Upload
tranngoc
View
258
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ACADEMIA ROMANA
INSTITUTUL DE BIOLOGIE SI PATOLOGIE CELULARA
„ NICOLAE SIMIONESCU”
TEZA DE DOCTORAT
Mecanisme celulare si moleculare responsabile
de alterarile morfo-functionale ale glomerulului renal
in imbatranire si hipertensiunea arteriala
Conducator stiintific:
ACAD. MAYA SIMIONESCU
Doctorand:
MADALINA DUMITRESCU
2013
CUPRINS
INTRODUCERE
PARTEA I - STADIUL ACTUAL AL CUNOSTINTELOR
Capitolul I. Aspecte morfo-functionale ale glomerulului renal in conditii fiziologice
I.1. Notiuni generale de anatomie si fiziologie renala
Structura anatomica si functionala a nefronului
Vascularizarea rinichiului
I.2. Structura si functia glomerulul renal
Mecanismul ultrafiltrarii glomerulare
Membrana sau bariera de filtrare glomerulara
Endoteliul capilar
Membrana bazala glomerulara
Epiteliul visceral
Rata de filtrare glomerulara
Capitolul II. Mecanisme fiziopatologice care contribuie la disfunctia celulelor
glomerulare in imbatranire si hipertensiunea arteriala
II.1. Modificari patologice ale celulelor glomerulului renal in disfunctia glomerulara
II.1.1 Disfunctia celulelor endoteliale glomerulare
Modificarea dimensiunilor celulelor endoteliale glomerulare
Pierderea fenestrelor celulelor endoteliale glomerulare
Alterari ale glicocalixului
Alterari ale celulelor endoteliale datorate stresului de curgere a sangelui
II.1.2. Modificari structurale ale membranei bazale glomerulare
II.1.3 Alterari structurale si functionale ale podocitelor
Hipertrofia podocitelor
Fuziunea pedicelelor
Podocitopenia
II.1.4 Alterari morfo-functionale ale componentelor mezangiului
Proliferarea celulelor mezangiale
Apoptoza celulelor mezangiale
II.2 Alterari morfo-functionale ale glomerulilor renali in imbatranire si in hipertensiune
Mecanismele imbatranirii la nivelul glomerulului renal
Senescenta celulara - marker al imbatranirii la nivel renal
Disfunctia glomerulara in hipertensiunea arteriala
Modificari ale arhitecturii membranei bazale glomerulare in imbatranire
Modificari structurale si functionale ale podocitelor in imbatranire si hipertensiune
Alterari morfo-functionale ale componentelor mezangiale in imbatranire si in
hipertensiunea arteriala
Capitolul III. Mecanisme moleculare implicate in senescenta celulelor glomerulare
renale
III.1. Caracteristici morfologice si functionale ale celulelor senescente
III.2. Markeri si inductori ai senescentei celulare
Markeri de senescenta celulara
Inductori ai senescentei celulare
Cai de semnalizare implicate in senescenta celulara
Calea de semnalizare intracelulara mediata de p53.
Calea de semnalizare intracelulara mediata de p16-pRb.
Rolul autofagiei in senescenta celulara
III.3 Relevanta senescentei celulare in imbatranire
PARTEA A II-A - CONTRIBUTII ORIGINALE
I. Mecanisme celulare si moleculare implicate in senescenta celulara la nivelul
glomerulului renal in imbatranire
1. INTRODUCERE
2. METODOLOGIE EXPERIMENTALA
Determinarea biochimica a parametrilor plasmatici
Procesarea tesutului renal pentru microscopie optica
Coloratii histologice
Determinarea SA- β–Gal
Imunofluorescenta
Microscopie electronica
Determinarea activitatii NADPH oxidazelor
Detectia speciilor reactive de oxigen
Analiza Western-blot
Analiza statistica
3. REZULTATE
3.1. Caracterizarea hamsterului Sirian auriu batran comparativ cu cel tanar
3.1.1. Determinarea parametrilor biochimici circulanti
3.1.2. Evaluarea histologica a alterarilor structurale induse de imbatranire la
nivel glomerular
3.1.3. Evidentierea modificarilor ultrastructurale ale glomerulului renal
3.2. Implicarea senescentei celulare in imbatranirea la nivelul glomerulului renal
3.2.1. Evidentierea unor markeri de senescenta celulara in celulele
glomerulare renale la hamsterii batrani
3.2.2. Efectori ai programului de senescenta identificati la nivel glomerular
3.2.3. Aprecierea productiei de specii reactive de oxigen in cortexul renal;
rolul acestora in inducerea senescentei celulare
3.2.4. Rolul disfunctiei mitocondriale in inducerea senescentei celulare in
imbatranire
3.3. Cross-talk-ul molecular intre mecanismul autofagiei si cel al senescentei
celulare la nivelul glomerulului renal in imbatranire
3.3.1. Rolul stresului reticulului endoplasmatic in inducerea autofagiei in celulele
glomerulare de la hamsterul batran
3.3.2. Activarea autofagiei ca mecanism de reciclare a componentelor structurale
ale mitocondriilor disfunctionale
3.3.3. Modularea autofagiei ca raspuns la stresul energetic al celulelor glomerulare
in imbatranire
4. DISCUTII
5. CONCLUZII
