TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)

7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)

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UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Y AGROPECUARIAS

Biolixiviacin de minerales sulfuro-ferroso en jales:aislamiento y caracterizacin de cultivos puros y mixtos

de microorganismos involucrados

TESIS

Que para obtener el grado deDoctor en Ciencias: rea Biotecnologa

Presenta

Argelia Jurez AlcarazArgelia Jurez Alcaraz

Asesores: Dr. Jos Gerardo Lpez Aguirre

Dr. Marcos Gustavo Monroy Fernndez

agosto de 2004


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I

INDICE

Pgina

ndice de figuras Vndice de cuadros IXndice de plantillas XI

Abstract XVII

Resumen XVIII

I INTRODUCCIN 1

I.1 El problema 3

I.2 Hiptesis 4

I.3 Objetivo general 4

II. ANTECEDENTES 52.1 Microorganismos quimiolitotrficos presentes en los procesos de

biolixiviacin 5

2.2 Microorganismos heterotrficos presentes en los procesos de biolixiviacin 9

2.3 Sinergismo en bacterias acidoflcas 12

2.4 Lixiviacin microbiana 132.5 Mecanismos de accin bacteriana 15

2.6 Sustratos de energa 162.6.1 Pirita (FeS2) 16

2.6.2 Hierro 172.6.3 Azufre 18

III. MATERIALES Y MTODOS 21

3.1 Localizacin de las determinaciones analticas 213.2 Sitio de muestreo 21

3.3 Procesamiento de las muestras de suelo 22

3.4 Procesamiento de las muestras de agua 24

3.5 Proceso de muestras de jales 24

3.5.1 Medicin del contenido de humedad 253.6 Determinacin del pH de las muestras 25

3.7 Medios de cultivo para aislamiento de microorganismos en

condiciones de medio mnimo de crecimiento 27

3.7.1 Condiciones y adaptacin de los microorganismos en los sustratos 28

3.7.2 Aislamientos en medios slidos selectivos 303.8 Medicin del crecimiento celular 32


3/191

II

3.8.1 Cuantificacin de los microorganismos 32

3.9 Caracterizacin de cepas 343.10 Bioensayos 35

3.10.1 Determinacin de la actividad de los microorganismos en substratoestril y no estril 35

3.10.2 Crecimiento de los microorganismos aislados en el substrato con jal ydos diluyentes en diferentes condiciones 35

3.10.3 Oxidacin del ion Fe (II) a Fe (III) presentes en los jales a travs de loscultivos puros y mixtos 36

3.10.4 Oxidacin de los minerales sulfurosos presentes en los jales con cultivomixto de microorganismos 37

3.10.5 Capacidad oxidativa de la mezcla de microorganismos 383.11 Mediciones usadas para determinar la oxidacin de los minerales

sulfurosos 38

3.11.1 Determinacin de la acidez 383.11.2 Determinacin del in sulfato 40

3.11.3 Determinacin de Fe (II) y Total 413.11.3.1 Medicin del Fe(II) por titulacin 42

3.11.3.2 Medicin del Fe(II) con orto-fenantrolina 43

3.11.3.3 Determinacin del Fe total 45

3.11.4 Determinacin de protenas totales solubles 46

3.12 Observacin microscpica del crecimiento celular de las cepas aisladas 483.13 Determinacin de la concentracin de azufre durante la biolixiviacin 48

3.14 Biolixiviacin de los minerales sulfurosos de los jales 493.14.1 Condiciones experimentales 493.14.2 Diseo experimental 50

lV. RESULTADOS 534.1 Sitio de muestreo 53

4.2 Caracterizacin qumica de muestras de suelo 53

4.3 Caracterizacin fsico-qumica de muestras de agua 58

4.4. Determinacin de la humedad de muestras de jales 59

4.5 Caracterizacin qumica de jales 60

4.6 Determinacin del pH de jales y suelo 614.7 Aislamiento de microorganismos en condiciones de medio mnimo decrecimiento 62

4.8 Condiciones y adaptacin de microorganismos al substrato 64

4.8.1 Microorganismos quimiolitotrficos 644.8.2 Microorganismos heterotrficos 66

4.9 Caracterizacin fenotpica de cepas aisladas 69


4/191

III

4.10 Bioensayos para determinar condiciones en la biolixiviacin de mineralessulfurosos 934.10.1 Actividad de los microorganismos en substrato estril y no estril 93

4.10.2 Condiciones de crecimiento de los microorganismos aislados en elsubstrato con jales y diluyente distinto 97

4.10.3 Oxidacin de Fe (II) por cultivos mixtos y puros en presencia de jales 1024.10.4 Estudio comparativo de la capacidad oxidativa de cultivos puros y

mixtos 104

4.11 Biolixiviacin de jales por comunidades microbianas seleccionadas 108

4.11.1 Descripcin de la evolucin de parmetros indicadores 108

4.11.2 Anlisis estadstico (ANOVA y Prueba de medias deTukey) 113

V. DISCUSION 119

VI CONCLUSIONES 127

VII. LITERATURA CITADA 129

VIII ANEXOS 151


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V

ndice de figuras

Pgina

Figura 1. Diagrama de flujo de metodologas y experimentosutilizados en el proyecto.

23

Figura 2. Punto de equilibrio (P. E.) de las soluciones de hidrxido de

Fe y sulfato ferroso para determinar su acidez por el mtodo

de titulacin.

39

Figura 3. Curva de calibracin del in sulfato concentracin de 0

hasta 6 mg/L.

41

Figura 4. Formacin del complejo por la reaccin del in ferroso con

orto-fenantrolina.

43

Figura 5. Curva de calibracin del in Fe(II) realizada para medir la

concentracin por medio del espectrofotmetro con luz

visible.

44

Figura 6. Curva de calibracin realizada para medir la concentracin

de las protenas totales (Bradford, 1976).

47

Figura 7. Crecimiento de microorganismos quimiolitotrficos en los

cultivos realizados en presencia de jales y sulfato ferroso.

66

Figura 8. Crecimiento de microorganismos quimiolitotrficos en los

cultivos realizados en presencia de jales y sulfato ferroso

(los valores son el resultados del promedio de tres

muestras).

67

Figura 9. Crecimiento de bacterias heterotrficas en medios de cultivo

orgnico e inorgnico FeSO4, S, y complementado con

extracto de levadura (los valores son el promedio de tres

muestras)

68

Figura 10. Crecimiento de hongos en medio de cultivo que contiene

Czapek y Sabouraud, flor de azufre y complementado con

extracto de levadura (los valores son el resultados del

promedio de tres muestras).

68


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VI

Figura 11 Crecimiento de levaduras en medio de cultivo que contiene

Czapek y Sabouraud, flor de azufre ycomplementado con

extracto de levadura (los valores son el resultados del

promedio de tres muestras).

69

Figura 12 Evolucin de la concentracin de Fe (II) en el control en

condiciones estriles y no estriles.

95

Figura 13 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo puro

(Thiobacillus sp) en medio mnimo de sales (MMS).

95

Figura 14 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo mixto

en medio mnimo de sales.

96

Figura 15 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo puro

(Thiobacillus sp) en medio mnimo de sales, extracto delevadura y sulfato ferroso.

96

Figura 16 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo mixto,

en medio mnimo de sales, extracto de levadura y sulfato

ferroso.

97

Figura 17 Evolucin de la concentracin de Fe (II) muestra de jales

con cultivo mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada

como diluyente: (1) control para el cultivo mixto; (2) con

extracto de levadura y cultivo mixto; (3) con extracto de

levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con

extracto de levadura y cultivo puro.

98

Figura 18 Evolucin de la concentracin de Fe (II), muestra de jales

con cultivo mixto y cultivo puro, empleando medio 9K como

diluyente: (1) control para el cultivo mixto; (2) con extracto

de levadura y cultivo mixto; (3) con extracto de levadura y

consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con extracto de

levadura y cultivo puro.

99


con cultivo mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada

como diluyente: (4) cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo

100


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VII

mixto, sulfato ferroso y extracto de levadura; (8) cultivo puro

y sulfato ferroso; (9) cultivo puro, extracto de levadura y

sulfato ferroso.


con cultivo mixto y cultivo puro, empleando medio 9K como

diluyente: (4) cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto,

sulfato ferroso y extracto de levadura; (8) cultivo puro y

sulfato ferroso; (9) Cultivo puro, extracto de levadura y

sulfato ferroso.

100

Figura 21 Oxidacin de Fe(II) a Fe(III) y evolucin del crecimiento de

los microorganismos en cultivo puro (Thiobacillus sp.) y

cultivo mixto.

102

Figura 22 Cintica de la oxidacin de Fe (II) en presencia de jales con

cultivo mixto.

103

Figura 23 Cintica de crecimiento de microorganismos en el cultivo

mixto con sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente

de energa.

104

Figura 24 Crecimiento del cultivo puro de Thiobacillus sp en presencia

de sulfato ferroso y extracto de levadura, as como evolucin

en la concentracin de Fe (II) disuelto.

105

Figura 25 Crecimiento del cultivo puro de Penicillium sp en presencia


en la concentracin de Fe(II) disuelto.

105

Figura 26 Crecimiento del cultivo puro de Rhodotorula sp en presencia


en la concentracin de Fe (II) disuelto.

106

Figura 27 Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de

Fe (II) para la mezcla de microorganismos (Thiobacillus sp,

Penicillium sp y Rhodotorula sp.), utilizando sulfato ferroso

con extracto de levadura como fuente de energa.

106

Figura 28 Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de 107


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VIII


Penicillium p y Rhodotorula sp.), utilizando sulfato ferroso

sin extracto de levadura como fuente de energa.

Figura 29 Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de


Penicillium sp y Rhodotorula sp.), sin fuente de energa

adicional, slo sulfuros presentes en jales.

