Genética molecular

ADN; estructura y función:http://www.hiru.com/biologia/la-duplicacion-del-adn

Replicación, transcripción y traducción.http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/dna-rna2.swfhttp://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swfhttp://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/translation.swf

Maduración de ARN en eucariotas:http://www.youtube.com/v/oBwO5LRi8wg?fs=1&hl=es_ES&rel=0

Regulación de la información genética:http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Operon/Operon.htm

Secuencia inicial

ATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTTATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTTATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTTATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTT

1- Obtén la secuencia reversa a partir de la secuencia de DNA.

TTCACGTTGTGGTGTTACAAGCGCGTACCAGGGGGTGGCGTGATGACTGACCCGGGATTCGACGAACTGACACGTCTAGTCTGCCCTACGTCATAAAAGTCGAACCATACCAGCGTGTATTCACGTTGTGGTGTTACAAGCGCGTACCAGGGGGTGGCGTGATGACTGACCCGGGATTCGACGAACTGACACGTCTAGTCTGCCCTACGTCATAAAAGTCGAACCATACCAGCGTGTATTCACGTTGTGGTGTTACAAGCGCGTACCAGGGGGTGGCGTGATGACTGACCCGGGATTCGACGAACTGACACGTCTAGTCTGCCCTACGTCATAAAAGTCGAACCATACCAGCGTGTATTCACGTTGTGGTGTTACAAGCGCGTACCAGGGGGTGGCGTGATGACTGACCCGGGATTCGACGAACTGACACGTCTAGTCTGCCCTACGTCATAAAAGTCGAACCATACCAGCGTGTA.

2- Obtén la secuencia complementaria a partir de la secuencia de DNA.

ATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTTATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTTATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTTATGTGCGACCATACCAAGCTGAAAATACTGCATCCCGTCTGATCTGCACAGTCAAGCAGCTTAGGGCCCAGTCAGTAGTGCGGTGGGGGACCATGCGCGAACATTGTGGTGTTGCACTT.

3- Haz el tránscrito de RNA a partir de la secuencia de DNA.

AUGUGCGACCAUACCAAGCUGAAAAUACUGCAUCCCGUCUGAUCUGCACAGUCAAGCAGCUUAGGGCCCAGUCAGUAGUGCGGUGGGGGACCAUGCGCGAACAUUGUGGUGUUGCACUUAUGUGCGACCAUACCAAGCUGAAAAUACUGCAUCCCGUCUGAUCUGCACAGUCAAGCAGCUUAGGGCCCAGUCAGUAGUGCGGUGGGGGACCAUGCGCGAACAUUGUGGUGUUGCACUUAUGUGCGACCAUACCAAGCUGAAAAUACUGCAUCCCGUCUGAUCUGCACAGUCAAGCAGCUUAGGGCCCAGUCAGUAGUGCGGUGGGGGACCAUGCGCGAACAUUGUGGUGUUGCACUUAUGUGCGACCAUACCAAGCUGAAAAUACUGCAUCCCGUCUGAUCUGCACAGUCAAGCAGCUUAGGGCCCAGUCAGUAGUGCGGUGGGGGACCAUGCGCGAACAUUGUGGUGUUGCACUU.

4- Obtén la estructura primaria de la proteína codificada; ¿cuántas soluciones posibles hay para la secuencia problema, y por qué?

No podemos saber si la cadena problema de DNA es la hebra codificante o la hebra complementaria, por tanto, ya tendremos dos cadenas de RNAm que pueden dar lugar a una proteína. Pero es que además, para cada una de las cadenas de RNA tendremos tres posibilidades, ya que la transcripción dependerá de dónde esté el inicio dentro del triplete (frame 1, frame 2, frame 3).

Si suponemos que la cadena codificante es la inicial, partiremos de la cadena de RNA de la pregunta 3. Y según donde esté el patrón de inicio, podremos tener:

Frame RF1:

MCDHTKLKILHPV*SAQSSSLGPSQ*CGGGPCANIVVLHLCATIPS*KYCIPSDLHSQAA*GPVSSAVGDHARTLWCCTYVRPYQAENTASRLICTVKQLRAQSVVRWGTMREHCGVALMCDHTKLKILHPV*SAQSSSLGPSQ*CGGGPCANIVVLH.

Frame RF2:

CATIPS*KYCIPSDLHSQAA*GPVSSAVGDHARTLWCCTYVRPYQAENTASRLICTVKQLRAQSVVRWGTMREHCGVALMCDHTKLKILHPV*SAQSSSLGPSQ*CGGGPCANIVVLHLCATIPS*KYCIPSDLHSQAA*GPVSSAVGDHARTLWCCT.

Frame RF3:

VRPYQAENTASRLICTVKQLRAQSVVRWGTMREHCGVALMCDHTKLKILHPV*SAQSSSLGPSQ*CGGGPCANIVVLHLCATIPS*KYCIPSDLHSQAA*GPVSSAVGDHARTLWCCTYVRPYQAENTASRLICTVKQLRAQSVVRWGTMREHCGVAL.

Si la cadena inicial de DNA es la hebra acompañante, tendríamos que obtener la reversa complementaria para obtener la hebra codificante. Y es a partir de ésta, la que se traduce y transcribe para obtener tres nuevas pautas de lectura.

AGTGCAACACCACAATGTTCGCGCATGGTCCCCCACCGCACTACTGACTGGGCCCTAAGCTGCTTGACTGTGCAGATCAGACGGGATGCAGTATTTTCAGCTTGGTATGGTCGCACATAAGTGCAACACCACAATGTTCGCGCATGGTCCCCCACCGCACTACTGACTGGGCCCTAAGCTGCTTGACTGTGCAGATCAGACGGGATGCAGTATTTTCAGCTTGGTATGGTCGCACATAAGTGCAACACCACAATGTTCGCGCATGGTCCCCCACCGCACTACTGACTGGGCCCTAAGCTGCTTGACTGTGCAGATCAGACGGGATGCAGTATTTTCAGCTTGGTATGGTCGCACATAAGTGCAACACCACAATGTTCGCGCATGGTCCCCCACCGCACTACTGACTGGGCCCTAAGCTGCTTGACTGTGCAGATCAGACGGGATGCAGTATTTTCAGCTTGGTATGGTCGCACAT La cadena de RNAm será entonces:

AGUGCAACACCACAAUGUUCGCGCAUGGUCCCCCACCGCACUACUGACUGGGCCCUAAGCUGCUUGACUGUGCAGAUCAGACGGGAUGCAGUAUUUUCAGCUUGGUAUGGUCGCACAUAAGUGCAACACCACAAUGUUCGCGCAUGGUCCCCCACCGCACUACUGACUGGGCCCUAAGCUGCUUGACUGUGCAGAUCAGACGGGAUGCAGUAUUUUCAGCUUGGUAUGGUCGCACAUAAGUGCAACACCACAAUGUUCGCGCAUGGUCCCCCACCGCACUACUGACUGGGCCCUAAGCUGCUUGACUGUGCAGAUCAGACGGGAUGCAGUAUUUUCAGCUUGGUAUGGUCGCACAUAAGUGCAACACCACAAUGUUCGCGCAUGGUCCCCCACCGCACUACUGACUGGGCCCUAAGCUGCUUGACUGUGCAGAUCAGACGGGAUGCAGUAUUUUCAGCUUGGUAUGGUCGCACAU.

quedando el tránscrito como:

Frame RF1:

SATPQCSRMVPHRTTDWALSCLTVQIRRDAVFSAWYGRT*VQHHNVRAWSPTALLTGP*AA*LCRSDGMQYFQLGMVAHKCNTTMFAHGPPPHY*LGPKLLDCADQTGCSIFSLVWSHISATPQCSRMVPHRTTDWALSCLTVQIRRDAVFSAWYGRT

Frame RF2:

VQHHNVRAWSPTALLTGP*AA*LCRSDGMQYFQLGMVAHKCNTTMFAHGPPPHY*LGPKLLDCADQTGCSIFSLVWSHISATPQCSRMVPHRTTDWALSCLTVQIR

RDAVFSAWYGRT*VQHHNVRAWSPTALLTGP*AA*LCRSDGMQYFQLGMVAH.

