TEMEL DENEYSEL ARAŞTIRMA YÖNTEMLERi

NELERDiR?

Figen DeveciFırat Ün Tıp Fak Göğüs Hast AD

fgndeveci@yahoo.com

Sunu Planı

I. Araştırma yöntemlerinin sınıflanması

II. Deneysel araştırma

III. Deney Hayvanları üzerindeki in‐vivo araştırmalar

IV. İn‐vitro çalışmalar 

Bilimsel araştırma“Sistematik veri toplama ve analiz etme süreci”

Doğru araştırma yöntemi

Kalite Güvenilirlik Sonuçların yayınlanabilme olasılığı

Amacına Göre Yöntemine Göre Temel Araştırmalar Uygulamalı Araştırmalar Laboratuvar Araştırmaları Deneysel Araştırmalar

Tarihsel Araştırmalar Tanımlayıcı Araştırmalar Sonuç Çıkarıcı Araştırmalar

Bilimsel araştırmalar

Yöntemlerine göreAmaçlarına göre Yapıldıkları yere göre

Temel

Uygulamalı Tarihi

Betimsel

Deneysel

Alan

Laboratuvar

NİTELİKSEL(Qualitative)

• Niçin? Nasıl? Ne şekilde sorularına yanıt arar

• Sayısal ve ölçmeye dayalı değerlendirmeleri içermez

NİCELİKSEL(Quantitative)

• Ne kadar? Ne miktarda? Ne kadar sık, Ne kadar yaygın? sorularına yanıt arar

• Ölçüme dayalı, gruplar arası objektif ve sayısal karşılaştırmalar yapabilen

Sayısal yöntemGözlem ve ölçmeye dayalıTekrarlanabilenObjektif

NİCELİKSEL

GÖZLEMSEL

DENEYSEL

TanımlayıcıKişi, zaman ve yer özelliklerine göre tanımlama• Olgu sunumu/serisi• Kesitsel(cross-sectional)

Analitik• Olgu-kontrol• Kohort• Kesitsel

Müdahale araştırmalarıProfilaktik önlemler (Alan)Terapotik önlemler (Klinik)

Hayvan Deneyleri

METODOLOJİK- Teşhis ve tarama yöntemlerinin geçerlilik ve güvenilirlik analizi - Ölçüm ve gözlemlerin güvenilirliğini belirlemeye yönelik araştırmalar

Epidemiyolojik Araştırma Tipleri

Sağlık sorunlarını ve boyutlarını saptama-Deskriptif Araştırma

Sorunların nedenlerini belirleme-Analitik Araştırmalar

Sorunların en uygun çözümlerin saptanması-Deneysel araştırmalar

Bir aşı ve/veya ilacın etkinliğinin değerlendirilmesi çeşitli aşamalardan geçer

1. Preklinik araştırmalara. Laboratuvarda in-vitro deneylerb. Deney hayvanları üzerinde in-vivo deneyler

Deneysel araştırmalar

2. Klinik araştırmalara. Profilaktik önlemler (Alan)b. Terapotik önlemler (Klinik)

Faz IFaz IIFaz IIIFaz IV

Medikal Araştırmalar

Primer

Sekonder

Temel Medikal Araştırmalar Klinik Epidemiyolojik

Teorik Uygulamalı

Metod geliştirme(fizik, kimya,biyoloji, biyometrik,psikoloji)

Analitik ölçüm

Görüntüleme

Biyometrik

Test geliştirme

Hayvan

Hücre çalşm

Genetik

Biyokimya

Materyal geliştirme

Deneysel (Interventional)

Gözlemsel

Klinik

Faz I

Faz II

Faz III

Faz IV

Tedavi çalşm(müdahale olmaksızın)

Prognostik

Tanısal

İlaçlarla gözlem

Sekonder veri analizi

Olgu serisi

Olgu sunumu

Deneysel Gözlemsel

Müdahale

Alan

Grup

Kohort

Prospektif

Historical

Olgu kontrol

Kesitsel

Ekolojik

Meta analiz

Derleme

(Röhric B, et al. Dtsch Arztebl Int 2009; 106: 262–8)