II. Mecanisme moleculare ale senescentei celulare in hipertensiunea indusa cu
L-NAME
1. INTRODUCERE
2. METODOLOGIE EXPERIMENTALA
Determinarea glicemiei si colesterolemiei
Determinarea concentratiei de nitrati/nitriti
Activitatea enzimei de conversie a angiotensinei (ACE)
Masurarea presiunii arteriale
Procesarea organelor pentru microscopie optica
Coloratii histologice
Determinarea SA- β–Gal
Microscopie electronica
Determinarea productiei de anioni superoxid
Cuantificarea carbonililor proteici
Analiza Western-blot
Analiza statistica
3. REZULTATE
3.1. Caracterizarea hamsterului cu hipertensiune indusa in urma administrarii cronice
de L-NAME
3.1.1. Masurarea parametrilor hemodinamici si a greutatii corporale si renale
3.1.2.Evaluarea histologica a alterarilor structurale glomerulare induse de inhibarea
sintezei de NO la hamsterii hipertensivi si control
3.1.3. Aspecte electronomicroscopice ale ultrastructurii glomerulului renal de la
hamsterii cu hipertensiune indusa cu L-NAME
3.2. Mecanisme moleculare ale senescentei celulelor glomerulare asociate cu
inhibarea cronica a NO la nivelul glomerulilor hamsterilor hipertensivi
3.2.1.Cuantificarea productiei de specii reactive de oxigen la nivelul cortexului
renal al hamsterilor hipertensivi si control
3.2.2.Implicarea cailor de semnalizare intracelulara activate de ROS in senescenta
celulelor gomerulare
3.2.3. Identificarea celulelor senescente in glomerulii hamsterilor hipertensivi
3.2.4. Modificari ultrastructurale glomerulare posibil implicate in senescenta celulara
favorizata de inhibarea sintezei NO
4. DISCUTII
5. CONCLUZII
III. Implicarea efectului antioxidant al Zofenopril in restabilirea disfunctiilor
glomerulare induse de inhibarea cronica a sintezei de NO
1. INTRODUCERE
2. METODOLOGIE EXPERIMENTALA
Determinarea biochimica a parametrilor plasmatici
Determinarea activitatii enzimei de conversie a angiotensinei
Masurarea presiunii arteriale
Procesarea tesutului renal pentru microscopie
Coloratia histologica tricromica Masson
Microscopie electronica
Determinarea productiei de anioni superoxid
Cuantificarea carbonililor proteici
Analiza Western-blot
Determinarea concentratiei de glutation (in forma totala, redusa, oxidata)
Determinarea activitatii glutation peroxidazei
Analiza statistica
3. REZULTATE
3.1. Caracterizarea sobolanilor cu hipertensiune indusa prin administrarea cronica de
L-NAME tratati/netratati cu Zofenopril
3.1.1.Determinarea parametrilor hemodinamici, circulanti si a greutatii corporale
3.1.2. Evaluarea histologica a alterarilor structurale glomerulare la sobolanii cu
hipertensiune tratati/netratati cu Zofenopril
3.1.3. Aspecte electrono-microscopice ale glomerulilor renali de la sobolanii cu
hipertensiune tratati/netratati cu Zofenopril
3.2. Implicarea stresului oxidativ in alterarile renale aparute la sobolanii cu hipertensiune
tratati/netratati cu Zofenopril; efectul anti-oxidant al Zofenopril
3.2.1. Determinarea productiei de anioni superoxid in cortexul renal al sobolanilor
cu hipertensiune tratati/netratati cu Zofenopril
3.2.2. Evaluarea expresiei proteice a subunitatilor NADPH oxidazei in omogenatele
de cortex renal
3.2.3. Determinarea exprimarii proteice a subunitatilor factorului de transcriptie
NFkB implicat in stresul oxidativ intracelular
3.2.4. Determinarea concentratiei carbonililor proteici - marker de stres oxidativ
3.2.5. Evaluarea statusului oxidant / antioxidant in cortexul renal;
estimarea nivelelor de glutation si activitatea glutation peroxidazica
4. DISCUTII
5. CONCLUZII
CONCLUZII GENERALE
BIBLIOGRAFIE
LISTA LUCRARILOR PUBLICATE
IMPLICAREA IN PROIECTE DE CERCETARE
CUVINTE CHEIE
Cortex renal; Glomerul renal; Podocite; Celule mezangiale; Imbatranire fiziologica;
Hipertensiune arteriala; Senescenta celulara; Fenotip senescent; Ciclul celular; Stres
oxidativ; Specii reactive de oxigen (ROS, „reactive oxygen species”); Disfunctie
mitocondriala; Stresul reticulului endoplasmatic; Autofagie; β-galactozidaza lisozomala
asociata senescentei (SA-β-gal), L-NAME (“Nω-Nitro-L-arginine methyl ester
hydrochloride”); Zofenopril; Antioxidant
REZUMAT
Teza de doctorat „Mecanisme celulare si moleculare responsabile de
alterarile morfo-functionale ale glomerulului renal in imbatranire si hipertensiunea
arteriala” a urmarit identificarea unor noi mecanisme celulare si moleculare implicate in
dezvoltarea senescentei celulare la nivel glomerular in imbatranirea fiziologica si in
hipertensiunea arteriala. Lucrarea cuprinde doua parti: partea I „Stadiul actual al
cunostintelor” si partea a II-a „Contributii originale”.
