-
ปญหาพิเศษ
การสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาเพื่อนาํมาใชเปนสียอมTHE PIGMENT
EXTRACTION FROM SPIRULINA PLATENSIS
FOR DYE PURPOSE
นางสาวพรทิพย อนันต
สายวิชาวิทยาศาสตร
คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตรมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
พ.ศ. 2551
-
ใบรับรองปญหาพิเศษสายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
วิทยาศาสตรบัณฑิตปริญญา
วิทยาศาสตรชีวภาพ วิทยาศาสตร สาขา สายวิชา
เรื่อง การสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาเพื่อนํามาใชเปนสียอมThe
Pigment Extraction from Spirulina platensis for Dye Purpose
นามผูวิจัย นางสาวพรทิพย
อนันตไดพิจารณาเห็นชอบโดยประธานกรรมการ
( ผูชวยศาสตราจารย ศิริลักษณ เอี่ยมธรรม )กรรมการ
( อาจารย วันเพ็ญ เหลาศรีไพบูลย )
สายวิชาวิทยาศาสตร
คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตรมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตรรับรองแลว
( อาจารย ศลยา สุขสอาด )
หัวหนาสายวิชาวิทยาศาสตรวันที่ เดือน พ.ศ.
-
ปญหาพิเศษ
การสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาเพื่อนาํมาใชเปนสียอมTHE PIGMENT
EXTRACTION FROM SPIRULINA PLATENSIS
FOR DYE PURPOSE
นางสาวพรทิพย อนันต
สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตรเพื่อความสมบูรณแหงปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต
(วิทยาศาสตรชีวภาพ)
พ.ศ. 2551
-
พรทิพย อนันต 2551:
การสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาเพื่อนํามาใชเปนสียอม
ปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต(วิทยาศาสตรชีวภาพ) สาขาวิชาวิทยาศาสตรชีวภาพ
สายวิชา วิทยาศาสตร ประธานกรรมการที่ปรึกษา: ผูชวยศาสตราจารยศิริลักษณ
เอี่ยมธรรม, Ph.D. 65 หนา
วัตถุประสงคของการศึกษาครั้งนี้คือ
ศึกษาวิธีการสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาเพื่อนํามาใชเปนสียอม
สาหรายสไปรูลินาเจริญอยูในอาหารเหลวสูตร Zarrouk ที่อุณหภูมิ 27-32
องศาเซลเซียส pH 9-11 พบวาชวงเวลา 4 สัปดาหของการเลี้ยงสาหราย
ความหนาแนนของเซลล
ปริมาณน้ําหนักแหงเซลลและปริมาณคลอโรฟลลมีปริมาณเพิ่มขึ้นและสาหรายมีการเจริญสูงสุดในวันที่
18 ของการเลี้ยง
การสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินานั้นใชอัตราสวนเซลลสาหรายสดตอตัวทําละลายหลายชนิดในอัตราสวน
1 กรัม:10 มิลลิลิตร เขยาที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ชวงเวลา 24, 48
และ 72 ชั่วโมง พบวาตัวทําละลายที่ใช CaCl2 ความเขมขน 0.1 และ 0.09
โมลาร ไดปริมาณไฟโคไซยานินสารสีน้ําเงินออน
และเมื่อใชอัตราสวนเซลลสาหรายสดตอตัวทําละลาย 1 กรัม:5 มิลลิลิตร
แชแข็งแลวละลาย พบวา CaCl2 ความเขมขน 0.1 และ 0.09 โมลาร 50
มิลลิโมลาร ฟอสเฟสบัฟเฟอรpH 6.8 และเอนไซมไลโซไซม
ไดปริมาณไฟโคไซยานินสารสีน้ําเงิน สวนตัวทําละลายชนิดอื่นไดสารสีเขียว
เมื่อนําสารสกัดสีไปยอมเซลลรากหอมพบวาสารสีที่ผานการระเหยตัวทําละลายออกจะติดเซลลดีกวาสารสีที่ไมไดระเหยตัวทําละลาย
ซึ่งบริเวณที่ติดสีที่เห็นสวนใหญจะเปนไซโตพลาสซึมและนิวเคลียส
นอกจากนี้ยังไดนําสาหรายมาทําเปนแชมพูผสมสไปรูลินากลิ่นมะนาวและไดทดสอบคุณลักษณะของแชมพูผสมสไปรูลินาตามมาตรฐานผลิตภัณฑ
มอก. ไดแก การทดสอบลักษณะทั่วไป การทดสอบความคงสภาพ
การทดสอบปริมาณจุลินทรียและทดสอบคาความเปนกรด-ดาง
พบวาแชมพูผสมสาหรายผานเกณฑมาตรฐานของมอก.
และเมื่อทดสอบคุณภาพแชมพูผสมสาหรายในดานการขจัดสิ่งสกปรกฝุนละอองบนเสนผม
หนังศีรษะและความสามารถที่ทําใหผมนุมลื่นหวีและจัดทรงงายพบวาอยูในระดับปานกลาง
______________________ ____________________________
_____/____/____ ลายมือชื่อนิสิต ลายมือชื่อประธานกรรมการ
-
Porntip Anan 2008: The Pigment Extraction From Spirulina
platensis For Dye Purpose. Bachelor of Science (Biological
Science), Major Field: Biological Science, Department of Science.
Special Problems Advisor: Associate Professor Siriluck Iamtham,
Ph.D. 65 Pages
Attempts were made to culture Spirulina platensis to achieve the
optimization of phycocyanin extraction from the algae. Spirulina
platensis was cultured in Zarrouk medium at 25-37 0C, pH 9-11. The
density, dry weight and chlorophyll content were gradually
increased in the four weeks of the cultivation. Excellent algae
growth occurred around the 18th day of the culture. The extraction
of pigment from Spirulina platensis were performed by using
different solvents at a ratio of 1 g algae: 10 ml of each solvent.
All of the mixed solutions were shaked at 300C for 24, 48 and 72
hours. The result showed that the CaCl2 0.1 and 0.09 M solvent have
an ability to extract the phycocyanin blue pigment from the algae.
The methodology of freeze and thaw of algae cells in different
solvents at ratio of fresh algae 1 g: 5 ml solvent was use as an
alternative method. The optimum condition of the extraction of the
blue phycocyanin from Spirulina platensis were the extract with the
CaCl2 0.1 0.1 and 0.09 M concentrated, 50 mM phosphate buffer pH
6.8 and lysozyme. Meanwhile, the green pigments were extracted from
other solvents. The pigment extract from Spirulina platensis has
been used mainly as a chromosome dying. It was concluded that the
pigment, with extract by solvent evaporation, was able to penetrate
to the cell better than that pigment without solvent evaporate. In
particular, we can harvest the Spirulina platensis and used it as
an ingredient of lemon flavor shampoo. The properties
andcharacteristic of the shampoo were evaluated follow the Thai
industrial standard. Those properties included: general
characteristic, stability of the shampoo, the contamination of the
microorganism and pH condition. Result showed that the incorporated
Spirulina platensis shampoo pass all the criterions of the Thai
industrial standard. The quality of shampoo was assessed follow the
criterion of the cleanness of hair and head and the smoothly and
easy manage hair styles. It can conclude that the incorporated
Spirulina platensis shampoo were moderlately satisfy.
