Temel Sitogenetik ve Nomenklatur;

Dünden Bugüne Kromozom Analizleri

Prof. Dr. Seher Başaranİstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp

Fakültesi, Tıbbi Genetik AD

Sitogenetiğin Tarihçesi• Kromozom,yunanca “renkli cisim” (“chroma + soma”) (1888, Waldeyer)• Kalıtımın fiziksel temeli kromozomlardır (1892,Weissmann)• Kalıtımın kromozomal teorisi ve kromozomların yapısını, fonksiyonlarını ve hastalık ilişkisini araştıran bilim

dalı “sitogenetik” (1902, Sutton)• Erkekler 47, dişiler 48 kromozom (1912, von Winiwarter) • Kromozom sayısı 48 (1923, Painter)• Kromozomlar boyandı (1924, Feulgen)• Kolşisin (1932, Blakeslee ve Eigsti) • Hipotonik solusyon kullanıldı (1953), • Kolşisin+hipotonik şok kullanıldı (1955, Ford ve Hamerton) • İnsanda 2n=46 (1956, Tijo ve Levan) “Modern sitogenetiğin başlaması”• Down sendromu (1959, Lejeune) • Ph kromozomu (1960, Nowell)• “cat cry, 5p-” (1963, Lejeune) • QFA (1968, Caspersson )• G band (1970, Drets veShaw )• ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature,1971)• HRBT (Prometafaz, High Resolution Banding Technique, 1981)• ISH (1981)• FISH (1990, Lichter)

G Bantlama (GTG)Metafaz plağı

GTG- Karyotip

Prometafaz plağı HRBT karyotip

450 500 600 700 bant/haploid set

~ 500 bant çözünürlükte ~ 1 bant 6 milyon nükleotid (~6 Mb ve 10’larca gen)

Metafaz Prometafaz(HRBT)

Fluorescence in situ hybridization (FISH)

Need to suspect a specific diagnosis!

Fluoresan In Situ Hibridizasyon (FISH)

Kromozom 21Kromozom 13Kromozom 18Kromozom XKromozom Y

Spektral karyotipleme

~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”•Tek test tüm genom/kromozomlar•Tüm sayısal anomaliler;

47,XX,+ 21

69,XXX 45,X

47,XY,+13

.nuc ish(DXZ1x1)

.nuc ish(D21S65x3)

.nuc ish(RB1x3)

~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”Yapısal kromozom anomalilerinin araştırılmasında sitogenetik yaklaşım

46,XX,5p-Bant paternine göre Karyotip;46,XX,5p-

•Sadece delesyon ?•Derivatif kromozom ?

Parental kromozom analizleri;

Anne ve Baba “Normal”

46,XX,del(5)(p15.1->pter) dn

FISH ile kırık noktalarının belirlenmesi ve konfirmasyon;

46,XX,del(5)(p15.1->pter).ishdel(5)(p15.1->pter)(CTNND2-)Yorum; Olgudaki 5p15.1->pter bölgesi için parsiyel monozominin fenotipi etkilemesi beklenmektedir.

~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”

Fetus 46,XY,3p+

Anne 46,XX,t(3;20)(p25.3;p11.2)

,der(3)t(3;20)(p25.3;p11.2) mat,der(3)(20pter->20p11.2::3p25.3->3qter)mat

Yorum; Fetus, annedeki translokasyonun Adjacent-1 dağılımı ürünü derivatif 3 kromozomunu taşıdığından 20pter->p11.2 bölgesi için trizomik ve 3p25.3->pter bölgesi için monozomiktir ve fenotipik olarak etkilenmesi beklenmektedir.

46,XY,t(8;13)(q24.13;q21.2).ish ins(2)(p16.2q33.2q22.2)(wcp2, wcp8, wcp13, 2pqsubtel).ish ins(2)(pter->p16.2::q33.2->q22.2::p16.2->q33.2->qter)dn Karaman et al. 2009

Yorum;Mikroskobik olarak dengeli görünen bu de novo kompleks kromozom anomalisinin fenotip üzerine etkisinin a-CGH tekniği ile araştırılması gerekmektedir.