In contextul cresterii accelerate a numarului persoanelor varstnice subiectul
abordat este de stringenta actualitate. In 2012, Organizatia Mondiala a Sanatatii a
estimat ca pana in 2050 proportia persoanelor trecute de 60 ani se va dubla comparativ
cu anul 2000. Co-morbiditatile asociate imbatranirii (hipertensiunea, ateroscleroza,
insuficienta cardiaca, etc.) sunt boli cronice pentru tratarea carora sistemul sanitar
trebuie sa aloce fonduri foarte mari. Descifrarea mecanismelor imbatranirii va contribui
la dezvoltarea unor strategii eficiente pentru cresterea calitatii vietii varstnicilor si
mentinerea lor in activitate, prin intarzierea aparitiei, sau diminuarea modificarilor
patologice celulare si tisulare ce apar cu inaintarea in varsta.
In imbatranirea fiziologica modificarile morfologice si functionale ale rinichilor
conduc la dezvoltarea insuficientei cronice renale. Acumularea celulelor senescente a
fost implicata in inducerea alterarilor tisulare in imbatranire si in afectiunile cronice care
o insotesc. Investigarea senescentei celulelor renale poate conduce catre o noua
abordare teraputica a fiziopatologiei imbatranirii la nivel renal. Recent prin
indepartarea celulelor senescente pozitive pentru proteina p16INK4a (marker recunoscut
de senescenta celulara) din tesuturi de la soareci cu fenotip progeroid, a fost intarziata
aparitia fenotipului asociat imbatranirii (Baker si colab., 2011). Aceste aspecte au
condus la ideea elaborarii unor strategii de „indepartare” a celulelor senescente din
tesuturi pentru restabilirea functiei acestor tesuturi.
Prima parte a tezei este structurata in trei capitole. In capitolul I sunt cuprinse
notiuni de anatomie si fiziologie renala, fiind prezentate structura si functia glomerulului
renal, respectiv arhitectura glomerulului renal si bariera de filtrare glomerulara, inclusiv
mecanismul ultrafiltrarii si rata de filtrare glomerulara, in conditii fiziologice normale.
Capitolul II prezinta modificarile patologice ale celulelor glomerulului renal si implicatiile
acestora in disfunctia glomerulara. Modificarea dimensiunii celulelor endoteliale
glomerulare, alterarea / pierderea fenotipului lor fenestrat, modificari ale glicocalixului,
sau alterari celulare datorate stresului de curgerea sangelui determina disfunctia
acestor celule, cu consecinte negative asupra filtrarii glomerulare. Deasemenea
disfunctia barierei de filtrare glomerulara este cauzata de modificarile structurale ale
membranei bazale glomerulare, de alterarile structurale si functionale ale podocitelor
(respectiv de hipertrofia acestor celule epiteliale viscerale, de fuzionarea pedicelelor lor,
sau de pierderea acestor celule) si de alterarile morfo-functionale ale regiunii
mezangiale (proliferarea, sau apoptoza celulelor mezangiale, hiperplazia mesangiala).
In capitolul II sunt evidentiate alterarile morfo-functionale ale glomerulilor renali in
imbatranire si hipertensiunea arteriala, cu referire la mecanismele afectate de
procesul imbatranirii in podocitele renale si in mezangiu. Plecand de la ipoteza ca in
procesul imbatranirii rinichiului una dintre cauzele modificarii arhitecturii membranei
bazale glomerulare si a alterarilor morfo-functionale ale podocitelor o reprezinta
acumularea de celule senescente la nivel renal, in capitolul III sunt prezentati markerii
si efectorii senescentei celulare, respectiv o serie de proteine implicate in semnalizarea
intracelulara implicata in aparitia fenotipului senescent. In acest capitol este subliniata
relevanta senescentei celulare in procesul imbatranirii fiziologice. In faza ei „timpurie”
senescenta celulara constituie un mecanism de protectie a celulelor impotriva
transformarii lor tumorale, insa exacerbarea fenotipului secretor asociat cu senescenta
celulara are impact negativ asupra celulelor din vecinatate, contribuind substantial la
morbiditatea asociata imbatranirii.
Partea a II-a, intitulata Contributii originale, cuprinde rezultatele originale
obtinute in trei studii care au vizat: 1) identificarea celulelor senescente in glomerulii
renali de la hamsteri Sirieni aurii de 24 de luni (considerati batrani), sau cu
hipertensiune arteriala (indusa experimental); 2) descifrarea unor mecanisme celulare si
moleculare implicate in inducerea senescentei celulare la nivelul glomerulilor renali;
3) ameliorarea efectelor stresului oxidativ la nivel cortical renal, prin administrarea de
Zofenopril sobolanilor cu hipertensiune arteriala indusa.
