ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERIAS AGRARIAS DE PALENCIA

DEPARTAMENTO DE PRODUCCION VEGETAL Y RECURSOS FORESTALES

TESIS DOCTORAL:

Identificación genética, estructura y orígenes de las variedades de vid (Vitis vinifera L.) cultivadas en Castilla y

León

Presentada por José Carlos Santana Pérez para optar al grado de doctor por la Universidad de Valladolid

Dirigida por:

Elena Hidalgo Rodríguez

Agradecimientos

Embarcarse en una tesis doctoral es una decisión que compromete la vida de

uno para varios años, en la mayoría de ocasiones encauzando definitivamente la que

será su orientación laboral. Cuando yo tomé esa decisión, no tenía ni idea sobre los

trámites y procedimientos inevitables para, primero, conseguir una beca, segundo,

conseguir financiación para los proyectos de investigación, y tercero, desarrollar una

labor investigadora útil y dirigida hacia objetivos abordables. Sólo sabía que tenía

inquietud por saber, por averiguar, por conocer… aunque con tendencia a la dispersión.

Por suerte, tropecé con la Dra. Elena Hidalgo, quien apostó por mí, y me guió a través

de los procelosos océanos de la ciencia aplicada (sin su astrolabio, los cantos de

sirena nunca me habrían dejado tocar puerto), y de los tediosos pero imprescindibles

pantanos burocráticos. Hoy día, sigo siendo un torpe redomado en la parte prosaica de

la ciencia, pero conozco sus caminos, y mis pensamientos siguen yéndose por los

cerros de Úbeda a la que tienen la menor ocasión, pero he aprendido a encauzarlos

hacia fines prácticos. Por todo ello, gracias, Elena.

Luego viene la praxis, hay que currar para sacar datos y resultados, y yo, suelto

por el laboratorio, no sabía ni por dónde empezar. Ahí es donde la suerte actuó por

segunda vez, poniendo en mi camino a Ana de Lucas, quien ha sido una especie de

hermana mayor. Ana me enseñó a optimizar recursos, a organizar mi trabajo, a ser

escrupuloso y constante, y a ser escéptico con mis propios resultados. Fue siempre

sincera y honesta, en lo bueno (eso es fácil) y en lo malo (eso es lo difícil, ahí es donde

uno encuentra el margen para mejorar). Gracias, Ana, por tu inmensa paciencia, por

todas las conversaciones de ida y vuelta, y por todo lo transmitido, que me ha

permitido hacerme independiente y tener mis propias iniciativas.

El suministro de las muestras necesarias para cumplir mis objetivos fue cosa de

la gente del grupo de viticultura del ITACyL, a quienes debo agradecer el trato que

recibí, en especial de César Arranz, Jesús Yuste, y José Antonio Rubio.

Siempre pensé que para rendir adecuadamente es necesario tener momentos

de distensión, sin los cuales uno corre el riesgo de pensar que su trabajo es

demasiado importante. Hace falta contactar con la realidad de vez en cuando. Cómo

disfrutaba yo de las reuniones casuales en los pasillos y rellanos, o de las

premeditadas en la cafetería. Tengo que agradecer a Ana, Cristóbal, Josu, Liber,

Gonzalo, Raulillo, Agustín (como compañeros más habituales, aunque no los únicos),

múltiples horas de debates terrenales y carcajadas. En esto último, debo hacer

mención especial a Josu, quien, aparte de hacerme siempre reir, me ayudó a

relativizar nuestras fútiles preocupaciones académicas.

Durante el transcurso de este doctorado en Palencia, compartí piso con

personas que ahora considero de mi familia. Hemos compartido todo, y convivido

como tales. A ellos les debo el tener un hogar lejos de mi hogar, al que regresar cada

día, a tener con quien desear celebrar mis alegrías y llorar mis penas. Se lo debo a

Asier, Gonzalo, Raulillo y Liber, personas con las que da gusto compartirlo todo.

Para abordar la última parte de la tesis, me desplacé una primavera a Madrid

para una pequeña estancia en el Centro Nacional de Biotecnología. Allí conocí lo que

es el trabajo científico a mayor escala, sumé experiencia, que me ha valido mucho

después, y, sobre todo, adquirí una perspectiva mucho más amplia, que me ha

permitido medir las posibilidades de mis propias ideas. Todo eso se lo debo,

principalmente, al doctor José Miguel Martínez Zapater. Asimismo, no puedo dejar de

reconocer la aportación a mis metodologías de trabajo del doctor Diego Lijavetzky,

gracias al cual aumenté y optimicé mis capacidades.

Finalizado el trabajo de recopilación, análisis, y extracción de resultados, vino la

época de redacción, la cual he tenido que compaginar con diferentes experiencias

laborales y distintos escenarios. Han sido varias las fases atravesadas en este último

proceso, mejores y peores, pero lo único inmutable en todo él ha sido la presencia de

mi perro, Sil, quien siempre ha estado fielmente echado bajo mi mesa de trabajo,

calentando mis pies en invierno, y soportando estoicamente mis pequeñas

frustraciones y mis pequeños triunfos. Por eso, no quería dejar de acordarme de él,

porque, aunque a muchos sonará ridículo, tiene su parte de culpa en que este trabajo

haya llegado a término.

Debo agradecer el apoyo incondicional de mi familia, mis padres, José y

Minerva, y mi hermano, Javi. Ellos siempre han creido en mí, incluso cuando yo no he

creido. Gracias por considerarme tan excepcional aunque no lo sea; gracias por estar

tan orgullosos, aunque no lo merezca.

Por último, gracias a Liber, por animarme, por apoyarme, por defenderme, por

estar siempre conmigo, por todo.

INDICE

PRÓLOGO ........................................................................................ i RESUMEN........................................................................................ ii SUMMARY ...................................................................................... iii Capítulo 1: INTRODUCCIÓN 1. Introducción .................................................................................. 3

1.1. Orígenes de la vid cultivada: domesticación........................................... 3 1.2. El viñedo en Castilla y León: Origen y diversidad................................... 6 1.3. La erosión genética de la vid .................................................................. 8 1.4. Importancia de la conservación de variedades locales .......................... 9 1.5. Identificación y caracterización de variedades ..................................... 10

1.5.1. Ampelografía......................................................................................... 10 1.5.2. Marcadores moleculares....................................................................... 12

1.6. Estrategias para investigar los orígenes, pedigríes y posibles parentescos de las variedades ............................................................. 14

1.7. Nuevas herramientas genéticas para la mejora de la vid ..................... 17

Capítulo 2: OBJETIVOS 2. Objetivos .................................................................................... 22 Capítulo 3: MATERIAL y MÉTODOS 3. Material y Métodos..................................................................... 25

3.1. Material Vegetal.................................................................................... 25 3.1.1. Variedades de vid cultivadas en Castilla y León................................... 25 3.1.2. Vides silvestres ..................................................................................... 27 3.1.3. Variedades y especies de vid utilizadas para identificar SNPs

cloroplásticos ............................................................................................ 30

3.2. Extracción de ADN ............................................................................... 31 3.3. Genotipado........................................................................................... 31

3.3.1. Elección de microsatélites..................................................................... 31 3.3.2. Diseño de cebadores para secuenciar regiones cloroplásticas variables................................................................................................... 33 3.3.3. Amplificación por PCR .......................................................................... 35 3.3.4. Electroforesis y ajuste de alelos............................................................ 36 3.3.5. Secuenciación y detección de SNPs .................................................... 40

3.4. Análisis de datos .................................................................................. 40 3.4.1. Parámetros genéticos de los microsatélites.......................................... 40 3.4.2. Estimadores de diversidad genética ..................................................... 41 3.4.3. Análisis de estructura............................................................................ 42 3.4.4. Análisis de parentesco .......................................................................... 43

3.4.5. Identificación de SNPs .......................................................................... 44

3.4.5.1. SNPs en variedades.................................................................. 44 3.4.5.2. SNPs en especies de la familia Vitaceae.................................. 45

Capítulo 4: RESULTADOS 4. Resultados ................................................................................. 48

4.1. Caracterización genética e identificación varietal ................................. 48 4.1.1. Parámetros genéticos de los marcadores: índices de diversidad ........ 48 4.1.2. Adscripción de genotipos: sinonimias y homonimias............................ 49

4.1.2.1. Sinonimias................................................................................. 54 4.1.2.2. Homonimias .............................................................................. 57 4.1.2.3. Errores de nomenclatura........................................................... 58 4.1.2.4. Genotipos con alelos únicos ..................................................... 61 4.1.2.5. Variedades extranjeras ............................................................. 61

4.1.3. Genotipos no referenciados en las bases de datos .............................. 62

4.2. Análisis de estructura genética............................................................. 65 4.2.1. Clorotipos asignados a los nuevos genotipos....................................... 65 4.2.2. Estructura genética de las vides de Castilla y León.............................. 66

4.2.2.1. Estructura genética ................................................................... 66 4.2.2.2. Diferenciación entre los grupos genéticos obtenidos................ 71

4.2.3. Factores que determinan la variabilidad genética de las vides de Castilla y León....................................................................................................... 72

4.2.3.1. Variación a nivel de genotipos individuales............................... 72 4.2.3.2. Variación a nivel de grupos ....................................................... 75 4.2.3.3. Variación en cuanto al uso ........................................................ 77

4.2.4. Análisis de la varianza molecular.......................................................... 78

4.3. Relaciones genéticas y posibles orígenes de las variedades autóctonas ........................................................................................... 80

4.3.1. Dendrogramas ...................................................................................... 80

4.3.2. Posibles parentescos ............................................................................ 83

4.4. Detección y comprobación de SNPs cloroplásticos.............................. 88 4.4.1. SNPs cloroplásticos entre variedades de vid........................................ 90

4.4.2. SNPs cloroplásticos entre especies del género Vitis ............................ 92

Capítulo 5: DISCUSIÓN 5. Discusión.................................................................................... 99

5.1. Caracterización genética e identificación varietal ................................. 99 5.1.1. Parámetros genéticos de los marcadores: índices de diversidad......... 99 5.1.2. Composición del acervo genético de vid de Castilla y León ............... 101 5.1.3. Genotipos no referenciados previamente en las bases de datos ....... 103

5.2. Análisis de estructura genética de las vides de Castilla y León.......... 105 5.2.1. Estructura genética de las vides de Castilla y León............................ 105 5.2.2. Diferenciación entre los grupos genéticos obtenidos.......................... 106 5.2.3. Factores que determinan la variabilidad genética de las vides de Castilla

y León..................................................................................................... 107

5.2.4. Análisis de la varianza molecular........................................................ 108

5.3. Relaciones genéticas y posibles orígenes de las variedades autóctonas ......................................................................................... 109 5.4. Naturaleza de las vides silvestres de Castilla y León ......................... 111 5.5. Detección y comprobación de SNPs cloroplásticos............................ 112

5.5.1. SNPs cloroplásticos entre variedades de vid...................................... 112 5.5.2. SNPs cloroplásticos entre especies del género Vitis .......................... 115

Capítulo 6: CONCLUSIONES 6. Conclusiones............................................................................ 121 Capítulo 7: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 7. Referencias bibliográficas ........................................................ 126 Capítulo 8: ANEJOS ................................................................... 141

Anejo I – Material suplementario

Anejo II – Identification of autochthonous grapevine varieties in the

germplasm collection at the ITA of ‘Castilla y León’ in Zamadueñas Station,

Valladolid, Spain

Anejo III – Identification and relationships of accessions grown in the

grapevine (Vitis vinifera L.) Germplasm Bank of Castilla y León (Spain) and

the varieties authorized in the VQPRD areas of the region by SSR-marker

analysis

Anejo IV – Genetic structure, origins, and relationships of grapevine

cultivars from the Castilian Plateau of Spain

i

PRÓLOGO

Uno de los mayores atractivos de la vid como objetivo de investigación es, sin duda, su relación

con la historia y cultura de las civilizaciones mediterráneas. La vid es una planta domesticada,

extraída de la naturaleza, transformada y moldeada en respuesta a las necesidades humanas a

lo largo de miles de años para conseguir de ella los mejores frutos posibles. Este largo proceso

de selección y mejora genética ha generado un gran patrimonio varietal, enormemente diverso

en cuanto a características agronómicas y enológicas, que han dado lugar, a su vez, a muy

diferentes vinos, íntimamente ligados, histórica y culturalmente, a las comarcas donde se han

producido. El presente trabajo trata de proporcionar una visión global de cómo el acervo

genético de una región vitícola tradicional se ha ido componiendo a lo largo de la historia,

contando con germoplasma de origen local y de origen foráneo, y con los cruces surgidos entre

ambos compartimentos. Los múltiples enfoques de análisis y estudio con los que se abordan

aquí estas cuestiones sirven, además, de piedra de toque para futuros trabajos, más

específicos, que permitan profundizar en las interesantes relaciones genéticas aquí propuestas,

que hablan tanto de una historia genética como cultural en Castilla y León.

Los resultados de los análisis llevados a cabo durante la elaboración de esta tesis doctoral han

dado lugar a tres artículos científicos aparecidos en publicaciones incluidas en el SCI, que

aparecen en el presente documento como Anejos II, III, y IV, y se citan como tales a lo largo del

texto:

i. Yuste J., Martín J.P., Rubio J.A., Hidalgo E., Recio P., Santana J.C., Arranz C. y Ortiz

J.M. (2006). Identification of autochthonous grapevine varieties in the germplasm

collection at the ITA of Castilla y León in Zamadueñas Station, Valladolid, Spain.

Spanish Journal of Agricultural Research 4(1): 31-36.

ii. Santana J.C., Hidalgo E., De Lucas A.I., Recio P., Ortiz J.M., Martín J.P., Yuste J.,

Arranz C. y Rubio J.A. (2008). Identification and relationships of accessions grown in

the grapevine (Vitis vinifera L.) Germplasm Bank of Castilla y León (Spain) and the

varieties authorized in the VQPRD areas of the region y SSR-markers analysis. Genetic

Resources and Crop Evolution 55: 573-583.

iii. Santana J.C., Heuertz M., Arranz C., Rubio J.A., Martínez-Zapater J.M. e Hidalgo E.

(2010). Genetic structure, origins and relationships of grapevine cultivars from the

Castilian Plateau (Northern Central Spain). American Journal of Enology and Viticulture

61(2): 214-224.

Asimismo, los resultados obtenidos en la última parte de esta tesis, en relación con la

identificación de SNPs en el ADN cloroplástico, serán objeto de una cuarta publicación

científica, actualmente en elaboración.

ii

RESUMEN

En el transcurso del último siglo, en muchas regiones de viticultura tradicional, la mayoría de

las variedades de vid autóctonas han ido siendo sustituidas por un pequeño número de

variedades más productivas o mejor conocidas, lo que se conoce como la erosión genética del

viñedo. Las variedades locales, bien adaptadas al medio, y, a menudo, de alto interés

enológico o gustativo, constituyen una reserva de genes individuales, de enorme y desconocido

potencial. Castilla y León, con una antiquísima tradición vitivinícola, alberga aún un importante

número de variedades locales en viñedos antiguos y marginales. En general, se trata de

variedades muy minoritarias, en algunos casos seriamente amenazadas, siendo muy poca o

nula la información agronómica y genética sobre ellas. La erosión del viñedo no afecta

únicamente a la vid cultivada, sino que, por su parte, la vid silvestre, Vitis vinifera L. ssp.

sylvestris (Gmelin) Hegi, ancestro de la anterior, se encuentra catalogada como subespecie en

peligro crítico de desaparición en Europa. Con objeto de conocer la diversidad y estructura

genéticas del acervo de vides castellanas y leonesas en la actualidad, así como los orígenes y

relaciones filogenéticas de sus variedades locales, se recopilaron un total de 470 muestras de

vides de los viñedos de Castilla y León. Asimismo, se prospectaron ambientes salvajes de esta

región en busca de posibles vides silvestres, recogiéndose 4 muestras. Las muestras fueron

genotipadas con los seis microsatélites estándar del proyecto europeo GENRES081,

discriminándose 122 genotipos diferentes. Entre las vides cultivadas se contabilizaron 351

genotipos redundantes, 176 sinónimos, 77 homónimos, y 29 genotipos no referenciados

previamente en las bases de datos españolas e internacionales consultadas. Los genotipos

discriminados se genotiparon, a su vez, con 16 marcadores microsatélites nucleares y 9

cloroplásticos adicionales, enfocados a análisis de estructura y relaciones filogenéticas. Las

variedades se estructuraron en tres grupos genéticos significativamente diferenciados,

segregando esencialmente (i) variedades de tipo Moscatel e híbridos interespecíficos entre

Vitis, (ii) variedades propias de Francia y de las zonas occidentales de Castilla y León, y (iii)

variedades tradicionales de la zona central de la Meseta Castellana junto con variedades

locales con aptitud para uva de mesa. Las estrechas relaciones genéticas detectadas entre

variedades de demarcaciones occidentales de Castilla y León y variedades francesas apoyan

la hipótesis de una introducción de las últimas a través de los peregrinos del Camino de

Santiago. Las variedades de uva blanca tradicionales de las zonas centrales de la Meseta

resultaron también muy relacionadas entre sí. Los datos obtenidos de los marcadores

cloroplásticos sugieren que los genotipos previamente no referenciados, así como algunas de

las variedades locales más representativas de ciertas comarcas centrales y occidentales de

Castilla y León, tienen orígenes autóctonos, o que derivan de cruzamientos entre variedades

autóctonas y variedades introducidas. Los rasgos morfológicos y los genotipos nucleares y

cloroplásticos detectados entre las muestras de ambiente salvaje sugieren que tres de las

cuatro plantas estudiadas se encuentran estrechamente relacionadas entre sí, y podrían ser

genuinas representantes supervivientes de la subespecie Vitis vinifera ssp. sylvestris en

Castilla y León.

iii

SUMMARY

Along the last century, most of the autochthonous grapevine varieties from many traditional

grape-growing areas have been replaced with several better known or more productive

varieties, what is known as the genetic erosion of the grapevine. Local varieties, well adapted to

their environments, and often with interesting enologic and taste features, represent a pool of

individual genes, with a great and unknown potential. Castilla y León, with an ancient viticulture

tradition, maintains a high number of local varieties in old marginal vineyards. In general, they

are very minor varieties, some of them seriously threatened, with scarce or none agronomic or

genetic information about them. The grapevine erosion does not affect only cultivated grapes,

but also the wild grapevine, Vitis vinifera L. ssp. sylvestris (Gmelin) Hegi, ancestor of the former,

which is listed as a critical endandegered subspecies in Europe. With the aim of knowing the

genetic diversity and structure of the grapevine pool from Castilla y León, along with the origin

and genetic relationships of its varieties, a total of 470 grapevine samples from vineyards were

collected in this region. Likewise, wild environments of the region were prospected in order to

find alleged representatives of wild grapevines, and 4 samples were collected. All samples were

genotyped at the six nuclear microsatellite loci (SSRs) proposed as a standard set for cultivar

identification by the GENRES081 project, yielding 122 different genotypes. The cultivated data

set harboured 351 redundant samples, 176 synonyms, 77 homonyms, and 29 previously

unreported genotypes. Non-redundant genotypes were typed at another 16 nuclear and 9

chloroplast additional microsatellite markers for structure and genetic relationships purposes.

Varieties were structured in three significantly differentiated genetic clusters, separating

essentially (i) Muscat-type accessions and interspecific Vitis hybrids, (ii) accessions from France

and the Western Castilian Plateau, and (iii) traditional accessions from the Central Castilian

Plateau together with local table grapes. The close relatedness of accessions from the Western

Castilian Plateau among each other and to French varieties supported introduction of the latter

along the pilgrimage Route to Santiago de Compostela. White-berried cultivars from Central

areas of the Plateau were also closely related among each other. Chlorotype data suggested

that previously unreported genotypes as well as local varieties typical from Western and Central

Castilla y León had local origins or resulted from crosses between introduced and local

varieties. Morphological features and allelic composition suggested that three out of the four

samples collected from wild habitats were closely related and might represent genuine Vitis

vinifera ssp. sylvestris individuals.

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN

Introducción

3

1. INTRODUCCIÓN

1.1. ORÍGENES DE LA VID CULTIVADA: DOMESTICACIÓN

Existe consenso en la comunidad científica acerca de que la vid cultivada (Vitis vinifera

ssp. sativa) fue domesticada a partir de su ancestro silvestre (Vitis vinifera ssp.

sylvestris) (Zohary 1995). La vid silvestre es una planta propia de ambientes riparios,

libres de heladas, y con irrigación constante, donde vegeta como trepadora sobre

árboles típicos de ribera, especialmente olmos, chopos, espinos, carpes, o fresnos

(Grassi et al. 2006). A diferencia de su descendiente cultivada, con flores

hermafroditas, la subespecie silvestre es dioica, y su área de distribución natural se

extiende desde las estribaciones occidentales del Himalaya hasta Portugal en longitud,

y desde la costa mediterránea de África hasta Alemania en latitud (Zohary y Hopf

2000).

Figura 1-1. Área de distribución natural de la especie Vitis vinifera L. (Zohary 1995)

La domesticación de la vid se ha documentado frecuentemente como un evento único

(Aradhya et al. 2003), localizado en Oriente Próximo, y concretamente, según

evidencias arqueológicas, en los Montes Zagros de Irán, entre el 5400 y el 5000 a.C.

(McGovern et al. 1996). Según esta hipótesis todas las variedades cultivadas actuales

descenderían de allí, y se habrían extendido después por la acción humana. Sin

embargo, algunos autores han encontrado recientemente posibles indicios de

domesticación en Europa occidental (Arroyo-García et al. 2006; Cunha et al. 2009;

Lopes et al. 2009; Terral et al. 2009; Myles et al. 2011), lo que ha abierto el debate

sobre el número y localización de los centros de domesticación de la especie. En

Introducción

4

cualquier caso, las evidencias arqueológicas apuntan a que la viticultura pudo tener su

origen en Oriente, en Transcaucasia (6000 a.C.) (McGovern y Rudolph 2000) y se

extendió después hacia occidente, con o sin incidencia de domesticaciones

secundarias en nuevos lugares. Una vez domesticada, la especie fue sometida a una

fuerte selección por parte de los primeros agricultores, que buscaban características

favorables a los intereses humanos, como el hermafroditismo, un mayor tamaño de

racimos y uvas, o un sabor más dulce y menos ácido, entre otras. Posteriormente,

realizaron cruzamientos sexuales en busca de nuevos fenotipos con caracteres

deseables, y fueron seleccionando los mejores descendientes, que luego multiplicaron

vegetativamente, dando lugar, progresivamente, a las distintas variedades (This et al.

2006). Las subsiguientes nuevas variantes, aparecidas por cruzamientos espontáneos

o premeditados y por mutaciones somáticas, quedaban fijadas por medio de

propagación vegetativa cuando el resultado era propicio (Pelsy et al. 2010). En Grecia,

las vides comenzaron a cultivarse desde el segundo milenio a.C. Posteriormente,

durante las colonizaciones griegas y fenicias, el vino y los conocimientos sobre

viticultura se exportaron a otras zonas del Mediterráneo. Los romanos se convirtieron

en embajadores de estos conocimientos en asociación con la fe cristiana, integrando

la ingesta de vino en la cultura europea, y extendieron variedades de vid cultivada por

toda Eurasia y el África mediterránea, a lo largo de las rutas comerciales de la época.

El producto principal que se obtenía de la vid era el vino, aunque posteriormente, la

expansión del Islam por el norte de África y Península Ibérica favoreció también la

dispersión de variedades utilizadas para producir uva de mesa, con caracteres

fenotípicos diferentes de los preferidos para la producción de vino (Imazio et al. 2006).

De esta forma, surgieron diferencias genéticas entre las variedades seleccionadas

para vino y las variedades seleccionadas para producir uva de mesa y pasas, que han

quedado patentes en diversos estudios (Aradhya et al. 2003, Arroyo-García et al.

2006, Heuertz et al. 2008, Fournier-Level et al. 2010). La expansión de la vid, tan

ligada a la historia humana, acabó alcanzando también América y Oceanía. Durante la

expansión de la viticultura por Europa, pudieron producirse cruzamientos espontáneos

con individuos silvestres locales (Zohary y Hopf 2000; Snoussi et al. 2004; Cunha et al.

2009, Myles et al. 2011), que propiciaron, en algunos casos, la aparición de nuevas

variedades híbridas con caracteres distintivos. Sin embargo, dichos cruzamientos

debieron ser poco frecuentes, dado que la mayoría de los estudios en los que se han

analizado las relaciones genéticas entre vides cultivadas y las vides silvestres

persistentes en la actualidad, como los de Lacombe et al. (2003) ó Snoussi et al.

(2004), suelen referir diferencias patentes entre ambos tipos. Sólo en contados casos

se ha podido documentar una relación genética estrecha entre variedades cultivadas y

Introducción

5

vides silvestres actuales, como el descrito por Grassi et al. (2003) en la isla de

Cerdeña (Italia) o el referido por Aradhya et al. (2003). Por su parte, DiVecchi-Staraz et

al. (2009) revelaron la existencia de flujo polínico desde viñedos comerciales a

poblaciones silvestres en el sur de Francia, con nefastas implicaciones para la

pervivencia de la subespecie silvestre.

Todos estos eventos (domesticación única o sucesiva, fuerte selección acorde al uso,

mantenimiento de las variedades por multiplicación vegetativa, y cruzamientos entre

vides cultivadas y entre cultivadas y silvestres) han dado forma a una extensa

diversidad varietal en la vid cultivada, estructurada por Negrul (1938) en tres diferentes

grupos ecogeográficos principales en función de su morfología: Occidentalis, referido a

las vides de baya pequeña utilizadas para vino y propias de Europa occidental;

Orientalis, que agrupa las vides de baya grande usadas como uva de mesa y propias

de Asia menor; y Pontica, que engloba las vides de tipo intermedio entre los otros dos,

propias de la cuenca del Mar Negro y Europa oriental. Posteriormente, Levadoux

(1956) incidió en la diferenciación morfológica entre las vides silvestres y cultivadas de

Europa occidental y las de la cuenca mediterránea oriental, argumentando que esta

diferenciación sería consecuencia de un posible aislamiento entre las poblaciones

occidentales y orientales durante el periodo glacial, seguida de una posterior

adaptación climática y selección diferencial. Ciertos estudios sobre vides de distintas

regiones europeas (Sefc et al. 2000), examinando únicamente aquellos cultivares con

mayor probabilidad de ser autóctonos de cada zona, sostienen que existen diferencias

genéticas significativas entre ellas. No obstante, cuando hablamos de las vides

cultivadas en cada zona en sentido amplio, se observa cómo el incesante intercambio

de materiales vegetales entre regiones y la diseminación de variedades acompañando

las migraciones humanas han podido actuar homogeneizando en cierta medida los

distintos acervos genéticos a lo largo del tiempo (This et al. 2006), de forma que, en

los últimos años, algunos autores han encontrado mayor variabilidad intra-grupal que

inter-grupal a nivel geográfico (Aradhya et al. 2003). En contraposición, también

existen estudios cuyos resultados genéticos parecen indicar que aún existe una

estructura filogeográfica en la vid cultivada actual, sugiriendo que, en muchas

regiones, los fenómenos de domesticación locales y la introgresión de vides silvestres

pudieron haber sido más importantes que la introducción de cultivares foráneos (Sefc

et al. 2003).

La situación actual de la vid silvestre, por el contrario, es crítica, encontrándose al

borde de la extinción en Europa. La incidencia de enfermedades provenientes de sus

Introducción

6

parientes cultivadas, como Mildiu y Filoxera, así como la intervención humana en los

cauces fluviales, en forma de embalses o reconducciones (Sefc et al. 2003), que

alteran la conformación de las riberas de los ríos que suponen su hábitat, han

confinado a esta subespecie a pequeñas poblaciones aisladas, potenciando la

endogamia y, por tanto, el progresivo decaimiento genético en los supervivientes (Di

Vecchi-Staraz et al. 2009). Por estos motivos, ya en la década de 1980 fue clasificada

como Especie Europea en Peligro por parte de la Unión Internacional para la

Conservación de la Naturaleza (Arnold et al. 1998). En lo que respecta a España,

cierto número de poblaciones silvestres de vid han sido localizadas en los últimos años

(Ocete et al. 1996, De Toda y Sancha 1997, Álvarez y Fernández-Prieto 2000, Arroyo-

García et al. 2006), en especial en la mitad sur del país y en las zonas costeras, donde

el clima es más benigno. Sin embargo, los individuos que persisten actualmente en

estado salvaje corresponderían con una posible mezcla entre V. vinifera ssp. sylvestris

propiamente dichas, vides cultivadas (V. vinifera ssp. sativa) e híbridos, y Vitis

americanas introducidas en los viñedos como portainjertos y después escapadas de

cultivo, así como posibles cruzamientos espontáneos entre todas estas categorías

(Lacombe et al. 2003, Sefc et al. 2003).

1.2. EL VIÑEDO EN CASTILLA Y LEÓN: ORIGEN Y DIVERSIDAD

Castilla y León es la región más extensa de España (94224 Ha, según datos del

Istituto Nacional de Estadística, http://www.ine.es/inebaseweb/pdfDispacher.do?

td=154090&L=0), con una configuración geomorfológica de Meseta elevada rodeada

de cadenas montañosas, surcada de este a oeste por el río Duero, y en dirección sur-

norte y norte-sur por sus afluentes. Debido a estas características, dentro de sus

límites coexisten ambientes muy diferentes. La tradición vitícola en las tierras

castellanas y leonesas es antiquísima, remontándose quizás, según recientes

hallazgos arqueológicos del siglo IV a.C. en el yacimiento vacceo de Pintia

(Valladolid), hasta épocas anteriores a la conquista romana (Sanz-Mínguez et al.

2008). Hoy en día, la viticultura es, económicamente, una de las actividades agrícolas

más importantes de la región, con 206.000 Tm de uva producida y más de 1,4 millones

de Hl de vino en 2009 (datos de información agraria de la Junta de Castilla y León,

http://www.jcyl.es/web/jcyl/AgriculturaGanaderia/es/Plantilla100/1284137229262/_/_/).

Castilla y León alberga numerosas zonas vitícolas con distintas denominaciones de

origen (Figura 1-2), dentro de las cuales se cuentan algunas bodegas de prestigio.

Introducción

7

Figura 1-2. Comarcas vitícolas y Rutas tradicionales de la Meseta Castellana (elaboración propia).

La combinación de los anteriores factores hacen de esta región un lugar

potencialmente muy rico en diversidad varietal vitícola. Este patrimonio varietal

castellano-leonés se habría configurado a través de milenios de tradición vitivinícola,

moldeado por las necesidades y movimientos humanos a lo largo de la rica historia de

estos territorios. Así, hoy sabemos que, durante la Edad Media, la producción de vino

estuvo muy ligada a los monasterios, que disponían de sus propios viñedos para

elaborar los vinos empleados en la liturgia cristiana. De esta forma, recayó en estos

monjes medievales la tarea de repoblar de cepas las zonas reconquistadas a los

musulmanes, manteniendo y haciendo evolucionar el legado vitivinícola. En esta

época el Camino de Santiago supuso una vía de comunicación e intercambio esencial,

por la que penetraron en tierras castellanas tanto conocimientos, lenguas, y culturas,

como variedades de uva de allende las fronteras, en especial de la vecina Francia,

traídas por monjes para enriquecer los viñedos monásticos de sus correspondientes

órdenes en los territorios que hoy conforman Castilla y León. El Camino fue también

una importante ruta comercial, lo que ayudó a diseminar los vinos y variedades a lo

largo de su recorrido (Cedrón, 2004). Es también en época de Reconquista (s. XI-XII)

cuando la repoblación de la zona suroeste de la Meseta castellana fue encargada por

Alfonso VI a su yerno el noble francés Raimundo de Borgoña, quien recurrió a

compatriotas franceses para llevarla a cabo. Éstos, a su vez, pudieron introducir en la

Introducción

8

zona salmantina sus propias vides. Nuevos pobladores franceses llegaron al área en

sucesivas oleadas entre los siglos XI y XIII, por lo que se cree que la comarca de la

Sierra de Francia debe su nombre a esta causa. En el siglo XV se instaura el culto a la

Virgen de la Peña de Francia, lo que motivó que se estableciera un ramal secundario

de peregrinación desde el Camino de Santiago en León, hacia la Sierra de Francia,

discurriendo de norte a sur por el tramo correspondiente de la conocida y comercial

Ruta de la Plata, a través del cual nuevos viajeros foráneos pudieron influir en la

cultura de estas tierras, y, muy probablemente, en la composición de sus cultivos

(Ramos 1994). Por estas razones históricas, la introducción de cultivares de vid

franceses (puede que también de otras procedencias foráneas) y el posible

cruzamiento entre éstos y los locales para dar lugar a nuevas variedades de uva en la

Meseta Castellana resulta plausible, lo que sin duda habría enriquecido aún más la

diversidad cultivar de vid de esta región.

Con respecto a la vid silvestre, en el territorio castellano y leonés, debido al carácter

continental generalizado de su clima, únicamente unos pocos valles a baja altitud, con

micro-clima más cálido, situados en los límites geográficos de la región, pueden

ofrecer las condiciones propicias para albergar poblaciones supervivientes de esta

subespecie.

1.3. LA EROSIÓN GENÉTICA DE LA VID

Desafortunadamente, en el transcurso del s. XX, la región de Castilla y León, al igual

que toda Europa, ha observado una drástica y alarmante reducción de la diversidad

varietal de sus vides, conocida como la erosión genética del viñedo. Varios son los

factores que han motivado esta erosión, destacando la epidemia de filoxera

(Dactylosphaera vitifoliae Fitch), plaga que, llegada desde el continente americano,

asoló los viñedos europeos a partir de finales del s. XIX, obligando a arrancar las

plantas de grandes superficies de este cultivo, y a injertar las variedades locales sobre

patrones de especies americanas del género Vitis spp. o de híbridos, resistentes a la

plaga, pues los suelos quedaron infestados de forma permanente. Multitud de

cultivares locales europeos desaparecieron sin remisión, ante la rapidez con que se

extendió la filoxera por el continente, debido a la sensibilidad de la especie europea,

Vitis vinifera, al insecto. La otra gran causa global de pérdida de diversidad varietal en

la vid ha sido, en las últimas décadas, la globalización del mercado del vino, que ha

inducido la instauración preferente a nivel mundial de cultivares muy conocidos y

Introducción

9

populares, como Cabernet Sauvignon, Chardonnay, Merlot, o Syrah, provocando

indirectamente la desaparición por reemplazo de las variedades locales antiguas (This

et al. 2006).

En Castilla y León, los viñedos tradicionales han sucumbido progresivamente y siguen

haciéndolo, a día de hoy, a las exigencias del mercado, en detrimento de variedades

minoritarias muy arraigadas y ligadas íntimamente a áreas concretas. Asimismo, el

progresivo abandono de las zonas rurales y el envejecimiento de su población, que

han incidido tan decisivamente en esta región en las últimas décadas, han propiciado

el abandono del cultivo de viñedos muy antiguos y la desaparición de localismos.

Esta erosión genética de los viñedos ha conducido a que, en la actualidad, la mayoría

de las variedades de vid documentadas en el mundo existan únicamente en el marco

de colecciones de germoplasma (This et al. 2006).

1.4. IMPORTANCIA DE LA CONSERVACIÓN DE VARIEDADES LOCALES

La diversidad actual de la vid en el mundo se estima en unas 10000 variedades

(Alleweldt y Dettweiler 1994) mantenidas en las colecciones, aunque si nos basamos

en los resultados de estudios con marcadores moleculares de ADN llevados a cabo en

los últimos años, podrían verse reducidas a unos 5000-6000 genotipos, muchos de

ellos estrechamente relacionados entre sí (This et al. 2006, Laucou et al. 2011). Esta

redundancia es atribuible a los abundantísimos errores de nomenclatura que se dan

entre las variedades de vid cultivada en forma de sinonimias, esto es, diferentes

nombres para una misma variedad. La alta incidencia de sinonimias es debida, en

muchos casos, a la extendida costumbre de rebautizar los cultivares recién llegados a

una comarca con denominaciones que aluden a caracteres morfológicos o fenológicos

llamativos, o bien se refieren a similitudes entre el nuevo cultivar y variedades

conocidas a nivel local.

Estos datos apoyan la necesidad de identificar correctamente las variedades en los

bancos de germoplasma, de forma que puedan eliminarse accesiones redundantes y

optimizar su manejo. Además, de esta manera podría evaluarse de forma precisa la

verdadera diversidad genética que encierra la especie. El mantenimiento de la mayor

diversidad posible es esencial para el futuro de la vid, su adaptación a nuevas

condiciones de cultivo y, por lo tanto, para la mejora genética de la especie. Para este

Introducción

10

fin, la conservación en cultivo de las variedades locales es primordial, pues sus

genotipos pueden encerrar caracteres adaptativos particulares, potenciales

resistencias y tolerancias a factores bióticos y abióticos, y rasgos productivos y

cualitativos singulares, en su inmensa mayoría aún por estudiar. Los cultivares locales,

aún cuando no manifestasen caracteres de calidad, pueden encerrar en sus genes un

gran potencial como parentales para cruzamientos dirigidos, tal y como ha sido

demostrado en algunos estudios (Bowers et al. 1999a). Cada uno de los acervos

locales constituye una fuente de variación genética única, ya que pueden contener

genes específicos o variantes alélicas cuya existencia e importancia son actualmente

desconocidas, y suponen por lo tanto un valioso reservorio de caracteres para la

mejora genética. La actual tendencia de instaurar cultivares más comerciales y mejor

conocidos como Cabernet Sauvignon o Chardonnay en las regiones vitivinícolas

tradicionales por todo el mundo debería ser compensada con un cuidadoso

mantenimiento de las variedades típicas de cada comarca para combatir la grave

erosión genética de la especie (Sefc et al. 2000).

La necesidad de mantener la diversidad genética es estratégica en las especies

agroalimentarias, ya que garantiza la capacidad de respuesta ante las amenazas

futuras, y más teniendo en cuenta lo imprevisible del actual escenario de cambio

climático en que nos encontramos inmersos. Una base genética amplia no sólo es

esencial para que la especie Vitis vinifera L. subsista ante nuevas plagas,

enfermedades y restricciones edafo-climáticas, sino que, además, favorece la

diferenciación de los vinos, aportando caracteres específicos para experimentar e

innovar en su calidad.

1.5. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE VARIEDADES

La identificación varietal ha sido uno de los objetivos constantes en el estudio del

material vegetal y se ha ido abordando en cada momento con la metodología y los

instrumentos disponibles (Ortiz et al. 2000).

1.5.1. Ampelografía

Tradicionalmente, la identificación de las variedades de vid se ha basado en la

descripción morfológica de los órganos de cada variedad y de sus medidas,

entendiendo que sus características les son propias y están determinadas

Introducción

11

genéticamente. La descripción morfológica de las plantas es un método muy laborioso,

que consiste en la observación de una serie de caracteres morfológicos fundamentales

de la vid, tanto cualitativos (de los que se ocupa la ampelografía) como cuantitativos

(los que evalúa la ampelometría), normalizados por la Oficina Internacional de la Viña

(O.I.V.), a través de la edición de los “Códigos de los Caracteres de las Variedades y

Especies del género Vitis” (O.I.V. 1984), recientemente actualizados y

complementados en una nueva edición (O.I.V. 2009). En esta publicación se recogen

130 caracteres, codificados para su estandarización mediante un número OIV

(www.oiv.int), y catalogados según un baremo más o menos estricto que permite

objetivar y tabular las descripciones. La caracterización morfológica está, además,

regulada por las normas de la UPOV, Unión Internacional para la Protección de las

Obtenciones Vegetales (www.upov.int) y del IPGRI, International Plant Genetic

Resources Institute (www.ipgri.cgiar.org). Los caracteres morfológicos principales que

se tienen en cuenta son vellosidad, tamaño, color y forma, y se observan en

momentos concretos del desarrollo vegetativo de la planta sobre diferentes órganos,

fundamentalmente: sumidad, pámpano joven, hoja joven, pámpano en floración, hoja

adulta, racimo y baya.

