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LÍDIA DORNELAS DE FARIA
TERAPIA POR ONDAS DE CHOQUE
ELETROHIDRÁULICAS AUMENTA A ATIVIDADE DA
ERK-1/2 E Akt EM TÍBIAS ÍNTEGRAS DE RATOS
POR 21 DIAS APÓS ESTÍMULO INICIAL
CAMPINAS
2015
ii
iii
Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Ciências Médicas
LÍDIA DORNELAS DE FARIA
TERAPIA POR ONDAS DE CHOQUE ELETROHIDRÁULICAS
AUMENTA A ATIVIDADE DA ERK-1/2 E Akt EM TÍBIAS ÍNTEGRAS
DE RATOS POR 21 DIAS APÓS ESTÍMULO INICIAL
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, área de concentração
em Fisiopatologia Cirúrgica
Orientadora: Prof. Dr. William Dias Belangero
CAMPINAS
2015
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação
defendida pela aluna LÍDIA DORNELAS DE FARIA e
orientada pelo PROF. DR. WILLIAM DIAS BELANGERO
Assinatura do Orientador
IV
V
VI
vii
RESUMO
A Terapia por ondas de choque (TOC) é uma alternativa não invasiva utilizada
como método de indução a formação óssea que consiste em pulsos sonoros de
alta energia transmitidas de modo focal a um tecido específico.
Artigos demonstram aumento de vascularização, que ativação de proteínas como
BMP (bone morphogenic protein) e Erk (extracellular signal-regulated kinase)
induzindo diferenciação osteogênica após sua utilização no tecido ósseo.
O presente estudo visou avaliar os níveis das proteínas Erk e Akt
(akutely transforming), envolvidas na cascata protéica responsiva a deformação
celular gerada por estímulo mecânico e consequente transformação em estímulo
bioquímico induzindo a osteogênese.
Os animais selecionados para o estudo foram anestesiados e divididos em
dois diferentes grupos, onde no dia 1, o primeiro grupo foi submetido a TOC em
sessão única de 500 impulsos gerados por aparelho eletrohidráulico a
0,12mJ/mm² na tíbia intacta e o segundo não recebeu TOC. Na sequência,
os animais foram divididos em 3 subgrupos para cada tempo de segmento de
7, 14 e 21 dias
A determinação dos níveis das proteínas propostas foi realizada por meio de
immunoblotting. A fosforilação das proteínas Erk e Akt dos tecidos ósseos das
tíbias extraídas dos ratos aumentou nos grupos submetidos a TOC após
7, 14 e se manteve elevado até o 21° dia quando comparado ao controle.
viii
ix
ABSTRACT
Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a non-invasive alternative used as a
method for inducing bone formation that consists of high-energy acoustic pulses
transmitted in a focal way to a specific tissue. Studies show increase in
vascularization and expressions of angiogenic growth factors which activate
proteins such as BMP (bone morphogenical protein) and Erk (extracellular
signal-regulated kinase), inducing osteogenic differentiation after its use in the
bone tissue.
The present study aimed at evaluating the levels of Erk and Akt (acutely
transforming) proteins involved in the protein cascade responsive to cell
deformation in biochemical stimulus inducing osteogenesis.
Thirty male Wistar rats were selected randomly and divided in two different groups.
The control group received anesthesia and the treated group was submitted to
anesthesia and shock wave therapy in a single 500 pulse-session generated by an
electrohydraulic device at 0,12mJ/mm² in intact tibia and fibula and the second did
not receive ESWT. Then the animals were divided into 3 sub-groups, one for each
segment times of 7, 14 and 21 days.
Immunoblotting analysis was performed to determine the levels of the proposed
proteins. The Erk and Akt protein phosphorylation of the bone tissues of extracted
tibia from the animals increased in the groups submitted to ESWT and kept
elevated until the 21st day when compared to the control group.
x
xi
SUMÁRIO
Pág.
RESUMO...................................................................................................... vii
ABSTRACT.................................................................................................. ix
DEDICATÓRIA............................................................................................ xiii
AGRADECIMENTOS................................................................................... xv
LISTA DE FIGURAS.................................................................................... xvii
LISTA DE TABELA..................................................................................... xix
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................... xxi
1- INTRODUÇÃO......................................................................................... 1
1.1- Tecido ósseo - Composição.......................................................... 1
1.1.1- Matriz Óssea.......................................................................... 2
1.1.2- Células ósseas....................................................................... 3
1.2- Formação óssea.............................................................................. 5
1.2.1- A célula mecanosensora........................................................ 6
1.2.2- Mecanotransdução................................................................. 10
1.2.3- Integrinas e quinase de adesão focal (Fak)........................... 12
1.3- As vias das proteínas Erk e Akt.................................................... 12
1.4- Terapia por ondas de choque....................................................... 14
1.4.1- Princípios da geração das ondas de choque........................ 15
1.4.2- Aplicabilidade em patologias ósseas..................................... 15
xii
2- OBJETIVOS............................................................................................. 18
2.1- Geral................................................................................................. 18
2.2- Específico........................................................................................ 18
3- MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 19
3.1- Animais............................................................................................ 19
3.2- Métodos........................................................................................... 20
3.2.1- Estímulo por ondas de choque............................................... 20
3.2.2- Extração do tecido ósseo....................................................... 21
3.3- Immunoblotting............................................................................... 23
3.3.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt)
envolvidas no processo de mecanostransdução do tecido
ósseo.....................................................................................
23
3.3.1.1- Eletroforese.............................................................. 23
3.3.1.2- Immunoblotting......................................................... 25
3.4- Análise Estatística......................................................................... 26
4- RESULTADOS........................................................................................ 27
4.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt)
envolvidas na sinalização do estímulo mecânico nos ossos
das tíbias........................................................................................
27
5- DISCUSSÃO............................................................................................ 31
6- CONCLUSÕES........................................................................................ 36
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 37
8- ANEXOS.................................................................................................. 44
xiii
Aos meus pais,
Dirceu e Rosa Maria
pelo amor incondicional.
Ao meu namorado
sempre presente,
Sandro
por todo apoio e compreensão,
Ao meu irmão,
Diego
pela amizade.
Aos animais,
minha fonte de inspiração.
xiv
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por me proporcionar saúde e
sabedoria durante as horas de estudo.
Ao meu orientador, Dr. William pela confiança, oportunidade e
ensinamentos de realizar o mestrado e colaboração neste trabalho.
À grande amiga, Juliana Vecina pela amizade, acolhimento, paciência e
disposição em me ensinar e ajudar a qualquer momento, além dos conselhos e
incansáveis horas de laboratório.
A Capes pela bolsa concedida para que o projeto fosse realizado com
sucesso.
À Nilza, grande amiga e companheira, fundamental para que esse
trabalho pudesse ser realizado durante todos os momentos dessa jornada.
Alexandre Gabarra pelos ensinamentos e incentivos.
Ao Dr. Mário Abdalla Saad pela disponibilidade de sua estrutura de
laboratório e auxílio de seus alunos durante o experimento.
Ao Mariolani, pelo convívio e ajuda profissional.
Ao amigo Vinícius Gusmão por ter me passado sua experiência e ajuda
no processo do presente estudo.
A grande amiga Valéria, incentivadora do meu ingresso na Unicamp.
Ao meu namorado e grande incentivador de todas as horas, Sandro.
Pela paciência nos momentos de ausência e apoio incondicional nesse trabalho.
Aos meus pais pelo dom da vida e por terem me proporcionado amparo
emocional e estabilidade para que eu pudesse prosseguir em meus sonhos.
xvi
xvii
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 Esquema representativo das células ósseas (Junqueira e
Carneiro, 2004)........................................................................
4
Figura 2 Esquema ilustra a amplificação do estímulo mecânico.......... 9
Figura 3 Esquema da disposição das integrinas.................................... 11
Figura 4 Representação esquemática do desenho do estudo............. 14
Figura 5 Procedimento onda de choque: (a) aparelho de onda de
choque (b) procedimento de terapia de onda de choque na
tíbia no rato sob anestesia.......................................................
19
Figura 6 Procedimento de extração ósseo: (a) osso da tíbia e fíbula
extraídos (b) adição do nitrogênio líquido (c) masseração do
osso (d) osso masserado (e) masseração no cadinho
(f) politronagem do material masserado com Triton.................
20
Figura 7 Esquema representativo do processo de pipetagem do gel
de acrilamida, seguido da eletroforese e transferência para a
membrana de nitrocelulose, adição dos anticorpos dos
anticorpos e por fim representação após procedimento de
revelação.................................................................................
22
Figura 8 Gráficos e Blots demonstram a fosforilação em tecido ósseo
de pAkt e Akt em 7, 14 e 21 dias..............................................