In primul studiu, numit „Mecanisme celulare si moleculare implicate in
senescenta celulara la nivelul glomerulului renal in imbatranire”, am urmarit
investigarea unor mecanisme moleculare implicate in inducerea senescentei celulare
in imbatranirea fiziologica, in perspectiva dezvoltarii unor noi strategii terapeutice
directionate catre intarzierea aparitiei bolilor renale cronice, in vederea cresterii calitatii
vietii populatiei varstnice. Ca model experimental animal am utilizat hamsterii sirieni
aurii in varsta de 24 luni (considerati batrani) si, respectiv, in varsta de 4 luni (tineri) de
la care am prelevat rinichii, la momentul sacrificarii. Cortexul renal a fost procesat
pentru: a) microscopie optica (sectiuni in parafina si criosectiuni) si microscopie
electronica, in vederea examinarii alterarilor structurale ale celulelor glomerulare in
imbatranire, a prezentei disfunctiei mitocondriale, a stresului reticulului endoplasmatic si
a autofagiei, b) evidentierea reactiei β-galactozidazei lisozomale asociata senescentei
(SA β-gal), cu activitate la pH 6, c) identificarea imunochimica a unor proteine de
interes, atat prin tehnica de western blotting cat si prin imunohistochimie (microscopie
de fluorescenta), d) estimarea productiei de specii reactive de oxigen si a efectelor
stresului oxidativ la nivelul proteinelor si a cailor de semnalizare intracelulara activate de
stres si implicate in modularea senescentei celulare.
Examinarea histologica a sectiunilor renale (coloratii: hematoxilina-eozina, PAS,
tricromica Masson, metenamin-argint) a relevat prezenta glomerulosclerozei focale si
segmentare, acumularea excesiva de colagen de tip IV si ingrosarea membranei bazale
la nivelul glomerulilor de la hamsterii batrani. Testarea activitatii SA β-gal la pH 6 a
dovedit prezenta celulelor senescente in vivo in glomerulii renali de la hamsterii batrani
(Fig. 1, stanga). In literatura de specialitate sunt putine datele care arata prezenta
celulelor senescente la nivel renal. Un al marker de senescenta unanim recunoscut il
reprezinta p16INK4a, o proteina inhibitoare a unor complexe ciclina - kinaza ciclin-
dependenta, a carei exprimare crescuta reflecta oprirea ireversibila a ciclului celular -
trasatura definitorie a senescentei celulare. Exprimarea crescuta a p16INK4a la nivel
renal la hamsterii batrani a fost pusa in evidenta atat prin Western blot cat si prin
microscopie de fluorescenta (Fig. 1, dreapta).
Fig.1. Celule senescente in
glomerulii renali la hamsteri
batrani. Coloratia albastra
indica celule pozitive pentru
SA β-gal activa la pH 6
(stanga). Celule p16INK4a-
pozitive sunt marcate cu
Alexa 488 (verde) (dreapta).
Celulele senescente se opresc ireversibil din proliferare si desi raman active
metabolic ele prezinta caracteristic aplatizarea, rezistenta la apoptoza si
tumorigeneza, alterarea profilului expresiei genice si secretia unor molecule bioactive
(citokine inflamatorii si chiar specii reactive de oxigen) (Passos si colab., 2010).
Exprimarea crescuta a p27Kip1 si p21Cip1, doi inhibitori de complexe ciclina - kinaza
dependenta de ciclina din clasa Cip/Kip ce actioneaza in faza G1 a ciclului celular,
blocand progresia ciclului catre faza S, a indicat oprirea ireversibila a ciclului celular
in faza G1 in celulele renale de la hamsterii batrani, sugerand prezenta celulelor
senescente. Totodata studiile de Western blot au indicat acumularea tisulara de CDK4
la nivelul cortexului renal la hamsterii batrani.
Senescenta celulara constituie un raspuns al celulei la diversi factori de stres ce
determina lezarea ADN-ul genomic, sau modificari post-translationale ale proteinelor, si
care activeaza caile de semnalizare mediate de ARF/p53/p21Cip1 si de p16INK4a/pRb.
Determinarea productiei de specii reactive de oxigen (ROS) in omogenatele de
cortex renal de la hamsteri batrani si tineri a aratat generarea crescuta de ROS in cazul
hamsterilor batrani, aceasta reprezentand un factor posibil responsabil de inducerea
senescentei celulare in glomerulii renali. Intensificarea stresului oxidativ la nivel renal la
hamsterii batrani poate fi o cauza a exprimarii proteice crescute a p53, un factor de
transcriere redox-senzitiv implicat in decizia celulei de a deveni senescenta.
O alta proteina identificata recent ca mediator al fenotipului senescent, datorita
rolului pe care il joaca in remodelarea cromatinei si in facilitarea accesului factorilor de
transcriptie la ADN-ul nuclear, este alarmina HMGB1 („high mobility group box 1”)
(Davalos si colab., 2013). Timpuriu in senescenta HMGB1 transloca din nucleu in
citosol, fiind secretata extracelular; atat translocarea HMGB1 din nucleu, cat si
redistributia sa in spatiul extracelular depind de activarea p53. Urmarind implicarea
HMGB1 in senescenta, am aratat ca la nivelul cortexului renal, la hamsterii batrani,
exprimarea HMGB1 scade (Fig. 2, stanga; western blot), iar in celulele glomerulare
HMGB1 transloca din nucleu in citosol (Fig. 2, dreapta; imunofluorescenta ).
