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SUBSECRETARIA DE EDUCACIN SUPERIOR DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICA INSTITUTO TECNOLGICO DE VERACRUZ

SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA

CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y MOLECULAR DE CEPAS DE Trichoderma AISLADAS EN EL CENTRO DE MEXICO

TESISQUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS EN INGENIERA BIOQUMICAPRESENTA:

ING. CRISTOBAL TORRES PALACIOS

ASESORES: ecede DR. MARIO RAMREZ LEPE DR. VLADIMIR SANCHEZ LPEZ DRA. MIRNA L. SUREZ QUIROZ

H. VERACRUZ, VER., MEX.

DICIEMBRE, 2010

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CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y MOLECULAR DE CEPAS DE Trichoderma AISLADAS EN EL CENTRO DE MEXICO.

Por:

ING. CRISTOBAL TORRES PALACIOS

Tesis propuesta a la UNIDAD DE INVESTIGACIN Y DESARROLLO EN ALIMENTOS del INSTITUTO TECNOLGICO DE VERACRUZ

Como requerimiento parcial para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERA BIOQUMICA

VERACRUZ, VER. DICIEMBRE DE 2010

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Para Cinthya y Eira, Son la luz que ilumina mi camino.

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RECONOCIMIENTOS

A mi Madre, ejemplo claro del amor por el bien hacer y la perseverancia, sin los cuales ninguna empresa valdra la pena hacer o intentar.

A mi Padre, que me enseo que el conocimiento es la riqueza ms grande a la que uno puede aspirar y que nunca se deja de aprender.

A mis asesores, quienes siempre estuvieron dispuestos a compartir sus conocimientos y me brindaron su apoyo y confianza en la realizacin de este trabajo.

A mis amigos, particularmente Elizabeth, y Uriel, quienes con sus siempre objetivas crticas y sus sugerencias, mejoraron sustancialmente este trabajo.

Al CONACYT, por el financiamiento otorgado para la realizacin de mis estudios de postgrado.

Y por encima de todo, a Dios, que est al inicio y al final de cada empresa.

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RESUMEN Torres Palacios, Cristobal M.C. en Ingeniera Bioqumica. Unidad de Investigacin y Desarrollo en Alimentos del Instituto Tecnolgico de Veracruz. Diciembre del 2010. CARACTERIZACIN MORFOLGICA Y MOLECULAR DE CEPAS DE Trichoderma AISLADAS EN EL CENTRO DE MEXICO. Asesores: Dr. Mario Ramrez Lepe, Dr. Vladimir Snchez Lpez y Dra. Mirna Surez Quiroz.

En el presente estudio, una coleccin de hongos aislados en las inmediaciones del volcn Nevado de Toluca, Mxico que, por sus caractersticas morfolgicas bsicas fueron considerados como pertenecientes al gnero Trichoderma, fueron identificados hasta el nivel de especie mediante su caracterizacin morfolgica y anlisis filogentico.

Los aislados fueron caracterizados morfolgicamente mediante el estudio de sus colonias y estructuras reproductivas durante su crecimiento sobre los medios Agar de papa y dextrosa (PDA), Agar de dextrosa y masa de maz (CMD) y el medio mnimo SNA. Se us un rbol de decisin con las claves de identificacin morfolgica para determinar la especie o grupo al que cada aislado perteneca. La caracterizacin molecular fue realizada mediante un anlisis filogentico comparativo de los fragmentos Espaciador Interno Transcrito del rRNA ribosomal (ITS) y la secuencia parcial del 4to. Intrn del Factor de Elongacin de la traduccin 1 (TEF) obtenidas de cada uno de los aislados y las secuencias reportadas en GenBank para especies cuya identidad ya ha sido bien establecida. Las secuencias obtenidas por PCR fueron editadas y alineadas usando ClustalX 2.0 y se construyeron rboles filogenticos usando el software MEGA4.

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El resultado de este anlisis fue que 7 aislados se reconocieron como Trichoderma viridescens, 3 como Trichoderma koningiopsis, 1 como Trichoderma atroviride, 1 como Trichoderma petersenii, y 3 aislados se reconocieron como 2 especies no reportadas con anterioridad: VSL034, VSL045 y VSL049. Los resultados anteriores muestran que la incidencia de especies de la clade Trichoderma en la coleccin estudiada es elevada (65%) y, dada la similitud en las secuencias de la regin ITS de los hongos del gnero Trichoderma. y particularmente de este subgrupo, no es posible la adecuada separacin de especies por reconstruccin filogentica de solo este fragmento. Sin embargo, el uso de una combinacin del fragmento ITS y el cuarto intrn del TEF en la reconstruccin es suficiente para resolver esta problemtica.

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ABSTRACT

Torres Palacios, Cristobal M.C. en Ingeniera Bioqumica. Unidad de Investigacin y Desarrollo en Alimentos del Instituto Tecnolgico de Veracruz. December 2010. MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF STRAINS OF Trichoderma ISOLATED IN CENTRAL MEXICO. Advisors: Dr. Mario Ramrez Lepe, Dr. Vladimir Snchez Lpez and Dra. Mirna Surez Quiroz.

In this study, a collection of fungi obtained in the surroundings of the Volcano Nevado de Toluca, Mxico, and that were considered to belong to the Genus Trichoderma because of their basic morphological features, was identified up to specieslevel by means of morphological characterization and phylogenetic analysis.

The isolates were morphologically characterized by means of the examination of their cultures and reproductive structures as they were growing on Potato Dextrose Agar, CornMeal Dextrose Agar and SNA minimum media. A decision tree containing morphological identification keys was used to determine the species or clade each isolate belonged to. Phylogenetic analysis was made by comparing fragments of the Internal Trasncribed Spacer of rRNA (ITS) and partial sequence of 4th intrn of Translation Elongation Factor 1 (TEF) obtained from the isolates and those entered in GenBank whose species was previously determined. The sequences obtained by PCR were edited and aligned using Clustal X 2.0. The construction of phylogenetics trees were made using MEGA4

Resulting from this analysis the identification of 7 isoltates as Trichoderma viridescens, 3 as Trichoderma koningiopsis, 1 as Trichoderma atroviride, 1 as Trichoderma petersenii, and 3 more isolates were recognized as not previously reported species: VSL034, VSL045 and VSL049.

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This results indicated that the ocurrence of species of the Clade Trichoderma in the collection studied is high (65 %) and, since the similarity among the ITS sequences of the species in the Genus Trichoderma, was not possible to resolve by means of phylogenetic reconstruction of this only fragment. Nonetheless, the usage of TEF fragment in the reconstruction highly increased the resolution power of the reconstruction.

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CONTENIDORESUMEN ................................................................................................................................ vi

ABSTRACT ............................................................................................................................... vii CONTENIDO ................................................................................................................................ ix INDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. xii INDICE DE TABLAS ...................................................................................................................xv LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS .............................................................................xvi INTRODUCIN ..............................................................................................................................1 1. ANTECEDENTES.......................................................................................................................3 1.1. Hongos del Gnero Trichoderma ..............................................................................................3 1.2. Taxonoma. ...............................................................................................................................4 1.3. Aplicaciones industriales y biotecnolgicas. .............................................................................5 1.4. Identificacin de hongos. ..........................................................................................................6 1.4.1. Caracterizacin morfolgica. .................................................................................................6 1.4.1.1. Caractersticas macroscpicas .............................................................................................6 1.4.1.2. Caractersticas microscpicas. .............................................................................................6 1.4.2. Mtodos moleculares ..............................................................................................................8 1.4.2.1. DNA mitocondrial ...............................................................................................................9 1.4.2.2. Genes del RNA ribosomal (rDNA) ...................................................................................10 1.4.2.3. Genes de protenas ............................................................................................................12 1.4.2.3.1. Factor de Elongacin durante la Traduccin (TEF) ........................................................12 1.4.2.3.2. Otros genes usados en filogenia de Trichoderma ..........................................................12 1.4.2.4. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) ..............................13 1.4.2.5. DNA polimrfico amplificado aleatoriamente (RAPD). ...................................................14 1.4.2.6. TrichoKey .........................................................................................................................14 1.4.2.7. Reconstruccin filogentica. .............................................................................................15 1.4.2.7.1. Mtodo de agrupamiento por pares no ponderados con media aritmtica (UPGMA) 15

1.4.2.7.2. Mtodo de agrupamiento de vecinos (Neighborg-Joining Method) ................................16 1.4.2.7.3. Maxima Parsimonia. .......................................................................................................16

