TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MAGISTER …

TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO

DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Título: Aislamiento y caracterización del gen que codifica para la

enzima Isocitrato liasa de Mycosphaerella fijiensis Morelet.

Aspirante: Ing. Bárbara Ocaña Diaz

Tutor: Dr. Elio Jiménez González

Santa Clara, CUBA 2008

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS

DDeeddiiccaattoorriiaa

Dedico este trabajo a:

Mi hijo: Gabriel .

Mis padres, hermanos y esposo, por su apoyo incondicional.

AAggrraaddeecciimmiieennttooss

Después de culminar el presente trabajo quisiera agradecer:

• Al Consejo de Universidades Flamencas de Bélgica a través del programa de

cooperación institucional.

• A mis compañeros del laboratorio de Biología Molecular María I. Olóriz, Neyda

Bacallao, Milady Mendoza, Milady León, María J. Manso, Luis Rojas y José M.

Machado por el apoyo constante.

• Al Dr. Elio Jiménez por todos los consejos brindados que fueron de gran valor

para la culminación de este trabajo.

• Al Lic. Aminael Sánchez por su disposición y valiosa ayuda en todo momento.

• Al Lic. Orelvis Portal por su apoyo y preocupación.

• A los compañeros del laboratorio de Fitopatología por la ayuda brindada.

• A todos los trabajadores del IBP que de una forma u otra han propiciado la

culminación de esta investigación.

• A todos

Muchas Gracias.

RReessuummeenn

Resumen La raya negra de la hoja o SigatoKa Negra es producida por el hongo ascomiceto

Mycosphaerella fijiensis Morelet es la enfermedad más importante que ataca a la

superficie foliar de los plátanos y bananos. El objetivo del presente trabajo fue aislar el

gen que codifica para la enzima Isocitrato liasa de M. fijiensis y realizar su

caracterización mediante ensayos de expresión. Se aisló un fragmento de 1561 pb del

gen de la icl, empleando oligonucléotidos degenerados (ICL D e ICL R) diseñados a

partir de secuencias del gen de la icl de hongos relacionados filogenéticamente. Se

determinó el crecimiento y producción de conidios de M. fijiensis en medios con distintas

fuentes de carbono (sacarosa, glucosa, glicerol, etanol, acetato de potasio),

demostrándose que M. fijiensis es capaz de crecer en Medio Mínimo con 1% de glicerol

y etanol, con tasas de producción de masa seca superiores, en el caso de glicerol, a las

medias obtenidas en Medios Mínimos con glucosa y sacarosa al 1% y el etanol al 1 %

con una producción de masa seca superior al medio control PDB. Además se comprobó

la capacidad del hongo de producir conidios durante el cultivo en Medio Mínimo con

glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al 1%, confirmándose la activación del ciclo

del glioxalato en presencia de estas fuentes de carbono. El análisis mediante RT-PCR

con oligonucleótidos específicos (ICL Mif D e ICL Mif R), confirmó la expresión del gen

de la icl de M. fijiensis en el Medio Mínimo con glicerol al 1% y en el Medio Mínimo con

etanol al 1 % en muestras de micelio a los 7 y 21 días de cultivo. Los resultados

obtenidos brindan elementos sobre la regulación del metabolismo de carbohidratos en

M. fijiensis y podrán contribuir al desarrollo de nuevas estrategias de control de la

enfermedad.

IInnddiiccee

Aislamiento y caracterización del gen que codifica para la enzima Isocitrato liasa de Mycosphaerella fijiensis Morelet

Tesis de Maestría 53

1. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................................4

2.1 Enfermedades de Musa ....................................................................................................4

2.2 Sigatoka negra ................................................................................................................4

2.2.1 Historia y distribución ................................................................................................4

2.2.2 Importancia de la enfermedad ..................................................................................5

2.2.3 Impacto socioeconómico............................................................................................6

2.2.4 Agente causal.............................................................................................................6

2.2.5 Sintomatología............................................................................................................8

2.2.6 Epifitiología .................................................................................................................9

2.2.7 Ciclo de la enfermedad ............................................................................................11

2.2.8 Manejo de la enfermedad ........................................................................................13

2.3 Interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis ...............................................................15

2.4 Estrategias de adquisición de nutrientes de hongos fitopatógenos durante la

infección.................................................................................................................................17

2.4.1 Estudios de expresión del gen de la isocitrato liasa en hongos fitopatógenos. .....20

3. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................................................23

3.1 Aislamiento y clonaje del gen de la isocitrato liasa de Mycosphaerella fijiensis Morelet

...............................................................................................................................................26

3.2 Crecimiento de M. fijiensis en diferentes fuentes de carbono.......................................30

3.2.1 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de M. fijiensis en medio líquido

en agitación .......................................................................................................................30

3.2.2 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de M. fijiensis en medio

sólido. 32

3.2.3 Producción in vitro de conidios de M .fijiensis en diferentes fuentes de

carbono. 33



3.3 Estudio de la expresión del gen de la icl de M. fijiensis en medios de cultivo con

diferentes fuentes de carbono...............................................................................................34

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................37

4.1 Aislamiento y clonaje del gen de la isocitrato liasa de Mycosphaerella fijiensis Morelet

...............................................................................................................................................37

4.2 Crecimiento de M. fijiensis en diferentes fuentes de carbono.......................................41


en agitación .......................................................................................................................41

4.2.2 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de M. fijiensis en medio sólido .44

4.2.3 Producción in vitro de conidios de M .fijiensis en diferentes fuentes de carbono ..46

4.3 Estudio de la expresión del gen de la Isocitrato liasa de M. fijiensis en medios de

cultivo liquido con glicerol y etanol........................................................................................47

5. CONCLUSIONES..................................................................................................................51

6. RECOMENDACIONES .........................................................................................................52

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

IInnttrroodduucccciióónn



1. INTRODUCCIÓN

La producción mundial de plátanos y bananos se estima que es de unas 108 millones de

toneladas métricas por año, de las cuales el 68% corresponde a bananos, representando el

quinto producto básico más importante en la dieta mundial (FHIA, 2007).

Aunque la producción de plátanos y bananos sobrepasa las demandas del mercado

internacional, estas se ven afectadas anualmente por diferentes enfermedades dentro de las

cuales la Sigatoka negra, producida por el hongo hemibiotrófico Mycosphaerella fijiensis

Morelet (anamorfo: Pseudocercospora fijiensis), representa pérdidas entre el 20 y 90% de los

rendimientos (Etebu et al., 2005). Un problema adicional asociado a la enfermedad son las

costosas aplicaciones de fungicidas que requiere el cultivo y la posibilidad de la aparición de

fungo-resistencia a los mencionados químicos.

Significativos esfuerzos se han realizado en las musáceas para la búsqueda de resistencia a

la enfermedad. Hoy en día se encuentran disponibles a nivel internacional algunos

materiales resistentes, como son los híbridos de la Fundación Hondureña de Investigación

Agropecuaria (Rowe, 1993; 1994) y los del Instituto de Agricultura Tropical en Nigeria

(Tezenas du Montcel, 1993; Mobambo et al 1993 ).

En la última década se desarrollaron investigaciones en dos vertientes fundamentales. La

primera fue la búsqueda de genes de resistencia de la planta para el mejoramiento genético,

en la que se ha avanzado hacia la construcción de bibliotecas genómicas (Vilarinhos et al.,

2003) y de ADN complementario ó sustractivas para el aislamiento de genes expresados

diferencialmente en cultivares resistentes (Dagert et al., 2002). Una segunda vertiente se

enfocó al estudio del genoma del hongo causante de la enfermedad. Un importante avance

representó la construcción de una biblioteca genómica de M. fijiensis (Canto et al., 2007) y la

publicación de su genoma (Kema et al., 2008).



Durante la interacción hospedero-patógeno la eficiente nutrición del patógeno es un

prerrequisito para el éxito de la posterior colonización y sobre vivencia exitosa del patógeno.

Los hongos filamentosos tienen una marcada capacidad de adaptarse y explotar los

nutrientes del medioambiente. Para hongos fitopatógenos esta capacidad ha sido

desarrollada dentro del contexto fisiológico y metabólico del hospedero. El entendimiento de

la toma de nutrientes y el metabolismo primario del patógeno es de gran importancia para el

desarrollo de nuevas estrategias de control de la enfermedad. La regulación del metabolismo

de carbohidratos ha sido estudiada en las diferentes etapas del ciclo de infección de hongos

fitopatógenos y se ha demostrado su importancia en la inducción de estructuras infectivas y

la patogenicidad (Bowyer et al., 2000).

El centro de interés de estos estudios se ha focalizado hacia la regulación de la expresión

del gen de la isocitrato liasa (icl), como enzima marcadora de lipólisis y objeto de regulación

a través de represión catabólica por glucosa (Divon y Fluhr, 2007).

Se ha descrito en varios trabajos la importancia de la isocitrato liasa en la patogenicidad de

hongos de plantas. Investigaciones realizadas con un transgen de la GFP fusionado a al

promotor de la ICL de Neurospora crassa, expresado en Tapesia vallundae, un patógeno del

trigo, se demostró que la construcción fue pobremente expresada in vitro y especialmente

activado durante el proceso de infección de la planta (Bowyer et al., 2000).

Por otra parte, se comprobó que el metabolismo intracelular de los lípidos de reserva son de

gran importancia para la formación del apresorio en Magnaporthe grisea (Thines et al.,

2000).

En un estudio por inserción de mutagénesis se aisló un mutante avirulento de Leptosphaeria

maculans, un patógeno fúngico de Brassica napus (canola), en el cuál se encontró disfunción

de la isocitrato liasa (Idnurm y Howlett, 2002).



Los logros alcanzados en estudios básicos de expresión de la ICL permitieron hacer la

propuesta de un inhibidor de esta enzima como candidato para la protección de plantas de

arroz al ataque de Magnaporthe grisea (Shin et al., 2007).

Teniendo en cuenta la importancia que encierra el estudio del gen de la icl de M. fijiensis y el

conocimiento de su regulación en presencia de distintas fuentes de carbono es que se

propone la siguiente hipótesis:

¨El aislamiento y caracterización del gen que codifica para la Isocitrato liasa de

Mycosphaerella fijiensis Morelet, permitirá estudiar los niveles de expresión de este gen

cuando el hongo es cultivado en diferentes fuentes de carbono¨.

Para dar cumplimiento a la hipótesis propuesta se trazaron los siguientes objetivos.

Objetivo general:

• Aislar el gen que codifica para la enzima Isocitrato liasa de Mycosphaerrella fijiensis

Morelet y realizar su caracterización mediante ensayos de expresión.

Objetivos específicos

• Aislar, clonar y secuenciar el gen que codifica para la enzima Isocitrato liasa de M.

fijiensis.

• Determinar el crecimiento y producción de conidios de M. fijiensis en medios con

distintas fuentes de carbono (sacarosa, glucosa, glicerol, etanol, acetato de potasio).

• Realizar la caracterización del gen de la Isocitrato liasa mediante ensayos de

expresión en medios de cultivo con diferentes fuentes de carbono.