HMGB1
tubulina
Tineri Batrani
Fig. 2. Expresia si localizarea HMGB1 in cortexul renal la hamsteri batrani
Exista o legatura cauzativa intre stresul oxidativ, disfunctia mitocondriala,
senescenta celulara si fenotipul imbatranirii (Velarde si colab., 2012). In cazul
hamsterilor Sirieni aurii batrani studiati am observat, prin examinarea electrono-
microscopica a celulelor din glomerulii renali, prezenta mitocondriilor disfunctionale, atat
in podocite (Fig. 3, stanga) cat si in celulele mezangiale (Fig. 3, dreapta).
Fig. 3. Aspecte electronomicroscopice ale glomerulilor renali de la hamsterii batrani:
podocite (stanga) si mezangiu (dreapta). Mitocondriile au criste dezorganizate, iar
matricea mitocondriala are densitate scazuta.
Disfunctia mitocondriala este cauza, dar si consecinta senescentei celulare, in
conditii de stres oxidativ crescut si de incapacitatea enzimelor antioxidante de a inlatura
ROS. Urmarind exprimarea proteinei mitocondriale MnSOD, cu rol defensiv impotriva
ROS, nu am observat diferente semnificative in expresia acestei enzime in
omogenatele de cortex renal de la hamsterii batrani vs. tineri, insa este posibil ca la
hamsterii batrani activitatea enzimatica a MnSOD sa fie scazuta, astfel incat enzima
este ineficienta in reducerea stresului oxidativ.
In podocitele si celulele mezangiale din glomerulii hamsterilor batrani am
evidentiat, prin microscopie electronica, prezenta lipofuscinei, un produs nedegradabil,
rezultat prin reticularea/agregarea proteinelor si a lipidelor peroxidate. Acumularea de
lipofuscina apare caracteristic in imbatranire. Mitocondriile disfunctionale, care
determina eliberarea de anioni hidroxil foarte reactivi, pot contribui la formarea
lipofuscinei. Prezenta numeroaselor mitocondrii care apar sever afectate structural
sugereaza o diminuare substrantiala a autofagiei / mitofagiei (care elimina in mod
normal mitocondriile distruse).
Functia mitocondriala este modulata de o serie de proteine. AMPKinaza,
considerata senzor al metabolismului energetic, are rol in in activarea biogenezei
mitocondriale, dar si in directionarea mitocondriilor disfunctionale catre degradarea prin
mitofagie (Hardie, 2011). Disfunctia mitocondriala si productia crescuta de ROS
determina cresterea AMP in celule, iar cresterea raportului AMP:ATP intracelular
activeaza AMPKinaza care regleaza procesele metabolice in sensul refacerii resursei
energetice intracelulare. Un rol al AMPkinazei in inducerea senescentei este sugerat si
de potentialul AMP kinazei de a activa supresorul tumoral p53, prin controlul nivelelor
exprimarii proteice si prin capacitatea de transactivare a acestuia. Expresia AMPKinazei
in cortexul hamsterilor batrani studiati a fost crescuta, comparativ cu cei tineri, sugerand
implicarea acestei kinaze in imbatranire si in inducerea senescentei celulare la nivel
glomerular.
Alte doua proteine investigate pentru implicarea lor in senescenta celulara si
imbatranirea tisulara au fost SIRT1 si Nampt. Activarea SIRT1 si a Nampt, si o
concentratie intracelulara optima de NAD+, au rol important in asigurarea longevitatii
organismelor. SIRT1 face parte dintr-o familie de deacetilaze ce utilizeaza ca substrat
NAD+, jucand un rol cheie in metabolismul celular si in reglarea multor procese celulare,
de la supravietuirea celulei la raspunsurile acesteia la diversi factori de stres. Analiza
Western blot pe care am efectuat-o pe omogenatele de cortex renal de la hamsterii
batrani si tineri a aratat ca expresia proteica a SIRT1 este de doua ori mai scazuta la
hamsterii batrani, fata de cei tineri, rezultat care se coreleaza cu stresul oxidativ crescut
si cu alterarea structurii mitocondriilor. Nampt, enzima responsabila de sinteza NAD+ in
celula, “redreseaza” biodisponibilitatea NAD+, avand efecte benefice asupra scaderii
NAD+ si a ATP. Determinarea expresiei Nampt in cortexul renal al hamsterilor luati in
studiu a aratat reducerea semnificativa a expresiei Nampt la hamsterii batrani,
comparativ cu cei tineri.
In concluzie rezultatele experimentelor pe care le-am efectuat pe rinichi de
hamsterii batrani si tineri au aratat ca:
in imbatranire apare glomeruloscleroza, initial caracterizata de hipertrofia
celulelor glomerulare, urmata apoi de ingosarea membranei bazale glomerulare, de
expansiunea moderata a matricei mezangiale si de atrofia ghemului capilar glomerular;
celulele glomerulare de la hamsterii batrani exprima markerii senescentei
celulare: SA-β galactozidaza activa la pH 6, cresterea exprimarii p16INK4a si oprirea
ireversibila a ciclului celular in faza G1, indusa de p27Kip1, cu acumulare tisulara de
CDK4;
cresterea nivelelor de specii reactive de oxigen generate in cortexul renal de la
hamsterii batrani poate fi asociata cu activarea caii de semnalizare intracelulara
mediata de p53/p21Cip1;
la inducerea si stabilizarea fenotipului senescent contribuie alarmina HMGB1;
acumularea de mitocondrii disfunctionale in celulele glomerulare renal la
hamsterii batrani poate contribui la formarea lipofuscinei si la instalarea fenotipului
senescent;
cresterea expresiei AMPKinazei, posibil datorita stresului oxidativ crescut, indica
un stres energetic asociat procesului de imbatranire; acest stres determina scaderea
expresiei SIRT1 si a Nampt la nivelul cortexului renal, la hamsterii batrani.