9

Deneysel yöntem,

Laboratuar ya da laboratuar dışındaki bir deney düzeneğinde

Olaylar arasındaki sebep-sonuç ilişkilerini belirlemeyi amaçlayan ve

Araştırmacının önceden öngördüğü hipotezleri test etmeye yarayan bir araştırma yöntemi

DENEYSEL ARAŞTIRMALAR 1-Hayvan deneyleri2-Müdahale araştırmaları

a. Profilaktik önlemlere yönelik deneysel araştırmalar (Alan çalışmaları)b-Terapötik önlemlere yönelik deneysel araştırmalar (Klinik çalışmalar)

1. Preklinik araştırmalara. Laboratuarda in-vitro deneylerb. Deney hayvanları üzerindeki in-vivo deneyler

2. Klinik araştırmalara. Faz I klinik araştırmalarb. Faz II klinik araştırmalarc. Faz III klinik araştırmalard. Faz IV klinik araştırmalar

DENEYSELRandomized

controlled trials

Intervention studies

Primer koruma önlemlerine yönelik(Preventive trials)

Primer korunma

Sekonderkorunma

Tersiyerkorunma

Klinik deneyler(Clinical trials) Sağlık hizmeti

araştırmaları(Medical care

intervention studies)

Deneysel araştırmalarda ilk aşamayı genellikle

HAYVAN DENEYLERİ oluşturur

Deneysel araştırmalar

• Araştırmacı artık “gözlemci” değil “deneyi yapan”dır• Müdahale oluşturulur ve sonuç değerlendirilir

– İlaç– Cihaz veya yöntem– Önleyici stratejiler– Tanısal stratejiler

« Deneysel yöntem, bilimsel bilgiyi en objektif bir biçimde elde etmeye yarayan bir araştırma

yöntemidir »

Deneysel (Müdahale) AraştırmalarDeneysel yöntem; • Laboratuvar ya da laboratuvar dışındaki bir deney

düzeneği • Olaylar arasındaki sebep-sonuç ilişkilerini belirlemeyi

amaçlar • Araştırmacının önceden öngördüğü hipotezleri test eden

bir yöntem

Bozulan denge“SONUÇ”

Ağırlık“SEBEP”

Deneysel Araştırmalar• Deneyin sonucunu etkileyebilecek tüm etkenler

araştırmacı tarafından kontrol edilmeye çalışılır

• Bağımsız değişken manipüle edilerek bağımlı değişken üzerine etkileri incelenir

• Bu arada sonucu etkileyebilecek tüm diğer değişkenler sabit tutulur ya da randomize edilmeye çalışılır

Deneysel yöntem dendiğinde laboratuvarlar akla gelse de mümkün olan tüm çevre ve ortamlarda

kullanılabilen bir yöntemdir

Avantajları Neden-sonuç ilişkisini

gösterme imkânı verir

Neden olduğu düşünülen olayı deneyci yaratır

Sonuç olduğu düşünülen olayın ortaya çıkıp çıkmadığına bakılır

Sonuçlar evrene genellenebilir

Hafıza faktörünün etkisi en azdır

SakıncalarıDeneysel

Araştırmaların Uzun zaman alan pahalı ve

zor araştırmalar Bazı müdahaleler insanlar

üzerinde uygulanamaz Sıklıkla etik sorunlar

-- Deney grubuna etkisi yeterince bilinmeyen bir müdahalenin yapılması

-- Kontrol grubunun tedavisiz veya korumasız bırakılması

-- Deney hayvanlarına zarar verilmesi

-- Hayvanlardan elde edilen sonuçların insanlara genellemede güçlükler

DENEYSEL YÖNTEMİN ÖZELLİKLERİ

1. İncelenen faktör (etken, tedavi yöntemi vb) araştırmacının kontrolünde. İstediği taktirde değiştirebilir (İlaç dozu gibi)

2. İncelenen faktör dışındaki tüm değişkenler sabit tutulabilir. Araştırılan etkenin “Neden” olup olmadığı kesin olarak saptanabilir.

3. Denekler veya yöntemler deney ve kontrol grubuna rastgele ayrılabilir (Randomizasyon).

4. Neden-sonuç (etken-hastalık) ilişkisi tam ve doğru bir biçimde saptanabilir.

5. Deney ortamı her zaman gerçek hayata uymayabilir. (Özellikle laboratuvar deneylerinde in vitro koşullar in vivokoşullara tam olarak benzemeyebilir.