Existen numerosas referencias en bibliografía de trabajos de caracterización de la

especie Vitis vinifera L. mediante este método en España, como los de Asensio et al.

(1999), Martínez de Toda y Sancha (1999) y Cervera et al. (2001), por citar algunos.

Si bien la caracterización ampelográfica ha permitido estudiar los caracteres distintivos

y cualitativos propios de cada variedad, aportando descripciones detalladas de las

mismas, es cierto también que presentan algunas limitaciones, como son las

siguientes (Sefc et al. 2001):

- Para la identificación morfológica se tienen en consideración, entre otros

órganos, las hojas plenamente desarrolladas, por tanto, ésta solamente puede

realizarse durante el período vegetativo de la planta. Además, el material

vegetal de vid suele ser comercializado en forma de varas (madera), que hacen

que la identificación morfológica sea muy complicada.

- El fenotipo de las plantas está fuertemente influenciado por las condiciones

ambientales en que se desarrollan, de forma que distintos ambientes pueden

causar variación en los aspectos morfológicos que se consideran en

ampelografía. La identificación de plantas con carencias de agua o nutrientes,

Introducción

12

infectadas por hongos o virus, o atacadas por plagas, es muy susceptible de

errores.

- Como se citaba con anterioridad, el número total de cultivares de uva para

vinificación en las colecciones ampelográficas de todo el mundo se estima en

unas 10000 (Alleweldt y Dettweiler 1994), y muchas de ellas están en uso. Por

esta causa, y aunque las plantas a identificar estén en perfectas condiciones,

los ampelógrafos sólo pueden diferenciar algunas decenas de variedades

frecuentes en sus zonas de actividad, haciéndose extremadamente difícil

diferenciar todas las variedades por caracteres morfológicos.

- La aplicación de los métodos ampelográficos requiere personal muy

cualificado, que en ningún caso podría tener conocimiento acerca de los miles

de variedades diferentes en el mundo, pues ninguna colección es tan variada.

La estandarización de las observaciones es muy difícil de alcanzar, dada la

subjetividad que éstas implican, al depender en alta medida del criterio

personal del experto, de forma que no es descabellado pensar que dos

ampelógrafos podrían no coincidir en todas sus observaciones, y, por

consiguiente, en la identificación de variedades exóticas que no conozcan.

1.5.2. Marcadores moleculares

En los últimos 15 años, los avances en biología molecular han permitido complementar

las observaciones ampelográficas y ampelométricas con caracterizaciones mediante

distintos marcadores moleculares tanto bioquímicos (isoenzimas, limitadas a un

escaso número de loci, Núñez et al. 2004) como de ADN, cuyo análisis se basa en la

mayoría de casos en la técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction). Entre los

distintos tipos de marcadores se han empleado en estudios de caracterización

genética e identificación varietal de vides, los más destacados han sido, sin duda, los

microsatélites ó SSRs (Simple Sequence Repeats). Los microsatélites son secuencias

cortas de ADN (generalmente di-, tri-, o tetra-nucleótidos) que se repiten formando

secuencias mayores. El número de repeticiones para un mismo locus del genoma

puede ser muy variable, de forma que cada alelo corresponde con un número de

repeticiones diferente. Los microsatélites ó SSRs están presentes en casi todos los

genomas eucarióticos, no se transcriben a ARN y se consideran neutros desde el

punto de vista de la selección natural. Son muy útiles como marcadores genéticos,

debido a que las secuencias de ADN que los flanquean en el genoma están muy

conservadas entre individuos, variedades y géneros, lo que permite su amplificación

específica por PCR y la transferencia entre especies próximas. Ciertas características

Introducción

13

de los SSRs los hacen deseables para conseguir identificaciones biunívocas en

variedades vegetales (Ibáñez 1999):

- Polimorfismo muy elevado, por tratarse de secuencias hipervariables del

genoma, donde es altamente frecuente la variación en el número de

repeticiones del motivo básico. Esto se traduce en la existencia a priori de

múltiples alelos por cada locus y un alto nivel de heterocigosis. El polimorfismo

se traduce, en términos de identificación, en un gran poder de discriminación.

- Herencia mendeliana codominante, que permite conocer los dos alelos (la vid

es una especie diploide) que presenta un locus en un individuo. Esta

circunstancia es de gran interés para la confección de mapas genéticos y

también para la determinación de genealogías, lo que puede ayudar en

algunos casos a esclarecer con mayor precisión la identidad y origen de

determinados individuos.

- Resultados de interpretación sencilla, en especial cuando se analizan los

productos de la PCR utilizando secuenciadores automáticos, que permiten

evaluar simultáneamente distintos loci para la misma muestra.

- Alta reproducibilidad y transferibilidad de los resultados, pues las condiciones

de PCR para analizar SSRs son restrictivas. Los resultados para una misma

muestra se repiten en distintos tiempos y lugares si se disponen las mismas

condiciones. Gracias a esto, se pueden desarrollar grandes bases de datos de

microsatélites por el transvase de datos entre los distintos laboratorios.

Los microsatélites de ADN nuclear se han empleado de forma extensa para identificar

variedades de vid y como herramientas para la gestión de los bancos de

germoplasma, ya que la detección de entradas redundantes bajo distintos nombres o

sinonimias es esencial de cara a mantener la máxima diversidad posible con el menor

número de accesiones en las colecciones, optimizando así los recursos con que

cuentan las colecciones. Como ya se ha indicado anteriormente, en la vid son muy

frecuentes estos errores en la nomenclatura varietal, causados en parte porque las

variedades recién llegadas a una comarca son a menudo renombradas con apelativos

locales. Después, las variedades preferidas han sido multiplicadas vegetativamente y

su nombre original ha quedado olvidado, perpetuándose los errores.

La eficacia de los SSRs como herramientas independientes para la correcta

identificación varietal y la optimización de recursos de las colecciones de germoplasma

ha quedado plasmada en multitud de estudios en todo el mundo, como por ejemplo los

Introducción

14

de Lopes et al. (1999), Sefc et al. (2000), Dangl et al. (2001), Ibáñez et al. (2003) ó

Martín et al. (2003), por citar algunos. A nivel europeo, a partir de las conclusiones del

proyecto coordinado GENRES#81, se seleccionó y recomendó, debido a su alto poder

discriminatorio conjunto, un set de 6 marcadores microsatélites de ADN nuclear, con

los que caracterizar variedades y así poder elaborar grandes bancos de datos

unificados, en los que cotejar cada nuevo genotipo obtenido y realizar las

identificaciones varietales (This et al. 2004). En la actualidad, Europa cuenta con

amplias y abiertas bases de datos genotípicos de variedades de vid configuradas con

el citado set de marcadores, como por ejemplo el Vitis Internacional Variety Catalogue

(www.vivc.bafz.de).

Más recientemente, se han desarrollado nuevos marcadores, basados en la detección

de variaciones a nivel de un solo nucleótido, cuya enorme abundancia en los genomas

permite una discriminación mucho más fina de las variedades. Estos marcadores

abarcan los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) y los INDELs

(Insertion/Deletion). Una de las grandes ventajas de estos marcadores desde el punto

de vista de la identificación varietal es que pueden utilizarse en combinación con la

tecnología de microarrays (chips de ADN) para analizar miles de puntos polimórficos al

mismo tiempo (SNPlex). A este respecto, las investigaciones efectuadas hasta ahora

han permitido la identificación de más de 70000 SNPs de alta calidad en el genoma de

la vid, y la construcción de un array de 9000 SNPs para el genotipado de variedades

(Myles et al. 2010). La utilización de este array para genotipar la colección de

variedades de vid del USDA (United States Department of Agriculture) ha

proporcionado, recientemente, una visión global de la historia genética de este cultivo

(Myles et al. 2011). Se trata de marcadores de alta calidad, presentes en todo el

genoma, tanto en secuencias codificantes como en no codificantes, lo que los hace,

además, adecuados para estudios de asociación entre genotipos y fenotipos de

calidad o de adaptación y para la elaboración de mapas genéticos, identificación

molecular, o estudios de diversidad y relaciones genéticas (Rafalski 2002a), siendo

mucho más potentes que los marcadores utilizados hasta la fecha.

1.6. ESTRATEGIAS PARA INVESTIGAR LOS ORÍGENES, PEDIGRÍES Y

POSIBLES PARENTESCOS DE LAS VARIEDADES

Los orígenes de la gran mayoría de las variedades de vid son desconocidos (Sefc et

al. 1997). Esto se debe a que, históricamente, el cultivo de la vid ha acompañado las

Introducción

15

migraciones humanas, y a los cambios de nombre sufridos por cultivares provenientes

de tierras con otras lenguas (Dangl et al. 2001). Si bien algunos de los cultivares más

importantes de la actualidad son conocidos desde hace siglos, no fue hasta el s. XIX

cuando los procedimientos de selección y cruzamientos para la obtención de

variedades de vid comenzaron a ser documentados.

En el caso de Castilla y León, y a pesar de la importancia económica de la viticultura

en esta región, se sabe muy poco de los orígenes de sus variedades locales, y de sus

relaciones genéticas. De hecho, muy pocos de los parentescos recogidos en las bases

de datos internacionales, como el Vitis International Variety Catalogue

(www.vivc.bafz.de), implican a cultivares españoles . En algunos casos, se cuenta con

ciertas informaciones históricas que aportan pistas, como aquellas que apuntan a una

posible introducción medieval de variedades de vid francesas en Castilla y León a

través del Camino de Santiago (Cabello et al. 2000), o documentos que sugieren

cruzamientos o descendencias entre variedades autóctonas (Rojas-Clemente 2002

edición facsímil, original de 1807).

Las antiguas viñas silvestres implicadas en los cruces originales no pueden ser hoy en

día identificadas porque, con toda probabilidad, habrán desaparecido. Sin embargo,

los potenciales parentales de las variedades actuales que sean variedades cultivadas

podrían estar aún en cultivo o preservados en las colecciones. Mediante métodos de

análisis molecular, tales parentales (siempre que aún existan) y sus progenies pueden

ser reconocidos, y los pedigríes que describen la historia genética de las variedades

de vid pueden reconstruirse. Para estos propósitos, los SSRs resultan ser marcadores

adecuados debido a su herencia mendeliana codominante. La codominancia permite

conocer los dos alelos (cada uno procedente de un parental) que ocupan cada locus

analizado, de forma que, examinando la composición alélica de un número significativo

de loci microsatélites de un individuo y de sus presuntos parentales, es posible

confirmar o rechazar el parentesco propuesto (Sefc et al. 2001). Cada uno de los dos

alelos que presenta un individuo problema para cada locus ha de estar presente en el

genotipo de uno u otro de los potenciales parentales. No obstante, para alcanzar un

nivel de confianza significativo, es preciso incluir los datos de un alto número de loci no

ligados y un alto número de genotipos (Bowers y Meredith 1997). Gracias a estas

características, los microsatélites de ADN nuclear son herramientas útiles para deducir

las relaciones genéticas, e incluso para reconstruir pedigríes, como ha quedado

demostrado en numerosos estudios (Bowers y Meredith 1997; Sefc et al. 1997; Sefc et

Introducción

16

al. 1998; Meredith et al. 1999; Vouillamoz et al. 2003; Vouillamoz y Grando 2006;

Vouillamoz et al. 2007; Riahi et al. 2009).

Se han ideado diversas estrategias para analizar e interpretar los datos de

microsatélites nucleares en plantas y su nivel de significación a la hora de inferir

relaciones de parentesco y reconstruir pedigríes. En general, todas emplean medidas

matemáticas de distancia genética para estimar la divergencia entre genotipos.

Algunos autores (Bowers y Meredith 1997, Snoussi et al. 2004) han optado por análisis

que combinan los datos de frecuencias alélicas y grado de homología que se obtienen

de un cierto número de genotipos. Tomando tríos de genotipos en función de su nivel

de similitud en los loci analizados, se determina la probabilidad de que uno de ellos

descienda del cruce de los otros dos en contraste con la de ser descendiente del resto

de cruces posibles en la muestra. Otras estrategias optan, basándose también en las

frecuencias alélicas y similitudes genéticas detectadas en los análisis, por la

reconstrucción de genealogías y detección de parentescos por medio de simulaciones

que asumen una serie de condiciones previas, como por ejemplo un modelo de

mutación concreto en función del tipo de marcadores empleados (Vouillamoz y Grando

2006). Unas y otras estrategias se encuentran implementadas en softwares

específicos que trabajan con los genotipos obtenidos para loci microsatélites, como

por ejemplo: IDENTITY 1.0. (Wagner y Sefc 1999), KINGROUP (Konovalov et al.

2004), ó CERVUS (Kalinowsky et al. 2007).

Por otro lado, cuando se pretende estudiar la estructura genética y los orígenes de las

vides actuales, y debido a su excepcionalmente alta tasa de mutación, una de las

mayores observadas en loci nucleares (Goldstein y Pollock 1997), los microsatélites

del ADN nuclear (nuSSRs) reflejan divergencias recientes, pero no las acontecidas en

las fases ancestrales. Además, por la alta heterocigosidad que manifiestan los

genotipos de las vides, conservada por medio de una intensa propagación vegetativa,

los microsatélites del ADN nuclear indican mayor variación a nivel intra-grupal que a

nivel inter-grupal. A ésto se une que las variedades de vid se han trasladado tanto de

unas a otras zonas a lo largo de la historia humana que se hace difícil establecer

tendencias geográficas (Arroyo-García et al. 2006). Por estas razones, para

determinar el origen de una variedad vitícola o buscar trazas de la estructura genética

original del cultivo es recomendable acudir a marcadores microsatélites del ADN

cloroplástico (cpSSRs). Descritos por Powell et al. (1995), los cpSSRs tienen una tasa

de mutación mucho menor que los nucleares, un orden de sus genes muy conservado,

y herencia uniparental, generalmente materna en angiospermas (Provan et al. 2001).

Introducción

17

Precisamente gracias a que el genoma cloroplástico se hereda generalmente a través

del parental materno en angiospermas, los polimorfismos en los cpSSRs de los

parentales pueden contribuir a revelar cuál de ellos ejerció de madre en un cruce (Sefc

et al. 1997), si bien no por sí solos, por no ser lo suficientemente variables, lo que

genera problemas de homoplasia (coincidencia casual en longitud entre alelos

provenientes de diferentes ancestros genéticos), pero sí como complemento de los

microsatélites nucleares. Su herencia uniparental permite, además, y de nuevo en

conjunción con los microsatélites nucleares, dilucidar las contribuciones de los flujos

de polen y semillas a la estructura genética de las poblaciones (Grassi et al. 2006).

Como el ADN cloroplástico es haploide, tiene la mitad de tamaño de población que el

nuclear diploide y, como resultado, los marcadores específicos de cloroplasto deberían

ser buenos indicadores de cuellos de botella históricos, efecto fundador y deriva

genética, lo que los convierte en herramientas muy útiles para los objetivos de la

genética de poblaciones y la comprensión de la evolución de las plantas cultivadas y

su domesticación (Provan et al. 2001).

Por todo ello, los microsatélites del ADN cloroplástico (cpSSRs) se han convertido en

los últimos años en herramientas asiduamente utilizadas para investigar los orígenes,

los fenómenos de domesticación y la filogenia y filogeografía de la especie Vitis

vinifera L. (Grassi et al. 2003; Arroyo-García et al. 2006; Grassi et al. 2006; Imazio et

al. 2006), demostrando que la combinación de microsatélites nucleares y

cloroplásticos es una estrategia adecuada para obtener el máximo de información

sobre los orígenes y evolución de una especie (Heuertz et al. 2004).

1.7. NUEVAS HERRAMIENTAS GENÉTICAS PARA LA MEJORA DE LA

VID

La publicación de los genomas del individuo endogámico PN40024 (Jaillon et al.

2007), derivado de la variedad de vid Pinot Noir, y de la propia variedad heterocigótica

Pinot Noir (Velasco et al. 2007), han propiciado la posibilidad de generar múltiples

herramientas genéticas para investigar la genómica funcional de la vid.

Uno de los principales retos de la viticultura para el siglo XXI será mantener una

producción sostenible de uvas de alta calidad en un medio cambiante (Martínez-

Zapater et al. 2009). En este marco, los análisis genéticos con marcadores

moleculares hasta ahora aplicados en la especie aún requerirían de un desarrollo

Introducción

18

adicional, y la variabilidad genética detectada en los cultivares de Vitis vinifera, así

como en otras especies interfértiles del género Vitis, deben ser profundamente

explotadas para la mejora genética de las variedades clásicas y el desarrollo de

nuevas variedades. Para alcanzar estos objetivos, la identificación y comprensión del

funcionamiento de los genes implicados en la variación fenotípica es fundamental

(Martínez-Zapater et al. 2009, Vieira y Vieira 2010).

Conocida la secuencia de los genomas nuclear y cloroplástico de la especie, se están

comenzando a identificar las zonas de los mismos que están implicadas en los

caracteres distintivos a nivel genético, que diferencian las variedades y las relacionan.

Recientemente, se han identificado algunos genes relacionados con rasgos

agrónomicos, como los que determinan el color de las uvas (Fournier-Level et al.

2010), el aroma característico de las variedades de tipo Moscatel (Emanuelli et al.

2010), o el incremento en tamaño de racimos y retraso de la antesis (Fernández et al.

2010). En este sentido, los nuevos marcadores del tipo SNPs (Single Nucleotide

Polymorphisms), que revelan la variación a nivel de cada nucleótido, están llamados a

constituirse en herramientas definitivas para ilustrar la estructura genética, la filogenia

y la filogeografía de la especie Vitis vinifera L. Los SNPs y las inserciones/deleciones

(INDELs) son los tipos de polimorfismo más abundantes en el ADN, y teóricamente

pueden encontrarse en cualquier genoma eucariótico (Rafalski 2002b). Este tipo de

polimorfismos se están empleando en plantas como marcadores genéticos tanto para

la identificación de cultivares, como para la construcción de mapas genéticos,

evaluación de diversidad, detección de asociación entre genotipo y fenotipo, o la

mejora genética asistida (Lijavetzky et al. 2007). En los últimos años, el desarrollo de

métodos de genotipado de alta capacidad (SNPlex©), que permiten analizar múltiples

polimorfismos a nivel de nucleótido en un solo análisis, ha convertido a los SNPs en

marcadores potencialmente más informativos que los microsatélites, y, por lo tanto,

más atractivos de cara al futuro (De la Vega et al. 2005).

Recientemente, se ha puesto a punto esta tecnología de alta capacidad de genotipado

SNPlex© para el análisis conjunto de múltiples polimorfismos en el genoma nuclear de

la vid (Lijavetzky et al. 2007). Sin embargo, aún no se dispone de herramientas de

similar capacidad para el genoma cloroplástico, el cual, como ya se ha citado

previamente (ver epígrafe 1.5. de este documento), alberga también variabilidad

genética de máximo interés para los estudios evolutivos de la especie.

Introducción

19

La complementación de las extensas bases de datos de microsatélites ya existentes

con los resultados de los análisis más finos y potentes con microarrays de SNPs

representa el futuro inmediato para estudiar a fondo la biología de la vid (Núñez et al.

2004). Por todo ello, se abre en este momento un abanico de posibilidades en el

campo de las herramientas genéticas, tanto para el estudio de los orígenes y evolución

de la vid, como para la mejora genética del cultivo a través del esclarecimiento de los

mecanismos genéticos que regulan la expresión de sus caracteres productivos y de

calidad.

CAPÍTULO 2

OBJETIVOS

Objetivos

222

2. OBJETIVOS

El objetivo principal de esta tesis doctoral es profundizar en el conocimiento de la

composición y diversidad genética del viñedo castellano y leonés, con el fin último de

contribuir a la gestión y conservación eficaz de sus variedades y rasgos diferenciales.

Para ello, se fijaron los siguientes objetivos específicos:

Caracterizar genéticamente las variedades de vid cultivadas en la región, tanto

las conservadas en el Banco de Germoplasma de Vid de Castilla y León

(BGVCyL), como aquellas variedades admitidas por los Consejos Reguladores

de las Denominaciones de Origen y de las distintas áreas de la categoría Vinos

de Calidad Procedentes de una Región Determinada (VCPRD) de Castilla y

León, y, en lo posible, todas las variedades locales minoritarias que siguen en

cultivo en la Comunidad. Todo ello con la intención de detectar sinonimias y

homonimias y encontrar posibles genotipos únicos no incluidos hasta el

momento en las bases de datos internacionales.

Estimar la diversidad genética de las vides cultivadas en la región y determinar

la estructura y la composición del acervo genético de vid de Castilla y León.

Inferir los posibles orígenes y relaciones genéticas de las variedades cultivadas

en la región, tanto entre ellas como con otras variedades nacionales y

foráneas, con especial atención a las francesas, y a su vez con las posibles

vides silvestres que pudieran existir aún hoy en la zona.

Contribuir al desarrollo de nuevas herramientas genéticas que permitan revelar

mutaciones puntuales, poniendo las bases para poder llevar a cabo estudios

genéticos más profundos en la especie: una caracterización varietal más

precisa, asociación genotipo-fenotipo, identificación de genes candidatos, etc.

CAPÍTULO 3

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y Métodos

25

3. MATERIAL y MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

3.1.1. Variedades de vid cultivadas en Castilla y León

Con objeto de acometer el objetivo principal de la tesis, se reunió un total de 470

muestras (Tabla I), que incluyó 41 variedades de vid consignadas y cultivadas en el

Banco de Germoplasma de Vid de Castilla y León (BGVCyL), localizado en la finca de

Zamadueñas (Valladolid) (Figura 3-1) y gestionado por el Grupo de Viticultura del

Instituto tecnológico Agrario de Castilla y León (ITACyL).

Figura 3-1. BGVCyL en Zamadueñas (Valladolid)

Asimismo, se incluyeron 24 muestras en representación de cada una de las

variedades recomendadas por los Consejos Reguladores de las distintas zonas

vitivinícolas con Denominación de Origen o Vinos de Calidad Procedentes de una

Región Determinada (DOs y VCPRDs) de Castilla y León (Figura 3-2).

Material y Métodos

26

Figura 3-2. Regiones con DO ó VCPRD de Castilla y León. Fuente: Departamento de Viticultura del Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León.

Las 405 muestras restantes fueron recolectadas directamente en viñedos de los

diferentes territorios vitivinícolas de la región por los técnicos del Grupo de Viticultura

del ITACyL entre 2006 y 2008. Entre ellas se contaron, además, 27 plantas

procedentes de viñedos situados en la ribera portuguesa de los Arribes del Duero, con

el fin de estudiar sus posibles relaciones con los genotipos del lado español de la

frontera. Asimismo, se añadieron 2 muestras de las variedades más representativas

del territorio nacional, Tempranillo y Garnacha Blanca, procedentes de viñedos de La

Rioja, y una de Palomino Fino de Andalucía, para cotejar su posible identidad con

variedades castellanas supuestamente relacionadas. Todas las plantas se eligieron

según criterios morfológicos, tratando de que las muestras fueran representativas de la

mayor variabilidad posible existente en la región. En algunos casos, las muestras no

estuvieron acompañadas de sus correspondientes nombres locales originales, al no

poderse contactar con todos los propietarios. Por la misma razón, y dado que, en

algunos casos, las fechas de recogida de muestras no coincidieron con el periodo

fenológico de presencia de racimos y bayas, de algunas de las muestras se

desconoce el color de la uva. No obstante, todas las plantas se marcaron y

numeraron, y las muestras se codificaron, antes del análisis, con etiquetas en las que

se recogía la comarca de recogida y el número de planta. La relación de la totalidad de

las muestras se muestra en la Tabla A1 del Anejo I de este documento.

El material recolectado consistió en varas de madera agostada que incluían, al menos,

un par de yemas. Las varas se envolvieron en papel rociado con fungicidas

(Metiltiofanato 18% + Captan 50%) y se almacenaron en frío (4º C) para simular la

vernalización. Transcurridas de 8 a 12 semanas, se favoreció la brotación de sus

Material y Métodos

27

yemas en el laboratorio en recipientes con agua (Figura 3-3), sin control de

temperatura (entre 15 y 25ºC). De las varas con brotes se recolectaron hojas jóvenes,

de las que se cortó aproximadamente 1 cm2, que se introdujo a su vez en tubos

eppendorf, y se conservó a -80º C hasta el momento de la extracción de su ADN. De

las varas que no brotaron se raspó madera superficial, también alrededor de 1 cm2,

que se introdujo también en tubos eppendorf y se conservó, a -80º C, junto con el

resto de material.

Figura 3-3. Varas sometidas a brotación forzada en el laboratorio.

3.1.2. Vides silvestres

La subespecie Vitis vinifera sylvestris se llegó a creer prácticamente extinguida en la

Península Ibérica y en gran parte de Europa (Álvarez y Fernández-Prieto 2000), pero

en los últimos años se ha documentado la pervivencia de ciertas poblaciones de vid

silvestre en España, en especial en la mitad sur peninsular y en algunos valles de la

cuenca Cantábrica. Por otra parte, en recientes trabajos (Arroyo-García et al. 2006;

Imazio et al. 2006) se sugiere el extremo occidental europeo como posible centro de

domesticación secundario de Vitis vinifera L. Teniendo en cuenta estos hallazgos y el

hecho de que ciertos genotipos de entre los analizados en las primeras fases de la

Material y Métodos

28

caracterización molecular presentaban alelos muy poco frecuentes en los estudios

genéticos sobre vides españolas consultados, se decidió sondear zonas determinadas

de Castilla y León en busca de vides silvestres (Vitis vinifera ssp. sylvestris).

Sin embargo, pocas zonas castellano-leonesas cumplen los requisitos para albergar

esta subespecie, a saber: inviernos suaves, zonas permanentemente irrigadas, y

abundante vegetación riparia, por lo que la búsqueda se centró en las comarcas de

Arribes del Duero (Salamanca) y Valle de Mena (Burgos), por tratarse de las que

reunían, a priori, las condiciones más propicias. Se trata, además, de zonas vitícolas

tradicionales en Castilla y León, por lo que las riberas sondeadas se encontraban

rodeadas de viñedos convencionales. Los muestreos se acometieron durante la

primavera y verano de 2007. Aunque el número de vides silvestres detectado fue alto,

tan sólo en dos localizaciones de la comarca de Arribes del Duero se encontraron

individuos con características morfológicas compatibles con las descritas para Vitis

vinifera ssp. sylvestris. El resto de plantas correspondieron, de acuerdo a sus

características morfológicas, con diferentes especies americanas del género Vitis,

habitualmente empleadas como portainjertos resistentes a la filoxera, asilvestradas en

las riberas prospectadas.

La primera localización con vides silvestres potencialmente genuinas se detectó en el

término municipal salmantino de Aldeadávila (Lat. 41º 10’ N, Long. 6º 30’ O, Alt. de

200 a 400 m.s.n.m.). En ella se halló una población de unas 20 vides silvestres de

diferentes edades, establecidas principalmente sobre almez (Celtis australis), de entre

las que se tomaron 3 muestras (codificadas en el estudio como W1, W2, y W3). Dos

de las muestras correspondieron a machos y una a hembra, y cada una se recogió a

un nivel diferente de la ladera que las albergaba. La segunda localización se detectó

en Mieza (Salamanca), a unos 5 kilómetros de la primera, encontrándose una sola

planta, macho, de la que se tomó la muestra codificada como W4 (Figura 3-4).

Material y Métodos

29

Figura 3-4. A: Individuo silvestre W1, Aldeadávila (Salamanca). B: Individuo silvestre W1, Aldeadávila (Salamanca). C: Individuo silvestre W3, Aldeadávila (Salamanca). D: Individuo silvestre W4, Mieza (Salamanca).

Estas cuatro muestras (Tabla 3-1) se utilizaron como aproximación para sondear la

naturaleza de las vides silvestres supervivientes en Castilla y León y su posible

participación en el actual acervo genético de las variedades autóctonas de cultivo que

rodean su hábitat.

Tabla 3-1. Material vegetal de vid recopilado en ambiente salvaje.

Código Nombre de la muestra Sexo Localización de la muestra

W1 Individuo silvestre 1 Masculino Aldeadávila (Salamanca)

W2 Individuo silvestre 2 Femenino Aldeadávila (Salamanca)

W3 Individuo silvestre 3 Masculino Aldeadávila (Salamanca)

W4 Individuo silvestre 4 Masculino Mieza (Salamanca)

A

B

D

C

Material y Métodos

30

3.1.3. Variedades y especies de vid utilizadas para identificar SNPs

cloroplásticos

Con el fin de representar lo mejor posible la variación existente en el ADN cloroplástico

de la vid, se contó con muestras de ADN de 7 variedades diferentes (Tabla 3-2),

representativas de los 5 principales clorotipos identificados mediante microsatélites

nucleares en la especie Vitis vinifera L. (Arroyo-García et al. 2006). Entre ellas, se

contó con variedades de vino, como Cabernet Sauvignon, y de uva de mesa, como

Sultanina, contabilizándose dos representantes por cada uno de los cuatro clorotipos

mayoritarios. Como único representante del clorotipo G, exótico en la Península

Ibérica, se eligió la muestra codificada como Bi20, uno de los genotipos castellano-

leoneses referenciados por primera vez en el presente trabajo.

Con objeto de detectar diferencias interespecíficas a nivel de género, se realizó el

mismo trabajo con muestras de 10 especies diferentes del género Vitis (Tabla 3-2).

Estas muestras procedieron de plantas conservadas en la Colección de Germoplasma

de “El Encín” (IMIDRA, Alcalá de Henares, Madrid).

Tabla 3-2. Material vegetal utilizado para la localización de SNPs en ADN de cloroplasto de vid.

Especie Variedad Código Clorotipo Cabernet Sauvignon CBS D Garnacha GAR A Tempranillo TEM A Sultanina Blanca SUB C Bi20 Bi20 G Jaén Negro JAN D Merlot MER C Brujidera BRJ B

Vitis vinifera

Treixadura TRX B Vitis californica - calif - Vitis aestivalis - aest - Vitis vinifera - vin - Vitis arizonica - ariz - Vitis rupestris - rup - Vitis cordifolia - cordif - Vitis berlandieri - ber - Vitis amuriensis - amur - Vitis riparia - ripar - Vitis cinerea - ciner -

Material y Métodos

31

3.2. EXTRACCIÓN DE ADN

A partir de los fragmentos de hoja conservados a -80º C referidos en los puntos 3.1.1.

y 3.1.3., se procedió a la extracción de ADN siguiendo el protocolo de Doyle y Doyle

(1990), modificado por Torres et al. (1993), utilizando, en un paso previo, un molino

mezclador Mixer Mill 301 (Retsch) (Figura 3-5), para homogeneizar el material vegetal

en el tampón de extracción. En el caso del material destinado al desarrollo de SNPs

del genoma cloroplástico de la vid (ver punto 3.1.3.), la extracción de ADN genómico

total se realizó a partir de hojas jóvenes, utilizando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen),

de acuerdo a la metodología seguida por Lijavetzky et al. (2006). El ADN se conservó

a -20º C hasta el momento de su utilización.

Figura 3-5. Molino mezclador MM301 de Retsch

3.3. GENOTIPADO

3.3.1. Elección de Microsatélites

Para la caracterización genética e identificación varietal del material vegetal se

eligieron los 6 marcadores microsatélites nucleares recomendados por el Proyecto

Europeo GENRES081 (This et al. 2004) para estos fines, y con los cuales se han

configurado las principales bases de datos internacionales (European Vitis Database -

www.genres.de/vitis/vitis.htm, Vitis Internacional Variety Catalogue -

Material y Métodos

32

www.vivc.bafz.de). Dichos marcadores corresponden a los siguientes loci nucleares:

VVS2 (Thomas y Scott 1993), VVMD5 y VVMD7 (Bowers et al. 1996), VrZAG47,

VrZAG62 y VrZAG79 (Sefc et al. 1999), oficializados recientemente por la OIV como

descriptores de referencia, e identificados con los números del OIV801 al OIV806 en

sus tablas (O.I.V. 2009). Con este set de marcadores nucleares se genotiparon las 470

muestras recopiladas, discriminándose los genotipos diferentes y descartándose los

redundantes.

Los genotipos se compararon con los datos de microsatélites del Vitis Internacional

Variety Catalogue (www.vivc.bafz.de), y los de los estudios de Crespan et al. (1999),

Crespan y Milani (2001), Lefort y Roubelakis-Angelakis (2000), Aradhya et al. (2003),

Ibáñez et al. (2003), Martín et al. (2003, 2006), Hvarleva et al. (2004), Almadanim et al.

(2007), Gago et al. (2009) y Zinelabidine et al. (2010). Los genotipos de variedades

conocidas a nivel internacional, como Tempranillo, Garnacha, Cabernet Sauvignon,

Merlot, ó Palomino, presentes en la muestra estudiada, sirvieron para permitir

establecer la correspondencia alélica en las comparaciones, tal y como proponía el

Proyecto europeo GENRES081 (This et al. 2004).

Por su parte, para abordar el objetivo de estudiar en profundidad las relaciones

genéticas existentes entre los genotipos castellanos y leoneses, su estructura y

posibles orígenes, todos los genotipos discriminados en la fase anterior fueron

analizados con un set de 16 loci microsatélites nucleares (nuSSRs) adicionales (ver

Anejo IV): VVMD21, VVMD24, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD32 (Bowers et al.

1999b); VVIb01, VVIn16, VVIn73, VVIp31, VVIp60, VVIq52, VVIv37, VVIv67

(Merdinoglu et al. 2005), VMC1b11 (Adam-Blondon et al. 2004), y VMC4f3 (Di

Gaspero et al. 2000). Los 22 loci resultantes (ya que a estos 16 hay que añadir la

información alélica de los 6 loci empleados en la fase anterior) se encuentran

físicamente distribuidos entre los 19 grupos cromosómicos que conforman el genoma

nuclear de la vid, de tal forma que 20 de ellos (todos menos VrZAG62 y VrZAG79) no

están ligados (Adam-Blondon et al. 2004), lo que les confiere una mayor significación

genética en conjunto. De hecho, este set de 20 marcadores ya se ha mostrado muy

robusto en análisis de paternidad en vid (Di Vecchi-Staraz et al. 2009; Riahi et al.

2009).

Por último, se genotiparon las muestras previamente discriminadas con 9 loci

microsatélites del genoma cloroplástico, para generar información adicional acerca de

los orígenes geográficos potenciales de los genotipos del estudio, por comparación

Material y Métodos

33

con los datos aportados por el estudio de clorotipos eurasiáticos de Arroyo-García et

al. (2006). En dicho estudio se describen a su vez los 9 marcadores cloroplásticos

antes citados, que se refieren a continuación: cpSSR3, cpSSR5, cpSSR10, NTCP-8,

NTCP12, ccSSR5, ccSSR9, ccSSR14, y ccSSR23. Con posterioridad a los análisis

llevados a cabo en el presente trabajo, se ha determinado que 5 de ellos (cpSSR3,

cpSSR5, cpSSR10, ccSSR9 y ccSSR23) aportan la misma información que el total de

los 9, de modo que los microsatélites NTCP-8, NTCP-12, ccSSR5 y ccSSR14 son

redundantes (This et al. 2011).

3.3.2. Diseño de cebadores para secuenciar regiones cloroplásticas

variables

La secuencia completa de ADN del genoma cloroplástico de Vitis vinifera L. (Wheeler

et al. 2006) se obtuvo de la base del National Center for Biotechnology Information

(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene). La secuencia se descargó al programa BioEdit

v. 7.0.5.3. (Hall 1999). Dado que los genomas cloroplásticos se encuentran más

conservados que los nucleares, y son muy similares entre especies próximas, la

búsqueda de regiones polimórficas se centró en las zonas no codificantes (intrones y

espacios intergénicos), más variables. Los cebadores específicos para la amplificación

de estas regiones se diseñaron sobre los exones que las flanquean. El diseño de los

cebadores se realizó utilizando el programa Oligo Explorer (Gene Link, Inc.), según los

siguientes criterios:

Longitud del cebador ~ 20 bp (pares de bases).

Temperatura necesaria para romper dímeros (hibridaciones de los

cebadores entre sí) en cada ciclo de PCR ≤ 12º C.

Contenido porcentual de bases [G + C] entre 30% y 70%.

Contenido porcentual de bases [G + C] en las últimas 5 bases de la cola 3’

≤ 40%.

Temperatura de hibridación entre 59º C y 61º C.

Diferencia máxima de temperatura de hibridación entre cebadores del

mismo par = 2º C.

Tamaño de la región a amplificar entre 250 bp y 800 bp.

Diferencia porcentual entre bases G y C en el amplicón ≤ 10-15%.

Material y Métodos

34

Una vez diseñados los cebadores de las distintas regiones, y con el fin de facilitar la

posterior secuenciación directa de los productos de PCR obtenidos, se añadieron a los

mismos las secuencias iniciadoras homólogas M13 forward (5’-

TGTAAAACGACGGCCAGT-3’) y M13 reverse (5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’), del

bacteriófago M13, habitualmente utilizadas en secuenciación.

Con esta estrategia se buscó complementar el análisis previamente iniciado en el

Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas

(CNB del CSIC), en el que ya se habían desarrollado cebadores para 16 regiones

variables del genoma cloroplástico de la vid, poseedoras de un SNP comprobado cada

una (Figura 3-6). Estos 16 SNPs no permitieron discriminar todos los clorotipos

previamente establecidos mediante microsatélites (Arroyo-García et al. 2006), de

hecho algunos resultaron monomórficos tras analizarse en diferentes variedades, y de

ahí la necesidad de continuar la exploración del resto del genoma cloroplástico de la

especie.

Material y Métodos

35

Figura 3-6. Localización de los 16 SNPs desarrollados previamente sobre el mapa del genoma cloroplástico de Vitis vinifera L. Entre paréntesis, los clorotipos discriminados por cada uno. Fuente original del mapa: Jansen et al. (2006).

3.3.3. Amplificación por PCR

Las condiciones del análisis y concentraciones de los reactivos para la amplificación

de los loci microsatélites vienen reflejadas a continuación, así como en los apartados

de Materials and Methods de los Anejos II, III y IV de este documento, y fueron

establecidas tras los correspondientes ensayos de puesta a punto en el Laboratorio de

Diagnóstico Genético de la ETS.II.AA. de Palencia.

En el caso del análisis de loci microsatélites, las reacciones se llevaron a cabo en un

volumen final de 10 µL, con 2 µL de ADN de la muestra a una concentración de 5 a 20

Material y Métodos

36

ng, y 8 µL de una mezcla conteniendo 200 µM de cada dNTP, 0,1 µM de cada cebador

(uno de cada pareja fue marcado con un fluorocromo para la posterior detección de las

secuencias amplificadas en la fase de electroforesis), 2,5 mM de MgCl2 y 0,2 U de

ADN-polimerasa Taq en un tampón de reacción 1X (Applied Biosystems, Foster City,

CA). Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador PTC-100 (MJ

Research, Watertown, MA). El programa de amplificación se determinó

experimentalmente en laboratorio, a partir del propuesto por Borrego et al. (2000). Los

productos de amplificación (2 µL) se suspendieron en 20 µL de formamida desionizada

y se les añadió 0,4 µL de DNA size standard (GeneScan 500-ROX, Applied

Biosystems, Foster City, CA). Esta mezcla se desnaturalizó a 95º C durante 3 minutos

antes de pasar al analizador genético. Para evitar errores de asignación de alelos,

cada muestra se amplificó al menos dos veces, de forma independiente.

