Teoretický úvod:

FLUORESCENCE

RYCHLÁ KINETIKA FLUORESCEN�NÍ INDUKCE

Praktikum fyziologie rostlin

2

FLUORESCENCE 1. Co je to fluorescence? Emisi zá�ení, ke kterému dochází p�i p�echodu excitované molekuly do základního stavu

souhrnn� ozna�ujeme jako luminiscenci. Pokud je excitace vyvolána absorpcí kvanta zá�ení

nazýváme emitované zá�ení fluorescence. Emitované zá�ení je charakterizováno v�tší

vlnovou délkou a nižší energií než zá�ení excita�ní.

U fotosyntetizujících organizm� je molekulou emitující fluorescenci zejména chlorofyl a po

exitaci viditelným nebo UV zá�ením. Fluorescence chlorofylu má sv�j p�vod v chloroplastech

zelených rostlin (p�esn�ji �e�eno, ve sv�tlosb�rných komplexech PS II a I) a odráží širokou

škálu proces�, které probíhají v jejich fotosyntetických aparátech b�hem konverze slune�ní

(excita�ní) energie na

chemickou energii p�enaše��

vodíku (NADPH) a

makroergických molekul

(ATP). Ve fotosyntetickém

aparátu je energie kvant

sv�telného zá�ení

absorbována v anténních

pigmentech PS II a I a

p�enášena do reak�ních

center obou fotosystém�

2. Zdroj fluorescence chlorofylu – fotosystém II (PSII)

Naprostou v�tšinu (cca 90%) fluorescence emituje p�i pokojových teplotách chlorofyl a

z reak�ního PS II, zatímco PS I fluoreskuje pouze velmi slab�. Je tedy d�ležité si uv�domit, že

informace o zm�nách ve fotochemickém využití zá�ení získané z m��ení fluorescence se

týkají pouze PSII. Po absorpci kvanta sv�telného zá�ení p�ejde elektron molekuly chlorofylu a

v reak�ním centru ze základního (S0) do excitovaného (S1 nebo S2) stavu. Ten je však velmi

nestabilní a elektron je p�edán na další molekulu nebo p�ejde do základního stavu a energie

vznikající p�i p�echodu z excitovaného do základního stavu je vyzá�ena.

Obr. 1. Absorp�ní spektra zeleného listu (vlevo – šedá=kyselina ferulová a další fenolické látky vázané v b.s., žlutá=karotenoidy, zelená=chlorofyly) a odpovídající fluorescen�ní emisní spektra (vpravo). Podle Buschman a kol. 2000.

3

Po absorpci kvanta sv�telného zá�ení molekulou chlorofylu dojde k jednomu z t�chto

konkuren�ních pochod� :

1. energie foton� je využita pro separaci náboje a p�enos elektronu ve sv�telné fázi

fotosyntézy (fotochemické využití energie)

2. energie foton� je vyzá�ena v podob� �erveného zá�ení s vlnovou délkou v�tší než 650

nm – fluorescence

3. energie foton� se rozptýlí na teplo – disipace (obr. 2)

Tyto t�i procesy si navzájem

konkurují, pokles zastoupení

jakéhokoli z t�chto deexcita�ních

proces� se projeví vzr�stem

zastoupení jiného (Govindjee,

1995).

Pouhých zhruba 3-5%

absorbované energie je vyzá�eno

jako fluorescence, což se jeví

jako zanedbatelné množství,

p�esto díky zm�nám fluorescence

m�žeme usuzovat na zm�ny

ú�innosti fotochemických reakcí

primární fáze fotosyntézy.

V p�ípad�, že je intenzita

fluorescence nízká, ú�innost

fotochemických reakcí primární

fáze fotosyntézy je vysoká a

naopak.

3. P�enos elektronu strukturami fotosyntetického aparátu

Chlorofyly absorbují ve dvou oblastech PAR – v oblasti modré a fialové a v oblasti �ervené.