______________________ ___________________________
_____/_____/_____ Student’s signature Advisor’s signature
-
กิตติกรรมประกาศ
ผูวิจัยขอกราบขอบพระคุณผูชวยศาสตราจารยศิริลักษณ เอี่ยมธรรม
ประธานกรรมการที่ปรึกษาและอาจารยวันเพ็ญ เหลาศรีไพบูลย
กรรมการที่ปรึกษาปญหาพิเศษ ที่ไดกรุณาใหคําปรึกษาแนะนํา
และตรวจแกไขรายงานปญหาพิเศษฉบับนี้ใหสําเร็จลุลวงไปดวยดี
ขอขอบคุณเจาหนาที่สาขาวิชาพันธุศาสตร สาขาวิชาเคมี
พี่ปริญญาโทสาขาเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร นางสาวปยนารถ ศรชัย
ที่ใหความรูในดานการใชอุปกรณตางๆในหองปฏิบัติการ
ตลอดจนใหความชวยเหลือและอํานวยความสะดวกในการทําปญหาพิเศษในครั้งนี้
ขอกราบขอบพระคุณบิดา มารดา ญาติพี่นองทุกทาน
ที่ใหกําลังใจและสนับสนุนเปนอยางดีจนกระทั่งสําเร็จการศึกษา
ทายที่สุดขอขอบคุณเพื่อนๆ พี่ๆและนองๆทุกคน
ที่เปนกําลังใจมาโดยตลอด
พรทิพย อนันตพฤษภาคม 2551
-
(1)
สารบัญ
หนา
สารบัญ (1)สารบัญตาราง (2)สารบัญภาพ (3)คํานํา 1วัตถุประสงค
2การตรวจเอกสาร 3อุปกรณและวิธีการ
อุปกรณ 13วิธีการ 15
ผลและวิจารณผลการทดลอง 20วิจารณ 38
สรุปขอเสนอแนะสรุป 42ขอเสนอแนะ 43
เอกสารอางอิง 44ภาคผนวก 48ประวัติการศึกษา 66
-
(2)
สารบัญตาราง
ตารางที่ หนา
1 ปริมาณรงควัตถุชนิดตางๆ ในสาหรายสไปรูลินาเมื่อเปรียบเทียบกับ
สาหรายคลอเรลลา 6
2 ลักษณะของสารสกัดที่ไดจากการสกัดสารสีสาหรายสไปรูลินาดวย
ตัวทําละลายชนิดตางๆ แลวนําไปเขยาที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส 23
3 ลักษณะของสารสกัดที่ไดจากการสกัดสารสีสาหรายสไปรูลินาดวย
ตัวทําละลายชนิดตางๆ โดยการแชแข็งแลวละลายที่อุณหภูมิ 40 และ 60
องศาเซลเซียส 26
4 ผลการติดสีของเซลลรากหอมที่ยอมดวยสารสีที่สกัดไดจาก
สาหรายสไปรูลินา และสีสังเคราะหอะซีโตออรซีน 29 5
แสดงการเปลี่ยนแปลงคุณลักษณะที่เกิดขึ้นในผลิตภัณฑแชมพูสไปรูลินา
กอนและหลังการเก็บผลิตภัณฑ 35 6
ตารางบันทึกคะแนนคุณลักษณะในการใชงานของแชมพูสไปรูลินา 36
ตารางผนวกที่
ง1 ตารางบันทึกผลคาการวัดการเจริญเติบโตของสาหรายไปรูลินาชวง
ระยะเวลา 4 สัปดาห 59-60 จ1
แบบบันทึกผลการทดสอบความคงสภาพของผลิตภันฑแชมพูสไปรูลินา 62 จ2
หลักเกณฑใชการใหคะแนนคุณลักษณะในการใชงาน 63 จ3
แบบบันทึกผลหลักเกณฑการใหคะแนนคุณลักษณะในการใชงาน 64
-
(3)
สารบัญภาพ
ภาพที่ หนา
1 วงจรชีวิตของสาหรายสไปรูลินา 7 2 สภาวะการเลี้ยงสาหรายสไปรูลินา
20 3 กราฟแสดงคาการวัดความขุนของเซลลสาหรายสไปรูลินา
ที่ชวงการดูดกลืนแสง 560 และ 670 นาโนเมตร ระยะเวลา 4 สัปดาห 21 4
กราฟแสดงคาน้ําหนักแหงของสาหรายสไปรูลินา ในชวง ระยะเวลา 4 สัปดาห 21
5 กราฟแสดงคาการวัดปริมาณคลอโรฟลลของสาหรายสไปรูลินาใน ชวงระยะเวลา 4
สัปดาห 22 6
ลักษณะสารสีที่ไดจากการสกัดสาหรายสไปรูลินาดวยตัวทําละลายชนิดตางๆ
หลังจากเขยาที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส 24 7
ลักษณะสารสีจากการสกัดสาหรายสไปรูลินาดวยตัวทําละลายชนิดตางๆ
หลังการแชแข็งเพื่อนําไปละลายที่อุณหภูมิ 40 และ 60 องศาเซลเซียส 27 8
ลักษณะสารสีไฟโคไซยานินที่สกัดไดจากสาหรายสไปรูลินา 28 9
ลักษณะเซลลรากหอมที่ยอมดวยสารสีที่สกัดจากสาหรายสไปรูลินา
ซึ่งสกัดดวยตัวทําละลาย น้ํากลั่นและ NaCl 30 10
ลักษณะเซลลรากหอมที่ยอมดวยสารสีที่สกัดจากสาหรายสไปรูลินา
ซึ่งสกัดดวยตัวทําละลาย HCl ที่ความเขมขนตางๆ 31 11
ลักษณะเซลลรากหอมที่ยอมดวยสารสีที่สกัดจากสาหรายสไปรูลินา
ซึ่งสกัดดวยตัวทําละลาย CaCl2 และบัฟเฟอร 32 12
ลักษณะการยอมเซลลรากหอมดวยสีสังเคราะหอะซีโตออรซีน 33 13
ลักษณะสีของแชมพูสไปรูลินากลิ่นมะนาว 34 14
ลักษณะการแบงครึ่งผมของอาสาสมัคร 3 คน 36 15
กราฟแสดงระดับคะแนนของความพึงพอใจที่มีตอแชมพูสไปรูลินากลิ่นมะนาว
37
-
1
การสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาเพื่อนํามาใชเปนสียอม
The Pigment Extraction from Spirulina platensis for Dye
Purpose
คํานํา
ปจจุบันประเทศไทยไดมีการศึกษาและนําสาหรายสไปรูลินามาใชใหเกิดประโยชนมากมาย
ไมวาจะเปนการบริโภคโดยตรงและการใชในทางอุตสาหกรรม
ผลิตภัณฑท่ีไดจากสาหรายสไปรูลินามีหลายรูปแบบ เชน
ผลิตภัณฑอาหารเสริมเพ่ือสุขภาพ เปนสวนประกอบของเคร่ืองสําอาง
หรือผลิตยาเพื่อสรางภูมิคุมกันแกรางกาย
รวมท้ังเปนสวนประกอบในวุนและเยลล่ี
ผสมในอาหารสัตวเพื่อเรงสีในปลาสวยงาม
หรือการใชสาหรายสไปรูลินาเพื่อบําบัดคุณภาพน้ําในโรงงานอุตสาหกรรมและนากุง
(สรวิศ, 2543)
จากการที่สาหรายสไปรูลินามีประโยชนมากมายหลายดานและมีการเจริญท่ีรวดเร็ว
อีกท้ัง
ในสภาวะปจจบัุนมีการใชสารเคมีสังเคราะหเพื่อใชเปนองคประกอบเคร่ืองอุปโภคและบริโภคตางๆ
เชน อาหาร ยารักษาโรค เคร่ืองสําอาง ไดมีการนําพืชสมุนไพรตางๆ
มาใชเสริมหรือทดแทนในกระบวนการผลิตเคร่ืองอุปโภค
บริโภคจนมีปริมาณลดลงอยางรวดเร็ว
การใชสาหรายสไปรูลินาจึงนาจะนํามาใชแกปญหาได
โดยมีการนําเอามาใชประโยชนในดานตางๆ
มากข้ึนเพราะมีคุณคาทางอาหารมากมายและมีสารสีท่ีเดนเฉพาะตัว
งานวจิัยนี้มีความสนใจเก่ียวกบัสาหรายสไปรูลินา คือ
ทําการเพาะเล้ียงใหมีระดับการเจริญเติบโตสูงสุดและใหไดปริมาณมากท่ีสุด
เพือ่นํามาสกัดสารสี ถาสารสีท่ีไดมีคุณภาพดี
จะมีการนํามาใชเปนสียอมทางชีวภาพ
หรือนําสาหรายสไปรูลินาไปประยุกตใชในดานอ่ืนๆ ตอไป
ซ่ึงขอมูลงานวิจยัท่ีไดอาจเปนขอมูลพื้นฐานของการพัฒนาการวจิัยในระดบัท่ีสูงกวาในอนาคต
-
2
วัตถุประสงค
1.