26
Figura 9 Gráficos e Blots demonstram a fosforilação em tecido ósseo
de pErk e Erk em 7, 14 e 21 dias.............................................
29
xviii
Figura 10 Efeito do estímulo mecânico produzido pela terapia por
ondas de choque, onde Blots representativos demonstram a
fosforilação em tecido ósseo de pErk Os resultados
representam a média ± DP de 5 animais/grupo.......................
30
xix
LISTA DE TABELA
Pág.
Tabela 1 Apresentação dos valores numéricos da medida em pixels da
densitometria óptica das diferentes bandas e suas
respectivas médias e desvio padrão.........................................
28
xx
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS
Akt Akutely transforming
AMPc Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
BMP Bone morphogenic protein
BMP-2 Bone morphogenic protein-2
CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
CEUA/IB Comissão de Ética em Experimentação Animal
DP Desvio padrão
Erk Extracellular signal-regulated kinase
Fak Quinase de adesão focal
FCM Faculdade de Ciências Médicas
FDA Food and Drug Administration
GC Grupo controle
GT Grupo tratado
IGF-1 insuline-like growth factor
ip Intra peritoneal
xxii
JNK c-Jun amino (N)-terminal kinases
kDa Kilo Daltons
LICRI Laboratório de Investigação Clínica de Resistência à Insulina
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MEC Membrana extracelular
MPa Mega Pascals
NF-κB Fator nuclear kappa B
NO Óxido nítrico
PCR Polymerase chain reaction
PGE Prostaglandina
PI3K Fosfoinositídeo 3-quinase
RAKNL Receptor de ativação do fator nuclear kappa B
Tc-DPD Technetium 3.3-diphosphono-1.2-propandicarbon acid
TGF-β1 Fator de transformação de crescimento β1
TOC Terapia por ondas de choque
USbp Ultrassom de baixa potência
VEGF vessel endothelial growth factor
1
INTRODUÇÃO
O osso apresenta como principal função o suporte da carga do corpo, é
responsável também por proteção dos órgãos, armazenar cálcio, nutrientes e
realizar hematopoiese por ter em seu interior a medula óssea, responsável pela
produção das células vermelhas do sangue (Ham, 1983, Carvalho, 2003,
Junqueira e Carneiro, 2004), fatores endógenos como hipotiroidismo (Chow et al.,
1997), tumores (Marx, 1997), osteoporose e o desbalanço nos níveis de cálcio,
podem interferir no metabolismo do tecido ósseo (Frost, 1973, Oliveira, 2003,
Coleman, 2006, Hughes e Petit, 2010)
O osso responde dinamicamente as alterações da carga mecânica,
sendo, portanto o fundamental mecanismo para que ocorram a formação e a
degradação ósseas balanceadas em formato e micro arquitetura (Duncan e
Turner, 1995, Marx, 1997, Carvalho, 2003, Oliveira e Guimarães, 2003) .
1.1- Tecido ósseo - Composição
O tecido ósseo maduro é classificado como um tecido conjuntivo
especializado constituído por células e uma matriz extracelular mineralizada,
a matriz óssea e suas duas principais formas são imaturo (não lamelar) ou maduro
(lamelar). O esqueleto embrionário é formado pelo osso membranoso, o qual
persiste até a idade dos 4 anos e também em calo ósseo de fraturas de adultos e
crianças. Os ossos longos como o fêmur e tíbia e os chatos que são os ossos do
crânio e escápula são os dois tipos presentes na estrutura do corpo humano
(Marx, 1997, Oliveira e Guimarães, 2003, Gartner e Hiatt, 2007, Young et al.,
2007).
O osso longo é composto pelas epífises, localizadas em suas
extremidades as quais são recobertas por cartilagem e logo abaixo, as metáfises
que durante a fase de crescimento possuem cartilagem de crescimento. A região
2
epífise-metafisária é composta por osso trabecular ou esponjoso, que consiste em
uma rede de finas pontes ósseas chamadas trabéculas, sendo essa, uma região
rica em tecido medular hematopoiético e de intensa atividade metabólica
(Gartner e Hiatt, 2007).
Entre as metáfises, há uma porção chamada diáfise ou corpo do osso,
por onde passa o canal medular, região essa que é formada por osso cortical e é
externamente revestida pelo periósteo e internamente por tecido mesenquimal
chamado endósteo. No interior das diáfises há uma rede de condutos para os
vasos sanguíneos, nutrientes e nervos, denominados canais de Havers,
dispostos longitudinalmente e os canais de Volkman transversalmente
(Marx, 1997, Oliveira e Guimarães, 2003, Gartner e Hiatt, 2007, Young et al.,
2007).
1.1.1- Matriz óssea
A matrix extracelular é formada por duas partes, a inorgânica e a
orgânica. A porção inorgância corresponde a 65% do peso seco total do osso e é
constituída por bicarbonato, citrato, magnésio, sódio e potássio,
mas por principalmente, cálcio e fósforo em formato de cristais de hidroxiapatita
Ca10(PO4)6(OH)2 (Gartner e Hiatt, 2007). O componente orgânico é composto por
95% de colágeno tipo I e pequenas quantidades de glicoproteínas e
proteoglicanos, sendo em sua totalidade, constituinte de 35% do peso seco do
tecido (Gartner e Hiatt, 2007). A associação da hidroxiapatita com o colágeno é o
que torna o osso elástico e resistente (Marx, 1997).
O tecido ósseo apresenta em sua composição os canais de Havers,
e perpendicularmente a eles, os espaços vasculares chamados canais de
Volkmann. Cada canal haversiano possui osteoblastos em sua periferia interna e
abriga células osteoprogenitoras (Gartner e Hiatt, 2007). O osso apresenta em sua
estrutura uma grande quantidade de canalículos, os quais são responsáveis pela
3
nutrição e troca de íons entre a corrente sanguínea e os osteócitos,
as células mais numerosas nesse tecido (Junqueira e Carneiro, 2004).
1.1.2- Células ósseas
Os osteoblastos se localizam de forma perfilada na superfície óssea,
onde assumem aparência cuboide e possuem intensa atividade de síntese da
porção orgânica e de mineralização da matriz óssea, possuem grande importância
na formação óssea por meio da produção da fosfatase alcalina e osteocalcina.
No entanto quando sua atividade é diminuída, assumem a forma achatada e são
aprisionados pela matriz óssea dando origem aos osteócitos (Figura 1) (Oliveira e
Carvalho, 2003, Junqueira e Carneiro, 2004). Os osteócitos são células pequenas
e estreladas, as quais comunicam entre si por meio de prolongamentos
citoplasmáticos delgados em diversas direções localizados em lacunas na matriz
óssea, apresentam pouca atividade metabólica, mas importante papel na
manutenção óssea por emitirem sinais entre si quando o osso é submetido ao
estresse mecânico (Marx, 1997, Oliveira e Carvalho, 2003).
4
Figura 1- Osteoblastos localizados na periferia do canalículo sintetizam a matriz
orgânica (em sua maioria colágeno tipo I), após a mineralização da
matriz óssea, dão origem aos osteócitos. Os osteoclastos se encontram
na periferia da matriz óssea (Junqueira e Carneiro, 2004).
Os osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção da matriz
óssea dos osteócitos, devido as vilosidades para o transporte iônico presentes em
sua estrutura, onde há concentração de anidrase carbônica, ajuda a acidificar a
superfície, induzindo a reabsorção e apoptose dos osteócitos, dessa forma,
novos osteblastos são gerados (Ham, 1983, Marx, 1997, Carvalho, 2003).
Segundo Hughes e Petit (2010), o osteócito é a principal célula óssea
capaz de responder ao estímulo mecânico, pois apresenta receptores em formato
de cílios que são mecanosensíveis, tendo papel fundamental na renovação
celular. Há quarenta anos, com o auxílio da microscopia eletrônica, foi provado
que as células ósseas apresentam cílios, no entanto somente na última década foi
confirmada a correlação dessas estruturas com a regulação da homeostase e
formação óssea (Revisado por Hoey et al., 2012). Os cílios são estruturas finas
5
que projetam do citoplasma, geralmente numerosas e curtas constituídas por
microtúbulos, que possuem subunidades proteicas α e β tubulina, apresentam
comprimentos variados de 2 a 10μm e de forma coordenada, permite que
correntes de fluidos impulsionem o contato entre si (Junqueira e Carneiro, 2004).
1.2- Formação óssea
O crescimento ósseo compõem um processo fisiológico e controlado
decorrente da ativação e subsequente formação celular. Esse processo,
inicialmente descrito por Harold Frost em 1964, ocorre de forma simultânea em
todo o esqueleto e é composto por três fases principais: crescimento, remodelação
e modelagem (Frost, 1973, Duncan e Turner, 1995, Hughes, 2010).