RReevviissiióónn BBiibblliiooggrrááffiiccaa



2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Enfermedades de Musa

Las enfermedades y plagas de Musa spp. constituyen problemas significativos en todo

el mundo, limitan la producción, tanto de los pequeños productores como de la destinada a la

exportación y pueden ocasionar pérdidas considerables. Las enfermedades afectan todas las

partes de las plantas y son causadas por hongos, bacterias y virus (Jones 2000 a, Stover

1972, Wardlaw 1961). Entre ellas se encuentran el Mal de Panamá causada por Fusarium

oxysporum f. sp. var. cubense, el BBTV (del inglés Banana Bunchy Top virus), enfermedad

del Moko (Ralstonia solanacaearum) (Jain, 2002; Marín et al., 2003).

Las enfermedades fungosas son las más comunes y destructivas.(Jones 2000). Las

enfermedades de las manchas foliares causadas por Mycosphaerella spp. causan daños de

moderados a severos cuando ocurren lluvias significativas (Jacome et al., 2003). La más

importante es la Sigatoka negra causada por Mycosphaerella fijiensis . (Stover y Simmonds

1987).

2.2 Sigatoka negra

2.2.1 Historia y distribución La cronología de la enfermedad, destaca diferentes registros alrededor del mundo,

sugiriendo su origen en el Sudeste Asiático, tal como M .musicola que causa la Sigatoka

amarilla. En América Latina, desde la primera aparición de la enfermedad en Honduras en

1972 (Mourichon y Furlerton 1990), ésta se ha diseminado progresivamente a otros países

de América Latina y la cuenca del Caribe. Entre 1973 y 1980 severas epidemias ocurrieron



en el continente, distribuyéndose principalmente desde Honduras a Belice, Guatemala,

Nicaragua y Costa Rica. De igual manera, en el continente africano la Sigatoka negra se

registra por vez primera en Zambia (1973) y Gabón (1978); y la enfermedad se ha

diseminado en toda la franja tropical del continente. Posteriormente apareció en 1981 en

México, Panamá y Colombia, en 1986 en Ecuador. En la década siguiente se registra en

1990 en Cuba, en 1991 en Venezuela y entre 1995-96 en Jamaica y República Dominicana.

El último registro se refiere a Brasil en 1998 (Jones, 2000). En los Estados Unidos se registró

en 1998 y donde último se descubrió en América Latina fue en las Islas Galápagos a

principios de 2001. En abril de este mismo año, fue registrada por primera vez en un área de

producción comercial cerca de Tully en el norte de Queensland. (Jácome, 2003).

2.2.2 Importancia de la enfermedad La Sigatoka negra, es el principal problema fitopatológico del cultivo del banano y el plátano

en América, Asia y África (Carlier et al., 2000, Lepoivre et al., 2003,Marín et al., 2003).

Debido a sus características biológicas de mayor producción de ascosporas, mayor número

de ciclos sexuales por año y una elevada tasa de colonización de tejido, la Sigatoka negra

logra predominar sobre otras enfermedades foliares del banano menos agresivas (Romero,

2003). Esta enfermedad altamente destructiva en los principales cultivares de plátanos,

puede ocasionar según Burt et al (1997) y Orozco (1998) pérdida en el rendimiento entre un

50 y 100%, afectando de manera notoria la economía del productor. Ataca las hojas de las

plantas, produciendo un rápido deterioro del área foliar cuando no se combate, afecta

además el crecimiento y productividad de las plantas al disminuir la capacidad de

fotosíntesis. También produce una reducción en la calidad de la fruta, al favorecer la

maduración de los racimos, lo cual es la mayor causa de pérdida (Douglas y Ronald, 1992).



2.2.3 Impacto socioeconómico La aparición de la Sigatoka negra en la mayoría de los países ha tenido un gran impacto

económico y social debido a que se cuadruplicaron los gastos de control de las plantaciones

comerciales de banano y se afectó sensiblemente la economía de los pequeños agricultores

sin infraestructura económica para proteger bananos y plátanos que, además, por sus bajos

rendimientos no siempre cubren las inversiones requeridas para la protección con

agroquímicos (Stover, 1980, Stover y Simmonds, 1987).

Cuatro años después de su aparición en Cuba en 1990, reemplazó a Sigatoka (M. musicola)

en la mayoría de las plantaciones del país. La Sigatoka negra ha tenido un importante

impacto en la producción de bananos y plátanos susceptibles. En 1989 habían más de 40 mil

ha de plátanos (AAB) y 14 mil de Cavendish sometidos a protección. A partir de 1991 se

llegaron a realizar hasta 20 ciclos /año de fungicidas en las plantaciones de bananos

Cavendish y los costos de protección alcanzaron el 15 % de todos los costos de producción.

(Pérez et al., 2003).

2.2.4 Agente causal

El hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis (anamorfo Paracercospora fijiensis) es el

agente causal de la enfermedad de la raya negra del banano (BLSD, del inglés Banana Leaf

Streak Diseases) o Sigatoka negra, como es conocida comúnmente, la enfermedad foliar

más limitante en la producción de este cultivo (Stover y Simmonds 1987).

El género Mycosphaerella es uno de los más grandes de ascomicetos, que contiene más de

3000 taxa nombrados. La especie Mycosphaerella fijiensis Morelet es la causante de la

Sigatoka negra. Es un hongo heterotálico (Mourichon et al., 1990). Este patógeno durante su

ciclo de vida está caracterizado por dos estados: perfecto (Teleomorfo) e imperfecto

(anamorfo) (Alexoupoulos y Mims, 1979).

Estado perfecto: (Teleomorfo).



Clase: Ascomycetae.

Subclase: Euascomyceta.

Orden: Pseudospaeriles.

Familia: Mycosphaerellaceae.

Género: Mycosphaerella.

Especie: fijiensis Morelet.

Estado imperfecto: (Anamorfo).

Clase: Deuteromycetae.

Subclase: Hyphomycetae.

Orden: Hyphomycetales.

Familia: Dematiaceae.

Género: Pseudocercospora.

Especie: fijiensis Morelet (Deighton)

Aunque la fase anamorfa de M. fijiensis y M. musae, inicialmente se colocó en el género

Cercospora, se han clasificado como: Paracercospora fijiensis y Pseudocercospora musae

respectivamente (Deighton, 1976,1979; Pons, 1990).

El anamorfo fue originalmente descrito como Paracercospora musae (Zimmerrm) Deighton;

sin embargo, recientemente Crous et al. (2003) secuenciaron el espacio de transcripción

interna (ITS) del rDNA y mostraron que Paracercospora es sinónimo de Pseudocercospora,

por lo tanto Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton es el nombre correcto del

anamorfo de M. fijiensis Morelet.

La fase asexual se presenta en el desarrollo de las primeras lesiones de la enfermedad,

pizca, mancha, en donde se observó la presencia de un número relativamente bajo de

conidiósforos (estructura donde se producen las esporas asexuales llamadas conidios) que

salen de los estomas, principalmente en la superficie inferior de la hoja.



Los conidios son hialinos, cilíndricos, rectos o ligeramente curvos, de seis a nueve septos,

delgados en al ápice y más ancho en la base con una cicatriz en el hilium basal del

conidio(punto de unión entre el conidio y el conidióforo) (Orozco, 1998). Los conidiósforos

pueden emerger directamente del estoma de manera individual o en pequeños grupos o

pueden formar fascículos sobre un estoma irrumpen de color oscuro.

Según Orozco (1998), los conidios miden de 30-132μm de longitud y de 2.5 – 5 μm en la

parte más ancha. Las estructuras se producen en mayor abundancia en la superficie inferior

de las lesiones, pero también pueden ser encontradas en la parte superior.

2.2.5 Sintomatología

Leach, (1964) indicó que los primeros síntomas son numerosos, diminutos puntos pardos

que se desarrollan hasta formar finas rayas de color pardo rojizo de 1.5 mm de largo, visibles

en la superficie superior, se unen y oscurecen progresivamente hasta tornarse negras,

entonces las zonas muertas y negras se secan y adquieren un color más pálido. Las mancha

suelen ser intensas hacia las puntas de las hojas; las hojas afectadas pueden morir en tres o

cuatros semanas y el resultado es una desfoliación muy rápida y severa.

Basado en estas observaciones, Fouré (1985) redefinió los síntomas y propuso seis estados

de desarrollo de la enfermedad en condiciones naturales:

Estado 1a: Marcas despigmentadas en el envés de la hoja.

Estado 1b: Pecas rojo parduzcas en el envés de la hoja.

Estado 2: Pecas rojo parduzcas en el envés y en el haz de la hoja.

Estado 3: Estrías amplias que cambian de rojizas a pardo oscuro.

Estado 4: Estrías amplias pardo oscuras en el envés de la hoja y negras en el haz.

Estado 5: Manchas pardo oscuras a negras con halo clorótico.

Estado 6: Manchas pardo oscuras a negras con centros secos de color gris.



2.2.6 Epifitiología

La Sigatoka negra es una típica enfermedad policíclica, en la que tanto conidios como

ascosporas juegan su papel en la dispersión de la enfermedad. Debido a que

comparativamente con M. musicola, M. fijiensis produce relativamente pocos conidios, las

ascosporas son consideradas más importantes en la dispersión de la enfermedad (Meredith

y Lawrence, 1969; Meredith, 1970; Stover, 1980; Gauhl,1994). Las hojas secas adheridas a

las plantas representan una excelente fuente de inóculo (Gaulh, 1994). Los conidios

aparecen en conidióforos sencillos y se forman en lesiones jóvenes como estrías (estadíos 2

y 3) y en el primer estadío de mancha (estadío 4, según la escala de Fouré). Se producen

más abundantemente durante períodos de alta humedad, sobre todo si una película de agua

libre está presente en la hoja (Marín et al., 2003).

Los conidios no son desprendidos por el viento, se dispersan por medio del salpique de la

lluvia y el escurrimiento del agua por la superficie de las hojas. Por lo anterior, los conidios

son asociados principalmente con infecciones a corta distancia, entre hojas de una misma

planta, de la planta madre a los hijos y entre plantas cercanas. No obstante, los conidios

pueden jugar un rol muy importante en la prevalencia de la enfermedad durante períodos de

baja precipitación, en los que se forma abundante rocío en horas de la madrugada y las

primeras horas de la mañana. Hasta ahora no ha sido posible establecer diferencias entre

los síntomas de infecciones causadas por conidios o ascosporas. Definitivamente las

ascosporas son la principal forma de dispersión a distancias mayores, por efecto del viento y

son las responsables de la introducción paulatina de la enfermedad en nuevas áreas, sobre

todo, durante períodos de alta precipitación. Las ascosporas se producen en cuerpos

fructíferos denominados pseudotecios, en lesiones maduras, generalmente en las hojas más

viejas Los pseudotecios se forman en el haz y en el envés de las hojas (Meredith y

Lawrence, 1969). Para la liberación de las ascosporas se requiere de suficiente agua de

lluvia o rocío como para humedecer bien el pseudotecio (Guzman, 2003).



Los factores climáticos como temperatura y humedad (básicamente el número de horas que

la superficie de la hoja permanece humedecida) son factores principales en la velocidad de

evolución de la enfermedad (Pérez y Mauri, 1992; Pérez et al., 1993; Porras y Pérez, 1997).

Dichos factores climáticos, unido a las precipitaciones condicionan la incidencia y severidad

de la enfermedad (Fouré, 1994 y Gauhl, 1994).