Frame RF3:

CNTTMFAHGPPPHY*LGPKLLDCADQTGCSIFSLVWSHISATPQCSRMVPHRTTDWALSCLTVQIRRDAVFSAWYGRT*VQHHNVRAWSPTALLTGP*AA*LCRSDGMQYFQLGMVAHKCNTTMFAHGPPPHY*LGPKLLDCADQTGCSIFSLVWSH.

5- Estadísticas de secuencias.

Porcentaje de nucleótidos: 112 nucleótidos de Adenina (23,52%); 120 nucleótidos de Citosina (25,21%); 136 nucleótidos de Guanina (28,57%) y 108 nucleótidos de Timidina (22,68%).

Porcentaje de dímeros (parejas de bases diferentes): AA 24 dímeros (5,04%); AC 28 dímeros (5,88%); AG 32 dímeros (6,72%); AT 28 dímeros (5,88%); CA 48 dímeros (10,08%); CC 28 dímeros (5,88%); CG 20 dímeros (4,2%); CT 24 dímeros (5,04%); GA 20 dímeros (4,2%); GC 44 dímeros (9,24%); GG 32 dímeros (6,72%); GT 40 dímeros (8,4%); TA 19 dímeros (3,99%); TC 20 dímeros (4,2%); TG 52 dímeros (10,92%); TT 16 dímeros (3,36%).

Porcentaje de tripletes (codones): AAA 8 tripletes (1,68%); AAC 4 tripletes (0,84%); AAG 8 tripletes (1,68%); AAT 4 tripletes (0,84%); ACA 8 tripletes (1,68%);ACC 12 tripletes (2,52%); ACT 8 tripletes (1,68%); AGC 12 tripletes (2,52%); AGG 4 tripletes (0,84%); AGT 16 tripletes (3,36%); ATA 8 tripletes (1,68%); ATC 8 tripletes (1,68%); ATG 8 tripletes (1,68%); ATT 4 tripletes (0,84%); CAA 8 tripletes (1,68%); CAC 8 tripletes (1,68%); CAG 16 tripletes (3,36%); CAT 16 tripletes (3,36%); CCA 16 tripletes (3,36%); CCC 8 tripletes (1,68%); CCG 4 tripletes (0,84%); CGA 8 tripletes (1,68%); CGC 4 tripletes (0,84%); CGG 4 tripletes (0,84%); CGT 4 tripletes (0,84%); CTG 16 tripletes (3,36%); CTT 8 tripletes (1,68%); GAA 8 tripletes (1,68%); GAC 8 tripletes (1,68%); GAT 4 tripletes (0,84%); GCA 16 tripletes (3,36%); GCC 4 tripletes (0,84%); GCG 16 tripletes (3,36%); GCT 8 tripletes (1,68%); GGA 4 tripletes (0,84%); GGC 4 tripletes (0,84%); GGG 16 tripletes (3,36%); GGT 8 tripletes (1,68%); GTA 4 tripletes (0,84%); GTC 12 tripletes (2,52%); GTG 20 tripletes (4,2%); GTT 4 tripletes (0,84%); TAC 8 tripletes (1,68%); TAG 8 tripletes (1,68%); TAT 3 tripletes (0,63%); TCA 8 tripletes (1,68%); TCC 4 tripletes (0,84%); TCT 8 tripletes (1,68%); TGA 8 tripletes (1,68%); TGC 24 tripletes (5,04%); TGG 8 tripletes (1,68%); TGT 12 tripletes (2,52%); TTA 7 tripletes (1,47%); TTG 8 tripletes (1,68%).

6- Indica la dirección de Internet de donde obtuviste la información.

http://personales.upv.es/jcanizar/bioinformatica/introduccion/introduccion.htmlhttp://au.expasy.org/tools/dna.html

Problemas diversos:http://www.biologia.arizona.edu/molecular_bio/problem_sets/nucleic_acids/nucleic_acids_1.html

ADN recombinante

ADN recombinante:http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologia-del-adn-recombinante/que_es_la_tecnologia_del_adn_r.php

1- Localiza las secuencias palindrómicas de corte de las enzimas EcoRI (GAATTC/CTTAAG), Hindi (AAGCTT/TTCGAA) y PstI (CTGCAG/GACGTC); ¿cuántos fragmentos se espera que produzcan los ataques sobre el genoma completo del fago lambda con cada uno de los enzimas?

EcoRI: 6 fragmentos.Hind III: 7 fragmentos.Pst I: 30 fragmentos.

2- ¿Cuántos pares de bases tiene cada uno de esos fragmentos?

EcoRI:

f1: 21226 f2: 4878 f3: 5643 f4: 7421 f5: 5804f6: 3530 -

Hind III:

f1: 23130 f2: 2027 f3: 2322 f4: 9416 f5: 564f6: 6682 f7: 4361 -

PstI:

f1: 2560 f2: 264 f3: 805 f4: 15 f5: 216f6: 514 f7: 339 f8: 200 f9: 211 f10: 94f12: 468 f12: 2838 f13: 1093 f14: 164 f15: 1986f16: 72 f17: 2459 f18: 87 f19: 1700 f20: 150f21: 1159 f22: 2443 F23: 448 f24: 2140 f25: 4507f26: 5077 f27: 248 f28: 2749 f29: 11505 F30:

3- Describe el aspecto macroscópico del ADN en disolución; ¿es visible? Si hay diferencias entre ambas observaciones, ¿a qué puede ser debido?.

El aspecto macroscópico del ADN es de líquido transparente incoloro. No aprecio nada más.

4- Completa la tabla.

Tubo Lambda Tampón Pstl EcoRI HindIII

P 4 μL 5 μL 1 μL - -E 4 μL 5 μL - 1 μL -H 4 μL 5 μL - - 1 μLL 4 μL 6 μL - - -

5- ¿En qué tubos piensas que no habrá cambios, que no se producirán fragmentos de restricción de ADN?

En el tubo L, en el que no tenemos ningún enzima de restricción.

6- Compara el tubo P y el tubo L, qué pensas que pasará en el tubo P comparado con el tubo L?

En el tubo P, que hay enzima de restricción, se producirán fragmentos de restricción de ADN (aunq no se aprecia en la imagen, se obtienen 29 fragmentos). Estos fragmentos no se aprecian para el tubo L.

7- Si el ADN apareciera fragmentado al final del tubo L, ¿quéconclusión sacariamos?

Que se ha producido contaminación.

8- Indica el ordenamiento relativo del ADN en el gel según su tamaño,

y razónalo.

El orden relativo según tamaño estará definido por el número de pares de bases en cada fragmento; de este modo, aquellos fragmentos con mayor número de pares de bases quedarán más retenidos. Es por ello que en la imagen podemos apreciar que la primera línea que se aprecia se corresponde con el primer fragmento de H (pb=23130), luego la línea del tubo E (pb=21226) y finalmente la línea del tubo P (Pb=2560).

9- Si tuviéramos 50 pequeños trozos da cada fragmento, ¿cuántasç

bandas aparecerían?

Se apreciarán tantas bandas como fragmentos diferentes tengamos; por tanto, al partir de 4 fragmentos, tendremos cuatro bandas.

10- Completa la tabla.

M M L L PstI PstI EcoRI EcoRI HindIII HindIIImm pb mm pb mm pb mm pb mm pb

Banda 1 16 21130 21 7033 21 31804 20 20358 20 30358

Banda 2 17 9416 - - 23 16603 19 14955 18 12643

Banda 3 20 6557 - - 35,5 12458 22 9508 20 8852

Banda 4 23,5 4361 - - - - - - 18,5 5752

Banda 5 29 2322 - - - - - - - -

Banda 6 31 2027 - - - - - - - -

Se ha hecho con la lectura del gel correspondiente a S.

11- Cómo haces para volver visible el ADN migrado en un gel de

agarosa.

La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel  y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta.

12- Indica la utilidad del tampón de carga y de la tinción Fast Blast.

La utilidad del tampón de carga es la de facilitar el pinchazo de las muestras en cada uno de los pozillos, así como facilitar la lectura posterior de los resultados.

RESPUESTAS.

Guía de respostas

Lección 1. Enzimas de restricción. Un par de cuestións traballando cos datos das bases de datos moleculares.