O esqueleto maduro por sua vez, passa por constante reabsorção e
formação em resposta ao estímulo mecânico por sofrer desgaste como qualquer
outra estrutura, a sua renovação é baseada na permanente remoção constante da
matriz óssea que envolve os osteócitos, os quais são substituídos ao longo de
meses por osteoblastos que promovem a síntese de matriz óssea e a formação de
um novo osso, dessa forma, o osso está em contínuo processo de remodelação
com simultânea formação óssea osteoblástica e reabsorção osteoclástica.
Caso uma dessas vias, absorção e formação, forem alteradas, tal processo é
afetado levando a diminuição da densidade óssea (Neto, 2003, Carvalho, 2003,
Gartner e Hiatt, 2007).
Crescimento: ocorre até os 20 anos de idade, regulado principalmente
por hormônios e consiste no crescimento trabecular em tamanho do esqueleto
(Oliveira e Guimarães, 2003, Hughes, 2010).
Remodelação: ocorre no osso adulto durante toda a vida do indivíduo,
devido ao desgaste natural e micro lesões induzidas pela contínua variedade de
estímulos mecânicos oriundos de atividade física e força gravitacional,
o que incorre na remodelação óssea. Esse processo leva a reabsorção dos
6
osteócitos pelos osteoclastos e a renovação do tecido ósseo, gerando novos
osteoblastos (Oliveira e Guimarães, 2003, Hughes, 2010, Little et al., 2011).
Tal ciclo dura cerca de 3 a 4 meses, sendo influenciado pelo desuso e pelo
exercício físico, promovendo a reabsorção e formação respectivamente.
Modelagem: Corresponde ao processo biológico que mantém a forma,
resistência e tamanho do osso, ou seja, consiste em uma segunda fase que ocorre
após o remodelamento. Após uma fratura ser consolidada, e o calo ósseo ser
formado, ocorre o modelamento do calo ósseo, em que os osteoclastos absorvem
o tecido antigo e os osteoblastos promovem novo tecido ósseo a ser mineralizado
em sincronia, organizando a fratura que muitas vezes está em desvio (Oliveira e
Guimarães, 2003, Hughes, 2010).
Por outro lado, as vias pelas quais estas células entram em apoptose
devido ao desuso ainda não são totalmente conhecidas (Hughes e Petit, 2010).
Relatos demonstraram que a falta de aporte nutricional decorrente da pressão
irregular de fluidos associados à alteração na remoção de toxinas induz a
apoptose prematura dos osteócitos, resultando em balanço negativo e aumento da
porosidade óssea (Bonewald, 2006).
1.2.1- A célula mecanossensora
Todas as células ósseas são sensíveis a estímulos do meio ambiente,
tais força gravitacional e atividade física diária, os quais têm ação sobre o
metabolismo ósseo (Temiyasathit, 2010). Julius Wolff em 1892 descreveu a Lei de
Wolff, que inicialmente propôs que o tecido ósseo possuía a capacidade de
adaptar-se a diversas solicitações mecânicas ou cargas, e que responde com
formação, se houver estresse mecânico ou reabsorção em consequência da
diminuição do mesmo (Rice 1988, Frost, 2003, Frost, 2004, Little 2011).
7
Em 1964, Frost lançou a teoria do mecanostato, em que o tecido ósseo
possui um sensor de deformações que dirige a resposta celular para
dois caminhos, o da formação ou o da reabsorção, assim deformações relativas
menores do que 50-100μstrain (1-2Mpa=0,1-0,2kg/mm2) seriam consideradas
insuficientes e promoveriam a reabsorção óssea enquanto que deformações entre
1500 até 3000μstrain (60MPa=6kg/mm2) produziriam microfraturas e estimulariam
a sua neoformação. Para que se tenha uma ideia destes valores fraturas são
produzidas por pelo menos 25.000μstrain (120MPa=12kg/mm2) (Duncan e Turner,
1995, Frost, 2003, Scott et al., 2008).
Os osteoblastos, precursores dos osteócitos, são responsáveis pela
produção de componentes orgânicos proteicos e RANK (receptor de ativação do
fator nuclear kappa B), assim como a osteocalcina e osteopontina, responsáveis
por formação e mineralização ósseas (Gartner e Hiatt, 2007). Os fatores
endócrinos paratormônio, vitamina D3, prostaglandina 2 e interleucinas 1 e 2,
secretados naturalmente pelo organismo, estimulam a produção de RANK-L
(receptor de ativação do fator nuclear kappa B ligante), o fator de diferenciação
dos osteoclastos. O RANK-L é produzido na superfície dos osteoblastos e ao se
ligar ao receptor (RANK) na superfície dos osteoclastos imaturos, estimula a
diferenciação dos mesmos e consequente reabsorção óssea. No entanto para que
haja o equilíbrio da reabsorção, a osteoprotegerina, também produzida pelos
osteoblastos, atua competindo pelo sítio de RANK-L e limita a diferenciação dos
osteoclastos (Little et al., 2011).
Por muitos anos, os osteoblastos foram estudados como efetores na
renovação celular e os osteoclastos pela reabsorção. No entanto, os osteócitos
(célula mais numerosa no tecido ósseo), ganharam repercussão no processo da
osteogênese, pois estão envolvidos de forma direta no reconhecimento do
estímulo mecânico, devido a suas propriedades físicas de sustentação e
bioquímicas de renovação celular mediante a estímulos mecânicos (Burger et al.,
1995, Martin, 2007, Bonewald, 2006).
8
Os osteócitos são células que respondem aos estímulos mecânicos ou
de cisalhamento que ocorrem na sua parede pelo fluxo de líquido que existe nos
canalículos que ligam estas células entre si, causando assim, uma série de
reações bioquímicas a nível intracelular responsáveis pela ativação das células
mesenquimais. Esse processo mecânico e bioquímico ou biológico é denominado
de mecano transdução. Em resposta a esse estímulo, os osteócitos liberam
osteocalcina, AMPc (monofosfato cíclico de adenosina) e fatores de crescimento,
promovendo manutenção da homeostase e saúde ósseas (Gartner e Hiatt, 2007).
A presença de BMP (bone morphogenic protein), importante proteína reguladora
da proliferação e diferenciação celular, observada in vitro após o estímulo por fluxo
de fluido contínuo, também reforça a hipótese de que os osteócitos sejam
considerados células primárias na mecanotransdução óssea (Santos et al., 2011).
Ao contrário dos osteoblastos (localizados na periferia do tecido ósseo),
os osteócitos estão presentes em torno do sistema canalicular distribuídos pela
estrutura lamelar e próximos entre si, dessa forma, devido a seu grande número e
localização, estes desempenham importante papel na manutenção da matriz
óssea por possuírem maior comunicação intercelular. Apresentam
prolongamentos citoplasmáticos semelhantes a cílios que são sensibilizados
durante a deformação mecânica e a sua mobilização promove o contato e
comunicação entre as células vizinhas, o que leva a ativação dos mecanismos
osteogênicos dos osteoblastos e geram novos osteócitos (Gusmão e Belangero,
2009).
Os prolongamentos citoplasmáticos estão permeados pelo fluido
intersticial, o que favorece a mobilidade e o contato entre os cílios adjacentes, que
quando submetidos ao estresse mecânico, de forma que um gradiente de pressão
é gerado movendo este fluido, o qual pressiona as áreas de tensão promovendo o
contato entre os mesmos e então a amplificação do estímulo mecânico e ativação
dos osteócitos (Tate, 2003) (Figura 2), o que desencadeia a mobilização
intracelular de óxido nítrico (NO), prostaglandina (PGE) e adenosina trifosfato
(ATP) (Hughes e Petit, 2010).
9
Figura 2- Esquema ilustra a amplificação do estímulo mecânico no espaço
pericelular (PEM) na membrana extracelular (MEC) permeado por
fluido onde se localizam os processos citoplasmáticos dos osteócitos,
permitindo a comunicação entre essas células e levando ao
desencadeamento da resposta bioquímica intracelular (Modificado de
Gusmão e Belangero, 2009).
Para elucidar como a presença dos processos citoplasmáticos é capaz
de induzir a osteogênese por meio do estímulo mecânico (Reinholt et al., 1990,
Choi et al., 2008), estudos in vitro simulam o efeito semelhante por meio do fluxo
de fluido, processo de agitação induzindo pressão de fluidos em células em cultivo
(Weinbaum et al., 1994). Dentre esses estudos, Malone e col. (2007) utilizaram a
osteopontina, proteína estrutural extracelular óssea, que está envolvida na cascata
proteica de ativação da remodelação, para avaliar a resposta dos cílios dos
osteoblastos ao estímulo por fluxo de fluido. Diante a esse estímulo, foi observado
o aumento da expressão gênica dessa mesma proteína, no entanto, o mesmo não
aconteceu em modelos celulares em que os processos citoplasmáticos foram
previamente removidos pela utilização de cloro hidratado.
