Terapia fagica

Selezione del fago fD2 specifico per l’E.

coli O157:H7

Ruolo dei fagi nella ecologia

microbica

I fagi sono gli organismi più diffusi sul

pianeta. Il loro numero è stato stimato

intorno a 1031

Il numero dei batteri è di poco più piccolo.

I fagi controllano la moltiplicazione dei

batteri e quindi il riciclo di una enorme

massa organica.

Terapia fagica

I fagi

Twort (1915)

d’Herelle (1918)

La resistenza agli antibiotici

Il ritorno della terapia fagica

Terapia fagica: il contesto

2001

Loeffler et al., Science, 294, 2170

Nelson et al., Proc Ntl Acad Sci, USA, 98, 4107

Lisina fagica attiva contro lo Streptococcus

pnemoniae

2002

Schuck et al., Nature, 418, 884

Lisina fagica attiva contro il Bacillus antracis

Terapia fagica: il contesto2002

Cerveny et al., Inf. Immun., 70, 625

Fago attivo contro il Vibrio vulnificus

Biswas et al., Inf. Imm, 70, 204

Fago attivo contro l’Enterococcus faecium

2003

Merril et al., Nature Review Drug Discov, June 2, 489.

Loeffler et al. Inf. Immun. 71, 6199

Lisina fagica attiva contro lo Streptococcus pneumoniae

Campbell A. Nature Review Genetics, 4, 471.

2004

Schoolnick G., Summers W. J.

Watson. Nature Biotechnology 22,

506

Projan S. Nature Biotechnology 22,

167

Thiel K. Nature Biotechnology, 22,

31

Fischetti V. Lancet, The Lancet

Infectious Diseases, 4, 246.

Dixon B. The Lancet Infectious

Diseases 4, 186.

Terapia fagica: il contesto

Fagi attivi contro batteri

intracellulari

Broxmeyer et al (J. Inf.Dis. 2002, 186,

1155) hanno dimostrato che è possibile

usare il Mycobacterium smegmatis, un

micobatterio avirulento, come vettore per

trasferire all’interno dei macrofagi il fago

litico TM4. Il metodo è risultato efficace in

vitro nel ridurre il numero dei micobatteri

M. avium o M. tuberculosis intracellulari.

Terapia fagica. Vantaggi rispetto agli antibiotici.

I fagi sono attivi contro ceppi batterici antibiotico-

resistenti

Ceppi vancomicina-resistenti di

Enterococcus faecium (Biswas et al.,

Infect. Immun. 2002, 70, 204).

Ceppi meticillina-resistenti di

Staphylococcus aureus (Matsuzaki et al.,

J. Infect. Dis. 2003, 187, 613).

Limiti della terapia fagica. I batteri

sviluppano resistenza contro i fagi

Il tasso con cui i batteri sviluppano resistenza ai

fagi è circa 10 volte più basso del tasso con cui

compare la resistenza agli antibiotici

(Sulakvelidze et al., Antimicrobial. Agents and

Chem., 2001, 45, 649) .

Nelson et al. (PNAS 98, 4107, 2001), Schuck et al.

(Nature, 418, 884, 2002) non sono riusciti ad isolare

batteri fago-resistenti; sono però riusciti ad isolare

facilmente batteri antibiotico-resistenti.

Diverse tossine batteriche

sono prodotte da fagi

• La tossina del Corynebacterium diphteriae.

• La tossina del Vibrio cholerae.

• La tossina Shiga dell’E. coli.

• Gli Streptococchi del gruppo A sono molto

eterogenei dal punto di vista genetico e della

virulenza. Gran parte di queste differenze sono dovute

alla presenza di batteriofagi.

Limiti della terapia fagica

I fagi vengono riconosciuti dal sistema

immune innato ed eliminati entro poche

ore dalla somministrazione

I fagi hanno un host-range ristretto.

Non danneggiano la normale flora intestinale (vantaggio)

Impiego limitato nella pratica clinica (svantaggio).