Accede á páxina do NCBI coa secuencia completa do fago lambda: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/215104) e contesta ás seguintes preguntas:

1. Localiza as secuencias palíndromicas de corte das enzimas EcoRI (GAATTC/CTTAAG), HindIII (AAGCTT/TTCGAA) e PstI (CTGCAG/GACGTC). Cantos fragmentos se espera que produzan os ataques sobre o xenoma completo do fago lambda con cada un deses enzimas?Os resultados se presentan nunha táboa na seguinte ligazón: http://goo.gl/7oCri.Para cada secuencia de corte, á paxina devolve as posicións dentro da secuencia do xenoma completo do seguinte modo:

Neste exemplo, o punto de corte número 10 dun total de 28 para a secuencia de corte da enzima PstI (CTGCAG), comeza no par de bases da posición 5214 e remata na 5219 (a referencia J02459 é o número de acceso correspondente ó xenoma do fago lambda na páxina web da NCBI, observa que é o mesmo en tódolos resultados deste exercicio). Construindo unha sinxela folla de cálculo podemos obter o número de pares de bases de cada fragmento. Para os últimos fragmentos cómpre ter en conta que a secuencia completa do xenoma do fago lambda contén un total de 48502pb (dato que tamén proporciona a páxina indicada no enunciado).

2. Cantos pares de bases ten cada un deses fragmentos? Se non es quen de resolver esta pregunta na páxina do NCBI, podes usar o geneboy (http://www.dnai.org/geneboy/) para resolver esta cuestión.Podes atopar os resultados na táboa á que se fai referencia na resposta anterior: http://goo.gl/7oCri.

Unhas cuestións sobre o realizado no laboratorio.

1. Describe o aspecto macroscópico do ADN en disolución. É visible o ADN? (Podes tomar como referencia para comparar o que viches na práctica “xenética a domicilio”). Se pensas que hai algunha diferencia entre as dúas observacións, a que se pode deber?O ADN non é visible nesta práctica. A disolución que contén o ADN é totalmente transparente. A diferencia coa práctica “xenética a domicilio” é a cantidade de ADN, que neste caso é moito menor.

2. Enche a táboa seguinte cos volumes usados na práctica.

TuboLambdaTampónPstIEcoRIHindIII

P 4μL 5μL 1μL

E 4μL 5μL 1μL

H 4μL 5μL 1μL

L 4μL 5μL1. En que tubo pensas que non vai a haber cambios, que non se van a producir

fragmentos de restricción do ADN?No tubo no que non se introduce nengunha enzima de restricción, o tubo L.

2. Compara o tubo P e o tubo L, qué pensas que pasará no tubo P comparado co tubo L? Xustifica a resposta.No tubo P terá lugar unha dixestión enzimática do

ADN do fago lambda. O resultado será a formación dun número determinado de fragmentos por cada molécula completa de ADN orixinal.

3. Se o ADN aparecese fragmentado ó final da reacció no tubo L, que teríamos que concluir?O máis probable é que se producira unha contaminación a partires de algunha punta de pipeta e que chegaran a ese tubo algunha enzimas de restricción. Outra posibilidade è que a contaminación proveña do propio operario por non usares luvas ou por utilizares instrumental non axeitado; deste modo é doado transmitir ADN-asas que poderían ter fragmentado o ADN.  

Lección 2. Electroforese en xel de agarosa

1. Indica cal será o ordenamento relativo dos fragmentos de ADN segundo o seu tamaño, dentro do xel de agarosa. Indica cal é a causa de ese ordenamento.Os máis grandes, con máis pares de bases, desprázanse máis lonxe das pozas do xel, mentres os máis pequenos quedan máis preto. Os fragmentos máis grandes teñen máis problema para se desprazar a través da matriz do xel, que ofrece máis resistencia, mentres que os máis pequenos poden facelo de xeito tanto máis doado canto menores son.

2. Supoñendo que tiveramos 500 pequenos anacos de cada un dos catro fragmentos logo dun tratamento con enzimas de restricción, cantas bandas aparecerían no xel de agarosa?Non importa o número de fragmentos, mentres teñan o mesmo tamaño hanse desprazar xuntos dando lugar a unha única banda no xel. Se hai 500 anacos de cada un dos catro tamaños diferentes de fragmentos resultantes dunha dixestión enzimática, aparecerán catro bandas.

3. Enche a seguinte táboa cos datos obtidos na práctica:Variable segundo a imaxe usada (en todo caso, poden servir coma exemplo os datos proporcionados nos resultados de referencia xa publicados. Máis que as distancias en sí mesmas, o interesante é observar se hai coincidencia entre o observado no laboratorio e o esperado en función da análise bioinformática (cuestións 1 e 2 da lección 1). No caso de qwue non sexa así, por exemplo nos datos obtidos a partires da dixestión con PstI (agardábamos observar 29 bandas), hai que pensar que os tamaños dos fragmentos máis pequenos son tan reducidos que precisariamos unha cantidade moito maior de mostra para observalos, ademáis de que a tinción FastBlast tampouco é a mellor, probablemente veríamos máis bandas usando bromuro de etidio.

M ML L PstIPstIEcoRIEcoRIHindIIIHindIII

mmpbmmpbmmpb mm pb mm pb

Banda 1

Banda 2

Banda 3

Banda 4

Banda 5

Banda 6

mm= distancia en mm; pb= número de pares de bases do fragmento

Lección 3. Cómo se fai para converter en visible o ADN migrado nun xel de agarosa.

1. Indica a utilidade do tampón de carga e da tinción Fast Blast.O tampón de carga permite observar a mostra no momento de pinchala nas pozas do xel de agarosa e tamén observar a fronte de avance durante a migración electroforética. Pola contra, a tinción FastBlast á que se somete o xel logo da migración serve para tinguir o ADN e facer visibles as diferentes bandas no xel.

2. Outro tipo de tinción usado é o Bromuro de etidio. Indica as principais diferencias en comparanza co Fast Blast.O bromuro de etidio fai visibles as bandas baixo luz UV, non con luz visible. Na outra man, a capacidade de observar bandas de baixa concentración de mostra é moito maior co bromuro de etidio que co Fast Blast. Por último, a peligrosidade do bromuro de etidio é ben coñecida polo seu carácter canceríxeno e teratoxénico.

Pregunta 1. Crea una tabla para exponer las observaciones de los resultados de la práctica de transformación bacteriana de E.coli.

Placa Resultado+ DNA LB / amp Colonias blancas

LB / amp / ara Colonias verdes fluorescentes- DNA LB / amp Sin crecimiento

LB Crecimiento bacteriano

Pregunta 2. Interpreta los resultados en cada placa; ¿por qué se produce o no el crecimiento en cada caso?

LB/ amp: el plásmido tiene resistencia a la ampicilina; por tanto, hay crecimiento.

LB/amp/ara: igual que el caso anterior; además la arabinosa activa el gen GPF que da la fluorescencia.

LB/amp: no hay plásmido, no hay resistencia a la ampicilina, y por tanto no hay crecimiento.

LB: hay crecimiento porque no hay nada que lo impida; no se produce fluorescencia porque no hay plásmido.

Pregunta 3. ¿Cuál es la función del plásmido?

Se utiliza para ver el proceso de transferencia de un gen desde un organismo a otro, introduciéndose en la bacteria E.Coli.

Pregunta 4. ¿Cuál es el interés de la incorporación de la ampicilina en el medio de cultivo?

Porque solo interesa que crezca la bacteria con el plásmido incorporado, el cual es resistente al antibiótico.

Pregunta 5. Función de la arabinosa incorporada en la placa LB/amp/ara.

El plásmido pGLO contiene el gen para la síntesis de la proteína GFP, el cual puede activarse en las células transformadas simplemente añadiendo arabinosa al medio de cultivo. Es esa la función en la placa de LB/amp/ara.

RESPUESTAS:

Sobre a transformación bacteriana de E.coli HB101 co plásmido pGLO

Enfocando o tema

1. Para transformar xenéticamente un individuo completo, temos que introducir o novo xen en cada célula do organismos ou, cando menos, en cada unha das células encargadas de expresar ese xen. Segundo isto, que tipo de organismo é optimo para unha trnasformación total?

Un organismos unicelular é o mellor receptor posible para unha transformación xenética, porque a transferencia só ten que se producir nunha célula.

2. Unha cuestión importante é poder saber se un organismo transformado pode trasmitir as súas novas características xenéticas á súa descendencia e ás xeracións futuras. Para conseguir esta información, que característica ha de ter un bo candidato a investigar?