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1.4.2.7.4. Estimacin de mxima probabilidad (MLE) ..................................................................17 1.4.2.8. Reconocimiento de especies por concordancia genealgica (GCPSR ). ............................17 JUSTIFICACION ..........................................................................................................................18 2.OBJETIVOS ...............................................................................................................................19 2.1 Objetivo general. ......................................................................................................................19 2.2 Objetivos especficos................................................................................................................19 3. MATERIALES Y METODOS...................................................................................................20 3.1. Microorganismos empleados ..................................................................................................20 3.2. Secuencias de cepas de referencia ...........................................................................................20 3.3. Medios de cultivo. ...................................................................................................................22 3.3.1. Medios nutritivos PDA y PD ................................................................................................22 3.3.2. Medio Corn Meal-Dextrosa-Agar (CMD) ............................................................................22 3.3.3. Medio SNA ..........................................................................................................................22 3.4. Mantenimiento de las cepas ....................................................................................................22 3.5. Caracterizacin morfolgica. ..................................................................................................24 3.5.1 Macroscpica ........................................................................................................................24 3.5.2. Microscpica ........................................................................................................................24 3.6. Caracterizacin molecular .......................................................................................................24 3.6.1. Obtencin y almacenamiento del micelio .............................................................................24 3.6.3. Extraccin de ADN de micelio (Chang-Bhatnagar, 1995) ...................................................25 3.6.4. Clculo de la concentracin de ADN extrado......................................................................25 3.6.5. Amplificaciones por PCR .....................................................................................................26 3.6.6. Oligonucletidos empleados para las reacciones por PCR ...................................................27 3.6.7. Electroforesis en geles de agarosa ........................................................................................29 3.6.8. Purificacin de productos de PCR ........................................................................................29 3.6.9. Secuenciacin .......................................................................................................................29 3.6.10. Alineamientos ....................................................................................................................30 3.6.11. Identificacin de especies en el gnero Hypocrea / Trichoderma con el programa TrichOkey 2.0 .......................................................................................30 3.6.12. Edicin de la secuencias .....................................................................................................31 3.6.13. Anlisis filogentico ...........................................................................................................31

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4. RESULTADOS Y DISCUSIN ................................................................................................32 4.1 Caracterizacin morfolgica ....................................................................................................32 4.1.1. Cepa VSL001 .......................................................................................................................32 4.1.2. Cepa VSL006 .......................................................................................................................33 4.1.3. Cepa VSL011 .......................................................................................................................35 4.1.4. Cepa VSL016 .......................................................................................................................35 4.1.5. Cepa VSL018 .......................................................................................................................36 4.1.6. Cepa VSL028 .......................................................................................................................38 4.1.7. Cepa VSL031 .......................................................................................................................40 4.1.8. Cepa VSL034 .......................................................................................................................40 4.1.9. Cepa VSL045 .......................................................................................................................41 4.1.10. Cepa VSL049 .....................................................................................................................43 4.1.11. Cepa VSL056 .....................................................................................................................44 4.1.12. Cepa VSL059 .....................................................................................................................45 4.1.13. Cepa VSL066 .....................................................................................................................46 4.1.14. Cepa VSL069 .....................................................................................................................48 4.1.15. Cepa VSL078 .....................................................................................................................50 4.1.16. Cepa VSL079 .....................................................................................................................50 4.2. Amplificacin por PCR de fragmentos ITS y TEF ..................................................................53 4.3. Anlisis de similitud BLAST-NCBI........................................................................................53 4.4. Anlisis de secuencias de ITS con el Software TrichOkey ......................................................57 4.5. Anlisis filogentico de las secuencias ....................................................................................61 4.5.1. Anlisis filogentico de la cepa VSL069. .............................................................................65 4.5.2. Anlisis filogentico de las presuntas cepas de T. viridescens. .............................................68 4.5.3. Anlisis filogentico de las otras cepas pertenecientes al subgrupo Trichoderma ................71 4.5.4. Anlisis filogentico de la cepa VSL034 presunta especie nueva.........................................75 4.5.5. Anlisis filogentico de las cepas VSL: 045 y 049. ..............................................................82 5 CONCLUSIONES ......................................................................................................................88 6. RECOMENDACIONES ............................................................................................................89 7 BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................90 APNDICE A ................................................................................................................................97 APNDICE B ..............................................................................................................................108 APENDICE C ..............................................................................................................................118

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INDICE DE FIGURASFIGURA 1. Estructuras microscpicas de los hongos de las secciones: ..........................................8 FIGURA 2. Diagrama de la repeticin en tndem de los genes que codifican para los rRNAs donde se muestran las ITS. ........................................................................11 FIGURA 3. Diagrama del Factor de Elongacin durante la Transcripcin 1- ..............................12 FIGURA 4. Diagrama que muestra las anclas (GSH) y (SSH) desarrolladas por Druzhinina et al (2005). ..........................................................................................15 FIGURA 5. El anlisis simultneo de varios genes muestra topologas similares para especies relacionadas. (Taylor et al, 2000) .............................................................17 FIGURA 6. Esquema general de la metodologa aplicada. ............................................................21 FIGURA 7 . a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL001 ......................................................33 FIGURA 8 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL006 ........................................................34 FIGURA 9 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL011 ........................................................36 FIGURA 10 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL016 ......................................................37 FIGURA 11 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL018 ......................................................38 FIGURA 12 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL028 ......................................................39 FIGURA 13 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL031 ......................................................41 FIGURA 14 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL034 ......................................................42 FIGURA 15 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL045 ......................................................43 FIGURA 16 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL049 ......................................................44 FIGURA 16 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL056 ......................................................46 FIGURA 17 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL059 ......................................................47 FIGURA 18 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL066 ......................................................48 FIGURA 19 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL069 ......................................................49 FIGURA 20 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL078 ......................................................51 FIGURA 21 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL079 ......................................................52 FIGURA 22. Fragmentos de ITS amplificados. .............................................................................54 FIGURA 23. Fragmentos amplificados de ITS y TEF ...................................................................54

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FIGURA 23. Reporte del software TrichOkey donde se indica la ubicacin de las anclas de la secuencia de ITS de la cepa .................................................................60 FIGURA 24. Reporte del software TrichOkey donde se indica la ubicacin de las anclas de las secuencias de ITS de las cepas VSL045 .............................................60 FIGURA 25. Relacin evolutiva linealizada de 20 aislados + 4 referencias ..................................62 FIGURA 26. Relaciones evolutivas de 20 aislados + 4 referencias. ...............................................63 FIGURA 27. Representacin esquemtica de la distribucin de los aislados dentro del gnero Trichoderma. ...............................................................................................64 FIGURA 28. Relaciones filogenticas del aislado VSL069 pertenecientes al subgrupo Pachybasium en relacin a la secuencia del fragmento ITS. ...................................66 FIGURA 29. Relaciones filogenticas del aislado VSL069 pertenecientes al subgrupo Pachybasium en relacin a la secuencia del fragmento TEF. ..................................66 FIGURA 30. Relaciones filogenticas del aislado VSL069 pertenecientes al subgrupo Pachybasium en relacin a la secuencia combinada de los fragmentos ITS y TEF................................................................................................................67 FIGURA 31. Relaciones filogenticas de los aislados pertenecientes al subgrupo Trichoderma en relacin a la secuencia de los fragmentos ITS . .............................69 FIGURA 32. Relaciones filogenticas de los aislados pertenecientes al subgrupo Trichoderma en relacin a la secuencia de los fragmentos TEF. .............................70 FIGURA 33. Relaciones filogenticas de los aislados pertenecientes al subgrupo Trichoderma en relacin a la secuencia de los fragmentos ITS. ..............................72 FIGURA 34. Relaciones filogenticas de los aislados pertenecientes al subgrupo Trichoderma en relacin a la secuencia de los fragmentos TEF. .............................73 FIGURA 35. Relaciones filogenticas de los aislados pertenecientes al subgrupo Trichoderma en relacin a la combinacin de los fragmentos ITS y TEF. ..............74 FIGURA 36. Topologa de las relaciones filogenticas de los aislados pertenecientes subgrupo Trichoderma en relacin a la combinacin de los fragmentos ITS y TEF................................................................................................................74 FIGURA 37. Topologa de las relaciones filogenticas del aislado VSL034 con respecto al subgrupo Trichoderma usando solo el fragmento ITS. ............................................75 FIGURA 38. Detalle del subrbol de la seccin Trichoderma usando solo ITS. ............................76 FIGURA 39. Detalle del subrbol de la seccin Trichoderma usando solo TEF............................77 al