Tomu také odpovídají dva typy excitovaných stav� – fotony z oblasti modré mají vyšší energii a

zp�sobí p�eskok elektronu na orbital od jádra vzdálen�jší (singletový stav II, SII), než foton

z oblasti �ervené (singletový stav I, SI, obr. 2). Energie mezi prvním a druhým singletovým

stavem se m�ní na energii tepelnou a není do reak�ního centra p�enášena.

Systém je uspo�ádaný tak, že sm�rem k reak�nímu centru množství energie pot�ebné

k excitaci molekuly pigmentu postupn� nepatrn� klesá (vlnová délka absorp�ního maxima

Obr. 2. Schéma absorpce zá�ení a deexcitace Po absorpci zá�ení elektron p�esko�í na orbital o vyšší energetické úrovni, molekula je ze základního stavu uvedena do stavu excitovaného (singletové stavy SI a SII). P�i deexcitaci (návratu elektronu na p�vodní orbital a molekuly do základního stavu) m�že být energie uvoln�na jako teplo nebo jako zá�ivá energie v oblasti viditelného sv�tla (jev zvaný fluorescence,emitované zá�ení má nižší energii a delší vlnovou délku). B = modré sv�tlo, nap�. 430 nm, R = �ervené sv�tlo, nap�. 680 nm. (Pavlová, 2006)

4

pigment� stoupá). Proto je na periferii LHC více molekul chlorofylu b, který má nižší absorp�ní

maximum než chlorofyl a, k jeho excitaci je tedy t�eba foton o vyšším obsahu energie.

V reak�ním centru je molekula chlorofylu a, která je excitována kvantem s nejnižším obsahem

energie, tady s nejvyšším absorp�ním maximem. Tak je zajiš�ován jednosm�rný p�enos energie

do reak�ního centra. (Pavlová, 2006)

V reak�ním centru fotosystém� se energie zá�ení m�ní na chemickou energii oxida�n� re-

duk�ních reakcí. V reak�ním centru dojde k excitaci jedné molekuly chlorofylu a ze speci-

fického páru, následuje vlastní fotochemická reakce – uvoln�ní elektronu (tzv. separace

náboje) se sou�asnou oxidací molekuly chlorofylu a a s redukcí prvního akceptoru elektronu.

Je zahájen sled oxida�n� reduk�ních reakcí, v nichž se uvoln�ný elektron p�enáší na další

akceptory. Oxidovaná molekula chlorofylu a p�ijme elektron od p�íslušného donoru a je

schopna další excitace.

Energie absorbovaná fotosyntetickými

pigmenty fotosystému II je p�enesena do

reak�ního centra II a zde zp�sobuje

exitaci molekuly chlorofylu a. V

excitovaném stavu je jeden elektron

v molekule chlorofylu na vn�jším

orbitalu vázán slab� a p�ejde na

molekulu feofytinu, která má k

elektronu vyšší afinitu než excitovaná

molekula chlorofylu a. Dojde k odd�lení

(separaci) náboje, tj. k p�edání elektronu

z molekuly chlorofylu a (donoru) na

molekulu feofytinu (akceptor).

Z feofytinu je elektron p�es atom Fe

p�edán na molekulu plastochinonu QA,

vázanou na protein D2, jejíž redoxní

potenciál je kladn�jší (mén� záporný)

než u feofytinu. QA se redukuje na QA-.

Charakter interakce QA s proteinem D2

umož�uje p�enos pouze jednoho

elektronu (QA je ve form� semichinonu). Elektron je transportován dále na QB (vázaný na D1),

vzniká redukovaný semichinon QB-. QA p�ijímá od feofytinu další elektron, uvoln�ný

z chlorofylu a, transportuje ho na QB- a vzniká QB2-. K plné redukci plastochinonu jsou však

t�eba ješt� dva protony (2H+), které QB2- p�ijme ze strany stromatu, �ímž se m�ní na PQH2

Obr. 3. Schéma PSII CP43, CP47 – hydrofobní proteiny; D1, D2 – proteiny reak�ního centra PSII; QA, QB – molekuly chinonu; Tyr 161 – tyrozinový zbytek v pozici 161 v proteinu D1; OEC – komplex rozkládající vodu, obsahuje 4 atomy Mn; P680 – pigment 680, molekula chlorofylu a s maximem absorpce 680 nm; v reak�ním centru jsou vázány 2 molekuly chlorofylu a, tzv. specifický pár. h� - foton. (Pavlová, 2006)