En el caso de los cebadores diseñados específicamente para la detección de SNPs

cloroplásticos, las amplificaciones se llevaron a cabo, para cada especie y variedad,

en volúmenes de reacción de 25 µL, que incluían 20 ng de ADN total, y 20 µL de

mezcla de reacción en solución tampón ó Buffer 1x, compuesta por MgCl2 a 1,5 mM,

ADN polimerasa Amplitaq Gold a 1 U/µL (Applied Biosystems, Foster City, California,

USA), desoxirribonucleótidos (dNTPs) a 0,2 mM (GE Healthcare, Hemel Hempstead,

Reino Unido), los cebadores previamente diseñados, a una concentración 0,2 mM, y

agua MilliQ estéril hasta completar el volumen. Las amplificaciones se realizaron en un

termociclador GeneAmp PCR System 9700, con un programa consistente en 10

minutos de desnaturalización inicial a 95º C, seguida de 10 ciclos de 1 minuto de

desnaturalización a 94º C, 1 minuto de hibridación de los cebadores a 65º C, y 1

minuto de extensión a 72º C. En cada ciclo se reducía 1º C la temperatura de

hibridación, según la técnica conocida como touch-down, reduciéndose así la misma

desde los 65º C iniciales hasta los 55º C en el último ciclo. Después seguían otros 35

ciclos de 1 minuto a 94º C, 1 minuto a 55º C, y 1 minuto a 72º C y, a continuación, una

extensión final de 7 minutos a 72º C.

3.3.4. Electroforesis y ajuste de alelos

Los fragmentos de ADN correspondientes a los 22 microsatélites nucleares y 9

cloroplásticos amplificados mediante PCR se separaron por medio de electroforesis

capilar con un analizador genético ABI PRISM 310® (Applied Biosystems, Foster City,

CA, Figuras 3-7 y 3-8). El registro de los amplímeros y la estimación de su tamaño se

Material y Métodos

37

llevaron a cabo por medio del software GeneScan v. 3.7 (Applied Biosystems, Foster

City, CA, Figura 3-9).

Figura 3-7. Analizador genético ABI Prism 310®(Applied Biosystems, Foster City, Calif.).

Figura 3-8. Analizador genético ABI Prism 310®(Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Interior y capilar.

Material y Métodos

38

Figura 3-9. Fragmentos de ADN (picos) obtenidos por amplificación de los loci microsatélites y estimación de sus tamaños con el programa GeneScan® v.3.7.(Applied Biosystems, Foster City, Calif.).

El ajuste de alelos en función de los datos obtenidos por el software se realizó a través

del método de los sorted alleles plots, descrito por Li et al. (2001), y basado en la

elaboración de histogramas y gráficas de escalonamiento de los grupos de datos

(Figuras 3-10 y 3-11).

Material y Métodos

39

Locus VMC1b11

Alelos

frec

uenc

ia

163 165 167 169 171 173 175 177 179 181 183 185 187 189 191 193 195

0

2

4

6

8

10

Figura 3-10. Ejemplo de histograma de frecuencias para asignación de alelos. locus: VMC1b11.

DEA VMC1b11

163165167169171173175177179181183185187189191193195

0 20 40 60 80 100

Figura 3-11. Gráfica elaborada por el método de los alelos ordenados. locus: VMC1b11.

Material y Métodos

40

Por su parte, las amplificaciones de regiones susceptibles de albergar SNPs en el

genoma cloroplástico se verificaron por electroforesis de los productos de PCR en

geles de agarosa al 1% en TBE 0,5x, teñidos con Gel-Red (Biotium, Inc.), y

visualizados bajo luz ultra-violeta.

3.3.5. Secuenciación y detección de SNPs

Previamente a su secuenciación, 5 µL de cada reacción de amplificación verificada se

sometieron a purificación mediante tratamiento enzimático con ExoSAP-IT (USB

Corporation). Las muestras así preparadas fueron secuenciadas en la Unidad de

Genómica del Parque Científico de Madrid (Campus de Cantoblanco, Universidad

Autónoma de Madrid), valiéndose de los iniciadores universales M13 forward y M13

reverse, en un secuenciador ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, Foster City,

California). La identificación de las bases, y los recortes y alineamiento de los

cromatogramas ABI obtenidos se realizó utilizando el software SeqScape v. 2.5

(Applied Biosystems, Foster City, California). Los polimorfismos del tipo SNPs o

INDELs detectados al alinear las secuencias se verificaron manualmente con la ayuda

del programa Bioedit v. 7.0.5.3. La identificación de las regiones codificantes y no

codificantes se realizó por medio del programa BLASTX, utilizando los servidores del

NCBI (National Center for Biotechnology Information -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y

del GENOSCOPE BLAST (http://www.genoscope.cns.fr/cgibin/blast_server/).

3.4. ANÁLISIS DE DATOS

3.4.1. Parámetros genéticos de los microsatélites

Con el fin de evaluar la capacidad discriminatoria y la adecuación a los objetivos del

set de loci microsatélites GENRES081, empleados para discriminar e identificar

genotipos, se estimaron ciertos parámetros informativos. Entre ellos, los siguientes:

número de alelos por locus (Na), frecuencias alélicas, heterocigosis observada (HO),

heterocigosis esperada bajo las condiciones de equilibrio de Hardy-Weinberg (HE,

equivalente a diversidad génica) (Nei 1973), frecuencia de alelos nulos (r) (Brookfield

1996) y probabilidad de identidad (PI) (Paetkau et al. 1995), se calcularon a través de

los programas IDENTITY 1.0. (Wagner y Sefc 1999) y Microsat Toolkit (Park 2001),

con los que a su vez se estimó la incidencia de sinonimias en la muestra.

Material y Métodos

41

El parámetro poder de discriminación (D) se calculó por medio de la siguiente fórmula

(Tessier et al. 1999): 21 iPPD , en la que Pi es la frecuencia de cada genotipo i.

Los parámetros D y PI describen, aunque con distinta base, la probabilidad de que dos

variedades no relacionadas puedan ser distinguidas por un determinado marcador. D

se basa en las frecuencias genotípicas, mientras que PI se basa en las frecuencias

alélicas. Por tanto, se consideran mejores marcadores aquellos microsatélites que

presenten simultáneamente un elevado D y una reducida PI.

Por su parte, la base de datos de genotipos completos de 22 loci permitió, a su vez,

realizar una evaluación indirecta de la capacidad del set de 6 microsatélites

GENRES081 para discriminar las variedades castellano-leonesas bajo estudio. Los

parámetros PI y D funcionan bajo la asunción de que los cultivares no están

relacionados y, por lo tanto, presuponiendo que tanto los loci como los genotipos son

independientes. A través de Microsoft Excel, se compararon entre sí los genotipos

obtenidos y se contabilizó el número de loci idénticos en cada par comparado. Con el

resultado de los conteos par a par se construyó una matriz, en base a la cual pudo

identificarse el número medio de genotipos coincidentes para 6 o más loci de entre los

22 analizados.

3.4.2. Estimadores de diversidad genética

La diversidad de la muestra castellano-leonesa estudiada se evaluó a través de los

parámetros conocidos como diversidad génica ó heterocigosis esperada (HE) (Nei

1973), heterocigosis observada (HO), y probabilidad de identidad (PI) (Paetkau et al.

1995), que fueron calculados utilizando el programa IDENTITY 1.0 (Wagner y Sefc

1999), partiendo de las frecuencias alélicas obtenidas para cada locus.

Con el fin de establecer comparaciones legítimas con las diversidades obtenidas en

estudios similares, realizados sobre muestras de vides cultivadas de otras regiones de

la Península Ibérica, los cálculos en esta sección se realizaron únicamente sobre el set

de 6 loci GENRES, utilizado también en dichos estudios, y se excluyeron de los

mismos los genotipos obtenidos de las muestras silvestres.

Material y Métodos

42

3.4.3. Análisis de estructura

Partiendo de los datos genotípicos de los 22 nuSSRs obtenidos para las muestras no

redundantes, se utilizó el programa STRUCTURE v. 2.1 (Pritchard et al. 2000) para

inferir si en ellas existía una posible estructuración en grupos genéticos.

El diseño del análisis constó de 10 carreras con burn-in de 50000 y longitud de 100000

iteraciones para cada número de grupos propuesto, variando entre K=1 y K=10,

utilizando el modelo admixture, que permite que los genotipos puedan tener

ascendencia en más de uno de los grupos genéticos resultantes y establecer

correlación entre las frecuencias genéticas de los distintos grupos. Para determinar el

número óptimo de grupos, K, que mejor se adapta a la estructura de la muestra, se

empleó del método delta K (Evanno et al. 2005), mientras que las proporciones de

ascendencia de cada genotipo para cada grupo genético propuesto, que permiten la

asignación final de la muestra a uno u otro, se consensuaron entre las carreras del

parámetro K candidato usando el programa CLUMPP (Jakobsson y Rosenberg 2007).

La diferenciación genética entre los grupos se calculó, analizando par a par los

genotipos de unos y otros, mediante el estadístico FST (Weir y Cockerham 1984),

utilizando el programa FSTAT v. 2.9.3 (Goudet 1995). La significación estadística de

esta diferenciación se estimó a través de los tests exactos implementados en

GENEPOP 4.0 (Raymond y Rousset 1995). El polimorfismo relativo de cada grupo

genético se computó en términos de diversidad génica (HE), calculada con IDENTITY,

y de riqueza alélica (As), esto es, el número de alelos esperado en una muestra de un

tamaño dado, que se calculó con FSTAT v. 2.9.3.

Asimismo, se llevaron a cabo análisis factoriales de correspondencia (FCA), tanto a

nivel individual como por colectivos, separando en este caso los genotipos en función

de su procedencia geográfica y de su uso, utilizando para ello el programa GENETIX

(www.genetix.univ-montp2.fr/genetix/intro.htm). El propósito de estos análisis fue

averiguar cuáles son los principales factores de variación entre las vides analizadas y

apreciar gráficamente las distancias genéticas entre genotipos en respuesta a los

mismos.

Por último, se realizaron análisis de la varianza molecular anidados (AMOVA) sobre

los genotipos completos, valorando la influencia de los factores de variación

propuestos sobre la varianza existente entre las vides castellano-leonesas. Estos

Material y Métodos

43

análisis se llevaron a cabo utilizando el programa ARLEQUIN 3.1

(http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3).

3.4.4. Análisis de parentesco

Se calcularon las distancias genéticas entre los genotipos obtenidos para 22 nuSSRs

nucleares, según las medidas DA (Nei et al. 1983) y DC (Cavalli-Sforza y Edwards

1967), elegidas por haber sido consideradas las más apropiadas para reflejar

topologías correctas en los árboles filogenéticos (Takezaki y Nei 1996), en especial

cuando se trata de genotipos muy estrechamente relacionados, como es el caso de las

variedades de vid, y con independencia del modelo de mutación (Goldstein y Pollock

1997). Se considera que estas medidas de distancia se ajustan adecuadamente a los

objetivos, ya que, en el caso de los microsatélites nucleares, no hay consenso sobre

su modelo mutacional (Jarne y Lagoda 1996). Asimismo, para las variedades de vid,

se estima que han transcurrido muy pocas generaciones desde su domesticación

(Arroyo-García et al. 2006), por lo que los tiempos evolutivos de divergencia a nivel

varietal son reducidos.

Basados en dichas medidas de distancia, y utilizando los métodos Neighbour-Joining

(Saitou y Nei 1987) y UPGMA (Sneath y Sokal 1973), implementados en el programa

POPULATIONS (Langella 2002), se construyeron cuatro dendrogramas consenso, uno

por cada combinación de medida de distancia y método de agrupamiento, que fueron

representados gráficamente mediante el programa TREEVIEW (Page 1996). De entre

ellos, se escogió el dendrograma con mayor número de relaciones significativas de

acuerdo a sus valores de bootstrap (calculados en 1000 iteraciones). Esta técnica

consiste en reanalizar la muestra de genotipos un número determinado de repeticiones

(iteraciones), modificando cada vez, de forma aleatoria, los datos en los mismos, de

forma que se generen nuevos dendrogramas. Las ramas del árbol que se mantengan

iteración tras iteración a pesar de las modificaciones aleatorias de datos presentarán

proposiciones de relación genética más robustas que aquellas que varíen. El

porcentaje de veces en que se repite cada rama propuesta en las iteraciones se

conoce como el bootstrap de la misma.

Por último, se calculó el porcentaje de alelos compartidos y el estimador de relación r

(Queller y Goodnight 1989) para cada par posible de genotipos, y se asignó una

categoría potencial de parentesco a través de tasas de probabilidad (Likelihood Ratios

Material y Métodos

44

– LRs) obtenidas mediante simulaciones de MCMC (Monte Carlo Markov Chains),

realizadas con el programa KINGROUP (Konovalov et al. 2004).

3.4.5. Identificación de SNPs

Las secuencias homólogas amplificadas de cada una de las 9 variedades estudiadas

se alinearon y compararon para detectar la frecuencia y posición de los polimorfismos

SNP ó INDEL, por medio del programa BIOEDIT (Hall 1999). Posteriormente, se

configuró un patrón clorotípico para cada variedad, compuesto por la serie ordenada

de bases nitrogenadas que presentaban en cada una de las posiciones polimórficas

detectadas, y se comprobó visualmente la coincidencia o desacuerdo entre esos

patrones para esos puntos. El mismo procedimiento se siguió con las secuencias

obtenidas de las amplificaciones hechas sobre las 10 especies del género Vitis.

3.4.5.1. SNPs en variedades

Se calcularon los siguientes parámetros: frecuencia de SNPs e INDELs en las

regiones cloroplásticas resecuenciadas, y ratio transición/transversión en los SNPs

detectados. Los resultados de estos parámetros se compararon con los de estudios

previos sobre el genoma nuclear de la misma especie (Vitis vinifera L.) y con los de

otros trabajos realizados sobre los genomas cloroplásticos de distintas especies

vegetales.

Con el objeto de inferir la historia evolutiva de las 9 variedades analizadas, y utilizando

el programa MEGA4 (Tamura et al. 2007), se construyó un árbol filogenético

consenso, basado en las distancias genéticas entre las secuencias de cada par

posible de los diferentes patrones cloroplásticos, según el método UPGMA (Sneath y

Sokal 1973), utilizando un algoritmo del tipo nd. Las posiciones polimórficas con algún

dato ausente se excluyeron del cálculo de distancias. Los árboles consenso se

infirieron tras reanalizarse mediante bootstrap de 500 réplicas. Las particiones que se

reprodujeron en menos de un 50 % de las réplicas se mostraron colapsadas en los

dendrogramas. La longitud de las ramas en el dendrograma se escaló en función de

las distancias genéticas halladas entre los patrones cloroplásticos discriminados.

Material y Métodos

45

3.4.5.2. SNPs en especies de la familia Vitaceae

En el caso de las 10 especies distintas de la familia Vitaceae analizadas, se utilizó el

programa MEGA4 (Tamura et al. 2007) para construir un árbol filogenético, basado en

las distancias genéticas entre las secuencias de cada par posible de los diferentes

patrones cloroplásticos, según el método UPGMA (Sneath y Sokal 1973), y utilizando

un algoritmo del tipo nd. Las posiciones ambiguas entre cada par de secuencias se

eliminaron del cálculo de distancias. Se calculó un valor de bootstrap para cada

relación propuesta, con 500 réplicas. Al igual que en el caso del análisis del punto

3.4.5.1., las particiones que se reprodujeron en menos de un 50 % de las réplicas se

mostraron colapsadas en el dendrograma, y la longitud de las ramas representó las

magnitudes de las distancias evolutivas entre los patrones cloroplásticos

discriminados.

CAPÍTULO 4

RESULTADOS

Resultados

48

4. RESULTADOS

4.1. CARACTERIZACIÓN GENÉTICA E IDENTIFICACIÓN VARIETAL

4.1.1. Parámetros genéticos de los marcadores: índices de diversidad

El set de 6 nuSSRs recomendados por el Proyecto Europeo GENRES081 permitió

discriminar 122 genotipos diferentes en la muestra analizada, 118 entre las cultivadas

y 4 entre las silvestres. Para evitar redundancias que sesgaran la evaluación del

polimorfismo de los marcadores, sólo estos 118 genotipos discriminados entre las

muestras de vides cultivadas se incluyeron en los cálculos de frecuencias alélicas

(Tabla 4-1) y parámetros genéticos (Tabla 4-2).

Tabla 4-1. Tamaños de los alelos (pares de bases) y frecuencias alélicas (%) de los 6 loci GENRES para la muestra estudiada. Los alelos más frecuentes del estudio (>25%) se destacan en negrita.

VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 VrZAG62 VrZAG79 Alelo Frec. Alelo Frec. Alelo Frec. Alelo Frec. Alelo Frec. Alelo Frec. 119 0,4 217 2,1 230 2,1 172 1,3 179 0,4 235 0,4 121 0,4 221 17,7 232 0,9 176 14,7 180 0,4 237 2,6 125 0,4 223 10,3 234 1,3 178 21,1 184 15,8 240 9,0 129 21,4 225 0,4 236 38,9 180 6,5 186 36,3 242 6,8 131 5,6 227 8,6 240 13,7 182 15,5 190 2,6 244 20,1 133 7,3 229 12,1 242 0,4 186 22,4 192 13,7 246 2,6 135 3,4 231 18,1 244 6,8 188 2,2 194 6,8 248 26,9 139 15,4 234 18,1 246 15,4 191 15,1 196 0,4 252 5,6 141 16,7 235 9,0 248 3,0 197 0,9 198 6,8 254 13,7 144 1,7 240 1,7 250 6,0 202 0,4 200 1,3 256 9,4 146 1,7 242 0,4 252 0,9 202 15,0 258 3,0 148 19,7 247 0,9 254 7,3 204 0,4 153 2,1 261 0,4 258 0,4 155 3,8 260 2,6

262 0,4

Tabla 4-2. Parámetros genéticos obtenidos por los microsatélites del set GENRES en la muestra. Na HE HO D PI

VVS2 14 0,852 0,914 0,947 0,072 VVMD5 13 0,861 0,836 0,960 0,066 VVMD7 15 0,790 0,821 0,933 0,104 VVMD27 10 0,832 0,905 0,931 0,095 VrZAG62 12 0,792 0,846 0,923 0,117 VrZAG79 11 0,842 0,872 0,949 0,078 Media 12,5 ± 1,87 0,828 ± 0,012 0,866 ± 0,013 0,940 0,089 Acumulado 75 4,3 x 10-7

Los alelos más frecuentes de este estudio fueron el VVMD7-236, el VrZAG62-186, y el

VrZAG79-248. El número de alelos por locus (Na) osciló entre 10 (VVMD27) y 15

(VVMD7), con una media de 12,5 alelos/locus en la muestra analizada. La diversidad

Resultados

49

génica o heterocigosis esperada (HE) varió entre 79,0% de VVMD7 y 86,1% de

VVMD5, con una media de 82,8%, mientras que la heterocigosis observada (HO) osciló

entre el 83,6% de VVMD5 y el 91,4% de VVS2. Sólo uno de los seis loci, VVMD5,

mostró una HO menor que la que se esperaría bajo las condiciones de equilibrio de

Hardy-Weinberg (HE), por lo que es posible que existan alelos nulos no detectados en

este locus, ya que su índice de frecuencia de alelos nulos (Fr, datos no mostrados)

resultó positivo, aunque muy próximo a cero.

La probabilidad de identidad (PI) fue muy reducida para todos los loci, oscilando entre

0.066 (VVMD5) y 0.117 (VrZAG62). La PI combinada derivada de las frecuencias

alélicas obtenidas para los 6 loci o, dicho de otro modo, la probabilidad acumulada de

que dos cultivares no emparentados puedan compartir el mismo genotipo, estuvo en

un rango de 10-7 en el presente estudio, por lo que, de acuerdo al umbral fijado por

Sefc et al. (2001), los marcadores utilizados resultan muy eficaces para identificar

sinonimias en la muestra. El mayor poder de discriminación (D) correspondió al locus

VVMD5 (96,0%), mientras que el menor lo presentó el locus VrZAG62 (92,3%), siendo

la media de 94,0%, indicativa de microsatélites altamente discriminatorios de acuerdo

a las consideraciones de Tessier et al. (1999).

Sin embargo, la posterior comparación par a par de los genotipos de 22 loci de las 118

variedades discriminadas (comparaciones no mostradas) puso en evidencia que cada

una de ellas resultaba idéntica, en 6 o más loci, a una media de 3,57 variedades de

entre las 116 restantes, lo que sugiere que estas variedades están relacionadas

genéticamente entre sí, por lo que incumplirían la premisa asumida para el cálculo de

los parámetros PI y D (ver punto 3.4.1.).

4.1.2. Adscripción de genotipos: sinonimias y homonimias

El análisis con los 6 loci GENRES condujo a la discriminación de 118 genotipos

diferentes entre 468 muestras de vides cultivadas de Castilla y León correctamente

amplificadas, por lo tanto, 351 de ellas presentaron genotipos redundantes. Las

redundancias se dividen entre muestras con genotipo idéntico al de uno de los

discriminados pero nombre diferente (sinónimos), muestras con idénticos genotipo y

nombre (repeticiones), y muestras con idéntico genotipo pero recogidas sin nombre

(repeticiones sin nombre). Además, se contabilizaron 77 casos de homonimia, y un

mínimo de 33 errores de nomenclatura.

Resultados

50

Tabla 4-3. Genotipos de las 122 variedades discriminadas para los seis loci recomendados por el proyecto europeo GENRES081.

Genotipo VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 VrZAG62 VrZAG79 Bi1 129 148 229 234 236 240 178 186 186 194 240 242 Bi3 129 141 221 235 240 246 176 178 184 186 244 258 Bi4 133 148 221 227 236 260 178 182 186 192 244 256 Bi6 129 141 229 235 240 254 178 186 186 192 242 244 Bi7 139 148 221 235 236 236 180 191 184 186 254 256 Bi8 135 148 221 229 236 240 178 180 186 186 240 256 Bi9 129 135 231 234 236 260 180 186 184 194 248 256

Bi10 133 148 221 227 236 246 176 188 184 202 248 248 Bi11 133 148 217 229 236 246 178 178 184 202 244 244 Bi12 141 148 221 231 246 254 178 186 186 192 244 248 Bi13 129 141 221 234 236 240 178 191 186 186 240 254 Bi15 129 139 221 229 244 246 176 178 186 192 240 246 Bi19 119 133 231 234 234 248 182 191 186 200 244 254 Bi20 135 139 223 240 234 236 176 186 184 196 246 248 Bi21 129 148 217 221 236 236 182 186 186 192 248 256 Bi22 139 141 234 235 236 254 186 191 186 186 248 254 Bi25 129 153 231 231 244 246 176 178 184 202 252 256 Bi28 129 148 227 235 240 244 182 186 192 202 242 248 Bi29 129 139 229 229 236 240 178 191 186 194 240 254 Bi32 148 155 221 234 236 240 182 186 184 186 248 248 Bi36 141 148 217 231 236 240 178 182 186 192 244 256 Bi37 129 148 221 235 246 246 176 186 186 202 248 258 Bi43 131 131 231 231 232 244 182 182 190 200 237 246 Bi48 139 153 221 227 236 260 176 186 192 202 248 252 Bi50 129 139 221 229 240 246 176 191 186 202 248 254 Bi54 129 148 227 227 236 254 176 186 184 192 242 248 SF5 133 155 221 231 236 246 178 182 186 202 244 256 SF8 129 139 223 231 246 248 176 186 184 202 240 252 SF12 139 141 229 231 236 244 178 186 186 202 240 244 SF13 139 141 223 227 236 240 180 191 186 190 244 254 SF14 139 141 221 223 236 236 178 182 184 186 248 256 SF15 131 139 229 234 240 240 191 191 186 186 254 254 SF17 139 148 221 229 236 246 176 191 186 202 254 258 SF18 135 148 223 234 236 236 176 186 184 184 248 258 SF27 129 153 223 234 230 244 182 186 192 194 237 248 SF34 139 141 231 231 236 236 180 186 184 186 240 248 SF46 148 148 234 234 236 254 176 182 184 186 248 248 SF50 139 144 227 242 236 240 176 180 190 202 244 246 SF60 133 141 231 235 236 246 178 191 184 202 254 256 SF61 129 141 231 235 236 236 178 178 186 194 244 254 AR4 129 129 221 221 240 244 176 178 186 202 252 256 AR7 133 139 221 231 246 250 176 178 198 202 244 248 AR8 129 129 217 227 236 236 182 186 184 194 240 248 AR13 139 148 229 234 240 250 178 182 186 186 244 254 AR14 133 148 229 234 246 254 178 186 186 202 244 248 AR17 139 148 - - 236 242 - - 184 186 242 244 AR35 139 148 227 234 240 240 176 186 186 202 246 248 AR38 133 139 229 234 246 250 178 186 198 202 244 248 TL1 129 148 217 234 236 254 178 186 184 192 242 244 TL3 139 148 221 234 236 254 176 186 186 192 248 248 TL13 131 131 231 231 236 236 176 191 186 186 244 252 TL16 129 148 221 247 244 248 178 182 186 192 240 258 BE13 141 148 231 234 246 250 178 186 198 202 244 248 BE26 129 146 227 234 240 244 176 191 190 202 252 254 TO1 139 141 221 229 240 250 178 191 186 198 244 256 TO4 129 131 231 231 240 244 178 178 186 202 244 244

TO21 131 144 227 234 236 246 180 191 190 202 244 254

Resultados

51

TO37 129 129 223 225 230 236 176 178 186 194 252 256 TO38 135 148 221 231 236 244 186 188 192 192 256 256 TVZ2 131 153 223 223 230 236 182 186 194 194 237 248 TVZ7 129 141 234 247 240 258 182 191 186 192 240 252 PT5 139 141 229 234 246 250 178 186 198 202 244 248 PT8 129 148 229 234 236 246 178 182 186 202 244 248

PT18 129 139 234 234 236 254 176 182 184 192 244 248 PT20 133 148 229 229 240 254 178 186 186 192 242 244 ME1 121 129 223 223 244 252 182 182 180 202 246 248 ME3 148 148 221 231 236 260 186 188 186 192 244 248 ME5 129 141 229 261 236 262 178 202 194 198 240 252 ME6 129 148 227 240 234 248 188 197 179 198 242 248 ME8 129 146 240 240 236 248 186 197 186 192 242 256 ME9 125 141 221 221 232 236 182 191 186 204 254 256

ME10 141 153 231 235 240 246 178 186 186 198 244 248 ME12 129 148 221 229 236 236 178 186 194 194 240 248 ME15 135 148 221 234 236 236 176 180 184 186 248 256 ME17 133 139 229 234 236 240 178 186 186 194 240 242

CONV1 131 139 231 235 240 246 178 186 186 202 240 244 CONV2 129 131 221 234 246 252 182 182 184 202 237 248

1BE1 141 148 234 235 230 236 182 186 186 202 240 248 1BE2 135 148 221 234 246 250 182 191 186 202 248 254 1BE3 129 146 223 227 246 248 176 191 184 202 244 252 1BE9 133 141 229 234 240 246 178 191 186 202 244 254

1BE12 131 146 227 234 244 246 176 182 184 190 237 252 1BE14 129 155 223 231 236 246 176 182 184 184 248 252 1BE15 129 129 223 231 230 246 176 191 184 194 248 252 2BE1 133 141 229 231 240 246 178 178 186 202 244 244 2BE3 139 148 221 234 250 254 176 186 186 198 248 248 4BE6 148 148 223 234 246 260 186 186 192 198 248 256

4BE13 133 148 221 221 246 250 176 191 186 186 244 254 4BE14 129 141 227 235 240 246 176 178 184 186 244 248 5BE1 141 141 223 231 236 236 178 186 186 186 240 256

CyL-03 141 155 231 235 236 236 180 191 184 186 248 254 CyL-04 131 141 235 235 236 246 186 191 186 192 240 254 CyL-06 129 141 227 235 236 250 176 191 186 198 248 254 CyL-09 133 141 223 229 236 236 182 191 186 194 235 254 CyL-10 131 141 231 235 236 248 176 186 186 198 240 248 CyL-12 139 141 229 231 236 236 182 191 184 186 248 254 CyL-18 129 141 223 234 236 244 182 191 184 192 237 254 CyL-22 129 139 223 231 236 244 182 186 192 202 248 256 CyL-23 139 155 221 231 236 236 180 182 184 184 248 248 CyL-26 133 144 221 223 236 236 182 191 186 202 244 254 CyL-27 129 139 221 231 244 250 176 180 198 202 248 248 CyL-30 139 148 234 234 236 254 172 186 186 186 242 244 CyL-31 139 148 221 234 250 254 178 186 192 198 242 258 CyL-34 129 155 221 231 236 254 178 186 186 192 242 244 CyL-37 141 144 223 229 236 240 178 186 186 186 240 244 CyL-39 139 141 231 231 236 250 180 180 194 198 244 248 CyL-40 129 148 221 234 236 254 178 186 186 192 242 258 CB08 129 141 223 235 236 246 182 191 186 192 248 254 CB09 129 148 223 227 236 254 172 186 186 192 242 244 CB10 148 155 221 234 236 254 180 186 184 192 248 248 CB11 129 141 231 234 236 236 186 191 186 186 240 254 CT01 135 148 227 235 236 236 172 186 186 192 244 244 CT02 133 141 221 235 236 240 191 191 186 186 254 254 CT05 129 148 223 234 236 260 186 188 186 200 242 256 Ci1 139 141 227 231 236 250 180 191 184 198 248 254 Ci2 141 155 231 235 236 246 182 191 184 192 248 254 Ti1 139 155 229 231 236 240 176 178 184 186 244 248

Resultados

52

W1 129 139 223 231 254 260 186 186 186 194 244 248 W2 148 148 223 223 236 260 186 186 190 194 244 248 W3 129 148 223 223 236 246 178 186 184 190 244 248 W4 129 133 229 247 240 246 191 202 186 200 240 252

Tras comparar todos los genotipos discriminados con los disponibles de estudios

previos y las bases de datos internacionales, configurados también con el set

GENRES (ver apartado 3.3.1), se comprobó que un gran número de las muestras

consideradas locales en su zona de cultivo presentaban genotipos idénticos a los de

variedades conocidas previamente, tanto españolas como foráneas, en especial

francesas, lo que permitió corregir la identidad que se les había asignado a nivel local.

Ciertas muestras locales, por el contrario, no se identificaron con ningún genotipo de

las fuentes consultadas. Dado que la mayoría de los genotipos discriminados fueron

compartidos por más de una muestra, se escogió un único representante de cada uno,

la muestra más antigua, respecto del orden de análisis, en cada caso. La relación de

los genotipos discriminados y sus identidades, establecidas tras dichas

comparaciones, se presentan a continuación (Tabla 4-4):

Resultados

53

Tabla 4-4. Relación de genotipos discriminados en la muestra e identificaciones determinadas para los mismos, según bases de datos internacionales consultadas. Los genotipos desconocidos se indican en itálicas.

Cdigo Nombre local Color Bayaa Identificación Código Nombre local

Color Bayaa Identificación

Bi1 Tintorera t Negrón de Aldán 1BE9 Santa Paula n Molinera / Red

Malaga

Bi3 - n Rabo de Ovella /

Sumoll 1BE12 Moscatel Romano n Muscat Hamburg

Bi4 - n Negreda 1BE14 Moscatel Blanco de

Grano Menudo b Desconocido

Bi6 - b Desconocido 1BE15 Moscatel Tinto de

Grano Menudo n

Moscatel de Grano Menudo / Moscato

Bianco

Bi7 - n Mandón / Morenillo II 2BE1 Morisco b Jaén Blanco

Bi8 - t Grand Noir / Morrastel

Bouschet 2BE3 Tinta Fina n Albarín Negro

Bi9 - - Desconocido 4BE6 Molinera n Corbeau

Bi10 - b Picapoll 4BE13 Teta de Cabra Tinta n Negra Dorada

Bi11 Doña Blanca b Doña Blanca / Cigüente 4BE14 Juan el Herrero n Tarragoní

Bi12 Mencía n Mencía 5BE1 - b Pleita / Mandilari

Bi13 Garnacha Tintorera t Garnacha Tintorera TO1 Colgadera b Airén

Bi15 Palomino Macho b De Rey TO4 - p Perlon

Bi19 - - Desconocido TO21 Teta de Cabra p Teta de Vaca

Bi20 - - Desconocido TO37 Malvasía b Desconocido

Bi21 - n Brancellao TO38 Merlot n Merlot

Bi22 - b Allarén TVZ2 Albillo Real n Albillo

Bi25 - b Perla de Csaba TVZ7 - n Desconocido

Bi28 - b Cagarrizo ME1 Blanca del País b De José Blanco

Bi29 Toledana n Aramon ME3 Hondarrabi b Petit Courbu

Bi32 Godello b Godello ME5 Tinta del País n Desconocido

Bi36 - n Desconocido ME6 Tinta del País n Desconocido

Bi37 - n Monastrell ME8 Tinta Redonda n Desconocido

Bi43 - - Desconocido ME9 Blanca del País b Desconocido

Bi48 - n Petit Verdot ME10 Tinta Gorda n Señá

Bi50 Tinta n Trepat ME12 Hondarrabi b Matza Zuri

Bi54 - b Pedro Ximénez Canario ME15 Tinta n Graciano

SF5 Verdejo Serrano b Desconocido ME17 Blanca del País b Chardonnay

SF8 Moscatel Gordo Peludo b Gordera Roja CoNV1 Blanca de Mesa b Beba / Calop Rojo

SF12 - n Moristell CoNV2 De Mesa Gorda n Alphonse Lavallé

SF13 Vigorosa n Brujidera Ci1 Albillo Mayor b Albillo Mayor

SF14 Nudo Corto n Mazuelo / Cariñena Ci2 Temprana Media b Pardillo

SF15 Colgadera n Gordera Negra Ti1 Albillo Real Extremadur

b Albillo Real

SF17 - n Ariño CB08 Palomino b Palomino

SF18 Falso Rufete n Desconocido CB09 Sauvignon Blanc b Sauvignon Blanc

Resultados

54

SF27 - b Legiruela CB10 Verdejo b Verdejo

SF34 - n Morate CB11 Viura b Macabeo

SF46 Calabrés n Desconocido CT01 Cabernet Sauvignon n Cabernet Sauvignon

SF50 Cojón de Gallo r Desconocido CT02 Garnacha Tinta n Garnacha

SF60 - b Desconocido CT05 Malbec n Malbec

SF61 Del Pipajo b Zalema CyL-03 Alcazpepita b Cañorroyo

AR4 Bastardillo Serrano n Sinsó CyL-04 Calagraña b Calagraña/Katsano

AR7 Tinta Jeromo n Tinta Jeromo CyL-05 Doradilla 1 b Doradilla

AR8 Puesta en Cruz b Rabigato CyL-06 Doradilla 2 b Desconocido

AR13 - b Mantúo CyL-09 Huerta del Rey b Marfal

AR14 Juan García n Juan García CyL-10 Marta Nava b Salvador

AR17 - - Desconocido CyL-12 Pirulés Dorada b Malvasía Riojana /

Alarije

AR35 Verdejo Colorado r Desconocido CyL-18 Temprana Agosteña b Lairén

AR38 Gajo Arroba n Gajo Arroba CyL-22 Tempranillo de Nava b Chasselas Doré

PT5 Cornifesto n Desconocido CyL-23 Tolociriana b Castellana Blanca

PT8 Trincadeira Preta n Trincadeira CyL-26 Juliana r Desconocido

PT18 - n Desconocido CyL-27 Cenicienta n Desconocido

PT20 Poilta n Desconocido CyL-30 Pan y Carne 1 n Merenzao

TL1 Albarín Blanco b Albarín Blanco CyL-31 Pan y Carne 2 n Desconocido

TL3 Prieto Picudo n Prieto Picudo CyL-34 Rufete n Rufete

TL13 Francesa b Centennial Seedless CyL-37 Tinta Madrid n Bobal

TL16 - n Desconocido CyL-39 Tinta del País n Tempranillo

BE13 - - Desconocido CyL-40 Verdejo Tinto n Puesto Mayor /

Saborinho

BE26 Moscatel b Italia W1 Individuo silvestre 1 Macho Desconocido

1BE1 Redondal b Kamchiya W2 Individuo silvestre 2 n Desconocido

1BE2 Teta de Cabra b Bougseb W3 Individuo silvestre 3 Macho Desconocido

1BE3 Moscatel Romano b Muscat of Alexandria W4 Individuo silvestre 4 Macho Aramon rupestris

(híbrido) a b = blanca ; n = negra ; r = rosada ; t = tintorera ; g = gris

4.1.2.1. Sinonimias

Entre los 351 genotipos redundantes contabilizados, 176 se identificaron como

sinónimos de alguno de los 118 recogidos en la Tabla 4-3. El resto de las

redundancias correspondieron a repeticiones de muestras, muchas de ellas bajo el

mismo nombre y muchas otras recogidas sin nombre.

A continuación, en la Tabla 4-5, se muestra una relación de los sinónimos que se han

identificado en Castilla y León para los genotipos discriminados en el estudio:

Resultados

55

Tabla 4-5. Sinónimos empleados en las diferentes comarcas vitícolas de Castilla y León para referirse a las variedades identificadas en el estudio.