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FIGURA 40. Relaciones filogenticas del aislado VSL034 con respecto al subgrupo Trichoderma usando la combinacin de secuencias ITS+TEF. ...............................78 FIGURA 41. Comparacin por alineamiento de las secuencias de VSL 034, T. viride y T. viridescens. ..............................................................................................................80 FIGURA 42. Relaciones filogenticas todos los aislados del subgrupo Trichoderma usando la combinacin de secuencias ITS+TEF. .....................................................81 FIGURA 43. Detalle del subrbol de la seccin Longibrachiatum usando solo ITS. .....................82 FIGURA 44. Relaciones filogenticas de la seccin Longibrachiatum usando solo TEF. .............83 FIGURA 45. Topologa de las relaciones filogenticas entre VSL045 y los dems elementos del subgrupo Longibrachiatum.. .............................................................84 FIGURA 46. Relaciones filogenticas de la seccin Longibrachiatum usando la combinacin de secuencias ITS+TEF......................................................................85 FIGURA 47. Comparacin por alineamiento de las secuencias de VSL 045, VSL049 y dos aislados de la especie H. novaezelandiae. ......................................................86

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INDICE DE TABLAS

TABLA 1. Secuencias genticas que han sido usadas en filogenia molecular de Trichoderma/Hypocrea. ..........................................................................................12 TABLA 2. Secuencias de referencia para anlisis filogentico. .....................................................23 TABLA 3. Condiciones utilizadas para amplificacin de ITS por PCR. ........................................27 TABLA 4. Condiciones utilizadas para amplificacin de TEF por PCR ........................................28 TABLA 5. Oligonucletidos empleados para la obtencin de genes por PCR ...............................28 TABLA 6. Resultados de la identificacin usando criterios morfolgicos. ....................................53 TABLA 7. Resultados de la bsqueda de secuencias similares en BLAST para los fragmentos ITS de cada cepa. .................................................................................55 TABLA 8. Resultados de la bsqueda de secuencias similares en BLAST para los fragmentos TEF de cada cepa. .................................................................................56 TABLA 9. Longitud de los fragmentos ITS y las anotaciones del inicio y fin de las subregiones ITS1, 5.8 S rRNA e ITS2 ...........................................................................................57 TABLA 10. Resultados de la identificacin usando el software TrichOkey 2.0 ............................58 TABLA 11. Datos de las secuencias de las cepas de referencia usadas en la reconstruccin del rbol filogentico preliminar .....................................................61 TABLA 12. Distribucin de los aislados de Trichoderma por grupos y por especies ....................87

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LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS et al.....y colaboradores ITS..Internal Transcribed Spacer IGS..non-transcribed intergenic spacer PCRPolymerase Chain Reaction DNA...cido desoxirribonucleico RNA...cido ribonucleico rRNA..cido desoxirribonucleico ribosomal TEF.Factor de Elongacin durante la traduccin. Taq..Termus aquaticus kgkilogramos m...micro metros Lmicro litros mM..mili Molar mL...mili Litro cmcentimetro h...hora

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INTRODUCCION

Los hongos pertenecientes al gnero Trichoderma han sido estudiados ampliamente debido a su potencial como agentes de biocontrol, productores de enzimas de inters industrial e inductores de resistencia contra fitopatgenos en las plantas (Harman et al, 2004). Debido a su utilidad se han desarrollado tcnicas para su aislamiento e identificacin, siendo en esta ltima donde se ha encontrado la mayor dificultad debido a la diversidad del gnero. Se han reportados hasta la fecha 72 especies agrupadas en 4 secciones y adems existe una gran similitud entre especies del mismo gnero (Kullnig-Gradinger et al, 2002) por lo que la caracterizacin morfolgica no siempre permite la identificacin de la especie a la que pertenecen las cepas aisladas (Samuels, 2002; Druzhinina, 2005; Kubicek, 2008). Se han usado otras metodologas para mejorar la eficacia de la identificacin como son la caracterizacin de los lpidos y otros componentes de la pared celular, caracterizacin del sistema ubiquinona y produccin de metabolitos secundarios (Guarro et al, 1999). Los resultados de estas tcnicas no siempre son confiables adems la metodologa para su realizacin es complicada.

Las tcnicas de identificacin de hongos que mejores resultados han dado son aquellas que utilizan la secuenciacin y anlisis filogentico de marcadores moleculares tales como los genes para la calmodulina, tubulina, actina, (Chaverri et al, 2003), Factor de Elongacin durante la traduccin (TEF) (Samuels et al, 2006, Hanada et al, 2006) y los genes para el ARN ribosomal siendo la regin del Internal Transcribed Spacer (ITS) de los organismos la ms utilizada. (Hermosa et al, 2000; Samuels et al, 2002; Mukherjee et al, 2002) Hanada et al, 2006;

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Samuels et al, 2006) Esta ltima regin ha resultado ser de de utilidad y eficacia para la identificacin de hongos (Guarro et al, 1999).

Con la secuenciacin de ITS, diversos investigadores han identificado especies de Trichoderma utilizando para ello alineamientos con las secuencias previamente reportadas en bases de datos. Sin embargo, la comparacin de la similitud de las secuencias no es suficiente para identificar adecuadamente la filiacin gentica de los hongos del gnero Trichoderma sino debe realizarse reconstruccin filogentica a fin de ubicar adecuadamente a las especies que lo conforman.

El objetivo de este trabajo es la caracterizacin morfolgica y molecular de una coleccin de cepas de hongos del gnero Trichoderma aisladas en la regin central de Mxico. La caracterizacin molecular se realizar usando un enfoque de anlisis filogentico de los fragmentos ITS, TEF y una combinacin de ambos a fin de alcanzar la resolucin adecuada.

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1. ANTECEDENTES

1.1. Hongos del Gnero Trichoderma El gnero Trichoderma fue introducido como taxn hace unos 200 aos para agrupar cuatro especies fngicas, una de las cuales era Trichoderma viride, mientras que las otras ya no se consideran actualmente dentro de este gnero. Durante los siguientes 150 aos despus de su descubrimiento no fue sujeto de investigacin, sin embargo, durante la Segunda Guerra mundial, la armada norteamericana se sorprendi por la velocidad a la cual se deterioraban las lonas en sus tiendas en las zonas tropicales por lo que iniciaron una investigacin profunda a fin de determinar las causas de este deterioro. Como resultado de este estudio, se descubri la cepa Trichoderma viride QM 6a como uno de los hongos ms celulolticos de esa regin. Esta cepa sigui considerndose como T. viride durante 20 aos ms, hasta que la investigacin conducida por Elwyn T. Reese y Mary Mandels la ubicara como una especie separada a la que se le llam Trichoderma reesei en honor al investigador principal. (Kubicek y Harman, 1998). Actualmente, este hongo y algunos de sus mutantes son utilizados ampliamente en la investigacin por su sistema celuloltico.

El gnero Trichoderma es cosmopolita, encontrndose en suelos y materiales vegetales en descomposicin. Las especies del gnero son generalmente dominantes en la composicin de la microflora de una multitud de hbitats. (Kubicek y Harman, 1998). Esto es atribuible a la diversa capacidad metablica de las especies de Trichoderma y a su naturaleza agresivamente competitiva. Pese a ello, se le ha asociado raras veces a enfermedades significativas en las plantas (Howell et al, 2003).

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Muchas especies de Trichoderma no han sido a la fecha asociadas con un estado sexual, e incluso se le haba considerado como una especie mitosprica, sin embargo, estudios recientes han demostrado que Trichoderma es solo una etapa en el ciclo reproductivo de las especies de este gnero cuando presentan reproduccin asexual y clonal siendo organismos dentro del gnero Hypocrea asociados fuertemente con el gnero Trichoderma por lo que actualmente se considera que ambos son un mismo gnero en diferentes etapas de desarrollo o presentado diferentes formas o estructuras reproductivas (Samuels et al, 2006, Kubicek et al, 2008)

No obstante, la cantidad de informacin que existe actualmente acerca de este gnero, la taxonoma de este mismo es an incompleta (Danielson y Davey,1973; Davet, 1985; Claydon et al., 1987; Papavizas, 1985; Widden y Hsu,1987; Widden y Scattolin, 1988; Samuels,1996) .

1.2. Taxonoma. Aunque el gnero Trichoderma se conoce desde el siglo XIX y su asociacin con teleomorfos de Hypocrea se sospecha desde entonces, la taxonoma de este gnero es aun muy complicada. Bisby (1939) consider que las variantes conocidas podan ser todas adscritas a T. viride. Rifai (1969) intent resolver un conglomerado de especies pues consideraba que los 9 taxones que el distingua no podan estar asociados con un solo teleomorfo. Las conexiones con los teleomorfos fueron establecidas por medio de aislados ascospricos por Dingley (1957). Samuels et al (1994) iniciaron un estudio extenso a fin de establecer las relaciones existentes entre los organismos del gnero Trichoderma y aquellos en Hypocrea. Bisset (1984) realiz estudios separando 21 especies dentro de la seccin Pachybasium y 7 en la seccin Longibrachiatum.