2pq subtel2pq wcp

Kompleks Kromozom AnomalilerininAydınlatılması

46,XY,t(2q;8q;13q)?

• Klinik yönlendirme varsa bilinen mikrodelesyon sendromları (~ 3-5Mb)

~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”

• Klinik yönlendirme varsa bilinen mikrodelesyon sendromları (~ 3-5Mb)

A. 46,--,del(22)(q11.2) . ishdel(22)(q11.2q11.2)(D22S75-)

Yorum; Olguda saptanan 22q11.2 bandındaki delesyonun fenotipi etkilemesi beklenmektedir. Bu delesyon DGS/VCFS ile uyumludur.

B. 46,--(D22S75x2)

Yorum; FISH incelemesinde D22S75 probu ile delesyon saptanmamıştır.

A B

47,XY,+mar

Marker kromozom: Çoğunlukla normal kromozom setine ilave, rutin bantlama teknikleri ile tanınamayan kromozomlar

47,XY,+mar 47,XY,+idic(15)(q12)(D15Z4+

+,SNRPN++)

Yorum; 15. kromozom kökenli, izodisentrik ilave kromozom, olguda 15p->15q12 için tetrazomiye yol açmaktadır ve fenotipi etkilemesi beklenmektedir.

Marker kromozomların yarısı fenotipi etkilemeyen ökromatin taşımayan kromozomlar olduğundan kromozomal kökeninin ve içeriğinin belirlenmesi gerekir (FISH veya a-CGH) !!!!

SNRPN

D15Z4

Kromozomal Polimorfizmler1, 9, 16 ve Y ve tüm akrosentrik kromozomlarda sentromer, satellit

bölgelerinde görülen uzama, duplikasyon, inversiyon, kısalma gibi özellikler “polimorfik bulgu” olarak tanımlanır ve toplumda yaygındır, sorun yaratmaz. Örn; inv9, Yqh++, 13ps++

Ender görülen heterokromatin bölge değişiklikleri ise yanlış tanıya götürebilir. Bu nedenle değişimin fenotip üzerine etkisi diğer tekniklerle araştırılmalı ve doğru tanıya gidilmelidir.

Polimorfizm ya da yapısal anomali??

46,--,22ps++Yorum; polimorfik bir özellik ve fenotipi etkilemesi beklenmemektedir

46,--,22p+. ishdup(22)(q11.1->q13.1)(wcp22, N25x2) Yorum; duplikasyon 22q11.1->q13.1, Fenotipi etkilenmesi beklenmektedir.

Tanım: Bir organizmada aynı bir zigottan kaynaklanan farklı genetik yapıda hücrelerin bulunmasıdır. • Mozaisizm, kromozom anomalileri ya da tek gen mutasyonları için olabilir. • Bir doku ile de sınırlı kalabilir. Fetal Kromozom Analizlerinde Karşılaşılan Mozaisizmler ve Sınıflandırması: 1. Psödomozaisizm (yalancı): Fetusta bulunmayan a. Tek kapta/klonda “Tek hücre mozaisizmi (SCM)”- 1. düzey b. Tek kapta “Çok hücre mozaisizmi (MCM)”- 2. düzey2. >2 kap/klonda “Gerçek mozaisizm” - 3. düzey Aynı bir kromozom anomalisinin;• farklı kültür kaplarında (“flask tekniği) • ya da farklı preparatlarda (in situ tekniği)>2 metafazda (monozomilerde >3 metafazda)

saptanması ile “gerçek mozaisizm” tanısı konur.

mos 45,X [25]/47,XXX [25]/46,XX [15] Mozaik Turner sendromumos 46,XY [25]/47,XY,+21 [25 ] Mozaik Down sendromu

Mozaisizm

Kadın-Doğum uzmanları ne bilmek ister? • Fetus normal ? anormal ? • Kötü gebelik prognozu için risk artmış

mı?