Klasik bir deneysel araştırmada aşamalar:

Referans popülasyon

Deney popülasyon

Random

izasyon

Deney grubu

Kontrol grubu

Bireyselveya grupeşleştirmesi

Sonuç biliniyor- olumlu

Sonuç biliniyor-olumsuz

Sonuç bilinmiyor

Parametre

Sonuç biliniyor-olumlu

Parametre

Sonuç biliniyor-olumsuz

Sonuç bilinmiyor

İzlem

Tanı ve seçimkriterleri

belirlenmeli

Uygun birörneklemeyöntemi ile

Koruyucu veya tedavi edici yöntemin uygulanması

Randomizasyon

Araştırmaya katılacakların deney ve kontrol gruplarına tarafsız bir biçimde ayrılmaları

Kişi özellikleri homojen olmalıÇevre özellikleri benzer olmalı

Rastgele ayırma “Rastgele sayılar tablosu”

Tabakalama veya bloklara ayırma

Rastlantısallığın sağlanması için:

• Katılımcının hangi grupta olduğunu bilmesi engellenebilir: "tek kör"

• Uygulamayı yapan kişinin de bilmesi engellenir: "çift-kör“

• Analizi/değerlendirmeyi yapan kişi de hangi grubun deney ya da kontrol grubunda olduğunu bilmez ("üçlü-kör").

Randomize kontrollü klinik ilaç çalışmalarında

Örneklem büyüklüğünün saptanması:

Deney ve kontrol grubunda güvenilir sonuç elde etmek için en az kaç kişi üzerinde araştırma yapılmalı

Deney ve kontrol grubunun eşit ya da yakın sayıda olması istenir

Genellikle daha önce yapılan çalışmaların sonuçları esas alınır

Klinikteki deneysel çalışmaların çoğu az sayıda kişi üzerinde yapılmaktadır

Deney grubu

Kontrol grubu

Önce değerlendirme

Sonra değerlendirme

Randomizasyon

Deneysel araştırmanın üç temel parçası vardır

Deney grubu: Bağımsız değişken uygulanan grupKontrol grubu: Bağımsız değişken uygulanmayan grupBağımsız değişken:• Neden-sonuç ilişkisinde “neden” konumunda• Bağımlı değişken üzerinde etkisi incelenen değişken • Araştırmacı manipüle eder Bağımlı değişken:Neden-sonuç ilişkisinde “sonuç” durKontrol değişkenler:Bağımlı değişkeni etkileme olasılığı bulunan “öteki olası

nedenler”dir.Öntest: Bağımlı değişkenin müdahale edilmeden önce ölçülmesiSontest: Bağımlı değişkenin müdahale edildikten sonra ölçülmesi

Deneyin Bölümleri

• Ölçülebilir• Basit ve karmaşıklıktan uzak olmalı• Etik

Basit

Karmaşık

Karıştırıcıetken

Karıştırıcıetken

Karıştırıcıetken

Bağımlı Değişken

Sonuç

• Gerçek yaşamda pratik anlamı olmalı

• Uyarıcı düzeyler arasındaki fark yeterince fazla olmalı

Bağımsız Değişken

Ders süresinin birey üzerindeki yorgunluğa etkisi

45 dk

48 dk

45 dk

60 dk

Bir araştırmanın deneysel olabilmesi için

• Değişimleme (Bir değişkene ait en az iki farklı miktar)• Randomizasyon sağlanmalıdır

Farelere, daire sembolü gördükleri zaman sağdaki pedala, kare sembolü gördükleri zaman soldaki pedala basmaları

RandomizeI. grup II. grup

yanlış pedal; şok

doğru pedal; pekiştireç

yanlış pedal; --------

doğru pedal; pekiştireç

30 dk 20 dk

I. Grup(kuyruğu 17 cm)

II. Grup(kuyruğu 20 cm)

yanlış pedal; şok

doğru pedal; pekiştireç

yanlış pedal; --------

doğru pedal; pekiştireç

30 dk 20 dk

Bu iki araştırmadan hangisi deneyseldir ?