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Adicionalmente, Trichoderma tiene relacin con teleomorfos de los gneros Podostroma (Doi, 1967) y Sarawakus (Rifai et al, 1985). Hermosa et al (1997) usaron anlisis filogentico de los fragmentos de ITS para determinar que existan cuatro haplotipos diferentes de T. harzianum en un conglomerado que se consideraba era una sola variedad. Samuels et al (1999) usaron el mismo enfoque para determinar que en la especie T. viride se encontraban agrupadas dos especies diferentes bien definidas. Samuels et al (2006) determinaron que en la especie hasta entonces considerada como T. koningii existen 7 especies nuevas entre ellas, T. petersenii, T. koningiopsis, T, dingleye y 4 ms.

Estos estudios muestran que la resolucin de conglomerados de especies dentro del gnero Trichoderma usando solo criterios morfolgicos es

extremadamente complicada. Otros criterios tiles en la identificacin de estos hongos es el estudio de la produccin de metabolitos secundarios (Okuda et al., 1982), microensayos enzimticos, perfiles isoenzimticos (Leuchtmann et al., 1996; Samuels et al., 1994) y datos moleculares como las secuencias de ITS usando tcnicas de fingerprinting. Esta ltima tcnica ha mostrado la resolucin ms fina en el reconocimiento de especies fngicas (Fujimori y Okuda, 1994; Kuhls et al., 1995, 1996, 1997; Meyer, 1991; Meyer et al., 1992; Muthumeenakshi et al., 1994; Zimand et al., 1994).

1.3. Aplicaciones industriales y biotecnolgicas.

Los hongos del gnero Trichoderma producen una amplia variedad de sustancias antibiticas (Sivasithamparam y Ghisalberti, 1998), parasitan otros hongos, compiten por los exudados de la semilla que podran estimular la germinacin de propgulos de hongos dainos para las plantas (Howell, 2002), compiten por los nutrientes y el espacio con los organismos del suelo y degradan

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o inhiben la produccin de pectinasas que son esenciales para que patgenos de plantas penetren las paredes celulares, como en el caso de Botrytis cinerea. (Elad, 1996)

Actualmente se han realizado investigaciones sobre el aislamiento y clonacin de genes que codifican para protenas que tienen actividad microbiana, enzimas degradadores de la pared celular de hongos patgenos y que se pueden usar en la generacin de plantas transgnicas resistentes a enfermedades, y el descubrimiento de enzimas que son utiles en la degradacin de la quitina. Tambin se estn investigando los mecanismos a travs de los cuales Trichoderma ejerce efectos benficos en las plantas tales como (1) induccin de la resistencia a patgenos, (2) asociaciones simbiticas benficas y (3) promocin del crecimiento radicular y vegetativo (Harman et al, 2004).

1.4. Identificacin de hongos. 1.4.1. Caracterizacin morfolgica. Las caractersticas morfolgicas generales del gnero Trichoderma son consideradas como aquellas de T. viride que se considera la especie tpica. Una lista de claves morfolgicas para la identificacin son presentadas en el libro Trichoderma and Gliocadium. (Kubicek y Harman, 1998)

1.4.1.1. Caractersticas macroscpicas Las colonias de T. viride crecen rpidamente con micelio inicialmente sumergido con micelio areo variablemente floculento, lanoso o aracnoideo dependiendo de la cepa y del medio de cultivo. El reverso de la placa se aprecia incoloro, amarillento, rojizo o verdiamarillento. El olor a coco o alcanfor es caracterstico del gnero. La conidiacin es difusa y con formacin de pustulas de tonalidades verdosas, blanquecinas, grisceas o cafs, aunque estas ltimas en casos raros.

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1.4.1.2. Caractersticas microscpicas. Los conidiforos en la mayora de las especies tienen un eje principal ancho que est ramificado a intervalos regulares, usualmente con ramas sucesivas apical y distalmente ms angostas conforme se acerca uno al extremo de la colonia. Las bifurcaciones del conidiforo pueden resultar en una estructura piramidal altamente ramificada. En otras especies fuera de la seccin Trichoderma, la bifurcacin es menos regular con ramas solitarias o en pares y no se bifurcan ms. En la seccin Pachybasium, el eje principal del conidiforo y las ramas primarias se terminan a menudo en elongaciones estriles simples o ramificadas, rectas, flexibles, onduladas o en forma de resorte y pueden presentar anastomosis.

Las filides y ramas frtiles surgen a menudo de otras hifas areas no diferenciadas en reas de conidiacin profusa. Las filides a menudo se disponen en verticilos divergentes en las zonas terminales del conidiforo. Los conidios son unicelulares, tpicamente verdes o incoloros, grisceos o cafs en raros casos. Su pared puede ser lisa o ligeramente rugosa, sinuosa o con pequeas protuberancias. La forma puede ser subglobosa, obovoide, oblongas, elipsoides o corto-cilndricas. Las clamidosporas son estructuras que se presentan frecuentemente, sobre todo en el micelio sumergido, intercalares o terminales en las ramas laterales cortas de las hifas vegetativas. Pueden ser globosas a elipsoides, incoloras o ligeramente verdosas o amarillentas, lisas y, algunas veces, de pared gruesa (hasta 4 m). Las hifas vegetativas suelen ser hialinas, de pared lisa de (1)210 m de ancho, de color amarillo plido con ensanchamiento irregulares de hasta 16m.

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a

b

FIGURA 1. Estructuras microscpicas de los hongos de las secciones: a) Trichoderma. b). Pachybasium. (Kubicek y Harman, 1998).

1.4.2. Mtodos moleculares

El estudio de la frecuencia de monmeros en determinadas molculas portadoras de informacin ha demostrado que la distancia evolutiva entre dos especies puede medirse por las diferencias en la secuencia de aminocidos o nucletidos entre molculas homlogas de las dos especies. A estas molculas se les llama cronmetros evolutivos. En especies que se separaron de un antepasado comn el nmero de diferencias en la molcula bajo estudio es proporcional al nmero de cambios mutacionales estables que se han quedado fijos en el DNA que codifica para dicha molcula.

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A fin de elegir adecuadamente un cronmetro evolutivo es esencial considerar que a) debe estar distribuido universalmente, b) debe realizar la

misma funcin en ambos organismos estudiados, c) debe poder alinearse adecuadamente y sus regiones homlogas y heterogneas pueden identificarse plenamente y, por ltimo, d) la secuencia de la molcula elegida deber cambiar con una frecuencia que guarde relacin con la distancia filogentica que se mide (Madigan et al, 1999).

1.4.2.1. DNA mitocondrial Las molculas de DNA mitocondrial (mtDNA) son genomas relativamente pequeos que coevolucionan a su propia tasa evolutiva en relacin con el genoma nuclear de los organismos en los cuales ellos estn alojados.

Particularmente en animales y hongos dichos genomas evolucionan ms rpidamente que su contraparte de DNA nuclear (Uribe et al. 2007). El mtDNA es ampliamente empleado para la determinacin de relaciones taxonmicas y filogenticas entre los grupos de organismos eucariticos que poseen dicho organelo. Las razones para su popularidad reside en caractersticas intrnsecas de esta molcula tales como su reducido tamao, la alta tasa evolutiva, la falta de bases metiladas, el alto contenido de residuos adeninatimina (AT) y el hecho de ser una molcula haploide donde la mayora de los alelos poseen la misma funcin e inclusive poseen regiones universalmente conservadas. Dentro del genoma mitocondrial las secuencias de RNA ribosomal (rRNA) han sido empleadas como herramienta molecular para identificar relaciones filogenticos a diferentes niveles taxonmicos. A pesar de las diferencias en tamaos, todos los genomas mitocondriales pertenecientes a hongos examinados hasta la fecha poseen un nmero similar de genes, incluyendo una serie de genes de rRNA, 2326 RNA de transferencia (tRNA) y varios genes codificantes de protenas. La diferencia en tamao en relacin con los genomas ms grandes est determinada principalmente por intrones y regiones ricas en A-T (Uribe et al. 2007). El genoma mitocondrial (mtDNA) tiene un tamao de 15 a 17 kb y su

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longitud vara considerablemente entre especies: 20 micrmetros en Neurospora; 25 micrmetros en levaduras; 30 micrmetros en plantas superiores; 5 micrmetros en algunos animales metazoarios (multicelulares). Se considera que la mayora del mtDNA de hongos y plantas no codifica, ya que el mtRNA contiene intrones (Rentara 2007).