10
1.2.2- Mecanotransdução
O processo de interação entre um estímulo mecânico,
gerando deformação do tecido ósseo em nível de membrana plasmática,
sua transmissão pelo citoesqueleto e a consequente reação bioquímica
intracelular, é denominada mecanotransdução, o que promove o equilíbrio entre a
apoptose e a proliferação celular óssea (Gusmão e Belangero, 2009). O estresse
mecânico ou elétrico ao ser aplicado em um tecido ósseo, gera o aumento da
pressão de fluidos, e a consequente comunicação intercelular óssea, que por sua
vez ativa fatores de crescimento em osteoblastos e consequentemente dos
osteócitos (Mikic e Carter, 1995, Hung, et al., 1996).
Quando esse estímulo mecânico é aplicado sobre o tecido ósseo,
e é formada a força de arrasto no meio fluido pericelular, ocorre a amplificação
desse estresse em 20 a 100 vezes. Isso demonstra que a célula necessita de uma
deformação relativa ou strain maior do que o tecido ósseo como um todo para
responder e desempenhar seu papel na mecanotransdução. Essa formação óssea
ocorrerá após 3 a 5 dias do estímulo aplicado, tempo esse, o necessário para que
ocorra toda a transmissão da deformação e diferenciação das células
osteoprogenitoras em novos osteoblastos. (Duncan e Turner, 1995).
É conhecido que a carga e a atividade física estimulam a renovação
óssea (Carvalho, 2003), no entanto, métodos geradores de estímulos físicos como
ultrassom terapêutico e a terapia por ondas de choque (TOC) também são
capazes de gerar o estímulo de deformação mecânico o qual será amplificado no
sistema canalicular por meio do fluxo de fluidos levando ao desencadeamento da
resposta bioquímica intracelular (Rockett e Sousa, 2007, Gusmão et al, 2010).
Este processo é regulado pela mecanotransdução, ou seja, pela ação
dos osteócitos que funcionam como sensores mecânico biológicos que a partir de
um estímulo mecânico induzem respostas biológicas mediadas por proteínas que
atuam no interior das células do tecido ósseo regulando em parte, a remodelação
do esqueleto (Duncan e Turner, 1995, Gartner e Hiatt, 2007, Gusmão e Belangero,
2009, Temiyasathit, 2010).
11
A resposta celular decorrente do processo da mecanotransdução,
é iniciada por meio de muitas proteínas transmembrana, dentre elas os canais
iônicos e integrinas (Figura 3), além de proteínas do citoesqueleto associadas à
liberação de fatores de crescimento (Wang et al., 2007), esse sistema gerado
entre a matriz extracelular, integrinas e citoesqueleto interage com o núcleo e
permite a transmissão do estímulo mecânico gerado no tecido ósseo, o que gera
deformação da membrana extracelular até o núcleo (Duncan e Turner, 1995).
De acordo com a disposição dessas estruturas, ocorre um sistema de alavancas,
de forma em que cada uma se conecte com a outra e permita interações
sincronizadas da transmissão da deformação mecânica recebida (Gusmão e
Belangero, 2009).
Figura 3- Esquema da disposição das integrinas apresentando os dois
heterodímero α e β localizados no espaço transmembrana compondo
o citoesqueleto. Actina, vinculina e Paxilina também compõe o
citoesqueleto e apresentam relevante função na adesão local
(Adaptado de Turner e Pavalko, 1998).
12
1.2.3- Integrinas e quinase de adesão focal (Fak)
As integrinas estão dispostas na membrana plasmática das células,
e conectam o citoesqueleto a estruturas da matriz extracelular, como colágeno e
fibronectina. Apresentam-se em heterodímeros compostos por cadeias
glicoprotéicas α e β os quais se ligam a α-actina do citoesqueleto, dessa forma,
permitem a migração das células ao longo da matriz extracelular (Gartner e Hiatt,
2007).
A transdução dos sinais bioquímicos para o meio intracelular também é
função das integrinas, as mesmas são ativadas pela FAK (focal adhesion kinase),
que quando sofrem a deformação mecânica, ativam as cascatas de sinalização de
diversas proteínas no meio intracelular, promovendo assim a ativação do ciclo
celular, regulação da expressão gênica, incluindo regulação de apoptose celular e
reorganização do citoesqueleto (Gartner e Hiatt, 2007).
Segundo Gusmão e Belangero (2009), esta deformação mecânica
estimula a Fak (focal adhesion kinase), que ao sofrer deformação mecânica,
sofre autofosforilação no resíduo de tirosina-397 (Tyr-397) e ativa as cascatas de
sinalização de diversas proteínas no meio intracelular, dentre elas as vias Akt
(akutely transforming) Fak/PI3K/Akt/NF-κB e da Erk (extracellular signal-regulated
kinase) por meio de FAK-Src/Grb2/Sos/Ras-Raf/Mek/Erk-1/2.
1.3- As vias das proteínas Erk e Akt
As proteínas do grupo das MAPK (Mitogen-activated protein kinase) são
responsáveis por reconhecer o estímulo mecânico externo e convertê-los em
resposta celular. Suas vias estão presentes em todas as células eucarióticas e
envolvidas nos processos de mitose, motilidade, expressão de genes,
diferenciação, sobrevivência e apoptose. Dentre as mais estudadas desse grupo
estão as JNK (c-Jun amino (N)-terminal kinases), p-38 e Erk (Cargnello, 2011).
13
A Erk é uma proteína efetora que pode exercer suas funções no
citoplasma e núcleo, isto é a indução da migração, proliferação e diferenciação
celular, além da inibição da apoptose. Sua ativação ocorre pelos receptores
tirosina quinase na superfície celular (Cargnello e Roux, 2011). Apresenta várias
isoformas, destacando-se Erk-1 (44 kDa) e Erk-2 (42KDa), esta última sendo a
mais importante na resposta ao estímulo mecânico (Gusmão et al., 2010).
Akt é uma proteína efetora da via Fak, localizada na membrana
plasmática e responsiva à deformação mecânica, podendo exercer suas funções
no citoplasma e núcleo da célula óssea. Seu peso molecular é 60 kDa e apresenta
3 isoformas, entretanto não há descrição de qual é mais importante para a
resposta ao estímulo mecânico (Gusmão e Belangero, 2009). Estudo demonstrou
que a Akt fosforilada é capaz de aumentar a permeabilidade da membrana
plasmática de osteócitos in vitro após o estímulo mecânico, promovendo a
formação óssea (Batra et al., 2014).
Trabalhos realizados com a utilização de meios físicos como ultrassom
terapêutico (Gusmão et al., 2010), terapia por ondas de choque (TOC) (Rockett e
Sousa, 2007) ou pela atividade física sugerem que os meios físicos estimulam a
renovação óssea (Carvalho, 2003).
14
Figura 4- Esquema que demonstra a cascata de sinalização das proteínas Erk1/2
e Akt e a consequente indução aos fatores da osteogênese.
1.4- Terapia por ondas de choque
As ondas de choque (TOC) foram inicialmente utilizadas na medicina
para fragmentação de cálculos renais em 1980 e posteriormente passaram a ser
usadas no tratamento de doenças musculoesqueléticas. Dentre as indicações da
terapia, as principais são a fascite plantar, a epicondilite lateral do cotovelo,
as tendinoses calcificadas e as pseudoartroses (Rockett e Souza, 2007,
Scott et al., 2008, Xu et al., 2009).
15
1.4.1- Princípios da geração das ondas de choque
O tratamento se caracteriza por aplicar no local da lesão uma
sequência de pulsos mecânicos sonoros de alta energia com alto gradiente de
pressão (positiva acima de 100 MPa seguida por uma queda brusca até
-5 a 10 MPa), em curto espaço de tempo em um ponto específico do corpo
(Rockett e Souza, 2007).
Dentre os métodos de geração de ondas de choque focalizadas,
estão relacionados os aparelhos que emite m as ondas sonoras por meio de
princípios piezoelétrico, eletromagnético e eletro-hidráulico. A forma de geração
das ondas de choque eletro-hidráulicas, representam a primeira geração de
aparelhos utilizados na medicina, no ano 2000 a FDA (Food an Drug
Administration) norte americana, inicialmente aprovou a utilização da tecnologia
como tratamento de patologias ortopédicas, e em 2002 a tecnologia
eletromagnética também se tornou reconhecida (Ogden, 2001, Wang, 2012).