In cel de-al doilea studiu cuprins in teza, numit „Mecanisme moleculare ale
senescentei celulare asociate hipertensiunii indusa cu L-NAME”, am urmarit:
1) identificarea prezentei celulelor senescente la nivelul glomerulilor renali in
hipertensiune, afectiune caracterizata de stres oxidativ crescut si 2) mecanismele
intracelulare care intervin in inducerea fenotipului senescent in in vivo, in hipertensiune.
Hipertensiunea arteriala (HTA), considerata „ucigasul tacut (the silent killer)”, reprezinta
o problema majora de sanatate publica, afectand circa un miliard de persoane in
intreaga lume. Prezenta celulelor senescente in bolile glomerulare asociate HTA nu
este inca fundamentata, dar se presupune ca alterarea biodisponibilitatii oxidului nitric
(NO), implicata in patogenia hipertensiunii arteriale, contribuie la stresul oxidativ crescut
si la aparitia fenotipului senescent. Inhibarea cronica a sintazei NO cu analogi de L-
arginina precum L-NAME induce senescenta celulelor endoteliale in vitro, in timp ce in
vivo determina hipertensiune sistemica si arterioloscleroza (Zhong si colab., 2010).
Rolul NO in senescenta celulara nu este inca elucidat, iar raportarile din literatura
referitoare la acest subiect sunt foarte putine.
In experimentele intreprinse am utilizat un model experimental original:
hamsterul Sirian auriu cu hipertensiune indusa prin administrarea cronica de L-NAME
(un inhibitor al sintezei de NO. Grupul hamsterilor hipertensivi (HT) a fost constituit din
hamsteri masculi carora li s-a administrat L-NAME (45 mg/kg corp/zi; 200 l) prin gavaj,
timp de 35 saptamani, iar grupul de control a fost alcatuit din masculi de aceeasi varsta
cu cei din grupul HT (4 luni) care au primit zilnc 200 l ser fiziologic. Obiectivele
specifice ale studiului au fost: a) caracterizarea hemodinamica si a parametrilor
biochimici ai modelului experimental ales; b) evaluarea histologica a modificarilor induse
in glomerulii renali, dupa administrarea de L-NAME; c) evidentierea electrono-
microscopica a modificarilor ultrastructurale ale glomerulilor renali de la hamsterii luati in
studiu; d) identificarea celulelor senescente prin determinarea activitatii β-galactozidazei
lisozomale asociata senescentei (SA-β-gal), activa la pH6), la nivelul glomerulilor renali
de la hamsterii cu hipertensiune; e) estimarea productiei de specii reactive de oxigen la
nivelul cortexului renal prelevat de la hamsterii cu hipertensiune; f) evaluarea
modificarilor oxidative ale proteinelor din celulele glomerulare de la hamsterii cu
hipertensiune; g) cuantificarea exprimarii unor proteine din caile de semnalizare activate
de stres si implicate in inducerea senescentei celulare.
Rezultatele acestui studiu au aratat ca inhibarea cronica a sintezei de NO cu
analogul structural al L-argininei (L-NAME) induce hipertensiune arteriala (HTA)
hamsterilor Sirieni aurii. La nivel renal HTA apare insotita de glomeruloscleroza in
stadiu incipient, fara fibroza sau depuneri de tesut hialin si fara ingrosarea membranei
bazale glomerulare, insa insotita de colapsarea capilarelor glomerulare si de fuziunea
pedicelelor podocitelor. Determinarea productiei de anioni superoxid in omogenatele
de cortex renal de la hamsterii hipertensivi vs. control a indicat cresterea cu ~ 90% a
productiei de anioni superoxid la hamsterii hipertensivi fata de cei control. Stresul
oxidativ crescut contribuie la modificarea oxidativa a proteinelor, lipidelor si ADN-ului
celular. Continutul de carbonili proteici constituie un indicator al oxidarii proteinelor in
conditii de stres oxidativ. Proteinele carbonilate pot fi implicate in senescenta celulara,
fapt dovedit recent in cazul fibroblastilor senescenti (Baraibar si colab., 2012).
Determinarea spectrofotometrica a carbonililor proteici in cortexul renal al hamsterilor
hipertensivi vs. control a dovedit cresterea modificarilor oxidative ale proteinelor la nivel
renal in grupul hamsterilor hipertensivi. Cresterea productiei de anioni superoxid si
modificarea oxidativa, prin carbonilare a proteinelor din cortexul renal al hamsterilor
hipertensivi pot contribui la inducerea senescentei celulelor glomerulare. La nivelul
celulelor glomerulare ale hamsterilor hipertensivi au fost evidentiate celule senescente,
pozitive pentru activitatea SA β-galactozidazei (SA-β-gal) la pH6.