1.4.2.2. Genes del RNA ribosomal (rDNA) La revolucin molecular en cuanto a taxonoma de hongos comenz a inicios de 1990, con la amplificacin del rDNA, con la ayuda de la PCR (Hibbet et al. 2007). Efectivamente, las regiones de DNA mitocondrial y nuclear que tienen un mayor inters tanto en estudios de filogenia como en taxonoma de hongos, son las que codifican para el RNA ribosmico (rDNA) (Iturralde, 2005). El rDNA puede encontrarse en mitocondrias, cloroplasto y ncleo, y contiene la informacin para el RNA que conforma los ribosomas, por lo que es informacin que se transcribe pero no se traduce (Rentara, 2007). La principal razn para el estudio de rDNA es que es un gen multicopia que contiene regiones que no codifican para protenas, y que estas copias estn repetidas en tndem, facilitando as su amplificacin (Calle, 2005). En el DNA ribosmico existen fragmentos con distinto grado de conservacin de una longitud cercana a 6Kb, lo que permite realizar estudios a diferentes niveles. Las regiones que se encuentran altamente conservadas nos permiten realizar estudios evolutivos a nivel de gneros y familias y suelen usarse para el diseo de cebadores universales. La heterogeneidad de estas secuencias nucleotdicas ha sido utilizada para clasificar filogenticamente a los microorganismos (Baschien, 2003; Franco, 2005; Rivera, 2006; Sol, 2002). Entre las secuencias altamente conservadas de los genes de esta regin se encuentran regiones variables, denominadas espaciadores ITS (Internal Transcribed Spacers), cuya funcin es desconocida (Peintnen et al, 2004). La tasa de variabilidad en estas regiones espaciadoras es ms elevada que en los genes, pero sus secuencias se pueden alinear con confianza entre taxones estrechamente relacionados. La regin del rDNA incluye el gen 18S que

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tambin esta regin tambin se denomina SSU, el espaciador intergnico ITS1, el gen 5.8S, el espaciador ITS2 y el gen 28S (tambin denominado LSU). Las regiones 18S, 5.8S, 28S estn relativamente conservadas entre los hongos, facilitando una base molecular para buscar relaciones filogenticas a diferentes niveles, el gen 5.8S esta conservado evolutivamente como los genes 18S y 28S, pero su tamao pequeo limita su utilidad en comparaciones filogenticas (Luna et al. 2001; Said et al. 2007). El gen ms pequeo, 5S rRNA puede o no estar incluido en la unidad de rDNA dependiendo del grupo taxonmico que se est analizando. Cuando se transcribe el rDNA que codifica los genes para cada uno de los rRNAs que forman los ribosomas eucariontes, las regiones espaciadoras (ITS), no codificantes, quedan representadas en este transcrito primario, por lo que estas secuencias son removidas por un mecanismo especfico de procesamiento del RNA ribosmico y slo despus de estas modificaciones los rRNAs pasan a formar parte del ribosoma (Said et al. 2007). Comparando con los genes los espaciadores ITS1 e ITS2 son mucho ms variables porque sus transcriptos son cortados desde el rRNA y descargados en lugar de hacerse parte del ribosoma (Herrera 2007; Tedersoo et al. 2006; Guevara 2004).

FIGURA 2. Diagrama de la repeticin en tndem de los genes que codifican para los rRNAs donde se muestran las ITS.

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1.4.2.3. Genes de protenas

1.4.2.3.1. Factor de Elongacin durante la Traduccin (TEF) Este gen codificante para un factor de elongacin durante la transcripcin de RNA en protena es un fragmento de casi 2 kb, del cual se pueden usar sus exones o intrones para anlisis filogentico. Estos exhiben variabilidades diversas y pueden ser usadas con diferentes fines dependiendo de la resolucin necesaria. El fragmento ms utilizado y que se conoce como tef1, es aquel que incluye al 4to. Intrn, el 5to. Exn, el 5to. Intrn y parte del 6to exn. Este fragmento tiene una longitud de entre 600 y 650 pb. (Druzhinina, 2005). La informacin que puede ser obtenida de este fragmento se muestra en la tabla inferior.

FIGURA 3. Diagrama del Factor de Elongacin durante la Transcripcin 1-. Se muestran los oligonucletidos usados para la amplificacin de los diferentes fragmentos a estudiar.

1.4.2.3.2. Otros genes usados en filogenia de Trichoderma

Tambin, las porciones codificantes de la endoquitinasa 42 (ech42)y la subunidad 2 de la RNApolimerasa2 (rpb2) han mostrado significativa variabilidad intra- e interespecfica, mientras que otros genes como las regiones D1 y D2 del rDNA 28S, o la subunidad pequea del DNA ribosomal mitocondrial han exhibido

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baja resolucin (ssu-mDNA). Se han usado fragmentos de los genes codificantes para actina y calmodulina pero tambin han exhibido una baja resolucin cuando se les compara con el fragmento tef1 (Chaverri et al., 2003).

TABLA 1. Secuencias genticas que han sido usadas en filogenia molecular de Trichoderma/Hypocrea.LocusEspaciadores internos Transcritos 1 y 2 Genes del Rrna Subunidad pequea del DNA ribosomal mitocondrial Gen rDNA 28S Genes que codifican para protenas Calmodulina Actina cal1 act1 1er. Intrn 2do. Intrn RNA polimerasa B subunidad 2 Endoquitinasa 42 Translation Elongation factor 1 rpb2 ech42 tef1 Exn grande 5to. Intrn 4to. Intrn Exn grande 0.45 0.35 0.8 0.4 0.6 0.1 0.35 0.7 15 5 6 40 33 30 29 29 28S rDNA 0.5 8 Ssu-mDNA 0.4 5

AbreviaturaITS1 e ITS2

Fragmento

Longitud, kb0.4

Variabilidad, %25

Druzhinina et al, 2005

1.4.2.4. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP)

Se pueden analizar los polimorfismos presentes a nivel de DNA por diversos medios. El mtodo ms comn es el de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin. En este el DNA se corta usando enzimas de restriccin que reconocen secuencias especificas de DNA. Posteriormente, los fragmentos son sometidos a electroforesis o hibridacin con sondas de DNA generando patrones ms o menos complejos de polimorfismo que son luego usados para los estudios taxonmicos. (Hermosa et al, 2000).

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Los fragmentos que se han usado

para este mtodo son DNA

mitocondrial y rDNA para estudios en hongos filamentosos. (Bruns et al., 1991). Meyer (1991) us DNA mitochondrial y plsmidos para investigar las relaciones dentro de un agregado de 12 cepas de T. viride

1.4.2.5. DNA polimrfico amplificado aleatoriamente (RAPD). En este mtodo se usa la amplificacin por PCR de fragmentos desconocidos de DNA usando oligonucletidos ricos en GC (Williams et al., 1990). El uso de esta tcnica en Trichoderma ha sido reportada por Schlick et al. (1994) y Kuhls et al. (1995) para identificar y detectar impurezas en los cultivos. Kuhls et al. (1996) combin PCR fingerprinting con secuenciacin de rDNA para probar la relacin entre las especies de Trichoderma estrictamente asexuales y el ascomiceto Hypocrea jecorina.

1.4.2.6. TrichoKey

Druzhinina et al (2005) demostraron que pese a la alta similitud existente entre las secuencias de la regin ITS en las especies dentro del gnero Trichoderma, hay secuencias bien definidas cuya presencia o ausencia se correlacionan muy bien con cada una de las especies del gnero para propsitos de identificacin. Usando esta informacin generaron un software para la identificacin de hongos: TrichOkey, que se encuentra disponible en la red.

.

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1.4.2.7. Reconstruccin filogentica. 1.4.2.7.1. Mtodo de agrupamiento por pares no ponderados con media aritmtica (UPGMA) UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) o Mtodo de agrupamiento pareado sin ponderacin usando Medias aritmticas es un protocolo de agrupamiento simple aglomerativo. Asume una velocidad de evolucin constante y no se considera un mtodo de inferencia filogentica si esta asuncin no se cumple. Originalmente se usaba para el anlisis de datos electroforticos pero actualmente se usa para la generacin de rboles gua para que sean usados para algoritmos de reconstruccin ms sofisticados.

FIGURA 4. Diagrama que muestra las anclas (GSH) y (SSH) desarrolladas por Druzhinina et al (2005). Los colores indican las bases a las que corresponde la secuencia.

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1.4.2.7.2. Mtodo de agrupamiento de vecinos (Neighborg-Joining Method) Este mtodo est basado en el criterio de mnima evolucin para un rboles filogenticos, es decir, la topologa que d la menor longitud de las ramas del rbol involucrando el menor nmero de mutaciones posibles que expliquen la filogenia final. Es un mtodo que consume poco espacio informtico por lo que es muy eficiente y puede ser usado para resolver grandes grupos de datos superando en este sentido a mtodos ms exactos para la reconstruccin como Mxima parsimonia o inferencia bayesiana. A diferencia del mtodo UPGMA, no asume una velocidad de evolucin constante y produce arboles sin raz. La generacin de la raz se hace mediante el uso de un sujeto externo al grupo de anlisis. Debido a que es congruente con muchos modelos de evolucin puede llegar a generar un rbol con la topologa verdadera cuando se le alimentan secuencias de una longitud adecuada.