La temperatura y la humedad relativa, según Jácome y Wschuh, (1992) durante un estudio

realizado, favorecieron el desarrollo de la enfermedad, ya que temperaturas entre 20-35 0c

contribuyen a la germinación de conidios y ascosporas de los hongos, ocurriendo máxima

germinación si existe un rango de temperatura entre 25-28 0c y una alta humedad relativa,

especialmente cuando hay presencia de la película húmeda sobre la hoja, como se expresó

anteriormente.

Con relación a las temperaturas, Pérez, (1996) estimó que las ascosporas de M. fijiensis

germinan en un rango amplio entre 10-38 0c, considerándose óptimo 27 0c, observándose

que la velocidad relativa del crecimiento de los tubos germinativos de esta se deprimen

fuertemente a temperaturas menores de 20 0c.

Con respecto al viento, se ha observado que la concentración de las conidiósforos en las

plantaciones es alta en las capas inferiores del aire, en comparación con el follaje, mientras

que las ascosporas en el aire es la misma en ambas alturas, lo cual indica su importancia en

el ciclo de la enfermedad (Stover, 1984).

Las esporas de M. fijiensis la son dispersadas por el viento y depositadas en las hojas mas

jóvenes de la planta (Douglas y Ronald, 1992). Las esporas depositadas germinan, si las

condiciones de humedad son buenas, emitiendo un tubo germinativo que penetra por los

estomas de las hojas, para luego ramificarse y colonizar varias células vecinas, produciendo

el síntoma característico de pizca y posteriormente la mancha necrosis.



La lluvia posee un papel muy importante en la liberación del inóculo, la precipitación provee

condiciones de humedad que favorecen el desarrollo de las infecciones, permitiendo

establecer una época relativa baja y otra de alta incidencia.

La humedad relativa es importante en proveer las condiciones hídricas de las esporas y el

desarrollo de las infecciones, y el viento es el factor que permite la dispersión de las esporas

del patógeno, una vez que estas han sido liberadas (Douglas y Ronald, 1992).

La distribución de este patógeno está determinada también por la altitud (Mouliom-Pefoura,

1995). La Sigatoka negra puede afectar al cultivo desde el nivel del mar hasta los 1940m de

altitud (Belalcázar et al., 1994). M fijiensis ha reemplazado a M. musicola en altitudes altas

en Costa Rica sugiriendo que M. fijiensis se puede adaptar al medioambiente (Gauhl et al.,

2000).

2.2.7 Ciclo de la enfermedad

Germinación y penetración estomática

Los tubos germinativos de las ascosporas y conidios penetran a través del estoma después

de 48-72 horas con temperaturas superiores a 20°C (Stover, 1980; Fouré y Moreau, 1992).

Después de la penetración de la hifa, estas colonizan las células adyacentes por un tiempo

aproximado de siete días sin evidencia de destrucción de las mismas. Una vez que la

infección está establecida, una o más hifas vegetativas emergen desde los estomas que

están en el envés de las hojas. Estas hifas epifíticas se desarrollan a través de la superficie

de la hoja paralela a las venas con una distancia de tres milímetros adyacente a la infección

estomática (Stover, 1980; Gauhl,1989). Pueden formar una compleja red de hifas y a varios

intervalos se desarrollan ramificaciones sobre el estoma (Meredith y Lawrence, 1969). El

crecimiento epifítico del hongo para colonizar el tejido adyacente de la hoja provoca un

desarrollo rápido de los síntomas (Gaulh, 1994 y Stover, 1980).



Desarrollo de las lesiones.

Luego de la penetración, el micelio epífito puede infectar otros estomas cercanos y conduce

a reacciones similares. Este fenómeno acelera la tasa de colonización así como la expansión

de las lesiones. Cuando el inóculo es muy concentrado se observan grandes áreas de tejido

necrótico que coalescen rápidamente. Algo similar sucede, cuando las condiciones

ambientales son favorables (Stover, 1980; Gaulh, 1994).

Período de incubación.

El período de incubación es el tiempo entre la infección y la aparición de los primeros

síntomas sobre la hoja. Los resultados de algunas pruebas de campo han indicado que este

varía según la susceptibilidad de los cultivares (Meredith y Lawrence, 1970; Firman 1972;

Fouré, 1991), de las condiciones del tiempo y de la intensidad de la infección (Meredith y

Lawrence, 1970).También se ha definido por el número de días desde el momento de la

inoculación hasta la aparición de los primeros síntomas en inoculaciones artificiales (Molina y

Castaño, 2003).

En condiciones de campo, el período de incubación de plantas provenientes del cultivo in

vitro es de tres a cinco meses (Pasberg-Gauhl, 1993; Mobambo et al.,1997). Sin embargo,

en condiciones de inoculación artificial el período de incubación inferior encontrado ha sido

de cuatro días (Romero y Sutton, 1997a).

Período de latencia.

Es el período entre la infección y la aparición de manchas maduras con presencia de

pseudotecios maduros y ascosporas, depende de la susceptibilidad del cultivar, intensidad

de la infección y las condiciones medio ambientales. Este término también se define como

Tiempo de desarrollo de la enfermedad (Fouré et al., 1984, Gauhl, 1994, Marín et al., 2003).



Molina y Castaño (2003) realizaron inoculaciones artificiales con suspensiones conidiales y

definieron este término como el número de días entre el momento de la inoculación y la

aparición de las manchas necróticas (maduras) en la hoja.

Período de evolución de los síntomas, Período de transición o tiempo de evolución de

los síntomas.

Es el número de días entre la aparición de los primeros síntomas y la aparición de manchas

maduras con centros secos. Este varía con la susceptibilidad del cultivar y las condiciones

ambientales (Gauhl et al., 2000). También se ha definido como la duración en días de la

evolución de los síntomas desde el estado 1 al 6 propuestos por Fouré (1985) (Hernández y

Pérez, 2001).

2.2.8 Manejo de la enfermedad

El manejo de la Sigatoka negra en plantaciones comerciales de bananos en el mundo es

altamente dependiente del uso de fungicidas, los cuales son apoyados con prácticas de

cultivos (deshoje, deshije, drenaje, control de maleza y nutrición) para reducir fuentes de

inóculos y evitar condiciones favorables para el desarrollo del patógeno (Douglas y Ronald,

1992, Orozco-Santos et al., 2001).

El uso de fungicidas para la protección contra la enfermedad recibe una atención importante,

porque en áreas con una adecuada pluviometría para la producción bananera de clones

susceptibles las medidas no químicas no permiten alcanzar un control satisfactorio de la

enfermedad (Perez, 2006).

El control químico y la selección de plantas resistentes continúan siendo las únicas

estrategias, por excelencia, para combatir la sigatoka negra según Riveros y Lepoivre

(1998). Para los pequeños agricultores, los clones resistentes o tolerantes serían las



medidas de control mejor adaptadas a su formación técnica y al contexto socio económico

de este cultivo.

Sin embargo, hoy en día el combate químico es la alternativa más usada para hacerle frente.

Esta opción trae problemas colaterales, como es el caso de contaminación ambiental, salud

humana y resistencia del hongo causal a los fungicidas (Orozco, 1998).

A escala mundial el control químico de la sigatoka negra, se considera de alto riesgo por los

problemas de resistencia del hongo a algunos grupos de fungicidas. Existen numerosos

reportes sobre las pérdidas de sensibilidad de Mycosphaerella fijiensi a los fungicidas

benzimidazoles Romero y Sutton, 1998; Stover, 1979 y más recientemente a los triazoles

Castro et al, 1995; Romero y Marín, 1990; Romero y Sutton, 1997).

En México hasta 1995, según Orozcos- Santos, (1998), el combate químico de la

enfermedad se realizaba mediante el uso de fungicidas de acción sistémica del grupo de las

triazoles (tebuconazole, propeconazol, bitertanol y hexaconazol), pirimidinas (fenarimol),

benzimidazoles (benomyl, carbendazim y metil-tiafanato), morfolinas (tridemorph).

Recientemente, se ha incorporado el grupo químico de las estrobilurinas (azoxistrobin) y

otros triazoles (fenbuconazole).

La sigatoka negra ha tenido un fuerte impacto en la economía y en la producción de bananos

y plátanos desde su aparición en Cuba. Los costos de protección aumentaron entre tres a

cuatro veces debido al aumento del número de ciclos de fungicidas. El costo total de la

inversión en fungicidas anualmente para la protección de plantaciones Cavendish alcanzó

los dos millones de dólares anuales(Pérez et al., 2003a).

Las mayores pérdidas en el cultivo se originan donde no se realizan controles de malezas,

insectos y nemátodos no se practica la eliminación de hojas secas colgantes, ni la aplicación

de fertilizantes; además problemas con el riego y drenaje, así como una inadecuada

distribución de las plantas en el campo (Martínez et al, 2002).



El uso de clones resistentes es el método más económico y ambientalmente seguro de

manejo de sigatoka negra, y prácticamente el único método de control disponible para

pequeños agricultores en áreas de media y alta pluviometría [Hernández y Pérez, 2001]. Se

han descrito los tipos de interacciones existentes entre Mycosphaerella fijiensis y Musa spp.

[Fouré et al., 1984; Fouré et al., 1990; y Fouré, 1994]. Una de las interacciones más

frecuentemente explotada en los programas de mejora para resistencia a sigatoka negra es

la resistencia parcial utilizada ampliamente en el programa de obtención de híbridos de la

FHIA [Rowe y Richardson, 1975; Rowe y Rosales, 1994]. La resistencia parcial se manifiesta

por el alargamiento de la incubación, de la transición de las lesiones de los estados iniciales

de rayas a manchas y de la formación de cuerpos de reproducción sexual y asexual del

patógeno que permite llegar con más hojas funcionales a la cosecha [Pérez, 1998;

Hernández y Pérez, 2001]. Se han desarrollado y distribuido por la FHIA y el IITA clones

con resistencia parcial aptos para los mercados locales, lo que en algunos casos ha obligado

al cambio de las preferencias gustativas. En Cuba se encuentran en producción más de 12

000 ha de clones tetraploides sintéticos de la FHIA (FHIA 23, FHIA, 18 y FHIA 21) con

resistencia parcial, lo que ha permitido una importante disminución de los costos de

producción [Pérez et al., 2002b].

2.3 Interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis

El comportamiento de los bananos respecto de la Sigatoka negra muestra dos tipos de

interacción:

Interacción compatible

La interacción compatible corresponde a un desarrollo total de la enfermedad que implica

necrosis y esporulación. Dentro de este fenotipo se observa un gradiente. Ciertos bananos



presentan una reacción de sensibilidad a la Sigatoka negra comparable a la del cv. Grande

Naine (AAA, Cavendish). El desarrollo de la enfermedad desde la fase 1 a la necrosis es

rápido. La tasa de esporulación puede alcanzar un nivel alto si las condiciones climáticas son

propicias para un desarrollo rápido de la enfermedad. En el momento de la cosecha, en la

planta tan sólo quedan unas hojas funcionales. Otros bananos presentan una resistencia

parcial que puede ser moderada (Pisang Berlin, Pisang Mas) o muy pronunciada y

comparable, en este caso, a la del cv. Pisang Ceylan (AAB, subgrupo Mysore) o del cv.

