (C3).


Estructura del ADN

• Estructura descubierta por James Watsony Francis Crick en 1953.

• Basada en dos fuentes de informaciónprincipales:– Estudios de composición de bases de Erwin

Chargaff.– Estudios de difracción de rayos X de

Rosalind Franklin y Maurice Wilkins.


Reglas de Chargaff

• Chargaff (1949):– (A + G) / (C + T) = 1– A/T = 1– G/C = 1– (A + T) / (G + C) = %GC

• Contenido GC varía a escala evolutiva:– 50-60% procariotas– 45% eucariotas


Difracción de rayos X

• Los rayos X son difractados de una forma particularsegún la disposición de los átomos en una molécula.

• Franklin y Wilkins (1953), ADN:– hélice no sencilla– diámetro de 2nm– dos regularidades de 0.34 y 3.4 nm a lo largo del

eje de la molécula

Figura. Difracción de rayos X.


Modelo de Watson y Crick (1953)

1. Dos cadenas polinucleotídicas enlazadas en unadoble hélice dextrógira.

2. Las cadenas son antiparalelas, una está orientada endirección 5’-3’ y la otra en dirección 3’-5’.

3. El esqueleto azúcar-fosfato se sitúa en la parteexterna, mientras que las bases nitrogenadas seorientan perpendicularmente hacia el eje interno.

4. Las bases complementarias en cadenas opuestasforman enlaces de hidrógeno. A se empareja con T(puentes 2H), y C con G (puentes 3H).

5. Pares de bases 0.34 nm aparte. Una vuelta completade la hélice requiere 3.4 nm (10 bases por vuelta).

6. Las vértebras de azúcar-fosfato forman surcosmayores y menores.


Modelo de la doble hélice

ADN-B


Un descubrimiento revolucionario


Protagonistas

• Crick, Watson y Wilkins recibieron elNobel en 1962.

Rosalind

Franklin

James D.

Watson

Francis H.

Crick

Maurice H. F.

Wilkins


Tipos diferentes de ADN


Estructura del ARN

• El ARN es de cadena única,y puede adoptar estructurascomplejas, inclusointramoleculares.

• El ARN utiliza como azúcarla ribosa.

• El ARN utiliza U en vez deT.

• El ARN puede catalizarimportante reaccionesbiológicas.

rRNAtRNA


Organización del ADN en cromosomas

• El DNA de la célula se organiza cromosomas.• El cromosoma o juego de cromosomas que

contiene todo el DNA de un organismo sedenomina genoma.

• En procariotas el genoma es usualmente uncromosoma circular único.

• En eucariotas el genoma es un juego haploidecompleto de cromosomas contenidos en elnúcleo celular.


Cromosomas virales

• Virus = ácidos nucleicos + proteínas.• Material genético:

– ADN!1, ADN!2, ARN!1, ARN!2– Circular o linear– Uno o varios cromosomas

Fago "X174 infecta E. coli. Tiene unúnico cromosoma circular de ADN de5386 nucleótidos. Forma icosaédrica.

El fago # es parecido alos fagos T. GenomaADN!2. Presentaextremos pegajososcomplementarios.

Los fagos pares son ADN!1. Elgenoma de T4 abarca 168 kb. En unapoblación los distintos genomas sonpermutaciones circulares de losmismos genes. Algunos genes serepiten al principio y final delcromosoma, lo que se denominaredundancia terminal.


Cromosomas procarióticos

• La mayoría ADN!2 circular.• En Bacteria y Archaea el cromosoma se localiza una

masa densa (nucleoide).• E. coli: 1 cromosoma de 4.6 Mb

– Superenrrollamiento– Lazos


Valor C

• Valor C = cantidad total de ADN en el genomahaploide de una especie.

• Varía entre las especies sin relación concomplejidad estructural u organizativa (paradojadel valor C).


Cromatina

• La cromatina es el complejo de ADN y proteínascromosómicas. Parecida en todos los eucariotas.

• En la cromatina encontramos proteínas histonas y nohistonas.

• Las histonas son comunes, pequeñas, básicas (+)– Papel fundamental en el empaquetamiento de la cromatina.– Cinco tipos principales H1, H2A, H2B, H3 y H4,– En peso, histonas/ADN =1 en todos los eucariotas.– Muy conservadas evolutivamente (H4 de vacas y guisantes se

diferencian en 2 aminoácidos).

• Las proteínas no histonas son a menudo acídicas (-)– Difiere mucho entre los tipos celulares y entre los diferentes

organismos.– En peso, no histona / ADN = 50-100%.