108

Figura 30 Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad

microbiana durante la biolixiviacin de los jales en presencia

de sulfato ferroso como fuente de energa: (a) concentracin

de clulas en suspensin, (b) protenas totales; (c) pH; (d)

potencial rdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfatodisuelto; (g) concentracin total de Fe disuelto; y (h)

concentracin total de ferroso disuelto.

110


microbiana durante la biolixiviacin de los jales en presencia

de sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente de

energa: (a) concentracin de clulas en suspensin; (b)

protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f)

concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de

Fe disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.

111


microbiana durante la biolixiviacin de los jales como nica

fuente de energa: (a) concentracin de clulas en

suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox;

(e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g)

concentracin total de Fe disuelto; y (h) concentracin total

de ferroso disuelto.

112


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IX

ndice de cuadros

Pgina

Cuadro 1. Reacciones involucradas en el camino bioqumico de la

oxidacin de compuestos de azufre inorgnico por

Thiobacillus (Kelly,1988 b)

19

Cuadro 2. Donadores de electrones en la oxidacin de compuestos de

azufre inorgnico (Kelly,1988 b).

20

Cuadro 3. Caractersticas aparentes de las muestras obtenidas de la

presa de jales (Minatitln, Colima).

25

Cuadro 4. Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo,

obtenidas de la presa de jales (Minatitln, Colima.).

26

Cuadro 5. Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo,

obtenidas de la presa de jales (Minatitln, Colima.).

26

Cuadro 6. Medio de cultivo 9K para microorganismos quimiolitotrficos

(Silverman y Lundgren, 1959).

27

Cuadro 7. Medio de cultivo 9K para microorganismos heterotrficos

(Johnson, 1995).

28

Cuadro 8. Diseo experimental realizado con jales de la Presa(9x3x3=54 matraces).

51

Cuadro 9. Composicin qumica de las muestras de suelo cercano a

presas de jales (Minatitln, Colima).

53

Cuadro 10. Composicin qumica de las aguas de las orillas de la presa

de jales.

58

Cuadro 11. Contenido de humedad de las muestras de jales. 59

Cuadro 12. Concentracin de los elementos y xidos mayores presentes en

los jales.

60

Cuadro 13. Concentracin de metales potencialmente txicos al ambiente y

xidos mayores, presentes en una muestra compsito de jales.

61

Cuadro 14. Resultado de la apariencia y el pH de las muestras en tres

fechas diferentes tomadas de la presa de jales, Minatitln,

61


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X

Colima.

Cuadro 15. Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con

muestras de suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa

de microorganismos quimiolitotrficos.

63

Cuadro 16. Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con

muestras de suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa

de microorganismos heterotrficos.

64

Cuadro 17. Caractersticas descriptivas de microorganismos

quimiolitotrficos desarrollados en medio lquido y slido de

muestras de suelo y agua de la presa de jales (Ramsay et al.,

1988; Kelly y Wood, 2000).

78

Cuadro 18. Caractersticas descriptivas de las colonias de microorganismoshetertrofos obligados, identificados en este trabajo.

90

Cuadro 19. Valores iniciales y finales del in Fe (ll) en cada tratamiento para

las comparaciones con cultivo mixto y puro con distintas fuentes

de energa.

94

Cuadro 20. Velocidad mxima de oxidacin del ion ferroso (mg.h-1) en

presencia de jales, para microorganismos, en funcin de la

presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura y dos

diluyentes distintos.

101

Cuadro 21. Valor de F calculada por anlisis de varianza de las

interacciones, aplicando los resultados de pruebas de

biolixiviacin con distintos microorganismos seleccionados.

114

Cuadro 22. Efecto de los microorganismos sobre las variables medidas

durante la biolixiviacin de los jales.

115

Cuadro 23. Efecto de la biolixiviacin de los minerales de sulfuro de los jales

con las tres diferentes fuentes de energa.

116

Cuadro 24. Efecto del tiempo de reaccin en la biolixiviacin de los jales con

las tres diferentes fuentes de energa (se consideran los

resultados de todas las pruebas, incluyendo distintas fuentes de

energa y distintos cultivos).

117


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XI


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XI

ndice de plantillas

Pgina

Plantilla 1. Panormicas de los sitios de muestreo de jales, suelo y agua:

(a) presa de jales; (b) perfil de suelo muestreado y (c) espejo

de agua en presa de jales

54

Plantilla 2. Sitios de muestreo de suelos para aislamiento de

microorganismos acidoflicos; (a) escurrimiento con

evidencias de produccin de drenajes cidos con ion frrico y

(b) detalle de suelo impactados por la actividad de

microorganismos

55

Plantilla 3. Sitios de muestreo de jales, suelo y agua: (a) presa de jales

donde se muestre agua y jales y (b) muestreo de suelo con

evidencia de escasa vegetacin por impacto de la oxidacin

de sulfuros.

56

Plantilla 4. Detalle de sitios de muestreo de jales y suelo: (a) alteracin

de los minerales sulfurosos en jales y (b) Evidencias de la

oxidacin de los minerales sulfurosos y precipitacin de

compuestos de fierro en suelos impactados.

57

Plantilla 5. Pruebas en matraces agitados para evaluar la oxidacin delion ferroso para muestras de suelo: (a) pruebas en medios de

cultivo para adaptacin y crecimiento de microorganismos

nativos; (b) pruebas para crecimiento de microorganismos

heterotrficos y (c) pruebas para crecimiento de

microorganismos quimiolitotrficos.

65

Plantilla 6. Colonias y clulas de bacterias quimiolitotrficas creciendo en

medios inorgnicos con azufre como fuente de energa: (a)

Colonia de Thiobacillus sp a 600 X; crecidas sobre agar (b)

Thiobacillus sp, crecidas sobre tiosulfato de sodio (600 X) y

(c) colonia bacteriana a 600X, crecida sobre tiosulfato de

sodio.

71

Plantilla 7. Colonias de bacterias quimiolitotrficas creciendo en medios 72


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XII

slidos inorgnicos en presencia de tiosulfato de sodio: (a)

bacterias aisladas de presas de jales a pH


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XIII

Plantilla 13. Crecimiento del consorcio de microorganismos heterotrficos

creciendo en un medio con sulfato ferroso y extracto de

levadura, proveniente de la presa de jales. (a) y (b) consorcio

original, a 600 X y (c) microorganismos aislados del

consorcio, a 600 X.

79

Plantilla 14. (a,b,c) Microorganismos heterotrficos aislados a partir del

consorcio creciendo en un medio con sulfato ferroso y

extracto de levadura, proveniente de la presa de jales a pH

1mm

En medio contiosulfato, bordes

lobulados, redondosverdes con centro rojo

> 1mm.

MEDIO LQUIDO

En medio con Fe(II),cambia el color

ambar, por oxidacin

del Fe. Con piritacambia a turbio verde

amarillo

En medio con Fe(II),cambia al color

ambar. Por oxidacin

del Fe, con piritacambia a turbio verde

amarillo

En medio con S se

volvi turbio ypolvoriento

TINCIN Gram negativo Gram negativo Gram negativo

NUTRICIN Auttrofa Auttrofa Auttrofa

RELACIN C/OXIGENO Aerobia Aerobia Aerobia

FUENTE DE ENERGA Fe(II), S, Tiosulfatopirita

Fe(II), S, Tiosulfato,pirita

Fe(II), S, Tiosulfatopirita

FUENTE DE CARBONO CO2 CO 2 CO 2

TEMPERATURA, 0C 29 20C 29 20C 29 20C

pH 2.0 a 2.5 2.0 a 2.5 2.0 a 2.5FUENTE

AISLAMIENTOAgua Agua Suelo

OLOR MEDIOSLIDO

H2SO4 H 2SO4 H 2S y H2SO4

OLOR MEDIOLIQUIDO

H2SO4 H 2SO4 H 2SO4

Adems de estas bacterias quimiolitotrficas estrictas, se realiz el aislamiento de

bacterias creciendo en presencia de un medio de cultivo con sulfato ferroso y extracto de

levadura, por lo que deben tratarse de bacterias hetertrofas facultativas, entre las que se

distinguen algunas del gneroAcidophillium y algunas especies del gnero Thiobacillus,

por ejemplo T. acidophilus y T. cuprinus(Rawlings, 1997). La evidencia de que estas

bacterias emplean el sulfato ferroso como fuente de energa es la aparicin de

precipitados frricos (Plantillas 13 a 15), por lo que el extracto de levadura, debe ser


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utilizado slo como el materia de construccin para la biosntesis de estructuras

celulares.

Adems de las bacterias quimiolitotrficas y heterotrficas facultativas que recin

se mencionaron, tambin se aislaron algunos hongos y levaduras, esto esmicroorganismos heterotrficas que crecieron inicialmente en medios de cultivo con

sulfato ferroso y extracto de levadura. Enseguida, su aislamiento y confirmacin fueron

realizados en presencia de medios de cultivo especficos: agar sabouraud y czapek para

crecimiento de hongos; y agar sabouraud con extracto de levadura para crecimiento de

levaduras. En el Cuadro 18 se describen las caractersticas ms sobresalientes de los

que se eligieron para el experimento. Lo anterior correspondi a la caracterizacin

basada nicamente en propiedades fenotpicas, basndose en los aspectos

mencionados en el captulo de materiales y mtodos.

En las plantillas 16 a 18 se presentan las colonias de hongos que se manifestaron

originalmente en el medio con sulfato ferroso y extracto de levadura, mientras que en la

plantilla 19 se observan colonias tipo fngico que crecieron en presencia de tiosulfato de

sodio. Todas estas colonias fueron aisladas a partir del consorcio recuperado de la presa

de jales, tanto de los jales como del agua ah depositada. Como se present en el

Cuadro 18, se reconocieron al menos 5 posibles especies fngicas diferentes(Aspergillus, Cryptococcus, Mucor, Penicillium y Rhizopus), distinguindose sus colonias

caractersticas en los medios slidos especficos (Plantillas 16 a 19).