1.4.2.7.3. Mxima Parsimonia. La parsimonia es parte de los mtodos de estimacin de rboles basado en caractersticas. Usa una matriz de caractersticas filogenticas discretas para inferior uno o ms rboles ptimos para un grupo de taxones, generalmente especies. El criterio de optimizacin en el caso de Mxima parsimonia es el uso del menor nmero de mutaciones para que se explique la topologa resultante. Este mtodo es de los de mayor potencia de resolucin, sin embargo, requiere una gran potencia informtica por lo que generalmente se desestima a favor del mtodo NJ.

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1.4.2.7.4. Estimacin de mxima probabilidad (MLE) Maximum likelihood estimation (MLE) o estimacin de mxima

probabilidad es un mtodo que necesita el conocimiento de un modelo estadstico de probabilidad que prediga el comportamiento de una poblacin. As, el rbol se genera en base al rbol que tenga una mayor probabilidad de explicar los datos en base al modelo previamente propuesto u obtenido. Esta es la razn por lo cual este mtodo es ms complicado que los anteriores, debido a que no siempre se conocen estos modelos. Sin embargo, si el modelo se conoce es un mtodo sumamente efectivo y confiable. 1.4.2.8. Reconocimiento de especies filogenticas por concordancia genealgica (GCPSR ). El Reconocimiento de especies filogenticas por concordancia

genealgica (GCPSR, por sus siglas en ingles) fue propuesto por Taylor et al (2000) a fin de resolver especies en base a su genealoga. Propone el uso de diferentes genes y la generacin de filogenias para cada uno de ellos. La comparacin de estos arboles mostrara que la topologa en la que se separan las especies debe ser la misma o al menos muy similar sin importar el gen que se est usando para la reconstruccin.

FIGURA 5. El anlisis simultneo de varios genes muestra topologas similares para especies relacionadas. (Taylor et al, 2000)

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JUSTIFICACION

Los hongos del gnero Trichoderma han sido estudiados fundamentalmente por sus caractersticas antagnicas hacia hongos fitopatgenos, su potencial para favorecer el crecimiento de plantas, su alta produccin de enzimas de inters industrial y ms recientemente como precursores de aromas. Su identificacin taxonmica es fundamental para relacionarlos con sus caractersticas fisiolgicas El uso de herramientas moleculares para su identificacin ha sido una alternativa viable a la identificacin morfolgica ya que a travs de esta en algunos casos no es posible identificar la especie por la alta homologa morfolgica. Por otro lado el estudio de cepas nativas de Mxico ha sido limitado. Debido a la variedad de ecosistemas de la republica mexicana las cepas de Trichoderma podran tener un potencial importante para ser utilizadas en el control biolgico, as como un potencial uso de sus enzimas en la industria. En estudios previos se aislaron 67 cepas de Trichoderma spp que provienen de 5 estados de la Repblica Mexicana, y se considera como primer paso importante el estudio taxonmico morfolgico y molecular de veinte de ellas.

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL. Caracterizar morfolgica y molecularmente cepas de Trichoderma spp aisladas en sitios del centro de Mxico.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Caracterizar morfolgicamente las cepas de Trichoderma utilizando estereoscopia y microscopa de campo claro.

Obtener el material gentico de los aislados y amplificar la regin ITS y TEF de las cepas y obtener su secuencia.

Realizar anlisis filogentico de las secuencias obtenidas previamente a fin de establecer su identidad.

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3. MATERIALES Y METODOS La metodologa aplicada en este trabajo se divide en dos partes principales: una caracterizacin morfolgica parcial que tiene la finalidad de determinar la clade a la que pertenece el aislado y una caracterizacin molecular y anlisis filogentico para determinar certeramente la identidad de cada aislado. A continuacin se describen los protocolos utilizados as como detalles de la metodologa en los que se debe tener cuidado a fin de obtener resultados aceptables.

3.1. Microorganismos empleados Los microorganismos utilizados para desarrollar esta investigacin fueron aislados de muestra de suelos obtenidas en las inmediaciones del volcn Nevado de Toluca, Mxico, Mexico, por el Dr. Vladimir Snchez Lpez. Las cepas proporcionadas para este estudio son: VSL001, 006, 011, 016, 018, 024, 028, 031, 034, 045, 049, 054, 056, 059, 066, 069, 078, 079, 085 y 090. Por algunas de sus caractersticas morfolgicas se han considerado como Trichoderma.

3.2. Secuencias de cepas de referencia Se obtuvieron secuencias de cepas de Trichoderma cuya identidad a sido probada adecuadamente y han sido reportadas por Samuels (2006). Estas secuencias sern usadas para el anlisis filogentico. La tabla 2 resume las secuencias descargadas.

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GURA 6. Esuema general de la metodologa aplicada.

Propagacin de Cepas en Medio PDA

Caracterizacin morfolgica de cada especie reportada.

Inoculacin en medio PD lquido por disco micelial

Siembra en medios PDA, CMD y SNA

Obtencin del micelio seco Colectar pstulas en SNA Congelacin y Molido del micelio DNA

Fotografiar anverso y reverso de la placa a los 4, 7 y 10

Preparacin en Fresco sobre KOH 3%

Extraccin y Purificacin de DNA

Amplificacin y secuenciacin de Fragmentos ITS y TEF Tomar medidas microscpicas Edicin de las secuencias usando MEGA4

Anlisis de las secuencias en software TrichoKey 2.0 y BLAST-NCBI

Construccin de rboles filogenticos usando el software 4.0

Identificacin de especies

FIGURA 6. Esquema general de la metodologa aplicada.

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3.3. Medios de cultivo. El medio PDA se usa para la propagacin de las cepas y la obtencin de micelio. Los medios PDA, CMD y SNA se usaron para la caracterizacin morfolgica y la generacin de pstulas (SNA)

3.3.1. Medios nutritivos PDA y PD El medio de cultivo agar papa y dextrosa (PDA) se prepar con 300 g de papa en 850 mL de agua destilada, se lleva a cocimiento durante 30 minutos y se recupera el sobrenadante, se le adicionan 20 g de glucosa, 15 g de agar y, finalmente, se afora a 1 L y se esteriliza. Para la preparacin de medio PD se omite la adicin de agar.

3.3.2. Medio Corn Meal-Dextrose-Agar (CMD) Se aaden 60 g de maz molido a 1 L de agua destilada y se lleva a ebullicin durante 1 h. Se recupera el sobrenadante, se le agregan 20 g de glucosa, 15 g de agar, se afora a 1 litro y se esteriliza.

3.3.3. Medio SNA Se prepara aadiendo 1g de KH2PO4, 1 g de KNO3, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,5 g de KCl, 0,2 g de glucosa, 0,2 g de sacarosa y se afora a 1 L. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min.

3.4. Mantenimiento de las cepas Para el mantenimiento y propagacin de las cepas de hongos se utilizan placas petri con agar PDA. Se corta un cuadrado de 0,5 cm por lado de la parte ms exterior de una colonia creciente de la cepa a propagar y se coloca sobre la

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superficie del agar de una caja nueva con el micelio hacia abajo y se incuba a 25 C durante 7 a 15 das. Para mantener el cultivo viable las resiembras se realizan cada 30 das y se realiza el procedimiento antes mencionado. (Jaklitsch et al, 2005).

TABLA 2. Secuencias de referencia para anlisis filogentico. (Samuels, 2006).Especie T. aggressivum f. aggressivum T. asperellum T. atroviride/H. atroviridis T. citrinoviride/H. schweinitzii T. crassum/H. crassa T. hamatum T. harzianum/H. lixii T. konilangbra T. koningii/H. koningii T. Longibrachiatum T. longipile H. novaezelandiae H. orientalis T. ovalisporum T. polysporum/H. pachybasioides including T. croceum T. pseudokoningii/H. pseudokoningii T. pubescens T. reesei/H. jecorina T. strigosum T. tawa/H. tawa T. virens/H. virens T. viride/H. rufa Entry 1 AF348094.1 AY376058.1 AF348112.1 AY937422.1 AY750879.1 AY750893.1 AY737729.1 AY937425.1 AY376045.1 AY937412.1 AY937430.1 AY937448.1 AY937421.1 AY387660.1 AY750886.1 AY937429.1 AY750887.1 DQ025754.1 AY376057.1 AY737739.1 AY750894.1 AY376052.1 Entry 2 AF348109.1 AF348113.1 AY750892.1 Entry 1 AF345950.1 AJ230669.1 AJ230666.1 Z31017.1 DQ083026.1 DQ083017.1 AY737761.1 DQ083021.1 Z79628.1 Z31019.1 AF011975.1 DQ083019.1 X93964.1 AY380896.1 Z48815.1 DQ083025.1 DQ083016.1 Z31016.1 DQ083027.1 AY737756.1 DQ083023.1 AJ230678.1 Entry 2 AF345949.1 AJ230680.1 AF055212.1 X93939.1 AF011946.1