Empaquetamiento ADN (I)

• El genoma de un única célula humana (3.4 ! 109

pb) debería de medir 2.3 metros.• Empaquetamiento a varios niveles:

– Enrollamiento del ADN (145 pb) sobre octámeros dehistonas (2 ! H2A, H2B, H3 y H4) para formar losnucleosomas.

– Conexión de los nucleosomas mediante ADN de unión(9-115 pb) asociado a H1.

– Empaquetamiento de los nucleosomas en fibras decromatina de 30 nm.

– Formación de dominios en lazo.


Empaquetamiento ADN (II)

Nucleosoma

Nucleosomas unidos por ADN de unión + H1

Fibras de 30 nmDominios en lazo


Empaquetamiento ADN (III)


Eucromatina y heterocromatina

• Eucromatina: sigue los ciclos habituales decondensación (máxima en metafase)ydescondensación durante el ciclo celular.– La mayoría del genoma de una célula activa es eucromatina.– Transcripción activa.– Secuencias no repetidas.

• Heterocromatina: siempre condensada.– Transcripción inactiva.– La heterocromatina constitutiva está presente en todas las

células en posiciones idénticas cromosomas homólogos.Básicamente ADN repetitivo. Ej. Regiones centroméricas.

– La heterocromatina facultativa varía en estado de célula acélula, durante el desarrollo, y a veces, entre cromosomashomólogos. Ej. corpúsculos de Barr.


ADN centromérico y telomérico

• En el centrómero se pueden encontrar secuencias deADN especiales (CEN en levaduras) que interactúancon los microtúbulos.

• Las secuencias teloméricas mantienen la estabilidad delos cromosomas y intervienen en su replicación:– Secuencias simples teloméricas: secuencias repetidas en

tándem en los extremos con funciones esencialesestabilizadoras.

– Secuencias asociadas a telómeros, de forma más interna, algomás complejas y con función desconocida.


Propiedades físico-químicas de losácidos nucleicos

• Densidad de los ácidos nucleicos.• Desnaturalización de los ácidos nucleicos:

temperatura de fusión (Tm).• Absorbancia a 260 nm.• Cinética de renaturalización: Curvas Cot.• Hibridación de los ácidos nucleicos.


Densidad y desnaturalización

• $G+C $densidad del ADN.• Desnaturalización: paso de cadena doble a

sencilla.– $G+C $estabilidad del ADN (+puentes 3H).– Temperatura de fusión (Tm): Tº necesaria para

desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla.– $G+C $Tm

Ab

sorb

anci

a a

26

0 n

m


Absorbancia UV a 260 nm

• El menor grado de absorción se produce enestado de doble hélice.

• La absorción aumenta cuando se produce ladesnaturalización pasando a estado de hélicesencilla (efecto hipercrómico, aumento de laabsorbancia).

• Si degradamos este ADN de hélice sencilla anivel de nucleótidos libres, de nuevo aumentala absorbancia.


Cinética de la reasociación (I)

• La renaturalización es el paso de hélice sencilla adoble hélice.

• Curvas Cot o de renaturalización.• Cot ! = tiempo en que se ha reasociado ! del ADN.

– Directamente proporcional a la complejidad del ADN delorganismo.

– $secuencias repetidas $velocidad renaturalización

Figura. Curva Cot.


Cinética de la reasociación (II)

• Las curvas Cot de virus y bacterias tienen un sólopunto de inflexión (secuencias únicas).

• Las curvas Cot de eucariotas poseen varios puntos deinflexión:– Cot ! bajos (10-4 a 10-1): secuencias altamente repetidas– Cot ! 10–102: secuencias moderadamente repetidas.– Cot ! > 103 : secuencias únicas o de bajo número de copias.

Figura. Curvas Cot.


Hibridación

• Las técnicas de desnaturalización renaturalizaciónpermiten la hibridación ADN+ADN o ADN+ARN.

• Se puede identificar el gen que ha dado lugar a undeterminado ARN mensajero.

• Las técnicas de hibridación "in situ" permiten localizarla posición de un gen de un cromosoma eucariótico.– ADN marcado con fluorescencia (FISH).– Marcaje del genoma (GISH).

Figura. FISH Figura. GISH


Secuencias únicas y repetidas de ADN

• ADN de secuencia única: una opocas copias.– Genes codificantes– ADN procariota– ~65% genoma humano

• ADN repetitivo:– Moderadamente repetitivo (pocas

o hasta 105 copias) o altamenterepetitivo (105 – 107 copias).

– Disperso (SINEs y LINEs; funcióndesconocida) o en tándem(centrómeros y telómeros; ~65%genoma humano; microsatélites).