Além dessas formas de se obter onda sonora com aplicabilidade
terapêutica na medicina atual, encontra-se a onda de pressão radial, um método o
qual não é capaz de exceder a barreira do som e possui característica radialmente
divergente do foco (Rockett e Sousa, 2007).
1.4.2- Aplicabilidade em patologias ósseas
Sua ação nos tecidos muscular e tendíneo promove o aumento da
vascularização (Wang et al., 2003) e nova celularidade com reparação fibro
conectiva (Alves et al., 2005, Neuland et al., 2008). No osso condral também é
possível observar células semelhantes aos tecidos moles. Logo, a indução de
nova inflamação em um tecido inflamatório crônico, pode criar uma nova
oportunidade de reparação dessa condição anormal da estrutura
musculoesquelética. Efeitos adversos, tais como sinais de necrose ou displasia
celular não foram observados nos pacientes tratados com TOC (Brañes e
Guiloff, 2007). Além disso, estudos clínicos em animais mostraram alinhamento e
16
neoangiogênese em tendões, após 2-4 semanas e 4-8 semanas de aplicações de
TOC, respectivamente. (Alves, et al., 2005, Wang et al., 2002).
O mecanismo celular para a consolidação de fraturas e cicatrização de
tendões ainda não está totalmente esclarecido. No entanto, relatos da literatura
evidenciam que a TOC pode promover o crescimento e a diferenciação celular da
medula óssea (Wang, et al., 2002). Wang e colaboradores (2001) mostraram que
sua aplicação em fraturas de tíbia de cães, foi capaz de promover a consolidação
mais eficiente e com maior formação de osso cortical após 12 semanas da terapia.
Outros estudos obtiveram 75% de sucesso no tratamento de não uniões ósseas e
fraturas em atraso, o que demonstra que o método pode ser uma excelente
escolha na consolidação destas patologias (Schaden et al., 2001, Xu et al. 2009).
Sabe-se que o estímulo mecânico gerado pela força gravitacional e
atividade física são essenciais para manutenção da homeostase (formação e
reabsorção) óssea (Duncan e Turner, 1995, Frajacomo et al., 2013). Neste sentido
a TOC tem sido utilizada nos últimos anos como método alternativo de estímulo
mecânico inclusive para estimular a consolidação óssea em pacientes com
pseudoartrose (Schaden et al., 2011, Xu et al., 2009). A consolidação óssea por
meio do estímulo da TOC ocorre pela expressão de IGF-1 (insuline-like growth
factor), VEGF (vessel endothelial growth factor), NO (nitric oxide), TGF-β1 (tumor
growth factor-β1) e BMP-2 (bone morphogenic protein-2), que contribuem para o
desencadeamento de fatores angiogênicos, secreção do fator
pro-osteoclastogênico e proliferação e diferenciação das células ósseas (Wang
et al., 2002, Wang et al., 2003, Tamma et al., 2009, Nortanicola et al., 2011).
Alguns estudos in vitro investigaram o efeito da TOC na atividade da
FAK e ERK-1/2, mas nenhum estudo in vivo foi encontrado (Chen et al., 2004,
Wang et al., 2002, Xu et al., 2009). Por isso, é questionado se a atividade da FAK,
ERK-1/2 e Akt aumentam após TOC eletro-hidráulicas em ossos íntegros de ratos
saudáveis. Neste estudo, as tíbias e fíbulas íntegras de ratos Wistar machos foram
estimuladas com ondas de choque eletrohidráulicas uma única vez para investigar
a atividade da FAK, ERK-1/2 e Akt após 7, 14 e 21 dias do estímulo inicial.
17
Levando-se em consideração estes aspectos, o objetivo deste estudo
foi verificar se o estímulo mecânico produzido por ondas de choque do tipo
eletro-hidráulico poderiam induzir a formação das proteínas Akt e Erk em ratos
Wistar, e assim confirmar ou não o efeito que este tipo de tratamento pode ter no
processo de remodelação do tecido ósseo.
18
OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Para o presente estudo, propõe avaliar o aumento da expressão de
proteínas que estimulam a osteogênese em tíbias e fíbulas intactas de ratos após
7, 14 e 21 dias do tratamento por ondas de choque.
2.2- Objetivos específicos
✓ avaliar a presença da Erk e Akt por meio de immunoblotting nas tíbias e
fíbulas hígidas dos ratos
19
MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Animais
Foram tratados 30 ratos brancos machos (Rattus novergicus) da
linhagem Unib: W-H, fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação
Biológica (CEMIB) da Unicamp, com 12 (±2) semanas de idade e massa corpórea
de aproximadamente 300 gramas (±20). Os animais foram mantidos sob
condições estáveis de temperatura em estante ventilada a 22°C em ciclos
claro/escuro de 12 horas controlados, com livre acesso à água e alimentação
ad libitum. Todo experimento foi conduzido de acordo com protocolo n° 2861-1
submetido e aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal
(CEUA/IB - Unicamp). Os animais foram divididos em dois grupos: controle (GC-
somente anestesiados) e tratado (GT) (n=15), e subdivididos de acordo com o
tempo de seguimento pré-estabelecido em: 7, 14 e 21 dias (Figura 5).
Figura 5- Representação esquemática do desenho do estudo.
20
3.2- Métodos
3.2.1- Estímulo por ondas de choque
Os animais foram previamente pesados e anestesiados com xilazina
(5 a 15μg/Kg) e quetamina (80 a 100μg/Kg), via intra peritoneal (ip). Conforme
Figura 5, foi realizada a tricotomia da região das tíbias bilateralmete em todos os
animais. Os ratos do GC foram anestesiados, segundo protocolo acima,
foi realizada a tricotomia e mantidos sem outras intervenções a fim de
recuperarem-se. O GT, após a aplicação de gel de contato a base de água
(meio de condução para transmissão da onda de som), receberam estímulo único
de 500 impulsos a 0,12mJ/mm2 por tíbia aparelho eletro-hidráulico
(Switech Medical, Activator Vet, 2009) (Figura 6), como descrito previamente por
Wang et al., 2003. Após o procedimento de estímulo por ondas de choque,
os ratos foram acondicionados em gaiolas coletivas para 5 animais, como descrito
no item 3.1.
Figura 6- Procedimento de TOC: (A) Aparelho Vetgold120 (adaptado do manual
do fabricante) utilizado para a TOC; (B) Demonstração da aplicação das
ondas de choque com o animal anestesiado e o transdutor na face
lateral do membro posterior (500 impulsos a 0,12mJ/mm2) do rato dos
grupos de estudo (GT; n=5 animais por grupo).
21
3.2.2- Extração do tecido ósseo
Este estudo foi realizado no Laboratório de Investigação Clínica de
Resistência à Insulina (LICRI), na Faculdade de Ciências Médicas (FCM),
sob a coordenação do Prof. Dr. Mário José Abdalla Saad.
Decorrido cada tempo de seguimento pré-estabelecido (7, 14 e 21 dias)
para análise da expressão das proteínas, os animais foram anestesiados por via
IP (intraperitoneal) sendo protocolo citado acima (item 3.2.1), após a perda dos
reflexos podal e corneano, as tíbias foram expostas com o auxílio de bisturi,
os joelhos desarticulados e com auxílio de tesoura apropriada realizou-se a
osteotomia das diáfises das tíbias e fíbulas, as quais foram imediatamente
colocadas em um recipiente contendo nitrogênio líquido, fragmentadas e
homogenizadas (máxima velocidade por 30 segundos; Polytron PTA 20S,
modelo PT 1035; Brinkmann Instruments) em tampão de extração,
conforme representado em Figura 4. Em todas as amostras foi adicionado
triton X-100 1% e as mesmas permaneceram no gelo por 40 minutos.
Todos os animais foram sacrificados por aprofundamento anestésico após a
extração das tíbias.
22
Figura 7- Extração e politronagem: tíbia extraída do animal vivo, adição de
nitrogênio líquido utilizando cadinho para masseração da tíbia e fíbula,
procedimento de politronagem do tecido ósseo adicionado a tampão
de extração, em seguida processo de centrifugação sob refrigeração e
após obtenção da separação do sedimento e sobrenadante,
é realizada a quantificação das proteínas utilizando o teste do Biureto.
O material extraído foi então centrifugado na velocidade de 11.000rpm
por 40 minutos a 4°C, para remover o material insolúvel. O sobrenadante foi
utilizado para as etapas seguintes: uma pequena parte para determinar a
concentração proteica de cada amostra pelo método colorimétrico de biureto em
comprimento de onda a 540nm e a outra parte foi utilizada para avaliação do
extrato total, ou seja, separação das proteínas em gel de dodecil sulfato de sódio e
poliacrilamida (SDS-PAGE), com tampão de Laemmli, acrescido de DTT 200mM,
23
em proporção de 5:1, mantido sempre a 4ºC até o momento de submeter à fervura
a 100ºC durante 5 minutos. As técnicas de immunoblotting estão descritas a
seguir.
