TERAPIA GENICA

Transferencia de material genético para tratar/corregir una enfermedad causada por la ausencia, o mal funcionamiento de un gen.

• EX-VIVO vs IN- VIVO

• CÉLULAS SOMATICAS vs CÉLULAS MADRE/ PRECURSORAS (STEM CELLS)

USO DE RETROVIRUS EN TERAPIA GENICA

Vector Viral Recombinante que contiene el gen terapeútico

Infección in vitro de células

Selección de las células corregidas

Ex-vivoIn vivo

Consideraciones:

- Riesgo de efectos secundarios

- Eficiencia de la transferencia de genes

- Expresión contínua del gen terapeútico

CONSIDERACIONES EN LA TERAPIA GENICA

- Conocer y entender la causa de la enfermedad

- Conocer la estructura y función del gen a introducir

- Eficiencia de la transferencia del gen en células blanco

- Control de la expresión del gen

- Prevención y control de la respuesta inmune

- Riesgo de efectos secundarios (ej: uso de vectores virales)

- Ensayos en animales

- Ensayos clínicos

ESTRATEGIAS DE TERAPIA GENICA

• Reemplazo del gen

• Incremento de la expresión del gen (Gene augmentation therapy, GAT), por ej.: fibrocis cistica.

• Corrección del gen

• Eliminación dirigida de celulas blanco específicas (ej. uso combinado de virus + prodrogas)

• Inhibición de la expresión de un gen (gen ablation)- ej: antisense, ribozimas, RNA de interferencia

.

Inhibición de la expresión

• Ribozymes ( Ribozimas)– pueden cortar el mRNA específico

• Antisense oligos (oligonucleótidos antisentido)– inhiben la traducción del mRNA

• siRNA (small interference RNA)− RNA pequeño de interferencia dirigido a un mRNA

específico induciendo el corte del mRNA en fragmentos pequeños (de aprox. 23 pb)

5’- - c g g a g u c a c u u c g - - 3’ mRNA 3’ G C C U C A U G A A G C 5’

AIAGCGGCG

GCCGC

UC

C

G U

AGU

AG

U

Ribozima

Mecanismo de corte por ribozima

Targeted Killing -Genetic Pro-drug Activation Therapy

Targeted Killing -Genetic Pro-drug Activation Therapy

viral vector

thymidine kinasegene

tumour cell

ganciclovir phosphate

ganciclovir

tk

(Tóxico sólo si ha sido fosforilado)

Transferencia del GenTransferencia del Gen

In vivo: el vector se trasfiere directamente al paciente (inyectable, respirado)

Ex vivo: se modifica las celulas del paciente en el laboratorio antes de re-introducirlas (ej. hepatocitos, fibroblasto, celulas hematopoyeticas, etc.)

METODOS DE TRANSFERENCIA DEL DNA EXOGENO A CELULAS EUCARIOTES

I. Metodos fisicos: - transfección - microinjección- bombardeo de partículas de DNA recubiertas con

tungsteno, oro (“gene gun”)- electroporación

II. Metodos no virales: liposomas, transferencia mediada por receptores.

III. Metodos virales: virus de DNA, virus de RNA.

METODOS DE TRANSFERENCIA

I. Metodos físicos

No limitado por el numero de genes o tamaño de fragmento. Poco eficiente.

- Inyección de DNA desnudo

- Electroporación

- Gene gun

Gene Gun (pistola de genes)

EFECTO DE LA ELECTROPORACION EN MEMBRANA

II. Metodos no virales

- liposomas- transferencia mediada por ligandos o receptores

específicos

Desventajas:- Expresión transiente- Baja eficiencia de transferencia de genes

III. Metodos Virales

- Mayor eficiencia de transducción

- Mayor riesgo

• Retrovirus : ej.:- Moloney murine leukaemia virus (Mo-MuLV), HIV

• Adenovirus

• Herpes Simplex (HSV)

• Virus Adeno-asociados (AAV)

• Lentivirus

Retrovirus

- Alta eficiencia

-Requiere que la célula esté en división

- Hasta 8 kb

- Integración al genoma del hospedero

- Alto riesgo

Adenovirus: Alta eficiencia de transducción

•Hasta 8 kb

•Infecta celulas diferenciadas y tambien en replicación

•Desventajas: - Expresión transiente (gen no integrado al genoma) - Las proteinas virales pueden ser expresadas - Problemas por la respuesta inmune

Herpes Simplex: fragmentos largos

- expresión por mayor tiempo

- sistema nervioso central

- poco eficiente

Adenovirus

Se puede direccionar al virus hacia un tejido o tipo de célula en particular, acoplando ligandos para receptores específicos.

CELULA DE EMPAQUETAMIENTO

(para la producción de particulas virales recombinantes)

CELULA DE EMPAQUETAMIENTO

(liberación de particulas virales recombinantes, infectivas pero no replicativas)

CONSIDERACIONES EN LA TERAPIA GENICA

- Conocer y entender la causa de la enfermedad

- Conocer la estructura y función del gen a introducir

- Eficiencia de la transferencia del gen en células blanco

- Control de la expresión del gen

- Prevención y control de la respuesta inmune

- Riesgo de efectos secundarios (ej: uso de vectores virales)

- Ensayos en animales

- Ensayos clínicos

CLONACION

TERAPEUTICA

Defecto en la actividad de la Adenosina

Deaminasa (ADA)

Primer Protocolo de Terapia Génica (1990)

Sindrome de Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID)

Protocolos de Terapia Génica en Cancer.

RNA de interferencia en la terapia para Cancer

• Cancer Gene Therapy - From the publishers of Nature. • Current Gene Therapy - From Bentham Science Publishers. • Gene Therapy - From the publishers of Nature. • Human Gene Therapy - Journal published by Mary Anne Liebert,

Inc. • The Journal of Gene Medicine - Official journal of the European

Society of Gene Therapy (ESGT), Japan Society of Gene Therapy (JSGT), and the Australasian Gene Therapy Society (AGTS).

• Molecular Therapy - A monthly journal published by the American Society of Gene Therapy (ASGT).

• Other Publications

Gene Therapy Journals(Scientific, peer-reviewed publications targeted to clinicians and researchers.)