Modelos de replicación del ADN• Semiconservativo: cada molécula de la progenie conserva una de las

hebras parentales.• Conservativo: las hebras parentales sirven como un único molde para la

síntesis de nuevas dobles hélices.• Dispersivo: fragmentos de doble hélice parental sirven como moldes

para la síntesis de nuevos segmentos de doble cadena. Las nuevas hélicesestán formadas por segmentos parentales y de la progenie.


Experimento de Meselson y Stahl (1958)

• Obtuvieron evidencia experimental de que elmodelo semiconservativo era el correcto.

• Marcan ADN de E. coli con 15N.• 15N y 14N (normal) se pueden separar mediante

centrifugación en gradientes de densidad.


Experimento de Meselson y Stahl (1958)


ADN polimerasa I

• Arthur Kornberg (1955): la ADN polimerasa Illeva a cabo la síntesis de ADN.

• Los componentes necesarios son:– La ADN polimerasa I– Desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs = dATP,

dCTP, dGTP, dTTP), precursores de losnucleótidos.

– Un molde de ADN.– Iones de magnesio (Mg2+), que optimizan la

actividad de la ADN polimerasa.

Figura. Arthur Kornberg (Nobel 1959).


Reacción de la polimerasa I de ADN (I)

• Formación de un enlace fosfodiéster en el 3’-OH de ladesoxirribosa y el fosfato 5’ del dNTP.– La energía proviene de la liberación de 2 de los 3 fosfatos.– La cadena que crece actúa como cebador en la reacción.

• La polimerasa encuentra el dNTP complementario alnucleótido de la cadena molde y lo incorpora– 800 nucleótidos por segundo.– 1 error cada 10-6 nucleótidos.

• La dirección de la síntesis es 5’-3’.


Reacción de la polimerasa I de ADN (II)


Reacción de la polimerasa I de ADN (III)


Polimerasas de ADN procarióticas

• E. coli: 3 polimerasas de ADN (I, II, y II).• Actividad exonucleásica 3’-5’: corrección de

errores (tasa error final 10-9).• La polimerasa de ADN I presenta además

actividad exonucleásica 5’-3’.


Replicación en procariotas• Un único origen de replicación (oriC en E. coli, ~245 pb).• En este sitio el ADN se desnaturaliza en cadenas sencillas

produciendo una horquilla de replicación.• Replicación bidireccional.


Inicio de la replicación en E. coli (I)

1. Una girasa (tipo de topoisomerasa) relaja el superenrollamiento delADN.

2. Proteínas iniciadoras se unen al origen de replicación.3. Una helicasa de ADN se une a las proteínas iniciadoras. La helicasa

avanza hidrolizando ATP desenrollando la doble cadena.4. Las proteínas de unión al ADN de cadena sencilla (SSB), previniendo

que estas cadenas se emparejen de nuevo.5. La primasa de ADN (polimerasa de ADN) se une a la helicasa

formando el primosoma.6. La primasa sintetiza un cebador de ARN (11-12 nt.), al cual puede

añadir nucleótidos la polimerasa de ADN III en dirección 5’-3’.7. El cebador de RNA es más tarde eliminado y reemplazado por ADN

por acción de la polimerasa de ADN I. El hueco es sellado por unaligasa.


Inicio de la replicación en E. coli (II)


Replicación semidiscontinua (I)

• Para mantener la polaridad 5’-3’, el ADN ha de sintetizarse endirecciones opuestas en ambas hebras molde.

• Hebra líder: síntesis en la misma dirección que el movimiento dela horquilla de replicación.– Síntesis continua.– Sólo necesita 1 cebador

• Hebra retardada: síntesis en dirección opuesta al movimiento dela horquilla de replicación.– Síntesis discontinua (fragmentos de Okazaki).– Necesita varios cebadores de ARN.– Eventualmente los fragmentos de Okazaki son conectados entre sí

por la acción de la polimerasa I de ADN (que reemplaza el cebadorde ARN por ADN) y una ligasa de ADN, que une los fragmentos.


3

Polimerasa III

5’ % 3

’

Hebra líder

Pares de bases

5’

5’

3’

3’

ADN superenrrollado relajado por la girasa y desenrollado por la helicasa + proteínas:

Helicasa +

Proteínas Iniciadoras

ATP

Proteínas SSB

CebadorARN

primasa

2Polimerasa III

Hebra retardada

Fragmentos de Okazaki

1

Cebador de ARN reemplazado por la polimerasa I& hueco sellado por la ligasa

Replicación semidiscontinua (II)


Replicación semidiscontinua (III)


Replicación semidiscontinua (IV)


Replisoma• Las proteínas que intervienen en la replicación forma

un complejo denominado replisoma.