A partir de estas colonias, se realizaron subcultivos repetidos para tener la certeza

de su pureza con el fin de mantenerlos como cepas puras para su posterior identificacin

y empleo en pruebas. Las imgenes de la plantilla 20 presentan la conservacin de las

cepas fngicas purificadas.

En las plantillas 21 y 22, se presentan imgenes de colonias de levaduras

Saccharomyces sp.y Rhodotorula sp., que fueron aisladas y purificadas a partir del

consorcio proveniente de los jales cidos (pH


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importancia en este trabajo sea su sinergismo con el resto de microorganismos (bacterias

y hongos) que crecieron en estos medios.

Es importante tambin mencionar, que se identificaron algunos protozoarios, aun

cuando el experimento se mantuvo permanentemente en oscuridad. Solo se trabaj con

ellos cuando se utiliz el consorcio de origen. En la plantilla 23 se presentan algunas

fotomicrografas de estos eucariotas.

Cuadro 18. Caractersticas descriptivas de las colonias de microorganismoshetertrofos obligados, identificados en este trabajo.

Posible especie demicroorganismos

Caracterstica del hbitat

As perg illu s nger

pH 2.3 a 6.0 de 29 a 30 C. Se encontraron en agua cida y en elsuelo que present color verde. Colonias tpicamente negras. Losconidiforos largos y ramificados aproximadamente de 1.5 a 3.0

mm (Domsch et al., 1993).

Cryptococcus spSe encontr en el agua y suelo donde se registr el pH de 1.2 a 1.9.El color de las colonias fue verde. Se observaron hifas septadas,formaron esclerocios (Alexopoulos, 1996).

Mucor racemosus

El pH fue de 2.5 a 2.8. Se encontr en el suelo, present coloniasde color gris. El esporangiforo oscuro. Las clamidosporas seobservaron globosas y las zigosporas que se detectaron masgrandes. (Domsch et al.,1993).

Penici l l ium ita l icum

En pH 2.9, encontrado en aguas rojas y suelo verde en la orilla de lapresa. La colonia cuando joven se dio verde pero al envejecercambi al color gris verdoso. Muy ramificadas se observaron hifasaseptadas (Domsch et. al., 1993)

Rhizopus stoloniferSe encontr en el suelo con un pH de 3.0. Colonias de color negro ylas zigosporas tambin negras. Hifas ramificadas y formaronesclerocios.

Rhodoto rula sp

El pH registrado en el suelo de color verde donde se encontrfue de 2.0. Las colonias fueron de color anaranjado debido a lospigmentos carotenoides de que son caractersticas estaslevaduras. El color se mantuvo constante hasta los 25 dascambiando al gris cuando envejecieron.

No se hizo ningn tipo de caracterizacin para estos microorganismos. Sin

embargo, se observ con frecuencia durante los conteos, la presencia de protozoariosas como algunos tipos de Amoebas. Adems de todos los microorganismos arriba

citados, se observaron algunos microorganismos filamentosos que crecieron en

presencia de sulfato ferroso, tanto como fuente de energa nica, como en presencia de

extracto de levadura (Plantilla 24).


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Tanto en los protozoarios, como los microorganismos filamentosos, no existi una

evidencia de formar colonias en los medios slidos, identificados exclusivamente como

individuos en los medios lquidos. Para ambos tipos de microorganismos, no se realiz

alguna caracterizacin fisiolgica, aunque ya se han reportado evidencias de su

presencia en este tipo de ambientes cidos (Bacelar-Nicolau y Johnson, 1999).

4.10Bioensayos para determinar condiciones en la biolixiviacin de

minerales sulfurosos

4.10.1 Actividad de los microorganismos en substrato estril y no estril

Se realizaron pruebas con los cultivos puros (Thiobacillus sp.) y mixtos (mezcla de

Thiobacillus sp., Rhodotorula sp. y Penicillium sp.) en presencia de un medio mnimo desales (MMS), en ausencia y presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura, utilizando

los jales como sustrato mineral, donde se compar el efecto de la esterilizacin del

sustrato con el fin de diferenciar la capacidad oxidativa de ambos cultivos. Los resultados

de estas pruebas se reportan en el Cuadro 19, donde se observa para los cuatro distintos

bioensayos una mayor oxidacin del ion ferroso en los cultivos con el sustrato estril,

aunque el contenido inicial de sulfato ferroso es superior para las pruebas donde se

adicion extracto de levadura y sulfato ferroso.

Aun cuando se observa que el porcentaje de oxidacin del Fe (II) para casi todos

los cultivos en sustrato no estril es similar al reportado para la prueba control (~26%), lo

cual significara ningn efecto en la oxidacin del ion ferroso por la presencia de los

cultivos puros y mixto en los sustratos no estril, en realidad si existe un efecto positivo

de la presencia de los microorganismos presentes en ambos cultivos (puro y mixto). Se

observ que al comparar la velocidad de oxidacin del ion ferroso (expresada en mg.h-1),

se comprueba que en presencia del MMS la velocidad de oxidacin del Fe(II) se

incrementa de 3 a 20 veces en comparacin a la prueba control, mientras que en

presencia del medio con extracto de levadura y sulfato ferroso, la velocidad de oxidacin

se incrementa de 78 a 260 veces en comparacin a la prueba control (Cuadro 19).


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94

Cuadro 19. Valores iniciales y finales del in Fe (ll) en cada tratamiento para lascomparaciones con cultivo mixto y puro con distintas fuentes de energa.

CondicionesConcentracininicial (mg/L)

Concentracin final(mg/L)

Oxidacin de Fe(II)(%)

Velocidad deoxidacin deFe(II) (mg.h-1)

Controlstril 0.05 0.037 26 1.8*10-5

no estril 0.05 0.036 28 1.9*10-5

Cult ivo pu ro (Thiobacil lus sp.) en MMS

Estril 0.35 0.09 74 3.6*10-4

no estril 0.30 0.18 40 1.7*10-4

Cul t ivo mix to en MMS

Estril 0.20 0.07 65 1.8*10-4no estril 0.20 0.16 20 5.5*10-5

Cult ivo puro (Thiobacil lus s p.) en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso

Estril 3.98 2.60 35 1.9*10-3

no estril 3.60 2.60 28 1.4*10

-3

Cult ivo mixto en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso

Estril 4.27 0.89 79 4.7*10-3No estril 4.21 3.10 27 1.5*10-3

Debe mencionarse que en las pruebas donde no se adicion sulfato ferroso (tanto

bioensayos control como cultivos con MMS), el Fe (II) inicial es aportado por los jales.

Adems, se observ que no existe un mayor aporte del ion ferroso por la esterilizacin

del sustrato. En todos los casos, fueron evidentes las tendencias de disminucin en laconcentracin de Fe (II) en solucin conforme se incrementa el tiempo de reaccin (Fig.

12 a 16), cuando se esteriliz el medio y adems se adicion sulfato ferroso y extracto de

levadura el consumo fue significativamente mayor (Fig. 16). Como tambin se demostr

en el Cuadro 19, se observ una oxidacin similar del ferroso, tanto con los cultivos puros

como con los mixtos (Fig. 13 y 14). Sin embargo, cuando se adicion el sulfato ferroso y

extracto de levadura fue notablemente ms oxidado en presencia d el cultivo mixto (Fig.15

y 16).


114/191

95

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 24 48 60 72

Tiempo (h)

Ferroso(mg/L)

no estril

estril

Fig. 12. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) en el control en condiciones

estril y no estril.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 24 48 60 72

Tiempo (h)

Ferroso(mg/L)

no estril

estril

Fig. 13. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacil lus sp.)

en medio mnimo de sales (MMS).


115/191

96

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 24 48 60 72

Tiempo (h)

Ferroso

mg/L

no estril

estril

Fig. 14. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo mixto en mediomnimo de sales.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 24 48 60 72

Tiempo (h)

ferroso

(mg/L)

no estril

estril

Fig. 15. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacillussp.)en medio mnimo de sales, extracto de levadura y sulfato ferroso.


116/191

97

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 24 48 60 72

Tiempo (h)

ferroso(mg/L)

no estril

estril

Fig. 16. Evolucin de la concentracin de Fe (ll con el cultivo mixto en mediomnimo de sales, extracto de levadura y sulfato ferroso.

4.10.2 Condiciones de crecimiento de los microorganismos aislados enel substrato con jales y diluyente distinto

Esta serie de bioensayos fue realizado para demostrar el efecto de dos diluyentes

diferentes: agua acidulada y medio 9K, ambos a pH de 2, realizndose para los cultivos

puros y mixtos en presencia de jales. Adems del diluyente, se evalu su efecto en

presencia y ausencia de sulfato ferroso como fuente de energa, con y sin extracto de

levadura.

En la Fig. 17, se presentan los resultados cuando se utiliz agua como diluyente,

con los cultivos puros (Thiobacillus sp.),mixto (mezcla de Thiobacillus sp.,Rhodotorula

sp. y Penicillium sp.) y consorcio, sin sulfato ferroso adicionado como fuente de energa

inorgnica. Se observa que no existe una disolucin adicional de ion ferroso a partir de

los jales para las cinco pruebas reportadas. La concentracin inicial de Fe(II) disuelto al


117/191

98

poner en contacto los jales con el agua acidulada, disminuye de 2 a casi 1.3 mg/L,

obtenindose el mejor resultado para el consorcio en presencia de extracto de levadura.

00.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.82

0 2 5 8 12 36

Tiempo (h)

ferroso(mg/L)

1

2

3

6

7

Fig. 17. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) muestra de jales con cultivo mixto

y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (1) control parael cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) conextracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) conextracto de levadura y cultivo puro.