5

(plastochinol). V této form� je plastochinon vázán na D1 jen slab�, z vazebného místa se

uvolní do membrány. Vazebné místo na D1 se obsadí jednou z molekul PQ, které v nadbytku

voln� difundují mem-bránou thylakoidu. PQ má k vazebnému místu silnou afinitu a molekulu

PQH2 vyt�sní.

4. Kinetika indukované fluorescence chlorofylu a

Fluorescence chlorofylu není statická veli�ina, ale m�ní se v �ase. Když temnotn�

adaptovanou rostlinu vystavíme kontinuálnímu sv�tlu, intenzita fluorescence vykazuje

charakteristické zm�ny v �ase. Tyto zm�ny jsou zp�sobeny rozdíly v rychlostech fotochemie

na tylakoidální membrán� a fixace COB2B ve stromatu chloroplast�. Zatímco fotochemické

procesy na membrán� za�nou probíhat okamžit� po vystavení rostliny sv�tlu, metabolické

procesy ve stromatu startují daleko pozd�ji.

V temnotn� adaptovaném stavu, který je vzhledem k elektronov� transportním proces�m

fotochemicky neaktivním stavem thylakoidní membrány, jsou obecn� všechna reak�ní centra PSII

a p�enaše�e elektron� na akceptorové stran� PSII reoxidovány. V tomto stavu je možné

zaznamenat tzv. minimální výt�žek fluorescence (F0 nebo O), jestliže je vzorek v

p�edzatemn�ném stavu osv�tlen slabým m��ícím zá�ením fluorimetru. Je-li vzorek následn�

ozá�en krátkým satura�ním pulzem bílého sv�tla, zp�sobí tento satura�ní pulz rychlé uzav�ení

všech aktivních reak�ních center PSII, nebo� dojde k úplné redukci jejich primárního

elektronového akceptoru QBAB, doprovázené úplným vysycením fotochemických proces� v PSII.

Tehdy je zaznamenán tzv. maximální výt�žek fluorescence (FM).

Rozdíl mezi FM a F0 je ozna�ován jako maximální výt�žek variabilní fluorescence v temnotn�

adaptovaném stavu (FV). FV lze vypo�ítat ze vztahu:

Po zapnutí aktinického sv�tla (st�edn� silné sv�tlo, nej�ast�ji �ervené, optimální pro fotosyntézu)

se intenzita fluorescence zvyšuje až na FP (peak), maxima p�i dané intenzit� ozá�enosti, pak op�t

klesá, až se po n�kolika minutách ustálí na ur�ité hodnot� FS B (steady-state). Zm�na fluorescence

v �ase mezi F0 a FP je tzv. „rychlá fáze“ fluorescen�ní indukce a souvisí s primárními procesy

fotochemie na PSII. „Pomalá fáze“ fluorescen�ní indukce (FP až FS) souvisí s postupným

p�echodem fotosyntetického aparátu z temnotn� do sv�teln� adaptovaného stavu. Ten je

charakterizován nep�etržitou syntézou ATP, NADPH+H+ a soub�žnou fixací CO2. Jakmile se

procesy elektronového transportu a sp�ažených biochemických reakcí dostanou do rovnováhy, je

dosaženo i tzv. ustálené úrovn� (steady-state) výt�žku fluorescence (FBS).