Ten que ser un organismo que se reproduza rápidamente. Unha rápida producción de descendencia e, mellor aínda, con unha proxenie numerosa, permite observar axiña se o carácter é transmitido ou non.

3. A seguridade é outro factor importante a considerar na elección dun organismo experimental. Que características ha de ter (ou non ter) un organismo para asegurarmos que non mancará ás persoas ou ó medio ambiente?

O organismo non debe producir toxinas ou compostos que poidan mancar ós seres humanos. Tería que medrar de xeito vigoroso nas condición do laboratorio, pero non ser quen de sobrevivir fora do mesmo. Tampouco ten que infectar plantas ou animais (non pode chegar á cadea alimenticia).

4. Sobre a base destas consideracións, cal é a mellor elección para unha transformación xenética: unha bacteria, un verme (anélido, platelminto, nematodo, ...), un peixe ou un rato?

A bacteria é sen dúbida o mellor hóspede. A bacteria é pequena, unicelular e a súa reproducción é rápida e doada.

NOTA: A bacteria Escherichia coli en xeral, e a cepa HB101 en particular, cumpre tódolos requisitos anteriores; é unicelular como calquera bacteria, o seu tempo de duplicación é de 20 minutos, non produce danos en humanos sans e non medra de xeito doado fora do ambiente do laboratorio cando se adoptan as precaucións básicas.

Outras consideracións

1. Lembremos que o obxectivo da transformación é un cambio nas características do organismo (fenotipo). Antes da observación dos cambios fenotípicos, evidentemente, temos que observar o fenotipo salvaxe, punto imprescindible de comparación. Na nosa práctica, ese punto ven dado polo aspecto colonial nas placas de partida.

As características nas que temos que poñer atención son o color das colonias, o número das mesmas e a súa distribución sobre o agar.

2. Cómo se pode facer para saber como afecta a ampicilina á bacteria E. coli?

Podemos inocular cantidades iguais de células de E.coli en dúas placas de agar nutritivo LB, una delas só con Agar LB e outra con Agar LB suplementado con ampicilina. O crecemento de E.coli sobre as dúas placas pode ser comparado. Se a ampicilina afecta negativamente ó crecemento das bacterias, na placa correspondente haberá menos colonias. Se a ampicilina non afecta ó crecemento, o número de colonias (ou a supercicie na que se observa crecemento) serán semellantes en ámbalas dúas placas.

Os antibióticos adoitan matar bacterias (axentes bactericidas) ou inhibir o seu crecemento (axentes bacteriostáticos). Así, atoparanse poucas, ou nengunha, colonias na placa que contén agar LB + ampicilina. A presenza de crecemento nesa placa pódese explicar pola presenza de bacterias resistentes á ampicilina.

Cuestións de revisión

1. En cal das placas agardamos atopar bacterias máis semellantes ás E.coli non transformadas inicialmente observadas?

As bacterias semellantes ás E.coli non transformadas atoparanse na placa -pGLO, LB. Estas bacterias foron transferidas desde a placa de inicio, sen que se lles engadira plásmido e foron inoculadas sobre a placa co medio LB (sen ampicilina e sen arabinosa). Deste xeito, son virtualmente idénticas as bacterias non transformadas do cultivo de partida.

2. Se ten lugar o proceso de transformación xenética, en que placas é máis doado atopalas?

Nas placas LB/amp e LB/amp/ara. As células xenéticamente transformadas tomaron ó plásmido pGLO que expresa o xen da resistencia á ampicilina o que permite que esas bacterias sexan quen de medrar en placas nas que está presente ese antibiótico.

3. Que placas se teñen que comparar para determinar se efectivamente tivo lugar a transformación xenética?

A placa -pGLO, LB/amp e a placa +pGLO, LB/amp poden ser comparadas de xeito directo. As células que non foron tratadas con ADN (-pGLO) non expresan o xen da resitencia á ampicilina e non medran nas placas LB/amp. As células tratadas con ADN (+pGLO) conteñen o plásmido e expresan ese xen polo que, nesa placa, aparecen colonias das bacterias transformadas.

4. Que podemos saber coa placa de control?

Unha placa de control é unha axuda na interpretación dos resultados experimentais. Nesta práctica, as placas -pGLO son placas de control. A placa -pGLO, LB/amp compárase coa placa +pGLO, LB/amp. Esta comparación permite demostrar que as bacterias froito do proceso de transformación poden medrar nun medio con ampicilina, debido á incorporación no seu xenoma do plásmido pGLO e á expresión do xen da resistencia á ampicilina. A placa de control -pGLO, LB pode ser comparada con calquera das placas LB/amp para amosar que o plásmido incorporado é preciso para o crecemento en presencia de ampicilina. A placa -pGLO, LB/amp amosa que o cultivo de inicio non medra sobre medio con ampicilina. Sin este control non seríamos quen de saber se as colonias que medran sobre o medio +pGLO, LB/amp son transformadas ou non.

Expresión de resultados

A tabla de resultados debería asemellarse á seguinte:

Placa Observacións

+pGLO, LB/amp [~#] Múltiples colonias de bacterias transformadas de coloración blanquecina.

+pGLO, LB/amp/ara [~#] Múltiples colonias de bacterias transformadas. Coloración blanquecina baixo luz de día e verdes brilante baixo luz UV.

-pGLO, LB/amp Non debería apreciarse crecemento bacteriano.

-pGLO, LB Crecemento abundante bacteriano, incontable número de colonias. Coloración blanquecina. Probablemente as colonias teñen un diámetro moito menor que nas placas +pGLO pola limitación de recursos que supón o maior crecemento.

Interpretación dos resultados

1. ¿Que caracteres dos orixinalmente observados na morfoloxía colonial da placa de inicio semellan no ter cambiado?

As colonias do cultivo inicial eran tamén blanquecinas observadas baixo luz de día.

2. ¿Que caracteres dos orixinalmente observados é agora, despois do proceso de transformación, significativamente diferente?

As colonias aparecidas sobre o medio LB/amp/ara son de cor verde brilante cando son observadas baixo luz UV.

As colonias tranformadas (+pGLO) son quen de medrar sobre medio con ampicilina (son resistentes).

3. Se as células xenéticamente transformadas adquiriron a habilidade de medrar en presenza de ampicilina, que podemos inferir dos outros xenes presentes no plásmido relacionados co proceso de transformación?

O plásmido pode expresar o xen para a resistencia á ampicilina (a proteína producto do xen 'bla' que codifica a ß-lactamasa, a proteína que cataliza a ruptura da molécula ampicilina).

Mapa xenómico do plásmido pGLOusado na práctica.

Atopado na procura de imaxes de Google usando a cadea

alfanumérica "pglo" como motivo de procura

Os plásmidos son pequenas moléculas de ADN circular que se atopan dentro das células bacterianas. Replican o seu propio ADN usando as polimerasas celulares. Deste xeito poden permanecer indefinidamente dentro das células facendo pouco más que o traballo de seu.

Debido ó seu pequeno tamaño poden ser extraídos de forma doada e purificadas a partires das células bacterianas. E cando se rompen usando enzimas de restricción, poden xuntarse con outro ADN de distintas fontes que foron fragmentados coas mesmas enzimas.

O resultado son moléculas híbridas de ADN que se poden reintroducir en células bacterianas para procesos de transformación. Así, eses plásmidos híbridos pódense manter en cultivos bacterianos puros. Decimos que o ADN orixinal das células hóspede foi clonado e ó plásmido portador do ADN estraño, chamámolo vehículo clónico ou, máis normalmente, vector.

Ademáis da súa utilidade para clonar xenes, ás veces os plásmidos portan xenes de seu. As bacterias son susceptibles ós antibióticos. Con todo, os xenes que codifican resistencia antibiótica permiten ás bacterias medrar en medios nos que están presentes antibióticos coma a ampicilina. Este tipo de xen adoita estar presente nos plásmidos. Cando un ADN insértase nun plásmido, e estos híbridos se introducen nas células bacterianas para inducir a tranformación xénica desas células, é doado seleccionar as bacterias que recibiron os plásmidos (porque esas células adquiriron a habilidade de medrar en presenza de antibiótico, mentres que as que non o recibiron non se desenvolven no mesmo medio de cultivo).