En la Fig. 18 se presenta el bioensayo equivalente, empleando al medio 9K comodiluyente. Los resultados fueron similares a los obtenidos para el agua con los cultivos

puro y mixto, mientras que para el consorcio con extracto de levadura, la disminucin en

la concentracin del ion ferroso fue aun mayor (de 2 a 0.2 mg/L). Entonces, comparando

los diez tratamientos, la mejor condicin fue con medio 9K como diluyente y consorcio

como grupo microbiano (90% de potencial oxidacin de ion ferroso), aunque a muy bajas

concentraciones de ion ferroso (< 2 mg/L), por lo que era necesario confirmar esto con

mayores concentraciones de sulfato ferroso (con y sin extracto de levadura).


118/191

99

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 5 8 12 36

Tiempo (h)

ferroso

(mg/L)

12

3

6

7

Fig. 18. Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivomixto y cultivo puro, empleando medio 9K como diluyente: (1) controlpara el cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) conextracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) conextracto de levadura y cultivo puro.

Cuando se adicion sulfato ferroso como sustrato energtico, la concentracin

inicial de este ion fue superior: 1500 mg/L para la prueba con agua acidulada y 15000

mg/L para el medio 9K. En las nuevas series de bioensayos con adicin del sulfato

ferroso, no se experiment la presencia del consorcio, puesto que este ya haba

demostrado su mayor capacidad para oxidar el ion ferroso, sobre todo en presencia del

medio 9K con extracto de levadura. En cambio, en estas nuevas series, se tratara de

comparar el efecto del ion ferroso para los cultivos mixto y puro. En las Figs. 19 y 20, se

presentan las tendencias de la disminucin del ion ferroso cuando se us,

respectivamente, agua y medio 9K como diluyentes. Cuando se emple agua como

diluyente, se obtuvo un comportamiento similar para las pruebas con cultivo puro +

extracto de levadura, as como para el cultivo mixto, con y sin extracto de levadura (40%de disminucin, segn Fig. 19).


119/191

100

0

200

400

600

800

10001200

1400

1600

1800

0 2 5 8 12 36

Tiempo ( h )

ferroso

(mg/L

)

4

5

8

9

Fig. 19: Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivo

mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (4)cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto, sulfato ferroso yextracto de levadura; (8) cultivo puro y sulfato ferroso; (9) Cultivo puro,extracto de levadura y sulfato ferroso.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 2 5 8 12 36

Tiempo (h)

ferroso(mg/m

L)

45

8

9

Fig. 20. Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivomixto y cultivo puro, empleando medio 9K como diluyente: (4) cultivomixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto, sulfato ferroso y extracto delevadura; (8) cultivo puro y sulfato ferroso; (9) Cultivo puro, extracto delevadura y sulfato ferroso.


120/191

101

Por otro lado, en la Fig. 19 se observa que el substrato que contena cultivo mixto,

sulfato ferroso y extracto de levadura en medio 9K, la disminucin de la concentracin de

ion ferroso fue significativamente mayor que el resto de los tratamientos. La disminucin

del in ferroso se aceler rpidamente a partir del quinto da, obtenindose un consumo

del 87 % del total del ferroso al inicio presente.

Si se considera que en las condiciones del sistema en estudio, la disminucin del

ion ferroso es provocada por su oxidacin a ion frrico, el Cuadro 18 reporta las

velocidades de oxidacin para estos 9 tratamientos. Con ello se confirma que la mayor

velocidad de disminucin en la concentracin de Fe(II) disuelto se obtuvo con el cultivo

mixto en presencia del medio 9K (7.6X10+2mg.h -1), sulfato ferroso y extracto de levadura

(Cuadro 20). Debe sealarse que esta velocidad mxima se obtuvo en los perodos

iniciales de la cintica, mientras que en ausencia del medio 9K, la mxima velocidad dedisminucin de Fe(II) se obtuvo hacia el final de la cintica (6.5*10+1mg.h -1). Dado que

estos bioensayos demostraron que el cultivo mixto presenta los mejores resultados en la

disminucin de Fe(II), la cual se asocia a su oxidacin en ion frrico, enseguida slo se

realizaron experimentos con este cultivo, haciendo comparacin de eficiencia con el

cultivo puro. Adems, tambin de estas pruebas se propone slo el empleo de medio 9K

como diluyente y extracto de levadura y sulfato ferroso como sustratos energticos.

Cuadro 20. Velocidad mxima de oxidacin del ion ferroso (mg.h-1) en presencia dejales, para microorganismos, en funcin de la presencia de sulfatoferroso y extracto de levadura y dos diluyentes distintos.

Agua acidulada como diluyente Medio 9K como diluyente

Sin FeSO4 Con FeSO4 Sin FeSO4 Con FeSO4Tipo deMicroorganismo Sin

extractoCon

extractoSin

extractoCon

extractoSin

extractoCon

extractoSin

extractoCon

extracto

Consorcio demicroorganismos

- 7.5E-2 - - - 1.9E-1 - -

Puro (Thiobacillussp.)

2.5E-2 2.0E-2 6.1E+1 4.6E+1 5.7E-2 6.2E-2 3.3E+2 3.7E+2

Mixto (Thiobacillussp. Penicillium sp. y

Rhodotorulla sp.)1.5E-2 6.3E-2 8.3E0 6.5E+1 9.7E-2 4E-2 3.0E+2 7.6E+2


121/191

102

4.10.3 Oxidacin de Fe(II) por cultivos mixtos y puros en presencia dejales

Fue evidente la adaptacin de los cultivos de microorganismos al substrato

preparado. En un primer experimento no se adicion extracto de levadura, por lo que no

hubo carbono orgnico como fuente de energa. Se compararon cultivos puros

(Thiobacillus sp.) y mixtos, en presencia de los minerales sulfurosos presentes en los

jales y del sulfato ferroso que se adicion como fuente de energa. Se puede observar en

la Fig. 21 que se increment de manera logartmica la biomasa en ambos tipos de cultivo.

Aunque el cultivo mixto super el nmero de microorganismos con respecto al puro. Sin

embargo, en ambos cultivos se observa el mayor incremento durante los 20 a 35 das de

incubacin.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tiempo (d)

Feensol

ucin(mg/L)

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

10000000

100000000

clu

las/mL

F e( II ) p ar a c ul ti vo mi xt o F e( II I) par a c ul ti vo m ixt o

Cul tivo M ixto (cel / ml ) Cul ti vo P ur o (cel / ml )

Fig. 21. Oxidacin de Fe(II) a Fe(III) y evolucin del crecimiento de losmicroorganismos en cultivo puro (Thiobacil lus sp.) y cultivo mixto.

Por otro lado, tambin se evidenci un incremento en la concentracin de Fe(lll),

mientras que la concentracin de Fe(ll) disminuy de manera proporcional conforme se


122/191

103

incrementa el tiempo de la prueba (Fig. 21). Aun cuando en esta grfica no se

presentan los resultados para la oxidacin del Fe(II) correspondiente al cultivo puro, se

obtuvo una muy lmitada oxidacin del ferroso por estos microorganismos.

En seguida se realiz una prueba adicionando extracto de levadura y el sulfatoferroso. Los resultados de este experimento, confirmaron que la actividad microbiana

favoreci la disminucin de la concentracin de Fe(ll), incrementndose al mismo tiempo

la concentracin de Fe(lll) (Fig. 22). Debe sealarse que el pH de la pulpa descendi de

2.0 hasta 0.9. Con respecto a la actividad de los microorganismos en este substrato, se

manifest un aumento importante de la biomasa. El inculo inicial fue de 1*103

clulas.mL-1, alcanzando una concentracin de 4X109 clulas.mL -1 en periodo

estacionario (a seis das de incubacin) (Fig. 23).

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo (d)

Fe(II)yFe(III),g/L

Fe(II)g/l Fe(III)g/l

Fig. 22. Cintica de la oxidacin de Fe(II) en presencia de jales con cultivo mixto.

Los microorganismos que se desarrollaron en este substrato fueron

microorganismos hetertrofos y quimiolitotrficos (cultivo mixto), ya que el aporte de

sulfato ferroso y el extracto de levadura seguramente funcionaron como fuente deenerga para la proliferacin celular. Cabe sealar que el cultivo de microorganismos que

se us en este experimento, es el que ya se ha seleccionado y adaptado al substrato

empleado en los experimentos anteriores.


123/191

104

En la Fig. 23 se observa tambin que despus de alcanzar su periodo estacionario

de crecimiento entre 5 y 10 das despus de inoculacin, la concentracin de

microorganismos en suspensin disminuy significativamente.

1000

10000

100000

1000000

10000000

100000000

1000000000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo (d)

Clulas/mL

Fig 23. Cintica de crecimiento de microorganismos en el cultivo mixto con

sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente de energa

4.10.4 Estudio comparativo de la capacidad oxidativa de cultivos puros ymixtos

Dado que el cultivo mixto presentaba mejor capacidad oxidativa del Fe(II), y

considerando que este cultivo mixto est constituido por una mezcla de los cultivos puros

identificados como Thiobacillus sp., Penicillium sp. y Rhodotorula sp., se procedi a

realizar cinticas de oxidacin del ion ferroso en presencia de los cultivos puros bajo las

condiciones de crecimiento determinadas como ideales para el cultivo mixto, esto con el

fin de distinguir cual de los microorganismos tiene mayor capacidad de oxidacin en lamezcla.

Bajo las condiciones de las pruebas, el crecimiento de los microorganismos

(expresado en celulas.mL-1), fue mayor para el cultivo identificado como Thiobacillus sp.,

el cual creci de 1*103 a 1*10 5, mientras que el crecimiento de Penicillium sp. y


124/191

105

Rhodotorula sp., fue apenas menor de 5 veces la concentracin inicial de clulas (fFigs.

24 a 26). La oxidacin del ion ferroso fue mayor para los cultivos puros de Thiobacillus

sp. y Penicillium sp., quienes promovieron la disminucin de la concentracin de Fe(II) de

8000 mg.L-1 hasta menos de 3000 mg.L -1 en 45 das (Figs. 24 y 25). En cambio, el cultivo

de Rhodotorula sp.,present una menor capacidad de oxidacin de Fe (II), de 550 a 300

mg.L-1 (Fig. 26).