ศึกษาปจจัยในการเล้ียงสาหรายสไปรูลินาท่ีเหมาะสมเพ่ือใหสาหรายมีระดับการเจริญเติบโตสูงสุด
2. ศึกษาการสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินา
เพื่อใชเปนสียอมทางชีวภาพหรือการ
นําไปใชประโยชนดานอ่ืนๆ
-
3
การตรวจเอกสาร
“สาหราย” ตรงกับภาษาอังกฤษวา “Algae” (อานวา แอล-จี) ซ่ึงเปนพหพูจน
สวนเอกพจน คือ “Alga” (อานวา แอล-กา) แปลวา วัตถุท่ีมีคานอย (Object
of little value) มีการนําคําวา “สาหราย” มาใชกับส่ิงมีชีวติท่ีไมมีตน
ราก และใบ มีลักษณะงายๆ เปนทอนหรือดุนหรือทัลลัส (Thallus) คือ
มีตั้งแตเซลลเดียว (Unicellular) ซ่ึงเปนชนดิท่ีงายท่ีสุด
จนกระท่ังถึงชนิดเชิงซอนและมีขนาดใหญ ประกอบดวยเซลลเปนจํานวนมาก
สาหรายมีแบบแผนการสืบพันธุท่ีแตกตางกันอยางหลากหลาย
สาหรายเปนส่ิงมีชีวิตท่ีสรางอาหารไดเองโดยการสังเคราะหแสงเชนเดียวกับพืชช้ันสูง
(วันเพ็ญ, 2549) 1. ลักษณะทางชีววิทยาของสาหรายสไปรูลินา
ลักษณะของสาหรายสไปรูลินาเปนเสนสายประกอบไปดวยเซลลท่ีเรียงตอกัน
ไมแตกแขนง เรียกเสนสายนีว้า ทรัยโคม (trichome) เสนสายนีบิ้ดเปนเกลียว
ลักษณะของเกลียวแตกตางไปตามสปชีส ขนาดความยาวประมาณ 300-500 ไมโครเมตร
ความกวางประมาณ 8 ไมโครเมตร
เดิมนักวิทยาศาสตรท่ีสนใจเกีย่วกับสาหรายจดัใหสาหรายสไปรูลินาเปนสาหรายเซลลเดียว
เนื่องจากมองเห็นผนังเซลลของแตละเซลลท่ีมารวมกันเปนเสนสายไมชัด
แตตอมาดวยการใชกลองจุลทรรศนกําลังขยายสูงข้ึนกส็ามารถเห็นชัดวาทรัยโคมของสาหรายสไปรูลินาประกอบไปดวยเซลลหลายเซลลมาตอกัน
ผนังเซลลเปนผนังหลายช้ัน ประกอบดวยสารมิวโคโปรตีนและเพคตนิ
ช้ันนอกเปนสารโพลีแซคคาไรด มีแวคคิวโอล (Vacuole)
ขนาดใหญทําใหลอยน้ําได นิวเคลียสไมมีเยื่อหุม
กรดนิวคลีอิคกระจายอยูท่ัวเซลล ตัวเซลลไมไดปกคลุมดวยเยื่อเมือก
(mucous membrane) เหมือนสาหรายสีเขียวแกมนํ้าเงินท่ัวไป
ผิวของเซลลไมมีจุลินทรียมาเกาะ มีความสามารถในการตานทานจุลินทรียสูง
และยังตานทานตอรังสีอุลตราไวโอเลตสูง
การเคล่ือนท่ีของสาหรายสไปรูลินาจะเปนแบบควงสวานและเปนคล่ืน (ยวุด,ี
2546)
-
4
การสืบพันธุของสาหรายสไปรูลินาจะมีเฉพาะแบบไมอาศัยเพศ
โดยการขาดออกเปนทอน(Fragmentation)
และทอนท่ีขาดไปนี้สามารถแบงเซลลใหมทําใหทรัยโคมยืดยาวออกได
เสนสายของสาหรายสไปรูลินาอาจยาวบาง ส้ันบาง
ข้ึนอยูกับอายแุละความอุดมสมบูรณ
ความเปนเกลียวบางคร้ังบิดชัดเจนสวยงาม หรือคลายออกคลายเสนตรง
ซ่ึงข้ึนอยูกับปจจัยการเพาะเล้ียง อาจจะเปนความอุดมสมบูรณของอาหาร แสง
อุณหภูมิ หรือ pH (ยุวด,ี 2549) การจัดจําแนกสาหราย Spirulina
platensis ในแงของอนกุรมวิธานไดยึดตามหลักของ Bold and Wynne (1978)
และ Venkataraman(1983) ซ่ึงไดจัดไวดังนี ้
Kingdom Monera Division Cyanophyta
Class Cyanophyceae Order Oscillatoriales
Family Oscillatoriaceae Genus Spirulina
Species Spirulina platensis 2. รงควัตถุของสาหรายสไปรูลินา
2.1 ไฟโคไซยานิน (Phycocyanin) เปนโปรตีนท่ีสีน้ําเงิน
ประกอบดวยธาตุแมกนีเซียมกับธาตุเหล็กจึงทําใหเห็นสาหรายสไปรูลินาเปนสีน้ําเงินเขมเมื่อรวมกับคลอโรฟลลซ่ึงเปนสีเขียว
บางคร้ังเรียกกนังายๆวา สาหรายน้ําเงิน-เขียว (Blue Green Algae)
ไฟโคไซยานินมีความเขมขนถึงรอยละ 14 โดยนํ้าหนัก
ซ่ึงไฟโคไซยานินจะมีแตในสาหรายสไปรูลินาเทานั้น ในสาหรายคลอเรลลา
(Chlorella)
ซ่ึงเคยเปนสาหรายท่ีนิยมบริโภคจะไมมีไฟโคไซยานินจึงไมมีสีน้ําเงินอยูดวย
สมศักดิ,์ 2547 (ตารางท่ี 1) นอกจากน้ียังมี ซี- ไฟโคไซยานิน
ซ่ึงจดัอยูในพวกรงควัตถุประกอบประเภทไฟโคบิลิน (phycobilin)
รงควัตถุประกอบประเภทนี้แบงออกเปนกลุมยอยไดอีกคือ ซี-
แอลโลไฟโคไซยานิน (c-allophycocyanin) และซี-ไฟโคอิริทริน
(c-phycoerythrin)
(การมีอักษรซีนําหนาเปนการช้ีวาเปนรงควตัถุท่ีอยูในสาหรายสีเขียวแกมนํ้าเงิน)
ไฟโคบิลินมีไนโตรเจนเปนสวนประกอบท่ี
-
5
ละลายไดดใีนน้ํา ไฟโคบิลินแตละชนดิจะอยูรวมกับโปรตีนอยางใกลชิดมาก