Activarea p53 si a proteinei substrat, p21Cip1 contribuie la arestul ciclului celular in
faza G1 si inducerea senescentei celulare. In cortexul renal al hamsterilor hipertensivi si
control expresia proteica a p53 a fost crescuta la hipertensivi cu ~ 150% comparativ cu
cei control. Cresterea Exprimarea p53, a p21Cip1 si a p27Kip1 in cortexul renal al
hamsterilor hipertensivi au fost gasite crescute, ceea ce sugereaza oprirea ireversibila a
ciclului celular in faza G1, o caracteristica a senescentei celulare. Deasemenea
activarea protein kinazei AKT in glomerulii hamsterilor hipertensivi poate determina
acumularea de p53 si p21Cip1, contribuind la inducerea si stabilizarea senescentei
celulare in celulele glomerulare renale.
Asadar acest studiu a aratat ca senescenta celulara este indusa la nivelul
celulelor glomerulare in conditiile inhibarii cronice a NO, posibil datorita stresului
oxidativ crescut care activeaza calea de semnalizare intracelulara mediata de
AKT/p53/p21Cip1.
Exploatarea farmacologica a moleculelor implicate in inducerea senescentei
celulare in hipertensiune la nivel glomerular ar putea sta la baza dezvoltarii unor noi
strategii terapeutice de abordare a hipertensiunii arteriale.
In cel de-al treilea studiu, intitulat „Implicarea efectului antioxidant al
Zofenopril in restabilirea disfunctiilor glomerulare induse de inhibarea cronica a
sintezei de NO” am urmarit mecanismele moleculare asociate actiunii antioxidante a
Zofenopril la nivelul glomerilor renali, intr-un model experimental de hipertensiune
arteriala indusa cu L-NAME la sobolani Wistar. Rinichii au un rol critic in mentinerea
presiunii sanguine in limite normale, iar cresterea tensiunii arteriale duce la boala
cronica renala. Stresul oxidativ crescut reprezinta un mediator cheie in agravarea
leziunilor renale asociate hipertensiunii. Sursa principala de ROS in rinichi este NADPH
oxidaza, enzima alcatuita din doua subunitati ancorate in membrana (gp91phox si
p22phox) si patru subunitati citoplasmatice (p40phox, p47phox, p67phox si NOX; Wiliams si
colab., 2007). In functie de nivelul de ROS sunt activati diferiti factori de transcriptie
redox-senzitivi. O cantitate semnificativa de ROS declanseaza un raspuns inflamator
prin activarea NFkB si AP-1 (Reuter si colab., 2010). Zofenoprilul, un inhibitor al
enzimei de conversie a angiotensinei, care blocheaza transformarea angiotensinei I in
angiotensina II si duce la scaderea presiunii sanguine, are capacitate de chelatare a
radicalilor liberi datorita unei grupari sulfhidril libere, ceea ce ii confera proprietati anti-
oxidante. In literatura de specialitate sunt putine datele referitoare la efectele Zofenopril
la nivel renal in conditii de stres oxidativ crescut. in acest studiu experimentele au fost
efectuate folosind sobolani Wistar, masculi, in varsta de 3 luni, grupati in: 1) HT, grupul
sobolanilor hipertensivi carora li s-a administrat L-NAME (50 mg/kg corp/zi) in apa de
baut timp de 12 saptamani; 2) HTZ, grupul sobolanilor hipertensivi care au primit
L-NAME (50 mg/kg corp/zi) 12 saptamani, iar in ultimele 4 saptamani de tratament li s-a
administrat, concomitent cu L-NAME, Zofenopril (15mg/kg corp/zi); si 3) C, grupul
control format din sobolani de aceeasi varsta cu cei din grupurile HT si HTZ, carora nu li
s-a administrat L-NAME sau Zofenopril. Am investigat: a) alterarile glomerulare induse
de administrarea cronica de L-NAME sobolanilor Wistar, b) productia de anioni
superoxid si expresia subunitatilor NADPH oxidazei - ca principala sursa de O2.- in
cortexul renal de la sobolanii hipertensivi, c) modificarile oxidative ale proteinelor, prin
cuantificarea nivelelor carbonililor proteici, d) expresia subunitatilor NF-kB modulate de
speciile reactive de oxigen, si e) nivelele de glutation redus (GSH) si oxidat, precum si
activitatea glutation peroxidazei (GPx) pentru aprecierea eficientei sistemului
antioxidant intracelular, raportul GSH/GSSG fiind un indicator sensibil al starii redox.
Rezultatele studiului nostru au aratat ca:
- Administrarea de L-NAME sobolanilor Wistar (grupul HT) a determinat: 1) cresterea
presiunii arteriale si a activitatii enzimei de conversie a angiotensinei; 2) modificari
ultrastructurale ale celulelor endoteliale si podocitelor din glomerulii sobolanilor HT
(inclusiv pierderea fenestrelor, pierderea sporadica a diafragmei de filtrare a podocitelor
si uneori fuziunea pedicelelor), modificari ce afecteaza proprietatile barierei de filtrare
glomerulara; 3) cresterea productiei de O2.- la nivelul cortexului renal de la sobolanii
HT; 4) cresterea stresului oxidativ, evidentiata prin nivelele crescute ale carbonililor
proteici - ca marker de oxidare a proteinelor si prin activarea NF-kB - ca si cale de
semnalizare intracelulara redox-senzitiva in cortexul renal al sobolanilor HT;
5) scaderea capacitatii antioxidante la nivelul cortexului renal de la sobolanii HT
apreciata pe baza scaderii GSH si a diminuarii activitatii GPx .