Kadın-Doğum uzmanları ne duymak istemezler?

• Yeni girişimler, ilave incelemeler, vs..

Fetal karyotip analizlerinde mozaisizm saptanırsa??

Örnek OlguRapordaki Bilgiler; İsim, materyalin cinsi (amniyon mayii), tarih

ve “Amniyon sıvısı kültürlerinden elde metafaz plaklarının GTG bant

tekniği ile yapılan mikroskobik değerlendirmesinde;50 metafaz plağında; 38 plakta 46,XY

9 plakta 47,XXY 3 plakta 47,XY,+21 1 plakta 48,XXY,+21 kromozom kuruluşu

gözlenmiştir. Gözlenen çoklu mozaik yapı nedeniyle fetusun kromozom kuruluşunun belirlenebilmesi için kord kanının değerlendirilmesi gereklidir.”

En önemli bilgi bu anomaliler kaç kültür kabında gözlendi??Amniosentez tekrarlandı ve sonuç; • fetus gerçek mozaik Klinefelter idi, • trizomi 21’ li hücreler ise görülmedi ve aile gebeliğe devam

kararı aldı.

Direkt Preparasyon

1. 46,XX,5p+2. 46,XX,5p+.ish idic(5)(p13.3)(wcp5pq+

+subtel5p-,5q++)

İleri anne yaşı ve patolojik USG nedeniyle uygulanan CVS de

Hücre Kültürü; 46,XX,del(5)(p13.3->pter)(subtel5p-)

Fetal karyotip; mos 46,XX,idic(5)(p13.3)/46,XX,del(5)(p13.3->pter)(subtel5p-)

Yorum; Fetus 5p13.3->pter için monozomi ve 5p13.3->5qter için trizomi taşımaktadır. Mozaisizmin dokulara dağılımı kesin olarak belirlenemez.Fetusun fenotipinin etkilenmesi beklenmektedir.

Moleküler KaryotiplemeOlgu Kontrol

Cy5 Cy3

Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays)

2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;

• 4391 olgudan 51 olguda array sonuçsuz, başarı %98,8

• 4282 nonmozaik karyotip ve 58 mozaik karyotip

Anomaliler Kromozom n Array tanıyabilir Array tanıyamaz

Anöploidiler (tri 21,18,13,X,Y ve 45,X)

374 374 0

Dengesiz yapısal 22 22 0

Marker kromozom 3 2 1 (heterokromatin)

Dengeli yapısal 40 0 40

Triploidi 17 0 17

(7 si SNP array ile tanınabilirdi)

Toplam 456 398 (%87.3) 58 (%12.7)

KARYOTİPLEME vs ARRAY

Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays)

2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;Normal karyotip saptanan prenatal olgu n:3822

1) Klinik anlamı bilinmeyen CNVs n: 94 (%2.5) Rapor edilmeyen CNVs n: 33 (%0.9) Rapor edilen CNVs n: 61 (%1.6)

2) Patolojik CNVs n: 35 (%0.9)

Endikasyon gruplarına göre klinik ile ilişkili CNVs İleri anne yaşı n: 1966 n:34 %1.7 Positiv Tarama Testi n:729 n:12 %1.6 Patolojik USG n:755 n:45

%6

Klinik ile ilişkili CNVs %2.5

Endikasyon Array-normal Array-şüpheli Array-patolojik Toplam olgu

Pat-USG2462 (%88.5) 135 (%4.9) 184 (%6.6) 2781

Pat-USG (soft markers) 72 (93.5) 3 (%3.9) 2 (%2.6) 77

MS-ST68 (%88.3) 5 (%6.5) 4 (%5.2) 77

Aile öyküsü461 (%94.7) 11 (%2.3) 15 (%3.1) 487

İleri Anne Yaşı337 (%97.4) 8 (%2.3) 1 (%0.3) 346

Psikolojik94 (%98.9) 1 (%1.1) 0 95

Diğer/?12 (%92.3) 0 1 (%7.7) 13

Toplam (canlı fetuslar

3506 (%90.5)