Po zapnutí aktinického sv�tla (st�edn� silné sv�tlo, nej�ast�ji �ervené, optimální pro fotosyntézu)

se intenzita fluorescence zvyšuje až na FP (peak), maxima p�i dané intenzit� ozá�enosti, pak op�t

klesá, až se po n�kolika minutách ustálí na ur�ité hodnot� FS B (steady-state). Zm�na fluorescence

FV = FM – F0

6

v �ase mezi F0 a FP je tzv. „ rychlá fáze“ fluorescen�ní indukce a souvisí s primárními procesy

fotochemie na PSII a trvá p�ibližn� do 1s. „ Pomalá fáze“ fluorescen�ní indukce (FP až FS) souvisí

s postupným p�echodem fotosyntetického aparátu z temnotn� do sv�teln� adaptovaného stavu a

m�že trvat až n�kolik minut. Sv�teln� adaptovaný stav je charakterizován nep�etržitou syntézou

ATP, NADPH+H+ a soub�žnou fixací CO2. Jakmile se procesy elektronového transportu a

sp�ažených biochemických reakcí dostanou do rovnováhy, je dosaženo i tzv. ustálené úrovn�

(steady-state) výt�žku fluorescence (FBS). (Soukupová 2006)

5. Rychlá fáze fluorescen�ní indukce – OJIP k�ivka

Rychlá fáze fluorescen�ní indukce je definovaná jako záznam p�echodu fluorescence chlorofylu

b�hem n�kolika málo sekund z temnostn� adaptovaného stavu fotosyntetického aparátu po

ozá�ení krátkým pulzem aktinického sv�tla. Zaznamenaná k�ivka má n�kolik charakteristických

fází ozna�ovaných anglickými zkratkami O, J, I, P:

• O = origin, po�átek, odpovídá základní hladin� fluorescence chlorofylu a v temnostn�

adaptovaném stavu, také je ozna�ován jako F0.

• J a I = odrážejí krátkodobé rovnovážné stavy mezi vkladem exita�ní energie do PSII a

tokem energie z PSII pomocí redoxní kaskády chinon� (QA, QB, PQ) a dalších akceptor�

v elektrontransportním �et�zci PSII. Rovnovážné stavy J a I nastávají zpravidla po 2 a 30

ms od ozá�ení aktinickým sv�tlem

• P = peak, vrchol, odpovídá maximální hladin� fluorescence dosažitelné p�i daném ozá�ení.

Nár�st fluorescen�ního signálu z fáze

O (F0) do P (v p�ípad� satura�ního

pulzu FP = FM) vypovídá o postupném

poklesu koncentrace oxidovaného

chinonu QA a sou�asné akumulaci

jeho redukované formy QA-. �asový

pr�b�h OJIP p�echodu odráží

postupnou redukci zásobníku (poolu)

elektronových akceptor� PSII

(jednoelektrolového p�enaše�e QA,

dvouelektronového QB a mobilního

plastochinonu). QA je ur�ující faktor,

na kterém závisí vzr�st fluorescence

p�i OJIP p�echodu.

Obr. 4. Rychlá fáze fluorescen�ní indukce (nár�st fluorescence chlorofylu, OJIP k�ivka) m��ená na listu 9-ti denní pšenice fluorimetrem Plant Efficiency Analyser (PEA, Hansatech, Norfolk, UK). P�evzato z Rohá�ek et al. 2008

7

6. Vybrané Fluorescen�ní parametry odvozené z OJIP k�ivky

Ze tvaru a jednotlivých hodnot OJIP k�ivky m�žeme odvodit r�zné fluorescen�ní parametry, které

se dají ve fyziologických studiích využít k interpretaci d�j� ve fotosyntetickém aparátu nap�íklad

pod vlivem r�zných stresových faktor�, což budete mít možnost vyzkoušet i b�hem jedné z úloh.

FO, F0 minimální FChl v temnotn� adaptovaném stavu, m��ený ve fázi O – 50µs po zapnutí aktinického sv�tla

FP, FM FChl ve fázi P pro danou intenzitu aktinického sv�tla, v p�ípad� satura�ní ozá�enosti FM = maximální FChl