Variedades identificadas

Sinónimos en Castilla y León Variedades

identificadas Sinónimos en Castilla y León

Airén Colgadera (TO) Macabeo Colgadera Blanca (SF), Federico (SF),

Viura (Ru)

Alarije Malvasía Riojana (Bi y SF), Pirulés Dorada

(RD), Pirulés Verde (RD), Rojal (RD) Mantúo

Albarrucio (SF), Colgadera (SF), Formosa (PT)

Albarín Negro Alfrocheiro Preto (PT), Bruñal (AR y SF) Marfal Huerta del Rey

Albillo Albillo Real (TVZ), Chichorra (TO),

Leovigildo (TO) Matza Zuri Hondarrabi (ME), Hondarrabi Zuri (ME)

Albillo Mayor Albilla (Ci) Mazuelo Lairén Peludo (SF), Nudo Corto (SF)

Albillo Real Albillo Real de Extremadura (Ti) Mencía Mencía Pajaral (Bi)

Alphonse Lavallé

De Mesa Gorda (CONV) Merenzao Bastardillo Chico (AR), Bastardo (PT), Negro Saurí (TL), Pan y Carne 1 (Bi),

Tinta Fina (BE)

Aramon Ojo de Gallo (Bi), Toledana (AR y Bi) Morenillo II Mandón (TVZ), Tinta Vigorosa (TVZ)

Beba Blanca de Mesa (ME) Moscatel de Grano Menudo / Moscato

Bianco

Moscatel (SF y TO), Moscatel de Toro (TO)

Bobal Tinta de Madrid (Ci), Juan el Herrero (BE) Muscat Hamburg Moscatel Romano (BE)

Bougseb Teta de Cabra (BE) Muscat of Alexandria

Moscatel (TVZ), Moscatel de Alejandría (Bi), Moscatel Gordo (CONV), Moscatel

Romano (BE)

Brujidera Aragonesa (Ci), Marufo (PT), Morisco Tinto

(PT), Vigorosa (SF) Negra Dorada

Bastardillo Serrano (AR), Cojón de Gallo (SF), Corazón de Gallo (TVZ), Teta de Cabra (TL), Teta de Cabra Tinta (BE)

Cañorroyo Alcazpepita (Ru), Hornipepita (Ru) Palomino Jerez (SF y CONV), Malvasia Rei (PT), Palomino Fino (And), Uva de Mesa (BE)

Castellana Blanca

Tolociriana (Ru) Pardillo Temprana Media (Ci), Toledana Blanca

(TO) Centennial Seedless

Francesa (TL) Perla de Csaba Moscatel Blanco Peludo (TO)

Chardonnay Blanca del País (ME) Petit Courbu Hondarrabi (ME)

Chasselas Doré / Temprano

Blanco

Albillo Negro (Ci), Elba (TO), Malvasía (Bi), Temprana Agosteña 2 (Ci), Temprana Blanca (Ci), Temprana Media (Ci), Temprana Tardía (Ci), Tempranillo Blanco (SF), Tempranillo Blanco menudo (BE), Tempranillo Gordo

(BE), Tempranillo de Nava (Ru),

Picapoll Claireto (Ci)

Corbeau Molinera (BE) Poilta Portuguesa (AR)

De José Blanco Blanca del País (ME) Prieto Picudo Prieto Picudo Oval (TL)

Doña Blanca Cigüente (PT), Godella (Ci), Gorreta (TO),

Malvasía (AR y TO), Verdegudillo (Ci) Puesto Mayor

Falso Rufete (SF), Nieva (Ru), Saborinho (PT), Verdejo Tinto (Ru)

Garnacha Tinta

Albarrucio Tinto (SF), Aragonesa (BE), Garnacha Blanca (RJ), Garnacha Colorada (BE), Garnacha Gris (RA), Garnacha Roja (Ci), Garnacha Rosa (Ci), Tinta Fina (BE)

Rabigato Puesta en Cruz (AR), Turruntés (AR)

Garnacha Tintorera

Lagareta (TL), Tintorera (SF) Red Malaga Santa Paula (BE)

Godello Godello Rojo (PT), Prieto Picudo Blanco (TL) Salvador Cañorroyo (TL), Marta Nava (Ru), Puente

(TO), Salvador (Ci)

Gordera Negra Colgadera (SF), De Mesa Larga (CONV), Gris

de Mesa (CONV), Roja de Mesa (CONV) Señá Tinta Gorda (ME)

Gordera Roja Moscatel Gordo Peludo (BE), Moscatel Rosa

(BE) Sinsó Bastardillo Serrano (AR)

Graciano Tinta (ME) Tarragoní Juan el Herrero (BE)

Grand Noir Tinturón (AR) Tempranillo

Tempranillo Pedrosa (RD), Tempranillo Peludo (SF), Tinta de Madrid (BE), Tinta de Nava (Ru), Tinta del País (RD), Tinta de Toro (TO), Tinta de Toro Blanca (TO)

Italia Moscatel (BE), Moscatel de Mesa (TO) Teta de Vaca De Mesa (TO), Teta de Cabra (TO)

Jaén Blanco Jaén (PT), Mindundo (SF), Morisco (BE) Tinta Jeromo Porte Erguido (AR)

Resultados

56

Juan García Juan García Fino (AR), Juan García Grueso

(AR), Negrera (Bi), Tinta Gorda (PT), Villarino (AR)

Trepat Mondundo (SF)

Kamchiya Redondal (BE) Trincadeira Preta Tinta Amarela (AR)

Katsano Calagraña (Ru) Verdejo Abasta (TL), Albillo (BE), Albillo Nava

(Ru), Verdeja (Ci)

Lairén Blanco de España (BE), Temprana Agosteña 1

(Ci), Temprana Blanca (SF), Tempranillo Blanca (SF)

Verdejo Serrano Acebo (AR), Verdejo de Salamanca (SF)

Abreviaturas referentes a las comarcas vitivinícolas de procedencia de las muestras: AR – Arribes del Duero; BE – Valles de Benavente; Bi – Bierzo; Ci – Cigales; CONV – Convento religioso en Valldolid; ME – Valle de Mena; PT – Arribes del Duero portugueses; RD – Ribera del Duero; Ru – Rueda; SF – Sierra de Francia; Ti – Valle del Tiétar; TL – Tierra de León; TO – Toro; TVZ – Tierra del Vino de Zamora.

Entre los casos de sinonimia, algunos implicaron a variedades que mostraban claras

diferencias morfológicas referidas al color y forma de sus bayas, pero que, no

obstante, presentaron genotipos idénticos. Tal fue el caso de Garnacha Tinta con las

Garnachas Blanca, Gris, Roja, y Rosa; Pirulés Dorada con Pirulés Verde; Tinta de

Toro Blanca con Tinta de Toro; ó Prieto Picudo con Prieto Picudo Oval.

Destacan los numerosos sinónimos locales por los que se conoce en diversas

comarcas de Castilla y León a variedades conocidas, como Tempranillo, Garnacha,

Chasselas Doré, Albillo ó Albarín Negro. Así, el genotipo de Tempranillo recibe el

nombre de Tinta del País en Ribera del Duero ó Tinta de Toro en Toro, como ejemplos

más conocidos, pero se han detectado más apelativos de marcado carácter local para

esta conocida variedad, frecuentemente con apellido en referencia a localidades

concretas, como Tinta de Nava (Rueda) y Tempranillo Pedrosa (Ribera del Duero).

Garnacha, por su parte, es conocida como Aragonesa en la comarca de Valles de

Benavente. El genotipo de Chasselas Doré ó Temprano Blanco se corresponde con

los de Elba (Toro), Albillo Negro (Cigales), y todo tipo de denominaciones aplicadas a

uvas blancas que comienzan por la palabra “Temprana”. La variedad Albillo recibe

sinónimos como Albillo Real en Cebreros y la Tierra del Vino de Zamora, y Leovigildo

ó Chichorra en la comarca de Toro. En Arribes del Duero se recogieron numerosas

muestras bajo el nombre de Bastardillo Serrano y de Bastardillo Chico; las primeras se

correspondieron con el genotipo de Sinsó, mientras que las segundas lo hicieron con

el de Merenzao, que, a su vez, se encontró bajo un nombre similar, Bastardo, en

Portugal. Por último, cabe destacar la amplia presencia de muestras con el genotipo

de Albarín Negro en numerosas comarcas occidentales de la región, conocido tanto

por este nombre como por los de Bruñal (Arribes del Duero y Sierra de Francia), Tinta

Fina (Valles de Benavente), o Alfrocheiro Preto (Portugal). Asimismo, la variedad Doña

Blanca se cultiva en varias comarcas diferentes de Castilla y León, donde recibe a su

vez nombres muy distintos, entre los que destacan los de Gorreta (Toro), Malvasía (en

Toro y en Arribes del Duero), ó Verdegudillo (en Cigales).

Resultados

57

4.1.2.2. Homonimias

Las homonimias detectadas en la muestra, así como las distintas identidades

genéticas que cubría cada una de ellas en las comarcas sondeadas, se relacionan en

la Tabla 4-6.

Tabla 4-6. Homonimias de la muestra: nombres locales y su correspondencia con variedades de diferentes identidades genéticas en Castilla y León, conocidas o desconocidas (éstas últimas en itálicas).

Denominación local Correspondencias con variedades discriminadas

Blanca del País Chardonnay (ME), De José Blanco (ME), ME8-Desconocida, ME9-Desconocida

Cojón de Gallo SF50-Desconocida, Negra Dorada (SF)

Colgadera Airén (TO), Gordera Negra (SF), Mantúo (SF)

Doradilla Doradilla (Ru), Cyl-06-Desconocida (Ru)

Falso Rufete SF18-Desconocida, Puesto Mayor (SF)

Hondarrabi Matza Zuri (ME), Petit Courbu (ME)

Juan el Herrero Bobal (BE), Tarragoní (BE)

Malvasía Chasselas Doré (Bi), TO37-Desconocida, Doña Blanca (AR y TO)

Moscatel Italia (BE), Moscatel de Grano Menudo (TO y SF), Muscat of Alexandria (TVZ)

Moscatel Romano Muscat Hamburg (BE), Muscat of Alexandria (BE)

Pan y Carne CyL-31-Desconocida (Bi), Merenzao (Bi)

Temprana Agosteña Chasselas (Ci), Lairén (Ci)

Temprana Blanca Chasselas Doré (Ci), Lairén (SF)

Temprana Media Chasselas Doré (Ci), Pardillo (Ci)

Teta de Cabra Bougseb (BE), Negra Dorada (TL), Teta de Vaca (TO)

Teta de Cabra Tinta Monastrell (SF), Negra Dorada (BE)

Tinta de Madrid Bobal (Ci), Tempranillo (BE)

Tinta del País ME5-Desconocida, ME6-Desconocida, Tempranillo (RD y SF)

Tinta Fina Albarín Negro (BE), Garnacha (BE), Merenzao (BE)

Tinta Gorda Juan García (PT), Señá (ME)

Tinta Redonda ME6-Desconocida, ME8-Desconocida

Tintorera Negrón de Aldán (Bi), Garnacha Tintorera (SF)

Trepat Graciano (ME)

Abreviaturas referentes a las comarcas vitivinícolas de procedencia de las muestras: AR – Arribes del Duero; BE – Valles de Benavente; Bi – Bierzo; Ci – Cigales; CONV – Convento religioso en Valldolid; ME – Valle de Mena; PT – Arribes del Duero portugueses; RD – Ribera del Duero; Ru – Rueda; SF – Sierra de Francia; Ti – Valle del Tiétar; TL – Tierra de León; TO – Toro; TVZ – Tierra del Vino de Zamora.

Entre los casos de homonimia hallados, destaca el caso del nombre Blanca del País,

que, según las muestras analizadas en el presente estudio, se utiliza para designar al

menos cuatro identidades diferentes, sólo en la comarca de Valle de Mena. También

Resultados

58

fueron destacables los casos de los nombres Colgadera, Malvasía, Moscatel, Teta de

Cabra, y Tinta Fina, bajo los cuales se detectaron hasta tres genotipos diferentes en

los viñedos de la región.

4.1.2.3. Errores de nomenclatura

En todas las homonimias, así como en un alto número de las sinonimias detectadas,

hubo nombres que se hubieron de calificar como erróneos tras efectuar

comprobaciones en las bases de datos consultadas. En dichas fuentes, se comprobó

si aparecían citados previamente los variados sinónimos detectados en Castilla y

León.

Los nombres locales sin coincidencias en las referencias se consideraron sinónimos

válidos a nivel comarcal para designar una cierta variedad conocida, siempre que se

emplearan consistentemente para referirse a ella en la susodicha comarca o

comarcas, según los datos de las muestras analizadas de ese lugar. Por ejemplo, la

variedad Sinsó es conocida en la demarcación de Arribes del Duero como Bastardillo

Serrano, según indicó el genotipo de dos muestras independientes recogidas bajo este

nombre en la comarca. Los casos en los que el sinónimo aparecía citado previamente

en referencia a la misma identidad genética detectada en este estudio, se admitieron

también como válidos para la designación de esa identidad. Ese fue el caso, por

ejemplo, de Tinta del País, que ya había sido citada previamente como sinónimo de

Tempranillo.

Por el contrario, se consideraron erróneos los nombres que, estando citados

previamente en referencia a una cierta identidad, se usaron aquí, sin embargo, para

designar otras identidades que claramente no les correspondían. En la comarca Valles

de Benavente, por ejemplo, se recogió una muestra bajo el nombre Verdejo, que no

sólo no correspondía con el genotipo de la consabida variedad, sino que además lo

hacía con el de Albillo.

Con el mismo criterio se trató a los nombres locales correspondientes,

consistentemente, con algunos de los nuevos genotipos detectados en el estudio,

cuando éstos fueron mal empleados para designar identidades conocidas por otros

nombres. Por ejemplo, Pan y Carne es un nombre local de la comarca Bierzo,

correspondiente con un genotipo hasta ahora no reflejado en las fuentes consultadas,

Resultados

59

y por tanto mal empleado cuando se usó para designar a Merenzao, variedad

conocida por otros nombres.

Asimismo, en el caso de las homonimias en las que, tras comprobar las fuentes antes

referidas, una de las identidades homónimas resultó legítima correspondiente del

nombre empleado, el resto de identidades bajo el mismo nombre se calificaron

también como errores de nomenclatura, ya fueran genotipos correspondientes con otro

nombre conocido y citado o bien genotipos previamente no referenciados.

Los casos que se ajustaron a estas premisas se presentan en la Tabla 4-7.

Resultados

60

Tabla 4-7. Errores de nomenclatura detectados en la designación de variedades de Castilla y León. Los

nombres correspondientes a los genotipos no referenciados previamente, aparecen en itálicas.

Identidad genética Nombres erróneos detectados en Castilla y León

Albarín Negro Tinta Fina (BE)

Albillo Verdejo (BE), Albillo Real (Ce y Ti)

Beba Chasselas Doré (Ci)

Brujidera Aragonesa (BE)

Calabrés Bruñal (SF)

Chardonnay Blanca del País (ME)

Doña Blanca Godella (Ci)

Garnacha Tinta Fina (BE)

Juan García Tinta Gorda (ME)

Kamchiya Albillo (TL)

Lairén Temprana Blanca (SF)

Mantúo Colgadera (SF), Formosa (PT)

Matza Zuri Hondarrabi (ME)

Mazuelo / Cariñena Lairén (SF)

ME5-Desconocida Tinta del País (ME)

ME6-Desconocida Tinta del País (ME)

Merenzao Pan y Carne (Bi), Tinta Fina (BE)

Monastrell Teta de Cabra Tinta (SF)

Negra Dorada Bastardillo Serrano (AR), Cojón de Gallo (SF)

Pardillo Temprana Media (Ci)

Petit Courbu Hondarrabi (ME)

Puesta en Cruz Turruntés (AR)

Puesto Mayor Falso Rufete (SF)

Salvador Cañorroyo (TL)

Tarragoní Juan el Herrero (BE)

Tempranillo Tinta de Madrid (BE)

Teta de Vaca Teta de Cabra (TO)

TO37-Desconocida Malvasía (TO)

Abreviaturas referentes a las comarcas vitivinícolas de procedencia de las muestras: AR – Arribes del Duero; BE – Valles de Benavente; Bi – Bierzo; Ci – Cigales; CONV – Convento religioso en Valldolid; ME – Valle de Mena; PT – Arribes del Duero portugueses; RD – Ribera del Duero; Ru – Rueda; SF – Sierra de Francia; Ti – Valle del Tiétar; TL – Tierra de León; TO – Toro; TVZ – Tierra del Vino de Zamora.

En su mayoría, los errores de nomenclatura detectados se debían a confusiones entre

variedades utilizadas a nivel local, o entre éstas y otras de uso más extendido, que se

cultivan próximas o mezcladas en los mismos viñedos. Por ejemplo, dos de las tres

muestras recogidas en la Sierra de Francia con el nombre de Bruñal, que apela a una

Resultados

61

variedad local muy utilizada en la comarca cuyo genotipo corresponde con la identidad

de Albarín Negro, presentaron genotipos correspondientes con la identidad de

Calabrés, otra variedad de marcado carácter local en aquella zona, cultivada en los

mismos viñedos que la anterior.

Sin embargo, también hubo muchos casos en que los errores implicaron a varias

comarcas diferentes. Por ejemplo; en general, lo que en las demarcaciones vitícolas

de Cebreros y Tierra del Vino de Zamora se conoce como Albillo Real, corresponde

genéticamente con la variedad Albillo (sin epíteto), ampliamente documentada en el

territorio nacional. La denominación Albillo se aplica en Castilla y León a algunas

variedades de uva blanca que no corresponden a esa identidad, como en los

siguientes ejemplos: en Tierra de León se recogió un Albillo correspondiente en

realidad con la identidad Kamchiya (nombre originario de Bulgaria), y en Valles de

Benavente un Albillo correspondió realmente con Verdejo.

4.1.2.4. Genotipos con alelos únicos

Once genotipos presentaron alelos específicos, en referencia a esta muestra

castellano-leonesa, para uno o más de los seis loci del set GENRES081 (Tabla 4-3).

Todos ellos, excepto los correspondientes a las identidades De José Blanco y Huerta

del Rey (sinónimo de Marfal), no se identificaron con ninguno de los contenidos en las

bases de datos consultadas. Destacan los casos de las muestras codificadas como

ME5 (Tabla 4-3), con tres alelos específicos de entre los 12 que componen el

genotipo, y ME9 (Tabla 4-3), con dos alelos específicos, así como el de la muestra

identificada como De José Blanco (dos alelos específicos).

4.1.2.5. Variedades extranjeras

Resultaron numerosos los genotipos que, a pesar de proceder de muestras con

nombres locales, correspondieron finalmente con los de variedades foráneas.

Entre ellos, los más abundantes fueron los referidos a variedades francesas, como

Alphonse Lavallé, Aramon, Chardonnay, Chasselas Doré, Corbeau, Grand Noir, Petit

Courbu, y Petit Verdot, que se unen así a las oficialmente recogidas por los Consejos

Reguladores de las D.O. en el territorio castellano y leonés: Cabernet Sauvignon,

Malbec, Merlot, y Sauvignon Blanc. Asimismo, se detectó la presencia bajo nombres

locales, como Moscatel Romano, de diversos genotipos internacionalmente conocidos

Resultados

62

de la familia de uvas Moscatel, como los de Muscat of Alexandria (Egipto), Muscat

Hamburg (Alemania-Reino Unido), o Italia (Italia). En otros casos, las adscripciones de

los genotipos de algunas muestras locales resultaron más exóticas, como en los casos

de Perla de Csaba (Hungría), encontrada en el Bierzo; Kamchiya (Bulgaria), Bougseb

(Marruecos), y Pleita (Grecia) en los Valles de Benavente; Centennial Seedless

(Francia-USA) en Tierra de León; y Perlon (Centro Europa-Argentina) en Toro.

En general, los nombres locales que recibían estas muestras resultaron erróneos, ya

que son aplicables también a otros genotipos previamente identificados en variedades

autóctonas. Sin embargo, esto no se cumplió en el caso de Calagraña (CyL-04, Tabla

4-4), una variedad de uva blanca cultivada en la zona de D.O. Rueda, cuyo nombre

local es aplicado únicamente al genotipo obtenido en esta muestra, que a su vez

resulta único en la comparación con los datos de muestras españolas, pero que

corresponde con el de la variedad griega Katsano.

4.1.3. Genotipos no referenciados en las bases de datos

Un total de 29 genotipos, esto es, el 24,8% de entre los pertenecientes a variedades

cultivadas incluidas en este estudio, no correspondieron con los de ninguna otra

variedad documentada hasta la fecha en las bases de datos y trabajos previos

consultados. En su mayoría, dichos genotipos provienen de variedades locales

minoritarias, sin referencias escritas previas, y que no figuran en los viveros

comerciales.

Entre las comarcas castellano-leonesas sondeadas, El Bierzo fue la que aportó la

mayor cantidad de genotipos hasta ahora desconocidos, con un total de 7. Destacaron

también los 5 genotipos novedosos hallados en Sierra de Francia, y los 4 del Valle de

Mena.

Parte de estos genotipos pertenecieron a muestras que no recibían un nombre

concreto, o que recibían nombres genéricos, o erróneos, correspondientes en realidad

a otros genotipos previamente referenciados. Éste es el caso de las muestras Bi6, Bi9,

Bi19, Bi20, Bi36, Bi43, SF18, SF60, PT18, TL16, BE13, TVZ7, ME5, ME6, ME8, ME9,

y de CyL-06. Ésta última muestra, conservada en el Banco de Germoplasma de Vid de

Castilla y León (BGVCyL) bajo el nombre de Doradilla 2, representa uno de los casos

de homonimia detectados, pues su genotipo no corresponde con el de ninguna otra

entrada recogida como Doradilla en éste y otros estudios, por lo que se debe evitar en

Resultados

63

el BGVCyL esta denominación. Esta variedad tiene uva blanca, y el origen de la planta

que representa a este genotipo en el banco se encuentra dentro del territorio de la

D.O. Rueda.

El resto de genotipos de nueva identificación corresponden con variedades locales

cuya identidad genética se ha demostrado única mediante este estudio y que tienen

nombres específicos. En esta tesitura se encuentran las siguientes muestras:

Bi6, es una muestra recogida sin nombre en El Bierzo, cuyo genotipo es

prácticamente idéntico al de la variedad Río Abaixo (González-Andrés et al. 2007)

de la misma comarca, difiriendo únicamente en un alelo del locus VrZAg79: el

genotipo de Bi6 para ese locus fue 242/244, mientras que el de Río abaixo, según

los citados autores, era 240/244. Dada la contigüidad entre los alelos que difieren,

y la escasa diferencia (<10%) entre ambos genotipos, insuficiente para

considerarlos genotipos distintos según los criterios habitualmente aplicados, hay

que admitir, a efectos prácticos, que se trate de la misma variedad. Sin embargo,

la discrepancia se confirmó tras dos repeticiones independientes, por lo que, a falta

de datos genotípicos de Río Abaixo para otros loci con los que poder hacer más

comparaciones, y a efectos de este estudio, se decidió incluir el genotipo Bi6 entre

los previamente no referenciados como representante de una variedad minoritaria

local singular.

Calabrés (SF46), podría corresponder a una variedad de uva tinta autóctona de la

comarca de Sierra de Francia. No obstante, parece ser que la mayoría de las

cepas que los viticultores de esa comarca denominan Calabrés corresponden en

realidad a Garnacha Tinta (Arranz et al. 2008), por lo que es posible que las dos

muestras recogidas bajo el nombre Calabrés en este estudio, con genotipo hasta

ahora no referenciado, fueran denominadas así erróneamente. Dado que subsisten

escasas cepas en cultivo con este nuevo genotipo, no hay suficientes datos para

saber si el nombre Calabrés procede originalmente de ellas, para después

popularizarse su uso como sinónimo habitual de Garnacha Tinta, o si se ha

producido un error en su utilización para denominar a las muestras SF46 y SF47.

Cenicienta (CyL-27), es una variedad de uva gris-tinta, poco apreciada para hacer

vino, de la que se han localizado escasos individuos cultivados en el territorio de la

D.O. Rueda.

Cojón de Gallo (SF50), es una variedad de uva entre roja y rosa, empleada como

uva de mesa y para vinificación en la comarca de Sierra de Francia. El nombre

equivalente “Botón de Gallo”, que también hace referencia al supuesto parecido de

Resultados

64

las uvas con los testículos del ave, se relaciona históricamente, según

informaciones aparecidas en periódicos locales, con la uva Verdejo, así como con

Godello y Prieto Picudo, si bien no se ha encontrado documentación científica que

avale esta relación, ni tampoco se apoya en similitudes morfológicas evidentes.

Cornifesto (PT5), es una variedad de uva tinta minoritaria cultivada en la comarca

de Arribes del Duero, tanto en su vertiente española (donde habitualmente se la

conoce como Gajo Arroba) como en la portuguesa, de donde parece originaria. Sin

embargo, en este estudio los genotipos de Cornifesto y Gajo Arroba resultaron

diferenciados en un alelo del locus VVS2, siendo la discrepancia abultada en

cuanto al tamaño de los alelos (133 pb frente a 141 pb), y comprobada tras

repetición independiente. Desgraciadamente, no se cuenta con datos de Gajo

Arroba para los 16 microsatélites adicionales utilizados en este trabajo, por lo que

la diferencia no ha podido ser contrastada más allá de los 6 loci GENRES. El

nombre Cornifesto está registrado además como variedad de vid autorizada en

Sudáfrica (www.extranet.senat.fr).

Juliana (CyL-26), es una variedad de uva roja empleada como uva de mesa,

representada por escasos individuos localizados en territorio de la D.O. Rueda, y

que parece ser sinónima de la antiguamente denominada Jamí en la obra de Rojas

Clemente (2002 edición facsímil, original de 1807), presente en el Jardín Botánico

de Madrid (F. Cabello, comunicación personal).

Malvasía (TO37), es un genotipo perteneciente a una variedad de uva blanca, que

difiere ampliamente del de la Malvasía oficialmente recogida por la normativa del

Consejo Regulador de la D.O. Toro, también conocida por Malvasía Castellana, y

sinónimo reconocido de Doña Blanca. Según la propia D.O., el nombre Malvasía

provendría de variedades originales de Grecia, desde donde llegaron sus varas a

Zamora a través de la colonización almogárave. Sin embargo, esta información es

aplicada también a Malvasías de otras denominaciones, que genéticamente son

diferentes. En general, el nombre Malvasía se ha asignado tradicionalmente a

variedades olorosas, independientemente de su procedencia. El genotipo TO37,

dada su evidente singularidad y diferencia respecto al de la Malvasía propia de la

comarca donde se ha detectado, se tratará en este estudio como TO37-

Desconocida.

Moscatel Blanco de Grano Menudo (1BE14), es una variedad de uva blanca

procedente de la comarca de Valles de Benavente, donde se emplea para elaborar

vino, aunque el número de cepas en cultivo es escaso. Sus cualidades

organolépticas y morfológicas encajan con las propias de las uvas del tipo

Moscatel.

Resultados

65

Pan y Carne 2 (CyL-31), procede de la D.O. Bierzo, donde se emplea para

producir vinos tintos. Teniendo en cuenta que la otra entrada del BGVCyL bajo el

nombre Pan y Carne (1) fue identificada como Merenzao tras el genotipado, la

identidad definitiva Pan y Carne se asignó al genotipo, hasta ahora no

referenciado, de Pan y Carne 2, también conocido en el Bierzo por Estaladiña.

Poilta (PT20), es una variedad tinta con nombre de origen portugués, cultivada a

ambos márgenes del Duero en la comarca de los Arribes. En el lado español, se

ha encontrado este genotipo bajo el sinónimo de Portuguesa.

Verdejo Colorado (AR35), es una variedad de uva roja, también utilizada tanto

como uva de mesa como para elaborar vinos, que se considera autóctona de la

comarca de Arribes del Duero.

Verdejo Serrano (SF5), es una variedad de uva blanca minoritaria, cultivada en la

comarca de Sierra de Francia, donde muchas veces aparece bajo el sinónimo de

Verdejo de Salamanca. En el material objeto de estudio, el genotipo de Verdejo

Serrano fue detectado también en una muestra de la comarca de Arribes del

Duero, bajo el nombre de Acebo.

Además de estos 29 genotipos obtenidos entre las muestras de vides cultivadas, tres

de las muestras recogidas en ambiente salvaje presentaron también genotipos hasta

ahora no publicados en las bases de datos consultadas. Estas muestras fueron las

codificadas como W1, W2, y W3, correspondientes, respectivamente, a tres plantas

localizadas en el mismo enclave geográfico, en las proximidades de la presa de

Aldeadávila (Salamanca).

4.2. ANÁLISIS DE ESTRUCTURA GENÉTICA

Los genotipos completos para 22 loci nucleares de las muestras previamente

discriminadas, y los clorotipos determinados para los 9 loci cloroplásticos, se

presentan en las Tablas A2 y A3 del Anejo I, respectivamente.

4.2.1. Clorotipos asignados a los nuevos genotipos

De entre los 29 genotipos hasta ahora no referenciados que se detectaron en la

muestra, la mayoría (15) presentaron el clorotipo A, típico en las vides silvestres de la

Península Ibérica y Europa Central (Arroyo-García et al. 2006). También se

Resultados

66

identificaron cinco muestras con clorotipo B, cinco con el D, dos con el C, y una con

clorotipo G. La muestra restante, codificada como AR17, no pudo ser completamente

genotipada con los SSR nucleares, y no se consiguió ninguna amplificación fiable de la

misma con cpSSRs, de modo que no se le asignó clorotipo.

Seis de estos genotipos, los pertenecientes a las muestras codificadas en el estudio

como TL16, TVZ7, ME5, ME6, ME8, y ME9, presentaron alelos con tamaños fuera de

los rangos habituales de Vitis vinifera L. para más de uno de los loci nucleares

analizados. Cinco de ellas portaban clorotipos B o C, los dos únicos encontrados en

las especies americanas del género Vitis típicamente utilizadas en cruzamientos con

V. vinifera (Arroyo-García et al. 2002). La muestra restante, TVZ7, presentó clorotipo

A, y compartió un alto número de alelos con la muestra silvestre W4, que se identificó

como híbrido interespecífico, tal como se explica a continuación.

Por su parte, las cuatro muestras de plantas silvestres presentaron algunos alelos

característicos en sus genotipos nucleares, no detectados entre las cultivadas que se

han caracterizado en el estudio. Una de ellas, W4, mostró algunos alelos cuyo tamaño

se situó fuera de los rangos habituales en vid para algunos de los microsatélites

nucleares genotipados (Tabla 4-3 y Tabla A2 del Anejo I). El genotipo nuclear de esta

muestra se identificó con el de Aramon rupestris (De Andrés et al. 2007), un

portainjerto comúnmente empleado, derivado del cruce interespecífico V. vinifera x V.

rupestris.

4.2.2. Estructura genética de las vides de Castilla y León

4.2.2.1. Estructura genética

El enfoque basado en la modelización implementada en el programa STRUCTURE

obtuvo la máxima probabilidad para la hipótesis de que las muestras se estructuraran

en K=3 grupos principales. Esta probabilidad se refleja en el parámetro Ln P(D). En

este caso Ln P(D) no mostró variaciones significativas entre las distintas hipótesis, por

lo que se recurrió al método de Evanno et al. (2005), según el cual el mayor

incremento ΔK de Ln P(D) entre dos hipótesis indica el K (número de grupos) más

probable para la muestra. Esta premisa se cumplió para K=3 grupos (Ln P(D) = -

9247,5; ΔK = 295,8). De entre las 10 carreras ejecutadas con K=3 se estimó una

media mediante el programa CLUMPP. Las proporciones de ascendencia de cada

muestra en cada uno de los tres grupos, obtenidas en esa carrera media, permitieron

Resultados

67

la asignación de los genotipos a su grupo correspondiente. Cada genotipo individual

se asignó al grupo para el que tuvo más de un 70% de probabilidad de ascendencia

(Tabla 4-8).

Tabla 4-8. Proporción de ascendencia de cada genotipo con 22 microsatélites nucleares (nuSSRs) en cada uno de los tres grupos genéticos diferentes estimados con STRUCTURE.

Proporción de Ascendencia Muestra Identidad Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

Asignación

ME1 De José Blanco 0,975 0,010 0,016 1 1BE15 Moscatel de Grano Menudo 0,972 0,017 0,011 1 ME8 Desconocida 0,970 0,016 0,014 1 1BE3 Muscat of Alexandria 0,970 0,014 0,016 1 Bi43 Desconocida 0,956 0,036 0,009 1 Bi25 Perla de Csaba 0,955 0,021 0,024 1 Bi20 Desconocida 0,955 0,028 0,017 1

1BE12 Muscat Hamburg 0,946 0,015 0,039 1 ME6 Desconocida 0,946 0,007 0,047 1 ME5 Desconocida 0,946 0,043 0,011 1 W4 Aramon rupestris 0,938 0,050 0,012 1

TL16 Desconocida 0,936 0,030 0,034 1 TVZ7 Desconocida 0,934 0,049 0,018 1 TO37 Desconocida 0,920 0,026 0,054 1

CONV2 Alphonse Lavallé 0,882 0,094 0,024 1 ME9 Desconocida 0,876 0,110 0,014 1 BE26 Italia 0,875 0,053 0,073 1 W3 Desconocida 0,856 0,021 0,123 1

SF27 Legiruela 0,850 0,027 0,123 1 AR8 Puesta en Cruz 0,838 0,051 0,110 1 Bi19 Desconocida 0,792 0,196 0,012 1

CyL-22 Chasselas Doré 0,790 0,016 0,194 1 1BE14 Moscatel Blanco Gr Menudo 0,786 0,124 0,090 1 TVZ2 Albillo 0,762 0,214 0,024 1 TL13 Centennial Seedless 0,759 0,221 0,020 1 SF8 Moscatel Gordo Peludo 0,713 0,275 0,012 1

SF15 Gordera Negra 0,010 0,979 0,011 2 Ci1 Albillo Mayor 0,010 0,978 0,011 2

CyL-12 Alarije 0,011 0,976 0,014 2 CyL-37 Bobal 0,015 0,976 0,009 2 CyL-26 Juliana 0,015 0,974 0,011 2 CyL-03 Alcazpepita 0,012 0,971 0,018 2 SF12 Moristell 0,016 0,970 0,014 2 SF13 Bruijidera 0,018 0,970 0,012 2 SF34 Morate 0,013 0,967 0,021 2 CB11 Viura 0,013 0,964 0,024 2 1BE9 Red Malaga 0,027 0,959 0,015 2 5BE1 Pleita 0,021 0,957 0,022 2 SF60 Desconocida 0,017 0,956 0,027 2

CyL-39 Tempranillo 0,017 0,954 0,029 2 CyL-10 Salvador 0,036 0,953 0,011 2 SF61 Zalema 0,019 0,951 0,030 2 Ti1 Albillo Real 0,011 0,951 0,038 2

SF14 Cariñena 0,025 0,937 0,038 2 CyL-06 Desconocida 0,034 0,935 0,031 2 SF50 Cojón de Gallo 0,055 0,932 0,013 2

CyL-23 Tolociriana 0,020 0,929 0,051 2 CyL-09 Huerta de Rey 0,062 0,923 0,016 2 TO21 Teta de Vaca 0,048 0,923 0,029 2

Resultados

68

CONV1 Beba 0,063 0,920 0,017 2 CyL-04 Calagraña 0,039 0,916 0,044 2

Bi50 Trepat 0,033 0,900 0,067 2 4BE14 Tarragoní 0,067 0,886 0,047 2

Ci2 Pardillo 0,066 0,878 0,055 2 TO1 Airén 0,106 0,872 0,022 2 Bi13 Garnacha Tintorera 0,072 0,871 0,057 2 AR13 Mantúo 0,012 0,839 0,149 2 2BE1 Jaén Blanco 0,019 0,833 0,148 2 Bi29 Aramon 0,050 0,814 0,136 2 CT02 Garnacha 0,055 0,807 0,138 2 Bi15 De Rey 0,146 0,794 0,061 2 CB08 Palomino 0,103 0,761 0,136 2

CyL-27 Cenicienta 0,179 0,751 0,071 2 AR35 Verdejo Colorado 0,017 0,700 0,283 2

TL3 Prieto Picudo 0,009 0,011 0,980 3

CyL-40 Puesto Mayor 0,010 0,010 0,980 3 CyL-31 Pan y Carne 0,009 0,014 0,977 3

Bi54 Pedro Ximénez Canario 0,014 0,010 0,977 3 TL1 Albarín Blanco 0,016 0,008 0,976 3

2BE3 Albarín Negro 0,016 0,011 0,972 3 Bi21 Brancellao 0,027 0,012 0,961 3 CB09 Sauvignon Blanc 0,027 0,023 0,949 3 PT18 Desconocida 0,018 0,037 0,945 3 Bi4 Negreda 0,025 0,032 0,943 3

CyL-34 Rufete 0,020 0,040 0,940 3 SF46 Calabrés 0,022 0,043 0,936 3

CyL-30 Merenzao 0,016 0,055 0,930 3 ME15 Graciano 0,033 0,037 0,929 3 ME3 Petit Courbu 0,065 0,014 0,921 3 CB10 Verdejo 0,015 0,080 0,905 3 Bi9 Desconocida 0,053 0,053 0,895 3

Bi32 Godello 0,015 0,110 0,875 3 SF18 Desconocida 0,044 0,092 0,864 3 ME12 Matza Zuri 0,131 0,030 0,839 3 ME17 Chardonnay 0,094 0,074 0,832 3 Bi36 Desconocida 0,023 0,151 0,826 3 BE13 Desconocida 0,017 0,158 0,825 3 AR17 Desconocida 0,127 0,051 0,822 3 Bi10 Picapoll 0,127 0,053 0,821 3 SF5 Verdejo Serrano 0,061 0,122 0,818 3 PT5 Cornifesto 0,014 0,192 0,794 3 Bi28 Cagarrizo 0,061 0,147 0,791 3 4BE6 Corbeau 0,199 0,013 0,789 3 Bi11 Doña Blanca 0,024 0,201 0,776 3 Bi8 Grand Noir 0,035 0,193 0,773 3

CT01 Cabernet Sauvignon 0,196 0,053 0,752 3 PT8 Trincadeira 0,023 0,247 0,730 3 Bi37 Monastrell 0,041 0,255 0,704 3 AR14 Juan García 0,014 0,285 0,701 3

Bi1 Negrón de Aldán 0,110 0,200 0,691 Na

Bi48 Petit Verdot 0,310 0,013 0,677 Na PT20 Poilta 0,027 0,341 0,632 Na Bi12 Mencía 0,013 0,358 0,629 Na CT05 Malbec 0,368 0,027 0,606 Na Bi6 Desconocida 0,016 0,418 0,567 Na AR7 Tinta Jeromo 0,015 0,442 0,543 Na W1 Desconocida 0,443 0,026 0,531 Na

Resultados

69

AR4 Sinsó 0,443 0,040 0,517 Na 1BE2 Bougseb 0,065 0,466 0,470 Na AR38 Gajo Arroba 0,049 0,482 0,469 Na Bi22 Allarén 0,010 0,571 0,419 Na Bi7 Mandón 0,024 0,573 0,403 Na

SF17 Ariño 0,027 0,574 0,398 Na Bi3 Rabo de Ovella 0,027 0,583 0,391 Na

TO38 Merlot 0,617 0,011 0,372 Na W2 Desconocida 0,665 0,010 0,325 Na

4BE13 Negra Dorada 0,338 0,338 0,324 Na 1BE1 Kamchiya 0,177 0,524 0,299 Na

CyL-18 Lairén 0,502 0,399 0,100 Na ME10 Señá 0,388 0,525 0,087 Na TO4 Perlon 0,508 0,463 0,030 Na

Veintidós genotipos, de entre los 122 iniciales, no alcanzaron el umbral clasificatorio

para ninguno de los tres grupos propuestos, por lo que quedaron sin asignar (Na).

El grupo 1 de este análisis englobó a todas las muestras relacionadas con el

sustantivo “Moscatel” presentes en la muestra, incluyendo ciertos cultivares locales

cuyos nombres estaban relacionados con aquél o que presentaban ciertos caracteres

morfológicos propios de esta familia de vides, como Moscatel Blanco de Grano

Menudo, Moscatel Gordo Peludo, y el cultivar codificado como TO37. Además, este

grupo incluyó ciertos genotipos identificados con los de variedades foráneas exóticas,

como Centennial Seedless (Estados Unidos de América) o Perla de Csaba (Hungría),

junto con los híbridos identificados y las muestras recogidas fuera de cultivo en la

región.

El Grupo 2 de STRUCTURE albergó diversas variedades locales usadas para la

obtención de uva de mesa, así como un gran número de cultivares de uva blanca

procedentes de viñedos de las tierras del centro de la Meseta Castellana. Destacó la

presencia en esta división de las variedades Tempranillo y Garnacha, muy conocidas y

de muy amplia distribución en España.

Por último, el Grupo 3 incluyó todas las variedades francesas utilizadas para vino del

estudio, junto con variedades representativas de las zonas occidentales de la región,

como Juan García (Arribes del Duero), Prieto Picudo (Tierra de León), Rufete (Sierra

de Francia), Doña Blanca, o Godello (Bierzo). Además, un buen número de los nuevos

genotipos caracterizados quedó encuadrado en esta división.