Fougamou (ABB, subgrupo Pisang Awak). Cuando la resistencia parcial es pronunciada, el

desarrollo de la enfermedad de la fase 1 a la necrosis es lento y la esporulación es débil. La

planta conserva una importante superficie foliar funcional en el momento de la cosecha. Se

procede actualmente a una caracterización más precisa de los cultivares parcialmente

resistentes, en condiciones controladas, para poder evaluar los diferentes parámetros del

ciclo infeccioso.

Interacción incompatible

Los bananos clasificados en esta categoría muestran una resistencia muy pronunciada

comparable a la de Yangambi km5 (AAA, subgrupo Ibota). Dentro de este fenotipo, el

desarrollo de los síntomas está bloqueado y no hay esporulación sexual o asexual. Un

estudio con el microscopio ha mostrado que las reacciones de defensa del huésped se inicia

justo después de que el hongo penetre en los estomas. El comportamiento de los bananos

clasificados en esta categoría parece muy similar a las reacciones de hipersensibilidad

observadas en otros sistemas huésped-patógeno. Las reacciones de algunas variedades de

banano altamente resistentes inoculadas artificialmente con aislados de M.fijiensis sugieren

la existencia de interacciones específicas. Ya se ha observado la ruptura de este tipo de

resistencia (ejemplo: variedad de banano Paka) en una isla del Pacífico (Ratoronga), lo que



indica que el agente patógeno supera con más facilidad esta resistencia y que, por

consiguiente, no es duradera.

Se estudió la herencia de la resistencia a la Sigatoka negra en el diploide silvestre Calcutta

4, realizando cruces entre éste y unos plátanos triploides susceptibles. En la actualidad se

estudian las descendencias de cruces entre diploides silvestres (AA) para comprender mejor

el modo de herencia de la resistencia a la Sigatoka negra y localizar mediante mapas

genéticos los genes o loci de características cuantitativas implicados en esta resistencia (

Mourichon et al., 1997).

2.4 Estrategias de adquisición de nutrientes de hongos fitopatógenos durante la

infección

Durante la interacción hospedero- patógeno la eficiente nutrición del patógeno es un

prerrequisito para el éxito de la posterior colonización y sobre vivencia exitosa del patógeno.

Los hongos filamentosos tienen una marcada capacidad de adaptarse y explotar los

nutrientes del medioambiente. Para hongos fitopátogenos esta capacidad ha sido

desarrollada dentro del contexto fisiológico y metabólico del hospedero. El entendimiento de

la adquisición de nutrientes y el metabolismo primario del patógeno es de gran importancia

para el desarrollo de nuevas estrategias de control de la enfermedad.

Los hongos fitopatógenos con estilo de vida hemibiotrófico son aquellos que mantienen vivo

a su hospedero por un período de tiempo hasta que se establece dentro del tejido del

hospedero. Solamente después de esta fase, similar a los biotróficos, es que ocurre el

cambio a un estilo de vida necrotrófico (Perfect y Green, 2001).

El proceso de infección por el hongo puede ser separado en tres fases, germinación,

proliferación y esporulación (Solomon et al., 2003). Es generalmente asumido que durante la

germinación de la espora y la fase de penetración los hongos fitopatógenos son

completamente dependientes de sus propias reservas. Los principales componentes de las



esporas fúngicas incluyen glucógenos, trealosa y polyoles tales como manitol y lípidos

(Thevelein, 1984; Thines et al., 2000; Voegele et al., 2005). Estudios de interacción planta-

patógeno posteriores han focalizado el papel de la movilización de ácidos grasos durante el

proceso de penetración (Divon y Fluhr, 2007).

La movilización de las reservas de lípidos ocurre a través de la lipolisis y la β-oxidación para

formar acetil-CoA, el cual es posteriormente asimilado por el ciclo de los ácidos

tricacarboxílicos por la vía del ciclo del glioxilato.

La isocitrato liasa (ICL) es una enzima marcadora de la actividad lipolítica, es inducida en

ausencia de glucosa y cuando el microorganismo crece sobre fuentes de carbono

gluconeogénicas tales como acetato, etanol y glicerol y sobre ácidos grasos (Bowyer et al.,

2000).

Durante el ciclo de infección de Tapesia yallundae en trigo, la actividad del promotor de la

ICL fue detectado predominantemente en el estado de penetración sobre la superficie de la

planta y disminuyó su actividad luego de la penetración del apresorio, indicando un cambio

del metabolismo gluconeogénico a glicolítico en este estado (Bowyer et al., 2000).

En estudios a mutantes con capacidad de virulencia reducida se ha encontrado defectos en

el desarrollo peroxisomal (Kimura et al., 2001) o problemas con las enzimas del ciclo del

gioxalato: isocitrato liasa (Idnurum y Howlett , 2002 ; Wang et al., 2003) y la malato sintasa

(MLS) (Solomon et al., 2004a). Estos hallazgos son evidencia del papel del metabolismo de

los ácidos grasos y del ciclo del glioxilato durante la penetración de la planta por el hongo,

independientemente del estilo de vida. En algunos estudio se demostró la capacidad de la

glucosa para complementar la pérdida de la patogenicidad (Kimura et al., 2001; Idnurum y

Howlett , 2002; Solomon et al., 2004b).

Estos experimentos demostraron el papel crítico que desempeña el metabolismo de los

ácidos grasos para el soporte del ciclo de los ácidos tricarboxílicos a través de la producción



de acetil-CoA con el objetivo de generar ATP dentro de las pobres condiciones nutricionales

que existen en la superficie de la planta (Divon y Fluhr, 2007).

Cuando el hongo hemibiotrófico se encuentra en el interior del hospedero y sus reservas de

nutrientes se encuentran exhaustas, necesita activar mecanismos de movilización que le

permitan una adecuada toma de nutrientes. Se conoce que las invertasas y transportadores

de azúcares tipo hexosas desempeñan un papel primordial en la definición de la hoja como

una fuente o reserva de carbohidratos. La sobre expresión de invertasas extracelulares de

planta en tejidos infectados se ha encontrado como una respuesta común para el estrés

biótico y abiótico sirviendo como una fuente de energía para la defensa de la planta. Se ha

demostrado que esta estrategia de defensa de Arabidopsis thaliana es explotada por el

Erysiphe cichoracearum para asegurar un suplemento rápido de carbohidratos (Fotopoulos

et al., 2003).

De manera similar a la utilización de carbohidratos de la planta por el hongo durante la

infección, la adquisición de nitrógeno puede reportar beneficios para el hongo. El ácido

gamma -aminobutírico (GABA) y el ácido úrico, sintetizados por la planta, tienen función en

la eliminación de las moléculas reactivas de oxígeno (ROS). Durante la interacción

Cladosporium fulvum-tomate, GABA es acumulado en el apoplasto de tomate

concomitantemente con la inducción de la glutamato descarboxilasa de la planta (involucrada

en la síntesis de GABA) y la GABA transaminasa del hongo (Solomon y Oliver, 2002). De

modo similar se indujo la uricasa en un estado no necrotrófico de la interacción de Fusarium

oxysporum con tomate (Divon et al., 2005).

La esporulación completa el ciclo de vida del hongo y ocurre en los organismos

hemibiotróficos en el estado necrotrófico. Estudios in vitro han demostrado que la

esporulación puede ser inducida por el agotamiento de las fuentes de nitrógeno y carbono

(Griffin, 1994). Resultados contradictorios fueron encontrados durante el análisis por

microarreglos del hongo hemibiotrófico Micospharella graminicola durante la fase de



esporulación in planta. En este estudio se demostró que los patrones de expresión génica

tenían mayor similitud a los encontrados durante el crecimiento del hongo in vitro en medios

ricos en nutrientes que a los encontrados en medios empobrecidos (Keon et al., 2005). Esto

sugiere la existencia de un inductor de la esporulación diferente como por ejemplo un

mecanismo similar a un quórum sensibilizado (Divon y Fluhr, 2007).

Un ejemplo que esclarece la dependencia del transporte de nutrientes en un estado tardío

del crecimiento del hongo lo constituye un mutante de Colletotrichum gloesosporidioides con

disfunción de la glicerol 3 fosfato deshidrogenasa. El mutante contiene cantidad reducida de

glicerol y durante el crecimiento heterotrófico exhibió severos defectos en la utilización del

carbono y fallos en la producción de conidios. In planta este mutante fue capaz de

desarrollar un proceso de infección y producción de conidios normal, y en la zona de

infección disminuyeron los niveles de glicerol del tejido indicando su transferencia desde la

planta al hongo (Wei et al., 2004).

2.4.1 Estudios de expresión del gen de la isocitrato liasa en hongos

fitopatógenos.

El ciclo del glioxilato es una variante anaplerótica del ciclo de los ácidos tricarboxilicos en la

cual se convierten dos moléculas de acetil-CoA a succinato para la gluconeogénesis.

Este ciclo comparte tres de las cinco enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y evade

dos etapas de descarboxilación a través de la enzima isocitrato liasa (ICL) que convierte el

isocitrato en glioxilato y succinato (Kornberg y Krebs, 1957, Nelson y Cox, 2005). El ciclo es

completado por la malato sintasa que produce el malato a partir de glioxilato y acetil-CoA.

Este ciclo se conoce que opera en bacterias (Nelson y Cox, 2005), hongos (Lowenstein,

1967), algunos protistas ( Levy y Scherbaum, 1965 ; Nakazawa et al., 2005 ) y plantas

(Kornberg y Beepers, 1957).



La síntesis y la actividad de la enzima ICL son inducidas cuando un organismo toma o

produce energía a partir de sustratos basados en dos carbonos o ácidos grasos, y se

considera un marcador de la actividad lipolítica. La producción y actividad de la enzima son

reprimidas cuando un organismo crece en presencia de glucosa u otros sustratos glicolíticos

(Bowyer et al., 2000). Este proceso es un caso específico de represión catabólica por carbón

y significa que los carbohidratos metabolizables reprimen rápidamente la síntesis de enzimas

relacionadas con el catabolismo de fuentes alternativas de carbón, asegurando el empleo

preferencial de fuentes de carbono más favorables. Esto reporta dos principales beneficios a

la fisiología celular: permite el empleo de fuentes de carbono más favorables y no existen

gastos de energía en la síntesis de otros sistemas catabólicos. La represión puede darse por

varias fuentes de carbono pero la glucosa probablemente sea la más represiva (Ruijter y

Visser, 1997).

La ICL es estrictamente regulada a nivel transcripcional en todos los hongos estudiados y

posee altos niveles de expresión durante el crecimiento en sustratos de dos carbonos, así

como no fue observada su expresión en el crecimiento en glucosa. El promotor es reprimido

durante la glicolisis y el metabolismo normal del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Bowyer et

al., 2000).

Se ha descrito en varios trabajos la importancia de la isociatrato liasa en la patogenesidad de

hongos de plantas. Investigaciones realizadas con un transgen de la GFP fusionado a al

promotor de la ICL de Neurospora crassa, expresado en Tapesia vallundae, un patógeno del

trigo, se demostró que la construcción fue pobremente expresada in vitro y especialmente

activado durante el proceso de infección de la planta (Bowyer et al., 2000).

Por otra parte, se comprobó que el metabolismo intracelular de los lípidos de reserva son de

gran importancia para la formación del apresorio en Magnaporthe grisea (Thineset et al.,

2000).