Çevresel Değişkenler; Deneğin dışında bulunan değişkenler(İlaç miktarı, aydınlanma, ısı, nem düzeyi…)

Araştırmacı çevresel değişkenleri manipüle edebilir

Denek Değişkenleri; Deneğin araştırmaya gelirken getirdiği özellikler(Yaş, cinsiyet, eğitim düzeyi…)

Değişkenlerin Kontrolü: iç geçerliği arttırır

Bir araştırmanın 2 temel hedefi vardır;

1. Bağımsız değişkenin etkisi hakkında gerçekçi bir sonuca ulaşmak (İç geçerlik)

2. Araştırmadan elde edilen bulguları evrene genelleyebilmek (Dış geçerlik)

Bulguların genellenebildiği evren büyüdükçe dış geçerlilik artar

Deneysel Desen, araştırmacı tarafından geliştirilen planTürleriDenenmek istenenbağımsız değişkensayısına göre

• Tek değişkenli modeller• Çok değişkenli modeller

Denemeye katılan grupsayısı, kontrol önlemlerizaman ve sayısınındikkate alındığı

• Deneme öncesi modeller• Yarı deneme modelleri• Gerçek deneme modelleri

Deneme öncesi modeller;Tek grup sontest modelTek grup öntest – sontest modelKarşılaştırmalı eşitlenmiş grupsontest modeller

Yarı deneme modelleriZaman dizisi modeliEşit zaman örneklemiEşitlenmemiş kontrol grubu modelÖntest sontest ayrı örnek

grup modelRotasyon modeli

Gerçek deneme modelleriÖntest – sontest kontrol gruplu modelSontest kontrol gruplu modelSolomon dört grup modeli

Kontrol grubu yokGerçek deney olarak kabul edilmezElde edilen sonuçlar şüphelidir

Randomizasyon yokBilimsel değeraçısından gerçek deneme modellerinden sonra gelir

Deneme öncesi modeller;

Tek grup sadece son test tasarımı

GX

O

Tek grup öntest – sontest model

GO1X O2

Statik grup karşılaştırması

G I

K

X O

O

G; grupR; randomizasyonX; bağımsız değişken düzeyiO; ölçüm, gözlem

Gerçek deney olarak kabul edilmez

Elde edilen sonuçlar şüphelidir

Yarı deneme modelleri;Zaman dizisi modeli

X

O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7 O8G

Eşitlenmemiş kontrol grubu model

G I

K

O1 O2

O3 O4

X

Gruplar gelişigüzel seçilir

Gerçek deneme modelleri;Öntest-Sontest Kontrol Grubu Model

G I

K

O1 O2

O3 O4

X

R

R

K

G IR

R

O1

O2

X

Sontest Kontrol Grubu Model

Klasik deneysel tasarım

Solomon Dört Grup Modeli

G I

G 2

G 3

G 4

R

R

R

R

O1

O3

O2

O4

X

X O5

O6

Posttest ortalama skorlarıkarşılaştırılabilirO2, O4, O5, O6Pretest’in etkisi analiz edilebilirO4 ve O6Tedavinin etkisi analiz edilebilirO5 ve O6Maturasyon analiz edilebilirO1, O3 karşın O6

Çok fazla sayıda denek gerektirir

Bağımlı değişkeni ölç

Bağımlı değişkeni ölç

Deneysel uyarıcı

Bağımlı değişkeni yeniden ölç

Bağımlı değişkeni yeniden ölç

Karşılaştıraynı mı?

Karşılaştırfarklı mı?

R R

Randomize Kontrollü Deney – RCT‐

Randomizasyon

Deneyseltedavi

Standart tedavi

Uygun hastalar

Hastalık

İyileşme

Hastalık

İyileşmeAraştırmanın yönü

Randomize Paralel grup çalışma örneği

Akut ajite hastalar

Midazolam

Midazolam + Droperidol

Midazolam + Olanzapin

Etkinlik

ve

güvenilirlik

R

R

R

İki periyodlu çaprazlama çalışma örneği

Grup I

Grup II

Psödoefedrin Psödoefedrin

Dimenhidronat Dimenhidronat

Etkiler;ReaksiyonGeçerlikHafıza

Etkiler;ReaksiyonGeçerlikHafıza

R

R

Alan Deneyi

A Sağlık Ocağı Bölgesi

B Sağlık Ocağı Bölgesi

Sigara içme prevelansı

Sigarayı bırakma eğitimi

Eğitim yok

Sigara içme prevalansı

Bir yılTIPTA ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİProf. Dr. Nazmi BilirProf.Dr. Gül Ergör