Librerías de ADN

Cando o ADN extráese dunha célula dada, pode ser cortada en pequenos anacos que se poden clonar en masa en poboacións de plásmidos. Este proceso produce poboacións de ADNs híbridos (recombinantes). Despois de introducir estes híbridos en células, cada

célula tranformada recibe, e é quen de propagar, un único tipo híbrido. Cada un dos tipos de híbrido contén o mesmo vector ADN pero un diferente ADN insertado.

Se por exemplo temos 1.000 fragmentos diferentes de ADN nunha mestura, formaranse 1.000 tipos de híbridos distintos e 1.000 tipos diferentes de células transformadas, cada una delas transportando un dos 1.000 fragmentos distintos de información xenética (ADN) orixinal. Unha colección deste tipo chámase librería de ADN. Se o ADN orixinal é de orixen humano, a librería sería tamén humana.

Podemos extraer un fragmento determinado da información contida nunha librería mediante rastreo da mesma usando técnicas das chamadas "de screening" (de cribado).

4. Como podemos probar que os cambios observados foron causados polo procedemento de transformacion?

A mellor forma é comparar as placas de control. As células non tratadas co plásmido (-pGLO) non poden medrar en presenza de ampicilina, mentres que as que foron tratadas (+pGLO) si poden facelo. Esto implica que a resistencia á ampicilina foi proporcionada polo tratamento, noutras palabras, o plásmido proporciona a resistencia.

5. Tendo en conta que a solución acuosa que contiña o plásmido, introducida no tubo +pGLO nun dos primeiros pasos do procedemento, non emite fluorescencia, que dous posibles orixes da fluorescencia poden ser descartados?

O plásmido pGLO (o ADN que o conforma) e a bacteria orixinal non son as causas directas da fluorescencia. Nin a solución de plásmido emite fluorescencia nin se observa esta característica nas colonias que medran nas placas -pGLO e +pGLO, LB/amp.A fonte da florescencia probablemente sexa algunha proteína codificada no ADN do plásmido. Para entender a causa da aparición de fluorescencia na placa +pGLO, LB/amp/ara, temos que ter en conta a estructura do xenoma do plásmido pGLO (imaxe anterior) e o funcionamento do operón arabinosa (imaxe seguinte):

Atopado na procura de imaxes de Google usando a cadea alfanumérica "operon arabinosa" como motivo de procura A regulación da expresión de proteínas adoita ocorrer a nivel de transcripción do ADN en ARN (aínda que non é a única alternativa). Esta regulación ten lugar nun lugar específico do ADN chamado promotor, lugar onde a ARN-polimerasa se xunta ó ADN e comeza a transcripción do xen. Nas bacterias, algúns xens relacionados, se sitúan xuntos e son transcritos a partires dun único promotor. Estos grupos, controlados por un único promotor, que pode á súa vez regulado, chámanse operóns.

Os tres xenes (araB, araA e araD) que codifican tres enzimas dixestivas relacionadas coa catálise da arabinosa están xuntos no chamado operón arabinosa. Estos xene que expresan as proteínas funcionais reciben o nome de "estructurais". A súa transcripción ten lugar a partires dun único promotor (PBAD). A transcripción destes tres xenes precisa a presenza, simultaneamente, do ADN molde (promotor e xenes estructurais), ARN polimerasa, unha proteína que se xunta ó ADN (chamada araC) e arabinosa. A proteína araC xúntase co ADN no sitio de unión da ARN-polimerasa, chamado promotor, situado xusto antes da posición dos xenes estructurais. Se no medio está presente a arabinosa, a bacteria a incorpora. Unha vez no interior celular, a arabinosa interactúa coa proteína araC unida ó ADN. A interacción provoca un cambio conformacional que

promove a unión da ARN-polimerasa de xeito que os xenes estructurais transcríbense. Como consecuencia, prodúcense as tres enzimas que rompen a arabinosa para que se incorpore ó catabolismo. En ausencia de arabinosa, a proteína araC regresa á súa conformación espacial orixinal e a transcripción cesa.

O ADN do plásmido pGLO foi alterado mediante enxeñería xenética para incorporar o sistema de regulamento do sistema operón araninosa. O promotor (PBAD) e o xen da proteína araC foron incorporados, mentres que os xens araB, araA e araD foron reemplazados polo xen único que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). Deste xeito, en presenza de arabinosa, a proteína araC promove a unión do ARN-pol e prodúcese GFP. En ausenza de arabinosa, a proteína C non facilita máis a xuntanza da AN-pol e a proteína GFT non se produce. Se non se produce GFP as colonias resultantes teñen o fenotipo salvaxe (cor blanquecino sen fluorescencia baixo UV).

6. Cómo se pode saber si o experimento de tranformación foi satisfactorio ou non?

O éxito experimental ven representado pola presenza de colonias nas dúas placas +pGLO (LB/amp e LB/amp/ara) e pola ausenza de colonias na placa -pGLO, LB/amp. Tamén, pola presenza de fluorescencia verde brilante nas colonias da placa +pGLO, LB/amp/ara.

Un experimento non exitoso pode ser un no que non medran colonias nas placas +pGLO. ISto pode ocurrir se non inoculamos o plásmido e/ou a bacteria no tubo +pGLO nos primeiro pasos do protocolo.

PURIFICACION PROTEICA

Fase de cultivo celular

Pregunta 1: Se hicieron dos cultivos, uno partiendo de una colonia no fluorescente, y otra fluorescente; ¿qué se trata de demostrar haciendo esto?

Se demuestra así la función de la arabinosa, que activa la síntesis de la proteína GFP.

Pregunta 2: ¿Qué papel cumplen en el proceso de clonación el iluminador UV, la estufa de incubación y la agitación mecánica antes y durante la incubación?

1. El iluminador se usa para seguir el rastro continuamente de las colonias fluorescentes (que lo son en longitudes de onda de UV).

2. La estufa de incubación, como tal, permite obtener mejores condiciones de incubación de las colonias bacterianas.

3. La agitación mecánica, se emplea para homogeneizar la muestra.

Pregunta 3: ¿Para que se hacen crecer las bacterias en caldo nutritivo previamente a hacer la purificación?

Para tener un crecimiento mayor de las bacterias.

Fase de concentración celular y lisis

Pregunta 1: Indica el papel en esta fase del protocolo de la ultracentrífuga, la lisozima y el congelador.

La ultracentrífuga sirve para precipitar todas las bacterias en suspensión, para poder decantar posteriormente. La lisozima sirve para la digestión enzimática de la pared bacteriana, mientras que el congelador se emplea para la rotura completa de la bacteria.

Pregunta 2: ¿Por qué eliminamos el sobrenadante después de la primera centrifugación?

Para tener una mayor concentración protéica.

Pregunta 3: ¿Cómo puede la congelación romper las membranas celulares?

Mediante la formación de cristales tras la digestión con la lisozima.

Pregunta 4: ¿Cuál es el propósito de lisar las bacterias?

Conseguir la extracción de la proteína que contiene la bacteria.

Pregunta 5: ¿Qué color tiene el concentrado celular? ¿Qué color debería tener el sobranadante? Interpreta los resultados.

El color del concentrado ha de ser fluorescente, pues es quien contiene el gen GPF, mientra sque el sobrenadante no presenta color (no se ha producido la lisis de las células).

Pregunta 6: ¿Por qué eliminamos el concentrado celular en esta fase del procedimiento?

Fase de cromatografía

Pregunta 1: Describe brevemente el proceso de cromatografía por interacción hidrofóbica. Relaciona la expliación con el caso concreto de purificación de esta práctica.

Este tipo de cromatografía separa las proteínas en base a su hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las biomoléculas a la superficie débilmente hidrofóbica de la resina en una solución fuertemente salina y su posterior elución mediante un gradiente salino negativo.

Pregunta 2: Cubre la siguiente tabla indicando las observaciones realizadas después de correr los tres tampones de cromatografía.

Tubo de recogida Predicción Observación bajo luz UV (columna e

tubo)

#1 Sin color Sin color / color verde

#2 Sin color Sin color / color verde

#3 Con color verde Color verde / sin color

Pregunta 3: Teniendo en cuenta los resultados, indica el papel de:

El tampón de equilibrado: estabilizar los cationes y aniones en la columna de intercambio catódico.

El tampón de unión: El tampón de lavado: arrastra los restos que quedan en la

columna. El tampón de elución (TE): ayuda en la elución de las proteínas.