163 (%4.2) 207 (%5.3) 3876

Karyotipi “Normal” prenatal olgularda array sonuçları;

Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 979-985

Olgu KS 112 Karyotip endikasyonu; PATUSG (ventrikulomegali, CCA, ikiz eşi)Karyotip; 47,XX,+mar a-CGH endikasyonu; marker kromozomun aydınlatılması

47,XX,+mar . arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6

Konfirmasyon; FISHwcp 9 arm spesifik 9 p ve q subtelomerik prob

47,XX,+mar1/48,XX,+mar1,+mar2 [56/4]. ish 47,XX,+i(9)(p?)/ 48,XX,+i(9)(p?), +idic(9)(q21) 9ptel30(43N6x6, wcp9p++/wcp9q+, D9Z3++)[56/4]. arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6

Yorum; Olguda saptanan 2 marker kromozom da 9. kromozom kökenlidir. Olgu 9p24.3->q21.11 bölgesi için tetrazomi ve9p24.3->p23 bölgesi için hekzazomi taşımaktadır. Bu anomalinin fenotipi etkilemesi beklenmektedir.

Olgu GDPrenatal tanı endikasyonu; İleri anne yaşı+2’li testte artmış risk+ICSI (donuk embriodan)CVS Karyotipi 13.GH; 46,--,t(2;4)(p23;q31.1)dna-CGH endikasyonu; görünürde dengeli de novo resiprokal translokasyona-CGH sonucu normal

22. GH, 2. düzey USG; Ense plisi kalınlığında artışPTPN11 dizi analizi; 13. ekzonda heterozigot c.1529A>C de novo (Leopard sendromu’nda tanımlanmış bir mutasyon)

Kromozom Anomalierinin Tanısında Kullanılan Teknikler

Tüm genomu incelerDengeli kromozom anomalilerini tanırDüşük oranlı mozaikler saptanır3n/4n tanısı mümkün

Rezolüsyon daha düşüktür (5-10 Mb)Hücre kültürü gerektirirTanı subjektiftirOtomatizasyon zordur

Lokusa /kromozoma özeldirRezolüsyonu yüksektir <3Mb)Otomatizasyona uygundur3n/4n tanısı mümkün

Endikasyona göre hücre kültürü gerekirEndikasyona göre kullanılır

Tüm genomu incelerRezolüsyonu en yüksek (>100 Kb)Hücre kültürü gerekmezOtomatizasyona uygundur

Dengeli kromozomal değişimleri tanıyamazDüşük oranlı (<%10) mozaikleri tanıyamazBioinformatik çalışma gerektirirHenüz pahalı

ACOG (2009; Obstet and Gynecol, 114:5,1161-1163)

SIGU çalışma grubu (2012;Ultrasound Obstet Gynecol,

39:384-388)

1) konvensiyonel karyotipin yerini almaması gerektiği,

2) tüm gebeliklerde genel tarama için değil seçilmiş gebeliklerde özel tanı

amacıyla kullanılması gerektiğini,

3) prenatal tanıda özel endikasyonlarda;

i) izole veya multiple USG anomalisi saptanan gebelikler

ii) karyotip analizinde dengeli bile görünse de novo yapısal kromozom

anomalilerinde

iii) marker kromozomların karakterizasyonunda tamamlayıcı ikinci bir test

olarak kullanılmasını önermektedir

4) “hedefe yönelik array” testi öncesinde ve sonrasında verilecek danışmalarla,

anne babalar a-CGH in tüm patolojileri yakalayamayabileceği ve a-CGH

sonuçlarının yorumunun zor olabileceği konusunda bilgilendirilmeli

5) Array faydalı bir test olmakla birlikte, ilave çalışmalar (parental testler,

konfirmasyonlar) gerekebilir ve maliyet artar

ı