FV variabilní FChl FV = FP – FO, v p�ípad� satura�ní ozá�enosti FV = FM-F0 FJ FChl ve fázi J pro danou intenzitu aktinického sv�tla FI FChl ve fázi I pro danou intenzitu aktinického sv�tla ΦP0 maximální výt�žek FChl v temnotn� adaptovaném stavu je mírou maximální

fotochemické kapacity PS II. Pro mnoho r�zných rostlinných druh� m��ených v nestresových podmínkách je jeho pr�m�rná hodnota rovna 0,8. U stresovaných nebo poškozených rostlin je pom�r FV/FM výrazn� snížen (nap�. na 0,5), a tak velikost ΦP0 slouží jako citlivý indikátor fotoinhibice nebo jiného typu poškození komplex� PS II. ΦP0 = (FM - F0) / FM = FV / FM = FP – FO / FP

7. Vliv stresu vysokých teplot na fotosyntetický apartá a tvar OJIP k�ivky

Fotosyntetická aktivita chloroplast� je záma jako velmi citlivá k teplot�. P�i vyšších teplotách

dochází v listech ke snížené produkci kyslíku, snížené fixaci CO2 a k významné inhibici

fotofosforylace. Vysoké teploty zp�sobují rozvoln�ní gran v chloroplastech, p�ípadn�

disociaci anténního komplexu PSII. V n�kterých studiích je popisován i pozm�n�ný transport

elektron� mezi chinony QA a QB. Práv� tyto zm�ny lze snadno detekovat pomocí m��ení

fluorescence chlorofylu.

Obr. 5. Teplotní závislost na tvaru OJIP k�ivky P�i ošet�ení teplotou nad 40°C je na k�ivce patrná další fáze v nár�stu fluorescence – K, která m�že v n�kterých p�ípadech (48°C) vykazovat nejvyšší hladinu fluorescence v celém p�echodu z FO do FP. Výsledky získány na listových ter�ících hrachu Pisum sativumL. ošet�ených p�íslušnou teplotou po dobu 5 minut. P�evzato z Srivastava a kol. 1997.

8

P�i vysokých teplotách dochází díky výše zmín�ným fyziologickým zm�nám i ke zm�n� tvaru

nebo absolutních hodnot n�kterých fází fluorescen�ní OJIP k�ivky. Nap�íklad bylo

zaznamenáno snížení variabilní FChl FV a to hlavn� díky poklesu FP (FM).

8. Význam fluorescence ve fotosyntetickém výzkumu

Záznam fluorescence vyza�ované molekulami Chl a se ve fotosyntetickém výzkumu stal

základem široce využívané metody, která dovolila pochopit fotochemické a nefotochemické

procesy probíhající v tylakoidní membrán� chloroplast�. Emise fluorescence z molekul

chlorofylu fixovaných v chloroplastech zelených rostlin je citlivým indikátorem

fotosyntetických proces�, probíhajících v �asové škále od mikrosekund (tj. pro rychlé

primární fotochemické d�je) až po mnoho minut (tj. pro pomalé regula�ní a enzymatické

procesy ve stromatu chloroplast�). Vyhodnocením fluorescen�ních induk�ních k�ivek (FIK)

lze získat tzv. fluorescen�ní parametry, které umož�ují kvalitativn� i kvantitativn�

charakterizovat funk�nost fotosyntetického aparátu rostlin, jejich fyziologický stav, úrove�

stresu, jemuž jsou rostliny vystaveny a též detailn� studovat d�je probíhající v thylakoidních

membránách v obou fotosystémech (PS I a PS II), sv�tlosb�rných komplexech, mechanizmy

regulující elektronový transport, fotoinhibi�ní a ochranné procesy apod.

Literatura:

Pavlová L. Fyziologie rostlin (skriptum). Karolinum. 2006.

Srivastava A. et al. Regulation of antenna structure and electron transport in Photosystem II of Pisum sativum under elevated temperature probed by the fast polyphasic chlorophyll a fluorescence transient: OKJIP. Biochimica et Biophysica Acta. – Bioenergetics: 1320, str. 95-106. 1997.

Rohá�ek 2006

Sokupová 2006

Buschman 2000

Govindjee 2005

9

Zadání praktických úloh k tématu:

FLUORESCENCE

P�ehled úloh k vypracování:

Úkol 1: Rychlá kinetika fluorescen�ní indukce 1a) Ov��te p�sobení herbicidu diuronu na listy kuku�ice seté pomocí zm��ení a analýzy rychlé fluorescen�ní indukce (OJIP) kapesním fluorimetrem FluorPen.