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

clulas/mL

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Fe(ll)mg/mL

microorganismos [Fe(II)]

Velocidad promediode oxidacin = 1.5 mg/h

Fig. 24. Crecimiento del cultivo puro de Thiobaci llus spen presencia de sulfato

ferroso y extracto de levadura, as como su evolucin en laconcentracin de Fe(II) disuelto.

1

10

100

1000

10000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

celulas/mL

0

2000

4000

6000

8000

10000

Fe(II),mg/L

microorganismos Fe(II)


Fig. 25. Crecimiento del cultivo puro de Penici l lium spen presencia de sulfatoferroso y extracto de levadura, as como evolucin en la concentracinde Fe(II) disuelto.


125/191

106

Enseguida se realizaron nuevamente bioensayos con la mezcla de cultivos puros

de los cultivos de Thiobacillus sp., Penicillium sp., y Rhodotorula sp., en los mismos

tiempos y condiciones que las tres pruebas anteriores, con fuentes de energa diferentes

y empleando a los jales como un sustrato comn.

1

10

100

1000

10000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

clulas/mL

0

100

200

300

400

500

600

Fe(II),mg/L

microorganismos Fe(II)


Fig. 26. Crecimiento del cultivo puro de Rhodotorula spen presencia de sulfatoferroso y extracto de levadura, as como evolucin en la concentracinde Fe (II) disuelto.

1.00E+00

1.00E+02

1.00E+04

1.00E+06

1.00E+08

1.00E+10

1.00E+12

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

clulas/mL

0

1000

2000

3000

4000

5000

60007000

8000

9000

Fe(II),mg/L

Microorganismos Fe(ll)

Velocidadpromedio de

Fig. 27. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para lamezcla de microorganismos (Thiobacillu s sp, Penicill ium sp y Rhodotoru lasp.), utilizando sulfato ferroso con extracto de levadura como fuente deenerga.


126/191

107

1.00E+00

1.00E+02

1.00E+04

1.00E+06

1.00E+08

1.00E+10

1.00E+12

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

clulas/mL

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Fe(II),m

g/L

Microorganismos Fe(ll)Velocidad

romedio de

Fig. 28. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la mezcla demicroorganismos (Thiobaci llus sp, Penici ll ium sp y Rhod otorula s p.), utilizando

sulfato ferroso sin extracto de levadura como fuente de energa.

En la figura 29 se observa la cintica de microorganismos que result con los jales

como nica fuente de energa. Expresa resultados con diferencia significativa comparada

con las dos pruebas anteriores. La produccin mxima de clulas por mL que se obtuvo

fue de 1X105, es decir, 6 y 4 ordenes de magnitud menor que con sulfato ferroso +

extracto de levadura y sulfato ferroso sin extracto de levadura, respectivamente.

Seguramente consecuencia del limitado crecimiento microbiano, la concentracin inicial

de Fe(ll) disminuy slo de 540 a 350 mg.L-1

, al final del tiempo de incubacin (Fig. 29).

1.00E+00

1.00E+02

1.00E+04

1.00E+06

1.00E+08

1.00E+10

1.00E+12

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

clulas/mL

0100020003000400050006000700080009000

FeII(ppm)

Microorganismos Fe(ll)

Fig. 29. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la

mezcla de microorganismos (Thiobaci l lus sp, Penici l l ium sp yRhodotorula sp.), sin fuente de energa adicional, slo sulfurospresentes en jales.


127/191

108

A travs de estos bioensayos, se pudieron detectar las tendencias de la oxidacin

del ion ferroso y del crecimiento microbiano para tres diferentes combinaciones de

fuentes de energa: (i) medio 9K con jales, sulfato ferroso y extracto de levadura; (ii)

medio 9K con jales y sulfato ferroso; y (iii) medio 9K con jales. La mayor proliferacin de

microorganismos que se dio a travs del tiempo fue para el primer bioensayo, es decir,

cuando se utiliz jales, sulfato ferroso y extracto de levadura (Figs. 27 a 29). En este

caso, el crecimiento celular alcanz hasta 1X1011clulas.mL -1, a lo cual se asocia una

disminucin en la concentracin de Fe(II) de 8000 hasta 500 mg.L -1 (Fig. 27). Al utilizar

jales y sulfato ferroso, tambin se expres un importante crecimiento celular, aunque slo

alcanz una concentracin de 1X107 clulas.mL -1 a los 20 das de incubacin,

disminuyendo la concentracin de Fe (II) de 7762 a 2000 mg.L -1 (Fig. 28).

4.11 Biolixiviacin de jales por comunidades microbianasseleccionadas

4.11.1 Descripcin de la evolucin de parmetros indicadores

Se realizaron pruebas de biolixiviacin de los jales sulfurosos con los distintos

tipos de microorganismos y en presencia de distintas fuentes de energa (sulfato ferroso y

extracto de levadura). Los resultados de este estudio compararativo se reportan

grficamente en las Figs. 30 a 32, donde se presentan los principales indicadores de la

actividad microbiana tomando como base los productos de reaccin del sistema en

estudio.

En las tres comparaciones realizadas en funcin de la fuente de energa (jales,

jales+sulfato ferroso y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura), la evolucin de los

parmetros analizados en los bioensayos testigo (sin adicin de microorganismos),

demuestra que efectivamente en todos los casos existe una influencia de la actividad

microbiana, comparado con su respectivo testigo (Plantilla 29 del anexo).

En todos los bioensayos, se observ un incremento en la biomasa (expresadaaqu por el nmero de celulas en suspensin) entre el perodo 15 a 35 das (Figs. 30a,

31a y 32a). Despus de este perodo, en la mayora de los ensayos se observ una

disminucin en el nmero de clulas. Esto fue confirmado por el ensayo de la

concentracin de protenas totales (Figs. 30b, 31b y 32b).


128/191

109

En cuanto al pH, tambin se observ una evolucin similar para todos los

bioensayos, esto es, una disminucin conforme se incrementa el tiempo de la cintica, de

los valores iniciales cercanos de 2 hasta valores de pH ligeramente inferiores de 1 a los

45 das (Figs. 30c, 31c y 32c). Slo en la serie de pruebas con sulfato ferroso como

fuente de energa, se observa una tendencia de la acidez asociada a la evolucin del pH,

esto es, incremento de la acidez con la disminucin del pH (Figs. 30e, 31e y 32e). En

cambio, para las pruebas con jales y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura, no se

observa un comportamiento asociado entre el pH y la concentracin de la acidez en la

pulpa. De una manera similar, la evolucin de la concentracin de ion sulfato es irregular

en la mayora de los bioensayos, aunque para los ltimos tres muestreos se observ una

tendencia de incremento (Figs. 30f, 31f y 32f).

El potencial rdox de las pulpas durante las pruebas mostraron una tendencia

normal para los sistemas de oxidacin de minerales sulfurosos, esto es, un incremento

hasta potenciales cercanos de 600 mV/SCE (equivalente a 840 mV/SHE), aunque en los

tres casos, se observ un mayor incremento en el potencial rdox para las pruebas con

el consorcio (Figs. 30d, 31d y 32d).

En el caso del anlisis de Fe total, se observ para los bioensayos donde se

adicion ion ferroso una tendencia a la disminucin en la concentracin de Fe (Figs. 30gy 31g), en cambio donde no se adicion el Fe (II) y el nico sustrato energtico fueron los

sulfuros de los jales, si se observ una tendencia al incremento en la disolucin de este

metal (Figs. 32g). A diferencia de este comportamiento no esperado del Fe total para los

bioensayos con el Fe(II), la concentracin del ion ferroso si present una tendencia

normal a la esperada, esto es, una disminucin en su concentracin, atribuida a su

oxidacin a ion frrico (Figs. 30h, 31h y 32h).


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1,00E+00

1,00E+02

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1,00E+06

1,00E+08

1,00E+10

1,00E+12

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo(das)

Clulas/mL

CMS M Th P R

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

pH

CMS M Th P R T

c

0

20

40

60

80

100

120

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

Acidez(%

CMS M Th P R T

e

0

2000

4000

6000

8000

10000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

FeTotalmg/L

CMS M Th P R T

g

0

2

4

6

8

10

12

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

ProtenasTotales(ug/mL)

CMS M Th P R T

b

0

200

400

600

800

1000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

ORP

(mV/SCE

CMS M Th P R T

d

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

ionsulfato(mg/L)

CMS M Th P R T

f

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

Fe(ll)mg/L

CMS M Th P R T

h

Fig. 30. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante labiolixiviacin de los jales en presencia de sulfato ferroso como fuente de energa: (a)concentracin de clulas en suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencialrdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de Fe

disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.CMS = Consorcio de microorganismos seleccionados; M = cultivo mixto ( Thiobacillus sp.,Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th = cultivo puro de Thiobacillus sp., P= cultivo puro de

Penicillium sp.; R = cultivo puro de Rhodotorula sp.; T = testigo.


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1,00E+00

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1,00E+04

1,00E+06

1,00E+08

1,00E+10

1,00E+12

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

Clulas/mL

CMS M Th P R T

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

pH

CMS M Th P R T

c

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

5 10 15 20 25 30 35 40

tiempo (das)

Acidez(%

CMS M Th P R T e

0

2000

4000

6000

8000

10000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tiempo (d)

Fetotal(mg/L)

CMS M Th P R T

g

0

3

6

9

12

15

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

ProtenasTotales

(ug/mL)

CMS M Th P R T

b

0

200

400

600

800

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

ORP(mV/SCE

CMS M Th P R T

d

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

tiempo (das)

ionSulfato(mg/L)

CMS M Th P R T f

0

10000

20000

30000

40000

50000

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

Fe(ll)mg/L

CMS M Th P R T

h

Fig. 31. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante labiolixiviacin de los jales en presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura comofuente de energa: (a) concentracin de clulas en suspensin; (b) protenas totales; (c)

pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g)concentracin total de Fe disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.