La representación esquemática de la asignación de cada genotipo a uno de los grupos

genéticos establecidos por este análisis, se presenta en la Figura 4-1:

Resultados

70

Figura 4-1. Proporción de ascendencia de cada genotipo en cada uno de los K=3 grupos genéticos propuestos en base al análisis con STRUCTURE.

Resultados

71

4.2.2.2. Diferenciación entre los grupos genéticos obtenidos

De entre los grupos propuestos en el análisis de estructura, el Grupo 1 fue el que

obtuvo los mayores valores de riqueza alélica (As), diversidad génica (HE), y número

de alelos por locus (Na) (Tabla 4-9), aunque los resultados obtenidos por los dos

grupos restantes para estos parámetros indicaron también una variabilidad y

polimorfismo elevados, superiores al 70% para los parámetros de heterocigosis

considerados, y con más de 6 alelos por locus.

Tabla 4-9. Diversidad genética en los grupos generados con STRUCTURE. Datos (± SD) de 22 loci nucleares: Número medio de alelos por locus (Na), heterocigosis esperada y observada (HE y HO), y riqueza alélica (As).

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Na 9.9 ± 3.0 6.4 ± 2.2 6.4 ±1.77 HO 0.762 ± 0.018 0.759 ± 0.015 0.799 ± 0.015 HE 0.812 ± 0.016 0.713 ± 0.026 0.718 ± 0.027 As 9.86 6.13 01/06/22

Todos los tests de diferenciación genética, basados en el parámetro estadístico FST

entre cada par posible de grupos (Tabla 4-10), arrojaron diferencias estadísticamente

significativas (P < 0.001) cuando se testaron con GENEPOP. La mayor diferenciación

se dio entre los Grupos 2 y 3 (FST = 0.077).

Tabla 4-10. Diferenciación genética entre los tres grupos estimada mediante FST par a par. Grupo 2 Grupo 3 Grupo 1 0.051 0.056 Grupo 2 0.077

Respecto a estas procedencias, y analizando los clorotipos predominantes en cada

uno de los grupos, el Grupo 1 presentó mayoría de clorotipos B y D, típicos de los

cultivares de la familia Moscatel (Laiadi et al. 2009), con significativa presencia de

variedades con clorotipo C. Sin embargo, el clorotipo A, predominante tanto en las

poblaciones silvestres ibéricas como en las vides cultivadas en la Península (Arroyo-

García et al. 2006), prácticamente no tuvo presencia en dicho grupo. Por el contrario,

en los Grupos 2 y 3 el clorotipo A fue abrumadoramente mayoritario, con escasa

presencia de los clorotipos D y C, en su mayoría correspondientes a las vides

francesas de la muestra, y ausencia absoluta del clorotipo B.

Resultados

72

4.2.3. Factores que determinan la variabilidad genética de las vides de

Castilla y León

4.2.3.1. Variación a nivel de genotipos individuales

El análisis factorial de correspondencia (AFC) sobre los genotipos individuales de 22

loci, ordenados en función de los tres factores (representados como ejes) que más

porcentaje explican de la variación total entre los genotipos, se presenta en la Figura

4-2:

tesis.gtx

Axe 1 (4,96 %) 30.00025.000

20.00015.000

10.0005.000

0

Axe

2 (

4,55

%)

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

-80

-100

-120

-140

-160

-180

-200

-220

-240

-260

-280

Axe 3 (3,88 %)

12.00010.0008.0006.0004.0002.0000-2.000-4.000-6.000-8.000-10.000-12.000-14.000-16.000-18.000-20.000-22.000-24.000-26.000

Bi1 1 Bi3 1

Bi4 1

Bi6 1 Bi7 1

Bi9 1

Bi10 1

Bi15 1

Bi19 1

Bi21 1

Bi22 1 Bi28 1

Bi36 1 Bi37 1

Bi50 1

Bi54 1

SF5 1 SF8 1

SF12 1 SF13 1

SF14 1

SF15 1

SF17 1

SF18 1

SF27 1 SF34 1

SF46 1

SF50 1

SF60 1

SF61 1 AR4 1

AR7 1 AR8 1

AR13 1

AR35 1 TL1 1

BE13 1

TO1 1

TO21 1 ME10 1

ME12 1

ME15 1

CONV1 1

1BE1 1 1BE2 1

1BE9 1

1BE14 1

2BE1 1

2BE3 1

4BE13 1 4BE14 1 5BE1 1

Bi13 1

RU1 1

RU3 1 TL3 1

CyL-39 1

RD2 1

Bi12 1 AR14 1

CyL-37 1

CyL-30 1 CyL-31 1

CyL-34 1 CyL-40 1

Ci1 1

TVZ2 1

Ti1 1 CyL-03 1

CyL-04 1 CyL-27 1 Bi11 1

CyL-06 1

Bi32 1

CyL-09 1 CyL-26 1 CyL-18 1 TO37 1

CyL-10 1 CyL-12 1

Ci2 1

CyL-23 1

RU4 1 AR38 1 PT8 1 PT5 1

PT18 1

PT20 1 ME17 1

TO38 1

RD3 1 RD1 1 CyL-22 1 RU2 1 Bi48 1 ME3 1

4BE6 1

Bi8 1

W1 1 W2 1

W3 1

Bi25 1

Bi29 1

TL13 1

BE26 1

TO4 1

CONV2 1

1BE3 1

1BE12 1 1BE15 1

Bi43 1

Bi20 1

TL16 1

TVZ7 1

ME1 1

ME5 1

ME6 1

ME8 1

ME9 1

W4 1

AR17 1

Figura 4-2. Posición espacial de los genotipos en función de los tres factores que más porcentaje explican de la varianza genética total entre individuos, según el AFC.

En el gráfico se observa cómo un cierto número de genotipos, representados como

puntos en el mapa, actúan como outliers, distorsionando la visualización. Estos

genotipos, coincidentes en su mayoría con algunos de los posibles híbridos

interespecíficos detectados en la muestra, resultan tan diferentes del resto respecto de

los tres factores principales de variación que impiden ver suficientemente desplegada

la disposición espacial del grupo principal de muestras, el cual aglutina la inmensa

mayoría de la información. En consecuencia, el análisis se repitió excluyendo los

genotipos outliers, obteniéndose la configuración que se presenta a continuación

(Figura 4-3):

Resultados

73

tesis.gtx

Axe 1 (5,05 %) 6.0004.0002.0000-2.000-4.000-6.000-8.000-10.000-12.000-14.000-16.000

Axe

2 (

4,40

%)

40

20

0

-20

-40

-60

-80

-100

-120

-140

-160

-180

Axe 3 (3,78 %)

20.00018.00016.00014.00012.00010.0008.0006.0004.0002.0000-2.000-4.000-6.000

Bi1 1 Bi3 1

Bi4 1

Bi6 1

Bi7 1

Bi9 1

Bi10 1

Bi15 1

Bi19 1

Bi21 1

Bi22 1

Bi28 1

Bi36 1

Bi37 1

Bi50 1

Bi54 1

SF5 1

SF8 1

SF12 1 SF13 1 SF14 1

SF15 1

SF17 1

SF18 1

SF27 1

SF34 1

SF46 1

SF50 1

SF60 1

SF61 1

AR4 1

AR7 1

AR8 1

AR13 1

AR35 1

TL1 1

BE13 1

TO1 1 TO21 1 ME10 1 ME12 1

ME15 1 CONV1 1 1BE1 1

1BE2 1

1BE9 1

1BE14 1

2BE1 1

2BE3 1

4BE13 1

4BE14 1 5BE1 1 Bi13 1

RU1 1

RU3 1 TL3 1

CyL-39 1

RD2 1 Bi12 1

AR14 1 CyL-37 1

CyL-30 1 CyL-31 1

CyL-34 1 CyL-40 1

Ci1 1

TVZ2 1

Ti1 1

CyL-03 1 CyL-04 1 CyL-27 1

Bi11 1

CyL-06 1

Bi32 1

CyL-09 1 CyL-26 1

CyL-18 1

TO37 1

CyL-10 1

CyL-12 1

Ci2 1 CyL-23 1 RU4 1

AR38 1

PT8 1

PT5 1

PT18 1

PT20 1

ME17 2

TO38 2 RD3 2

RD1 2

CyL-22 2

RU2 2

Bi48 2

ME3 2

4BE6 2

Bi8 2

W1 3

W2 3

W3 3

Bi25 4

Bi29 4

TL13 4

BE26 4

TO4 4

CONV2 4

1BE3 4

1BE12 4

1BE15 4

Figura 4-3. Posición espacial de los genotipos en función de los tres factores que más porcentaje explican de la varianza genética total entre individuos, según el AFC, excluyendo outliers. En Blanco: muestras silvestres. En Azul: genotipos franceses. En Amarillo: genotipos ibéricos. En Gris: genotipos exóticos.

Desplegada sobre los dos ejes principales, representativos de los dos factores que

mejor (%) explican la variabilidad genética de la muestra, la información quedaría

como sigue (Figura 4-4):

Figura 4-4. Posición espacial de los genotipos en función de los 2 factores (ejes X e Y) que más explican la varianza genética total entre individuos, según el AFC, excluyendo outliers. En Blanco: muestras silvestres. En Azul: genotipos franceses. En Amarillo: genotipos ibéricos. En Gris: genotipos exóticos.

Respecto del eje horizontal, correspondiente al primer factor de variación, que explica

el 5,05% de la misma, las muestras recogidas en ambiente salvaje (coloreadas en

blanco en la Figura 4-4) se situaron en el extremo del cuadrante negativo, claramente

alejadas de las provenientes de cultivo. Los genotipos de variedades francesas (en

es s.g

Axe 1 (5,05 %)0-1

Axe

2 (4

,40

%)

0

-1

Bi1 1

Bi3 1

Bi4 1

Bi6 1

Bi7 1

Bi9 1

Bi10 1

Bi15 1

Bi

Bi21 1

Bi22 1

Bi28 1

Bi36 1

Bi37 1

Bi50 1

Bi54 1

SF5 1

SF8

SF12 1 SF13 1 SF14 1

SF1

SF17 1

SF18 1

SF27 1

SF34 1

SF46 1

SF50 1

SF60 1

SF61 1

AR4 1

AR7 1

AR8 1

AR13 1

AR35 1

TL1 1

BE13 1

TO1 1 TO21 1

ME10 1 M E12 1 ME15 1 CONV1 1

1BE1 1

1BE2 1

1B

1BE14 1

2BE1 1

2BE3 1

4BE13 1

4BE14 1

5BE1 1 Bi13 1

RU1 1

RU3 1 TL3 1

CyL-39 1

RD2 1 Bi12 1

AR14 1 CyL-37 1

CyL-30 1 CyL-31 1

CyL-34 1

CyL-40 1

Ci1 1

TVZ2 1

Ti1 1

CyL-03 1

CyL-04 1 CyL-27 1

Bi11 1

CyL-06 1

Bi32 1

CyL-09 1

CyL-26 1

CyL-18 1

TO37 1

CyL-1

CyL-12 1

Ci2 1

CyL-23 1 RU4 1

AR38 1

PT8 1

PT5 1

PT18 1

PT20 1

M E17 2

TO38 2

RD3 2

RD1 2

CyL-22 2

RU2 2

Bi48 2

ME3 2

4BE6 2

Bi8 2

W1 3

W2 3

W3 3

Bi25 4

Bi29 4

TL13 4

BE26 4

TO4 4

CONV2 4

1BE3 4

1BE12 4

1BE15 4

Resultados

74

azul) aparecieron cercanos entre sí y, hasta cierto punto, a los de los individuos

silvestres, en especial Merlot (TO38), Corbeau (4BE6), y Petit Courbu (ME3). Todavía

en el cuadrante negativo respecto del eje horizontal, el siguiente grupo en aparecer

representado corresponde a variedades ibéricas (en amarillo) en su mayoría típicas de

las demarcaciones occidentales de Castilla y León, como es el caso de Rufete (CyL-

34), Prieto Picudo (TL3), Merenzao (CyL-30), Albarín Negro (2BE3), etc., así como de

genotipos hasta ahora desconocidos recogidos en esas mismas comarcas, como los

de Cornifesto (PT5), Verdejo Serrano (SF5), o Calabrés (SF46), entre otros. Por su

parte, los genotipos identificados con los de variedades foráneas de diversas

procedencias (en gris) se situaron en el extremo positivo respecto del eje horizontal en

el diagrama, en general, a la misma altura que el resto de variedades ibéricas (en

amarillo).

En cuanto al eje vertical, que corresponde al segundo factor principal de variación

individual, que explica el 4,40% de la misma, el grueso de los genotipos quedaron en

el cuadrante positivo del eje, mientras que en el negativo se situaron genotipos en su

mayoría correspondientes a variedades de uva de mesa. El extremo del eje negativo lo

ocuparon variedades foráneas de mesa de distintas procedencias (en gris), en

especial las de la familia Moscatel, como Muscat of Alexandria (1BE3), Muscat

Hamburg (1BE12), Italia (BE26), o Moscato Bianco (1BE15), acompañadas de

variedades locales castellano-leonesas cuyas características morfológicas y

denominación local ya las acercaban a dicha familia, como Moscatel Gordo Peludo

(SF8) ó Moscatel Blanco de Grano Menudo (1BE14).

Dado que se observó una remarcable coincidencia entre la disposición de los

genotipos respecto de los factores principales de variación y los grupos genéticos

propuestos por los análisis de estructura (ver punto 4.3.2.), se repitió el análisis, de

nuevo desde el enfoque individual, pero identificando a cada genotipo según su

pertenencia a uno u otro de los grupos propuestos por STRUCTURE, lo que ofreció la

siguiente perspectiva (Figura 4-5):

Resultados

75

tesis.gtx

Axe 1 (5,05 %)0-1

Axe

2 (4

,40

%)

0

-1

Figura 4-5. Posición espacial de los genotipos en función de los 2 factores (ejes X e Y) que más procentaje explican de la varianza genética total entre individuos, al aplicar AFC, excluyendo outliers. Colores en función de los grupos de STRUCTURE. En Amarillo: genotipos del Grupo 1. En Azul: genotipos del Grupo 2. En Blanco: genotipos del Grupo 3. En Gris: genotipos no asignados a ningún grupo.

El AFC parece confirmar la estructura genética propuesta, al tender los genotipos a

aglutinarse en consonancia con sus colores, intuyéndose grupos bien definidos.

4.2.3.2. Variación a nivel de grupos

- Grupos genéticos

Los resultados del análisis respecto de los factores que influyen en la variación entre

los grupos genéticos propuestos por STRUCTURE se presentan a continuación

(Figura 4-6):

Resultados

76

tesis.gtx

Axe 2 (39,37 %)8.0006.0004.0002.0000-2.000-4.000-6.000-8.000

Axe

1 (

50,3

6 %

)

140

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

Axe 3 (10,27 %)

12.00011.00010.0009.0008.0007.0006.0005.0004.0003.0002.0001.0000-1.000-2.000-3.000-4.000-5.000-6.000-7.000

Figura 4-6. Posición espacial de los genotipos en función de los 3 factores que más porcentaje explican de la varianza genética entre los grupos propuestos por STRUCTURE, según el AFC. En Amarillo: genotipos del Grupo 1. En Azul: genotipos del Grupo 2. En Blanco: genotipos del Grupo 3. En Gris: genotipos no asignados a ningún grupo.

Los tres factores representados en los ejes explicaron el 100% de la variación entre

grupos del análisis de estructura. Los Grupos 2 (en azul en el diagrama) y 3 (en

blanco), aparecieron muy alejados entre sí a lo largo del eje horizontal y solapados

respecto del vertical, mientras que el Grupo 1 quedó en posición intermedia respecto

del eje horizontal, y aislado de los otros respecto del vertical. Los genotipos no

asignados quedaron en posiciones intermedias a todos los niveles.

- Grupos geográficos

El AFC respecto de los tres factores más explicativos de la variación entre grupos

geográficos de variedades: Ibéricas, Francesas, silvestres, y Otras Foráneas,

identificados según la información del Vitis Internacional Variety Catalogue, se

presenta en la Figura 4-7:

Resultados

77

tesis.gtx

Axe 1 (34,83 %)

5.0000

-5.000-10.000

-15.000-20.000

-25.000-30.000

-35.000-40.000

Axe

2 (

29,3

9 %

)

260

240

220

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

-20

-40

Axe 3 (20,56 %)

15.00014.00013.00012.00011.00010.0009.0008.0007.0006.0005.0004.0003.0002.0001.0000-1.000-2.000-3.000

Figura 4-7. Posición espacial de los genotipos en función de los 3 factores que más porcentaje explican de la varianza genética entre grupos geográficos, según el AFC. En Amarillo: genotipos ibéricos. En Azul: genotipos franceses. En Blanco: genotipos silvestres. En Morado: genotipos de otras procedencias foráneas. En Gris: híbrido demostrado.

La suma de los tres factores explicó el 84% de la variación entre los grupos

establecidos según su procedencia geográfica. El punto gris, muy apartado del resto

en el diagrama, corresponde al híbrido comprobado de la muestra. Las muestras

silvestres se mostraron también alejadas del resto, más próximas al grupo de

variedades francesas que a las de las demás procedencias.

4.2.3.3. Variación en cuanto al uso

Por último, se identificó a cada variedad en función de su uso (vino o mesa), y se

repitió el análisis a nivel de variación individual (Figura 4-8):

Resultados

78

tesis.gtx

Axe 1 (5,35 %)0-1

Axe

2 (5

,04

%)

0

-1

Figura 4-8. Posición espacial de los genotipos en función de los 2 factores que más porcentaje explican de la varianza genética entre individuos, según el AFC. En Azul: uso para vino. En Amarillo: uso para uva de mesa.

En el gráfico se comprueba que los genotipos asignados a los usos respectivos de

vino (en azul) y mesa (en amarillo) ocupan áreas separadas en cierto grado en el

diagrama, estando los de uva de mesa agrupados en su mayoría en el cuadrante

positivo respecto a abscisas y negativo respecto a ordenadas, mientras que los de

vino tienden a posicionarse en el cuadrante negativo respecto a abscisas y positivo

respecto a ordenadas.

4.2.4. Análisis de la varianza molecular

Los resultados del AMOVA, tomando la procedencia geográfica y el uso como

principales factores de la variación genética entre los genotipos, se presentan en la

Tabla 4-11. Por consiguiente, para la ejecución de estos análisis se dividió la muestra

en cuatro grupos: Ibéricas de vino, Ibéricas de mesa, Francesas de vino, y Resto de

Foráneas de mesa, según la información disponible en el Vitis internacional Variety

Catalogue (VIVC, www.vivc.bafz.de). Se excluyeron expresamente las muestras

recogidas en ambiente silvestre, porque, al conformar un grupo muy pequeño en

comparación con los cuatro citados, introducían gran sesgo en el análisis. Asimismo,

quedaron fuera de dicha clasificación, basada en el origen geográfico y el uso, todas

aquellas muestras para las cuales no se encontró información disponible en el VIVC, o

bien ésta fue ambigua, con el fin de garantizar lo más posible la fiabilidad de los

resultados.

Resultados

79

Tabla 4-11. Resultados de los diseños de AMOVA. Tests de significación estadística basados en 16000 permutaciones, realizados con el programa Arlequin. Factor de variación gl* Suma de

cuadrados Componentes de la

Varianza % de variación

explicado Procedencia geográfica: Ibérica, Francesa, Otros Entre grupos (grupos geográficos) 2 35,878 0.14980 Va 1.76 Entre poblaciones (Vino vs. Mesa) dentro de cada grupo

1 18.593 0.19063 Vb 2.24

Entre individuos dentro de cada población

156 1276.767 8.18440 Vc 96.01

Total 159 1331.237 8.52483 FST = 0.040, Vc y FST: P = 0.0000 ; media ponderada sobre los 22 loci P = 0.0000

FSC = 0.023, Vb y FSC: P = 0.0000 ; media ponderada sobre los 22 loci P = 0.0000

FCT = 0.018, Va y FCT: P = 0.3363 ; media ponderada sobre los 22 loci P = 0.0032

Utilización: Vino vs. Uva de Mesa Entre grupos (Vino vs. Mesa) 1 26.274 0.10896 Va 1.28 Entre poblaciones (grupos geográficos) dentro de cada grupo

2 28.197 0.20349 Vb 2.39

Entre individuos dentro de cada población

156 1276.767 8.18440 Vc 96.32

Total 159 1331.237 8.49685 FST = 0.037, Vc y FST: P = 0.0000 ; media ponderada sobre los 22 loci P = 0.0000

FSC = 0.024, Vb y FSC: P = 0.0000 ; media ponderada sobre los 22 loci P = 0.0000

FCT = 0.013, Va y FCT: P = 0.3338 ; media ponderada sobre los 22 loci P = 0.0002

* grados de libertad

El AMOVA jerárquico contrastando las diferentes procedencias geográficas de las

muestras no reveló varianza significativa (FCT = 0.018, P > 0.05) en el diseño global, si

bien estuvo cercano a la significación estadística para un intervalo de confianza del

99,9% cuando el análisis se basó en una media ponderando los 22 loci (P = 0.003; >

0.001). El segundo nivel de este análisis, juzgando la varianza en función del uso (vino

ó mesa) de las variedades agrupadas según procedencia, sí fue significativo (FSC =

0.023, P < 0.001).

El segundo diseño AMOVA, contrastando en esta ocasión en el nivel superior el uso

de las variedades, tampoco mostró significación en el planteamiento global (FCT =

0.013, P > 0.05), pero sí fue significativo para una confianza del 99,9% cuando se

basó en la media ponderada de los 22 loci (P = 0,0002; < 0,001). El segundo nivel de

este diseño, testando la procedencia geográfica dentro de los grupos basados en el

uso, también resultó significativo (FSC = 0.024, P < 0.001).

En ambos casos, la varianza a nivel de genotipos individuales explicó el mayor

porcentaje de la variación genética total en la muestra (96%), mientras que las

Resultados

80

varianzas debidas a la procedencia geográfica y el uso de las variedades explicaron

tan sólo el 4% restante.

4.3. RELACIONES GENÉTICAS Y POSIBLES ORÍGENES DE LAS

VARIEDADES AUTÓCTONAS

Comparando par a par todas las combinaciones posibles de los genotipos de 22 loci

obtenidos, se comprobó que un buen número de las parejas posibles podrían

presentar relaciones genéticas de primer grado, puesto que cumplían la premisa de

compartir al menos un alelo por cada uno de los loci analizados, y además,

frecuentemente coincidían en características morfológicas, recibían nombres similares,

o pertenecían a viñedos de una misma área geográfica. Por todo ello, en el presente

trabajo se estudió la probabilidad de parentesco entre variedades a través de un

enfoque múltiple, que combina los resultados de diferentes estimaciones estadísticas:

porcentaje de alelos compartidos IBS (Identical By State); valor de bootstrap obtenido

por cada relación en el más significativo de los dendrogramas construidos con

diferentes medidas de distancia genética y diferentes algoritmos (ver epígrafe 3.4.4.);

coeficiente de relación (r); y ratios de probabilidad (LR, Likelihood Ratios) de

parentesco establecidos a través de cálculo bayesiano, con simulaciones realizadas

por el algoritmo MCMC (Cadenas de Montecarlo de Markov). A estas estimaciones se

unió la información aportada por los clorotipos de cada variedad, y por fuentes

históricas y culturales, para contrastar, en conjunto, la coherencia de los parentescos

propuestos.

4.3.1. Dendrogramas

Los dendrogramas construidos según los algoritmos Neighbour-Joining (en adelante

NJ) y UPGMA obtuvieron bajos valores de bootstrap en sus nodos principales, por lo

que la clasificación en grupos propuesta por los mismos careció de significación

estadística. El árbol con mayor número de valores de bootstrap por encima de 70%

(10 valores) fue el construido a partir de la distancia DA y mediante el algoritmo NJ

(Figura 4-9). Los tres árboles restantes se descartaron, y se muestran en este

documento como material complementario en las Figuras de la A-1 a la A-3 del Anejo

I. El algoritmo NJ no asume una tasa de mutación única para todas las ramas del árbol

filogenético, y fue considerado por sus autores (Saitou y Nei 1987) como el más

Resultados

81

eficiente para obtener topologías correctas con simulaciones informáticas. Los mismos

autores consideraron la distancia DA como la que asegura mayor corrección en las

ramas cuando se trabaja con microsatélites (Takezaki and Nei 2008). Aunque sin

suficiente significación estadística, en este dendrograma se observa una división de

los 122 genotipos discriminados en tres grupos principales en función de sus

distancias genéticas. El primer grupo se denominó Garnacha, por ser la variedad más

representativa de entre las incluidas en él. El segundo grupo quedó a su vez dividido

en dos subgrupos: el subgrupo Francia, en el que quedaron incluidas todas las

variedades francesas usadas para producir vino que figuraban en la muestra; y el

subgrupo Tempranillo, con esta conocida variedad como representante más

destacado. El tercer grupo se denominó Moscatel, por incluir a todas las muestras

cuyo nombre se relacionaba con esta familia.

En líneas generales, las divisiones propuestas por el dendrograma NJ coincidieron en

buena medida con las sugeridas por el análisis con STRUCTURE. Así, la suma del

grupo Garnacha y el subgrupo Tempranillo coincidió, grosso modo, con el contenido

del Grupo 2 del análisis de estructura. Por su parte, el contenido de la división

Moscatel fue equiparable al del Grupo 1 del análisis realizado con STRUCTURE,

aunque éste último englobó mayor número de genotipos. Por último, el contenido del

subgrupo Francia del dendrograma se asemejó en gran medida al del Grupo 3

sugerido en el análisis de estructura.

Resultados

82

Figura 4-9. Dendrograma representando las relaciones filogenéticas entre los 122 genotipos discriminados en el estudio, construido por el método Neighbour-Joining, con los datos de 22 microsatélites nucleares.

Resultados

83

4.3.2. Posibles parentescos

La inclusión en el estudio de parejas de variedades con relaciones de parentesco

descritas con anterioridad permitió evaluar la adecuación de los Likelihood Ratios (LR)

obtenidos mediante simulaciones con el programa KINGROUP. Así, se conocían

previamente las siguientes relaciones de la categoría parental-progenie (PO, del inglés

Parent-Offspring): Sauvignon Blanc y Cabernet Sauvignon (Bowers y Meredith 1997),

Muscat Hamburg e Italia (www.vivc.bafz.de), Muscat of Alexandria y Moscatel de

Grano Menudo (sinónimo de Muscat aux Petit Grains y de Moscato Bianco) (Crespan y

Milani 2001), y de Garnacha Tintorera (sinónimo de Alicante Bouschet) con Garnacha

(Cabezas et al. 2003).

Los LR obtenidos en el presente trabajo para todas estas parejas de referencia

confirmaron la categoría de relación PO. Dado que los coeficientes de relación (r) que

mostraron las mismas variaron entre los valores 0,470 y 0,602, se fijó r = 0,470 como

umbral a partir del cual se investigaron parentescos. Un total de 45 de los

emparejamientos posibles en el estudio (contando con las de referencia), superaron

dicho umbral, siendo los r correspondientes a todos ellos estadísticamente

significativos (P < 0.001, testados con KINGROUP). Las 45 parejas, ordenadas en

función de los grupos determinados por el análisis de estructura genética, y sus

parámetros para el estudio de parentesco, se presentan en la Tabla 4-12.

Resultados

84

Tabla 4-12. Estimadores de parentesco. Alelos IBS Pares de genotipos Clorotipo loci %

r Categoría según LR

Grupo 1 : Moscatel Albillo Real (TVZ2)– Legiruela (SF27) A – A 22 64 0.564 PO Moscatel de Grano Menudo (1BE15)– Muscat of Alexandria (1BE3) D – B 22 61 0.562 PO Moscatel Gordo Peludo (SF8)– Muscat of Alexandria (1BE3) A – B 21 66 0.552 FS*

Lairén (CyL-18)– Legiruela (SF27) A – A 22 66 0.547 PO Wild 3 (W3) – Wild 2 (W2) A – A 19 57 0.533 FS/HS Moscatel de Grano Menudo (1BE15)– Moscatel Blanco de Grano Menudo (1BE14) D – A 22 59 0.480 PO Muscat Hamburg (1BE12) – Italia (BE26) D – C 22 61 0.470 PO Grupo 2 : Meseta Castellana Central Garnacha (CT02) – Garnacha Tintorera (Bi13) A – A 22 70 0.602 PO/FS Alcazpepita (CyL-03)– Pardillo (Ci2) A – A 20 70 0.565 FS Cojón de Gallo (SF50) – Verdejo Colorado (AR35) A – A 21 66 0.563 PO Albillo Mayor (Ci1)– Tempranillo (CyL-39) A – A 22 64 0.555 PO Mantúo (AR13)– Colgadera (SF15) A – A 19 59 0.519 FS/HS Cojón de Gallo (SF50) – Teta de Vaca (TO21) A – C 22 61 0.506 PO Marta Nava (CyL-10)– Pleita (5BE1) D – D 22 59 0.503 PO Pleita (5BE1)– Morate (SF34) D – A 21 62 0.555 PO Mantúo (AR13) – Teta de Cabra (1BE2) A – C 22 59 0.488 PO Marta Nava (CyL-10)– Morate (SF34) D – A 20 62 0.485 FS*

Alcazpepita (CyL-03) – Tolociriana (CyL-23) A – A 22 57 0.485 PO Albillo Mayor (Ci1) – Doradilla2 (CyL-06) A – C 21 61 0.482 FS*

Alcazpepita (CyL-03) – Calagraña (CyL-04) A – D 21 61 0.481 FS*/HS Viura (CB11)– Morate (SF34) A – A 20 60 0.478 HS Pleita (5BE1) – Mazuelo (SF14) D – A 21 64 0.477 FS*

Cojón de Gallo (SF50)– Brujidera (SF13) A – D 22 64 0.474 PO Albillo Mayor (Ci1) – Tolociriana (CyL-23) A – A 22 57 0.472 PO Morisco (2BE1)– Bi6 A – D 22 61 0.470 PO Grupo 3 : Meseta Castellana Occidental BE13 – Cornifesto (PT5) A – A 22 68 0.600 FS Albarín Negro (2BE3) – Prieto Picudo (TL3) A – A 21 73 0.570 FS Sauvignon Blanc (CB09)– Merenzao (CyL-30) D – A 21 73 0.558 FS*

Graciano (ME15) – Bi9 A – A 22 66 0.541 PO Puesto Mayor(CyL-40) – Prieto Picudo (TL3) A – A 22 75 0.539 FS Puesto Mayor (CyL-40)– Rufete (CyL-34) A – A 22 70 0.538 PO/FS Verdejo Serrano (SF5)– Negreda (Bi4) A – A 22 66 0.526 PO/FS Godello (Bi32)– Verdejo (CB10) A – A 20 68 0.515 FS Juan García (AR14)– Morisco (2BE1) A – A 22 66 0.505 PO Ariño (SF17)– Monastrell (Bi37) A – A 20 66 0.505 FS Graciano (ME15)– Falso Rufete (SF18) A – A 20 61 0.513 FS Graciano (ME15)– Mandón (Bi7) A – A 22 64 0.500 PO Pan y Carne 2 (CyL-31)– Merenzao (CyL-30) D – A 21 66 0.495 FS*

Albarín Negro (2BE3)– Cornifesto (PT5) A – A 22 59 0.490 PO Graciano (ME15)– Monastrell (Bi37) A – A 21 66 0.486 FS Matza Zuri (ME12)– Negrón de Aldán (Bi1) A – A 20 64 0.480 FS Doña Blanca (Bi11)– Morisco (2BE1) A – A 21 66 0.475 PO/FS*

Albarín Blanco (TL1)– Pedro Ximénez Canario(Bi54) D – D 20 68 0.475 FS Sauvignon Blanc (CB09)– Cabernet Sauvignon(CT01) D – D 22 61 0.471 PO Sin Asignación Teta de Cabra Tinta (4BE13)– Teta de Cabra (1BE2) C – C 22 66 0.523 PO Abreviaturas: LRs, Likelihood Ratios / PO: Parent-Offspring (Parental-Progenie) / FS: Full Siblings (Hermanos Completos / HS: Half Siblings (Medio Hermanos) Las itálicas indican variedades cuyo nombre se ha modificado al demostrarse erróneo tras la identificación de genotipos en las bases de datos disponibles. *Sugerencias de Full-Siblings con sólo un locus en desacuerdo para catalogarse como Parent-Offspring.

Resultados

85

Las ocho parejas cuya sugerencia de relación Full-Siblings se muestra marcada con

un asterisco requerirían dos cruces recíprocos independientes para hacer esa

sugerencia válida, ya que los clorotipos no coinciden. En todos estos casos sólo existe

un locus en desacuerdo con la posibilidad de relación Parent-Offspring, y siempre al

menos uno de los dos miembros de la pareja fue homocigoto para el locus problema.

Conocidos estos datos, la explicación más plausible para la desavenencia de

clorotipos podría ser que en realidad se trate de relaciones de categoría PO,

enmascarada por la incidencia de alelos no amplificados en el análisis.

Dentro del Grupo 1 ó “Moscatel”, siete parejas de variedades mostraron relaciones

potencialmente interesantes. Moscatel Blanco de Grano Menudo, una variedad

recogida en la demarcación Valles de Benavente, con genotipo hasta ahora no

documentado, apareció relacionada (r = 0,480) con Moscatel de Grano Menudo, una

variedad más extendida y previamente descrita bajo diferentes sinónimos (por

ejemplo, Muscat aux Petit Grains ó Moscato Bianco). Los LR sugirieron una relación

de tipo Parental-Progenie (PO) entre ellas (P < 0.001 de PO frente al resto de posibles

categorías de relación, calculado con KINGROUP), y en el dendrograma NJ ambos

genotipos ocuparon posiciones adyacentes, con bootstrap de 54%. Además, el

nombre de ambas variedades es manifiestamente similar, y ambas muestras

procedieron de viñedos de la misma demarcación geográfica, si bien el genotipo de

Moscatel de Gr. Menudo apareció también en Toro, bajo el nombre de Moscatel de

Toro. Moscatel Blanco de Gr. Menudo presentó clorotipo A, mientras que Moscatel de

Gr. Menudo, mostró el clorotipo D, característico de vides orientales (Arroyo-García et

al. 2006) y más relacionado con la familia Moscatel (Laiadi et al. 2009). En un caso

similar, la conocida variedad Muscat of Alexandria (recogida en Valles de Benavente

bajo el nombre de Moscatel Romano), resultó estrechamente relacionada (r = 0.552 y

NJ bootstrap = 54%) con Moscatel Gordo Peludo, variedad recogida en la

demarcación de Sierra de Francia, sinónima de Gordera Roja. En este caso, Muscat of

Alexandria presentó el clorotipo B, considerado ancestral en Vitis vinifera L., pues está

presente en toda el área de distribución de la misma aunque con baja frecuencia

(Arroyo-García et al. 2006), y es también típico en la familia Moscatel (Laiadi et al.

2009). Por contra, Moscatel Gordo Peludo mostró el clorotipo A, típico de las vides

ibéricas. Dentro de este grupo se dio, además, un caso de significativa relación a tres

bandas implicando a Albillo, presente en distintas áreas de la región bajo el apelativo

de Albillo Real; Lairén, recogida en el Banco de Germoplasma de Vid de Castilla y

León (BGVCyL) bajo el nombre erróneo de Temprana Agosteña; y Legiruela, recogida

en Sierra de Francia. Las tres son de uva blanca y compartieron el clorotipo A,

Resultados

86

presentando elevados r y bootstraps, y sus interrelaciones fueron sugeridas como PO

en el análisis de LR. Los genotipos de vid silvestre W2 y W3 fueron propuestos como

FS ó HS por los LR, con un significativo soporte estadístico (r = 0,533 y NJ bootstrap =

90%).

En el Grupo 2 (“Meseta Castellana Central”), dieciocho pares de variedades resultaron

candidatas a tener relaciones genéticas de primer grado. Alcazpepita, una variedad

local de uva blanca originaria de los viñedos de la demarcación de Rueda, y sinónima

de la también española Cañorroyo, reveló, según los LR, una posible relación de

Hermanos Completos (FS), con Pardillo (r = 0.565 y NJ bootstrap = 64%), ambas

compartiendo el clorotipo A. Alcazpepita manifestó también alto grado de relación (r =

0.485) con Tolociriana (sin: Castellana Blanca), otra variedad local de uva blanca

ligada al territorio de Rueda y también con clorotipo A ibérico. Del mismo modo,

Alcazpepita se relacionó estrechamente con Calagraña (r = 0,481), variedad de uva

blanca cultivada también en Rueda, con clorotipo D, sinónima de la griega Katsano.

Por su parte, la bien conocida variedad Tempranillo, mostró dentro de este grupo una

relación muy significativa (PO, P < 0.001) con Albillo Mayor (r = 0.555 y NJ bootstrap =

72%), otra variedad, de uva blanca, procedente de Rueda. Ambas variedades

presentaron clorotipo A, y su relación ya había sido sugerida en trabajos anteriores

(Martín et al. 2006). Albillo Mayor, a su vez, mostró estrechas relaciones con otras

variedades de uva blanca de la misma área, como CyL-06 (r = 0.482), variedad de

genotipo desconocido y clorotipo C, erróneamente recogida como Doradilla en el

BGVCyL, y Tolociriana (r = 0.472). Las variedades Verdejo Colorado y Cojón de Gallo

(r = 0.563), cuyos genotipos no habían sido hasta ahora publicados, podrían tener una

relación PO (P < 0.001). Sus correspondientes muestras procedieron de viñedos de

Arribes del Duero y Sierra de Francia, ambos en Salamanca, y presentaron clorotipo

A. Cojón de Gallo, a su vez, podría mantener una relación del tipo PO con Teta de

Vaca (r = 0,506), variedad usada como uva de mesa, con clorotipo C, recogida en la

demarcación de Toro, y con Brujidera (r = 0,574), variedad tinta con clorotipo D, más

extendida y conocida.

En lo que respecta al Grupo 3, “Meseta Castellana Occidental”, un total de diecinueve

pares de variedades cumplieron los requisitos fijados para el análisis de parentesco.