3.3- Immunoblotting
3.3.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt) envolvidas no
processo de mecanostransdução do tecido ósseo:
3.3.1.1- Eletroforese: Os aparelhos e reagentes para eletroforese em
SDS-PAGE foram da Bio-Rad® (Richomond, C.A.), e
Metanohidroximetilamina (TRIS), fenilmetilsulfonilfluoreto
(PSMF), aprotinina e ditiotreitol (DTT) foram da Sigma
Chemical Co. (St. Louis Mo). A membrana de nitrocelulose BA
85, 0,2μm foi proveniente de Schleider e Schuell.
Os anticorpos anti-Akt e anti-p-Akt, anti-Erk e anti-p-Erk foram
obtidos da Santa Cruz Biotechnology Inc®.
As soluções empregadas no experimento estão descritas abaixo.
. Tampão de extração: Continha: trisma base 100mM, EDTA 10mM,
pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio 10mM, ortovanadato de sódio
10mM, PMSF 2mM (diluído em álcool etílico), triton X 100 1%, aprotimina 10 3%
(0,1mg/mL). Esta solução foi mantida a 4ºC. O ortovanadato, PSMF e aprotinina
foram acrescidos no momento do uso.
. Tampão de Laemmli (5x): Foi utilizado para estocar o material extraído e para
aplicação no gel de poliacrilamida. Continha: Azul de bromofenol 0,1%,
fosfato de sódio 1M pH 7,0, glicerol 50% e SDS 20%.
24
. Solução tampão para eletroforese em gel (SDS-PAGE): Foi utilizada para a
realização da eletroforese das proteínas extraídas no gel SDS-PAGE.
A solução foi diluída 1:4. Continha: Trisma base 0,2M, glicina 1,52M,
EDTA 7,18M e SDS 0,4%.
. Solução tampão para transferência: Foi utilizada para a transferência das
proteínas separadas no SDS-PAGE para a membrana de nitrocelulose.
Continha: Trisma base 25mM, glicina 129mM, Metanol 20% e SDS 0,02% para
facilitar a eluição de proteínas de alto peso molecular. Foi ser estocada a 4ºC.
. Solução tampão para SDS-PAGE, gel de resolução (resolving): Foi utilizada
para o preparo do SDS-PAGE, gel de resolução. Continha: EDTA 4mM, SDS
25% e trisma base 1,5M. O pH da solução foi ajustado para 8,9 com ácido
clorídrico.
. Solução tampão para SDS-PAGE, gel de empilhamento (stacking): Foi utilizada
no preparo do SDS-PAGE, gel de empilhamento das proteínas. Continha:
EDTA 4mM, SDS 2% e trisma base 10mM. O pH foi ajustado para 6,7 com
ácido fosfórico.
. Solução basal: Solução básica foi utilizada para o manuseio da membrana de
nitrocelulose após transferência das proteínas. Continha: cloreto de sódio
0,12M, trisma base 0,01M, Tween 20 0,05%.
. Solução bloqueadora: Foi utilizada para incubar a membrana de nitrocelulose
logo após a transferência. Continha: 5% de leite em pó desnatado (Molico®) e
azida sódica 0,02% dissolvidas em solução basal.
. Solução para anticorpos: Solução onde foram diluídos os anticorpos
específicos. Continha: 0,3% de soro albumina bovino (BSA) e azida sódica
0,02% diluídos em solução basal.
25
3.3.1.2- Procedimento de Immunoblotting
Foram aplicados no SDS-PAGE de 1,5mm, 200µg de proteína por
amostra, sendo o gel balizado por marcador de alto peso molecular comercial,
para gel de poliacrilamida, da Bio Rad®: PageRuler (Thermo Scientific®).
A eletroforese foi efetuada em cuba de minigel Mini- PROTEAN® II Cell da
Bio Rad®, com solução tampão para eletroforese previamente diluída.
O SDS-PAGE foi inicialmente submetido a 20 volts, até a passagem da linha
demarcada pela fase de empilhamento (stacking) e 100 volts até o final do gel de
resolução (resolving).
A seguir, as proteínas separadas no SDS-PAGE, foram transferidas
para membrana de nitrocelulose, utilizando-se o equipamento de
eletrotransferência do minigel da Bio Rad®. Durante a transferência, a cuba foi
mantida a 120 volts por 150 minutos (Towbin et al., 1979). Para evitar aumento
excessivo da temperatura, foram efetuadas trocas sucessivas da forma de gelo
durante a transferência.
As membranas com as proteínas transferidas foram incubadas em
solução bloqueadora por duas horas à temperatura ambiente, e depois lavadas
em solução basal por três sessões de dez minutos para subsequente incubação
com anticorpo específico. Tal incubação foi feita overnight a 4ºC, sob agitação
constante e, novamente, as membranas foram lavadas com solução basal por
quatro sessões de dez minutos. A seguir, utilizando-se a diluição 1:1 dos
reagentes do kit comercial Pierce Western Blot Signal Enhencer (Thermo
Scinetific®, Illinois, EUA) adicionou-se 2mL por membrana e incubou-se
1 a 2 minutos. Após a incubação as membranas foram reveladas com auxílio do
fotodocumentador ChimioDoc MP (Bio-Rad® Laborarie, Hercules, CA-EUA) uma
vez identificadas, as bandas, a leitura foi feita por meio de densitometria óptica
(Un-Scan-It® gel 6.1), quantificando suas áreas. A partir de então, foi realizada a
análise dos dados, comparando o valor obtido no tecido ósseo do animal controle
com o submetido à TOC, de forma que sempre haja controle dentro de um
experimento.
26
Figura 8- Esquema representativo do processo de pipetagem do gel de
acrilamida, seguido da eletroforese e transferência para a membrana
de nitrocelulose, adição dos anticorpos dos anticorpos e por fim
representação após procedimento de revelação.
3.4- Análise Estatística
O immunoblotting foi realizado em triplicata para cada amostra de proteína
e o resultado final para cada espécime considerado, foi a média dos valores
obtidos em cada uma das três análises. O resultado final para cada grupo foi dado
pela média ± desvio-padrão dos resultados de cada espécime intragrupos.
A comparação entre o GT e seu respectivo GC foi realizada empregando-se
one-way ANOVA (α=0,05), seguido do teste de Bonferroni com auxílio do
programa Minitab®17 (Minitab Inc, State College, PA).
27
4- RESULTADOS
4.1- Expressão das proteínas totais e fosforiladas (Erk e Akt) envolvidas na
sinalização do estímulo mecânico nos ossos das tíbias
Após a aplicação de um único estímulo da TOC, pode-se observar por
meio da avaliação das médias dos valores numéricos da medida em pixels da
densitometria óptica das diferentes bandas (Tabela 1) em relação a Erk e Akt o
seguinte:
Com relação a Akt houve a modulação de sua expressão no tecido
ósseo após avaliação por meio de immunoblotting. A atividade de Akt aumentou
1,77 vezes após 7 dias (p=0.005); 2,8 vezes após 14 dias (p
28
Tabela 1- Apresentação dos valores numéricos da medida em pixels da
densitometria óptica das diferentes bandas e suas respectivas médias
e desvio padrão para os ratos dos GC e GT com sete, 14 e 21 dias de
seguimento (n=5).
pAkt Grupo Controle médias/SD Grupo Tratado médias/SD
7 dias 27,14 23,5 20,97 20,06 15,66 21,47±4,25 51,15 35,49 36,74 38,9 27,39 37,93±9,35*
14 dias 27,05 21,12 21,11 9,51 25,87 20.93±6,93 51,19 59,3 53,88 54,13 74,47 58,59±13,66*
21 dias 38,81 19,89 31,59 30,95 39,95 32,24±8,02 62,56 65,9 35,9 41,71 41,65 49,54±13,66*
pErk1/2 Grupo Controle médias/SD Grupo Tratado médias/SD
7 dias 15,03 13,15 16,57 22,49 21,19 17,69±4,01 31,73 32,94 34,63 35,42 37,61 34,47±2,27*
14 dias 6,46 1,82 0,45 1,23 2,13 2,42±2,35 14,84 13,46 16,39 14,19 22 16,18 ±3,43*
21 dias 54,14 72,13 65,08 78,65 72,84 68,57±9,39 77,77 91,29 81,25 77,44 83,6 82,27 ±5,65*
*p
29
*p
30
#p
31
DISCUSSÃO
Segundo Tuner e Pavalko (1998), o processo de formação óssea é
complexo e mediado por proteínas cuja expressão pode ser induzida por
estímulos mecânicos externos. Tais estímulos atingem a membrana plasmática
das células levando a ativação do sistema de proteínas integrina-citoesqueleto-
núcleo. Dentre as proteínas envolvidas nesse processo, tem-se as vias da Erk e
da Akt com grande relevância na conversão do estímulo mecânico em biológico no
interior das células e consequente liberação dos fatores de crescimento e
osteogênese (Cargnello e Roux, 2011).