กลายเปนสารประกอบเชิงซอนเรียกวา ไฟโคบิลินโปรตีน ในสาหรายสไปรูลินา
ซี- ไฟโคไซยานิน จะอยูรวม
กับไฟโคบิลินโปรตีนชนิดอ่ืนๆ (ท่ีสําคัญคือ ซี- แอลโลไฟโคไซยานิน)
กลายเปน
สารประกอบเชิงซอนท่ีมีขนาดโมเลกุลใหญข้ึน เรียกวา ไฟโคบิลิซัม
(phycobilisomes) ซ่ึงจะเกาะอยูบนผิวดานนอกของไทลาคอยด (thylakoid)
ภายในไทลาคอยดมีคลอโรฟลลเอบรรจุอยู
ไฟโคบิลิซัมทําหนาท่ีรับพลังงานรังสีจากแสงแลวสงใหแกคลอโรฟลลเอ
จากการท่ีทําหนาท่ีเปนรงควัตถุประกอบ ทําใหไฟโคบิลิซัมมีปริมาณลดลง
เม่ือความเขมแสงเพ่ิมข้ึน ซ่ึงสอดคลองกันรายงานของ Myers และ Kratz
ท่ีพบวา ไฟโคไซยานินจะมีปริมาณมากข้ึนเม่ือมีแสงจํากัด
นอกจากนี้ในสาหรายสีเขียวแกมน้ําเงินยังมีไฟโคไซยานินเปนแหลงสะสมไนโตรเจนซ่ึงจะใหธาตุไนโตรเจนแกเซลลสาหรายในยามท่ีขาดแคลนธาตุไนโตรเจน
(สุมาลี, 2535)
2.2 คลอโรฟลล (Chlorophyll) คลอโรฟลลเปนรงควัตถุสีเขียว
ซ่ึงเปนตัวสําคัญในการ
สังเคราะหแสง คลอโรฟลลมีหลายชนิด ไดแก คลอโรฟลล เอ บี ซี ดีและอี
แตคลอโรฟลลในสาหรายสีเขียวแกมนํ้าเงินเปนคลอโรฟลลเอเทานั้น
คลอโรฟลลเอจัดเปนรงควัตถุสังเคราะหแสงข้ันตน
สามารถดูดกลืนแสงดวยตัวเอง
สวนคลอโรฟลลอ่ืนๆจัดเปนรงควัตถุสังเคราะหแสงข้ันสอง
ซ่ึงทําหนาท่ีดดูพลังงานรังสีจากแสงแลวสงตอไปใหคลอโรฟลลเอ
คลอโรฟลลเปนสารประกอบอินทรียชนิดหนึ่ง ไมละลายในนํ้า
แตละลายในตวัทําละลายท่ีเปนสารอินทรีย
ปริมาณคลอโรฟลลท่ีพบในสาหรายท่ัวไปปกติมีปริมาณ 0.5-1.5%
ของนํ้าหนกัแหง และสามารถเพ่ิมสูงไดถึง 6%
ในสาหรายท่ีเล้ียงไวในท่ีมีแสงออนๆ
คลอโรฟลลเอเปนดัชนีอยางหนึ่งในการแสดงมวลสาหราย
โดยมีความสัมพันธโดยตรงกับปริมาณมวลสาหราย ปริมาณคลอโรฟลลเอจะผันแปรได
ข้ึนอยูกับปจจยัหลายประการ ไดแก ความเขมแสง ปริมาณไนโตรเจนในอาหาร
อายุเซลลสาหราย และปจจัยทางฟสิกสอ่ืนๆ
2.3 เบตา-แคโรทีน ( -carotene)
เปนรงควัตถุท่ีไมสามารถสังเคราะหไดโดยสัตวแต
สามารถสังเคราะหไดโดยพืชและจุลินทรีย
เบตา-แคโรทีนเปนแหลงวิตามินของมนุษย รางกายเราจะเปล่ียนเบตา-แคโรทีน
เปนวิตามินเม่ือตองการ สาหรายสไปรูลินาเปนอาหารท่ีมีเบตา-แคโรทีนสูง
Berton and Ingold (1984) รายงานวา
เบตา-แคโรทีนสามารถจับกับอนุมูลอิสระ peroxyl
โดยเฉพาะในสภาวะท่ีมีปริมาณออกซิเจนตํ่า
สมบัติการตานออกซิเดชันของเบตา-แคโรทีนข้ึนอยู
β
-
6
กับสมบัติในการจับ singlet oxygen และอนุมูลอิสระ peroxyl
ซ่ึงข้ึนกับโครงสรางของโมเลกุลและจํานวนพันธะคูของโมเลกุล (Sergio et
al., 1999) นอกจากน้ี
เบตา-แคโรทีนยังลดความเปนพิษของอนุมูลอิสระซ่ึงทําลายเซลลและนําไปสูโรคมะเร็ง
เนื่องจากสาหรายสไปรูลินามีเบตา-แคโรทีนอยูสูง
จึงมีการนําเอามาทดสอบถึงผลในการตานมะเร็งของเบตา-แคโรทีนและสารสกัดจากสาหรายสไปรูลินาท่ีมีตอกอนเนื้อรายในปากหนูพบวาสามารถลดท้ังจํานวนและขนาดของกอนเนื้อและทําใหกอนเนื้อหายไปได
(สมชาย, 2539) ตารางท่ี 1 ปริมาณรงควัตถุชนิดตางๆ
ในสาหรายสไปรูลินาเม่ือเปรียบเทียบกับสาหรายคลอเรลลา
รงควัตถุ สาหรายสไปรูลินา (มก./100 กรัมน้ําหนักแหง)
สาหรายคลอเรลลา
คลอโรฟลล 1,600 1,400 แคโรทีนอยด 400 200 แคโรทีน 170 - แซนโทฟลล
100 - คริพโตแซนทิน 55.6 - อีคินีโนน 43.9 - แซนทิน 31.6 -
ไฟโคไซยานิน 18,000 ไมมี
ท่ีมา : ยุวด ีพีรพรพิศาล (2546) 3. วงจรชีวิตของสาหรายสไปรูลินา
วงจรชีวิตของสาหรายสไปรูลินา (Richmond, 1986) เร่ิมจากไตรโคม
(Trichrome) ท่ีโตเต็มท่ีเปล่ียนแปลงเปนเซลลพิเศษท่ีเรียกวานิคริเดีย
(Necredia) หลังจากนั้น นิคริเดยีแตกออกเปนช้ินสวนเล็กๆ
หลายสายแตละสายประกอบดวย 2-4 เซลล เรียกแตละสายวา ฮอรโมโกเนีย
(Hormogonia) จากนั้นปลายทั้งสองดานของฮอรโมโกเนียคอยๆมวนเปนเกลียว
เซลลของฮอรโม
-
7
โกเนียเพิ่มจํานวนโดยวิธี Cell Fusion และเจริญตอไปเปนไตรโคม
ลักษณะเซลลของฮอรโมโกเนียมีสีซีดเพราะในไซโตพลาสซึมมีกรานูล (Granule)