En un estudio por inserción de mutagénesis se aisló un mutante avirulento de Leptosphaeria

maculans, un patógeno fúngico de Brassica napus (canola), en el cuál se encontró

disfunción de la isocitrato liasa (Idnurm y Howlett, 2002).

El empleo del inhibidor de la ICL, el halisulfato 1, durante la interacción Magnaporthe grisea-

arroz redujo la formación del apresorio y la infección de las plantas (Shin et al., 2007).

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Biotecnología

de las plantas en el período comprendido de enero del 2007 a febrero del 2008.

Procedimientos generales

Aislado de M. fijiensis

Se utilizó el aislado CCIBP-Pf-83 de Mycosphaerella fijiensis Morelet del Laboratorio de

Fitopatología del Instituto de Biotecnología de las Plantas, caracterizado como altamente

virulento (Cruz et al., 2004).

Preparación de suspensiones miceliales

Para todos los ensayos donde se utilizaron suspensiones miceliales como inóculo inicial,

estas se prepararon siguiendo el protocolo que se describe a continuación:

Un fragmento de micelio del aislado, procedente de tubos de ensayo con medio de cultivo

Agar Papa y Dextrosa, conservados a 4 ºC, se inoculó en erlenmeyers (250 ml de capacidad)

con 100 ml de medio de cultivo Caldo Papa y Dextrosa(Duchefa Biochemie B.V., Holanda)..

El mismo se colocó a temperatura ambiente, en zaranda a 120 rpm durante 14 días.

Transcurrido este período de tiempo se eliminó el medio de cultivo por decantación. Se tomó

1 g de micelio y se homogenizó con 30 ml de agua desionizada estéril en un tubo FALCON

(45 ml de capacidad) mediante un agitador Ultra-turrax T25(Rose Scientific Ltd., Canada) por

un minuto. Luego se filtró con tamiz metálico de 40 µm. La concentración de fragmentos de

micelio se determinó en cámara de Neubauer por observación al microscopio óptico

Olympus (aumento 100x) (Rose Scientific Ltd., Canada) y se ajustó a una concentración en

el orden de aproximadamente 105 fragmentos de micelio.ml-1 con agua desionizada estéril.



Medios de cultivo de M. fijiensis

Se utilizaron los medios de cultivo líquido: Caldo Papa y Dextrosa (Duchefa, Biochemie B.V.,

Holanda), pH 5.6±0.2), Medio Mínimo (KH2PO4 1 g.l-1, MgSO4 7H2O 0.5 g.l-1, KCL 0.5 g.l-1,

FeSO4 7H2O 10 mg.l-1, NaNO3 2 g.l-1, fuente de carbono 1%, solución de elementos traza

0.2ml.l-1, pH 5.6±0.2).

Solución de elementos traza.

Na 2MoO4 2 H2O 50 mg

CuSO4 5H2O 0.25 g

Mn SO4 H2O 50 mg

H3PO3 50 mg

Zn SO4 7H2O 5 g

Fe(NH4)2 (SO4)2 6 H2O 1 g

Acido cítrico 5 g

H2O completar 95 ml

Además, se emplearon los medios de cultivo sólido: Medio Mínimo, Agar V-8 modificado

(Mourichon et al., 1987), ambos solidificados con 20 g.l-1 de agar granulado (Difco

Laboratories, Detroit, MI, U.S.A.), Agar Papa y Dextrosa ( Duchefa, Holanda).

Cepa de Escherichia coli y plasmidio

E. coli XL1-Blue: recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17(rk-, mk+), supE44, relA1, lac, [F´,

proAB+, laclqZΔM 15, ::Tn10(Tetr)].

Se utilizó el plasmidio pJET1/blunt (3128 pb) (Fermentas,GmbH, Alemania), (figura 1).



Figura 1. Mapa circular del plasmidio pJET1/blunt (Fermentas,GmbH, Alemania) y puntos de

referencia en la secuencia.

Medios de cultivo de E. coli.

Se utilizaron los medios de cultivo: Luria-Bertani (LB) sólido: triptona 10 g.l-1, extracto de

levadura 5 g.l-1, NaCl 10 g.l-1, y agar 15 g.l-1 y Luria-Bertani líquido: triptona 10 g.l-1, extracto

de levadura 5 g.l-1, NaCl 10 g.l-1.

LBA: Medio LB suplementado con ampicillina (100 mg.ml-1).

Preparación de soluciones y utensilios libre de ARNasas.

Se añadió dietil pirocarbonato (DEPC) (Sigma, USA) al agua destilada a una concentración

de 0.1% y se mantuvo con agitación durante una hora. Luego se calentó con agitación

durante cuatro h para eliminar el DEPC y seguidamente se esterilizó a una atmósfera

durante una hora (Sambrook y Russell, 2001). Esta agua se utilizó en la preparación de

todas las soluciones necesarias en el trabajo con ARN.



Los utensilios como morteros, espátulas y pinzas fueron mantenidos en agua tratada con

DEPC (Sigma, USA) durante toda la noche y posteriormente esterilizados en la estufa a 180

°C durante dos horas.

3.1 Aislamiento y clonaje del gen de la isocitrato liasa de Mycosphaerella fijiensis

Morelet

Este experimento se realizó con objetivo aislar y secuenciar el gen de la isocitrato liasa de

M.fijiensis, a partir del aislado CCIBP-Pf-83, empleando oligonucléotidos degenerados.

Preparación de muestras de micelio

Se inocularon 3.5 ml de una suspensión micelial (descrito en Preparación de

suspensiones miceliales) en erlenmeyers (250 ml de capacidad) con 100 ml de medio de

cultivo líquido Caldo Papa y Dextrosa (Duchefa Biochemie B.V., Holanda). Los mismos

fueron colocados a 26 ºC, en zaranda orbital termostatada a 120 rpm durante 14 días.

Transcurrido este periodo de tiempo se eliminó el medio de cultivo por filtración con filtros

de papel (Whatman de 125mm Ø). Seguidamente se repartieron a razón de 5 gramos en

frascos de vidrio de 10 ml, se taparon de forma no hermética y se sumergieron en

nitrógeno líquido durante 5 min. Posteriormente se colocaron en la liofilizadora (Martin

Christ GmbH, Modelo Alpha 1-2 LD plus, Alemania) (Christ, Modelo Alpha 1-2 LD plus) y

fueron liofilizados a -50 ºC con una presión de vacío de 1,5 mbar durante 24 h. Las

muestras se sellaron con un material flexible (Parafilm) y se conservaron a 4 ºC.

Extracción de ADN de M. fijiensis

Para la extracción de ADN se utilizó el Sistema de Purificación DNeasy Plant Mini (Qiagen,

Alemania) según indicaciones del fabricante y se partió 20 mg de micelio liofilizado. Se

determinó la concentración y pureza del ADN total por el método de espectrofotometría con



la ayuda de un biofotómetro (Eppendorf Biophotometer, Alemania). La concentración de

ácidos nucleicos se precisó midiendo a 260 nm y comparando con un blanco (agua en

nuestro caso). La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un

«cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280

para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN

puros son aproximadamente de 1.8 y 2.0. El ADN purificado se chequeó por electroforesis en

gel de agarosa al 0.8% en tampón TBE 1X (890 mM Tris-borato, 890 mM ácido bórico y 20

mM EDTA).

Diseño de oligonucleótidos

Para aislar el gen de la isocitrato liasa (icl) de M.fijiensis se diseñaron oligonucleótidos

degenerados. Se utilizó el programa CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) (Thompson

et al., 1994) para la comparación de secuencias ortólogas del gen de la icl reportadas en

bases de datos internacionales. Las secuencias utilizadas fueron de Mycosphaerella

graminícola (GenBank Acc: AW180916, AW179981), Neurospora crassa (GenBank Acc:

CAE76404, AL451022), Aspergillus fumigatus (GenBank Acc: XN 746387), Aspergillus

nidulans (GenBank Acc: X62696) Magnaporte grisea (GenBank Acc:, XM 359882),

Penicillium marneffei (GenBank Acc: AF373918).

Los oligos diseñados ICL D e ICL R fueron sintetizados por la compañía (Invitrogen, USA).

Adicionalmente se empleó el software Vector NTI Advance 9 (Invitrogen, USA) para la

manipulación de las secuencias de ADN, así como para el diseño de los oligonucleótidos.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain

Reaction ) utilizando la enzima Taq ADN Polimerasa (Fermentas, GmbH, Alemania) y 160

ng de ADN total, para la amplificación de un fragmento del gen de la icl con los



oligonucleótidos previamente diseñados. La reacción se llevo a cabo en el termociclador

Mastercycler personal (Eppendorf, Alemania). Las condiciones de la reacción fueron las

siguientes: 1 ciclo a 94 °C por 5 min, 31 ciclos a 94 °C por 45 min, 56 °C por 1 min, 72 °C

por 90 s, seguido de 10 min a 72 °C. El producto de la amplificación por PCR fue visualizado,

mediante una tinción con bromuro de etidio, sobre un gel de agarosa 1% en tampón TBE

1X..

Clonaje del gen de la isocitrato liasa

El fragmento amplificado por PCR fue corrido en un gel preparativo de agarosa al 1%. Se

escindió la banda correspondiente, para su posterior purificación mediante el sistema

MinEluteTM Gel Extraction (Qiagen, Alemania) siguiendo las indicaciones del fabricante.

Para la realización del clonaje del fragmento de interés amplificado, se utilizó el sistema

comercial GeneJETTM PCR Cloning (Fermentas GmbH, Alemania), específicamente

siguiendo el protocolo para productos de PCR generados con extremos romo.

Por otro lado se prepararon células competentes de la cepa E. coli XL1-Blue siguiendo las

instrucciones del sistema TransformAidTM Bacterial Transformation (Fermentas GmbH,

Alemania).

El producto de cada ligazón se transformó en 50 µl de las células competentes previamente

obtenidas. Las colonias recombinantes se seleccionaron sobre medio selectivo LBA.

Chequeo por digestión enzimática de los clones recombinantes

Para la purificación del ADN a escala minipreparativa se inocularon colonias individuales en

tubos de precultivo conteniendo 3 ml de medio LBA líquido. Se incubaron a 37 ºC con

agitación durante 16 h aproximadamente y se centrifugó 1.5 ml del cultivo de células a 5 900

g durante 3 min. El precipitado se resuspendió en 100 µl de solución de resuspensión (50

mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA y 400 µg.ml-1 ARNasa A). Posteriormente, se adicionaron



300 µl de solución de lisis celular (200 mM NaOH; 1% SDS), se mezcló suavemente por

inversión del tubo y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Transcurrido este

tiempo se añadieron 300 µl de solución de neutralización (2.55 mM acetato de potasio pH

4.8), se mezcló de igual forma y se centrifugó a 13 400 g durante 15 min. Se tomó

cuidadosamente el sobrenadante y se añadió igual volumen de fenol-cloroformo, se aplicó

vortex y se centrifugó a 13 400 g durante 5 min. El ADN se precipitó por adición de 630 µl

de isopropanol e incubación a -20 ºC durante 20 min, seguido de un paso de centrifugación a

13 400 g durante 15 min. El precipitado se lavó con etanol al 70% para eliminar las sales y

se secó al vacío, las muestras se resuspendieron en 30 µl de agua destilada. Los ADN

purificados se chequearon por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% en tampón TBE 1X..