La variedad francesa Sauvignon Blanc, con clorotipo D, se mostró candidata a

mantener una relación PO con Merenzao (r = 0.558 y NJ bootstrap = 48%), una

variedad de uva tinta presente en diversas zonas del occidente de la región,

inicialmente etiquetada en el BGVCyL como Pan y Carne 1. Su homónima Pan y

Resultados

87

Carne 2, con clorotipo D y genotipo hasta ahora no referenciado, apareció

estrechamente relacionada con ella (r = 0,495). Por su parte, Albarín Negro, variedad

tinta típica de Asturias cuyo genotipo apareció bajo diferentes nombres en varias

demarcaciones occidentales de la Meseta en este sondeo, tomó parte en otra

presumible relación PO (r = 0,490) con Cornifesto, variedad recogida en Arribes del

Duero, cuyo genotipo resultó desconocido hasta la fecha para las bases de datos

consultadas y que, a su vez, mostró un destacable nivel de relación (r = 0.600 y NJ

bootstrap = 74%) con otro genotipo hasta ahora no documentado, cuya muestra se

codificó como BE13, proveniente de Valles de Benavente. Las tres muestras

anteriormente referidas presentaron clorotipo A. Otro de los genotipos hasta ahora

desconocidos, correspondiente a una variedad recogida en la demarcación de Sierra

de Francia como Verdejo Serrano, se implicó también en una posible relación de

primer grado, PO ó FS, con Negreda, cultivar local de la zona del Bierzo, ambas con

clorotipo A, apoyada estadísticamente por unos elevados r (0,526) y NJ bootstrap

(88%). Por otro lado, las variedades tintas Prieto Picudo (variedad representativa de

Tierra de León) y Puesto Mayor (recogida como Verdejo Tinto en el Bierzo) mostraron

una estrecha relación (r = 0,539). Puesto Mayor, a su vez, se relacionó con Rufete

(variedad representativa de Sierra de Francia), con valores significativos (r = 0.538 y

NJ bootstrap = 46%). De nuevo, los tres cultivares presentaron el clorotipo A. Las

variedades de uva blanca Verdejo y Godello, también con clorotipo A, manifestaron

una relación muy estrecha, siendo catalogadas como posibles FS (P < 0.001), dato

apoyado por unos elevados NJ bootstrap (72%) y (r = 0.515). Otras variedades

representativas de las comarcas occidentales, como Juan García (Arribes del Duero),

ó Doña Blanca (Bierzo), también resultaron implicadas en posibles parentescos de

primer grado con una tercera variedad recogida como Morisco en Valles de

Benavente, sinónima de Jaén Blanco. Por último, destacan las posibles relaciones de

primer grado exhibidas en este grupo por variedades tradicionales de otras latitudes

españolas, como Graciano (Rioja), Monastrell (Levante), ó Pedro Ximénez Canario

(Canarias), las cuales aparecieron relacionadas tanto entre sí como, en el caso de

Graciano, con variedades locales provenientes de comarcas occidentales de la

Meseta, con genotipos hasta ahora no documentados, como SF18 o Bi9.

Dentro del grupo de variedades que no se asignaron a ninguno de los grupos apareció

una relación genética muy significativa entre las variedades de uva de mesa Teta de

Cabra (sinónimo de Bougseb, cultivar norteafricano) y Teta de Cabra Tinta (sinónimo

de Negra Dorada), cuyas muestras se recogieron en la demarcación de Valles de

Benavente. Además de la evidente similitud nominal, los LR apuntaron a un

Resultados

88

parentesco tipo PO (P < 0,001) entre ellas, con r = 0,523 y NJ bootstrap = 90%.

Ambas compartieron el clorotipo C, relacionado con variedades empleadas para uva

de mesa (Arroyo-García et al. 2006).

4.4. DETECCIÓN Y COMPROBACIÓN DE SNPS CLOROPLÁSTICOS

El trabajo de diseño de cebadores para la amplificación mediante PCR de las zonas

aún no exploradas del genoma cloroplástico de la vid rindió 18 nuevos pares de

cebadores que cumplían los requisitos prefijados para el diseño (Figura 4-10). Éstos

fueron utilizados para la amplificación de nuevas secuencias en las zonas más

susceptibles de presentar polimorfismos, esto es, intrones y espacios intergénicos, con

una longitud total de 12866 bp.

Resultados

89

Figura 4-10. Mapa del genoma cloroplástico de Vitis vinifera L. Se muestran las zonas variables identificadas en este estudio (marcos rosados) y en estudios previos del Centro Nacional de Biotecnología (marcos azules) para la búsqueda de polimorfismos.

Los nuevos cebadores, unidos a los 16 pares previamente desarrollados por el equipo

del Centro Nacional de Biotecnología, que a su vez amplificaban 9331 bp efectivas, se

snp F

snp P

snp J

snp I

snp L

snp Z snp M

snp E

snp N

snp C

snp B

snp K

snp D

snp H

snp A

snp O

snp Q

snp Y

snp X

snp Wsnp V

snp U

snp T

snp S

snp R

snp AB

snp AA

snp ZZ

snp AD

snp AC

snp AEsnp AH

snp AG snp AF

snp AI

snp AL

Resultados

90

utilizaron para la amplificación de estas zonas potenciales de variación en 9

variedades de Vitis vinifera L. y en 10 muestras de especies del género Vitis, para

conformar un total de 34 secuencias informativas independientes, con una longitud

total de 22197 bp, en las que buscar puntos de variación.

4.4.1. SNPs cloroplásticos entre variedades de vid

Tras alinear y comparar entre sí las 34 secuencias cloroplásticas homólogas obtenidas

de cada una de las nueve variedades analizadas (Figura 4-11), se contabilizaron 28

posiciones polimórficas, 23 del tipo SNP (10 puntos de transversión y 13 de transición)

y 5 del tipo INDEL (inserciones o deleciones), todas ellas de carácter bi-alélico.

Figura 4-11. Ejemplo del alineamiento de secuencias entre las variedades analizadas de la especie Vitis vinifera L. con el programa BioEdit.

La frecuencia de polimorfismos en los fragmentos resecuenciados fue de 1 SNP cada

965 bp, y de 1 INDEL cada 4439 bp. En conjunto, se contabilizó un polimorfismo cada

793 bp sondeados. El ratio transición/transversión observado entre los SNPs fue de

1,30. Todos los INDELs fueron mononucleótidos. Los patrones de nucleótidos

correspondientes a los polimorfismos detectados para cada una de las 9 variedades

analizadas se presentan en la Tabla 4-13.

Resultados

91

Tabla 4-13. Patrones de las 9 variedades de Vitis vinifera L. analizadas, configurados de acuerdo a la información de 23 SNPs y 5 INDELs cloroplásticos.

SNPs A332 C61 F399 H indel

K94 N Z O P R296 indel

S582 T507 V501 indel

W292

CBS (D) C A G - T A T T A - T C - C

GAR (A) C A T T C T A C A G T C - C

TEM (A) C A T T C T A C A G T C - C

SUB (C) T G G - T A A T T G T C - C

Bi20 (G) C G G T T N N C A - A A A T

JAN (D) C G G - T A T T A - T C - C

MER (C) T G G - T A A T T G T C - C

BRJ (B) C G G - N A T T A - T C - C

TRX (B) N N G - N N N T A - T C - C

SNPs Y85 Y205 Y212 indel

AC357 AD261 AF293 AG72 AH181 AH459 AH474 AI307 AI312 AL270 indel

AL408

CBS (D) C A - G A A T A A C T T T C

GAR (A) C T T G G G T A A A A T T C

TEM (A) C T T G G G T A A A A T T C

SUB (C) C A - G A A G A A C A T T C

Bi20 (G) T T T A N G T G T A A A - G

JAN (D) C A - G A A T A A C T T T C

MER (C) C A - G A A G A A C A T T C

BRJ (B) C A - G A A T A A C T T T C

TRX (B) C A - G A A T A A C T T T C

Las letras A,C,G, y T representan los cuatro tipos de nucleótidos y N = dato ausente por fallo de amplificación. Entre paréntesis, clorotipos según Arroyo-García et al. (2006).

Las nueve variedades, que correspondían a 5 clorotipos diferentes (A, B, C, D, y G) en

base al análisis de 9 microsatélites cloroplásticos (Arroyo-García et al. 2006), se

agruparon solamente en 4 patrones diferentes cuando se consideraron los 28

polimorfismos analizados, ya que dichos polimorfismos no permitieron distinguir los

clorotipos B y D.

En la figura 4-12, se muestra el árbol filogenético elaborado de acuerdo a las

distancias genéticas entre los patrones de SNPs/INDELs, excluyendo las 6 posiciones

para las que hubo uno o más datos ausentes (reflejados como N en la tabla), debidos

a fallos sistemáticos de amplificación.

Resultados

92

Figura 4-12. Dendrograma construido según el método de agrupamiento UPGMA, utilizando las distancias genéticas entre los patrones de SNPs e INDELs cloroplásticos obtenidos para las 9 variedades analizadas.

El árbol consenso separó los cuatro patrones de SNPs/INDELs discriminados, los

cuales engloban los 5 clorotipos caracterizados por Arroyo-García et al. (2006), en tres

ramas principales. Por un lado, queda claramente diferenciado el clorotipo G, mientras

que el resto quedaron agrupados en una segunda división. Dentro de ésta, el clorotipo

A resultó el más distante genéticamente de los demás, presentando 10 posiciones

diferentes respecto a B y 13 respecto a D. Como se indicaba en párrafos anteriores, B

y D no pudieron distinguirse, mientras que C resultó estrechamente relacionado con

ellos (sólo 4 SNPs, con 1 transición y 3 transversiones, y 1 INDEL, separaron ambos

grupos).

4.4.2. SNPs cloroplásticos entre especies del género Vitis

Tras alinear y comparar entre sí las 34 secuencias cloroplásticas homólogas

correspondientes a las 10 especies (Figura 4-13), se encontraron un total de 45 loci

polimórficos, 33 con uno o más polimorfismos del tipo SNP, y 12 con polimorfismos del

tipo INDEL.

Resultados

93

Figura 4-13. Ejemplo del alineamiento de secuencias entre especies del género Vitis con el programa BioEdit.

La frecuencia de polimorfismos en los fragmentos resecuenciados fue de 1 SNP cada

616 bp, y de 1 INDEL cada 493 bp. En conjunto, se contabilizó un polimorfismo cada

274 bp sondeados. El ratio transición/transversión observado entre los SNPs fue de

0,56. Los patrones de nucleótidos para cada especie, correspondientes a los

polimorfismos detectados, se presentan en la Tabla 4-14:

Resultados

94

Tabla 4-14. Patrones de las 10 especies del género Vitis analizadas, configurados de acuerdo a la información de 33 loci con SNPs, y 12 INDELs cloroplásticos.

B318 indel

B360 E356 E364 indel

E416 H87 J73 indel

J98 indel

J294 indel

L458 N305 N313 N344 indel

N512 N518

vin ----- T C - ACA G ATCCT - ------- A C T ----- A T

calif ----- G C T NNN G NNNNN N NNNNNNN A N N NNNNN N N

aest CAACT T G - TGT N ATCCT T NNNNNNN A A G TAACT N N

ariz ----- T C T TGT N ----- - ------- A A G TAACT C G

rup CAACT T C T TGT A ATCCT T ------- C A G TAACT C T

cordif ----- T C - TGT G ATCCT - TTTCGTC A A T ----- C T

ber ----- T C T TGT A ----- T ------- A A G TAACT C N

amur ----- T C - TGT G ATCCT - TTTCGTC N N N ----- N N

ripar CAACT T C T TGT A ATCCT T ------- A A G TAACT C T

ciner ----- T C T TGT A ----- N ------- A N N ----- C T

N538 Q281 R104 R296 indel

S624 T507 V372 V510 indel

W107 W157 Y89 Y174 indel

Y205 Y305indel

Y441

vin G T A G- TA C T --------------- A T C A T - T

calif N T C G- TA A T TTTAGTCATTCGAAA C T C A T A G

aest N N A -- TA A T TTTAGTCATTCGAAA A T N N T - T

ariz T T A -- TA A T TTTAGTCATTCGAAA A T T A T - T

rup T T A -- AA A T TTTAGTCATTCGAAA A T T - T - T

cordif G G A -- TT C C TTTAGTCATTCGAAA A C C A A - T

ber N T A GG TA A N NNNNNNNNNNNNNNN A T T A T - T

amur N G A -- NN C N NNNNNNNNNNNNNNN A C C A A - T

ripar T T A -- TA A T TTTAGTCATTCGAAA A T T A T - T

ciner T T A G- NN A N NNNNNNNNNNNNNNN A T T - N - T

Y523 ZZ76 indel

AA275 AB274 AB286 indel

AB644 AC345 AE172 AE229 AE238 AE260 AE502 AG98 AH181 AH459

vin C - G G - G G A A G C A C A A

calif C - G G - G G A A A T A A A A

aest C - G G - G G A A G C A A G T

ariz C - G G - G G A A G C A A G T

rup C - G G - G G G A G C A A G T

cordif T - T A - A A A G G C C A A A

ber C A G G - G G A A G C A A G T

amur T - T A - A A A G G C C A A N

ripar C - G G A G G A A G C A A G T

ciner C - G G - G G A A G C A A G T

Las letras A,C,G, y T representan los cuatro tipos de nucleótidos y N = dato ausente por fallo de amplificación. Las posiciones correspondientes a INDELs se indican expresamente.

Seis de los polimorfismos del tipo INDEL (50% del total de INDELs detectados), fueron

mononucleótidos, uno fue un dinucleótido, y el resto, cinco, se compusieron de series

de más de tres nucleótidos. Dos de los loci polimórficos identificados incluyeron

agrupaciones de más de 1 SNP, ocupando posiciones consecutivas: así, el locus S624

Resultados

95

incluyó 2 SNPs, y otros 3 SNPs el locus E416. Los patrones se compusieron de un

total de 81 nucleótidos, sumando las secuencias de los 45 loci. Estos 81 nucleótidos

incluyeron 36 polimorfismos del tipo SNPs (23 debidos a transversiones y 13 debidos a

transiciones) y 45 polimorfismos del tipo INDEL. Entre los 45 loci, 43 tuvieron carácter

bi-alélico, mientras que sólo dos, R296 (INDEL) y S624 (2 SNPs consecutivos),

presentaron tres alelos. Comparando los patrones de 81 nucleótidos de las 10

especies en estas 45 zonas de variación, se detectaron tan sólo 9 distintos. Así, las

muestras correspondientes a V. cordifolia y V. amurensis resultaron indistinguibles a

efectos de estos patrones. Por su parte, las muestras de V. arizonica, V. berlandieri, V.

riparia, y V. cinerea, se distinguieron únicamente en algunos de los INDELs. En

concreto, sólo V. arizonica se distinguiría de las otras tres si prescindiéramos de la

información de los INDELs, y lo haría sólamente en 1 SNP (el N518). La analogía

media registrada entre los patrones de estas cuatro especies fue de un 95% de los loci

analizados. El resto de las especies manifestaron patrones únicos discriminados tanto

por SNPs como por INDELs, destacando el patrón mostrado por V. cordifolia y V.

amurensis como el más alejado de los demás, al presentar polimorfismos exclusivos

en 12 loci. El patrón de V. californica también resultó muy distinto de los demás, al

presentar polimorfismos exclusivos respecto al resto de especies en 7 de los loci

comparados.

El árbol filogenético consenso, elaborado en base a las distancias genéticas entre los

patrones inferidos por SNPs, se presenta en la Figura 4-14.

Figura 4-14. Dendrograma construido según el método de agrupamiento UPGMA, utilizando las distancias genéticas entre los patrones de SNPs e INDELs cloroplásticos obtenidos para las 10 especies de Vitis analizadas.

ariz

ber

ripar

ciner

aest

rup

vin

calif

cordif

amur100

75

98

79

49

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0

Resultados

96

El árbol filogenético divide las 10 especies en dos grupos principales. El más pequeño

lo conforman Vitis cordifolia y Vitis amurensis, cuyos patrones resultaron

indistinguibles en las secuencias comparadas, y que se muestran alejadas

evolutivamente del resto de especies. Dentro del grupo mayor, aparecen relacionadas,

y claramente separadas de las demás, con una amplia longitud de rama, que indica

también una significativa distancia genética entre ellas, las especies V. vinifera y V.

californica, cuya relación cuenta con un apoyo estadístico del 75%. Las seis especies

restantes forman una división con un valor de bootstrap del 98%, lo que le confiere una

alta significación estadística, y con V. aestivalis y V. rupestris apareciendo en

respectivas subdivisiones. Las especies V. arizonica, V. berlandieri, V. riparia y V.

cinerea aparecen agrupadas en un nodo terminal, si bien su valor de bootstrap fue

carente de significación.

CAPÍTULO 5

DISCUSIÓN

Discusión

99

5. DISCUSIÓN

5.1. CARACTERIZACIÓN GENÉTICA E IDENTIFICACIÓN VARIETAL

5.1.1. Parámetros genéticos de los marcadores: índices de diversidad

Con respecto a los 6 marcadores del set GENRES, utilizados para la fase de

caracterización e identificación de las muestras, resulta de interés la constatación de

que los alelos más frecuentes del estudio, y en especial el VVMD7-236, destacaron

como los más frecuentes también en trabajos previos realizados con los mismos loci,

tanto en el caso de variedades españolas (Martín et al. 2003; Santiago et al. 2005;

Martín et al. 2006; Fernández-González et al. 2007; González-Andrés et al. 2007)

como de variedades portuguesas (Lopes et al. 1999; Almadanim et al. 2007), italianas

(Costantini et al. 2005), búlgaras (Hvarleva et al. 2004), húngaras (Jahnke et al. 2009),

y chipriotas (Hvarleva et al. 2005). Los dos alelos más frecuentes en la muestra

castellano-leonesa, VVMD7-236 y VrZAG62-186, manifestaron frecuencias superiores

al 30% en todos estos estudios. Esto sugiere que los alelos en cuestión podrían

pertenecer al genotipo de un extendido ancestro, común a gran parte de las vides

cultivadas en la región mediterránea.

Los parámetros utilizados para evaluar la diversidad de la muestra, esto es, el número

de alelos por locus (Na) y la diversidad génica (HE), indicaron mayor variabilidad

genética en la muestra de vid castellano-leonesa aquí tratada que en el resto de

grupos de muestras analizados previamente en la Península Ibérica con los mismos 6

microsatélites recomendados por el proyecto GENRES. Dado que dichos estudios

manejaron tamaños de muestra muy diferentes, y con objeto de establecer

comparaciones justas, no se tuvo en cuenta el parámetro Na, muy dependiente de

este factor, y generalmente más elevado cuanto mayor es la muestra. Comparando

únicamente la diversidad génica (HE), independiente respecto del tamaño de la

muestra analizada, se obtienen los siguientes datos: la diversidad génica (HE) obtenida

en las vides cultivadas de Castilla y León fue del 82,8% (± 1,2) sobre 117 genotipos,

mientras que Lopes et al. (1999) obtuvieron 75,8% en 49 genotipos recogidos en

Portugal, Ibáñez et al. (2003) tuvieron 81,0% en 96 genotipos de España, Martín et al.

(2003) tuvieron 80,6% en 163 genotipos del BGVCAM (Banco de Germoplasma de Vid

de la Comunidad de Madrid), procedentes de toda España, Lopes et al. (2006)

tuvieron 78,1% en 37 genotipos de Portugal, Fernández-González et al. (2007)

Discusión

100

tuvieron 78,4% en 73 genotipos de Castilla-La Mancha, y González-Andrés et al.

(2007) tuvieron 81,4% en 33 genotipos recogidos en El Bierzo (comarca también

muestreada en el presente trabajo). El resultado obtenido en este estudio resulta

también superior al promedio de diversidad génica utilizando microsatélites para la

especie Vitis vinifera ssp. vinifera, que asciende a 76,9%, recientemente determinado

en un análisis comparativo a gran escala (Laucou et al. 2011). Estos resultados,

unidos a las elevadas heterocigosis observada (HO) y riqueza alélica (As) encontradas,

confirman una elevada diversidad genética en la muestra de Castilla y León, lo que

refuerza aún más la necesidad de conservación del conjunto de variedades estudiado.

El elevado porcentaje de heterocigosis es un rasgo esperable en los genotipos de los

cultivares de Vitis vinifera L., debido al carácter dioico de su ancestro silvestre, y la

posterior preponderancia de la reproducción vegetativa sobre genotipos

seleccionados. De hecho, se estima que el número de generaciones efectivas entre la

domesticación de la especie y nuestros días es bajo, entre 16 y 80 generaciones en

8000 años (Arroyo-García et al. 2006), lo que confirma una menor influencia de la

reproducción sexual en el proceso de generación de las variedades.

Por otra parte, es interesante resaltar que la discriminación de genotipos redundantes

podría haber infravalorado la diversidad genotípica de la muestra, a pesar del alto

poder de discriminación y de la baja probabilidad de identidad obtenidos para los seis

loci consensuados por el proyecto GENRES081, considerando como idénticos ciertos

genotipos que serían diferentes para otros loci. Esta infravaloración sería

particularmente acusada en la muestra aquí analizada, ya que está constituida por

muchos genotipos emparentados, como se demuestra en el presente estudio (capítulo

4.4.). Las relaciones de parentesco entre variedades implican que los alelos no se

combinan de forma independiente en los genotipos bajo análisis, incumpliendo una de

las premisas asumidas para el cómputo de PI y D. Así, que ciertos alelos sean

comunes a varios genotipos resulta más probable de lo que se esperaría si los

apareamientos entre individuos fueran aleatorios. Por tanto, se deduce que una

discriminación basada únicamente en los microsatélites del proyecto GENRES081

puede excluir algunos genotipos diferentes, tomándolos por idénticos a otros, y que la

estrecha relación genética que une a muchas de las muestras de vid analizadas,

podría dificultar su identificación en ciertos casos. Esto pone en duda la autonomía de

los seis loci de GENRES081 para la identificación varietal cuando se trabaja con

genotipos potencialmente muy emparentados. De hecho, el consorcio del Proyecto

Europeo GrapeGen06 (http://www1.montpellier.inra.fr/grapegen06), sucesor del citado

GENRES081, adoptó en 2006 la decisión de añadir tres loci SSR adicionales a los

Discusión

101

recomendados para el genotipado en vid, con el fin de asegurar una identificación

exclusiva de cada variedad en casos en que estuvieran estrechamente relacionadas.

Aunque los tres nuevos SSRs figuran entre el resto de los analizados en este trabajo,

no se emplearon para la comparación con las bases de datos nacionales e

internacionales, dado que éstas están aún configuradas con el set de seis recogido por

el proyecto antiguo, GENRES081.

5.1.2. Composición del acervo genético de vid de Castilla y León

En su mayoría, las sinonimias detectadas corroboraron las descripciones

ampelográficas. Sin embargo, en ciertos casos, la sinonimia se produjo entre

variedades que presentaban diferencias morfológicas puntuales pero evidentes, en

caracteres como el color o la forma de las bayas. Presumiblemente, y dado que en

todos los casos existe una clara relación nominal entre dichas variedades, estas

diferencias morfológicas podrían atribuirse a mutaciones somáticas en los genes que

regulan los caracteres correspondientes, perpetuadas después por la selección y

propagación vegetativa de individuos con variantes fenotípicas, fenómeno

extensamente documentado en vid (Crespan 2004; Muganu et al. 2009). De hecho, en

vid se justifica la inclusión bajo la misma denominación varietal de aquellos genotipos

que divergen solamente en mutaciones somáticas en algunos loci (Hocquigny et al.

2004). Dado el origen policlonal de las variedades de vid, en esta especie se les aplica

el término de variedades-población, el cual asume que están conformadas por un

cierto número de individuos con pequeñas diferencias (mutaciones) genéticas (Pelsy

et al. 2010). En ocasiones, la variabilidad genética puede ser mayor entre clones de

una misma variedad que entre ciertas variedades próximas, no siendo detectable a

través de los sets de microsatélites habitualmente utilizados. Casos como el de

Tempranillo, Tinta del País, y Tinta de Toro, variedades que presentan genotipos

idénticos según los microsatélites estandarizados, pero que manifiestan diferencias

agronómicas y fenotípicas entre sí, ejemplifican bien el concepto de variedad-

población.

En ocasiones, el sinónimo local está muy arraigado en la tradición vitícola de ciertas

comarcas, por lo que, conocida la sinonimia, éste puede prevalecer en el territorio sin

contribuir a crear confusión, como es el caso, por ejemplo, de Tinta del País en Ribera

del Duero, que es un sinónimo conocido de Tempranillo. Sin embargo, en muchos

otros casos los sinónimos detectados han de considerarse como meros errores de

Discusión

102

nomenclatura y, como tales, debieran ser subsanados, ya que inducen a confusiones

que sí pueden entorpecer la identificación de variedades y las estimaciones de

diversidad varietal en la comunidad. Por ejemplo, dado que el nombre de Albillo Real

presenta una identidad a nivel nacional diferente de la de Albillo, debiera ser

considerado como erróneo su uso en estas comarcas, pues induce a confusión. No

obstante, la muestra recogida en el Valle del Tiétar abulense con el nombre de Albillo

Real de Extremadura, sí corresponde con la identidad Albillo Real de otros estudios

nacionales.

Las homonimias, por su propia naturaleza, implican siempre errores de nomenclatura,

porque dos variedades diferentes siempre habrían de contar con nombres diferentes a

fin de poder identificarlas y distinguirlas. El error resulta tanto más grave cuanto más

alejadas, morfológica y/o genéticamente, sean las variedades que se denominan igual.

Por ejemplo, el nombre Malvasía encierra tres identidades distintas aparentemente

poco relacionadas (Doña Blanca, Chasselas Doré y TO37-Desconocida), que también

resultaron genéticamente alejadas en los análisis de estructura y parentesco llevados

a cabo en el presente estudio. Cada una de estas identidades se relaciona, además,

con unas comarcas concretas, de manera que, en El Bierzo, el nombre Malvasía

parece referirse al genotipo Chasselas Doré, mientras que en Arribes del Duero y

Toro, hace referencia al genotipo de Doña Blanca. También en Toro, se aplica el

nombre Malvasía al genotipo hasta ahora no referenciado, que en el presente estudio

se ha denominado TO37-Desconocida. Dado que en la D.O. Bierzo y en la D.O. Toro,

Malvasía es un nombre que se aplica a dos variedades autorizadas por sus Consejos,

pero genéticamente diferentes, sería aconsejable incluir alguna precisión en los

apelativos referentes a estas variedades. A este respecto, en la zona de Toro se utiliza

el nombre Malvasía Castellana, sinónimo reconocido de Doña Blanca. Quizá en la

D.O. Bierzo debiera adoptarse un nombre como, por ejemplo, “Malvasía del Bierzo”,

para designar al sinónimo de Chasselas Doré y Temprano Blanco.

En otras ocasiones, las homonimias se dan entre variedades potencialmente

relacionadas. En la muestra estudiada, el nombre Moscatel se utiliza profusamente

para identificar a nivel local genotipos diferentes, pero cuyas peculiaridades

morfológicas y organolépticas son similares entre sí, y características del reconocible

tipo Moscatel, al que en su mayoría pertenecen. Los distintos genotipos detectados

bajo el nombre Colgadera (Airén, Gordera Negra, y Mantúo), por su parte, también

tienen en común su uso como uvas de mesa y algunas características morfológicas,

resultando además los tres encuadrados en un mismo grupo según el análisis de

Discusión

103

estructura genética, con un reseñable porcentaje de coincidencia alélica, por lo que la

incidencia de la homonimia, aunque debería ser subsanada, resulta más lógica.

Los nombres que hacen referencia a un carácter morfológico poco discriminante, como

Blanca del País o Tinta del País, nombres muy extendidos entre las muestras

procedentes de la comarca de Valle de Mena, probablemente se utilizan por

desconocimiento u olvido de la procedencia original de la variedad a que se refieren, y,

por su propia simpleza y generalismo, son especialmente proclives a provocar la

incidencia de homonimias, como efectivamente se ha comprobado en el estudio.

Se deduce de todo esto que, en última instancia, todos los errores de nomenclatura

son sinonimias u homonimias, así que la consideración de erróneo para un nombre

tiene que ver casi exclusivamente con su mal uso, que desemboca en confusiones a la

hora de identificar las muestras. El uso erróneo se produce cuando se emplea un

nombre, previamente asignado a una identidad conocida, para designar a otra

identidad diferente. En cada caso, habría que establecer a qué identidad se le adjudica

cada nombre y dejar de utilizar aquellas que provoquen confusiones. Para ello, se

deberían tener en cuenta criterios como la antigüedad documentada y la amplitud

geográfica de cada denominación. No obstante, en el caso de variedades homónimas

con nombre local no claramente asignable, de acuerdo a los criterios citados, a

ninguna de ellas por encima de las demás, se hace complicado designar cuál es la

correspondiente legítima para el mismo.

La comparación de los datos obtenidos en este estudio con los recogidos en las bases

de datos internacionales arrojó una sorprendente correspondencia genotípica entre

algunas muestras recogidas en zonas tradicionales bajo nombres locales y variedades

internacionales documentadas. Dicha correspondencia demuestra la importancia que

han tenido en la vid los intercambios de material vegetal entre regiones y países, en

especial con la vecina Francia, ya que la mayoría de los genotipos coincidentes con

identidades extranjeras procedieron de vides francesas.

5.1.3. Genotipos no referenciados previamente en las bases de datos

Casi una cuarta parte de los genotipos discriminados entre las variedades cultivadas

del estudio corresponde a genotipos que no habían sido previamente caracterizados, a

pesar de los numerosos trabajos realizados en este sentido en España y en el resto de

Discusión

104

principales países vitícolas en los últimos años, profusamente citados a lo largo de

este documento. Algunos de estos genotipos se corresponden con variedades locales

minoritarias recogidas en el Banco de Germoplasma de Vid de Castilla y León

(BGVCyL), y de las cuales no existen referencias escritas previas. Otros, la mayoría de

los casos, corresponden con muestras recogidas de viñedos viejos, cultivados con

métodos tradicionales, en los que las variedades en cuestión están representadas por

apenas unas pocas plantas. Además, a la hora de hacer nuevas plantaciones vitícolas

no se cuenta con este tipo de cultivares minoritarios, principalmente porque no están

disponibles en los viveros comerciales ni documentadas sus características

productivas y agronómicas. Por estas razones, estas variedades se encuentran en un

evidente peligro de desaparición en la actualidad.

Más de la mitad de las variedades con genotipos novedosos presentaron el clorotipo

A, el más extendido entre las vides silvestres y cultivadas de la Península Ibérica

(Arroyo-García et al. 2006), especialmente en las utilizadas para vino, lo que

concuerda con un posible origen autóctono de los mismos.

Los genotipos TL16, TVZ7, ME5, ME6, ME8, y ME9, tuvieron en común la presencia

de alelos fuera del rango típico de Vitis vinifera L. en sus genotipos, y la adscripción

mayoritaria a los clorotipos B y C, únicos dos clorotipos encontrados en especies

americanas del género Vitis. Si a ello se une el que el genotipo TVZ7 presentó un alto

porcentaje de coincidencia alélica con un híbrido comprobado (W4), resulta probable

que estos seis genotipos puedan ser híbridos utilizados como portainjertos, que hayan

brotado espontáneamente en sustitución de la variedad con la que fueron

originalmente injertados en viñedos tradicionales de sus comarcas de origen.

Las muestras codificadas como Bi20 y Bi27, recogidas en el Bierzo en plantas

distintas, presentaron el clorotipo G, uno de los más infrecuentes, encontrado

solamente en vides originarias de Oriente Próximo y Medio, pero no detectado en las

vides silvestres occidentales (Arroyo-García et al. 2006), corroborando la presencia de

una variedad no identificada, con un posible origen exótico, en la comarca del Bierzo.

Las comarcas que aportaron mayor número de muestras con genotipos novedosos,

esto es: Bierzo (7), Sierra de Francia (5) y Valle de Mena (4), se caracterizan por

albergar viñedos minifundistas, tradicionales, con cepas antiguas podadas en vaso,

donde se mantienen variedades diferentes en una misma parcela, lo que ha permitido

la conservación de variedades locales minoritarias y no recogidas por las

Discusión

105

recomendaciones de los organismos que gestionan sus respectivas denominaciones

de origen o indicaciones geográficas. Estas comarcas, por lo tanto, resultan de

especial interés para ulteriores prospecciones, ya que parecen albergar todavía un

destacable porcentaje de la diversidad varietal que probablemente tuvieron en tiempos

pretéritos.

5.2. ANÁLISIS DE ESTRUCTURA GENÉTICA DE LAS VIDES DE

CASTILLA Y LEÓN

5.2.1. Estructura genética de las vides de Castilla y León

Según se deduce de los resultados obtenidos por los análisis llevados a cabo, por un

lado con STRUCTURE, y, por otro, con el algoritmo Neighbour-Joining, las variedades

castellano-leonesas que conforman la muestra se estructuran en tres ramas

filogenéticas diferentes.

Los cultivares de la familia Moscatel (Grupo 1), quedaron separados de los demás, tal

y como se había producido en estudios previos (Aradhya et al. 2003; Crespan y Milani

2001), en los que se les consideraba como un tipo ancestral de vides, poseedoras de

un aroma, sabor y morfología uniformes, muy característicos e identificativos.

Por su parte, muchos de los genotipos encuadrados en el Grupo 2 mostraron relación

geográfica, al tratarse de variedades tradicionalmente presentes en los viñedos de las

demarcaciones centrales de la Meseta Castellana, como son Rueda, Cigales o Ribera

del Duero. De hecho, algunos de los genotipos implicados, como los de Alcazpepita

(sin: Cañorroyo), Huerta de Rey (sin: Marfal), y Tolociriana (sin: Castellana Blanca)

están documentados en el Banco de Germoplasma de Vid de la Comunidad de Madrid

como originarios de una misma región. Por lo tanto, en este grupo se da una cierta

correlación genético-geográfica, que, unida a la significativa predominancia del

clorotipo A, muy ligado a la procedencia ibérica, refuerza el carácter local de estas

variedades y las relaciona, a su vez, con cultivares tan conocidos como Tempranillo o

Garnacha.

El Grupo 3 sugiere una posible relación genética entre las variedades locales de las

demarcaciones vitícolas occidentales de la región y los cultivares franceses, lo cual

Discusión

106

sugiere un probable intercambio o cruzamiento de materiales vegetales entre ambas

zonas. Es un hecho conocido que, durante la Edad Media, los peregrinos franceses

del Camino de Santiago, especialmente los monjes, introdujeron estaquillas de vid,

entre otros materiales vegetales, en los monasterios de la Meseta Castellana,

siguiendo el eje este-oeste que cruza el norte de la región (Cabello et al. 2000). Por

otra parte, las informaciones históricas nos hablan de que la comarca salmantina de

Sierra de Francia, en el suroeste de la región, fue repoblada con inmigrantes llegados

de Francia en distintas oleadas entre los siglos XI y XIII, especulándose que éste

podría ser el motivo del topónimo que recibe la zona. Ya en el siglo XV, comenzó el

culto a la Virgen de la Peña Francia, lo que motivó la aparición de un ramal de

peregrinación que unía dicho santuario con el Camino de Santiago en León, siguiendo

la conocida e importante Ruta de la Plata, que cruza de norte a sur las tres provincias

occidentales de la región (León, Zamora, y Salamanca), comunicando algunas de sus

demarcaciones vitícolas más representativas, como la propia Sierra de Francia,

Arribes del Duero, Valles de Benavente, Tierra de León, y, finalmente, El Bierzo. Así, a

través de estos dos ejes fundamentales pudieron haber ocurrido, primero la

distribución, y posteriormente el cruzamiento entre los materiales de ambas

procedencias, lo que explicaría la estructura genética actual que aquí se propone.

5.2.2. Diferenciación entre los grupos genéticos obtenidos

Los tres grupos filogenéticos obtuvieron valores de Na, He, Ho, y As que permiten

calificarlos como diversos, destacando el Grupo 1, debido probablemente a la

heterogeneidad de su composición, con genotipos de muy distintas procedencias. Las

muestras que lo componen engloban híbridos, tanto demostrados como probables,

variedades de origen exótico, muestras recogidas en ambiente silvestre, y variedades

del tipo Moscatel, lo que convierte al Grupo 1 en el más variable genéticamente, quizá

debido a la abundancia de alelos únicos que presentaron los genotipos de algunas de

estas muestras. Prueba de ello es, también, la diversidad de clorotipos encontrada

entre los miembros de este grupo, a diferencia de los otros dos, en los que el clorotipo

A, relacionado con la procedencia ibérica, fue netamente mayoritario.

Todos los valores de FST entre cada par de grupos se mantuvieron dentro del rango de

0,020 a 0,090, determinado por Sefc et al. (2000) cuando estimaron la diferenciación

genética entre grupos de cultivares de siete regiones europeas. Los Grupos 2 y 3 se

mostraron como los más diferentes genéticamente, entre sí, en la muestra analizada.

El valor de FST obtenido entre ellos fue superior a todos los calculados entre siete

Discusión

107

regiones europeas en el estudio antes citado, excepto los hallados entre vides

francesas y griegas (0,090), entre francesas y croatas (0,077), y entre italianas y

españolas (0,076). Aunque en el estudio efectuado por Sefc et al. (2000) las muestras

de cada país fueron pequeñas (una media de 23 variedades de cada procedencia), y

difícilmente representativas de todo un país, no deja de ser reseñable que la

diferenciación hallada entre grupos de vides de una misma región, Castilla y León, los

cuales además se relacionan visiblemente con dos de sus comarcas, la central y la

occidental, sea comparable a las determinadas entre vides de distintos países.

Esto sugiere que las variedades ligadas al Centro y al sector Occidental de la Meseta,

respectivamente, podrían tener al menos dos orígenes claramente separados, aunque

posiblemente ligados a la Península Ibérica, dado el evidente predominio del clorotipo

A entre sus muestras. De acuerdo a estos resultados, cada uno de los 3 grupos

genéticos aquí propuestos, constituye una fuente independiente de variación genética,

y, por lo tanto, una provisión de recursos fitogenéticos única para la mejora de la vid.

En aras de la salvaguarda de estas señas de identidad singulares, la actual tendencia

a recurrir a unas pocas variedades internacionalmente conocidas para establecer

nuevas plantaciones comerciales, debiera ser compensada con una adecuada gestión

enfocada al mantenimiento de las variedades locales que hacen tan diferente a cada

comarca.

5.2.3. Factores que determinan la variabilidad genética de las vides de

Castilla y León

Los Análisis Factoriales corroboraron, en todos los casos, la estructura genética

propuesta en el estudio, apareciendo una evidente agrupación formada por genotipos

franceses y locales de los sectores occidentales de Castilla y León. Las variedades de

tipo Moscatel, por su parte, se mostraron de nuevo claramente separadas del resto.

Los genotipos excluidos por su condición de outliers coinciden, lógicamente, con

aquellos que presentaron mayor porcentaje de alelos únicos, sospechosos de ser

híbridos interespecíficos. Por último, destaca el hecho de que las variedades francesas

fueron las únicas que se situaron próximas en los diagramas a las muestras recogidas

en ambiente salvaje, en concordancia con estudios previos, que citaban las variedades

francesas para vino como las vides cultivadas más semejantes a las vides silvestres,

menos diferenciadas genéticamente, por tanto, de los genotipos ancestrales

domesticados (Aradhya et al. 2003).

Discusión

108

Los distintos Análisis Factoriales de Correspondencia (AFC) ejecutados establecieron

dos factores o criterios de diferenciación genética principales: procedencia geográfica

y uso, para explicar los mayores porcentajes de la variabilidad encontrada entre las

vides de Castilla y León. En cualquier caso, los porcentajes de variación explicados

fueron reducidos, por lo que se deduce que la mayor parte de la diferenciación entre

los genotipos es atribuible a un número indeterminado de otros factores, no

identificados en este estudio.

5.2.4. Análisis de la varianza molecular

El AMOVA basado en los dos factores principales sugeridos por el AFC, otorgó mayor

influencia al uso que a la procedencia geográfica a la hora de explicar la varianza

encontrada. Este resultado es coherente con la información previa disponible (Aradhya

et al. 2003; Heuertz et al. 2008), en referencia a la selección para uva de mesa,

ejercida durante siglos para conseguir caracteres organolépticos muy específicos en

las bayas, como hecho determinante en la diferenciación genética entre variedades.