Com o objetivo de avaliar a expressão de Erk e Akt mediante estímulos
e deformação mecânica, neste estudo foi utilizado a TOC (terapia por ondas de
choque), alternativa segura e não invasiva utilizada no tratamento de não união
óssea (Schaden et al., 2001, Rockett e Souza, 2007, Xu et al., 2009).
O mecanismo de ação pelo qual a TOC estimula a consolidação óssea é pelo o
aumento da vascularização e consequente aumento do aporte nutricional,
(Wang et al., 2003). Embora experimentos in vitro tenham demonstrado sua
eficácia por meio da diferenciação de células osteoprogenitoras, o mecanismo de
ação pelo qual a onda mecânica ativaria o processo de neoformação óssea ainda
não está completamente entendido (Tamma et al., 2009, Yu et al., 2014).
Acredita-se que os estímulos mecânicos gerados pela TOC sejam
altamente eficientes no processo de estimulação do sistema de
integrinas/citoesqueleto/núcleo, corroborando com Harold Frost, que em 1964
lançou a teoria do mecanostato. Para Frost, o tecido ósseo possui um sensor de
deformações que dirige a resposta celular para dois caminhos, o da formação ou o
da reabsorção, assim deformações relativas menores do que 50-100μstrain
(1-2 Mpa=0,1-0,2kg/mm2) seriam consideradas insuficientes e promoveriam a
reabsorção óssea enquanto que deformações entre 1500 até 3000μstrain
(60MPa=6kg/mm2) produziriam microfraturas e estimulariam a sua neoformação.
32
A título de quantificação, fazendo uma analogia, fraturas são produzidas por pelo
menos 25.000μstrain (120MPa=12kg/mm2) (Duncan e Turner, 1995, Fritton et al.,
2000, Scott et al., 2008).
Mais recentemente You e colaboradores (2001) mostraram que a
deformação relativa para o estímulo celular deve ser de aproximadamente
10.000 a 100.000μstrain, ou seja, mais de 30 vezes maior do que o suportado pelo
tecido ósseo. Deste modo, autores sugeriram que a estrutura composta pelos
canalículos ligando os osteócitos e o citoesqueleto de actina e permeados por
fluido no espaço pericelular, que é responsável pela amplificação do estímulo
mecânico (Tate, 2003). Embora ainda não exista comprovação experimental
definitiva, os osteócitos seriam as células responsáveis por este controle da
remodelação óssea (Neve et al., 2012). Com base na teoria do mecanostato,
faz-se possível aventar que o estímulo promovido pela TOC tenha sido
amplificado de modo a manter a modulação da osteogênese por meio da
expressão das proteínas Erk e Akt até 21 dias após uma única aplicação de
500 pulsos a 0,12mJ/mm2.
Ao fazer uma comparação com o ultrassom de baixa potência (USbp),
utilizado por Gusmão e colaboradores (2010) com o objetivo similar de induzir
proteínas envolvidas na osteogênese por meio de estímulo mecânico, o efeito da
onda de choque tende a ser mais prolongado e possivelmente mais eficiente.
Uma vez que o estímulo único promovido pela TOC manteve níveis elevados da
expressão de Erk1/2 e da Akt mesmo após 21 dias o USbp embora tenha tenha
induzido a expressão de Fak e Erk 1/2 após sete e 14 dias de estímulo diário,
os níveis não se mantiveram elevados aos 21 dias de estímulo contínuo,
não havendo assim efeito cumulativo da terapia.
O protocolo estabelecido para tratamento com USbp é de um estímulo
diário (Gusmão et. al., 2010 Xue et al., 2013), ao passo que o protocolo da TOC é
de um único estímulo (Wang et al., 2003). Comparando-se os resultados do
estudo de Gusmão e colaboradores (2010) com o presente estudo, observa-se
que o tratamento com USbp aumentou a atividade da Erk somente por 14 dias nos
33
ossos íntegros de ratos. Provavelmente, 14 dias não é tempo suficiente para
aumentar a massa óssea de forma significativa, o que pode justificar a
superioridade da TOC para aumentar a massa óssea nos ossos íntegros sadios,
com osteoporose e com deficiência de estrógeno (Van der Jagt et al., 2009,
Van der Jagt et al., 2013).
A diferença entre a atividade da Erk após TOC comparada com a
atividade da Erk após estímulo com USbp é consistente com os achados de
Tam e col. (2008) que compararam, num modelo in vitro, a resposta de células
periosteais humanas após TOC e USbp isoladamente e em conjunto. Os autores
observaram que o USbp aumenta a proliferação celular, atividade da fosfatase
alcalina e mineralização óssea após 6 dias de estímulo diário e que as amostras
submetidas a TOC só iniciam esse aumento 18 dias após estímulo único.
Os autores relacionaram a resposta tardia da TOC ao fato do aumento da
permeabilidade de membrana e liberação das citocinas terem seu pico nesse
período (Wang et al., 2003), enquanto o efeito não acumulativo do USbp, por não
permanecer aumentado até o 180 dia, o que consiste com o estudo de Winter e
col. (2003) em que o estímulo mecânico contínuo in vitro diminui o cálcio,
fosfatase alcalina e a atividade do DNA celular dos osteoblastos. Em adição,
nesse mesmo estudo observou-se que a TOC provoca, inicialmente, morte celular
e diminuição da atividade de fosfatase alcalina (Tam et al., 2008). Em contra
partida, o presente estudo contrapõe os achados acima descritos, em que se
obteve como resultado a expressão precoce já aos sete dias da atividade proteica
e consequente osteogênese. Uma hipótese à distinção dos resultados dever-se-á
as diferentes metodologias empregadas nos estudos sendo um modelo in vivo e
outro in vitro, o que sugere novos estudos para melhor entendimento.
Corroborando os achados deste trabalho, o estudo de Wang e col.
(2003) utilizando o mesmo protocolo (0,12mJ/mm²), demonstrou que os níveis dos
fatores angiogênicos NO (óxido nítrico), VEGF (fator de crescimento endotelial
vascular) e BMP-2 (proteína morfogênica óssea-2), mantiveram-se expressos
entre a primeira e a oitava semanas após estímulo único de TOC nas junções
34
tendão-osso intactos, o que reforça o efeito cumulativo da expressão desses
fatores após estímulo único da TOC. No entanto, Maier e col. (2002), ao utilizar
energia menor (0,05 e 0,09mJ/mm²) do que a utilizada no presente estudo,
encontrou que o estímulo biológico produzido pela TOC em estímulo único com
aplicada em ossos íntegros de coelhos vivos, não estimulou a vascularização e
nem foi detectada após 10 dias cintilografia óssea utilizando marcador Tc-DPD
(technetium 3.3-diphosphono-1.2-propandicarbon acid).
Wang e col. (2002) observaram em cultivo celular de medula óssea de
ratos, que a diferenciação osteogênica foi induzida por meio da fosforilação da Erk
mediada pelo superóxido (O2-) após 1h do estímulo de TOC. Além disso,
há relatos que a Erk já pode ser detectada em osteoblastos cultivados in vitro,
10 minutos após a estimulação pela TOC, sendo um método eficaz e rápido no
recrutamento de fatores pró-apoptóticos que promove proliferação e diferenciação
dos mesmos (Tamma et al., 2009). Estes achados podem fortalecer e explicar os
resultados do presente estudo ao serem encontrados níveis altos de Erk aos dias
após a aplicação singular do estímulo.
Ao apresentar aumento da atividade da Erk e Akt por 21 dias após
única sessão de TOC, o presente estudo assemelha-se aos resultados de Chen e
colaboradores (2004) que demonstraram aumento da atividade de Erk e p38 por
42 dias após TOC em ossos de ratos num modelo experimental de defeito
segmentar. Apesar da possibilidade do modelo de defeito segmentar ser similar a
uma situação de osso com fratura, no estudo de Chen e colaboradores (2004),
a TOC foi realizada 8 semanas após a produção do defeito ósseo, quando o osso
já está consolidado. Desse modo, acredita-se que seus resultados podem ser
comparados com os resultados deste estudo, onde foram utilizados membros
intactos, aproximando dessa forma os resultados e dando mais consistência a
terapia por ondas de choque no processo de ganho de massa óssea.