Para la digestión enzimática se utilizó como material de partida ADN plasmídico a una

concentración final entre 60 y 100 ng. µl-1. Las reacciones se realizaron en un volumen final

20 µl a 37 ºC durante 2 horas. Se utilizó la enzima de restricción BglII (Promega, USA) a

razón de 5 U. µg-1 de ADN. La digestión se chequeó por electroforesis en gel de agarosa al

0.8% en tampón TBE 1X.

Secuenciación de los clones recombinantes

Para la purificación de los ADN plasmídicos que iban a ser enviados a secuenciación, se

utilizó el sistema comercial Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega,

USA) según las recomendaciones del fabricante.

Los ADN plasmídicos se secuenciaron en las facilidades disponibles de la compañía

Macrogen (Corea del Sur), mediante el uso de un secuenciador automático ABI 3730xl

(Applied Biosystems, USA). Se empleó el método de secuenciación por extensión de

oligonucleótidos (Sambrook y Russell, 2001). Los oligonucleótidos utilizados fueron:

pJET1 Forward 5´-GCCTGAACACCATATCCATCC- 3´

pJET1 Reverse 5´-GCAGCTGAGAATATTGTAGGAGATC- 3´



Genoma de M. fijiensis

El genoma de M. fijiensis se obtuvo del DOE Joint Institute (htt://www.jgi.doe.gov) y se

generó una base de datos local conteniendo el proteoma y el transcriptoma de este

organismo. Un total de 10037 secuencias fueron almacenadas en cada caso. Esta base se

datos se utilizó para realizar búsquedas de homología contra las secuencias generadas en el

laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Biotecnología de las Plantas.

Análisis de secuencias

Las secuencias obtenidas, un total de nueve clones, fueron agrupadas mediante el algoritmo

Cap3 (Huang y Madan, 1999) para la eliminación de secuencias redundantes y/o empalme

de las mismas.

Se realizó una búsqueda de homología mediante el algoritmo BLASTN (Altschul et al.,

1997), de cada agrupamiento resultante contra el transcriptoma de M. fijiensis.

Adicionalmente empleó el software Vector NTI Advance 9 (Invitrogen, USA) para la

manipulación de las secuencias de ADN.

3.2 Crecimiento de M. fijiensis en diferentes fuentes de carbono


en agitación

Con el objetivo de evaluar el crecimiento en medios de cultivo líquido de M .fijiensis en

diferentes fuentes carbonadas se utilizaron en este ensayo los medios de cultivo: Medio

Mínimo sin fuente carbonada, Medio Mínimo con glucosa al 1%, Medio Mínimo con sacarosa

al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al 1%, Medio Mínimo con

acetato de potasio al 1% y Caldo Papa y Dextrosa (Duchefa Biochemie B.V., Holanda) como



control para el crecimiento del patógeno. Se consideró cada medio de cultivo un tratamiento

y se emplearon 5 réplicas.

Se inocularon 3.5 ml de una suspensión micelial (105 fragmentos de micelio.ml-1) (preparada

como se describió previamente en procedimientos generales) en erlenmeyers (250 ml de

capacidad) con 100 ml de medios de cultivo.

Los mismos fueron incubados en zaranda orbital termostatada (Gerhardt, Alemania) a 120

rpm en la oscuridad, y a una temperatura de 26 ºC durante 28 días.

Se determinó la masa seca del micelio a los siete, 14, 21 y 28 días de crecimiento en los

diferentes medios de cultivo. Para ello, el micelio se separó del medio de cultivo mediante

filtración (papel de filtro Whatman de 125mm Ø). Luego se desecó en estufa a 60 ºC hasta

mantener un peso constante en balanza analítica. Además, se describieron las

características culturales del crecimiento micelial tales como: color del micelio, consistencia y

presencia de pigmentación o no en el medio de cultivo.

Los datos de la variable masa seca se analizaron por medio del paquete estadístico

Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 15.0 para Windows. En todos los casos

se comprobó si las variables estudiadas se ajustaban a una distribución normal mediante la

prueba de Kolmogorov-Smirnov. Debido a la no normalidad de los datos los mismos se

analizaron por medio de un ANOVA no paramétrico de clasificación simple Kluskal-Wallis

(p<0.05) para detectar diferencias significativas entre los rangos medios de los tratamientos

ensayados. Para obtener una matriz pareada de diferencias significativas entre tratamientos,

se realizo el test Mann- Whitney.



3.2.2 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de M. fijiensis en medio sólido.

Este ensayo se realizó con el objetivo de evaluar el crecimiento en medios de cultivo sólido

de M. fijiensis y describir las características culturales del patógeno en diferentes fuentes de

carbono.

Se utilizaron los medios de cultivo siguientes: Medio Mínimo con glucosa al 1%, Medio

Mínimo con sacarosa al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al

1% y Agar Papa y Dextrosa (Duchefa Biochemie B.V., Holanda) como control para el

crecimiento del patógeno. Se emplearon estos medios de cultivo, teniendo en cuenta los

resultados obtenidos en el ensayo de crecimiento de M. fijiensis en medio líquido en

agitación (acápite 3.1).

En cada tratamiento se utilizaron cinco placas Petri (90 mm Ø) que contenían 15 ml de los

medios de cultivo. Se estriaron 50 µl de una suspensión micelial (5.102 fragmentos de

micelio.ml-1) para obtener colonias aisladas. Las placas Petri se incubaron en condiciones

estáticas, en oscuridad y a 28 ºC durante 14 días.

Posteriormente se midió el diámetro de 100 colonias para cada tratamiento en el microscopio

estereoscópico con la escala milimetrada. Además, se determinó por observación visual las

características culturales del crecimiento: color del micelio, textura, consistencia, color del

reverso de la colonia, capacidad de pigmentar o no el medio y presencia de líquido

transpirado.

Los datos de diámetro de las colonias se analizaron por medio del paquete estadístico

Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 15.0 para Windows. En todos los casos

se comprobó si las variables estudiadas se ajustaban a una distribución normal mediante la

prueba de Kolmogorov-Smirnov. Debido a la no normalidad de los datos los mismos se

analizaron por medio de un ANOVA no paramétrico de clasificación simple Kluskal-Wallis

(p<0.05) para detectar diferencias significativas entre los rangos medios de los tratamientos



ensayados. Para obtener una matriz pareada de diferencias significativas entre tratamientos,

se realizo el test Mann-Whitney.

3.2.3 Producción in vitro de conidios de M .fijiensis en diferentes fuentes de carbono.

Con el objetivo de determinar la producción de conidios de M. fijiensis en medios de cultivo

con diferentes fuentes de carbono se realizó este experimento.

Se utilizaron los medios de cultivo siguientes: Medio Mínimo con glucosa al 1%, Medio

Mínimo con sacarosa al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al

1%, Agar Papa y Dextrosa (Duchefa Biochemie B.V., Holanda) como control para el

crecimiento del patógeno y Agar V-8 modificado como control para la producción de conidios

según se recomienda en la literatura consultada.

En cada tratamiento, cinco tubos de ensayo (150 x 22 mm) con 15 ml de medio de cultivo

inclinado, se inocularon con 300 µl de una suspensión micelial (105 fragmentos de micelio.ml-

1). Estos se incubaron a 20 ºC en cámara climatizada (Weiss Gallenkamp, UK) con luz

fluorescente blanca fría continua de 60 µmoles.m-2.s-1 durante 14 días, según lo descrito por

Carlier et al. (2002). Transcurrido ese tiempo a cada tubo de ensayo se le adicionaron 5 ml

de agua desionizada estéril más Tween 80 al 0.05%. Estos se removieron en agitador vortex

(Heidolph Top Mix 94 323, Alemania) para obtener una suspensión de conidios y

cuantificarlos.

Las evaluaciones se realizaron a los 14 días. En cada uno de los tratamientos se realizaron

50 determinaciones de la concentración de conidios en cámara de Neubauer por

observación al microscopio óptico (aumento 100x) ( Olympus, Japón).

Los datos de la variable producción de conidios se analizaron por medio del paquete

estadístico SPSS versión 15.0 para Windows. En todos los casos se comprobó si las

variables estudiadas se ajustaban a una distribución normal mediante la prueba de

Kolmogorov-Smirnov. Debido a la no normalidad de los datos los mismos se analizaron por



medio de un ANOVA no paramétrico de clasificación simple Kluskal-Wallis (p<0.05) para

detectar diferencias significativas entre los rangos medios de los tratamientos ensayados.

Para obtener una matriz pareada de diferencias significativas entre tratamientos, se realizo el

test Mann-Whitney.

3.3 Estudio de la expresión del gen de la icl de M. fijiensis en medios de cultivo con

diferentes fuentes de carbono

Este experimento tuvo como objetivo determinar la expresión del gen de la icl de M. fijiensis

en micelio cultivado en medios de cultivo líquido en presencia de diferentes fuentes de

carbono.

Preparación de muestras de micelio de M. fijiensis en medios de cultivo líquido con

diferentes fuentes de carbono.

En este ensayo se creció el patógeno en los mismos medios de cultivo del experimento de

crecimiento en medios líquidos (acápite 3.2.2) excepto el Medio Mínimo sin fuentes de

carbono: Medio Mínimo con glucosa al 1%, Medio Mínimo con sacarosa al 1%, Medio

Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al 1% y Caldo Papa y Dextrosa

(Duchefa Biochemie B.V., Holanda) como control para el crecimiento del patógeno.

Se inocularon 3.5 ml de una suspensión micelial (105 fragmentos de micelio.ml-1) (preparada

como se describió previamente en procedimientos generales) en erlenmeyers (250 ml de

capacidad) con 100 ml de medios de cultivo.

Los mismos fueron incubados en zaranda orbital termostatada (Gerhardt, Alemania) a 120

rpm en la oscuridad, y a una temperatura de 26 ºC durante 28 días.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el crecimiento del patógeno en medios de

cultivo líquido (descrito en el acápite 3.2.1) se determinó realizar la toma de muestra a los 7



y 21 días. Transcurrido este período de tiempo se filtraron y liofilizaron las muestras

siguiendo el procedimiento descrito en el acápite 3.1.

Extracción de ARN total

Para la purificación de ARN a partir fragmentos de micelio liofilizado, se utilizó el sistema

comercial RNAeasy® Plant Mini (Qiagen, Alemania).

Se maceraron 100 mg de micelio liofilizado en nitrógeno líquido y se decantó hacia un tubo

de 2 ml hasta que el nitrógeno líquido se evaporó. Se adicionó 450 µl de tampón RLC

(solución comercial) y se dió vortex vigorosamente. Se incubó a 56 ºC durante 3 min. El

lisado se transfirió directamente en la columna comercial QIAshredder y se centrifugó a 15

700 g durante 2 min. El sobrenadante se colocó en un nuevo tubo de 2 ml donde se

adicionaron 225 µl de etanol (96-100 %) y se mezcló con la pipeta.