CMS = Consorcio de microorganismos seleccionados; M = cultivo mixto ( Thiobacillus sp.,Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th = cultivo puro de Thiobacillus sp., P= cultivo puro de



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1,00E+04

1,00E+06

1,00E+08

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

Clulas/mL

CMS M Th P R T

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (d)

pH

CMS M Th P R T

c

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

Acidez(%

CMS M Th P R T

e

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo(das)

FeTotal(mg/L)

CMS M Th P R T

0

3

6

9

12

15

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

ProtenasTotales

(ug/mL)

CMS M Th P R T

b

0

200

400

600

800

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

ORP(mV/SCE)

CMS M Th P R T

d

0

500

1000

1500

2000

5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)

ionsulfato(mg/L)

CMS M Th P R T

f

0

50

100

150

200

250

5 10 15 20 25 30 35 40 45

tiempo (das)

Fe(ll)mg/L

CMS M Th P R T

h

Fig. 32. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante labiolixiviacin de los jales como nica fuente de energa: (a) concentracin de clulas en

suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f)concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de Fe disuelto; y (h)

concentracin total de ferroso disuelto.CMS = Consorcio de microorganismos seleccionados; M = cultivo mixto ( Thiobacillus sp.,Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th = cultivo puro de Thiobacillus sp., P= cultivo puro de



132/191

113

4.11.2 Anlisis estadstico (ANOVA y Prueba de medias de Tukey)

Se presenta el anlisis de la separacin de prueba de medias que se realiz

para conocer el efecto de las diferentes clases de microorganismos sobre las variables

medidas durante el proceso de biolixiviacin de los jales. Los resultados de los anlisis

de varianza se reportan en el Cuadro 21, mientras que aquellos de las pruebas demedias en los Cuadros 22 a 24.

En el Cuadro 22, se muestra que el valor del pH mas bajo (1.58) fue con el

consorcio de microorganismos seleccionados (CMS) y ms alto con el testigo (2.58).

Caso contrario sucedi con el potencial rdox (ORP), mientras la cifra ms alta se dio

en CMS la ms baja fue en el testigo. De la misma forma, las concentraciones del in

sulfato ms elevadas se dieron en el CMS y con Penicillium sp y la menor en el

testigo. Con respecto a la acidez, la mayor concentracin tambin se manifest en elCMS (84.19), enseguida con Thiobacillus, seguida de la mezcla de microorganismos

as como con Penicillium y Rhodotorula y la ms baja en el testigo. Sin embargo, la

concentracin de clulas ms destacada, se evidenci con la mezcla de

microorganismos; posteriormente en el CMS, le siguieron con cifras similares

estadsticamente los cultivos de Thiobaciilus, Penicillium y Rhodotorula, siendo la ms

baja con el testigo.

En Cuadro 22 se pone en evidencia, a travs de la separacin de medias, los

efectos de los microorganismos sobre el resto de las variables. En el caso de la

concentracin de proteinas totales, los valores ms elevados fueron para el CMS, la

mezcla de microorganismos y el cultivo puro de hongos, mientras que los valores ms

bajos fue para la muestra testigo.

En cuanto a los resultados de los iones Fe (ll), la mayor concentracin se

manifest en el testigo, le siguieron los cultivos puros de Rhodotorula sp, Penicillium

sp y Thiobacillus sp., mezcla de microorganismos, y finalmente la muestra con menor

concentracin de ferroso fue el CMS. Contrariamente, las concentraciones mas

elevadas del Fe (lll), estuvieron en CMS y le siguieron con cifras estadsticamente

iguales la mezcla de microorganismos, cultivos puros de Thiobacillus sp, Penicillium

sp, Rhodotorulla sp y finalmente el mas bajo estuvo en el testigo.


133/191

114

Por lo que se refiere a las concentraciones de azufre, de acuerdo al anlisis, la

evidencia reflej que la concentracin mas elevada fue en el CMS, le siguieron los

cultivos de hongos,Thiobacillus sp y Rhodotorula sp, teniendo la lectura menor para el

testigo.

Cuadro 21. Valor de F calculada por anlisis de varianza de las interacciones,aplicando los resultados de pruebas de biolixiviacin condistintos microorganismos seleccionados.

Fuente devariacin

Grados delibertad

ORP(mV)

In Sulfato(mg/L)

Acidez(%) pH

Azufre(mg/L)

Tratamientos 163

Microorga-nismos (M)

5 90.23*** 10.20*** 88.50*** 249.94*** 31.43***

Fuente deenerga (C)

2 19.38*** 721.83*** 1469.42*** 560.62*** 737.42***

Tiempo (T) 8 254.18*** 170.53*** 485.14*** 90.84*** 83.08***Repeticin (R) 2 1.17 NS 0.13 NS 0.27 NS 4.73 NS 0.20 NS

M*C 10 8.93*** 41.10*** 14.81*** 76.66*** 4.74***

M*T 40 6.40*** 66.96*** 7.74*** 4.85*** 9.05***C*T 16 4.91*** 15.02*** 26.87*** 8.99*** 7.96***

M*C*T 80 1.98*** 16.53*** 3.93*** 2.36*** 2.18***

Error 322CME 2948.915 17099.8 0.01027700 0.0454436 521690

C.V. (%) 11.24407 13.13519 14.70812 11.65991 18.34778

Fuente de

variacin

Gradosde

libertad

Fe (ll)

(mg/L)

Fe(lll)

(mg/L)

Fe Total

(mg/L)

Microorganismos

(Clulas/mL)

Protenas

totales(g/L)Tratamientos 163

Microorganismos(M)

5 52.48*** 179.97*** 202.79*** 3515.71*** 11.05***

Fuente deenerga (C)

2 1652.16*** 5182.50*** 1307.48*** 455.76*** 23.83***

Tiempo (T) 8 114.71*** 17.58*** 85.88*** 1136.72*** 27.67***Repeticin (R) 2 1.10 NS 1.34 NS 0.03 NS 0.95 NS 1.96 NS

M*C 10 25.00*** 135.86*** 6.43*** 40.09*** 10.42***M*T 40 5.95*** 8.81*** 75.30*** 50.78*** 6.49***

C*T 16 30.82*** 49.51*** 11.90*** 17.61*** 2.61 NS

M*C*T 80 4.05*** 5.26*** 4.83*** 7.99*** 3.92***Error 322CME 0.0571378 0.0152755 0.0598543 0.062253 0.1438972

C.V. (%) 10.61148 3.878380 8.463365 3.487970 40.39052 CME = Cuadrado medio del error. CV =Coeficiente de variacin.NS = No significativo *** Significativo al 1%


134/191

115

Cuadro 22. Efecto de los microorganismos sobre las variables medidasdurante la biolixiviacin de los jales

Tipo demicroorganismos

pH ORP(mV)

In Sulfato(mg/L)

Acidez(%)

Microorganismos(clulas/mL)

C. M. S. 1.58 c1 565 a 1031.2 a 84.19 a 6.41E+07 bMezcla (B, H y L) 1.66 bc 485 b 982.8 b 66.58 c 3.05E+08 a

Bacterias(Thiobaci i l lusp)

1.72 b 493 b 928.3 c 75.10 b 3.64E+07 c

Hongos(Penici l l ium sp)

1.74 b 496 b 1031.0 a 67.75 c 3.98E+07 c

Levaduras(Rhodototuru l la)

1.66 bc 473 b 958.0 bc 67.80 c 3.92E+07 c

Testigo (CN) 2.58 a 386 c 645.0 d 52.13 d 7.49E+03 d

Tipo demicroorganismos

Protenastotales(g/L)

Fe (ll)(mg/L)

Fe (lll)(mg/L)

Fe (Total)(mg/L)

Azufre(mg/L)

C.M S. 8.0 a1 345.4 d 3278.8 a 3624.2 a 4631.1 aMezcla (B, H y L) 7.8 a 788.44 c 1902.2 b 2690.6 cd 3770.6 c

Bacterias(Thiobaci i l lusp)

5.0 b 987.0 bc 1839.4 b 2928.5 c 3963.0 bc

Hongos(Penici l l ium sp)

7.0a 1089.0 b 1837.8 b 3299.4 b 4134.8 b

Levaduras(Rhodototuru l la)

5.6 b 1467.0 b 1687.8 b 2674.8 d 3859.2 bc

Testigo (CN) 1.9 c 1573.0 a 959.0 c 2531.8 d 3261.0 d1 Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).C M S = Consorcio de Microorganismos SeleccionadosB H L = Bacterias Hongos LevadurasCN = Consorcio Natural

Asimismo, fue analizada la fuente de energa como factor de variacin sobre

las mismas variables (Cuadro 23). Es decir, que se analiz el efecto de los

tratamientos sin fuente adicional de energa (solo jales), con sulfato ferroso y sulfato

ferroso con extracto de levadura como fuentes de energa. El pH ms bajo fue donde

se utiliz el sulfato ferroso con extracto de levadura y ms alto en donde no se

adicion ninguna fuente de energa. El ORP ms elevado fue obtenido para el cultivo

sin fuente de energa, mientras que el ms alto para el cultivo con sulfato ferroso. Por

otro lado, tanto en las variables in sulfato y acidez, como en los microorganismos, los

comportamientos fueron similares, ya que las cantidades ms grandes se

manifestaron en el sulfato ferroso con extracto de levadura que en los otros factores.