Hayvan Deneyleri

I. Klinik Araştırmalar

Deneysel hayvan araştırmaları;Bilimsel bilgi elde etmek amacı ile omurgalı veya omurgasız hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar

II. Temel Bilime Dayalı Araştırmalar

(Preklinik Araştırmalar)In-vivo

(Hayvan deneyleri)

In-vitro

Denek hayvanlarının en sık olarak kullanıldığı alanlar;Genetik,Gelişim biyolojisi, Davranış bilimleri, Uygulamalı biyomedikal bilimler, Transplantasyon,İlaç araştırmaları Eğitimsel amaçlarla, Irksal çalışmalarda, Savunma araştırmalarında

• Temel biyomedikal araştırmalar- % 32• Yeni tedavi veya korunma yolları - % 29• Hayvanların türetilmesi- % 35• Tıp dışı ürünlerin (ev, tarım ve endüstri) güvenlik testi- %3• Yeni tanı yöntemlerinin geliştirilmesi- % 1

Hayvan deneyleri neden önemli ?

• Hayvanların araştırmalara katkısı %10• Bilimsel soruların yanıtları başka bir yöntemle

bulunamazsa• İnsanda etik olmadığı durumlar

Biyomedikal araştırmalarda hayvanlar niçin gereklidir ?

Hayvanlar iyi bir araştırma bireyi, çünki; biyolojik olarak insanlara benzer

İnsanlara benzer şekilde çoğu sağlık problemleri için aynı hassasiyeti gösterir

Hayvanlar insanlara göre daha kısa yaşam süresine sahip

Hangi tip hayvanlar biyomedikal araştırmalarda kullanılır?Rat, fare, kuşlar, tavşan, kobay, koyun, balık, kurbağa, domuz,

köpek, primatlar ….kullanılmaktadır.

Ne kadar deney hayvanı kullanılıyor?

• Her yıl yaklaşık 17-23 milyon hayvan araştırma amaçlı kullanılıyor

• %95’i yetiştirilmiş rat ve fareler, • %4.25 tavşan, kobay, koyun, balık ve kurbağa• Sadece %0.75’i kedi, köpek ve primatlar

%97’sinde yalnızca dokuz hayvan türü kullanılır; rat (sıçan) tavşan kedi fare hamster tavuk kobay köpek maymun

Başarı ???

Hayvan deneyleri

Doğru metodoloji ile yapılırİyi standardize edilirse

İnsan hastalığının modelini tam olarak karşılayabilir Pozitif-negatif prediktif değeri yüksek olabilir

BAŞARISIZLIK !

o Aşı geliştirme (HIV aşısı)

o Teratojenik

o Karsinojenik

o Nöroprotektif ilaç geliştirme

Hayvanlar ve insanlar farklı kompleks sistemlere sahiptir

Genomik değişiklikler Epigenetik değişiklikler Metabolik farklılıklar Soy ve tür farklılıkları

Deneysel çevre ve deney protokolündeki değişkenlik azaltılmalı

Metodolojik kalite artırılmalı

Hayvan modelleri

Toksisite çalışmalarında

İnsan hastalıklarının tedavisini amaçlayan biyomedikal araştırmalarda

Devam eden yaygın kullanımlarıyla birlikte genellikle oldukça öngörüsel olarak kabul edilmektedir

Araştırmacı sorumluluğu ve konuyla ilgili yaptırımlar

• Helsinki Deklarasyonu (18. Dünya Hekimler Kurultayı’nda (Haziran, 1964, Helsinki, Finlandiya)

• Hayvan Deneyleri İle İlgili Etik YasaWHO ve UNESCO’nun bilimsel ortak kuruluşu CIOMS (Council for International Organisations of Medical Sciences)

• Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı’nın, “Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için Kullanılan Deney Hayvanlarının Korunması, Deney Hayvanlarının Üretim Yerleri ile Deney Yapacak Olan Laboratuvarların Kuruluş, Çalışma, Denetleme, Usul ve Esaslarına Dair Yönetmeliği 

• 24.06.2004 tarihli 5199 sayılı hayvanları koruma kanununun 9. maddesinde “deney hayvanları ile ilgili düzenlemeler”

• Çevre ve Orman Bakanlığı tarafından 6 Temmuz 2006, “hayvan deneyleri etik kurullarının çalışma usul ve esaslarına dair yönetmelik” (HADMEK) (HADYEK) 

• En uygun yöntem mi?