El contenido fue transferido a la columna comercial RNAeasy y se centrifugó a 9 300 g

durante 15 s. Para lavar la columna se adicionó 700 µl del tampón comercial RW1 y se

centrifugó a 9 300 g durante 15 s. Se transfirió la columna RNAeasy a un nuevo tubo de

colección donde se adicionaron 500 µl de tampón comercial RPE y se centrifugó a 9 300 g

durante 15 s. Para la elusión se adicionaron 50 µl de agua libre de ARNasas y se centrifugó

a 9 300 g durante 1 min. Todas las manipulaciones se realizaron a temperatura ambiente.

Tratamiento con ADNasa.

En todos los casos las muestras de ARN total fueron tratadas rigurosamente con ADNasa

usando el sistema TURBO DNAfree ™ (Ambion, USA) de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. A modo de control de la eficacia del tratamiento se realizaron reacciones de PCR

con cada una de las muestras empleando los oligos ICL D e ICL R y se colocó un control

positivo consistiendo en ADN de M. fijiensis aislado en el acápite 3,1



Reacción de reverso transcripción (RT)-PCR

Para estudiar la expresión del gen de la icl en medios de cultivo con diferentes fuentes de

carbono se diseñaron dos oligonucleótidos específicos (ICL MiD e ICL MiR) a la secuencia

del gen del aislado y secuenciado en el acápite 3.1. Se empleó el programa Primer 3 versión

0.4 (Rozen y Skaletsky, 2000) disponible en http://frodo.wi.mit.edu.

La amplificación del fragmento de la ICL a partir del ARN extraído, se realizó con el sistema

comercial Access RT-PCR System (Promega, USA).

Se tomó 1 μg de cada muestra de ARN total y se pre-incubó 10 min en un baño termostatado

a 70 ºC con el objetivo de eliminar las posibles estructuras secundarias presentes en las

muestras, las cuales fueron colocadas en hielo hasta su posterior uso. Las reacciones se

llevaron a cabo en un volumen final de 50 µl, en las siguientes condiciones para las

concentraciones finales de sus componentes: 1 mM MgSO4, 1X del tampón comercial

AMV/Tfl (10 mM Tris-HCl pH 9.0 a 25 ºC, 50 mM KCL 0.1 % Tritón X-100), 0.2 mM de cada

dNTP, 1 μM de cada oligonucleotido ICL MfiD e ICL MfiR, 5 U de reverso transcriptasa del

Virus de la Mieloblastosis Avícola y 5 U de Tfl ADN polimerasa.

Las reacciones se llevaron acabo en un termociclador Mastercycler personal (Eppendorf,

Alemania). Las condiciones para la realización de las reacciones fueron de 48 ºC durante 45

min, seguido por un ciclo a 96 ºC durante 1 min y 35 ciclos a 95 ºC durante 90 s

(desnaturalización), 56 ºC durante 1 min (hibridación) y 72 ºC durante 1 min (extensión) y

para finalizar 72 ºC durante 7 min. El resultado de la reacción se chequeó por electroforesis

en gel de agarosa al 1% en tampón TBE 1X.

RReessuullttaaddooss yy DDiissccuussiióónn



4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Aislamiento y clonaje del gen de la isocitrato liasa de Mycosphaerella fijiensis

Morelet

El sistema de purificación DNesasy Plant Mini (Qiagen) empleado para la purificación

permitió obtener un rendimiento aproximado de 200 ng de ADN por mg del micelio

liofilizado.

El cociente calculado a partir de las lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm de la muestra,

mostró un valor de 1.8, cómo índice de pureza. La corrida electroforética confirmó la

integridad del ácido nucleico aislado.

La alineación de secuencias correspondientes a ICL de las secuencias de Mycosphaerella

graminícola, Neurospora crassa ,Aspergillus fumigatus Aspergillus nidulans, Magnaporte

grises y Penicillium marneffei, permitió encontrar regiones conservadas en los extremos del

gen, a partir de las cuales se diseñaron los oligonucleótidos degenerados ICL D e ICL R de

23 mer cada uno (Figura 2).

Figura 2. Alineación de secuencias conservadas de genes ortólgos de la ICL y

oligonucleótidos diseñados.

La reacción en cadena de la polimerasa empleando los oligonuceótidos degenerados

amplificó tres bandas con una longitud aproximada de 1000, 1500 y 2300 pb (Figura 3). El



producto esperado para el gen de la ICL amplificado por PCR es de 1561 pb, las otras dos

bandas obtenidas pudieran considerarse productos de amplificaciones inespecíficas como

resultado de las características de los oligonucleótidos.

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio del

producto de la reacción de PCR empleando los oligonucleótidos ICL D e ICL R. Línea 1

marcador de peso molecular líneas 2 y 3 producto de la reacción de PCR.

El producto de la reacción de PCR de aproximadamente 1500 pb fue purificado y clonado en

el vector pJET1/blunt (Fermentas). El producto de la reacción de ligazón se transformó en

células competentes y se aislaron 18 clones.

La digestión enzimática (BglII) de los clones aislados permitió seleccionar 5 clones

recombinantes (figura 4) los cuales fueron secuenciados.



Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio de digestión

con BglIl del ADN de los clones aislados.. Línea 1 de ambos paneles marcador de peso

molecular O’Gene RulerTM DNA Ladder Mix, el resto de las líneas los clones aislados luego

de la restricción con BglIl. Líneas 7, 9 y 11 (panel A), y líneas 3 y 8 (panel B) clones

recombinantes.

Los cinco clones secuenciados tanto en dirección directa y reversa rindieron 10 secuencias

de las cuales 9 fueron útiles. Mediante el algoritmo Cap3 se realizaron 3 agrupamientos de

las secuencias obtenidas, designados como agrupamientos 1, 2 y 3. Como es posible

observar en la figura 5, la mayor cantidad de secuencias (5) pertenecen al agrupamiento 2.

Es necesario aclarar que durante el diseño y ejecución de esta parte experimental, aún no se

contaba con el genoma de M. fijiensis, por tanto los primeros análisis se realizaron a partir de

la inferencia de otros genomas de hongos disponibles en bases de datos públicas.

La comparación de secuencias nucleotídicas de cada agrupamiento con el genoma de M.

fijiensis puede observarse en la figura 4, con lo que fue posible comprobar que en efecto el



agrupamiento número 2, con una mayor representación de secuencias, es homólogo con un

valor de E=0.0 al gen de la isocitrato liasa.

Este resultado confirma que el diseño de los oligonucléotidos degenerados a partir de

secuencias del gen de la ICL de hongos relacionados filogenéticamente permitió aislar este

gen a partir del aislado de M. fijiensis empleado en este estudio.

Figura 5. Resultados del agrupamiento de secuencias de los clones recombinantes y la

comparación con el genoma de M. fijiensis mediante Blast n.



4.2 Crecimiento de M. fijiensis en diferentes fuentes de carbono


en agitación

Se logró el crecimiento de M. fijiensis en los medios de cultivo Medio Mínimo con glucosa al

1%, Medio Mínimo con sacarosa al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1% Medio Mínimo con

etanol al 1% y Caldo Papa y Dextrosa(figura 6). No se observó crecimiento en los medios

Medio Mínimo sin fuente de carbono y Medio Mínimo con Acetato de Potasio al 1% como

fuente de carbono.

Figura 6. Crecimiento de M. fijiensis en diferentes fuentes de carbono durante 28 días en

medios de cultivo líquido en agitación.



Los resultados obtenidos de masa seca de micelio a los siete días de crecimiento mostraron

como mejores medios de cultivo al Medio Mínimo con sacarosa al 1%, seguido de Medio

Mínimo con glucosa al 1%, existiendo diferencias estadísticas significativas entre ellas y con

el resto de las fuentes carbonadas analizadas.

No se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los medios de cultivo Medio

Mínimo con glicerol al 1% y Caldo Papa y Dextrosa a los siete días de cultivo.

A los 14 días de crecimiento los mejores resultados de masa seca se obtuvieron en los

medios de cultivo Medio Mínimo con glucosa al 1% y Medio Mínimo con sacarosa al 1%, no

existiendo diferencias estadísticas significativas entre ellos y sí con las demás fuentes de

carbono estudiadas.

Es de destacar que entre los 14 y 21 días se produce un incremento notable en los valores

de masa seca en el medio de cultivo que contenía glicerol al 1%. Esto puede ser debido a

que el hongo necesita una fase de adaptación del metabolismo para la utilización de esta

fuente carbonada que no es glucosa, que es la fuente de carbono que comúnmente los

hongos utilizan en el metabolismo para su nutrición.

Este proceso ocurre de forma similar en el medio de cultivo con etanol al 1% como fuente de

carbono pero los valores de masa seca obtenidos son menores y tienen diferencias

estadísticas significativas al ser comparadas con el medio de cultivo con glicerol al 1%.

A los 21 y 28 días los valores superiores de masa seca se observaron en Medio Mínimo con

glicerol al 1% existiendo diferencias estadísticas significativas con el resto de las fuentes de

carbono estudiadas, seguido por Medio Mínimo con sacarosa al 1% y Medio Mínimo con

glucosa al 1% que no mostraron diferencias estadísticas significativas entre ellas y si con las

otras fuentes de carbono.

En todos los medios de cultivo se observó crecimiento en forma de colonias esféricas

(pellets), con consistencia blanda y textura poco compacta.



La coloración del micelio varió con la fuente de carbono utilizada. En los medios de cultivo

Medio Mínimo con sacarosa al 1% y Medio Mínimo con glucosa al 1% se observaron

colonias de color verde olivo oscuro.

En el Medio Mínimo con etanol al 1% las colonias crecieron de color verde olivo claro y en el

Mínimo con glicerol al 1% las colonias a los 7 días crecieron de color verde olivo claro y a

los 14 días se aprecia un cambio de coloración rosada que se intensifica hasta los 28 días de

crecimiento en agitación (figura 7).

Figura 7 Crecimiento de M.fijiensis en medio líquido con diferentes fuentes de carbono con

agitación a los 21 días de cultivo.

No se observó pigmentación en el medio de cultivo para las fuentes de carbono evaluadas.

Se demostró que M. fijiensis es capaz de crecer en medios de cultivo con glicerol y etanol,

con tasas de producción de masa seca superiores, en el caso de glicerol, a las medias

obtenidas con glucosa y sacarosa. A la vez es capaz de usar eficientemente el etanol como

fuente de carbono con una producción de masa seca superior al medio control PDB.



4.2.2 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de M. fijiensis en medio sólido

Se logró crecimiento de M. fijiensis en los medios de cultivo: Medio Mínimo con glucosa al

1%, Medio Mínimo con sacarosa al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1%, Medio Mínimo con

etanol al 1% y Agar Papa y Dextrosa.

Los caracteres culturales de las colonias en los medios de cultivo Medio Mínimo con glucosa

al 1%, Medio Mínimo con sacarosa al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo

con etanol al 1% fueron similares en cuanto a color del micelio, textura, consistencia,

capacidad de pigmentar o no el medio y presencia de líquido transpirado.

Se observó micelio superficial, aterciopelado, elevado, compacto y no se apreció

pigmentación en el medio de cultivo ni presencia de líquido transpirado. Estas características

coinciden con las descritas por varios autores (Cruz, 2004) para el crecimiento de M. fijiensis

en el medio de cultivo Agar Papa y Dextrosa.

En todos los casos crecieron colonias de forma convexa y circulares con bordes regulares

como los que se muestran en la Figura 8.