- Administrarea de Zofenopril sobolanilor cu hipertensiune indusa cu L-NAME a avut
efect benefic asupra modificarilor ultrastructurale si a determinat redresarea catorva
componente ale stresului oxidativ: concentratia de O2.-, expresia proteica a subunitatilor
NADP(H) oxidazei (p22phox, NOX1, p47phox, p67phox), exprimarea proteica subunitatilor
NFkB p50 si, respectiv p65, precum si reducerea carbonilarii proteinelor.
In concluzie Zofenopril administrat sobolanilor cu hipertensiune arteriala
indusa cu L-NAME are efecte renoprotectoare, contribuind la scaderea stresului oxidativ
local, respectiv la atenuarea modificarilor cauzate de acesta si restabilind capacitatea
antioxidanta a sistemului glutation/glutation peroxidaza la nivelul cortexului renal.
CONCLUZII GENERALE
Imbatranirea fiziologica determina modificarea morfologica si functionala a tuturor
organelor, inclusiv a rinichilor. In ultimul deceniu fenotipului imbatranirii a fost asociat
cu acumularea in tesuturi a celulelor senescente. Componentele secretate de celulele
senescente induc alterari ale structurii si functiei tesutului, contribuind astfel la disfunctia
tisulara asociata imbatranirii.
Rezultatele obtinute in studiile noastre au dovedit prezenta celulelor senescente
la nivelul glomerulului renal la hamsterii batrani si la hamsterii cu hipertensiune arteriala
indusa prin inhibarea cronica a sintezei oxidului nitric. Experimentele efectuate pe
cortex renal de la hamsterii batrani si de la hamsterii hipertensivi sugereaza ca
senescenta celulelor glomerulare este asociata disfunctiei mitocondriale si contribuie la
atenuarea, sau disfunctia autofagiei, in special la nivelul podocitelor. Datele obtinute de
noi dovedesc faptul ca stresul oxidativ si oprirea ireversibila a ciclului celular in faza G1
sunt doua dintre etapele cheie in inducerea senescentei celulare la nivelul glomerulului
renal, atat in imbatranire cat si in hipertensiune. Mecanismele moleculare care mediaza
aceste doua procese sunt diverse si depind de contextul in care sunt activate. Activarea
supresorului tumoral redox-senzitiv p53 joaca rol cheie in medierea semnalelor de
inducere a senescentei celulare in conditii de stres oxidativ crescut. Mecanismele
celulare si moleculare implicate in inducerea senescentei celulare in celulele
glomerulului renal in imbatranire si hipertensiune nu sunt complet descifrate, de aceea
studiile cuprinse in aceasta lucrare vin in sprijinul aspectelor existente in literatura de
specialitate care abordeaza acelasi subiect.
BIBLIOGRAFIE
Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, LeBrasseur NK, Childs BG, van de Sluis B, Kirkland
JL, van Deursen JM (2011). Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays
ageing-associated disorders. Nature, 479: 232–236.
Passos JF, Nelson G, Wang C, Richter T, Simillion C, Proctor CJ, Miwa S, Olijslagers
S, Hallinan J, Wipat A, Saretzki G, Rudolph KL, Kirkwood TB, et al (2010). Feedback
between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Mol.
Syst. Biol., 6: 347.
Davalos AR, Kawahara M, Malhotra GK, Schaum N, Huang J, Ved U, Beausejour CM,
Coppe J-P, Rodier F and Campisi J (2013) p53-dependent release of Alarmin HMGB1
is a central mediator of senescent phenotypes JCB 201(4): 613-629
Velarde MC, Flynn JM, Day NU, Melov S, Campisi J (2012). Mitochondrial oxidative
stress caused by Sod2 deficiency promotes cellular senescence and aging phenotypes
in the skin. AGING, 4 (1): 3-12.
Hardie DG (2011). Amp-activated protein kinase: an energy sensor that regulates all
aspects of cell function. Genes Dev., 25: 1895–1908.
Zhong W, Zou G, Gu J, Zhang J (2010). L-arginine attenuates high glucose-accelerated
senescence in human umbilical vein endothelial cells. Diabetes Res. Clin. Pract., 89:
38-45
Williams HC, Griendling BS, Griendling KK (2007). NADPH oxidase inhibitors: new
antihypertensive agents? J. Cardiovasc. Pharmacol., 50 (1): 9 – 16
Reuter S, Gupta S, Chaturvedi M, Aggarwal B (2010). Oxidative stress, inflammation,
and cancer: How are they linked? Free Radical Biology and Medicine, 49 (11): 1603–
1616.
Baraibar MA, Liu L, Ahmed EK, Friguet B (2012) Protein oxidative damage at the
crossroads of cellular senescence, aging, and age-related diseases. Oxid Med Cell
Longev, 2012: 919832