1b) Použijte rychlou kinetiku indukované fluorescence pro porovnání stavu fotosyntetického aparátu a identifikaci kontrolních rostlin a rostlin stresovaných vysokou teplotou.

10

Úkol 1: Rychlá kinetika fluorescen�ní indukce Cíl: P�edstavit m��ení fluorescence jako možný neinvazivní a nedestruktivní zp�sob detekce raných fází stresu fotosyntetického aparátu.

Hypotéza, kterou b�hem práce ov��íme: Narušení funkce fotosyntetického aparátu vlivem stresu ovlivní intenzitu fluorescence, zm�nu intenzity je možné m��it.

Díl�í úlohy:

1a) Ov��te p�sobení herbicidu diuronu na listy kuku�ice seté pomocí zm��ení a analýzy rychlé fluorescen�ní indukce (OJIP) kapesním fluorimetrem FluorPen.

1b) Použijte rychlou kinetiku indukované fluorescence pro porovnání stavu fotosyntetického aparátu a identifikaci kontrolních rostlin a rostlin stresovaných vysokou teplotou.

Úloha 1a: Ov��te p�sobení herbicidu diuronu na listy kuku�ice seté pomocí zm��ení a analýzy rychlé fluorescen�ní indukce (OJIP) kapesním fluorimetrem FluorPen. Princip: Herbicid diuron - DCMU (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) je specifický

inhibitor fotosyntézy. DCMU blokuje vazebné

místo plastochinonu – p�enaše�e elektron� ve

fotosystému II - a p�erušuje tak p�enos elektron�

z PSII na molekulu plastochinonu. P�erušení

elektrontransportního �et�zce v PSII zamezuje

p�em�n� zá�ivé energie na chemickou. DCMU

p�sobí výhradn� na p�enos elektronu mezi PSII

reak�ním centrem a plastochinonem, nemá p�ímý

ú�inek na PSI nebo další fáze fotosyntetických

reakcí.

Energie fotosynteticky aktivního zá�ení zp�sobuje v reak�ním centru PSII excitaci elektronu

v molekule chlorofylu a. Energie excitovaného elektronu m�že být využita t�mito

konkuren�ními cestami (Obr. 2): bu elektron p�ejde do základního energetického stavu a

odpovídající energie se p�em�ní na teplo, nebo je vyzá�ena v podob� �erveného zá�ení

Obr. 6: Herbicid diuron 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethyl-mo�ovina. V �R se tento herbicid nepoužívá.

11

(s maximem kolem 700 nm) - fluorescence, �i je využita v kaskád� navazujících fotochemických

reakcí – fotosyntéza. Tato tzv. fotochemická cesta zahrnuje rozd�lení náboje a p�enos elektronu

p�es �adu p�enaše�� – jedním z prvních je práv� plastochinon. Po vazb� plastochinonu s DCMU

není tento schopný p�enášet elektrony a v�tšina energie excitovaného elektronu je vyzá�ena jako

fluorescence. K�ivka rychlé kinetiky indukované fluorescence nemá po aplikaci diuronu klasický

n�kolikafázový tvar (Obr. 7.).

Pot�eby:

• kuku�ice setá (Zea mays), rostliny staré p�ibližn� týden

• kádinka s vodou • kádinka s roztokem herbicidu

DCMU • papírová krabice na zakrytí

rostlin p�i adaptaci na tmu • kapesní fluorimetr FluorPen (PSI

Brno) • stolní po�íta� s možností

bluetooth komunikace a softwarem FluorPen

Provedení:

1. P�ipravte si do kádinky 500 µM

roztok DCMU – 1ml zásobního roztoku napipetujte do 100 ml vodovodní vody.

2. Aplikujte roztok DCMU na list kuku�ice.

• Aby herbicid ú�inkoval tém�� okamžit�, je pot�eba list jemn� poškodit. Sta�í

když list ve dvou místech vzdálených od sebe cca 2cm p�eložíte. Pono�te list

p�ibližn� na 30s do roztoku diuronu (Je výhodné list zlomit blízko u špi�ky,

lépe se pak pono�í do kádinky s roztokem herbicidu).