Figura 8. Colonias de M. fijiensis crecidas en medio sólido con glicerol a los 14 días de

incubación, a 28 °C y oscuridad constante.



Los colores de las colonias se corresponden con los descritos en la literatura (Stover, 1976;

Jeger et al., 1995; Cruz et al., 2004). Se encontró una gama de colores desde gris oliváceo

hasta blanco predominando este último.

Con respecto al color del reverso de la colonia, en los medios de cultivo Medio Mínimo con

glucosa al 1%, Medio Mínimo con sacarosa al 1%, se mostró de color negro. Para las

colonias crecidas en Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al 1% y

Agar Papa y Dextrosa se tornó pardo oscuro a pardo claro. El diámetro de las colonias

después de los 14 días no fue superior a los 3 mm

No obstante, se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los medios de cultivo

con respecto al diámetro de las colonias. El medio de cultivo Mínimo con glicerol al 1%

mostró los mayores valores de diámetro de las colonias, seguido en orden por el y Medio

Mínimo con etanol al 1% y no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los

mismos (Tabla 1).

Tabla 1. Diámetro medio de colonias de M. fijiensis a los 14 días de incubación en medio

de cultivo con diferentes fuentes de carbono.

Medio de Cultivo Diámetro de las

colonias (mm)

Rangos medios

Medio Mínimo con Glucosa 1% 2,5 b 235,00

Medio Mínimo con Sacarosa 1% 2,71 ab 290,83

Medio Mínimo con Glicerol 1% 2,82 a 314,21

Medio Mínimo con Etanol 1% 2,76 ab 305,43

PDB 2,54 b 247,55

Rangos medios con letras desiguales en una misma columna difieren por Prueba Kluskall-

Wallis p<0.05.



Los resultados de crecimiento en medios de cultivo sólido coinciden con los obtenidos en

medios líquidos en agitación, demostrándose que M .fijiensis es capaz de utilizar con

eficiencia el glicerol y el etanol como fuentes de carbono durante el cultivo in vitro.

4.2.3 Producción in vitro de conidios de M .fijiensis en diferentes fuentes de carbono

Se obtuvieron conidios de M .fijiensis en los medios de cultivo: Medio Mínimo con glucosa al

1%, Medio Mínimo con sacarosa al 1%, Medio Mínimo con glicerol al 1%, Medio Mínimo con

etanol al 1% y Agar V-8 modificado, a partir de los 14 días de incubación a la temperatura

de 20 ºC y luz constante. Sus características coincidieron con las referidas en la literatura

científica para esta especie (Carlier et al., 2002). En el medio de cultivo Agar Papa y

Dextrosa no se observó producción de conidios.

La mayor concentración de conidios se logró en el medio de cultivo Agar V-8 modificado,

seguido del medio de cultivo Medio Mínimo con sacarosa al 1%, y existieron diferencias

estadísticas significativas entre ellos y con las fuentes de carbono restantes (Tabla 2)

Tabla 2. Concentración de conidios de M. fijiensis en diferentes medios de cultivo.

Medio de Cultivo Concentración de

conidios

(x 105 conidios.ml-1)

Rangos

medios

Agar V8 4,05 a 260,3

Medio Mínimo con Sacarosa 1% 2,97 b 198,52

Medio Mínimo con Glucosa 1% 1,76 c 132,4

Medio Mínimo con Glicerol 1% 1,38 c 148,08

Medio Mínimo con Etanol 1% 0,84 d 59,160

Rangos medios con letras desiguales en una misma columna difieren por Prueba

Kluskall-Wallis p<0.05.



Estos resultados coinciden con los reportados en la literatura donde varios investigadores

han empleado el medio de cultivo V-8 para la obtención de conidios con buenos resultados

(Mourichon et al.,1987; Mata et al.,1994; Ceres y Menezes, 2001 y Acosta et al. 2004).

Estos resultados se diferencian de los obtenidos por Fullerton y Olsen (1995); González

(1999); Ceres y Menezes (2001) y Hadana et al. (2002) que lograron obtener conidios en el

medio de cultivo Agar Papa y Dextrosa.

En los medios de cultivo Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con glucosa al 1%

no existieron diferencias estadísticas significativas entre ellos en cuanto a la producción de

conidios.

La producción de conidios en Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con etanol al

1% confirman los resultados obtenidos en el ensayo de crecimiento de M. fijiensis en medios

de cultivo líquido en agitación y medio sólido sobre la utilización eficiente de estas fuentes de

carbono por este hongo fitopatógeno a través de la activación del ciclo del glioxilato.

Sobre la base de estos resultados se seleccionaron los medios mínimos con glicerol y etanol

para los estudios de expresión del gen de la icl de M. fijiensis.

4.3 Estudio de la expresión del gen de la Isocitrato liasa de M. fijiensis en medios de

cultivo liquido con glicerol y etanol

Para el estudio de la expresión del gen de la icl de M. fijiensis durante el crecimiento en

medio mínimo empleando diferentes fuentes carbonadas el protocolo de purificación de ARN

empleado resultó adecuado. Se obtuvo un rendimiento de 260 ng de ARN por mg de micelio

liofilizado de cada uno de las muestras del experimento.

El grado de pureza estimado a partir del cociente de las lecturas de absorbancia a 260 y 280

nm de las muestras mostró valores de 1.8. La corrida electroforética confirmó la integridad

de los ARN aislados.



Las muestras de ARN sometidas a la reacción de PCR con los oligonucleótidos ICL D e ICL

R no amplificaron banda alguna, lo que demostró que no existía contaminación por ADN en

cada uno de los ARN purificados. El ADN empleado como control de reacción amplificó la

banda esperada.

Para estudiar la expresión del gen de la icl en medios de cultivo con diferentes fuentes de

carbono se diseñaron dos oligonucleótidos específicos a la secuencia del gen de la icl de

M.fijiensis aislado y secuenciado en el acápite 4.1. Los oligonucleótidos resultantes fueron:

ICL Mif D CAAGGTCGAGCATCTGTTCA

ICL Mif R CGCCTTGGTAGCGGTAGTAG

El estudio de la expresión del gen de la Isocitrato liasa in vitro, mediante RT-PCR es

mostrado en la figura 9. En el micelio del patógeno crecido en Medio Mínimo con glucosa al

1% y en Medio Mínimo con sacarosa al 1% no se observó expresión del transcripto.

Mientras que las muestras de micelio crecido en Medio Mínimo con glicerol al 1% y en Medio

Mínimo con etanol al 1% se amplificó un banda de aproximadamente 700 pb, la cual se

corresponde con la longitud esperada según el diseño de los oligonucleótidos específicos al

gen de la icl aislado en este estudio (acápite 4.1). Se confirmó la expresión del trascripto

específico para la icl a los 7 y 21 días de cultivo del micelio en medio mínimo con glicerol y

etanol.



Figura 9. Resultados de la RT-PCR empleando los oligonuceótidos específicos para la

determinar la expresión del gen de la icl de M.fijiensis. Líneas 1 y 6 en medio con glucosa,

líneas 2 y 7 sacarosa, líneas 3 y 8 glicerol, líneas 4 y 9 etanol. Líneas 5 y 10 marcador de

peso molecular MassRuler DNA Ladders, 80bp-10Kb (Fermentas).

La represión del gen de la icl de M. fijiensis en medios de cultivo crecidos con glucosa y

sacarosa demuestra la preferencia por parte del hongo de estas fuentes de carbono. Este

resultado concuerda con los obtenidos en otros hongos fitopatógenos como M. graminicola,

N. crassa, A. nidulans, en los que se demostró la represión de la expresión del gen de la icl

por glucosa, fructuosa, galactosa y sacarosa (Bibbins et al., 1998, Bowyer, et al., 1994;

McCullough y Roberts, 1980).



La expresión del gen icl durante el crecimiento en medios de cultivo suplementados con

etanol y glicerol, demostró la activación del ciclo del glioxilato como una ruta metabólica

alternativa para la producción de energía a expensas de sustratos gluconeogénicos. Estos

resultados concuerdan con los estudios de expresión de este gen en Tapesia yallundae

(Bowyer et al., 2000).

Los estudios de expresión de genes relacionados con la nutrición de hongos filamentosos

por microarreglos, realizados en la última década, han aclarado los mecanismos que regulan

el metabolismo. Se conoce que el factor de transcripción CreA regula la represión por

glucosa del gen de la isocitrato liasa. En A. nidulans se demostró que la enzima alcohol

deshidrogensa, responsable de la asimilación de etanol en Aspegillus oryzae y N.crassa es

fuertemente inducida en ausencia de glucosa (Maeda et al., 2004; Xie et al., 2004). La

alcohol deshidrogenasa también es regulada a través de CreA (Flipphi et al. 2002). La

represión por glucosa mediada por CreA fue demostrada también en estudios de cambio de

etanol a glucosa (Aing y Hoheisel 2003).

Los resultados del estudio de expresión del gen de la icl refuerzan los resultados obtenidos

en los acápites 4.2, donde se demostró que M. fijiensis es capaz de crecer en condiciones in

vitro empleando fuentes de carbono alternativas como el glicerol y el etanol a expensas de

la activación del ciclo del glioxilato.

CCoonncclluussiioonneess



5. CONCLUSIONES

1. Se aisló y secuenció un fragmento de 1561 pb del gen que codifica para la enzima

Isocitrato liasa de M. fijiensis a partir del aislado CCIBP-Pf-83 empleando

oligonucléotidos degenerados diseñados a partir de secuencias del gen de la icl de

hongos relacionados filogenéticamente.

2. Se demostró que M. fijiensis es capaz de crecer en medios de cultivo mínimo con 1%

de glicerol y etanol, con tasas de producción de masa seca superiores, en el caso de

glicerol, a las medias obtenidas en medios mínimos con glucosa y sacarosa al 1% y

el etanol al 1 % con una producción de masa seca superior al medio control PDB.

3. Se comprobó que el aislado CCIBP-Pf-83 de M. fijiensis fue capaz de producir

conidios durante el cultivo en Medio Mínimo con glicerol al 1% y Medio Mínimo con

etanol al 1%, que unido a la capacidad de crecimiento en estos medios, demuestra la

activación del ciclo del glioxilato en presencia de estas fuentes de carbono.

4. Se demostró mediante RT-PCR con oligonucleótidos específicos (ICL Mif D e ICL Mif

R), la expresión del gen de la icl de M. fijiensis en el Medio Mínimo con glicerol al 1%

y en el Medio Mínimo con etanol al 1 % en muestras de micelio a los 7 y 21 días de

cultivo.

RReeccoommeennddaacciioonneess



6. RECOMENDACIONES

1. Aislar y secuenciar el gen completo y el promotor de la Isocitrato liasa de M.

fijiensis

2. Realizar estudios de expresión del gen la icl, empleando los oligonucleótidos

específicos (ICL Mif D e ICL Mif R) en micelio cultivado en medios líquidos con

cambio de la fuente de carbono, de glucosa a glicerol o etanol y de glicerol o

etanol a glucosa para demostrar la activación específica y el tiempo de activación

de esta enzima.

3. Estudiar posibles inhibidores de la isocitrato liasa durante el crecimiento de

M.fijiensis en medio Medio Mínimo con glicerol al 1%, como candidatos

fungicidas.

BBiibblliiooggrraaffííaa


Tesis de Maestría

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TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MAGISTER …