L’ingegneria genetica ha però sviluppato fagi modulari (che esprimono non uno, ma diversi recettori) in grado di infettare diverse specie batteriche (Merril et al., Nature Reviews, 2003,2, 489)

Terapia fagica

Data la straordinaria diversità dei fagi, non è

difficile isolare il fago con l’host range

desiderato.

E. coli O157:H7Ceppo non patogeno di E.coli

Terapia fagica: selezione per

l’attività litica in vitro102 PFU fW /tubo

106 CFU ceppo E. coli non patogeno

2h

102 PFU fW /tubo

107 CFU ceppo E. coli non patogeno

Dopo 10 cicli di selezione:

102 PFU fW in 2h lisano 102 CFU E. coli

102 PFU fD1 in 2h lisano 109 CFU E. coli

Terapia fagica: selezione del fago

fD1 per la persistenza nel sangue

108 PFU fD1

Titolo fagico

8h: 5x103 PFU/ml

24h: 0

Titolo del fago fD1 dopo 5 cicli di selezione:

18 h: 4x103 PFU/ml

Protocollo 1

Terapia fagica. Selezione del fago

fD1 per la persistenza nel sangueProtocollo 2

G1: 108 PFU fD1/topo G1: 108 PFU fD1/topo

G1: 109 CFU E. coli non pat/topo

Titolo fD2 nel sangue al G 38:

4x108 PFU/ml

G1: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

G2: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

G3: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

G4: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

Titolo fD2 nel sangue al G 38:

7x109 PFU/mlMerril et al. (Proc Ntl Acad Sci, USA, 1996, 93, 3188):

2x103 PFU/ml a 24h (inoculo iniziale: 5x107 PFU)

L’efficacia della selezione è il

risultato della:

Brevità delle generazioni (di fagi e batteri)

Elevata densità delle popolazioni (di fagi e

batteri)

Aploidia (che consente ad una mutazione di

esprimersi anche se in copia singola)

Somministrazione ai topi del ceppo non

patogeno di Escherichia coli (che ha

consentito alla popolazione fagica di

espandersi esponenzialmente)

Terapia fagica. Storia naturale del fago

fW.

fW (il fago selvaggio, isolato dal letame)

fD1 (fW selezionato rispetto alla virulenza)

fD2 (fD1 selezionato rispetto alla persistenza nel

sangue)

Distribution of phage fW and fD2 in vivoa 1

Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml)

Phage Time (h) Liver Spleen Blood

fWb

6

3.3 x 107

± 1.1 x 107

3.0 x 107

± 2.6 x 107

1.8 x 104

± 1.0 x 104

fD2b

6

0

0

3.2 x 106

± 1.0 x 106

2

a Values are means ± s.d. of three replicas. 3

b Phage number inoculated at time 0: 10

8 PFU/mouse. 4

Distribution of phage fW and fD2 in vivoa 1

Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml)

Phageb Time (h) Liver Spleen Blood

fW

24

3.6 x 106

± 1.5 x 106

3.3 x 106

± 1.5 x 106

0

fD2

24

0

0

1.3 x 107

± 0.6 x 107

2

a Values are means ± s.d. of three replicas. 3

b Phage number inoculated at time 0: 10

8 PFU/mouse. 4

Distribution of phage fW and fD2 in vivoa 1

Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml)

Phage Time (h) Liver Spleen Blood

fW

48

3.4 x 108

± 1.2 x 108c

3.9 x 108

± 1.3 x 108c

0

fD2

48

0

0

1.9 x 108

± 0.5 x 108c

2

a Values are means ± s.d. of three replicas. 3

b Phage number inoculated at time 0: 10

8 PFU/mouse. 4

c Phage replicate in vivo, presumably infecting E.coli bacteria present 5

in the intestinal tract. 6

Terapia fagica. Stabilità del fago fD2.

fD2 ha conservato per oltre 8 mesi il

livello di virulenza e persistenza acquisiti

attraverso la selezione. Nel corso di questi

mesi è stato amplificato e congelato

infinite volte.

Terapia fagica. Caratterizzazione del

fago fD2.

Terapia fagica. Caratterizzazione

del fago fD2.