นอย
แตเม่ือเจริญไปเปนไตรโคมท่ีโตเต็มท่ีภายในไซโตพลาสซึมจะมีกรานูลเพิ่มข้ึนทําใหเซลลมีสีเขียวแกมน้าํเงินมากข้ึน
(ภาพท่ี 1)
Hormogonia
Necredia
Trichrome ภาพท่ี 1 วงจรชีวิตของสาหรายสไปรูลินา ท่ีมา: Richmond
(1986) 4. การเพาะเลี้ยงสาหรายสไปรูลินา
การเพาะเล้ียงสาหรายสไปรูลินากลางแจง (Outdoor cultivation)
สถานท่ีเพาะเล้ียงควรอยูในสภาพแวดลอมเหมาะสม
สําหรับการเจริญเติบโตของสาหราย ปจจยัหลายอยางท่ีเกี่ยวของคือ
4.1 บอท่ีใชเพาะเล้ียงเปนวัสดุท่ีใชกอสรางตั้งแตอิฐ ดนิ ซีเมนต
ไปจนถึงพลาสติก PVC
ความสูงของน้ําในบอไมควรเกิน 20-50 เซนติเมตร
เพื่อท่ีแสงจะไดลอดผานถึงเซลลสาหรายท่ีอยูขางลางได ความสูงของบอไมเกิน
40-50 เซนติเมตร (สุรียวรรณ, 2536)
-
8
4.2
อาหารที่ใชในการเพาะเล้ียงสาหรายสไปรูลินาท่ีเปนตนแบบมาตรฐานหรือผลิตเพื่อ
การคาท่ีตองการผลิตภัณฑท่ีมีคุณภาพสูงคือ Zarrouk (Zarrouk’s
medium: traditional and international medium)
แตเนื่องดวยสารเคมีบางชนิดมีราคาสูง
จึงมีการปรับเปล่ียนมาใชสารอาหารจากน้ําท้ิงจากชุมชน
โรงงานอุตสาหกรรมบางประเภทและนํ้าหมักจากมูลสัตว
เม่ือตองการผลผลิตในปริมาณมากและตนทุนตํ่า (ยวุด,ี 2546) 4.3
แหลงคารบอน คารบอนจะปนอยูในน้าํในรูปคารบอนไดออกไซดละลายนํ้า
สําคัญคือ เปนสารประกอบท่ีสาหรายใชในการสังเคราะหแสง
เปนแหลงคารบอนท่ีสําคัญในการสรางเซลลของสาหราย ใน Zarrouk’s medium
ท่ีใชในการเพาะเล้ียงสาหรายสไปรูลินา แหลงคารบอนคือโซเดียมไบคารบอเนต
4.4 ความเขมขนเร่ิมตนมีความสัมพันธกับความเขมแสง
ถาความเขมขนเร่ิมตนของสาหรายต่ําแตความเขมแสงสูง
เซลลสาหรายจะเกดิการซีดจาง (Bleaching) และยังเปนการลดการสังเคราะหแสง
ถาความเขมขนเร่ิมตนสูงเกินไป
จะทําใหประสิทธิภาพในการหายใจและการใชพลังงานแสงลดลง
เนื่องจากเกิดการบังกนัเอง
ความเขมขนเร่ิมตนท่ีเหมาะสมตอการเพาะเล้ียงควรอยูระหวาง 225-250
มิลลิกรัม น้ําหนกัเซลลแหง/ลิตร 4.5 อุณหภูมิ
สาหรายสไปรูลินาสามารถเจริญเติบโตไดในระหวางชวงอุณหภูมิตั้งแต 15-50
องศาเซลเซียส แตจะเจริญไดดีท่ีสุดในอุณหภูมิ 32-42 องศาเซลเซียส
การเจริญจะลดลงเม่ืออุณหภูมิสูงกวา 44 องศาเซลเซียส
และจะตายถาอุณหภูมิสูงกวา 50 องศาเซลเซียส 4.6 การกวน (Agitation)
การกวนมีผลตอการเจริญทําใหสาหรายเจริญเติบโตดี
เปนการเพิ่มการกระจายตัวของสาหราย ใหไดรับแสงสมํ่าเสมอ
ชวยลดอัตราการตกตะกอนของสาหราย สารอาหารกระจายตัวอยางท่ัวถึง
ทําใหเซลลสาหรายดูดสารอาหารตางๆไปใชไดอยางมีประสิทธิภาพ
ปองกันไมใหเกิดความแตกตางของอุณหภมิูท่ีผิวน้ํา 4.7
ความเปนกรด-ดางในอาหารเพาะเล้ียง
ความเปนกรด-ดางของอาหารมีความสําคัญในการเพาะเล้ียงสาหราย
เพราะเปนตัวกําหนดความสามารถในการละลายของคารบอนไดออกไซดและแรธาตุอ่ืนๆ
ท้ังยังมีอิทธิพลโดยตรงและทางออมตอกระบวนการเมทาบอลิซึมของสาหราย
โดยท่ัวไปคาความเปนกรด-ดางท่ีเหมาะสมอยูในชวง 8.5-10.0
-
9
4.8 ความเค็ม
สาหรายสไปรูลินาเจริญไดในแหลงท่ีมีความเขมขนของเกลือโซเดียมคลอไรดสูงถึง
20-30 กรัมตอลิตร ชวงท่ีเหมาะสมท่ีสุดคือ 0-0.5 กรัมตอลิตร
ในทะเลสาบน้ําเค็มท่ีมีสาหรายสไปรูลินาเจริญอยู พบวามีความเค็มระหวาง
10-20 % ซ่ึงในทะเลจริงๆ มีความเค็มอยูเพยีง 3 % เทานั้น 4.9
ความเขมแสงเปนปจจยัท่ีมีผลตอการเจริญเติบโตของสาหราย ถาความเขมแสงสูง
เชน การเพาะเล้ียงสาหรายในท่ีมีแสงแดดจา
ความสามารถในการใชพลังงานแสงของสาหรายจะลดลง
ความเขมแสงและความลึกของบอมีผลตอความสามารถในการรับพลังงานแสงของสาหราย
ปริมาณแสงท่ีสองผานจะลดลงตามความลึกของบอ นั่นคือ
จะมีความลึกท่ีระดบัหนึ่งซ่ึงทําใหสาหรายใชพลังงานแสงไดดีท่ีสุด
ความเขมแสงท่ีเหมาะสมตอการเจริญของสาหรายสไปรูลินาเม่ือเพาะเล้ียงสภาพกลางแจงคือ
30-35 กิโลลักซ 4.10 การระเหยของนํ้าจะมีผลตอการเจริญเติบโตของสาหราย
ในการเพาะเล้ียงสภาพกลางแจงโดยเฉพาะในฤดูรอน (สุรียวรรณ, 2536) 5.