A Akt é encontrada no citoplasma e participa na sinalização dos fatores
de crescimento que promovem a sua modulação e diferenciação e previne a
apoptose durante o processo de renovação celular (Heron-Milhavet et al., 2011).
35
Este efeito foi demonstrado no estudo de Yu e colaboradores (2014),
no qual mioblastos de linhagem celular H9c2 em isquemia/hipóxia induzida,
foram submetidos à TOC, e foi observado que a capacidade de atenuar a
apoptose ocorreu mediada pela ativação da via PI3K/Akt, entretanto, o efeito
protetor da musculatura cardíaca não foi observado de forma significativa pela via
da Erk em relação ao controle. Moon e col. (2011) observaram o aumento da
expressão de Akt durante osteoclastogênese como sugerido no presente estudo,
onde foi observado o aumento da fosforilação dessa mesma proteína no tecido
ósseo extraído das tíbias e fíbulas dos ratos estimulados pela TOC.
Neste experimento, a atividade da Akt permaneceu aumentada por
21 dias após uma única sessão de ondas de choque. Na literatura consultada,
não foram encontrados estudos abordando o efeito da TOC sobre a Akt do tecido
ósseo, no entanto, estudo de Tam e col. (2008) observaram que a viabilidade
celular diminuiu 6 dias após a TOC, mas aumentou 18 dias depois. O aumento da
viabilidade celular observado naquele estudo pode estar relacionado com o
aumento da atividade de Akt observado neste estudo, que ocorreu sete dias após
a TOC.
Vale a pena ressaltar que os resultados podem apresentar algum viés
já que do ponto de vista metodológico, a extração das proteínas apesar de ter sido
exaustivamente planejada e treinada em estudo piloto, pode interferir
negativamente nos resultados (Gusmão et al., 2010) devido ao grande número de
etapas em que podem ocorrer variações no processamento manual das amostras
e da resposta individual de cada animal ao estímulo. Dessa forma faz-se
necessária a utilização de outras metodologias, dentre elas o PCR (polymerase
chain reaction) para aumentar a especificidade e sensibilidade da mensuração dos
níveis das proteínas, dessa forma, futuros trabalhos se fazem necessários para a
compreensão do completo mecanismo de ação da TOC no metabolismo ósseo.
36
CONCLUSÕES
Concluímos que o estímulo mecânico gerado pela TOC de forma
percutânea nas tíbias e fíbulas dos animais ativa a resposta bioquímica
intracelular (deformação mecânica da MEC/Integrina/Fak), onde houve a
fosforilação de Erk e Akt no grupo tratado em relação ao grupo controle.
Os resultados desse estudo contribuirão para melhorar o entendimento
dos efeitos das deformações mecânicas no tecido ósseo e para o aperfeiçoamento
do tratamento de patologias do aparelho locomotor como a osteoporose e fraturas.
6.1- Sugestões para trabalhos futuros
Testar um maior número de proteínas [dentre elas: IRS1
(insulin receptor substrate 1), JNK e p38] para comprovar com melhor eficácia a
resposta do tecido ósseo ao estímulo mecânico. E a utilização de outros métodos
de avaliação como por meio de PCR, onde pode ser observado a expressão
gênica das proteínas a serem pesquisadas.
37
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44
ANEXO I
Carta de submissão do artigo (20 de janeiro de 2015)
Sta Lídia Dornelas de Faria,
Agradecemos a submissão do seu manuscrito "Terapia por ondas de
choque eletrohidráulicas aumenta a atividade da ERK-1/2 e Akt em tíbias íntegras
de ratos por 21 dias após estímulo inicial." para Acta Ortopédica Brasileira.
Através da interface de administração do sistema, utilizado para a submissão, será
possível acompanhar o progresso do documento dentro do processo editorial,
bastando logar no sistema localizado em:
URL do Manuscrito:
http://submission.scielo.br/index.php/aob/author/submission/145023
Login: lidiadornelas
Em caso de dúvidas, envie suas questões para este email.
Agradecemos mais uma vez considerar nossa revista como meio de transmitir ao
público seu trabalho.
Fernanda Colmatti
Acta Ortopédica Brasileira
Acta Ortopédica Brasileira
http://submission.scielo.br/index.php/aob
Fernanda Colmatti / Arthur Tadeu de Assis.
Atha Comunicação e Editora Ltda.
Fone/ Fax: 55 11 5087-9502/ 5579-5308
http://submission.scielo.br/index.php/aob/author/submission/145023http://submission.scielo.br/index.php/aob
45
ANEXO II
Artigo submetido em 20 de janeiro de 2015.
Terapia por ondas de choque eletrohidráulicas aumenta a atividade da ERK-
1/2 e Akt em tíbias íntegras de ratos por 21 dias após estímulo inicial
Extracorporeal Shock wave therapy increases ERK-1/2 and Akt activity of
intact rat tibia for 21 days following primary stimulation
Lídia Dornelas de Faria¹, Alexandre Gabarra Oliveira², Juliana Falcato Vecina²,
Mario Jose Abdalla Saad², Carlos Vinícius Buarque de Gusmão¹, William Dias
Belangero¹
1-Laboratório de Biomateriais em Ortopedia (LABIMO) - Departamento de
Ortopedia e Traumatologia - Faculdade de Ciências Médicas - Universidade
Estadual de Campinas (Unicamp)
2-Laboratório de Investigação Clínica em Resistência à Insulina (LICRI) -
Departamento de Medicina Interna - Faculdade de Ciências Médicas -
Universidade Estadual de Campinas (Unicamp)
46
RESUMO
Objetivo: Determinar se a atividade da FAK (focal adhesion kinase),
ERK-1/2 (extracellular signal-regulated kinase) e Akt aumentam após terapia por
ondas de choque (TOC) eletrohidráulicas em ossos íntegros de ratos saudáveis.
Métodos: Quinze ratos Unib: WH machos foram submetidos à TOC em uma única
sessão em que foram aplicados 500 pulsos a 4 Hz e 0,12mJ/mm² nas patas
posteriores direita e esquerda. Após 7, 14 ou 21 dias, a atividade da FAK, ERK-1/2
e Akt das tíbias e fíbulas desses animais foram avaliadas por immunoblotting.
Outros quinze ratos foram falsamente estimulados e serviram como grupo
controle. Resultados: A atividade da ERK-1/2 e Akt aumentaram em todos os
grupos, porém a FAK não foi identificada em nenhum espécime.
Conclusões: A TOC aumenta a atividade da ERK-1/2 e Akt por 21 dias,
mas não é capaz de aumentar a atividade nem a expressão da FAK a partir de
7 dias do estímulo inicial. Nível de Evidência II, Estudo Prospectivo e Comparativo.
Descritores: Terapia por ondas de choque, mecanotransdução, osteogênese,
FAK, ERK, Akt.
ABSTRACT
Purpose: Determine whether FAK (focal adhesion kinase), ERK-1/2 (extracellular
signal-regulated kinase) and Akt activation are increased by extracorporeal shock
wave therapy (ESWT) in intact and healthy rat tibia. Methods: Each hindlimb of
15 Unib: WH male rats received 500 impulses of shock waves at 4 Hz and
0.12mJ/mm2. Seven, 14 or 21 days following that single stimulation, FAK, ERK-1/2
and Akt activities were assessed by immunoblotting. Fifteen rats received sham
ESWT and were assigned to the control group. Results: Increased ERK-1/2 and
Akt activation were observed in the treatment groups, but FAK expression and
activation were not detected in any specimen. Conclusions: ESWT increases
47
ERK-1/2 and Akt activation for 21 days, but fails to increase FAK expression and
activity 7 days following primary stimulation. Evidence level II, Prospective and
Comparative Study.
Keywords: Extracorporeal shockwave therapy, mechanotransduction,
osteogenesis, FAK, ERK, Akt.
INTRODUÇÃO
Terapia por ondas de choque (TOC) e ultrassom de baixa potência
(USbp) são métodos físicos não invasivos utilizados na prática ortopédica para
acelerar a consolidação óssea e tratar pseudoartrose(2,12,14,15). As ondas
mecânicas produzidas por esses aparelhos deformam as células ósseas e ativam
proteínas que promovem proliferação celular, migração celular e inibição da
apoptose. Baseado principalmente em estudos in vitro, advoga-se que a FAK
(focal adhesion kinase) é uma das primeiras e principais proteínas ativadas pelas
deformações mecânicas, funcionando como um conversor da deformação
mecânica em sinal biológico. Após ativação, a FAK ativa vias de sinalização
celular nas quais ERK-1/2 (extracelluar signal-regulated