Terapia fagica. fW ed fD2 sono

imparentati tra loro.

fW e fD2 analizzati con 6 diversi random primers

fW fW fW fW fW fW

fD2 fD2 fD2 fD2 fD2 fD2

M M

PCR gene msp dei fagi fW e fD2

fW = a, c

fD2 = b, d

M = marker

Terapia fagica. Selezione del fago

fD1 per la persistenza nel sangueProtocollo 2

G1: 108 PFU fD1/topo G1: 108 PFU fD1/topo

G1: 109 CFU E. coli non pat/topo

Titolo fD2 nel sangue al G 38:

4x108 PFU/ml

G1: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

G2: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

G3: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

G4: 2.5x108 CFU E. coli non pat/topo

Titolo fD2 nel sangue al G 38:

7x109 PFU/mlMerril et al. (Proc Ntl Acad Sci, USA, 1996, 93, 3188):

2x103 PFU/ml a 24h (inoculo iniziale: 5x107 PFU)

Il fago mutante fD2 è diventato

rapidamente dominante

fW

M

fD2 fW fD2

Antibacterial activity of phage fW and fD2 in vivoa

1

Bacterial titer (CFU/gr)

Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces

E. coli O157:H7b

6

3.7 x 108

± 1.2 x 108

3.5 x 108

± 1.2 x 108

4.2 x 108

± 1.7 x 108

4.5 x 108

± 2.4 x 108

E. coli O157:H7b

+ fWc

6

7.3 x 107

± 2.1 x 107

1.7 x 107

± 0.6 x 107

4.2 x 107

± 1.7 x 107

2.8 x 107

± 1.5 x 107

E. coli O157:H7b

+ fD2c

6

2.7 x 106

± 2.1 x 106

3.3 x 106

± 1.5 x 106

4.7 x 106

± 1.5 x 106

4.2 x 107

± 1.9 x 106

2

a Values are means ± s.d. of three replicas.

3

b 10

7 CFU/mouse. 4

c 10

8 PFU/mouse. 5

Antibacterial activity of phage fW and fD2 in vivoa

1

Bacterial titer (CFU/gr)

Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces

E. coli O157:H7b

24

2.6 x 108

± 1.5 x 108

3.7 x 108

± 1.2 x 108

3.5 x 109

± 1.3 x 109

4.1 x 109

± 2.1 x 109

E. coli O157:H7b

+ fWc

24

1.7 x 105

± 0.3 x 105

2.4 x 105

± 0.8 x 105

11.6 x 107

± 0.2 x 107

6.0 x 105

± 1.5 x 105

E. coli O157:H7b

+ fD2c

24

7.2 x 102

± 2.5 x 102

4.2 x 102

± 3.0 x 102

3.0 x 102

± 1.5 x 102

4.2 x 102

± 3.0 x 102

2

a Values are means ± s.d. of three replicas.

3

b 10

7 CFU/mouse. 4

c 10

8 PFU/mouse. 5

Antibacterial activity of phage fW and fD2 in vivoa

1

Bacterial titer (CFU/gr)

Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces

E. coli O157:H7b

48

5.3 x 108

± 2.5 x 108

4.2 x 108

± 1.8 x 108

7.2 x 109

± 2.5 x 109

6.0 x 109

± 2.2 x 109

E. coli O157:H7b

+ fWc

48

4.0 x 104

± 1.7 x 104

2.0 x 104

± 0.5 x 104

7.0 x 105

± 2.0 x 105

4.3 x 105

± 0.9 x 105

E. coli O157:H7b

+ fD2c

48

0

0

0

0

2

a Values are means ± s.d. of three replicas.

3

b 10

7 CFU/mouse. 4

c 10

8 PFU/mouse. 5

Terapia fagica. Attività terapeutica

del fago fD2.

Gruppo di controllo

G1 - 40 topi: 107 CFU E.coli patogeno

G5 – n° topi morti: 39/40

Gruppo sperimentale

G1 - 40 topi: 107 CFU E.coli pat + 108 PFU fD2

G10 – n° topi morti: 16/40

Curve di sopravvivenza dei topi

trattati con il fago fD2 (A) e non (B).