Pregunta 4: ¿Qué tampones tienen concentración salina mayor y cual menor? ¿Qué se puede decir sobre el papel de la salinidad?

Los primeros tienen mayor concentración. La salinidad de la superficie hidrofóbica permite una mayor elución al disminuir la concentración de la sal en el tampón

RESPUESTAS

Purificación proteica por cromatografía[Guía de respostas]

Cultivo celular en horizontal para aumentar aireación. Cultivos con producción de GFP. Pellet celular con GFP. Cromatografía. GFP retida en columna HIC

  Fase de cultivo celular.

1. Fixeches dous cultivos, un partindo dunha colonia non fluorescente baixo luz UV e outro partindo dunha fluorescente. Que se trata de demostrar facendo isto?Ámbalas dúas placas contiñan colonias +pGLO. Xa que logo, o feito de que unhas colonias sexan fluorescentes e outras non débese a que as primeiras expresaron o xen da GFP e as segundas non. No novo medio no que se inoculan (caldo LB con ampicilina e arabinosa) asbacterias de ámbalas dúas colonias son quen de expresar o xen e producir a GFP.Isto demostra que as dúas conteñen o xen, pero unhas o expresan e outras non en función das caracterísiticas do medio no que se desenvolven.

2. Que papel cumplen no proceso de clonación o iluminador de UV, a estufa de incubación e a axitación mecánica antes ou durante a incubación?O iluminador UV pon de manifesto a presenza da GFP.A estufa incubadora proporciona as condicións térmicas axeitadas para un óptimo crecemento das bacterias.A axitación, ben sexa manual ou no incubador, proporciona unha óptima axitación e aireación dos cultivos bacterianos. O incremento de osíxeno aumenta a taxa de crecemento das bacterias. Por esta mesma razón, no caso de non dispor de estufa de cultivo con axitación, colócanse os tubos deitados para aumentar a superficie de intercambio gaseoso.

3. Para que se fan medrar as bacterias en caldo nutritivo previamente a facer a purificación? Non sería máis sinxelo tomar directamente as colonias da placa de agar?A razón é conseguir unha concentración elevada da proteína que pretendemos purificar. No cultivo en medio líquido obtemos unha gran cantidade de células, todas elas clónicas das que formaron a colonia (en última instancia dunha única UFC) e, polo tanto, productoras de GFP.

Fase de concentración celular e lise1. Indica o papel nesta fase do protocolo, da ultracentrífuga, a lisocima e o conxelador.

A ultracentrífuga illa as bacterias do medio de cultivo concentrándoas

nun precipitado ó que adóitase chamarlle «pellet».A lisocima (ou lisozima, do inglés lysozime) realiza unha dixestión enzimática da parede celular bacteriana, deixando desprotexida a membrana celular.O conxelador, a conxelación, causa a ruptura das membranas celulares. Isto fai que se libere o contido celular.

2. Porque eliminamos o sobrenadante logo da primeira centrifugación?Porque contén o medio de cultivo, pero non a proteína que pretendemos purificar. A GFP está no interior das células.

3. Como pode a conxelación, un dos principais procesos de conservación, romper ás membranas celulares?Hay dous mecanismos implicados. Por unha banda, nunha conxelación sen usar sustancias crioprotectoras, fórmanse cristais que poden danar as membranas; por outra, durante a conxelación, o contido citoplasmático aumenta de volume, o que xenera presións que a membrana non é quen de soportar porque, a temperaturas máis baixas, ten reducida tamén a súa fluidez.

4. Cal é o propósito de lisar as bacterias? A liberación da GFP. A proteína prodúcese no citoplasma pola expresión dos xenes plasmídicos. Precisamos tela liberada para poder purificala na columna de cromatografía.

5. Que cor ten o concentrado celular? Que color debería ter o sobrenadante? Interpreta estas observacións.O pellet tería que ter unha cor verde pálida ou branquecino e o sobrenadante tería que ser verde fluorescente. Isto implica que a proteína fluorescente foi liberada das bacterias.

6. Porque eliminamos o concentrado celular nesta fase do procedemento?O precipitado, nesta fase, contén restos celulares que non nos interesan no procedemento (fragmentos de paredes e membranas celulares, DNA cromosómico, ribosomas). Cando queda algo de GFP retida no mesmo, é unha cantidade despreciable.

Fase de cromatografía1. Describe brevemente o proceso de cromatografía por interacción hidrofóbica. Relaciona

a expliación co caso concreto de purificación desta práctica.A cromatografía de proteínas é unha técnica que permite a purificación ou separación de proteínas presentes nunha mestura na que están presentes outras moléculas (tamén proteínas distintas das desexadas). Nesta práctica se usa una columna de interacción hidrofóbica porque a superficie da GFP ten carácter hidrofóbico. Isto se debe, por suposto, as características das cadeas laterais dos aminoácidos que ocupan posicións superficiais na conformación global da proteína. Iso a diferencia doutras proteínas bacterianas e permite a súa separación.

2. Cubre a seguinte táboa indicando as observacións realizadas logo de correr os tres tampóns de cromatografía.

Tubo de recolleit

a

Predicción

Observación baixo luz

UV (columna e

tubo)

Obsérvese a banda fluorescente na parte superior da matriz

#1. Mostra

en tampón

de ligazón

a GFP é retida na matriz da columna

a GFP aparece como unha banda fluorescente na parte superior da columna(ver imaxe seguinte)

#2. Mostra

con tampón

de lavado

a GFP permanece retida na matriz da columna

a GFP permanece como unha banda na parte superior da columna (ver imaxe seguinte)

#3. Mostra

con tampón

de elución

a GFP é lavada da columna

a GFP descurre pola columna e aparece no tubo #3

1. Tendo en conta os resultados, indica o papel de: O tampón de equilibrado

Prepara a columna para a aplicación da GFP. Eleva a concentración salina da columna para que coincida coa que ten o lisado celular que contén a GFP.

O tampón de ligazón.Eleva a concentración salina da solución coa GFP para inducir un cambio de configuración na mesma o que provoca a exposición das rexións hidrofóbicas.

O tampón de lavadoVehiculiza a través da columna aquelas proteínas e outras moléculas que teñen carácter menos hidrofóbico, facendo que a columna só reteña a proteína desexada, a GFP.

O tampón de elución (TE)Modifica as caraterísticas salinas provocando de novo un cambio de configuración na GFP de xeito que as rexión hidrofóbicas non queden

expostas e, xa que logo, a proteína deixe de ser retida pola matriz da columna.

2.3. Que tampóns teñen concentración salina maior e cal menor? Que se pode decir sobre o

papel da salinidade?As solucións empregadas, de maior a menor concentración salina son: Tampón de ligazón >> Tampón de equilibrado >> Tampón de lavado >> Tampón de eluciónO tampón de ligazón ten a maior concentración salina, precisa para elevar a concentración do lisado que contén a GFP. Os restos proteícos hidrofóbicos quedan expostos en estas condicións. A menor concentración corresponde ó tampón TE para provocar a elución da GFP xa que, ó baixar a concentración salina, os restos hidrofóbicos reoriéntanse cara o interior da molécula quedando expostas as rexións hidrofílicas.

4. O resultado da práctica foi exitoso? Xustifica a resposta en base os datos experimentais.

Consideramos que acadamos un resultado exitoso na purificación da GFP, si aparece fluorescencia no tubo #3 e non parece na columna de cromatografía.Se a fluorescencia permanece na columna, pode ser que se producise algún erro no uso das dilucións, que a salinidade foi elevada en tódalas dilucións usadas. Tamén houbo erros nas dilucións no caso de que a fluorescencia apareza nos tubos #1 ou #2 e desapareza da columna nun deses pasos.A aparición de pouca fluorescencia no tubo de recollida da elución (ver imaxe seguinte) é debida á unha baixa concentración celular no tubo centrifugado inicialmente.

LECCIÓN 1

1. ¿Por qué se hace preciso la acción de un quelante sobre los iones metálicos de una muestra durante el paso de lisis en ebullición a 100ºC?¿Qué pasaría si no se usa un agente quelante como la matriz InstaGene?

Impiden la ruptura o degradación del ADN al atrapar los iones metálicos que catalizan la ruptura de la hebra de ADN sometida a elevadas temperaturas en condiciones de baja fuerza iónica, de manera que luego podamos estudiar la molécula en condiciones óptimas.Si no usamos un quelante, se produciría la roptura del ADN por lugares que no nos interesan.