En cualquier caso, la varianza a nivel individual explicó el mayor porcentaje de la

variación, corroborando los resultados de estudios genéticos intensivos previos en la

especie Vitis vinifera L. (Aradhya et al. 2003, Arroyo-García et al. 2006), en los que la

variación entre individuos siempre resultó más significativa que la existente entre

grupos. Esto es un síntoma del efecto de homogenización entre los pools genéticos de

las diferentes áreas geográficas, motivado por el intenso e incesante intercambio

comercial y cultural de variedades de vid entre regiones y países durante siglos. Dada

la facilidad que presenta esta especie para la multiplicación vegetativa, las variedades

han sido fáciles de intercambiar y transportar y, además, han mantenido sus

diferencias genotípicas individuales, mientras que las diferencias a nivel de grupos se

han ido difuminando con el tiempo. Sin embargo, los resultados de los análisis

factoriales del epígrafe anterior sugieren que las diferencias entre grupos conformados

según criterios geográficos o de uso, aunque efectivamente difuminadas, y a un nivel

de significación estadística mucho menor que las diferencias entre individuos, aún

pueden apreciarse a efectos prácticos al analizar los genotipos.

Discusión

109

5.3. RELACIONES GENÉTICAS Y POSIBLES ORÍGENES DE LAS

VARIEDADES AUTÓCTONAS

Los análisis realizados en el presente estudio confirmaron las categorías de relación

genética previamente documentadas entre Cabernet Sauvignon y Sauvignon Blanc,

Moscatel de Grano Menudo y Muscat of Alexandria, y Garnacha Tintorera y Garnacha,

lo que refuerza la validez de las metodologías aplicadas.

Respecto de las variedades enmarcadas en el Grupo 1 del análisis de estructura, la

predominancia de los clorotipos B, D, y C, unida a la escasa presencia del A, indicaron

un posible origen foráneo de la mayoría de estos genotipos, por lo que su presencia en

los viñedos de Castilla y León podría deberse a una importación en el pasado. Un

ejemplo peculiar de este razonamiento lo encarnaría la variedad Bi20, recogida en la

comarca de El Bierzo, que presentó un genotipo hasta ahora desconocido, con alelos

únicos, y no relacionado con ningún otro de este estudio. Fue la única de la muestra

en mostrar un clorotipo G, exclusivo de las vides originarias de Próximo y Medio

Oriente, según Arroyo-García et al. (2006). Desgraciadamente, se dispone de muy

poca información de la misma, pero cabe pensar que se introdujo en algún momento

del pasado procedente de Oriente. Las variedades pertenecientes a la familia Moscatel

presentaron genotipos muy relacionados entre sí, pero no con el resto de la muestra.

Sus clorotipos fueron los habituales en el tipo Moscatel, esto es, B y D, con la única

salvedad de las dos Moscateles locales analizadas, Moscatel Gordo Peludo y

Moscatel Blanco de Grano Menudo, con clorotipo A. La implicación de variedades tan

extendidas como Moscatel de Grano Menudo (Muscat aux Petit Grains) ó Muscat of

Alexandria en relaciones putativas de primer grado con estos casi vestigiales cultivares

locales, induce a pensar en una posible introducción de las mismas en el pasado, y su

utilización en cruzamientos que pudieron dar lugar a estas Moscateles con clorotipo

local. La presencia de estos genotipos y clorotipos de origen oriental en Castilla y León

respalda la hipótesis de la introducción de variedades de Oriente Medio en la

Península Ibérica durante la ocupación musulmana, aventurada por Imazio et al.

(2006).

El Grupo 2 presenta un complejo entramado de parentescos de primer grado entre

variedades tradicionalmente asociadas a las demarcaciones vitícolas del área Central

de la Meseta Castellana: Rueda, Cigales, y Ribera del Duero. Entre estas variedades

se cuenta la bien conocida Tempranillo, así como algunas de genotipo hasta ahora no

referenciado en las bases de datos disponibles. Las pistas obtenidas tanto en los

Discusión

110

análisis de estructura como en los de relaciones genéticas apuntan a un posible origen

autóctono de estos genotipos, refrendado por indicios como la presencia de clorotipo A

en todos menos uno de ellos (CyL-06, con clorotipo C), la predominancia de uvas

blancas, y la vecindad de estos cultivares en los viñedos tradicionales. Estas

características son compartidas por variedades tradicionalmente arraigadas en estas

demarcaciones, y también implicadas en esa red de parentescos, como Alcazpepita,

Castellana Blanca ó Huerta del Rey.

Los parentescos propuestos dentro del Grupo 3 apoyan la hipótesis de que variedades

de vid procedentes de Francia podrían estar implicadas en el origen de ciertos

cultivares locales ligados a las demarcaciones vitícolas Occidentales de la Meseta

Castellana. Aunque tan sólo se identificó un parentesco directo entre uno de los

cultivares franceses de la muestra (Sauvignon Blanc) y uno de los típicamente

cultivados en el oeste de la región (Merenzao), ulteriores pesquisas incluyendo

genotipos franceses de distintas procedencias podrían detectar nuevas relaciones.

Hay que tener en cuenta que las variedades francesas actualmente cultivadas en

Castilla y León, aunque probablemente estén relacionadas con las presentes en la

Edad Media, han sido introducidas más recientemente, y representan una pequeña

parte de la variabilidad genética y geográfica de las vides de su país. Al igual que en el

grupo anterior, también el Grupo 3 parece albergar una red de estrechas relaciones de

primer grado entre cultivares representativos de las demarcaciones vitícolas

occidentales de la Meseta y variedades locales con genotipos hasta ahora

desconocidos provenientes de las mismas áreas. En esta red de interrelaciones, los

genotipos de Albarín Negro (variedad asturiana muy distribuida a lo largo de las

comarcas leonesas, zamoranas y salmantinas, que recibe los nombres de Bruñal en

Arribes del Duero, y Alfrocheiro Preto en Portugal) y Prieto Picudo (variedad principal

en Tierra de León, y abundante en León y Zamora) juegan papeles centrales, al estar

implicadas, cada una, en diversas relaciones de parentesco directo. El hecho de que

genotipos desconocidos como los correspondientes a Cornifesto (Arribes), Verdejo

Serrano (Sierra de Francia) ó BE13 (Valles de Benavente) manifiesten posibles

parentescos estrechos entre ellos y con los de las variedades locales principales en

estas comarcas, unido a que presentan el clorotipo A típico ibérico, indica un probable

origen autóctono para las correspondientes variedades. Dentro de las parejas

propuestas en este grupo genético, resulta asimismo significativa la estrecha relación

de probable parentesco entre Verdejo, variedad adscrita a comarcas centrales de la

Meseta Castellana, y Godello, variedad típica en Galicia y en el Bierzo, ya que ambas

presentan notorias semejanzas morfológicas, que refuerzan dicha posibilidad.

Discusión

111

Las relaciones genéticas de primer grado encontradas entre variedades de una misma

área geográfica sugieren una activa contribución de los cruzamientos sexuales,

espontáneos o dirigidos, en el origen de algunas variedades autóctonas en Castilla y

León. Las condiciones de gestión y mantenimiento de los viñedos modernos hacen

casi imposible la incidencia de hibridaciones espontáneas; sin embargo, los viñedos

antiguos, donde se mezclaban diferentes variedades en una misma parcela, con

escaso laboreo, posiblemente supusieron un adecuado caldo de cultivo para la

aparición de nuevas variedades durante siglos.

5.4. NATURALEZA DE LAS VIDES SILVESTRES DE CASTILLA Y LEÓN

Las muestras recolectadas en hábitats salvajes de los Arribes del Duero (Salamanca)

resultaron genéticamente relacionadas entre sí, con excepción, claro está, del híbrido

interespecífico comprobado W4. Los genotipos de W2 y W3 se encuadran en la

categoría de Hermanos Completos ó Medio Hermanos de acuerdo a la información de

los LR, mientras que el de W1 parece relacionado genéticamente con los anteriores,

pero de forma menos próxima. Las tres muestras pertenecían a plantas cercanas

físicamente, probablemente miembros de una misma población, que exhibían

características morfológicas típicas de Vitis vinifera sylvestris. Dos de las plantas (W1

y W3) tenían flores unisexuales masculinas, mientras que W2 mostraba racimos cortos

y estrechos, con bayas pequeñas, esféricas, y negras, separadas y escasas en

número. En todos los casos, las hojas fueron pequeñas y poco lobuladas, casi enteras.

En la misma localización se encontraron más individuos, tanto añejos como en fases

iniciales de desarrollo a partir de semilla, por lo que, en principio, puede decirse que se

trata de una población dinámica. Dado que las tres muestras presentaron el clorotipo

A, estrechamente relacionado con las vides silvestres ibéricas y no detectado en las

especies americanas del género Vitis, se reducen las probabilidades de que las

muestras pertenezcan a portainjertos híbridos escapados de cultivo. Los genotipos

nucleares obtenidos para estas vides silvestres, por su parte, no mostraron indicios de

relación con ninguno de los pertenecientes a vides cultivadas en la muestra. La

tecnología de arrays de SNPs, aplicada sobre una pequeña muestra de vides

cultivadas y silvestres de Europa occidental sugiere cierto grado de introgresión

genética del material silvestre en el cultivado (Myles et al. 2011). En cualquier caso, y

aunque se ha documentado un caso de relación directa entre un individuo silvestre y

uno cultivado (Aradhya et al. 2003), y unos pocos ejemplos de flujo genético desde el

Discusión

112

acervo cultivado hacia el silvestre (Di Vecchi-Staraz et al. 2009), la interrelación

espontánea entre ambos tipos parece un fenómeno factible pero infrecuente, y más si

se tiene en cuenta que, en algunas comarcas con presencia de ambas subespecies,

sus respectivos estadíos fenológicos de floración no concuerdan, lo que reduce

significativamente la posibilidad de que intercambien flujo polínico (This et al. 2006).

Por todo ello, se estima que las tres plantas (W1, W2, y W3) del entorno salvaje de los

Arribes del Duero salmantinos analizadas en el presente trabajo podrían ser genuinos

representantes de la subespecie Vitis vinifera sylvestris, actualmente considerada

residual y muy amenazada en Europa.

5.5. DETECCIÓN Y COMPROBACIÓN DE SNPS CLOROPLÁSTICOS

El alto número de polimorfismos detectados en el genoma cloroplástico de las vides

analizadas valida la estrategia de resecuenciación de zonas potencialmente variables

del genoma. Aunque dicha estrategia ya había rendido buenos resultados en su

aplicación al genoma nuclear de la especie (Lijavetzky et al. 2007), quedaba por

determinar su utilidad en el genoma cloroplástico, cuya tasa de mutación es

significativamente menor, y por lo tanto se halla más conservado que el nuclear,

presentando menor variabilidad intervarietal e interespecífica.

5.5.1. SNPs cloroplásticos entre variedades de vid

En las variedades del género Vitis analizadas, la frecuencia de SNPs detectada en el

genoma cloroplástico resecuenciado resultó 15 veces inferior a la obtenida por

Lijavetzky et al. (2007) en el genoma nuclear de Vitis vinifera L. (1 SNP cada 64 bp),

poniendo de manifiesto el alto grado de conservación del ADN cloroplástico en la

especie. Como comparación, en el genoma cloroplástico del arroz, Tang et al. (2004)

determinaron una frecuencia tan sólo 8 veces inferior a la hallada en el genoma

nuclear de esa misma especie (1 SNP cada 250 bp), si bien, por tratarse una especie

autógama, su genoma nuclear habría de ser teóricamente menos polimórfico que el de

la vid, que es alógama. El polimorfismo del genoma cloroplástico de la vid detectado

en el presente estudio, 1 SNP cada 965 bp, resultó asímismo dos veces superior al

obtenido en arroz, de 1 SNP cada 2000 bp (Tang et al. 2004). El ratio

transiciones/transversiones en los SNPs del genoma cloroplástico explorado (1,30),

estuvo en un rango similar al obtenido para el genoma nuclear en la propia especie

Discusión

113

(1,46 según Lijavetzky et al. 2007; 1,56 según Salmaso et al. 2004), y fue mayor que el

hallado en el genoma cloroplástico del arroz (0,71 según Tang et al. 2004). La alta

frecuencia de transiciones en comparación con transversiones es esperable, debido al

propio mecanismo molecular con que se producen las mutaciones, siendo la

transformación más frecuente la de la pirimidina C (citosina) en la pirimidina T (timina),

por medio de metilación y desaminación (Holliday y Grigg 1993). En la actualidad, se

cuenta con numerosos estudios sobre la abundancia y tipo de SNPs en los genomas

nucleares de gran cantidad de especies animales y vegetales (no tanto en los

genomas cloroplásticos vegetales), la mayoría de los cuales corroboran la mayor

proporción de transiciones frente a transversiones (Batley et al. 2003).

Con respecto a los polimorfismos de tipo INDEL, su frecuencia (1 cada 4439 bp) fue

solamente 2,3 veces inferior a la detectada en el genoma nuclear de la especie, 1

INDEL cada 1932 bp (Lijavetzky et al. 2007). No obstante, según los autores, este dato

está subestimado debido a que los intrones de ciertas zonas codificantes no rindieron

datos legibles, de modo que se estima que la frecuencia de INDELs en el genoma

nuclear podría ser hasta 5 veces superior (Lijavetzky et al. 2007), situándose entonces

el polimorfismo debido a INDELs en niveles de superioridad respecto del genoma

cloroplástico similares al caso de los SNPs. En arroz, la frecuencia de INDELs resultó

de 1 cada 5000 bp (Tang et al. 2004), en un rango, por tanto, similar al obtenido para

la vid, a diferencia de lo que ocurre con los polimorfismos de tipo SNP.

El hecho de que el 100% de los polimorfismos resultaran bi-alélicos concuerda con los

resultados del genoma nuclear de Vitis vinifera L. (Lijavetzky et al. 2007), en el cual el

99,75% fueron también bi-alélicos y el 0,25% tri-alélicos.

La determinación de tan sólo 4 patrones distintos de SNPs e INDELs en las nueve

variedades analizadas, cuando deberían haberse detectado 5, según los clorotipos de

Arroyo-García et al. (2006), pone de manifiesto la necesidad de continuar explorando

las zonas no codificantes del ADN cloroplástico de las mismas, con objeto de

conseguir discriminar los clorotipos B y D, ya que no se hallaron diferencias entre las

variedades representantes de ambos en los 28 puntos de variación contrastados en el

presente estudio. Así pues, los 28 polimorfismos SNP/INDEL tenidos en cuenta

resultaron menos significativos que los 9 microsatélites empleados por Arroyo-García

et al. (2006). Aunque los SNPs son muy abundantes, son mayoritariamente de

naturaleza bi-alélica, de forma que, individualmente, resultan significativamente mucho

menos polimórficos que los microsatélites, que suelen ser de naturaleza multi-alélica.

Discusión

114

De hecho, en vid, el valor de polimorfismo PIC (Polymorphism Information Content) de

los SNPs nucleares es de 0,25, casi 3 veces inferior que el de los microsatélites

nucleares (0,70) (Lijavetzky et al. 2007). Sin embargo, su abundancia suple su bajo

polimorfismo relativo, considerándose de forma general que se precisa disponer de al

menos 3 veces más cantidad de SNPs que de loci microsatélites para obtener la

misma discriminación (Xiong y Jin 1999), lo que se facilita con herramientas como los

microarrays de SNPs. En este estudio, aunque el número de SNPs obtenido triplica al

de microsatélites empleados por Arroyo-García et al. (2006), no se ha conseguido el

mismo poder de discriminación. No obstante, hay que tener en cuenta que no se han

estudiado exactamente las mismas zonas del genoma cloroplástico en ambos casos,

por lo que no cabe la comparación estricta entre los dos estudios. Dado que en el

citado estudio con microsatélites las diferencias entre los tipos B y D se reflejaban en 4

de los 9 loci analizados, se asume que se trata de diferencias consistentes, y, por lo

tanto, tienen que encontrarse en las regiones aún no resecuenciadas para la detección

de SNPs e INDELs.

El dendrograma construido con las distancias entre los patrones obtenidos para las

variedades en estos 28 puntos de variación, mostró una evidente diferenciación del

clorotipo G respecto del resto de los detectados, en contraste con el modelo de

relaciones propuesto por Arroyo-García et al. (2006), en el cual ocupaba una posición

cercana al clorotipo A, del que sólo le diferenciaba un alelo (Tabla A3 del Anejo I). Este

resultado apoya la hipótesis de clara diferenciación entre los clorotipos de Oriente y

Occidente, y pone de manifiesto el problema de homoplasia que presentan los

microsatélites cloroplásticos, que confunde las estimaciones de diferenciación entre

poblaciones (Goldstein y Pollock 1997). En dicho modelo, los clorotipos A, C, y D

representaban tres linajes diferentes, mientras que el B ocupaba una posición central

entre ellos, indicando que podría ser un clorotipo ancestral en la especie. En este

caso, el dendrograma mostró también una división de A, C y D en tres linajes

diferentes, el C y el D más relacionados entre sí que con el A, pero con el B

indistinguible del D. La posición aislada del clorotipo G concuerda, no obstante, con la

información existente sobre su distribución geográfica. Así, mientras el clorotipo A

resulta característico de las vides silvestres del extremo occidental de distribución de

la especie, el G lo es de las del cercano y medio oriente, aunque su frecuencia es muy

baja. Esta distribución puede verse reflejada también en nuestros días en las vides

cultivadas (Arroyo-García et al. 2006), de modo que la separación genética entre

ambos tipos en el dendrograma concuerda con su separación geográfica.

Discusión

115

5.5.2. SNPs cloroplásticos entre especies del género Vitis

Como cabía esperar, la frecuencia de posiciones polimórficas en el ADN cloroplástico

resultó 2,9 veces mayor entre especies que entre variedades de una misma especie (1

polimorfismo cada 793 bp entre variedades, 1 cada 274 bp entre especies). Sin

embargo, en este caso, la diferencia es atribuible en su mayor parte a los

polimorfismos de tipo INDEL, que resultaron 9 veces más frecuentes entre especies

que entre variedades, y no tanto a los de tipo SNP, sólo 1,6 veces más frecuentes. La

alta frecuencia de posiciones de tipo INDEL se debe al aglutinamiento de muchas de

ellas, el 42 %, en loci de más de 3 nucleótidos (5 casos entre los 12 loci con

polimorfismos INDEL), como había ocurrido previamente con dos tercios de los

INDELs detectados en el genoma nuclear de Vitis vinifera L. (Lijavetzky et al. 2007), y

con muchos de los polimorfismos de este tipo detectados en otros genomas, como por

ejemplo el del maíz (Batley et al. 2003).

La frecuencia de SNPs resultante fue 13 veces inferior a la hallada en el genoma

nuclear por Salmaso et al. (2004), para otra combinación de genotipos de especies del

género Vitis (V. riparia, V. rupestris, V. lincecumii, y V. Vinifera), parcialmente

coincidentes con las aquí estudiadas. Esta diferencia de polimorfismo entre los

genomas cloroplástico y nuclear tuvo una magnitud del mismo orden que la hallada

cuando se trataba de variedades de V. vinifera, 15 veces superior a favor del genoma

nuclear en aquel caso. El ratio transiciones/transversiones en los SNPs cloroplásticos

fue 2,8 veces inferior al obtenido en los SNPs nucleares por Salmaso et al. (2004), y

estuvo por debajo de 1, de modo que, a diferencia de lo ocurrido en el citado estudio y

en el realizado aquí entre variedades, se invirtió la frecuencia a favor de las

transversiones.

Si en el caso de las variedades de V. vinifera el 100% de los polimorfismos detectados

en el genoma cloroplástico tuvieron carácter bi-alélico, en el de las distintas especies

del género Vitis estudiadas el 95,5 % de los loci mostraron igualmente dos alelos,

siendo solamente dos de ellos de carácter tri-alélico para la muestra analizada, de

modo que no hubo un aumento significativo en el número de alelos por locus al pasar

de variedades a especies, lo que subraya la baja variabilidad detectada en el genoma

cloroplástico en relación al nuclear, debida a la reducida tasa de mutación propia del

mismo.

Discusión

116

El árbol filogenético agrupó las especies en dos grupos principales. El más pequeño

quedó integrado por V. amurensis, especie originaria de Asia, y V. cordifolia, originaria

de Norteamérica, significativamente relacionadas, según los patrones de SNPs

analizados, a pesar de provenir de diferente continente. Esta relación no se ajusta a lo

determinado por Tröndle et al. (2010), quienes analizaron las secuencias de tres

puntos del genoma cloroplástico de 30 especies del género Vitis, sólo uno de ellos

parcialmente coincidente con los resencuenciados en el presente estudio. En aquel

estudio, las muestras de estas dos especies quedaron encuadradas en grupos

diferentes, uno con mayoría de especies asiáticas (V. amurensis) y otro con mayoría

de norteamericanas (V. cordifolia).

En el grupo mayor se englobaron las especies norteamericanas restantes junto con V.

vinifera, europea. Precisamente ésta se separa del resto de integrantes del grupo en

una primera división unida a V. californica. En el estudio de Tröndle et al. (2010),

también se obtuvo un grupo filogenético de especies norteamericanas que incluía

algunas muestras de V. vinifera, y también en aquel caso V. californica resultó

segregada del resto, siendo su haplotipo, también en aquel caso, el más débilmente

ligado al grupo Norteamérica. Las plantas de la especie V. californica vegetan de

forma natural en la costa oeste de Norteamérica, donde comparten algunos territorios

con V. riparia, V. rupestris y V. aestivalis

El resto de especies, todas originarias de Norteamérica, formaron un grupo más

cohesionado, apoyado por un alto porcentaje de bootstrap (98%), lo que le confiere

significación estadística a efectos de las secuencias comparadas en el estudio. En él,

V. rupestris y V aestivalis ocuparon sus propios nodos terminales, presentando la

muestra de V. rupestris el patrón más claramente independiente dentro de esta

división, tal y como ocurrió dentro de la división norteamericana correspondiente en el

estudio de Tröndle et al. (2010). Por su parte, V. arizonica, V. berlandieri, V. riparia, y

V. cinerea aparecieron bajo un mismo nodo terminal al presentar sus respectivos

patrones un altísimo porcentaje de analogía en las posiciones polimórficas

investigadas. Las especies V. rupestris, V. riparia, y V. berlandieri resultaron también

agrupadas filogenéticamente por el método UPGMA en estudios previos realizados

con marcadores del tipo AFLP sobre ADN total (De Andrés et al. 2007). En el estudio

de Tröndle et al. (2010) estas especies resultaron también agrupadas en la división

que denominaron Norteamérica, con la excepción de V. arizonica, que, a pesar de ser

originaria del suroeste de EE.UU., en aquel estudio resultó encuadrada en la división

que denominaron Europa.

Discusión

117

La situación en el árbol filogenético de la mayoría de las especies concuerda con la

distribución geográfica natural de las mismas. Así, V. arizonica y V. berlandieri, que

comparten territorio en el centro-sur de los EE.UU., quedan la una junto a la otra en el

dendrograma, próximas a V. riparia, V. cinerea, V. aestivalis, y V. rupestris, las cuales

coinciden geográficamente en las zonas suroeste y este de los EE.UU., solapándose

además en el sur-sureste de ese país con el área de distribución de la previamente

citada V. berlandieri. La distribución geográfica de la especie V. californica, coincide

en los estados de la costa oeste de los EE.UU. con las de V. riparia, V. aestivalis y V.

rupestris, con las cuales compartió grupo en el dendrograma aunque, tal y como se ha

referido, su relación con el resto es débil y poco significativa, indicando una separación

genética más antigua que las demás.

Las distribuciones naturales de V. vinifera y V. amurensis se sitúan en Eurasia y Asia,

respectivamente. El patrón de la primera se relacionó débilmente con los presentes en

el grupo norteamericano, por lo que en este caso no hay correlación geográfica. En el

caso de V. amurensis, la evidente segregación mostrada en el dendrograma es

coherente con su clara separación geográfica respecto del resto de las especies

estudiadas. Sin embargo, no fue posible distinguir su patrón de SNPs/INDELs del de

V. cordifolia, especie distribuida de forma natural por la costa este de los EE.UU.,

cuando dos muestras diferentes de estas mismas especies sí fueron distinguibles a

nivel de ciertas secuencias cloroplásticas en el estudio de Tröndle et al. (2010).

Análogamente, mientras que en aquel estudio la especie V. arizonica quedó

encuadrada en la división europea, siendo indistinguible su haplotipo del de algunas

muestras de V. vinifera ssp. sylvestris, y la especie V. cinerea se incluyó en el grupo

asiático, sus respectivos patrones de SNPs/INDELs en el presente estudio sí que las

situaron en la agrupación correspondiente a su procedencia geográfica. Estas

discordancias entre unos y otros estudios, así como la falta de significación estadística

de los nodos más recientes en los dendrogramas, son atribuibles a las escasas

diferencias detectadas entre las especies del género Vitis a nivel del genoma

cloroplástico. Así, los patrones discriminados en el presente estudio se diferencian

entre sí en unos pocos SNPs/INDELs, y en estudios similares, como el realizado por

Tröndle et al. (2010), las diferencias entre secuencias de las divisiones filogenéticas

principales fueron tan sólo de 2 SNPs/INDELs entre los grupos Europa y

Norteamérica, y de 6 SNPs/INDELs de ambos respecto del grupo Asia, el más

diferenciado genéticamente en aquel estudio.

Discusión

118

Dada esta baja variabilidad, inherente a los genomas cloroplásticos, debido a su

reducida tasa de mutación en relación con la propia de los genomas nucleares, cada

nuevo polimorfismo detectado aporta una información que puede variar sensiblemente

la reconstrucción filogenética inferida, de modo que la zona del genoma donde se

efectúe el análisis influye decisivamente en la posición en el dendrograma de las

especies menos diferenciadas, y explica las discordancias entre estudios, en ninguno

de los cuales ha sido posible, hasta el momento, siquiera discriminar todas las

especies estudiadas. Todo ello hace necesaria una profundización en el estudio de

este genoma, de modo que se puedan discriminar todas estas especies, se afiancen

las diferencias detectadas, y se establezclan de forma más concluyente las relaciones

filogenéticas inferidas.

Dejando de lado las interpretaciones filogenéticas, la búsqueda de loci polimórficos

entre diferentes especies compatibles del género Vitis, muchas de las cuales se

emplean activamente en la creación de portainjertos comerciales, resulta de marcado

interés para la mejora genética de la vid, pues estas especies presentan rasgos

adaptativos potencialmente mejorantes, como son las resistencias y tolerancias a

ciertas enfermedades y plagas endémicas en los viñedos, y a factores abióticos

adversos. Por tanto, detectar los niveles de diferencia y los paralelismos que

presenten sus genomas, nuclear y cloroplástico, con los de Vitis vinifera L., aporta

información de gran ayuda.

CAPÍTULO 6

CONCLUSIONES

Conclusiones

121

6. CONCLUSIONES

I. El número de variedades que subsisten en los viñedos de Castilla y León es muy

elevado (118 variedades identificadas). Además, mantienen una elevada

diversidad, a pesar de la fuerte erosión genética a que está sometido y de la

subestimación de la misma que conlleva, en este caso, el uso de los 6

microsatélites del consorcio GENRES81 como único método discriminante.

II. En Castilla y León muchas variedades reciben muy distintas denominaciones, lo

que induce a frecuentes errores de identificación, que deben corregirse para

evitar confusiones en las plantaciones y mejorar la gestión y conservación de las

variedades locales.

a) La mayor incidencia de sinonimias afecta a las variedades más

conocidas, por lo que sería aconsejable no utilizar los sinónimos

locales, descartar todas las denominaciones erróneas, y conservar sólo

los nombres locales con arraigo en ciertas comarcas, siempre que se

refieran uniformemente a una sola variedad perfectamente identificada.

b) La incidencia de homonimias, aunque más escasa, tiene como

resultado una subestimación de la verdadera diversidad varietal de

Castilla y León, por lo que se debe consensuar un nombre identificativo

propio para cada genotipo diferente.

III. El acervo genético castellano-leonés de vid cuenta, curiosamente, con una

importante representación de cultivares foráneos, que reciben distintos nombres

locales, generalmente erróneos. Entre ellos predominan variedades francesas,

aunque también hay variedades más exóticas, procedentes de Grecia, Túnez, ó

Hungría (entre otras), en concordancia con el papel que ha jugado la vid en las

relaciones históricas y comerciales entre regiones mediterráneas.

IV. Se han identificado por primera vez una importante serie de genotipos que no

habían sido previamente caracterizados (29), a pesar de los numerosos trabajos

realizados en este sentido en los últimos años. Estos genotipos corresponden a

variedades locales minoritarias, de origen autóctono, muy ligadas a

determinadas comarcas del oeste y centro de la Meseta Castellana. Se trata de

recursos fitogenéticos de interés agroalimentario, amenazados de desaparición y

desconocidos, por lo que se recomienda su inclusión en los bancos de

Conclusiones

122

germoplasma para su adecuada conservación y estudio (caracterización

agronómica y genética), y para incluirlos en programas de multiplicación,

reintroducción o mejora.

V. Las variedades de vid cultivadas en Castilla y León se estructuran en tres grupos

filogenéticos principales, basándonos en los resultados obtenidos de los

diferentes análisis con que se ha enfocado el estudio:

a) Vides del tipo Moscatel y genotipos extranjeros, incluyendo algunas

variedades locales de tipo Moscatel, con aptitud para uva de mesa,

como Moscatel Gordo Peludo y Moscatel Blanco de Grano menudo, con

clorotipo autóctono. También incluye al genotipo Bi20, cuyo clorotipo

resultó exclusivo de variedades y vides silvestres del Medio y Próximo

Oriente.

b) Vides de uvas blancas tradicionales del centro de la Meseta: de

probable origen autóctono, muy interrelacionadas genéticamente entre

sí y con la variedad Tempranillo.

c) Vides francesas presentes en la región y variedades locales de uva tinta

de las comarcas occidentales de la Meseta. Podrían tener su origen en

la hibridación entre variedades francesas de vino tinto, introducidas en

tiempos medievales, y cultivares locales, en particular Albarín Negro y

Prieto Picudo.

VI. Se observa una diferenciación estadísticamente más significativa entre

variedades de un mismo grupo que la existente entre grupos. Aún así, los

análisis de diferenciación apuntan a una cierta influencia de la distribución

geográfica y el uso para vino o mesa de las uvas como factores relevantes en la

diferenciación de los grupos.

VII. La abundancia de relaciones de primer grado sugeridas por los análisis

demuestran que los cruzamientos sexuales han contribuido activamente a la

aparición de variedades autóctonas en Castilla y León, teniendo como base

tanto cultivares locales como foráneos.

VIII. Tres de las cuatro vides silvestres analizadas podrían ser genuinas Vitis vinifera

ssp. sylvestris, lo que probaría la pervivencia de esta subespecie en el territorio

castellano-leonés, aunque no se ha encontrado evidencia de relaciones de

parentesco entre ellas y las variedades cultivadas en la zona.

Conclusiones

123

IX. La resecuenciación del ADN cloroplástico ha permitido identificar numerosos

SNPs e INDELs en 34 secuencias (repartidos en 28 loci entre variedades de Vitis

vinifera L. y 45 loci entre especies de Vitis spp.), aunque no han resultado

suficientes para la discriminación de todos los clorotipos de V. vinifera, y de

todas las especies del género Vitis. Sin embargo, estos resultados muestran,

como se esperaba, una variabilidad genética menor que en el genoma nuclear,

por lo que probablemente dichas secuencias puedan ser transferibles a todas las

especies de la familia de las Vitáceas, sirviendo de base para el diseño de

sistemas de genotipado de alta capacidad.

X. El análisis de los datos combinados de 45 loci polimórficos del genoma

cloroplástico en muestras de 10 especies del género Vitis se utilizó para inferir su

filogenia, que muestra un patrón geográfico coherente, en su mayor parte, con la

distribución natural de estas especies. No obstante, y puesto que el ADN

cloroplástico está muy conservado (algunas especies sólo se diferencian en

unos pocos SNPs/INDELs) y se encuentra aún pobremente caracterizado, es

necesario ampliar el estudio para confirmar estas posiciones filogenéticas.

CAPÍTULO 7

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referencias Bibliográficas

126

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Eldredge G., Gatto P., Oyzerski R., Moretto M., Gutin N., Stefanini M., Chen Y.,

Segala C., Davenport C., Demattà L., Mraz A., Battilana J., Stormo K., Costa

F., Tao Q., Si-Ammour A., Harkins T., Lackey A., Perbost C., Taillon B., Stella

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CAPÍTULO 8

ANEJOS

ANEJO I

TABLA A1. Relación de códigos, nombres locales, colores de baya, orígenes, e identificaciones genéticas de las 421 muestras de vid incluidas en el estudio.

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

CyL-01 Albillo Nava b Rueda Verdejo AR49 Juan García Grueso n Arribes del

Duero Juan García

CyL-02 Albillo Negro b Cigales Temprano Blanco / Chasselas Doré AR50 Juan García Fino n Arribes del

Duero Juan García

CyL-03 Alcazpepita b Rueda Cañorroyo PT1 Morisco Tinto n Arribes - Portugal

Brujidera

CyL-04 Calagraña b Rueda Calagraña/Katsano PT2 Malvasia Rei b Arribes – Portugal

Palomino

CyL-05 Doradilla 1 b Rueda Doradilla PT3 Cigüente b Arribes – Portugal

Cigüente / Doña Blanca

CyL-06 Doradilla 2 b Rueda CyL-06 - Desconocida PT4 Tinta Gorda n Arribes – Portugal

Juan García

CyL-07 Elba b Toro Temprano Blanco / Chasselas Doré PT5 Cornifesto n Arribes – Portugal Cornifesto

CyL-08 Hornipepita b Rueda Cañorroyo PT6 Saborinho n Arribes – Portugal

Puesto Mayor / Saborinho

CyL-09 Huerta del Rey b Cigales Huerta del Rey / Marfal PT7 Jaén b Arribes – Portugal

Jaén Blanco

CyL-10 Marta Nava b Rueda Salvador PT8 Trincadeira Preta n Arribes – Portugal

Trincadeira Preta

CyL-11 Moscatel de Toro b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco PT9 Poilta b

Arribes – Portugal

Poilta

CyL-12 Pirulés Dorada b Ribera del

Duero Malvasía Riojana / Alarije PT10 Tinta Gorda n

Arribes – Portugal

Juan García

CyL-13 Pirulés Verde b Ribera del

Duero Malvasía Riojana / Alarije PT11 Alfrocheiro Preto n

Arribes – Portugal

Albarín Negro

CyL-14 Prieto Picudo Blanco 1 b Tierras de

León Godello PT12 Formosa b

Arribes – Portugal

Mantúo

CyL-15 Prieto Picudo Blanco 2 b Tierras de

León Godello PT13 Bastardo n

Arribes – Portugal

Merenzao

CyL-16 Puente b Toro Salvador PT14 Puesto Mayor n Arribes – Portugal

Puesto Mayor / Saborinho

CyL-17 Rojal b Ribera del

Duero Malvasía Riojana / Alarije PT15 Marufo n

Arribes – Portugal

Brujidera

CyL-18 Temprana Agosteña 1 b Cigales Lairén PT16 Godello Rojo r Arribes – Portugal

Godello

CyL-19 Temprana Agosteña 2 b Cigales Temprano Blanco / Chasselas Doré PT17 - n Arribes – Portugal

Gajo Arroba

CyL-20 Temprana Media b Cigales Temprano Blanco / Chasselas Doré PT18 - n Arribes – Portugal PT18 - Desconocida

CyL-21 Temprana Tardía b Cigales Temprano Blanco / Chasselas Doré PT19 Godello b Arribes – Portugal

Godello

CyL-22 Tempranillo de Nava b Rueda Temprano Blanco / Chasselas Doré PT20 Poilta n Arribes – Portugal Poilta

CyL-23 Tolociriana b Rueda Tolociriana / Castellana Blanca PT21 Godello b Arribes – Portugal

Godello

CyL-24 Verdegudillo b Cigales Cigüente / Doña Blanca PT22 Albillo b Arribes – Portugal

Albillo

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

CyL-25 Tinta Toro Blanca g Toro Tempranillo PT23 - n Arribes – Portugal

PT18 - Desconocida

CyL-26 Juliana r Rueda Juliana PT24 Saborinho n Arribes – Portugal

Puesto Mayor / Saborinho

CyL-27 Cenicienta n Rueda Cenicienta PT25 Jaén b Arribes – Portugal

Jaén Blanco

CyL-28 Mencía Pajaral n Bierzo Mencía PT26 - n Arribes – Portugal

BE13 - Desconocida

CyL-29 Negrera n

Bierzo

Juan García PT27 Trincadeira Preta n Arribes - Portugal

Trincadeira Preta

CyL-30 Pan y Carne 1 n Bierzo Merenzao TL1 Albarín Blanco b Tierra de León Albarín Blanco

CyL-31 Pan y Carne 2 n Bierzo Pan y Carne TL2 - b Tierra de León Muscat of Alexandria

CyL-32 Prieto Picudo Oval 1 n Tierras de

León Prieto Picudo TL3 Prieto Picudo n Tierra de León Prieto Picudo

CyL-33 Prieto Picudo Oval 2 n Tierras de

León Prieto Picudo TL4 Lagareta n Tierra de León

Garnacha Tintorera / Alicante Bouschet

CyL-34 Rufete Vi n Sierra de

Francia (SA) Rufete TL5 - b Tierra de León Temprano Blanco / Chasselas Doré

CyL-35 Rufete Mi n Sierra de

Francia (SA) Rufete TL6 - b Tierra de León Godello

CyL-36 Rufete Se n Sierra de

Francia (SA) Rufete TL7 - n Tierra de León Aramon

CyL-37 Tinta Madrid n Cigales Bobal TL8 - n Tierra de León Fallida

CyL-38 Tinta de Nava n Rueda Tempranillo TL9 Negro Saurí n Tierra de León Merenzao

CyL-39 Tinta del País n Ribera del

Duero Tempranillo TL10 Negro Saurí n Tierra de León Merenzao

CyL-40 Verdejo Tinto n Rueda Puesto Mayor / Saborinho TL11 - n Tierra de León Prieto Picudo

CyL-41 Villarino n Arribes del

Duero Juan García TL12 Albillo b Tierra de León Kamchiya

CB01 Albillo Mayor b Cigales Albillo Mayor TL13 Francesa b Tierra de León Centennial Seedless

CB02 Albillo Real b Cebreros Albillo TL14 Teta de Cabra r Tierra de León Negra Dorada

CB03 Doña Blanca b Bierzo Cigüente / Doña Blanca TL15 Abasta b Tierra de León Verdejo

CB04 Moscatel de Grano

Menudo b Toro

Moscatel de Grano Menudo / Moscato Bianco

TL16 - n Tierra de León TL16 - Desconocida

CB05 Godello b Bierzo Godello TL17 Gualarida n Tierra de León Gualarido

CB06 Malvasía b Toro TO37 - Desconocida TL18 Cañorroyo b Tierra de León Salvador

CB07 Malvasía b Bierzo Temprano Blanco / Chasselas Doré BE1 - - Valles de Benavente