• Seçenekler neler olabilir?

• Hayvanın deney sırasında herhangi bir andauyanık olması gerekiyor mu?

• Deneyin neden olduğu ağrı ya da sıkıntı azaltılabilir mi?

• Kullanılan hayvan sayısı azaltılabilir mi?

eplacement (Yerine geçirme)

eduction (Azaltma)

efinement (Arındırma)

esponsibility

4 hayvan modeli vardır

• İndüklenmiş• Spontan• Negatif• Olası (Orphon) model

Doğru model ? Temel anahtar soru iyi tanımlanmalı

Uygun laboratuvar hayvanı ? * Tür* Soy* Cinsi

DENEYSEL HAYVAN MODELLERİ

Yetiştirilme özelliklerine göre laboratuarhayvanı seçimi

• İnbred • Outbred• Selektif breeding • Crossbreeding

Mikrobiyolojik Durumlarına Göre Hayvanların Sınıflandırılması

• Axenic• Gnotobiotic• Spesifik Patojen Free• Monitörize• Konvansiyonel

1. Model insanlardaki kliniğe en iyi şekilde uyarlanabilmeli

2. Hayvanın tür, soy ve cinsi önemli. Türe ait anatomik, fizyolojik ve davranış karakterlerinin bilinmeli

3. Yeni model tanımlanması için literatür araştırması yapıp, hangi modelin mümkün ve gerçekçi olduğu belirlenmeli

4. Uygun bir istatistik çalışma yapabilmek için her grupta yeterli sayıda ve en az hayvan kullanılmalı

5. Kontrol grubu bağımlı değişken haricinde diğer tüm değişkenler tarafından deney grubu ile aynı olmalı

6. Deney bir müdahalenin etkisini araştırmak üzere planlanmışsa ise kontrol grubuna aynı anestezi ve müdahale uygulanmalı

Deneysel bir hayvan modeli oluştururken;

Hayvan modeli her zaman orijinal durumu tam olarak temsil etmez; yani model asla prototipinin aynı değildir

Modeller asla son sözü sağlamaz, ama yaklaşık bir fikir verir

Randomize seçim olmalı

Dişi ve erkek sayısı eşit

En az kompleks tür

En az denek sayısı

Deney hayvanına dayalı bir araştırma için çalışma planı örneği:

Akut Astım Modeli:

Hayvan türü: fareSoy: BALB/c atopik (Th2 yanıtı daha kolay oluşturulur)

Hipotez: Akut astımın fare modelinde anti-TNF- (İnfliximab), inflamatuvar yanıtı azaltıcı olası etkilere sahip değildir

Model: SİSTEMİK İMMÜNİZASYON

Küçük hayvanlarda astım modeli için en yaygın kullanılan model OVA protokolü

OVA (Ag) + adjuvan (genellikle alum) tek doz veya booster injeksiyonlar şeklinde ip enjeksiyonu (sistemik immünizasyon)

Genellikle 1-2 hafta olan inkubasyon periyodundan sonra

OVA ile aerosol “challenge” yapılır

Örnekler son “challenge” den 24-48 saat sonra alınır

0. g 14.g 17.g 18.g

İp OVA+alumAerosol OVA

Akut astım modeliAkut model remodelingin erkendeğişikliklerini oluşturur

Goblet hücre hiperplazisi Epitelyal kalınlaşma Belirgin inflamasyon AHR

(Locke NR. Am J Respir Cell Mol Biol 2007;36:625-32)

exitus

0.2 mL (100 µg) OVA+alum ip

0. gün 14. gün

0.05 mL (100µg) OVA in

25. gün 26. gün 27. gün

0.05 mL (100µg) OVA in

28. gün

Gerçek deneme modelleri;