2. ¿Qué parte de las células se precisa para hacer PCR?

Los cromosomas presentes en el núcleo de la célula.

3. ¿Qué estructuras necesitamos romper para liberar el ADN celular?

Puesto que está en el núcleo, será necesario romper las membranas que envuelven tanto a la célula como al núcleo.

4. ¿Por qué piensas que hay que mantener el ADN junto con la matriz InstaGene después de hervir las muestras?

Para liberar el DNA para posteriores usos.

LECCIÓN 2

1. ¿Por qué es preciso un cebador para cada una de las cadenas del segmento de ADN a amplificar?

Se necesitan dos para la reacción de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra. Son de aproximadamente 20 nucleótidos, porque es la cantidad necesaria para que de manera probable coincida en un sitio de la cadena de ADN.

2. ¿Por qué el Taq ADN-polimerasa se llama así?

Proviene de la bacteria thermus aquaticus, que es termófila, en especial a 72ºC, teniendo un vida de 40 minutos a 94ºC. Esto hace que sea muy utilizada para los ciclos de temperatura de la PCR.

3. ¿Por qué hay nucleótidos en la master-mix? Cita el resto de componentes de la master-mix e indica la función de cada uno de ellos.

Porque son necesarios tanto como cebadores / iniciadores, como para polimerizar el nuevo ADN (dNTP). El resto de componentes es el tampón (mantener el pH) y cloruro de magnesio (actúan como cofactores de la polimerasa)

4. Describe los tres pasos principales de cada ciclo de amplificación por PCR e indica a qué temperaturas ocurre cada un de ellos.

Desnaturalización a 94ºC(se separan las dos hebras de las cuales está constituido).

Alineamiento a 60ºC (cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde).

Extensión a 72ºC (La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente).

5. Explica porqué la longitud precisa del ADN diana no es amplificada hasta el tercer ciclo. Puedes hacerlo apoyándote en un esquema gráfico o dibujo.

Porque es en la tercera etapa de ampliación cuando la cadena molde de DNA tiene la longitud adecuada para hacer la cadena complementaria.

LECCIÓN 3

1. ¿Cuál es la diferencia entre un intrón y un exón?

Un intrón es una región del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN, a diferencia de los exones que son regiones que codifican para una determinada proteína. Por tanto, el intrón no contiene la información genética.

2. ¿Por qué los dos posibles productos de la PCR difieren en 300pb?

Debido a la presencia / ausencia de secuencias ALU, de unos 300 pares de bases.

3. ¿Por qué los fragmentos más pequeños se desplazan más lejos en la electroforesis?

Por el peso de los componentes, desplazándose más el que menor peso posea.

4. ¿Qué controles se usan en este experimento? Cuál es la importancia de usarlos? ¿Podrían haberse usados otros?

Se han empleado controles de homocigotos con presencia en ambos cromosomas del a secuencia ALU, con ausencia en ambos; y heterocigotos (presencia en un cromosoma, y ausencia en el otro). Y se deben usar porque serán los referentes, y los posibles resultados de nuestra práctica.

LECCIÓN 4

En la siguiente imagen se muestra el resultado de la electroforesis realizada en el laboratorio con las muestras del grupo LACC2.

1. ¿Cuál es tu genotipo para la inserción ALU en la región PV92 de tu cromosoma 16?

Mi pocillo es el número 17, lo cual indica homocigoto con ausencia de ALU.

2. ¿Cuáles son las frecuencias genotípicas de los homocigotos (+/+), homocigotos (-/-) e heterocigotos (+/-) en el grupo LACC2? Cubre la siguiente tabla con los resultados:

Genotipo Número FrecuenciaHomocigotos (+/+) 2 0,18 = 18%Homocigotos (-/-) 8 0,73 = 73%

Heterocigotos (+/-) 1 0,09 = 9%Total 11 100%

3. ¿Cuál es la secuencia de alelos en el grupo?

Alelo Número FrecuenciaAlelos (+) 5 p = 0,227Alelos (-) 17 q = 0,773

Total 22 -

4. En la siguiente tabla están los mismos datos para una muestra aleatoria de una población determinada; calcula las frecuencias alélicas para esa población:

Genotipo Número FrecuenciaHomocigotos (+/+) 2422 0,24 = 24%Homocigotos (-/-) 2050 0,21 = 21%

Heterocigotos (+/-) 5528 0,55 = 55%Total 10000 100%

Alelo Número FrecuenciaAlelos (+) 10372 p = 0,52Alelos (-) 9628 q = 0,48

Total 20000 -

5. Comparando los datos de LACC2 con los de la población del ejemplo anterior, ¿piensas que tenían que coincidir? ¿A que piensas que se pueden atribuir las diferencias o semejanzas?

No, no tienen porqué coincidir, pues se tratan de individuos diferentes. Las diferencias o semejanzas son cuestiones de azar.

6. Usando los valores ‘p’ y ‘q’ obtenidos en la cuestión 3, calcula p2, 2pq y q2. Si el resultado fuera el mismo que los que obtuviste en la cuestión 2, la población LACC2 se diría que está en equilibrio genético de Hardy-Weinberg. En otro caso, si las frecuencias genotípicas son distintas, ¿a qué piensas que se puede deber la diferencia?

p2 = 0,05 q2 = 0,60 2pq = 0,35

Debida a endogamia, emparejamiento selectivo y a una población de pequeño tamaño.

7. Usando los valores ‘p’ y ‘q’ obtenidos en la cuestión 4, calcula p2, 2pq y q2. ¿Se corresponden los valores obtenidos con los de la tabla del enunciado de la cuestión 4? Supón que la población hipotética de este ejercicio está en equilibrio de Hardy-Weinberg.

p2 = 0,27 q2 = 0,23 2pq = 0,50

Sí, podríamos decir que sí se corresponden; por tanto, la población estaría en equilibrio de Hardy – Weinberg.

RESPUESTAS

Cuestións de aplicación ~ Guía de respostasLección 1

1. Porque se fai preciso unha acción quelante sobre os ións metálicos da mostra durante o paso de lise en ebulición a 100ºC? Que pasaría se non se usa un axente quelante coma a matriz InstaGene?Os ións metálicos, coma o MG+2, actúan coma cofactores das ADNasas que poden degradar o ADN. A matriz InstaGene, ó bloquear os ións metálicos, inactiva as ADNasas co que o ADN molde queda intacto.No caso de non estares presente a matriz InstaGene, as ADNasas poderíanse activar e degradar o ADN molde. A consecuencia sería que non se produce amplificación durante a PCR.

2. Que parte das células se precisa para facer PCR?O ADN xenómico liberado do núcleo das celulas.

3. Que estructuras precisamos romper para liberar o ADN celular?É preciso romper as membranas celulares e as envolturas nucleares para liberar o ADN que servirá de molde na reacción da PCR.

4. Porque pensas que hai que mantér o ADN xunto coa matriz InstaGene despois de ferver as mostras?Si na disolución houbera ADNasas presentes, a matriz InstaGene bloquearía os cofactores metálicos MG+2 para manter inactivas as ADNasas. Se non estivera presente, as ADNasas degradarían o ADN da mostra perdéndose o molde preciso para a reacción de PCR.

Lección 21. Porque se precisa un cebador para cada unha das cadeas do segmento de ADN a

amplificar?Precísanse dous cebadores, un  para cada unha das dúas hebras da dobre hélice de ADN, para poder usar as dúas como moldes de repricación. O cebador 5’→3’ permite repricar unha das cadeas, pero na outra precísase o cebador “antisentido” 3’←5’.

2. Porque a Taq ADN-polimerasa se chama así?A Taq ADN-polimerasa foi illada da bacteria termófila Thermus aquaticus en contornos preto de augas termais. Trátase dunha enzima de moito valor para as técnicas de PCR porque soporta as elevadas temperaturas precisas na fase de desnaturalización do ADN.