การวัดการเจริญเติบโตสาหรายสไปรูลินา 5.1 การนับเซลล (Cell counts)
เปนวิธีท่ีนยิมใชกนัมาก ในการวัดการเจริญเติบโตของสาหราย
อุปกรณท่ีใชคือกลองจุลทรรศนหัวกลับ (inverted microscope)
และสไลดนับเซลล (counting slide or counting chamber)
สไลดมีหลายชนดิใหเลือกใชตามความหนาแนนของตัวอยางและขนาดของเซลลในตัวอยางท่ีนับ
ชนิดท่ีนิยมใชคือ Sedgwick-Rafter counting chamber ความจุ 1
มิลลิลิตร Palmer Maloney chamber ความจุ 0.1 มิลลิลิตร
และสไลดนับเม็ดเลือด (haematometer หรือ haemacytometer) ความจุ 0.004
มิลลิลิตร 5.2 การวัดการกระจายของแสงหรือความขุน (Light scattering or
turbidity)
เปนวิธีท่ีนยิมมากท่ีสุดในการวัดการเจริญเติบโตของเช้ือสาหรายบริสุทธ์ิ
ขอดีของวิธีนี้ คือ วัดงายและสะดวก ขอมูลท่ีไดเปนคาของมวลชีวภาพ
(biomass) ท่ีเพิ่มข้ึนโดยวัดจากคาน้ําหนักแหง อุปกรณท่ีใช
-
10
เรียกวา colorimeter หรือ สเปกโตรโฟโตมิเตอร
ถาจํานวนเซลลไมหนาแนนนักจํานวนเซลลจะมีความสัมพันธแบบเรขาคณิตกับความเขมของแสง
กลาวคือ ความเขมของแสงจะลดลงเม่ือจํานวนเซลลเพิ่มข้ึน 5.3
การวัดน้าํหนักแหง (Dry weight measurement)
เหมาะกับสาหรายชนิดท่ีไมใชเซลลเดี่ยวท่ีนับจํานวนเซลลไมได
ฉะนั้นจึงนิยมใชกับสาหรายชนิดท่ีเปนเสน
วิธีวดัจะวัดทุกวันแลวนํามาเขียนกราฟ
เร่ิมการวัดโดยเก็บตัวอยางจากภาชนะเล้ียง
กอนเก็บควรกวนตัวอยางใหเขากนัดีเสียกอน
กรองสาหรายใหออกจากน้ําโดยการปนใหตกตะกอน (centrifugation) รินน้าํใสๆ
ขางบนออก นําตัวอยางไปอบแหง ถาใชเคร่ืองกรอง (membrane filter)
ควรลางสาหรายบนแผนกรองใหสะอาดปลอดจากเกลือหรือส่ิงปนเปอนดวยสารอาหารอยางเจือจางหรือน้ํากล่ันท่ีเปนกลาง
ไมควรลางสาหรายน้าํเค็มดวยน้ํากล่ันเพราะจะทําใหเซลลแตก
อุณหภูมิท่ีอบแหงประมาณ 70-110 องศาเซลเซียส นานประมาณ 10-12 ช่ัวโมง
หรือจนกวาน้ําหนกัจะคงที่ นําแผนกรองออกจากตูอบในโถดูดความชืน้
(desiccators) นาน 15-30 นาที
(ถาใสแผนกรองหรือเยือ่กรองในหลอดแกวควรนําหลอดแกวเขาตูอบพรอมตัวอยางดวย)
รายงานผลเปนน้ําหนักแหง/ปริมาตร
หรือพื้นท่ีของนํ้าท่ีทําการเก็บตัวอยางสาหราย 5.4 การวัดคลอโรฟลล
(Chlorophyll determination) เร่ิมแรกใหเก็บตัวอยางจากภาชนะเล้ียง
กรองเซลลหรือแยกเซลลออกโดยการปนใหตกตะกอน ตอจากนัน้จึงสกัดสารสี
(pigment) โดยเติมสารละลายเคมี ชนิดท่ีนยิมใชไดแก อะซิโตน เมทานอล
อีเทอร
เม่ือสกัดสารสีออกจากเซลลแลวใหกรองอีกคร้ังหนึ่งเพื่อกําจัดตะกอนและส่ิงปนเปอนออกใหหมด
นําสารละลายท่ีกรองไดใสในหลอดแกวท่ีใชสําหรับวัดคาคลอโรฟลล (ลัดดา,
2543)
นอกจากน้ีสาหรายหรือแพลงกตอนพืชยงัมีลักษณะการเจริญเติบโตในการเล้ียงซ่ึงจะแบงออกเปน
5 ระยะตางๆ ดังนี้ ระยะปรับตัว (Lag phase or inductional phase)
เปนระยะท่ีเซลลปรับตัวใหเขาส่ิงแวดลอมใหม เชน แสง อุณหภูมิ
และธาตุอาหาร ฯลฯ ระยะน้ีแพลงกตอนพืชไมมีการแบงเซลล ฉะนั้น
ถาเซลลไมสามารถปรับตัวไดจะตายลง
การท่ีจะผานระยะปรับตัวนี้เร็วมากหรือนอยข้ึนอยูกับความแข็งแรงของเซลล
และความอุดมสมบูรณของอาหารท่ีเล้ียง
ถาสภาพท้ังสองเหมาะสมจะเขาสูระยะตอไปเร็วข้ึน
-
11
ระยะเอกซโพเนนเซียล (Exponential phase or Log phase)
เปนระยะท่ีแพลงกตอนพืชเจริญเติบโตและแพรขยายพันธุอยางรวดเร็ว
ระยะน้ีจะนานเทาใดข้ึนอยูกับปริมาณสารอาหาร และคุณสมบัติทางฟสิกส เคมี
ของส่ิงแวดลอม เชน อุณหภูมิ ความเขมแสง ชวงแสงสวาง
รวมท้ังผลผลิตนอกเซลลของแพลงกตอนพืช สภาวะรวมของส่ิงแวดลอม
ลักษณะการเจริญเติบโต ในระยะนี้เปนแบบที่รวดเร็วในระยะแรก และคอยๆ
ชาลงตามลําดับ (ธิดา, 2542) ระยะเฉ่ือย (Retardation phase or phase
of declining relative growth)
เปนชวงท่ีมีการเจริญเติบโตชาลงเพราะขาดแคลนอาหาร เชน ไนโตรเจน เหล็ก
คารบอน หรือออกซิเจน เพราะปริมาณเซลลเกิดหนาแนนเกินไป การเสียสมดุลของ
pH เพราะเกดิแอมโมเนียข้ึนมาก
หรือแสงสวางลดลงเน่ืองจากเซลลเกดิการบังกันเอง (auto-shading)
วิธีแกไขใหการเจริญเติบโตเพิ่มข้ึนเปนปกติไดโดยการเติมธาตุอาหารที่ขาดแคลน
ถามีตะกอนของเฟอริคฟอสเฟต อาจแกไขโดยเติมสารอีเลเตอร เชน
โซเดียมอีดีทีเอ (NaEDTA) ลงไปละลายตะกอนเหล็ก
สวนการปองกนัการขาดแคลนคารบอนและออกซิเจนนัน้อาจทําไดโดยการเขยาภาชนะตลอดเวลา
หรือใชการพนอากาศ ซ่ึงนอกจากจะเพ่ิมคารบอนและออกซิเจนแลว
ยังชวยใหเกดิการผสมผสานของมวลน้ําในภาชนะเล้ียง
ทําใหเซลลไดรับแสงสวางโดยท่ัวถึงอีกดวย ระยะคงที่ (Stationary phase)
เปนระยะท่ีการเจริญเติบโตของแพลงกตอนพืชหยุดนิ่งเนื่องจากธาตุอาหารลดนอยลงและเกดิสารพิษจากกระบวนการเมทาบอลิซึม
หรือการสลายตัวของเซลลเพิ่มข้ึน ระยะตาย (Death phase)
เปนระยะท่ีเซลลหยุดการเจริญเติบโตโดยส้ินเชิงเนื่องจากธาตุอาหารหมดลง
เซลลจะเร่ิมตายและการตายจะเพ่ิมข้ึนเร่ือยๆ และรวดเร็วข้ึน
ฉะนั้นความสําเร็จของการเพาะเล้ียงคือ
ควบคุมการเล้ียงใหมีกราฟการเจริญเติบโตอยูในระยะเอกโพเนนเซียลนานท่ีสุดเทาท่ีจะทําได
(ลัดดา, 2543)
-
12
6. การใชประโยชนจากสาหรายสไปรูลินา 6.1
ใชเปนอาหารเสริมโปรตีนของมนุษย
สาหรายสไปรูลินาเปนอาหารเสริมท่ีมีคุณคาสูงและไดผานการทดลองอยางดีในดานการใชประโยชนทางการแพทยจากประเทศญ่ีปุน
ท้ังยังเปนผลิตภัณฑทางธรรมชาติท่ีมนุษยใชเปนอาหารอยางปลอดภัยมานานนบัพันป
ความเปนอาหารพิเศษนั้นมิไดเนื่องจากมีปริมาณโปรตีนสูงเพียงอยางเดยีว
หากยังมีกรดอะมิโนท่ีจัดเรียงกนัอยางไดสัดสวนสมดุลถึง 18
ชนิดและยังมีวิตามินท่ีมีคุณคาอีกมากมาย 6.2 ใชในดานการแพทย
มีการทดลองเกี่ยวกับคุณสมบัติในการลดโคเลสเตอรอล
ใชเปนยาเพื่อระงับการอยากอาหาร
ลดการดูดซึมสําหรับผูท่ีตองการลดความอวน สามารถควบคุมและรักษาโรคตางๆ
ไดแก โรคเบาหวาน โรคโลหิตจาง โรคตับอักเสบ โรคกระเพาะอาหารอักเสบ
รักษาผิวพรรณและรักษาแผล ชวยสรางภูมิคุมกนั และทําใหผมดกดําอีกดวย
(สมชาย, 2538) 6.3 ใชเปนอาหารเสริมโปรตีนสําหรับสัตว
คุณคาทางอาหารท่ีสูงของสาหรายสไปรูลินานี้สามารถดูดซึมไดงาย
จึงเหมาะสําหรับนํามาใชเปนอาหารลูกกุงและปลาวัยออน
ผลของการกินอาหารที่ผสมของสาหรายสไปรูลินา ทําใหปลามีสีดีข้ึน
อัตราการรอดดี
เพิ่มความสามารถในการตอบสนองตอเช้ือโรคของระบบภูมิคุมกัน (อมรรัตน และ
บุษกร, 2543) และยังมีการทดลองใชสาหรายสไปรูลินาเปนอาหารแกะดวย
(ณรงคศักดิ,์ 2533)
-
13
อุปกรณและวิธีการ
อุปกรณ
1. สาหรายสไปรูลินา เซลลสาหรายสไปรูลินา (Spirulina platensis)
ท่ีใชในการทดลองไดนํามาจากศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วทิยาเขตกําแพงแสน ปริมาตร 1 ลิตร 2.