AF400261.1 AY380902.1

AY376037.1

X93969.1 X93966.1 AY376671.1 AY240839.1 Z82908.1

Z31018.1 Z95926.1 AF099006.1 X93986.1

AY750891.1 AY376053.1

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3.5. Caracterizacin morfolgica. 3.5.1 Macroscpica. Cada cepa fue sembrada por transferencia de un cuadrado de agar de 0,5 cm por lado a cajas con medio nuevo de PDA, CMD y SNA. Se incubaron a 25 C durante 10 das. Se tomaron fotografas del anverso y reverso de cada placa petri con una cmara Canon (faltan detalles de la cmara) a los 4, 7 y 10 das. Se determin la presencia de olor a coco sobre CMD para cada cepa. 3.5.2. Microscpica. Se colectaron pstulas sobre SNA y se observaron al estereoscpico bajo 10, 20, 30 y 40 X. Se anotaron sus caractersticas y se fotografiaron. Ests pstulas fueron colocadas sobre un portaobjetos en una gota de KOH al 3.0 %, se cubri la preparacin con un cubreobjetos y se observ en microscopio con objetivos 40X y 100X. Se tomaron medidas de 30 de cada una de las siguiente estructuras: filides: ancho, largo; clula basal: ancho, largo, y conidiforo: ancho, largo y ornamentacin.

3.6. Caracterizacin molecular. 3.6.1. Obtencin y almacenamiento del micelio. En 80 mL de medio PD (Apndice C) a pH de 5.5 estril, se inocula con una asada del hongo proveniente de una caja con PDA, se incuba a 30 C, durante cinco das en incubadora agitada a 150 RPM. Al finalizar el periodo de incubacin, se colecta el micelio por filtracin al vaco usando papel filtro Whatman no. 1, se enjuaga el micelio dos veces con agua destilada estril. Se seca el micelio con papel absorbente y se transfiere a un tubo falcn de 50 mL

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para su congelacin a 20 C. Una vez congelado, se coloca en un mortero y se muele hasta obtener un polvo fino. El polvo se transfiere al tubo falcon y se mantiene a 4 C hasta su uso.

3.6.3. Extraccin de ADN de micelio (Chang-Bhatnagar, 1995). En un tubo eppendorf nuevo se agrega aproximadamente una cantidad de 100200 mg de micelio molido fresco y se le agregan 500 L de buffer de extraccin (400 mM NaCl, 40 mM EDTA, 100 mM tris-HCl, 2% SDS [pH 8.0]), se agita en vortex y se incuba la preparacin durante 20 minutos a 68 C. Posteriormente, se centrifuga durante 3 min a 4000 RPM. El sobrenadante es recuperado y se le agregan 100 L de una mezcla de fenol:clofoformo:alcohol isoamlico (25:24:1) por cada 100 L de sobrenadante. La mezcla se agita en vrtex y se centrifuga durante 10 minutos 0 14000 RPM. El sobrenadante se recupera y se somete, de ser necesario, al mismo proceso hasta que no se aprecie la pelcula interfacial blanquecina de protenas desnaturalizadas. Una vez que la interfase no se aprecie, se agregan 100 L de Cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) por cada 100 L de sobrenadante, se agita en vrtex y se centrifuga a 14000RPM durante 10 minutos. Se recupera el sobrenadante y se le agregan 0,1 volmenes de Acetato de sodio 3M y 2.5 volmenes de etanol absoluto a 20 C. Se deja reposar la mezcla a 20 C durante 4 h. Posteriormente, se centrifuga durante 10 minutos a 6500 RPM manteniendo la temperatura de la centrifuga a 9 C. Se retira el sobrenadante, el tubo se deja secar a temperatura ambiente y se resuspende el pellet (que no debe verse) en 0,1 volmenes de TE o agua libre de nucleasas respecto del volumen inicial de extracto celular crudo.

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3.6.4. Clculo de la concentracin de ADN extrado. El clculo se realiza midiendo la absorbencia de la solucin de ADN a 260 nm en un espectrofotmetro BioRad Smartspect 3000. La concentracin se calcula sabiendo que una unidad de densidad ptica corresponde a 50 g de ADN/mL. El cociente entre las densidades pticas medidas a 260 y 280 nm indica la pureza de la muestra. Para una preparacin de ADN este valor debe ser de aproximadamente de 1.7 a 1.9, un valor menor indica posible contaminacin con protenas.

3.6.5. Amplificaciones por PCR. Todas las reacciones se realizan en un volumen final de 50 l, en un termociclador (Bio Rad Modelo Gene Cycler TM serie No. 11453). La enzima empleada es la GoTaq DNA polimerasa (Promega) 5 Unidades por l. Los dNTP`s son suministrados por Promega en una solucin cuya concentracin es de 10mM. Los oligonucletidos fueron sintetizados por el IBT (Instituto de Biotecnologa de la UNAM) y suministrados como lifilizados. Se prepar una solucin con una concentracin de 50M. El agua y otros materiales como tubos y puntas de pipetas son esterilizados en autoclave. Las reacciones de amplificacin se realizan en 3 ciclos, un primer ciclo de desnaturalizacin a 95 C durante 15 minutos, el segundo ciclo consta de un paso de desnaturalizacin a 95C durante 60 segundos, seguido del apareamiento de los nucletidos realizado a la Tm de los oligonucletidos necesarios para la reaccin durante 60 segundos y por ltimo una fase de extensin desarrollada a 72 C durante un minuto, posteriormente el tercer ciclo se lleva acabo a una temperatura de 72 C durante 5 minutos que permite finalizar la extensin en aquellos productos de PCR donde la polimerizacin no hubiera finalizado. Este procedimiento, se realiza para todas las reacciones de PCR de las tres cepas de Trichoderma.

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TABLA 3. Condiciones utilizadas para amplificacin de ITS por PCR. (White et al, 1990)

ITS Desnaturalizacin inicial Amplificacin Desnaturalizacin Alineamiento de los primers Extensin Extensin final

Temperatura, C 95 94 55 72 72

Tiempo, min 5,0 1,5 2,0 3,0 5,0

Ciclos 1

35

1

3.6.6. Oligonucletidos empleados para las reacciones por PCR. Los oligonucletidos empleados en las reacciones de amplificacin y

secuenciacin de los genes de las regiones espaciadoras ITS1-5.8S-ITS2 y TEF se muestran en la tabla 5.

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TABLA 4. Condiciones utilizadas para amplificacin de TEF por PCR. (Samuels et al, 2006)

TEF Desnaturalizacin inicial Amplificacin Desnaturalizacin Alineamiento de los primers Extensin Extensin final

Temperatura, C 95 94 59 72 72

Tiempo, min 5,0 1,5 2,0 3,0 5,0

Ciclos 1

35

1

TABLA 5. Oligonucletidos empleados para la obtencin de genes por PCR. FRAGMENTO ITS DIRECTO ITS1 tccgtaggtgaacctgcgg TEF EFI-728f catcgagaagttcgagaagg INVERSO ITS4 tcctccgcttattgatatgc TEF1r gccatccttgggagataccagc Samuels et al, 2006 Referencia White et al, 1990

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3.6.7. Electroforesis en geles de agarosa. Los productos de PCR son separados mediante electroforesis en geles de agarosa de concentracin adecuada al tamao esperado (0.1-0.5 %). El tampn de electroforesis empleado es el TBE 10x (Tris: cido brico, EDTA 0.5M pH 8.0) y el tampn de carga 10x contiene 0.4% de azul de bromofenol, 0.4% de Xylene cyanol, 1mM EDTA y glicerol 50% (p/v). La electroforesis se realiza a 80V proporcionados por una fuente de electroforesis Modelo 200/2.0 de BioRad, durante 45 minutos. El ADN se visualiza mediante adicion de bromuro de etidio al gel, seguido de la iluminacin del gel con luz ultravioleta en un transluminador Kodak digital science Modelo TS-20E. Las fotografas de los geles se obtienen con la cmara Kodak digital science EDAS 120 (Sambrock et al. 1989).

3.6.8. Purificacin de productos de PCR.

El grado de limpieza de los productos de PCR es importante para obtener una buena secuencia. El mtodo de limpieza empleado, es el Geneclean (QBiogene, USA). Este tratamiento permite la purificacin de fragmentos en disolucin y en gel de agarosa. El procedimiento de limpieza se realiza segn las instrucciones del proveedor. Este mtodo se basa en la unin especfica del ADN de tamao superior a 200 pb a unas esferas de slice "glassmilk" que precipitan, permitiendo eliminar en el sobrenadante cualquier impureza presente, as como el tampn de la reaccin de PCR, oligonucletidos, Taq polimerasa y dNTPs.