K

G IR

R

O1

O2

XSontest Kontrol Grubu Model

Random

izasyon

Deney Grubu(ASTIM)

Kontrol grubu

1. Peribronşiyal eozinofil ve nötrofil sayıları2. BAL IL-4, IL-6, TNF-,GM-CSF, RANTES

Parametre

Parametreİzleme

Tedavi edici yöntem (Anti-TNF-)

1. Peribronşiyal eozinofil ve nötrofil sayıları2. BAL IL-4, IL-6, TNF-,GM-CSF, RANTES

Bağımsız değişken

Bağımlı değişken

Plasebo (salin)

Random

izasyon

Deney grubu

Kontrol grubu

28. gün

exitus

1. 6.

0.1 ml ip remicade(1 mg/ml)

13. 20. 27.

0.1 ml ip salin

Salin + alum ip

0. gün 14. gün

salin in

25. gün 26. gün 27. gün

salin in

28. gün13. 20. 27. 1. 6.

0.2 ml Na-pentobarbital ip

exitus

0.2 mL (100 µg) OVA+alum ip

0. gün 14. gün

0.05 mL (100µg) OVA in

25. gün 26. gün 27. gün

0.05 mL (100µg) OVA in

In-vitro Teknikler

• Moleküller, hücreler ve dokular üzerinde yapılan çalışmalar

• Bunlar moleküller arasında, hücreler arasında olan etkileşimler veya organ fonksiyonları konusunda bilgiler sağlar

İn vitro yöntemler nerede kullanılır?

İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi;– Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs.– Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL– Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava

yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusuİn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi

– Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs

– Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs

İn Vitro yöntemler niçin kullanılır?

• Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs• Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya

titreşimi, elektriksel direnç, permeabilite• Hücrenin canlılığı; • Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot• Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi:

PCR, RT-PCR• Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya• Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre)

ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)

En sık kullanılan in-vitro yöntemler:

• Akım (Flow) sitometri

• Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)/Enzyme Immuno Assay (EIA)

• Elektroforez (“ Western blot vb)

• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

• DNA dizi analizi

Akım (Flow) sitometri• Hücre veya partiküllerin akmakta olan bir

akışkanın içerisindeyken karakteristiklerininölçülmesi

• Hücrelerin (Büyüklük/eksprese ettikleri belirteçlere göre) ayrılması/belirlenmesi

• Bir süspansiyon halindeki hücre ya da partiküller lazer ışığı ile aydınlatılmakta olan bir bölmeden geçirilir

• Hücrelerin ışığın önünden geçerken verdikleri sinyaller toplanarak analiz edilir

• Bir hücre/partikülün;– İmmünfenotipi - Hücre membran potansiyeli– DNA içeriği - Canlılığı– Enzim aktivitesigibi özellikleri belirlenebilir

Akım sitometride analiz edilebilen örnekler

• Kan• Kemik iliği• BOS• BAL sıvısı• Eklem sıvısı• Plevral sıvı• Asit sıvısı• Doku biyopsi örnekleri• Parafin bloktaki dokular• Hücre kültürlerinden hücre süspansiyonları

Akım Sitometri• DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs)• Apopitozis çalışmalarında• Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD

belirteçleri)• Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs)• Kromozom analiz ve tespitinde• RNA çalışmalarında• Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda

Akciğer hastalıklarının tanısında özellikle- BAL hücre tiplerinin belirlenmesinde- Solunum yolu hücre kültürlerinde hücre siklusu ve apoptozisi belirlemede

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)/Enzyme Immuno Assay (EIA)

• Hedef molekülü işaretlemek için enzimlerin kullanıldığı yöntemlerdir. Avantajları:

• Geniş tanı parametreleri ticari olarak kolayca temin edilebilir

• Yöntem otomasyona uyarlanabilir ve böylece çok sayıda örnek kısa sürede çalışılabilir

• Sonuçlar spektrofotometrede objektif olarak kalitatif, semikantitatif ya da kantitatif değerlendirilebilir