อาหารเล้ียงเชื้อ 2.1 อาหารเหลว Zarrouk 2.2 อาหารเล้ียงเช้ือ TGY 3.
เคร่ืองมือ
3.1 เคร่ืองปมออกซิเจน (Aquarium air-pump, ACO-9905) 3.2
เคร่ืองผสมสาร (Mixer, Vortex genic 2) 3.3 เคร่ืองช่ังสาร (Precisa
1620 C) 3.4 หมอนึ่งความดันไอ (Autoclave, Tomy SS-325) 3.5
เคร่ืองปนเหวีย่ง (Centrifuge, Hettich Zentrifugen-EBA20) 3.6
เคร่ืองวัดสเปกโทรโฟโตมิเตอร (Spectrophotometer, T80 UV/Vis
spectrophometer) 3.7 เคร่ืองวัดความเปนกรด-ดาง (pH meter, Consort
C861) 3.8เคร่ืองอบ (Memmert) 3.9 เคร่ืองเขยา (Shaker, GyromaxTM
929) 3.10 เคร่ือง Rotary evaporator R-210 (Buchi, Switzerland) 3.11
กลองจุลทรรศน (Light microscope, Olympus: CHA-2) 3.12
อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ (Water bath, EDEL STAHL Rost frei) 3.13
ตูปลอดเช้ือ (ISSCO LAMINAR FLOW MODEL VS-124) 3.14 ตูบมเชื้อ
(Incubator, Memmert) 3.15 ตูแชแข็ง (Whirlpool)
-
14
4. อุปกรณ 4.1 อางเล้ียงปลา 4.2 ขวดรูปชมพู 4.3 สายยางและขอตอ 4.4
หัวทราย 4.5 เทอรโมมิเตอร 4.6 กระดาษฟอยด 4.7 ลูกปดแกว 4.8 กระดาษกรอง
4.9 สไลด 4.10 กระจกปดสไลด 4.11 สียอมอะซีโตออรซีน
4.12เข็มเข่ียปลายแบน 4.13 ปากคีบ 4.14 ตะเกยีงแอลกอฮอล 4.15
รากหอมท่ีแชน้ํายาคงสภาพ 4.16 กระดาษชําระ 4.17 หัวแชมพ ู4.18
น้ํากล่ัน 4.19 อุปกรณเคร่ืองแกว
5. สารเคมี 5.1 กรดไฮโดรคลอริก 5.2 เอนไซมไลโซไซม 5.3
แคลเซียมคลอไรด CaCl2 5.4 โซเดียมคลอไรด NaCl 5.5 สารละลายบัฟเฟอร
-
15
วิธีการ
1. การเล้ียงสาหรายสไปรูลินาใหมีการเจริญเติบโตสูงสุด
เตรียมอุปกรณท่ีจะเล้ียงสาหราย เชน อางเล้ียงปลา ขวดรูปชมพู
เคร่ืองปมออกซิเจน หัวทราย เตรียมอาหารเหลว Zarrouk ตามสูตร (ภาคผนวก
ก) ปรับ pH 9-11 ทําการเล้ียงสาหรายสไปรูลินาในอางเล้ียงปลา
ความสูงของอาหารเหลวไมเกนิ 15 เซนติเมตร ท่ีอุณหภูมิ 27-32
องศาเซลเซียส ทําการวัดการเจริญเติบโตดวยการเล้ียงในขวดรูปชมพูขนาด
1000 มิลลิลิตร จํานวน 3 ขวด ปริมาตร 500 มิลลิลิตร
ใชเซลลสาหรายตออาหารอัตราสวน 2 มิลลิลิตรตอ 10 มิลลิลิตร
1.1 วัดความหนาแนนของเซลลในขวดรูปชมพูท้ัง 3 ขวด
ท่ีคาการดูดกลืนแสง 560 นาโนเมตร (Sarada et al., 1999)
และท่ีคาการดูดกลืนแสง 670 นาโนเมตร (Silveira et al., 2007) ทุกๆ 24
ช่ัวโมงเปนเวลา 4 สัปดาห
1.2 การชั่งน้ําหนักแหงของเซลลสาหรายในขวดรูปชมพูท้ัง 3 ขวด
ช่ังน้ําหนกัทุกๆ 2 วัน
เปนเวลา 4 สัปดาห โดยตวงเซลลมาขวดละ 10 มิลลิลิตร
เทใสในถวยกระดาษฟอยดท่ีอบและทราบน้ําหนกัแลว นาํไปอบท่ีอุณหภูมิ 60
องศาเซลเซียสเปนเวลา 24 ช่ัวโมง
จากน้ันนาํไปช่ังน้ําหนกัสาหรายท่ีอบแลว
นําน้ําหนักหลังอบสาหรายไปลบกับน้าํหนักกระดาษฟอยดท่ีทราบน้ําหนกัจะไดปริมาณนํ้าหนกัแหงของสาหราย
บันทึกผลไวแลวนําไปพล็อตกราฟการเจริญเติบโต
1.3 การวัดปริมาณคลอโรฟลล ทําการวัดทุกๆ 2 วันเปนเวลา 4 สัปดาห
โดยตวงเซลลมา
ขวดละ 10 มิลลิลิตร นํามาปนเหวี่ยงเก็บเซลล ท้ิงสวนใส เติมเมทานอล
ปริมาตร 10 มิลลิลิตร ใสลูกปดแกว 5 เม็ด ตีเซลลดวยการใชเคร่ืองผสมสาร
นําไปตมในอางน้ํารอนท่ีอุณหภมิู 70 องศาเซลเซียสเปนเวลา 30 นาที
ปนเหวี่ยงเอาสวนใสสีเขียวไปวัดคาการดดูกลืนแสงท่ี 650 และ 665
นาโนเมตร บันทึกคา Absorbance ท่ีไดไปคํานวณหาปริมาณคลอโรฟลล
ดังสูตรการคํานวณปริมาณคลอโรฟลล การคํานวณหาปริมาณคลอโรฟลล (นิติมา,
2547) ปริมาณคลอโรฟลล B = (16.5 ×A665) – (8.3 × A650) mg/l
ปริมาณคลอโรฟลล a = B × 2 mg/l
-
16
2. การสกัดสารสีสาหรายสไปรูลินาดวยตวัทําละลายชนดิตางๆ โดยวิธีของ
Sarada et al. (1999)
และ Silveira et al. (2007)
2.1 ใชเซลลสาหรายตอตัวทําละลายอัตราสวน 1 กรัม: 10 มิลลิลิตร
แลวนําไปเขยาท่ีอุณหภูมิหองในชวงเวลา 24, 48 และ 72 ช่ัวโมง
นํามากรองผานกระดาษกรอง whatman เบอร 1
แลวนําไปเปรียบเทียบดูสารสีไฟโคไซยานิน ซ่ึงตัวทําละลายที่ใชไดแก