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3.6.9. Secuenciacin. Todos los fragmentos obtenidos por PCR fueron enviados para su secuenciacin a la Unidad de Sntesis de oligonucletidos del Instituto de Biotecnologa (IBT) de la UNAM, con las siguientes condiciones: 1g de ADN purificado y 1g de oligonucletido directo en un tubo eppendorf de 250 l, liofilizado. Las secuencias obtenidas son visualizadas en el programa CHROMAS.

3.6.10. Alineamientos Las secuencias fueron exportadas desde el formato que reconoce Chromas hacia archivos tipo FASTA o plain text (.txt) a fin de conocer la secuencia de nucletidos de cada fragmento amplificado. Mediante el programa Blast del NCBI (National Center for Biotechnology Information

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), se determin el porcentaje de homologa con las secuencias ya reportadas en el GenBank (Hermosa et al, 2000).

3.6.11. Identificacin de especies en el gnero Hypocrea / Trichoderma con el programa TrichOkey 2.0. Se someti cada secuencia de ITS obtenida en este estudio al diagnstico usando TrichOkey, desarrollado por Druzhinina et al, (2005). Como resultado de este anlisis, se obtiene la identidad del aislado, siempre que la calidad de la secuencia sea elevada, y la ubicacin de las anclas (GSH). Las anclas 1 y 5 indican el inicio de la regin ITS1 y fin de la regin ITS2. Se us esta informacin para editar las secuencias de ITS.

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3.6.12. Edicin de la secuencias Las secuencias fueron recortadas usando el software MEGA4 a fin de eliminar segmentos no relevantes en trminos de parsimonia que pudieran interferir con el anlisis filogentico.

3.6.13. Anlisis filogentico

Las secuencias fueron alineadas usando Clustal X 2.0 y se guardaron como formato Clustal (.aln) que despes fueron convertidos al formato .meg para su uso con el Software MEGA4. Con este software se analiz la alineacin de las secuencias para las regiones ITS, TEF y la combinacin de ambas (ITS+TEF). Se construyeron arboles filogenticos usando el protocolo Neighborg Joining, realizando una prueba de bootstrapping con 1000 replicados para cada rbol. Los parmetros usados en la reconstruccin se detallan en el pie de cada rbol reconstruido.

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4. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1 Caracterizacin morfolgica. Las 16 cepas que resultaron pertenecer al gnero Trichoderma fueron caracterizadas morfolgicamente de acuerdo a la metodologa previamente descrita para las caractersticas macroscpicas tanto como macroscpicas. Los resultados de cada cepa se muestran a continuacin:

4.1.1. Cepa VSL001 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.4 5.1 m, ancho en punto medio: 2.4 3.2 m, ancho en la base: 2.6 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.6 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL001 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

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a

b

c

d

e

FIGURA 7. a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL001 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.2. Cepa VSL006 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia no desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son medianamente gruesos y las filides estn dispuestas formando cruces definidas,

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distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.8 4.7 m, ancho en punto medio: 2.3 3.1 m, ancho en la base: 2.8 3.0 m y ancho de la clula de soporte: 1.8 2.0 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL006 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006).

a

b

c

d

e

FIGURA 8 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL006 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

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4.1.3. Cepa VSL011 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.7 4.8 m, ancho en punto medio: 2.7 3.0 m, ancho en la base: 2.8 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.6 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL011 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

4.1.4. Cepa VSL016 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.4 4.5 m, ancho en punto medio: 2.8 3.2 m, ancho en la base: 2.6 2.7 m y ancho de la clula de soporte: 1.8 2.1 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa

36

VSL016 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

a

b

c

d

e

FIGURA 9 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL011 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.5. Cepa VSL018 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer

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sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.9 4.9 m, ancho en punto medio: 2.7 3.1 m, ancho en la base: 2.8 3.0 m y ancho de la clula de soporte: 1.6 2.0 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL018 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

a

b

c

d

e

FIGURA 10 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL016 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

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a

b

c

d

e

FIGURA 11 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL018 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.6. Cepa VSL028 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las

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filides

estn

dispuestas

formando

cruces

bien

definidas,

distribuidas

regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.6 5.0 m, ancho en punto medio: 2.6 3.1 m, ancho en la base: 2.7 3.2 m y ancho de la clula de soporte: 1.7 2.1 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL028 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

a

b

c

d

e

FIGURA 12 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL028 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

40

4.1.7. Cepa VSL031 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia no desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.6 4.8 m, ancho en punto medio: 2.6 3.1 m, ancho en la base: 2.8 3.0 m y ancho de la clula de soporte: 1.6 2.1 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL031 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006).

4.1.8. Cepa VSL034 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es escaso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides: Largo: 3.3 4.5 m, ancho en punto medio: 2.6 3.0 m, ancho en la base: 2.6 2.9 m y ancho de la clula de soporte: 1.8 2.1 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa

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VSL034 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

a

b

c

d

e

FIGURA 13 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL031 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.9. Cepa VSL045 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia no desprenda olor a coco. Gener pstulas al

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crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.4 4.5 m, ancho en punto medio: 2.4 3.1 m, ancho en la base: 2.8 3.0 m y ancho de la clula de soporte: 1.7 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL045 puede ser un miembro del grupo Longibrachiatum.

a

b

c

d

e

FIGURA 14 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL034 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

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a

b

c

d

e

FIGURA 15 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL045 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.10. Cepa VSL049 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso, escaso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia no desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas,

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distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.4 4.5 m, ancho en punto medio: 2.4 3.1 m, ancho en la base: 2.8 3.0 m y ancho de la clula de soporte: 1.7 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL049 puede ser un miembro del grupo Longibrachiatum.

a

b

c

d

e

FIGURA 16 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL049 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

45

4.1.11. Cepa VSL056 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa present ligera coloracin amarillenta. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas de forma dispersa sobre la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.8 4.9 m, ancho en punto medio: 2.6 3.1 m, ancho en la base: 2.6 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.6 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL056 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

4.1.12. Cepa VSL059 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso con formacin de estructuras globulares de color blanco sobre PDA y verde sobre CMD. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre los medios CMD y SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en anillos concntricos desde el interior de la colonia hacia la periferia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.4 4.5 m, ancho en punto medio: 2.8 3.2 m, ancho en la base: 2.7 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.7 2.0 m. Comparando las caractersticas

46

obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL059 puede ser T. atroviride, T. viride o T. viridescens.

a

b

c

d

e

FIGURA 16 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL056 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.13. Cepa VSL066 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer

47

sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.4 4.1 m, ancho en punto medio: 2.7 3.0 m, ancho en la base: 2.9 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.8 2.1 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL066 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

a

b

c

d

e

FIGURA 17 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL059 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

48

a

b

c

d

e

FIGURA 18 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL066 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

4.1.14. Cepa VSL069 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia no desprenda olor a coco. Gener escasamente pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas irregularmente sobre la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides fueron: Largo: 3.9 4.8 m, ancho en

49

punto medio: 2.6 3.2 m, ancho en la base: 2.8 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.8 2.3 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL069 puede ser T. harzianum.

a

b

c

d

e

FIGURA 19 a-c Cultivos de la cepa de Trichoderma VSL069 incubados durante 7 das a 25 C. a) Agar PDA. b) Agar CMD c) Agar SNA. D. Pstula creciendo sobre agar SNA observada al estereoscopio (40X). e) Detalle del conidiforo observado al microscopio ptico (100X)

50

4.1.15. Cepa VSL078 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia no desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre medio SNA. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las filides: Largo: 3.6 5.0 m, ancho en punto medio: 2.4 3.2 m, ancho en la base: 2.9 3.3 m y ancho de la clula de soporte: 1.7 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL078 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006).

4.1.16. Cepa VSL079 La colonia creci rpidamente sobre Agar de Dextrosa y Papa (PDA) o Agar de Dextrosa y masa de Maz (CMD) con micelio sumergido hialino. El micelio areo es lanoso y de color blanco. El reverso de la placa no present coloracin. Al crecer sobre CMD, la colonia desprenda olor a coco. Gener pstulas al crecer sobre los tres medios estudiados. Las pstulas eran verdes, difusas y escasas dispuestas en la cercana del borde creciente de la colonia. Los conidiforos son delgados y las filides estn dispuestas formando cruces bien definidas, distribuidas regularmente. Las medidas de las estructuras del conidiforo fueron: filide: Largo: 3.4 5.1 m, ancho en punto medio: 2.4 3.2 m, ancho en la base: 2.6 3.1 m y ancho de la clula de soporte: 1.6 2.2 m. Comparando las caractersticas obtenidas con las claves de identificacin reportadas por

51

Kubicek y Hartman (1998), la cepa VSL001 puede ser un miembro del agregado de especies de T. koningii (Samuels et al, 2006), T. viride o T. viridescens.

a

b