Moscatel Blanco de Grano Menudo

CB08 Palomino b Rueda Palomino BE2 - n Valles de Benavente

Moscatel de Grano Menudo / Moscato Bianco

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

CB09 Sauvignon Blanc b Rueda Sauvignon Blanc BE3 - n Valles de Benavente

Molinera / Red Malaga

CB10 Verdejo b Rueda Verdejo BE4 - b Valles de Benavente

Palomino

CB11 Viura b Rueda Macabeo BE5 - n Valles de Benavente

Bobal

CR01 Garnacha Roja r Cigales Garnacha BE6 - b Valles de Benavente

Muscat Hamburg

CT01 Cabernet Sauvignon n Ribera del

Duero Cabernet Sauvignon BE7 - n

Valles de Benavente

Garnacha

CT02 Garnacha Tinta n Ribera del

Duero Garnacha BE8 - n

Valles de Benavente

Bobal

CT03 Rufete n Arribes del

Duero Rufete BE9 - n

Valles de Benavente

Corbeau

CT04 Juan García n Arribes del

Duero Juan García BE10 - b

Valles de Benavente

Verdejo

CT05 Malbec n Ribera del

Duero Malbec BE11 - b

Valles de Benavente

Palomino

CT06 Mencía n Bierzo Mencía BE12 - b Valles de Benavente

Jaén Blanco

CT07 Merlot n Toro Merlot BE13 - - Valles de Benavente BE13 - Desconocida

CT08 Prieto Picudo n Tierra de León Prieto Picudo BE14 - b Valles de Benavente

Kamchiya

CT09 Garnacha Tintorera n Bierzo Garnacha Tintorera / Alicante

Bouschet BE15 - b

Valles de Benavente

Palomino

CT10 Tempranillo n Tierra del vino

de Zamora Tempranillo BE16 - n

Valles de Benavente

Corbeau

CT11 Tinta del País n Ribera del

Duero Tempranillo BE17 - n

Valles de Benavente

Bougseb

CT12 Tinta de Toro n Toro Tempranillo BE18 - b Valles de Benavente

Muscat of Alexandria

Bi1 Tintorera t Bierzo Negrón de Aldán BE19 - b Valles de Benavente

Muscat of Alexandria

Bi2 - b Bierzo Palomino BE20 - - Valles de Benavente

Moscatel Blanco de Grano Menudo

Bi3 - n Bierzo Rabo de Ovella / Sumoll BE21 - - Valles de Benavente

Tarragona

Bi4 - n Bierzo Negreda BE22 - - Valles de Benavente

Pleita / Mandilari

Bi5 - n Bierzo Rabo de Ovella / Sumoll BE23 - n Valles de Benavente

Mandón / Morenillo II

Bi6 - b Bierzo Bi6 - Desconocida BE24 - - Valles de Benavente

Pleita / Mandilari

Bi7 - n Bierzo Mandón / Morenillo II BE25 - n Valles de Benavente

Albarín Negro

Bi8 - t Bierzo Grand Noir / Morrastel-Bouschet BE26 Moscatel b Valles de Benavente

Italia

Bi9 - - Bierzo Bi9 - Desconocida 1BE1 Redondal b Valles de Benavente

Kamchiya

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

Bi10 - b Bierzo Picapoll 1BE2 Teta de Cabra b Valles de Benavente

Bougseb

Bi11 Doña Blanca b Bierzo Cigüente / Doña Blanca 1BE3 Moscatel Romano b Valles de Benavente

Muscat of Alexandria

Bi12 Mencía n Bierzo Mencía 1BE4 Moscatel Romano b Valles de Benavente

Muscat of Alexandria

Bi13 Garnacha Tintorera t Bierzo Garnacha Tintorera 1BE5 Albillo b Valles de Benavente

Verdejo

Bi14 - n Bierzo Tempranillo 1BE6 Tempranillo Gordo n Valles de Benavente

Temprano Blanco / Chasselas Doré

Bi15 Palomino Macho b Bierzo De Rey 1BE7 Moscatel Romano b Valles de Benavente

Muscat of Alexandria

Bi16 - b Bierzo Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco 1BE8 Tempranillo Gordo n

Valles de Benavente

Temprano Blanco / Chasselas Doré

Bi17 - n Bierzo Merenzao 1BE9 Santa Paula n Valles de Benavente

Molinera / Red Malaga

Bi18 - n Bierzo Pan y Carne 1BE10 Santa Paula n Valles de Benavente

Molinera / Red Malaga

Bi19 - - Bierzo Bi19 - Desconocida 1BE11 Redondal b Valles de Benavente

Kamchiya

Bi20 - - Bierzo Bi20 - Desconocida 1BE12 Moscatel Romano n Valles de Benavente

Muscat Hamburg

Bi21 - n Bierzo Brancellao 1BE13 Moscatel Romano b Valles de Benavente

Muscat Hamburg

Bi22 - b Bierzo Allarén 1BE14 Moscatel Blanco de

Grano Menudo b

Valles de Benavente Moscatel Blanco de Grano Menudo

Bi23 - - Bierzo Grand Noir / Morrastel-Bouschet 1BE15 Moscatel Tinto de

Grano Menudo n

Valles de Benavente

Moscatel de Grano Menudo / Moscato Bianco

Bi24 - - Bierzo Muscat Hamburg 1BE16 Uva de Mesa b Valles de Benavente

Palomino

Bi25 - b Bierzo Perla de Csaba 1BE17 Blanco de España b Valles de Benavente

Lairén

Bi26 - - Bierzo Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco 1BE18 Blanco de España b

Valles de Benavente

Lairén

Bi27 - - Bierzo Bi20 - Desconocida 1BE19 Blanco de España b Valles de Benavente

Lairén

Bi28 - b Bierzo Cagarrizo 2BE1 Morisco b Valles de Benavente

Jaén Blanco

Bi29 Toledana n Bierzo Aramon 2BE2 Morisco b Valles de Benavente

Jaén Blanco

Bi30 - n Bierzo Rabo de Ovella / Sumoll 2BE3 Tinta Fina n Valles de Benavente

Albarín Negro

Bi31 - n Bierzo Negreda 2BE4 Tinta Fina n Valles de Benavente

Garnacha

Bi32 Godello b Bierzo Godello 2BE5 Tinta Fina n Valles de Benavente

Albarín Negro

Bi33 - n Bierzo Pan y Carne 3BE1 Aragonesa n Valles de Benavente

Garnacha

Bi34 - n Bierzo Albarín Negro 3BE2 Aragonesa n Valles de Benavente

Garnacha

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

Bi35 Malvasía Riojana b Bierzo Malvasía Riojana / Alarije 3BE3 Juan el Herrero n Valles de Benavente

Bobal

Bi36 - n Bierzo Bi36 - Desconocida 3BE4 Juan el Herrero n Valles de Benavente

Bobal

Bi37 - n Bierzo Monastrell 3BE5 Juan el Herrero n Valles de Benavente

Bobal

Bi38 - b Bierzo Temprano Blanco / Chasselas Doré 3BE6 Tinta de Madrid n Valles de Benavente

Tempranillo

Bi39 - b Bierzo Temprano Blanco / Chasselas Doré 4BE1 Tinta Fina n Valles de Benavente

Albarín Negro

Bi40 - - Bierzo Mencía 4BE2 Tinta Fina n Valles de Benavente

Albarín Negro

Bi41 - - Bierzo Garnacha Tintorera / Alicante

Bouschet 4BE3 Tinta Fina n

Valles de Benavente

Merenzao

Bi42 - - Bierzo Tempranillo 4BE4 Tinta Fina n Valles de Benavente

Merenzao

Bi43 - - Bierzo Bi43 - Desconocida 4BE5 Juan el Herrero n Valles de Benavente

Bobal

Bi44 - - Bierzo Río Abaixo 4BE6 Molinera n Valles de Benavente

Corbeau

Bi45 - - Bierzo Garnacha Tintorera / Alicante

Bouschet 4BE7 Molinera n

Valles de Benavente

Corbeau

Bi46 - n Bierzo Rabo de Ovella / Sumoll 4BE8 Tinta Fina n Valles de Benavente

Merenzao

Bi47 - b Bierzo Picapoll 4BE9 Garnacha Colorada r Valles de Benavente

Garnacha

Bi48 - n Bierzo Petit Verdot 4BE10 Garnacha Colorada r Valles de Benavente

Garnacha

Bi49 Moscatel de Alejandría b Bierzo Muscat of Alexandria 4BE11 Tempranillo Blanco

Menudo b

Valles de Benavente

Temprano Blanco / Chasselas Doré

Bi50 Tinta n Bierzo Trepat 4BE12 Tempranillo Blanco

Menudo b

Valles de Benavente

Temprano Blanco / Chasselas Doré

Bi51 - n Bierzo Juan García 4BE13 Teta de Cabra Tinta n Valles de Benavente

Negra Dorada

Bi52 - n Bierzo Juan García 4BE14 Juan el Herrero n Valles de Benavente

Tarragoní

Bi53 - b Bierzo Lairén 4BE15 Juan el Herrero n Valles de Benavente

Bobal

Bi54 - b Bierzo Pedro Ximénez Canario 5BE1 - b Valles de Benavente

Pleita / Mandilari

Bi55 Ojo de Gallo n Bierzo Aramon TO1 Colgadera b Toro Airén

Bi56 - n Bierzo Bi36 – Desconocida TO2 - rs Toro Perlon

SF1 - n Sierra de Francia

Garnacha TO3 Moscatel Rosa rs Toro Gordera Roja

SF2 Temprana Blanca b Sierra de Francia

Lairén TO4 - rs Toro Perlon

SF3 Albarrucio b Sierra de Francia

Mantúo TO5 - b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

SF4 Bruñal n Sierra de Francia

Albarín Negro TO6 - b Toro Pardillo

SF5 Verdejo Serrano b Sierra de Francia

Verdejo Serrano TO7 Moscatel Blanco

Peludo b Toro Perla de Csaba

SF6 Moscatel n Sierra de Francia

Moscatel de Grano Menudo / Moscato Bianco

TO8 Colgadera b Toro Airén

SF7 Garnacha Rosa r Sierra de Francia

Garnacha TO9 - b Toro Pardillo

SF8 Moscatel Gordo

Peludo b

Sierra de Francia

Gordera Roja TO10 - b Toro Muscat of Alexandria

SF9 - b Sierra de Francia

Jaén Blanco TO11 - - Toro Perla de Csaba

SF10 - b Sierra de Francia

Lairén TO12 - b Toro Pardillo

SF11 - b Sierra de Francia

Lairén TO13 - - Toro Perlon

SF12 - n Sierra de Francia

Moristell TO14 - - Toro Perlon

SF13 Vigorosa n Sierra de Francia

Brujidera TO15 - b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco

SF14 Nudo Corto n Sierra de Francia

Mazuelo / Cariñena TO16 - b Toro Muscat of Alexandria

SF15 Colgadera n Sierra de Francia

Gordera Negra TO17 - b Toro Temprano Blanco / Chasselas Doré

SF16 Colgadera n Sierra de Francia

Gordera Negra TO18 - b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco

SF17 - n Sierra de Francia

Ariño TO19 - - Toro Cojón de Gallo

SF18 Falso Rufete n Sierra de Francia SF18 - Desconocida TO20 - b Toro Temprano Blanco / Chasselas Doré

SF19 Federico b Sierra de Francia

Macabeo TO21 Teta de Cabra rs Toro Teta de Vaca

SF20 Verdejo Serrano b Sierra de Francia

Verdejo Serrano TO22 - b Toro Salvador

SF21 Lairén n Sierra de Francia

Mazuelo / Cariñena TO23 Malvasía b Toro Cigüente / Doña Blanca

SF22 Lairén Peludo n Sierra de Francia

Mazuelo / Cariñena TO24 Moscatel de Mesa b Toro Italia

SF23 Verdejo Serrano b Sierra de Francia

Verdejo Serrano TO25 - n Toro Garnacha

SF24 - n Sierra de Francia

Tempranillo TO26 De Mesa rs Toro Teta de Vaca

SF25 - b Sierra de Francia

Palomino TO27 Moscatel b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco

SF26 Colgadera b Sierra de Francia

Mantúo TO28 Moscatel b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco

SF27 - b Sierra de Francia

Legiruela TO29 Moscatel b Toro Moscatel de Grano Menudo /

Moscato Bianco

SF28 Moscatel de Grano

Menudo b

Sierra de Francia

Moscatel de Grano Menudo / Moscato Bianco

TO30 - b Toro Verdejo

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

SF29 Teta de Cabra Tinta n Sierra de Francia

Monastrell TO31 - b Toro Salvador

SF30 Verdejo Serrano b Sierra de Francia

Verdejo Serrano TO32 - - Toro Cojón de Gallo

SF31 Verdejo Serrano b Sierra de Francia

Verdejo Serrano TO33 Leovigildo b Toro Albillo

SF32 Jerez b Sierra de Francia

Palomino TO34 Toledana Blanca b Toro Pardillo

SF33 - n Sierra de Francia

Tempranillo TO35 Gorreta b Toro Cigüente / Doña Blanca

SF34 - n Sierra de Francia

Morate TO36 Chichorra b Toro Albillo

SF35 Malvasía Riojana b Sierra de Francia

Malvasía Riojana / Alarije TO37 Malvasía rs Toro TO37 - Desconocida

SF36 Cojón de Gallo n Sierra de Francia

Negra Dorada TO38 Merlot n Toro Merlot

SF37 - n Sierra de Francia

Trepat TVZ1 Moscatel b Tierra del Vino de Zamora

Muscat of Alexandria

SF38 - n Sierra de Francia

Tempranillo TVZ2 Albillo Real n Tierra del Vino de Zamora

Albillo

SF39 - n Sierra de Francia

Mencía TVZ3 Mandón n Tierra del Vino de Zamora

Mandón / Morenillo II

SF40 Verdejo de Salamanca b Sierra de Francia

Verdejo Serrano TVZ4 Mandón n Tierra del Vino de Zamora

Mandón / Morenillo II

SF41 Tintorera t Sierra de Francia

Garnacha Tintorera / Alicante Bouschet

TVZ5 Albillo b Tierra del Vino de Zamora

Albillo

SF42 - b Sierra de Francia

Moscatel de Grano Menudo / Moscato Bianco

TVZ6 Corazón de Gallo r Tierra del Vino de Zamora

Negra Dorada

SF43 Tempranillo Blanca b Sierra de Francia

Lairén TVZ7 - n Tierra del Vino de Zamora

TVZ7 - Desconocida

SF44 Mindundo b Sierra de Francia

Jaén Blanco TVZ8 Tinta Vigorosa n Tierra del Vino de Zamora

Mandón / Morenillo II

SF45 Castellana Blanca b Sierra de Francia

Castellana Blanca TVZ9 Albillo b Tierra del Vino de Zamora

Albillo

SF46 Calabrés n Sierra de Francia

Calabrés RA1 Garnacha Gris g Ribera del Arlanza

Garnacha

SF47 Calabrés n Sierra de Francia

Calabrés RA2 Garnacha Gris g Ribera del Arlanza

Garnacha

SF48 Colgadera Blanca b Sierra de Francia

Macabeo RA3 Garnacha Gris g Ribera del Arlanza

Garnacha

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

SF49 Tempranillo Peludo n Sierra de Francia

Tempranillo RA4 - n Ribera del Arlanza

Mandón / Morenillo II

SF50 Cojón de Gallo r Sierra de Francia

Cojón de Gallo ME1 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

SF51 Albarrucio Tinto n Sierra de Francia

Garnacha ME2 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

SF52 Verdejo de Salamanca b Sierra de Francia

Verdejo Serrano ME3 Hondarrabi b Valle de Mena Petit Courbu

SF53 - n Sierra de Francia

Moristell ME4 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

SF54 - b Sierra de Francia

Picapoll ME5 Tinta del País n Valle de Mena ME5 - Desconocida

SF55 Moscatel Gordo

Peludo b

Sierra de Francia

Gordera Roja ME6 Tinta del País n Valle de Mena ME6 - Desconocida

SF56 Verdejo de Salamanca b Sierra de Francia

Verdejo Serrano ME7 Tinta n Valle de Mena ME6 – Desconocida

SF57 Verdejo de Salamanca b Sierra de Francia

Verdejo Serrano ME8 Tinta Redonda n Valle de Mena ME8 - Desconocida

SF58 Tempranillo Peludo n Sierra de Francia

Tempranillo ME9 Blanca del País b Valle de Mena ME9 - Desconocida

SF59 Tinta del País n Sierra de Francia

Tempranillo ME10 Tinta Gorda n Valle de Mena Señá

SF60 - b Sierra de Francia

SF60 - Desconocida ME11 Blanca del País b Valle de Mena Fallida

SF61 Del Pipajo b Sierra de Francia

Zalema ME12 Hondarrabi b Valle de Mena Matza Zuri

SF62 Tempranillo Blanco b Sierra de Francia

Temprano Blanco / Chasselas Doré ME13 Petit Courbu b Valle de Mena Petit Courbu

SF63 Bruñal n Sierra de Francia

Calabrés ME14 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

SF64 Mondundo n Sierra de Francia

Trepat ME15 Tinta n Valle de Mena Graciano

SF65 Bruñal n Sierra de Francia

Calabrés ME16 Tinta Redonda n Valle de Mena ME6 – Desconocida

SF66 Falso Rufete n Sierra de Francia

Puesto Mayor / Saborinho ME17 Blanca del País b Valle de Mena Chardonnay

SF67 Falso Rufete n Sierra de Francia

SF18 - Desconocida VM1 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

SF68 - n Sierra de Francia

Brujidera VM2 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

AR1 - b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato VM3 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

AR2 - b Arribes del

Duero Godello VM4 Blanca del País b Valle de Mena De José Blanco

AR3 Bastardillo Chico n Arribes del

Duero Merenzao VM5 Tinta del País n Valle de Mena ME5 – Desconocida

AR4 Bastardillo Serrano n Arribes del

Duero Sinsó VM6 Tinta del País n Valle de Mena ME6 – Desconocida

AR5 - n Arribes del

Duero Brujidera VM7 Tinta del País n Valle de Mena ME6 – Desconocida

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

AR6 - n Arribes del

Duero Rufete VM8 Tinta Redonda n Valle de Mena ME8 – Desconocida

AR7 Tinta Jeromo n Arribes del

Duero Tinta Jeromo VM9 Blanca del País b Valle de Mena ME9 – Desconocida

AR8 Puesta en Cruz b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato VM10 Tinta Gorda n Valle de Mena Señá

AR9 - b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato VM11 Blanca del País b Valle de Mena ME8 – Desconocida

AR10 - b Arribes del

Duero Cigüente / Doña Blanca VM12 Hondarrabi Zuri b Valle de Mena Matza Zuri

AR11 - n Arribes del

Duero Sinsó VM13 Petit Courbut b Valle de Mena Petit Courbu

AR12 - b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato VM14 - b Valle de Mena Sauvignon Blanc

AR13 - b Arribes del

Duero Mantúo VM15 - b Valle de Mena Petit Courbu

AR14 Juan García n Arribes del

Duero Juan García VM16 - b Valle de Mena De José Blanco

AR15 - n Arribes del

Duero Negra Dorada VM17 Tinta Redonda n Valle de Mena ME6 – Desconocida

AR16 - r Arribes del

Duero Verdejo Colorado VM18 Tinta n Valle de Mena Graciano

AR17 - - Arribes del

Duero Desconocida VM19 Tinta Redonda n Valle de Mena ME6 – Desconocida

AR18 - n Arribes del

Duero Mencía VM20 Tinta Redonda n Valle de Mena ME6 – Desconocida

AR19 - n Arribes del

Duero Mencía CONV1 Blanca de Mesa b Valladolid Beba / Calop Rojo

AR20 Bastardillo Serrano n Arribes del

Duero Sinsó CONV2 De Mesa Gorda n Valladolid Alphonse Lavallé

AR21 - n Arribes del

Duero Albarín Negro CONV3 Roja de Mesa n Valladolid Gordera Negra

AR22 Bastardillo Chico n Arribes del

Duero Merenzao CONV4 Moscatel Gordo n Valladolid Muscat of Alexandria

AR23 - r Arribes del

Duero Verdejo Colorado CONV5 Jerez n Valladolid Palomino

AR24 Bruñal n Arribes del

Duero Albarín Negro CONV6 Gris de Mesa b Valladolid Gordera Negra

AR25 Bastardillo Chico n Arribes del

Duero Merenzao CONV7 - b Valladolid Calagraña / Katsano

AR26 Porte erguido n Arribes del

Duero Tinta Jeromo CONV8 De Mesa Larga n Valladolid Gordera Negra

AR27 - b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato CONV9 De Mesa Gorda n Valladolid Alphonse Lavallé

AR28 Bruñal n Arribes del

Duero Albarín Negro Ci1 Albillo Mayor b Cigales Albillo Mayor

AR29 - b Arribes del

Duero Palomino Ci2 Temprana Media b Cigales Pardillo

AR30 Malvasía b Arribes del

Duero Cigüente / Doña Blanca Ci3 Claireto b Cigales Picapoll

Código Nombre local de la

muestra Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal Código

Nombre local de la muestra

Color bayaa

Zona de recolección

original Identificación varietal

AR31 - b Arribes del

Duero Palomino Ci4 Garnacha Rosa r Cigales Garnacha

AR32 - n Arribes del

Duero Mandón / Morenillo II Ci5 Albilla b Cigales Albillo Mayor

AR33 Bruñal n Arribes del

Duero Albarín Negro Ci6 Aragonesa n Cigales Brujidera

AR34 - b Arribes del

Duero Palomino Ci7 Godella b Cigales Cigüente / Doña Blanca

AR35 Verdejo Colorado r Arribes del

Duero Verdejo Colorado Ci8 Verdeja b Cigales Verdejo

AR36 Verdejo Colorado r Arribes del

Duero Verdejo Colorado Ci9 Salvador b Cigales Salvador

AR37 - b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato Ci10 Chasselas Doré b Cigales Beba / Calop Rojo

AR38 Gajo Arroba n Arribes del

Duero Gajo Arroba Ci11 Temprana Blanca b Cigales Temprano Blanco / Chasselas Doré

AR39 Sinsó n Arribes del

Duero Sinsó AND1 Palomino Fino b Andalucía Palomino

AR40 - n Arribes del

Duero Molinera / Red Malaga RD1 Tempranillo Pedrosa n

Ribera del Duero

Tempranillo

AR41 Tinta Amarela n Arribes del

Duero Trincadeira Preta RJ1 Tempranillo n Rioja Tempranillo

AR42 Merenzao n Arribes del

Duero Merenzao RJ2 Garnacha Blanca b Rioja Garnacha

AR43 Bastardillo Serrano n Arribes del

Duero Negra Dorada RU1 Nieva n Rueda Puesto Mayor / Saborinho

AR44 Tinturón t Arribes del

Duero Grand Noir / Morrastel-Bouschet Ti1

Albillo Real Extremadura

b Valle del

Tiétar Albillo Real

AR45 Portuguesa n Arribes del

Duero Poilta W1 Individuo salvaje 1 Macho

Arribes del Duero W1 - Desconocida

AR46 Toledana n Arribes del

Duero Aramon W2 Individuo salvaje 2 n

Arribes del Duero

W2 - Desconocida

AR47 Acebo b Arribes del

Duero Verdejo Serrano W3 Individuo salvaje 3 Macho

Arribes del Duero W3 - Desconocida

AR48 Turruntés b Arribes del

Duero Puesta en Cruz / Rabigato W4 Individuo salvaje 4 Macho

Arribes del Duero

Aramon rupestris (híbrido)

TABLA A2. Genotipos para 22 microsatélites nucleares en forma de series de alelos medidos en pares de bases (pb) y clorotipo definitivo (codificados de la A a la H de acuerdo a Arroyo-García et al. 2006) de los 121 perfiles discriminados en el estudio. Genotipo VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 VrZAG62 VrZAG79 VVIb01 VVIh54 VVIn16 VVIn73 VVIp31 Chlorotype

Bi1 129 148 229 234 236 240 178 186 186 194 240 242 292 292 163 167 149 151 262 262 174 192 A Bi3 129 141 221 235 240 246 176 178 184 186 244 258 288 305 165 165 151 157 262 262 178 188 A Bi4 133 148 221 227 236 260 178 182 186 192 244 256 288 305 165 165 149 151 262 262 190 192 A Bi6 129 141 229 235 240 254 178 186 186 192 242 244 288 292 165 167 149 151 262 262 178 178 D Bi7 139 148 221 235 236 236 180 191 184 186 254 256 288 288 165 167 151 157 262 262 174 190 D Bi8 135 148 221 229 236 240 178 180 186 186 240 256 288 292 163 165 149 151 262 262 174 178 A Bi9 129 135 231 234 236 260 180 186 184 194 248 256 288 288 165 165 149 157 260 262 188 190 A Bi10 133 148 221 227 236 246 176 188 184 202 248 248 286 292 165 165 149 157 262 262 178 182 C Bi11 133 148 217 229 236 246 178 178 184 202 244 244 288 305 163 165 151 157 262 262 174 188 A Bi12 141 148 221 231 246 254 178 186 186 192 244 248 292 305 163 165 149 151 262 262 178 190 A Bi13 129 141 221 234 236 240 178 191 186 186 240 254 288 292 163 167 149 157 254 262 174 182 A Bi15 129 139 221 229 244 246 176 178 186 192 240 246 305 305 165 167 149 151 262 262 174 188 C Bi19 119 133 231 234 234 248 182 191 186 200 244 254 292 292 165 165 149 149 262 262 174 182 D Bi20 135 139 223 240 234 236 176 186 184 196 246 248 286 288 165 165 146 149 260 268 174 180 G Bi21 129 148 217 221 236 236 182 186 186 192 248 256 286 292 163 165 151 151 256 262 186 190 A Bi22 139 141 234 235 236 254 186 191 186 186 248 254 286 288 167 167 151 157 260 262 178 188 A Bi25 129 153 231 231 244 246 176 178 184 202 252 256 288 292 163 165 146 155 262 262 178 192 C Bi28 129 148 227 235 240 244 182 186 192 202 242 248 286 288 163 165 151 157 262 262 174 178 D Bi29 129 139 229 229 236 240 178 191 186 194 240 254 292 292 165 167 149 151 262 262 174 178 D Bi32 148 155 221 234 236 240 182 186 184 186 248 248 286 288 163 165 149 151 262 262 178 188 A Bi36 141 148 217 231 236 240 178 182 186 192 244 256 288 292 163 167 149 151 256 262 178 190 A Bi37 129 148 221 235 246 246 176 186 186 202 248 258 288 288 165 165 151 157 262 262 178 190 A Bi43 131 131 231 231 232 244 182 182 190 200 237 246 290 292 165 165 146 149 262 262 188 190 B Bi48 139 153 221 227 236 260 176 186 192 202 248 252 288 292 163 179 151 155 262 264 178 192 A Bi50 129 139 221 229 240 246 176 191 186 202 248 254 288 288 163 165 151 157 262 262 178 188 A Bi54 129 148 227 227 236 254 176 186 184 192 242 248 286 288 163 165 151 157 262 262 174 192 D SF5 133 155 221 231 236 246 178 182 186 202 244 256 288 305 165 165 151 157 256 262 174 190 A SF8 129 139 223 231 246 248 176 186 184 202 240 252 288 292 165 165 146 151 254 262 186 190 A

SF12 139 141 229 231 236 244 178 186 186 202 240 244 288 292 165 165 149 151 254 262 188 188 A SF13 139 141 223 227 236 240 180 191 186 190 244 254 288 288 165 167 149 151 254 262 174 190 D SF14 139 141 221 223 236 236 178 182 184 186 248 256 288 292 165 165 149 151 262 262 174 176 A SF15 131 139 229 234 240 240 191 191 186 186 254 254 288 292 165 167 151 151 262 262 182 188 A SF17 139 148 221 229 236 246 176 191 186 202 254 258 288 288 165 165 151 157 262 262 174 178 A SF18 135 148 223 234 236 236 176 186 184 184 248 258 288 305 165 165 149 149 262 262 174 190 A SF27 129 153 223 234 230 244 182 186 192 194 237 248 286 292 165 173 151 157 254 254 174 192 A SF34 139 141 231 231 236 236 180 186 184 186 240 248 288 292 165 165 151 151 254 262 188 194 A SF46 148 148 234 234 236 254 176 182 184 186 248 248 288 292 163 167 149 151 262 262 176 188 A SF50 139 144 227 242 236 240 176 180 190 202 244 246 288 288 165 167 149 151 262 262 190 190 A SF60 133 141 231 235 236 246 178 191 184 202 254 256 288 288 165 165 151 151 262 262 182 188 A SF61 129 141 231 235 236 236 178 178 186 194 244 254 288 305 165 167 151 151 262 262 174 186 A AR4 129 129 221 221 240 244 176 178 186 202 252 256 288 292 163 167 149 149 262 262 180 186 C

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AR13 139 148 229 234 240 250 178 182 186 186 244 254 288 288 165 165 151 151 262 262 174 178 A AR14 133 148 229 234 246 254 178 186 186 202 244 248 292 305 167 167 149 157 262 262 174 178 A AR17 139 148 - - 236 242 - - 184 186 242 244 - - 140 165 151 - - - - - - AR35 139 148 227 234 240 240 176 186 186 202 246 248 288 288 163 165 151 151 262 262 178 190 A AR38 133 139 229 234 246 250 178 186 198 202 244 248 - - - - - - - - - - A TL1 129 148 217 234 236 254 178 186 184 192 242 244 286 288 163 165 151 157 262 262 180 192 D TL3 139 148 221 234 236 254 176 186 186 192 248 248 286 292 163 167 151 157 262 262 178 188 A

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AR13 318 324 82 82 157 157 353 367 245 245 204 204 252 252 231 257 249 269 183 187 185 185 AR14 303 319 78 82 159 159 361 370 245 252 204 206 246 252 245 245 249 269 171 187 177 201 AR17 76 82 245 208 212 AR35 319 324 78 82 159 168 353 367 245 245 206 210 246 252 251 255 249 249 165 183 177 181 AR38 TL1 318 318 82 82 159 163 359 359 245 245 204 208 238 246 231 243 237 249 169 169 171 177 TL3 303 319 76 82 155 159 359 370 245 252 204 208 246 252 231 245 237 253 165 169 171 177

TL13 315 319 76 82 155 178 367 367 239 245 204 213 236 252 215 233 261 269 183 183 171 189 TL16 318 318 78 78 159 168 353 353 252 260 202 213 238 238 249 255 269 269 179 187 169 187 BE13 315 319 82 82 159 159 367 370 252 252 204 208 238 246 233 245 249 249 165 167 177 185 BE26 319 319 80 82 168 172 367 370 245 252 204 208 236 246 231 241 249 269 171 183 171 204 TO1 319 319 78 82 157 159 348 361 239 262 204 208 252 252 231 241 249 269 183 183 171 185 TO4 318 318 82 82 159 178 367 393 239 252 204 204 238 252 241 255 247 269 183 187 165 185 TO21 319 319 76 82 155 157 353 359 245 252 204 204 252 263 245 251 249 253 183 183 187 187 TO37 315 318 82 82 159 161 359 370 245 245 204 213 238 246 241 255 249 261 181 187 163 187 TO38 311 328 76 78 159 170 367 367 239 243 204 208 236 246 225 231 237 237 171 183 171 201

TVZ2 318 324 78 82 159 174 356 359 239 252 204 206 236 236 231 241 249 269 183 187 165 171 TVZ7 319 322 82 82 157 161 359 359 223 239 204 204 238 255 233 241 247 247 167 181 171 171 PT5 315 319 82 82 159 159 367 367 245 252 204 204 238 246 233 233 249 253 165 167 185 204 PT8 303 319 78 82 159 159 359 367 245 252 204 206 238 259 225 231 237 269 165 187 171 204 PT18 303 319 82 82 159 174 353 367 245 250 208 210 236 246 225 255 253 269 169 183 177 185 PT20 319 319 76 78 155 159 359 367 245 252 206 208 246 252 231 245 249 253 183 187 171 201 ME1 315 319 78 78 159 161 348 359 237 245 204 206 238 238 215 241 237 237 171 179 177 201 ME3 303 318 82 82 159 159 359 359 245 245 208 210 246 263 215 255 237 269 165 181 177 204 ME5 322 322 76 78 157 159 359 359 217 245 202 202 236 236 241 255 269 269 171 187 171 171 ME6 315 319 78 82 159 159 334 359 260 262 204 208 234 246 225 249 237 237 171 179 171 179 ME8 311 319 76 78 146 159 329 334 225 239 204 212 234 252 241 249 247 247 171 187 179 185 ME9 307 315 78 82 159 161 348 359 223 237 206 212 238 238 241 241 237 247 179 187 185 201 ME10 313 324 76 78 148 159 359 359 239 245 206 208 238 252 231 264 237 269 171 183 165 171 ME12 318 322 76 82 159 159 359 359 245 245 204 208 236 246 243 255 237 269 169 171 171 171 ME15 307 315 82 82 161 174 353 359 245 250 204 204 259 267 241 255 237 253 171 183 177 204 ME17 315 318 76 82 148 159 359 367 245 245 204 212 236 252 215 225 237 269 165 183 171 177

CONV1 315 319 76 78 157 159 359 365 245 252 204 206 252 252 241 255 253 269 183 187 184 184 CONV2 319 324 76 78 155 159 353 365 245 245 204 208 236 252 241 241 249 269 165 173 165 204 1BE1 315 319 76 78 148 159 353 361 239 245 204 208 238 246 233 245 255 259 165 183 165 204 1BE2 315 318 78 82 148 157 353 370 245 245 204 208 252 267 231 257 249 249 169 183 185 201 1BE3 315 319 76 76 159 172 370 383 252 262 208 208 246 246 241 264 261 269 165 183 179 204 1BE9 315 319 78 82 157 159 367 370 245 245 206 206 238 252 231 255 249 269 185 187 165 184 1BE12 315 319 76 80 159 168 367 385 245 252 208 208 246 252 233 241 269 269 165 171 171 204 1BE14 315 319 76 82 155 161 356 370 245 250 208 213 246 246 255 264 253 261 165 183 181 204 1BE15 315 315 76 76 159 161 359 370 245 262 208 213 238 246 243 264 261 269 183 187 165 204 2BE1 319 319 78 82 159 174 361 370 245 252 204 206 238 252 231 245 249 253 167 187 185 201 2BE3 303 315 82 82 159 159 367 370 245 252 204 208 246 252 233 245 249 271 165 171 177 204 4BE6 303 315 82 82 148 159 359 367 252 262 212 212 246 259 225 241 237 269 169 173 171 171 4BE13 315 315 78 82 157 178 370 383 245 252 208 208 246 252 231 241 247 249 165 169 184 201 4BE14 319 324 78 82 159 168 356 361 239 245 204 204 238 238 231 255 237 269 187 193 165 171 5BE1 315 324 76 76 159 168 361 370 245 245 204 204 238 252 245 255 247 247 165 183 165 177

CyL-03 319 319 76 78 155 159 356 356 239 250 213 213 238 246 231 255 249 269 165 183 165 185 CyL-04 319 319 76 78 159 159 356 359 239 239 204 213 236 238 233 233 255 269 165 183 165 173 CyL-06 319 319 76 78 168 168 361 370 239 245 208 213 238 238 233 233 247 269 171 183 165 171 CyL-09 315 324 82 82 148 157 367 370 239 245 204 206 238 252 231 255 249 269 183 187 165 171 CyL-10 315 324 76 78 168 168 353 361 245 252 204 204 252 252 241 255 247 253 183 187 165 181 CyL-12 319 319 78 82 157 174 359 359 239 245 206 213 238 252 231 255 253 269 183 187 165 185 CyL-18 318 319 78 82 157 174 359 367 250 252 204 206 236 238 231 255 249 269 183 183 165 171 CyL-22 315 319 78 82 148 159 358 358 245 262 204 208 238 252 264 264 237 237 171 173 171 177 CyL-23 315 319 78 82 155 168 356 362 245 250 210 213 246 252 255 255 249 249 165 173 181 185 CyL-26 315 324 76 78 157 157 353 356 245 245 206 213 252 263 233 233 249 269 187 187 165 185 CyL-27 319 330 76 78 155 157 359 362 245 245 210 213 236 252 231 243 249 253 165 173 181 185 CyL-30 303 315 76 82 159 168 367 370 245 245 213 213 246 252 231 245 237 253 169 183 165 177 CyL-31 303 319 82 82 159 159 359 370 245 245 213 213 246 252 231 255 237 253 165 169 171 177 CyL-34 318 319 78 82 155 159 359 370 239 245 204 204 236 236 245 255 253 269 171 171 177 201 CyL-37 324 324 76 78 155 159 353 356 239 239 204 206 238 263 231 257 247 269 183 187 171 181 CyL-39 319 324 78 78 168 168 359 362 245 252 204 210 238 252 255 255 247 249 171 183 177 181

CyL-40 318 319 82 82 155 159 359 370 245 252 204 208 236 246 231 245 253 269 165 171 177 204 CB08 315 319 78 78 159 163 359 359 239 245 204 204 238 238 233 245 253 255 183 187 173 204 CB09 303 318 76 82 159 168 359 367 239 245 213 213 238 246 231 233 237 253 171 183 177 204 CB10 303 319 76 82 159 168 356 367 245 250 208 213 246 246 231 255 237 249 165 169 171 185 CB11 315 324 78 82 155 159 367 370 239 250 204 206 238 238 233 255 247 247 183 183 177 185 CT01 303 311 76 82 159 161 359 367 245 255 204 213 236 246 231 233 237 237 183 183 171 177 CT02 315 319 76 82 157 168 353 359 239 245 206 212 238 252 241 241 237 247 187 193 185 204 CT05 315 319 78 82 159 168 356 367 239 245 204 204 238 246 231 264 237 249 165 171 177 201 Ci1 319 319 78 78 168 168 362 370 245 250 210 213 238 252 231 255 249 269 165 183 165 181 Ci2 319 319 76 82 159 174 356 356 239 250 208 210 238 246 231 255 249 269 183 187 173 185 Ti1 319 319 82 82 155 159 353 361 245 250 204 210 246 252 255 255 249 269 187 187 185 185 W1 313 313 76 78 148 163 358 358 245 245 206 210 238 252 231 231 237 253 165 171 171 177 W2 311 313 76 76 159 159 353 358 245 245 204 212 263 263 259 261 237 269 165 167 201 201 W3 311 311 76 76 159 161 353 353 243 250 213 213 246 263 261 261 237 269 167 171 181 201 W4 319 330 78 82 151 168 359 379 223 245 202 204 236 238 247 257 247 247 167 181 171 171

TABLA A3. Composición alélica para 9 loci polimórficos de los 8 clorotipos presentes en Vitis vinifera L. (Arroyo-García et al. 2006).

locus Clorotipo

cpSSR3 cpSSR5 cpSSR10 NTCP-8 NTCP-12 ccSSR5 ccSSR9 ccSSR14 ccSSR23

A 106 105 114 248 119 255 166 201 280

B 106 105 115 248 119 255 165 202 281

C 106 105 116 248 119 255 165 203 282

D 107 104 115 249 118 254 165 202 281

E 107 104 116 249 118 254 165 202 281

F 107 105 115 248 119 255 165 202 281

G 106 105 114 248 119 255 165 201 280

H 106 105 115 248 119 255 166 201 280

FIGURAS de la A-1 a la A-3: Dendrogramas descartados por su menor significación estadística respecto del seleccionado para el análisis de estructura genética en el estudio.

FIGURA A-1. Dendrograma representando las relaciones filogenéticas entre los 122 genotipos

discriminados en el estudio, construido con la distancia Dc (Cavalli-Sforza y Edwards 1967) y el método Neighbour-Joining (Saitou y Nei 1987), con los datos de 22 microsatélites nucleares.

FIGURA A-2. Dendrograma representando las relaciones filogenéticas entre los 122 genotipos

discriminados en el estudio, construido con la distancia Da (Nei et al. 1983) y el método UPGMA (Sneath y Sokal 1973), con los datos de 22 microsatélites nucleares.

FIGURA A-3. Dendrograma representando las relaciones filogenéticas entre los 122 genotipos discriminados en el estudio, construido con la distancia Da (Nei et al. 1983) y el método UPGMA

(Sneath y Sokal 1973), con los datos de 22 microsatélites nucleares.

ANEJO II

ANEJO III

ANEJO IV