• La hebra retardada puede plegarse:– las polimerasas de las dos hebras forman un complejo.– Se acercan los fragmentos de Okazaki. El primosoma puede

ser reusado en la misma horquilla.


Replicación ADN circular E. coli

1. Dos horquillas de replicaciónresultan en una estructura enforma de zeta (&).

2. A medida que se separan lashebras, se formasuperenrrollamiento positivoen algún otro lugar de lamolécula.

3. Las topoisomerasas alivian latensión en lossuperenrrollamientos,permitiendo que las doshebras continúen separándose.


Replicación en círculos rodantes

• Varios fagos de ADN,como "X174.

1. Corte en la hebra +.2. El extremo 5’ la hebra +

se desplaza para formarun horquilla.

3. La cadena intacta sirvecomo molde.

4. La síntesis en la la hebra+ desplazada ocurre deforma discontinua haciael final de la cadena.


Replicación del ADN en eucariotas

• La replicación el ADN es similar en procariotas y eneucariotas (varios cromosomas).

• En cada ciclo celular, cada cromosoma debe de serduplicado fielmente durante la fase S. Tres puntos dechequeo:– Punto START (G1; en levaduras): se comprueba si la célula es

suficientemente grande y el ambiente favorable, para pasar ala fase S.

– Punto de chequeo de la G2: se decidirá si la célula entra enmitosis, para lo que todo el DNA tiene que estar replicado.

– Punto de chequeo durante la mitosis: los cromosomas debende estar propiamente ligados al huso mitótico para que secomplete la mitosis.

– En estos chequeos intervienen ciertas proteínas denominadasciclinas, y quinasas dependientes de ciclinas.


Polimerasas de ADN eucarióticas

• No se sabe mucho sobre estas enzimas, pero almenos 5 han sido identificadas en mamíferos:– Polimerasa ' (alfa): nuclear, replicación del ADN,

sin función correctora.– Polimerasa ( (beta): nuclear, reparación del ADN,

sin función correctora.– Polimerasa ) (gamma): mitocondrial, replicación

del ADN, con función correctora.– Polimerasa * (delta): nuclear, replicación del ADN,

con función correctora.– Polimerasa + (epsilon): nuclear, reparación del ADN

(?),con función correctora.


Replicón eucariótico

• Cada cromosomaeucariótico es una doblecadena linear de ADN.

• Existen varios orígenes dereplicación (no simultáneos).

• La región de replicación sedenomina replicón o unidadde replicación.– El replicón se mueve de forma

más lenta que en procariotas.– Los fragmentos de Okazaki son

más pequeños (100-150 pb).


Orígenes de replicación

• En levaduras se han identificado secuenciasespecíficas que parecen conferir la habilidad dereplicación autónoma (secuencias de replicaciónautónoma o ARSs).

• Se cree que por lo menos algunas de estas secuenciascorresponden con orígenes de replicación.

• En eucariotas más complejos los orígenes dereplicación no están bien definidos.


• Al eliminar los cebadores de los extremos, los huecos no puedenser cebados por otros fragmentos => los cromosomas se acortaríaen cada ronda de replicación.

• Secuencias repetidas en tándem en los telómeros.• La telomerasa (transcriptasa reversa), que contiene proteínas y

ARN complementario a la repetición terminal, añade repeticionesen el extremo del cromosoma, rellenando el hueco dejado por elcebador.

• El resultado de la acción de la telomerasa es el alargamiento delcromosoma.

Replicación de los telómeros (I)


Replicación de los telómeros (II)


Ensamblaje del nuevo ADN ennucleosomas

• La replicación estácoordinada con laformación de nuevosnucleosomas.

• Se requiere la formaciónde nuevas histonas.

• Los nucleosomas seforman casi de formainmediata durante lareplicación.

Figura. Ensamblaje de nucleosomas.


Replicación del ADN mitocondrial

• Modelo del lazo de desplazamiento olazo D.

• Hélice ligera (L) y pesada (H).• Primero se inicia la replicación

unidireccional de la nueva hélice L.• Cuando se ha sintetizado, unos 2/3 de

la hélice L, comienza la síntesis de lanueva hélice H, en otro origen y enuna sola dirección, opuesta a la desíntesis de la hélice L.

Figura. Replicación del ADN mitocondrial

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Tema 7. Estructura y organizaci n del ADN - darwin.uvigo.esdarwin.uvigo.es/docencia/2005/genccmar05/7.ADN.2x1.pdfhereditario de algunos virus. 1957 Fraenkel-Conrat y Singer conÞrman