3. Stejn� naložte s listem jiné rostliny, ale pono�te jej do �isté vodovodní vody – bude

sloužit jako kontrola.

• Je s výhodou si listy na špi��e ozna�it fixem, a� jste si jisti, co m��íte ;-)

4. Rostlinu nechte po dobu 10-15 minut adaptovat na tmu (pod papírovou krabicí) –

dojde k utlumení fotochemických d�j�, všechna reak�ní centra PSII se otev�ou –

oxidují, stejn� tak jako další �lánky elektrontransportního �et�zce PSII.

5. Po uplynutí doby pot�ebné k adaptaci na tmu opatrn� nadzvihn�te krabici a zm��te

rychlý nástup indukované fluorescence pomocí kapesního fluorimetru FluorPen.

• Pracujte rychle, nechte rostlinu stále stín�nou krabicí, a� nemusíte opakovat

fázi adaptace na tmu.

Obr. 7. Tvar OJIP k�ivek

12

• Do svorky fluorimetru uzav�ete oblast listu mezi dv�ma zlomy – tam bude

p�sobení herbicidu nejvíce patrné!

• Zm��te rychlý nástup indukované fluorescence i u nepoškozeného listu – bude

vám sloužit jako druhá kontrola.

6. Stáhn�te nam��ená data z fluorimetru do po�íta�e. V softwaru FluorPen si prohlédn�te

OJIP k�ivky kontrolního a herbicidem ošet�eného listu. Graf si pomocí PrintScreen

p�eneste jako obrázek do dokumentu a vytiskn�te.

7. Zaznamenejte z tabulky také následující parametry a porovnejte mezi kontrolním a

herbicidem ošet�eným listem.

Úloha 1b: Použijte rychlou kinetiku indukované fluorescence pro porovnání stavu fotosyntetického aparátu a identifikaci kontrolních rostlin a rostlin stresovaných vysokou teplotou. Pot�eby:

• kuku�ice setá (Zea mays), rostliny staré p�ibližn� týden • sušárna p�edeh�átá na 45°C • papírová krabice na zakrytí rostlin p�i adaptaci na tmu • kapesní fluorimetr FluorPen (PSI Brno) • stolní po�íta� s možností bluetooth komunikace a softwarem FluorPen

Provedení:

1. Rostliny kuku�ice nechte 10 minut inkubovat v sušárn� p�i teplot� 45°C.

2. Po 10ti minutách rostliny vyjm�te, nechte 5 minut p�i pokojové teplot� na sv�tle.

3. Rostliny nechte po dobu 10-15 minut adaptovat na tmu (pod papírovou krabicí) –

dojde k utlumení fotochemických d�j�, všechna reak�ní centra PSII se otev�ou –

oxidují, stejn� tak jako další �lánky elektrontransportního �et�zce PSII.

4. Rychle a opatrn� vyjm�te rostliny z krabice a zm��te rychlý nástup indukované

fluorescence pomocí kapesního fluorimetru FluorPen.

5. Stáhn�te nam��ená data z fluorimetru do po�íta�e. V softwaru FluorPen si prohlédn�te

OJIP k�ivky kontrolního a vysokou teplotou stresovaného listu. Graf si pomocí

PrintScreen p�eneste jako obrázek do dokumentu a vytiskn�te. Do protokolu

vysv�tlete p�í�inu tvaru OJIP k�ivek.

kontrola herbicid diuron FO FP FV FI FJ

13

6. Do protokolu zaznamenejte z tabulky také následující parametry a porovnejte mezi

kontrolním a vysokou teplotou stresovaným listem.

Vyhodnocení experiment�: Vypracujte protokoly, ve kterých zdokumentujete a vyhodnotíte získaná

experimentální data.