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116

Cuadro 23. Efecto de la biolixiviacin de los minerales de sulfuro de los jalescon las tres diferentes fuentes de energa

Fuentes deenerga

pHORP(mV)

In Sulfato(mg/L)

Acidez(%)


Sin fuente deenerga

2.271a 462 b 677.86 c 34.0 c 4.90E+06 c

Sulfato ferroso 1.68 b 498 a 1132 b 81.8 b 1.73E+07 bSulfato ferroso y

Extracto delevadura

1.52 c 488 a 1176 a 91.0 a 3.34E09 a

Fuentes deenerga

Protenas(g/L

Fe (ll)(mg/L)

Fe(lll)(mg/L)

Fe (Total)(mg/L)

Azufre(mg/L)

Sin fuente deenerga

5.01c 37.87 c 489.4 c 527.3 c 2163 c

Sulfato ferroso 6.1 b 2304.9 a 2359.5 b 4664.4 a 4950 aSulfato ferroso y

Extracto de

levadura

8.5 a 782.0 b 2902.0 a 3683.0 b 4780 b

1 Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).

En el Cuadro 24, se observa la evolucin que manifestaron las variables

estudiadas en el experimento a travs del tiempo. A travs de estos resultados se

confirma de manera estadstica a las tendencias de la evolucin del proceso de

oxidacin microbiana de los minerales sulfurosos presentes en los jales: disminucin

del pH y de la concentracin de ion ferroso disuelto; mientras que el ORP, acidez,

concentracin de ion sulfato, frrico y nmero de clulas, incrementaron con el avance

de las cinticas. Con relacin al Fe total, los valores ms altos se dieron durante los

primeros veinte das y la concentracin fue disminuyendo con el tiempo hasta los

cuarenta y cinco das de incubacin. Esta disminucin en la concentracin de hierro

disuelto, debe estar asociada a la formacin de jarosita [ ]643 ))(( OHSOKFe , que fue

observada como producto de la fase slida, a partir de los treinta y cinco das de

incubacin, en los tratamientos donde se usaron los cultivos mixtos. Este compuesto

no fue detectado en ningn otro tratamiento (Plantilla 30 del anexo).

De acuerdo a los resultados del anlisis del experimento, se observ que, las

diferencias que se obtuvieron en las concentraciones de las distinas variables

medidas, desde el origen del experimento, hasta los cuarenta y cinco das de

incubacin, fueron positivos y altamente significativas.


136/191

117

Cuadro 24. Efecto del tiempo de reaccin en la biolixiviacin de los jales conlas tres diferentes fuentes de energa (se consideran losresultados de todas las pruebas, incluyendo distintas fuentes deenergia y distintos cultivos).

Tiempo deincubacin

pHORP(mV)

In Sulfato(mg/L)

Acidez(mg/L)


5 2.251a 272 e 735.10 e 27.81 f 5.06E+07 bc

10 2.15 a 296 e 778.26 de 27.81 f 6.04E+07 b15 1.95 b 466 d 829.44 d 46.82 e 4.74E+07 c20 1.82 c 522 c 837.24 d 55.01 d 1.21E+09 a

25 1.81 c 530 c 959.14 c 77.26 c 1.15E+09 a30 1.79 cd 551 bc 1046.90 b 86.40 b 1.02E+09 a

35 1.67 de 586 a 1073.69 b 91.78 b 1.80E+06 d40 1.65 e 567 ab 1312.03 a 9834 a 5.24E+05 e

45 1.32 f 553 bc 1388.08 a 97.53 a 1.25E+04 f

Tiempo deincubacin

Protenas(g/L)

Fe (ll)(mg/L)

Fe (lll)(mg/L)

Fe (Total)(mg/L)

Azufre(mg/L)

5 2.8 c1

2.8954 a 2.3514 g 3.2864 a 3703.4 cd10 4.8 b 2.7144 b 2.4859 f 3.2731 a 3511.2 e

15 7.3 ab 2.4141 c 2.7252 e 3.2185 b 3134.2 f20 11.8 a 2.1524 d 2.8597 d 3.2129 bc 3050.1 f

25 11.0 a 2.1180 d 3.0211 c 3.2053 bc 3972.4 cd30 8.4 a 2.0994 de 3.0842 bc 3.1646 cd 5955.6 a

35 7.8 ab 2.0277def 3.1455ab 3.1253 cd 4584.9 b40 7.6 ab 1.9631 ef 3.1460 ab 3.1041 e 4070.9 b

45 1.9 c 1.8884 f 3.1974 a 3.0905 e 3446.9 e

1 Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).


137/191

119

V DISCUSIN

En este trabajo se realiz el muestreo de residuos, agua y suelos en una

presa de jales donde se depositan residuos que contienen minerales sulfurosos,

adems de xidos de hierro y silito-aluminatos. En este sitio se identificaron

ambientes cidos, tanto en el agua como en suelo, alcanzando valores de pH hasta

de 1.20, favorecindose entonces las condiciones para el desarrollo de

microorganismos acidoflicos que catalizan la oxidacin de los sulfuros como fuente

de energa. El anlisis del cuadro 10 donde se reporta la composicin de las aguas,

denota la generacin de DAM, dados los valores de pH y potencial rdox reportados,

adems de la alta concentracin de Fe y SO4disueltos. Incluso, en el caso del Fe, la

mayor proporcin es ion ferroso (82% en promedio), lo que sugiere reacciones deltipo (Sand et al., 2001):

++ ++ ++ HSOFeOHOFeS ismosmicroorgan 2227 2

42

222 (1)

Mientras que la presencia de los elementos alcalinotrreos (Ca, Na, etc.),

debe ser precisamente resultado de la disolucin cida de los silito-aluminatos, por

reacciones del tipo (Blowes y Jambor, 1994):

Muscovita:

4522221032 )(23

23)]([ OHOSiAlKOHHOHOAlSiKAl +++ ++ (2)

Albita:

4522442

283 )(2122

9 OHOSiAlSiOHNaOHHONaAlSi ++++ ++ (3)

El pH de los suelos, jales y aguas reportados durante los tres muestreos, es

tambin indicativo de la generacin de DAM, lo cual se confirma por la coloracin

rojiza puesta en evidencia en la mayora de los escurrimientos que derivan de la

presa de jales. La coloracin rojiza, debe ser consecuencia de la hidrlisis del ionfrrico producido durante el DAM, de acuerdo a las reacciones (Sand et al., 2001):

OHFeHOFe ismosmicroorgan

23

22 2444 + ++ +++ (4)

+++ HOHFeOHFe 3)(3 323

(5)

Sin embargo, en algunos puntos de muestreo, se detectaron precipitados de

coloracin verde, acompaados de olores caractersticos de H2S. Esto, podra ser


138/191

120

consecuencia de la disolucin cida de la pirrotita (Fe1-XS), el segundo sulfuro de

hierro caracterstico de estas mineralizaciones:

SHFeHFeS 222 ++ ++ (6)

Por ms de cinco dcadas se han estudiado a los microorganismos

acidoflicos que participan en los procesos de oxidacin de sulfuros, enfocndose los

estudios la mayor parte del tiempo hacia los quimiolitotrficos, particularmente a

Thiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Sin embargo, en estudios

recientes, se han identificado una mayor variedad de microorganismos en estos

ambientes cidos, entre los que se incluyen varias especies de hetertrofos,

reconocindose incluso que algunos de estos juegan un papel importante en la

oxidacin de los sulfuros y la conservacin de los ambientes cidos (Baker et al.,

2003).

La caracterizacin de las muestras de suelo y agua, as como la composicin

de los jales, demuestra que se tienen las condiciones para la proliferacin de

microorganismos que emplean los componentes minerales como fuente de energa o

que propician el ambiente para su desarrollo. Por ello, se realiz un trabajo de

aislamiento y caracterizacin de microorganismos recuperados del sitio en estudio,

donde predominan ambientes cidos, esto con fin de evaluar su capacidad de oxidar

las especies reducidas de hierro o azufre.El aislamiento y cultivo de los microorganismos se realiz manteniendo

condiciones similares a las de su ambiente de procedencia con el fin de asegurar su

actividad metablica. Gracias a ello, se pudo obtener un consorcio de

microorganismos a partir del cual se aislaron y seleccionaron cultivos de bacterias,

hongos, levaduras y otros eucariotas, todos ellos con capacidad para crecer en el

medio cido. De estos cultivos, fue posible seleccionar y caracterizar fenotpicamente

aquellos que mostraron una mejor adaptacin a las condiciones de cultivo,

destacndose bacterias posibles Thiobacillus sp., hongos posibles Penicillium sp. y

levaduras posibles Rhodotorula sp.

Adems, se demostr la capacidad por disolver minerales que tienen los

microorganismos hetertrofos acidoflicos con los que se trabaj, de una manera

similar a lo reportado por varios autores (Rezende et al., 1999; Brandl et al., 2001;

Gross y Robbins, 2000; Miadokova et al.,.2000; Schneegurt et al., 2001), para la


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biolixiviacin de minerales empleando microorganismos hetertrofos. Al parecer la

presencia de microorganismos hetertrofos, tienen inferencia metablica en el DAM,

aun cuando los niveles de carbono orgnico sean bajos. Este hecho coincide con los

resultados del trabajo que realizaron Bacelar-Nicolau y Johnson (1999).

Sin embargo, tambin se demuestra aqu que la diversidad de

microorganismos es muy amplia en este ambiente cido, contrario a lo esperado, de

que los microorganismos quimiolitotrficos tipo Thiobacillus sean los ms

abundantes.

Desde el inicio del trabajo, se demostr que los microorganismos hetertrofos

tienen tanta capacidad para aprovechar la oxidacin del ion ferroso, como los

quimiolitotrficos (fig. 6 y 7), de ah que se haya decidido encontrar las mejores

condiciones para mejorar el crecimiento y actividad oxidante por tipo demicroorganismo (bacterias, hongo o levadura) y para el cultivo mixto.

La oxidacin de especies reducidas de hierro y azufre realizada por bacterias,

ya fue demostrada por Blais et al, (1993). En este trabajo se mostr la correlacin

entre el incremento de biomasa y de la concentracin de iones sulfato y Fe(II), as

como un decremento en el pH en los tratamientos donde se adicion cultivo de

microorganismos. Esto se explica por las reacciones (1) y (4), caractersticas de

estos ambientes (Sand et al., 2001).