ELISA yöntemi ile antikor tayini

Western blot yöntemiyle elde edilen bantların yoğunluğu görüntü analiz sistemleri ile değerlendirilerek sayısal değerler halinde birbiriyle karşılaştırılabilir

Western Blot

Solid veya bir sıvı içinde yer alan spesifik bir proteinin düzeyini belirlemek için yaygın olarak kullanılır

Poliakrilamid jelde yürütülerek ayrılan protein bantları nitroselüloz veya naylon bant üzerine transfer edilir. Daha sonra bu proteinler özgün problar ile bağlanarak tanımlanır

Western Blot tekniği 4 adımda gerçekleştirilir:1. Jeldeki proteinlerin nitroselüloz membrana aktarımı (Blotlama)2. Nitroselüloz membranda protein bağlanmamış bölgelerin ilgisiz

proteinlerle kaplanması (Bloklama)3. Özgül antikorlarla tepkime4. Proteinlerin görüntülenmesi

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimeler

PCR 3 adımdan oluşur;1. Denatürasyon(İki zincirin yüksek ısıyla birbirinden ayrılması)2. Hibridizasyon(Sentetik dizilerin hedef DNA’ya bağlanması)3. Polimerizasyon(Zincirin uzaması)

PCR

“in vitro” klonlama

Genomun istenilen bölgesi milyonlarca kez çoğaltılabilir

DNA Polimeraz enzimi ile katalizlenir ve yeni DNA iplikleri sentezlenir

PCR kullanım alanları• Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı• Prenatal tanıda• Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması• Adli tıpta• Onkogenezisin araştırılmasında• Klonlamada, gen ekspresyon araştırmalarında• DNA üzerinde araştırılan bölgelerin tespitinde

kullanılan tek zincirli dizilerin (probe) oluşturulmasında• DNA dizi analizinde, büyük miktarlarda DNA

örneklerinin oluşturulmasında• Bilinmeyen dizilerin tayininde• Geçmiş DNA’ların incelenmesinde• İn vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon

öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra inplantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmasının sağlanması.

DNA dizi analiziBir DNA olinükleotidinde yer alan adenin (A), timin (T), sitozin (C) ve guanin (G) nükleotid bazlarının diziliminin ortaya konulmasıdır

On binlerce genin dizisi saptanabilmiştir

Gen mühendisliği ve klonlamada kullanılır

Genomic

• Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması

• Organizmaların bütün DNA dizilerinin (sekans)tespitine dayalı çalışmalar

Proteomic

•‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır

• Kapsamlı olarak organizmadaki proteinlerin yapı ve fonksiyonlarının aydınlatılmasında kullanılır

• ‘Proteome’; ‘protein’ ve ‘genome’ dan oluşur

• Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler

İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi

– Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs

– Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs

1. Çeşitli yöntemler ile ölümsüz (‘immortal’) hale getirilmiş hücrelerden elde edilen ve ticari olarak temin edilebilen hücre dizileri2. İn vivo olarak alınan dokulardan hazırlanacak primer hücre kültürleri

Hücre kültürü

Hücre kültürlerinin elde edilmesi:

Hücre Dizileri (‘cell line’)

Avantajları;– Elde edilmeleri kolay– İstendiği kadar çoğaltılabilir– Saklanabilir, tekrar kullanılabilir– Belli pasaj aralıkları kullanılmalı

Dezavantajları;– Bir takım genotipik ve fenotipik özellikleri in vivo

hücrelerden farklıdır

Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40);– BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri)– 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri)

Kanserleşmiş hücreler kullanılır– A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri)

Hücre Dizileri (‘cell line’)

Primer Hücreler

Avantajlar• İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik

benzerlik• Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde

edilebilirler

Dezavantajlar• Elde edilmeleri daha zor• Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar• Etik sorunlar

Doku - Hücre Kaynağı

• Cerrahi eksplant– Pnömonektomi, Lobektomi– Transplant akciğeri

• Biyopsi• Fırçalama (epitel hücreler)• Enzimatik digestion,• Disseksiyon• Hazır, ticari olarak

Akciğerin Primer Hücre Kültürleri

• Düz kas hücreleri• Fibroblast kültürleri• Alveolar epitel hücreleri• Bronş epitel hücreleri

Teşekkürler

fgndeveci@yahoo.com