Vysv�tlete p�í�inu tvaru OJIP k�ivek, vysv�tlete rozdíly mezi kontrolní

variantou a variantou ošet�enou herbicidem, vysv�tlete efekt vysoké teploty.

kontrola vysoká teplota FO FP FV FI FJ

14

Manuál k ovládání kapesního fluorimetru FluorPen

Obecné instrukce: Tla�ítko MENU používáte pro listování v nabídce Tla�ítko SET používáte jako „ enter“ pro spoušt�ní �i vstup do jednotlivých funkcí nabídky Pokud se v nabídce ztratíte, ma�kejte tak dlouho tla�ítko MENU, dokud se nedostanete na položku RETURN, pak stiskn�te SET a dostanete se o úrove� výš.

M��ení rychlé kinetiky fluorescen�ní indukce (O-J-I-P k�ivky) 1. Zapn�te p�ístroj dlouhým stiskem tla�ítka SET 2. Tla�ítkem MENU listujte v nabídce dokud nenajdete položku MEASURE 3. Pokud v projdete celou nabídku a položku MEASURE nenajdete, najete na

RETURN a stiskn�te SET. Tímto se dostanete v nabídce o úrove� výš. Postup opakujte, dokud nenarazíte na položku MEASURE, pak stiskn�te SET.

4. Listujte v nabídce parametr� a najdete OJIP, nic nema�kejte v tuto chvíli je p�ístroj p�ipraven k m��ení.

5. Podle instrukcí v postupu úlohy uzav�ete list kuku�ice do svorky fluorimetru. Svorka musí t�snit, ale nep�itla�ujte ji silou, abyste list nepoškodili.

6. Když máte p�ipravený list, stiskn�te SET. Probíhá m��ení, na displeji m�žete sledovat pokrok procesu v %. Když se na displeji ukáže znova OJIP, m��ení bylo dokon�eno.

7. P�ístroj je p�ipraven k dalšímu m��ení. 8. Když dom��íte, stáhn�te data do po�íta�e a p�ístroj vypn�te.

Stažení dat z FluorPenu do po�íta�e

Nastavení FluorPenu, zapnutí bluetooth komunikace 1. Pokud jste zrovna dom��ili, listujte v nabídce na položku RETURN a stiskn�te SET.

Dostanete se do hlavní nabídky. 2. Listujte hlavní nabídkou a najd�te položku SETTING BLUETOOTH, MEASURE

AND SOUND, stiskn�te SET. 3. M�li byste mít kurzor na položce BT_OFF. Pokud ne, listujte dále pomocí MENU

tla�ítka až tuto položku najdete. 4. Stiskn�te SET – položka se zm�ní na BT_ON. P�ístroj je p�ipraven komunikovat

s po�íta�em pomocí bluetooth.

Stažení dat pomocí software FluorPen 1. Otev�ete program Fluorpen (ikona se zeleným listem) 2. Na horní lišt� v nabídce klikn�te na SETUP a vyberte DEVICE ID. 3. Po�íta� by se m�l spojit s fluorimetrem. Vždy zkontrolujte, zda máte zapnutou

bluetooth komunikaci na fluorimetru! 4. Po p�ipojení se vám zp�ístupní levá horní ikona pro stažení dat do

po�íta�e, klikn�te na ni a �íselné hodnoty parametr� z OJIP k�ivky se zobrazí v okn� DATA. Soubor uložte pomocí ikony s disketou nebo pomocí menu FILE.

5. Po stažení dat vypn�te bluetooth na fluorimetru. 6. Dosta�te se do hlavní nabídky a vyhledejte položku DATA BROWSE AND

ERASE. Smažte nam��ená data a vypn�te fluorimetr dlouhým stiskem tla�ítka MENU.

7. Zaznamenejte si do protokolu požadované parametry. 8. P�epn�te dole na záložku GRAPH. Prohlédn�te si získané OJIP k�ivky a pomocí

funkce printscreen si je p�eneste do dokumentu, který následn� vytiskn�te. 9. pomoc v boji se softwarem �i tiskem požádejte vyu�ujícího.

Nevíte-li si rady, požádejte o asistenci vyu�ujícího. Selže – li všechno, použijte anglický manuál �