En este trabajo de tesis, se observ para casi todos los bioensayos realizados

una tendencia general similar de la evolucin de los parmetros indicadores de la

oxidacin del ion ferroso y la produccin de cido, que resultan de las tres reacciones

anteriores: disminucin de la concentracin de Fe(II), disminucin del pH, incremento

de acidez, proliferacin celular, incremento de potencial rdox e incremento de las

concentraciones en solucin de Fe(III) y SO42-.

El descenso del pH de 2.0 a 1.3 y la produccin de sulfato, ocurrieron

simultneamente a travs del tiempo. Al final de los experimentos, virtualmente todo

el Fe(II) ha sido oxidado a la forma Fe(IIl). Esto no se observ en los controles (no

inoculados), durante los 45 das de incubacin, lo que confirma el papel importante

que realizan los microorganismos. En un ambiente cido donde existe la presencia

de microorganismos, el ion ferroso formado durante la oxidacin de la pirita (FeS2)

presente en los jales sulfurosos, posiblemente sea una de las causas que incremente


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la velocidad de oxidacin biolgica de estos minerales, al favorecerse la produccin

de Fe (III) y la consecuente oxidacin frrica del sulfuro:

+++ ++++ HSOFeOHFeFeS 16215814 242

23

2 (7)

La velocidad de oxidacin est sujeta en esencia a las condiciones del medio

ambiente, puesto que los microorganismos deben encontrar las condiciones de

sustrato (en este caso, ion ferroso o pirita), de temperatura y de humedad. Como se

observ en este trabajo, durante mayo y septiembre, fueron los meses donde se

obtuvo el pH mas bajo, esto es, donde hubo mayor produccin de H+, generados por

la actividad microbiana, puesto que en estos meses se tienen condiciones climticas

ms favorables para la proliferacin de los mismos (temperatura, humedad y aporte

de nutrientes). Un resultado similar tambin fue reportado por Haack y Warren

(2003).

En este caso, los microorganismos con los que se trabaj, fueron aquellos que

se manifestaron sobre un material slido y adems, los que se mantuvieron

presentes cada vez que se realiz el sub-cultivo a partir de la colonia en la resiembra

a material nutritivo fresco. Caso que no se repiti con numerosos microorganismos

que se visualizaron en medio lquido y microscopio.

Sin duda alguna, los micro-nutrientes sugeridos por Silverman y Ludgren

(1959) para microorganismos quimiolitotficos y por Johnson (1995) parahetertrofos fueron exitosos para el aislamiento de ellos en este trabajo. Es

importante sealar que la cuantificacin de los microorganismos de ambas

modalidades nutricionales se realiz con los que se encontraron en solucin y los

que crecieron en medios slidos. Debido a que se ha sugerido, que durante la

oxidacin de los compuestos reducidos de azufre en la biolixiviacin (sulfuros

minerales), es mediada por la reduccin de los iones Fe (lll) a Fe(II), lo cual es

importante en la participacin de polmeros extracelulares de microorganismos y la

proliferacin de biopelculas sobre el soporte mineral (Tributsch, 2001). La formacin

de estos biopolmeros permite a los microorganismos adherirse a los substratos

sulfurosos para realizar la oxidacin de los compuestos, generando fuentes de

energa para su metabolismo (Sand et al., 1995; Ingledew, 1982).

Cuando se realizaron los bioensayos para elegir a los microorganismos ms

eficientes en la oxidacin, los que aqu destacaron fueron los identificados como


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posibles Thiobacillus, Penicillium sp y Rhodotorula sp. (figuras 24 a 26). Esta

actividad oxidativa de los microorganismos mencionados, ya ha sido citada por otros

trabajos, donde hacen referencia de su eficiencia no solo para oxidar al hierro, sino

tambin por su capacidad para tolerar concentraciones altas de metales, que para

muchas especies incluyendo al hombre, son txicas (Schneegurt et al., 2001; Gross

y Robbins, 2000; Rezende et al., 1999; Acharya et al., 2003). Adems, los cultivos

mixtos con hetertrofos acidoflicos, en la actualidad se estn considerando como el

futuro para los procesos de biolixiviacin (Ehrlich, 2001).

En las reacciones de oxidacin, tuvieron un papel importante, ya que estos

fueron integrantes del consorcio de microorganismos seleccionado (CMS), adems

de los protozoarios (Plantilla 23 en anexo), que ya se han reportado tener un papel

importante en estas reacciones (Johnson y Rang, 1993; Brake et al., 2001), tambinlas bacterias, hongos y levaduras, Aspergillus sp, Mucor sp y Saccharomyces sp,

ademas de Penicillium sp, Rhodotorula sp, Thiobacillus ferrooxidans yT. thiooxidans.

A lo que se le puede atribuir en su funcionalidad sinergtica destacada con respecto

al resto de microorganismos. Adems de estos, en el agua cida tambin se

encontraron microorganismos muy similares a los descritos por Bacelar-Nicolau y

Johnson (1999), los que denominaron serpentines cidos (Plantilla 24 en anexo).

Por otra parte, las concentraciones altas de acidez no solo son producto de la

concentracin de protones, por la oxidacin de la pirita o por la oxidacin del Fe (ll) a

Fe (lll) y posterior hidrlisis de este ltimo, sino tambin por la acumulacin de los

compuestos cidos formados como resultado metablico de los microorganismos

hetertrofos, tales como cido ctrico, cetoglutrico, frmico y lctico atribuido a

hongos y levaduras (Burgstaller y Schinner, 1993). Estos compuestos cidos, se

encuentran en la solucin en forma no disociada, no producen inhibicin para los

microorganismos quimiolitotrficos, reportndose que de esta forma son

transportados a travs de la membrana celular. Cuando estn internamente en el

citoplasma, se disocian para ser utilizados por la clula en sus procesos biosintticos

(Alexander et al., 1987).

La explicacin del porque se obtuvo mayor oxidacin en el medio esterilizado

y no en los no esterilizados, fue posiblemente porque los jales (usados como

substratos) estuvieron sometidos a un proceso de deshidratacin intensa a


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temperatura menor de 40 C, para eliminar la mayor cantidad de microorganismos

mesoflicos nativos. Adems, al someter a los jales a mayores temperaturas en

medio acuoso, durante la esterilizacin, se produce una oxidacin qumica superficial

de los minerales sulfurosos produciendo iones ferrosos (Mustin et al., 1992), que al

adicionar el sulfato ferroso, incrementa la concentracin del Fe(ll) en solucin y por lo

tanto la disponibilidad para los microorganismos en la prueba (Tonniazo, 1998). Una

vez agotada la fuente de energa, los microorganismos pasaran a obtenerla de los

minerales sulfurosos, a los cuales tienen que adherirse para iniciar el proceso

oxidativo.

Fue evidente la adaptacin de los microorganismos aislados en estudio hacia

los substratos adicionados, puesto que la velocidad de oxidacin durante el

experimento de biolixiviacin final fue significativamente mas rpida (6.62 mg.h -1) quecuando se sometieron al proceso de adaptacin a las diferentes fuentes de energa

(1.5X10-3 mg.h -1).

La comprensin de las reacciones qumicas que se dieron en el sistema,

podran explicarse de la manera siguiente: la contaminacin del agua puede ser

provocada por la intemperizacin fsica y qumica de los sulfuros en los depsitos de

jales. El principal mineral proveedor de energa acumulado en los jales, es la pirita,

por lo que el nivel de acidez y la concentracin de metales contaminantes en el

drenaje de las minas pueden estar directamente correlacionados con la cantidad de

pirita que se encuentre en el rea de los depsitos y la actividad de los

microorganismos. Los procesos geoqumicos implicados en la oxidacin de la pirita,

producen iones ferrosos e hidrgeno, as como electrones disponibles para los

microorganismos como fuente de energa (reaccin 1). Enseguida, tanto el ferroso

como el hidrgeno son oxidados nuevamente para producir iones frricos (reaccin

4). Los iones frricos con el agua producen hidrxido frrico y nuevamente protones

(5). Al combinarse la pirita con el in frrico y el agua, producindose in ferroso,

sulfato y buena proporcin de protones y electrones para utilizarlos como fuente de

energa durante el transporte de electrones (7). Cuando se combina el hidrxido

frrico con el sulfato en solucin se obtienen hidroxi-sulfatos frricos, de acuerdo a la

reaccin (8).

OHSOOHFeSOHOHFe 242

43 2)(2)( ++++ (8)


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Cuando el ion frrico formado como producto de la oxidacin del ferroso se

combina con el agua vuelve a producir hidrgenos que acumulados con las

reacciones anteriores, incrementando la concentracin de estos iones y ocasiona

que el pH del agua disminuya.

Una prueba de los resultados de estas reacciones que se puede mencionar en

este trabajo, fue la formacin de jarosita [ ]643 ))(( OHSOKFe , como producto de la fase

slida de los precipitados que se obtuvieron, donde se trabaj con los cultivos mixtos

(Plantilla 30 en anexo). El hidrxido frrico, precipitado cristalizado llamado tambin

hidroxi-sulfato, cuando lleg a su punto de saturacin, al incrementarse

sustancialmente la oxidacin del sulfato ferroso. Este precipitado, tambin se ha

encontrado en las aguas residuales de las minas por la oxidacin del Fe (ll) (Ivarson

y Sojak, 1978; Bigham, 1990).

La accin definitiva de los microorganismos en las reacciones de precipitacin

y solucin qumica, an no esta clara. Lo que si est claro, es que existe un amplio

espectro de microorganismos con requerimientos de energa tambin muy amplia. Lo

que se traduce, en un panorama importante y prometedor para continuar estudiando

sus procesos bio

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TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)