3. Porque hai nucleótidos na master-mix? Cita o resto de compoñentes da master-mix e indica a función de cada un deles.Os catro dNTPs son os nucleótidos que son incorporados por parte da Taq ADN-polimerasa (=TaqADN-pol) na cadea complementaria do molde de ADN durante a PCR.Os outros compoñentes son os oligonucleótidos cebadores, a Taq ADN-pol, o tampón salino e os ións Mg+2. Os cebadores xúntanse ás cadeas molde servindo de inicio no proceso de repricación por parte das Taq ADN-pol. A TaqADN-pol incorpora os novos dNTPs na cadfea complementaria en formación. O tampón salino é preciso para proporcionar o contorno axeitado en canto a concentración de ións e pH para a actuación da TaqADN-pol. O ión Mg+2  é imprescindible por ser cofactor da TaqADN-pol.

4. Describe os tres pasos principais de cada ciclo de amplificación por PCR e indica a qué temperaturas ocorre cada un deles.Os tres pasos principais da amplificación por PCR son: desnaturalización, hibridación e extensión. Durante a desnaturalización as dúas cadeas da dobre hélice de ADN sepáranse e fórmanse as dúas hebras sinxelas que actuarán coma moldes de repricación. Durante a hibridación os cebadores atopan as súas secuencias comprementarias nas cadeas molde e xúntanse a elas por emparellamento de bases. Durante a extensión, a TaqADN-pol incorpora os dNTPs prolongando a cadea dos cebadores, o que resulta na aparición dunha cadea comprementaria ó molde.

5. Explica porqué a lonxitude precisa do ADN diana non é amplificada ata o terceiro ciclo. Podes facelo apoiándote nun esquema gráfico ou debuxo.No primeiro paso da polimerización, unha nova cadea de ADN sintetízase partindo de cada cebador. A TaqADN-pol. extende esta nova cadea a partir da secuencia diana, producindo unha nova cadea de ADN que contén o propio cebador e que é máis longa que a secuencia diana.No segundo ciclo, o ADN desnaturalízase e os cebadores xúntanse tanto á á secuencia diana da cadea orixinal coma á creada no primeiro ciclo. ó final desde ciclo produciuse unha mestura de pequenas secuencias diana e cadeas híbridas de ADN longas.No terceiro ciclo, cada cadea de ADN diana dobre de lonxitude definida volve a

xuntarse co seu corresponde cebador. Xa que logo, a TaqADN-pol sintetiza dúas copias de ADN diana de dobre cadea. Este número duplícase a partires de este momento en cada ciclo subseguinte da PCR medrando logarítmicamente. Deste xeito, en 40 ciclos de PCR amplíficase unha secuencia dada 240 veces, cunha producción potencial de 1 x 1012 moléculas de ADN.

Lección 31. Cal é a diferencia entre un intrón e un exón?Os intróns son secuencias

intercaladas nos xenes que non codifican para a secuencia proteica e que son eliminadas do ARNm antes de que este abandone o núcleo celular. Os exóns son cada unha das secuencias que conteñen a información codificante dun xen; permañecen no ARNm que é transportado fora do núcleo ata os ribosomas onde definitivamente éon traducido para dar lugar a unha proteína.

2. Porque os dous posibles productos da PCR difiren en 300pb?Os cebadores amplifican un fragmento de 641pb na rexión PV92. Algúns individuos conteñen unha secuencia Alu de 300pb nesta rexión do cromosoma 16, de xeito que neses individuos a amplificación produce fragmentos de 941pb. Xa que logo, a diferencia de 300pb débese á inserción da secuencia Alu.

3. Porque os fragmentos máis pequenos se desprazan máus lonxe na electroforese?As moléculas de ADN obtidas por PCR (os productos da PCR) sepáranse por electroforese grazas á súa carga negativa. Coma o ADN está cargado negativamente, móvese cara o electrodo positivo (vermello) nunha cámara de electrodorese.A agarosa actúa coma unha peneira separando as moléculas en función do seu tamaño. As moléculas máis grandes móvense a modo no xel, mentres que as máis pequenas o fan máis rápido ó se enfrontar a unha resistencia menor por parte da matriz que forma o xel de agarosa.

4. Que controis se usan neste experimento? Cal é a importancia de usalos? Poderían terse usados outros?Os controis usados nesta práctica son mostras coñecidas de homocigotos (+/+), de homocigotos (-/-) e de heterocigotos (+/-). As bandas que resultan na electroforese destas mostras coñecidas correponden a fragmentos de tamaño (pb) coñecido e pódense usar para comparar coas bandas de mostras descoñecidas (as dos estudantes nesta práctica).

Lección 41. Cal é o teu xenotipo para a inserción ALU na rexión PV92 do teu cromosoma

16?Se hai dúas bandas coincidentes co control +/- eres heterocigoto. Si hai unha única banda que coincide co control -/- eres homocigoto. De seguido amósase

outra imaxe de exemplo de resultados desta práctica:

2. Cales son as frecuencias xenotípicas dos homocigotos (+/+), homocigotos (-/-) e heterocigotos (+/-) no grupo LACC2~2010-11? Enche a seguinte táboa cos resultados:Os datos que se expoñen de seguido corresponden ós reflectidos polas bandas obtidas no laboratorio, as da seguinte imaxe:

Xenotipo NúmeroFrecuencia (#/total)Homocigotos (+/+)2 0.18Heterocigotos (+/-)1 0.09Homocigotos (-/-) 8 0.73Totais: 11 1.00

1. Cal é a frecuencia de cada alelo no grupo?(Para o mesmo caso anterior)Hai que ter en conta que, nunha clase con 11 persoas (N) o total de alelos é 2(N)=22 alelos.

Alelo NúmeroFrecuenciaalelos (+)5 p=0.23alelos (-) 17 q=0.77Totais: 22 1.00

1. Na seguinte táboa están os mesmos datos para unha mostra aleatoria dunha poboación determinada; calcula as frecuencias alélicas para esa poboación.

Alelo NúmeroFrecuenciaHomocigotos (+/+)2.422 0,24Heterocigoto (+/-) 5.528 0,55Homocigotos (-/-) 2.050 0,21

Totais:10.000 1,00

Alelo NúmeroFrecuenciaalelos (+)10.372 p=0,52alelos (-) 9.628 q=0,48Totais: 20.000 1.00

1. Coinciden os datos de LACC2 cos da poboación do exemplo anterior? A que pensas que se poden atribuir as diferencias ou semellanzas?Moi probablemente os datos non coinciden. Mirando as cifras, a mostra da poboación hipotética é moito máis grande que a da “poboación LACC2” polo que aporta unha representación moito mellor das frecuencias esperadas nunha ampla poboación heteroxénea. Coma en LACC2 temos unha mostra moito máis pequena, con toda probabilidade as frecuencias alélicas serán diferentes.

2. Usando os valores ‘p’ e ‘q’ obtidos na cuestión 3, calcula p2, 2pq e q2. Se o resultado fora o mesmo que o que obtiveches na cuestión 2, a poboación LACC2 diríase que está en equilibrio xenético de Hardy-Weinberg. Noutro caso, se as frecuencias xenotípicas son distintas, a que pensas que se pode deber a diferencia?É de esperar que as frecuencias esperadas para p2, 2pq e q2 non

coincidan cos datos observados debido a que as mostras pequenas de máis non teñen as condicións precisas para que se dea o equilibrio de Hardy-Weinberg. Unha clase moi pequena non representa a unha poboación máis grande aínda que coincidan os valores de p e de q. Nunha poboación tan pequena non representa unha poboación na que “os cruzamentos ó chou producen descendencias con iguais probabilidades de éxito ó longo das xeracións”.

3. Usando os valores ‘p’ e ‘q’ obtidos na cuestión 4, calcula p2, 2pq e q2. Correspóndense os valores obtidos cos da táboa amosada no enunciado da cuestión 4? Supón esto que a poboación hipotética dese exercicio está en equilibrio de Hardy-Weinberg?.Na mostra poboacional do exemplo, os valores de p2, 2pq e q2 están moi preto das frecuencias xenotípicas observadas. A mostra é grande dabondo o que proporciona unha significatividade estatística alta o que suxire que a poboación está en equilibrio xenético. Con todo, cando se considera que o equilibrio de Hardy-Weinberg presupón que “o apareamento é ó chou produce descendencias coas mesmas probabilidades de éxito biolóxico” e que “non existen movementos migratorios de individuos en ningún sentido”, está claro que ningunha poboación humana cumpre con estas condicións. Hai que sinalar que o equilibrio de Hardy-Weinberg é un modelo teórico que supón un estado ideal que non se da na natureza, pero que é inetresante para evaluar e predecir a estabilidade xenética de mostras poboacionais naturais.