น้ํากล่ัน NaCl ความเขมขน 0.15 โมลาร และ 0.7 โมลาร CaCl2 ความเขมขน
0.10 โมลาร และ 0.09 โมลาร กรดไฮโดรคลอริก (HCl) ท่ีความเขมขน 2, 4,
6, 8 และ 10 นอรมอล 10 mM Sodium phosphate buffer pH 7.0
50 mM Sodium phosphate buffer pH 6.8 10 mM Sodium acetate buffer
pH 5.0 50 mM phosphate buffer pH 6.8 เอนไซมไลโซไซม (lysozyme)
ความเขมขน 0.05 0.07 และ 0.1 เปอรเซ็นต และ
กรดเอธิลลีนไดอะมีนเตรตราอะซิติก (Ethylene diamine tetraacetic
acid, EDTA) 0.16 เปอรเซ็นต โดยวิธีของ ปยนารถ (2550)
ซ่ึงสามารถเตรียมตัวทําละลายชนิดตางๆ ได (ภาคผนวก ข)
2.2 ใชเซลลสาหรายตอตัวทําละลายอัตราสวน 1 กรัม: 5 มิลลิลิตร
นําไปแชแข็งท่ีอุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ประมาณ 16 ช่ัวโมง
แลวละลายท่ีอุณหภูมิ 40 และ 60 องศาเซลเซียส
ทําการแชแข็งและละลายต้ังแต 1-4 คร้ัง นํามากรองผานกระดาษกรอง whatman
เบอร 1 แลวนาํไปเปรียบเทียบดสูารสีไฟโคไซยานิน
ตวัทําละลายท่ีใชเชนเดียวกับขอ 2.1 แตไมใชกรดไฮโดรคลอริก
2.3
เม่ือทําการสกัดแลวดวูาวิธีการและตวัทําละลายชนิดใดใหสารสีไฟโคไซยานินทีด่ีท่ีสุด
แลวทําการสกดัใหไดปริมาณมากข้ึนจึงนาํไปยอมเซลลรากหอม
แตกอนนําไปยอมเซลลรากหอมนําสารสกัดท่ีกรองไดไประเหยตัวทําละลายออกดวยเคร่ือง
Rotary evaporator
-
17
3. การยอมสีโครโมโซมรากหอมดวยสีสกัดจากสาหราย นําสารสกัดจากขอ 2
มายอมเซลลรากหอมท่ีมีการแบงตัวแบบไมโตซีสดวยวิธี squash technique
โดยจะตองทําการเตรียมเซลลรากหอม (ภาคผนวก ค)
และเปรียบเทียบลักษณะการติดสีกับโครโมโซมท่ียอมดวยสีสังเคราะหอะซีโตออรซีน
4. การนําไปใชประโยชนในดานอ่ืนๆ 4.1 นํามาทําแชมพูสาหรายสไปรูลินา
กล่ินมะนาว สวนผสมไดแก เซลลสาหรายสด 10 กรัม หัวแชมพ ู1 กิโลกรัม ผงขน
(NaCl) 2-3 ขีด น้ํา 3 กิโลกรัม กล่ินมะนาว 5 ออนซ
โดยนําน้ําเปลาผสมกับหัวแชมพูสําเร็จรูป
คนใหละลายเปนเนื้อเดียวกันแลวเติมเซลลสาหรายสดคนใหเนื้อเปนเดียวกันแลว
จงึเติมผงขนตามท่ีกําหนดขางตน คนใหเปนเนื้อเดียวกันก็จะไดความหนืด
หลังจากนัน้จึงเติมกล่ินมะนาวลงไปท้ิงไว 1
คืนแลวจึงบรรจุใสขวดและทําการทดสอบ
4.2 ทดสอบคุณลักษณะท่ีตองการของแชมพู 4.2.1 การทดสอบลักษณะทั่วไป
พิจารณาดูลักษณะของแชมพูวามีความเปนเนื้อเดียวกันหรือไม
มีการแยกช้ัน
หรือตกตะกอนหรือไม กล่ินเปนอยางไร และมีส่ิงแปลกปลอมหรือไม 4.2.2
การทดสอบความคงสภาพ ใหเก็บตัวอยางแชมพูท่ีอุณหภูมิ 4 ± 2 องศาเซลเซียส
เปนเวลา 24 ช่ัวโมง
นํามาเก็บท่ีอุณหภูมิ 30 ± 2 องศาเซลเซียส เปนเวลา 4 ช่ัวโมง
ทําเชนนี้จนครบ 4 คร้ัง แลวนําออกมาตรวจลักษณะท่ีเปล่ียนแปลงไป เชน
กล่ิน สี ความขนเหลว การแยกช้ัน และการจับตัวเปนกอน
ในระยะเวลาตามท่ีกําหนด บันทึกผลการทดสอบในตารางผนวกท่ี จ1 (ภาคผนวก
จ)
4.2.3 การทดสอบจุลินทรีย
โดยการนับจํานวนเช้ือจุลินทรียท้ังหมด (Total colony count)
ตองไมเกิน 1 X 105 โคโลนีตอตัวอยาง 1 กรัม เตรียมอาหารเล้ียงเช้ือ TGY
(ภาคผนวก ก) นึ่งดวยหมอนึ่งความ
-
18
ดันไอ ท่ีความดัน 121 ปอนดตอตารางน้ิว นาน 15 นาที
และเทอาหารเลี้ยงเช้ือ TGY ท่ีละลายและทําใหเย็นลงถึงอุณหภูมิ 45
องศาเซลเซียส ประมาณ 15 ถึง 20 มิลลิลิตร ลงในจานเล้ียงเชื้อ จํานวน
18 คู ท่ีแสดงฉลากสําหรับใสตวัอยางท่ีมีความเจือจางต้ังแต 10-1 ถึง
10-3
เตรียมสารละลายแชมพูตวัอยางๆ รอยละ 10
โดยปริมาตรในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร จะไดความเขมขนของตัวอยางเทากับ 1ใน
10 (10-1) แลวดําเนินการตอไป ทําการเจอืจางแชมพูตัวอยางๆ ละ 2 ซํ้า
ดูดตัวอยาง 1.0 มิลลิลิตร ใสลงในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร 9.0 มิลลิลิตร
ในหลอดแกว จะไดตัวอยางท่ีมีความเจือจาง 10-2
ทําตอไปจนไดตวัอยางท่ีมีความเจือจางครบต้ังแต 10-1 ถึง 10-3
ปเปตแชมพูตัวอยางท่ีเจือจาง 0.1 มิลลิลิตร
ลงบนอาหารเล้ียงเชื้อและเกล่ียใหท่ัวผิวอาหรแลวใหกลับจานเล้ียงเช้ือ
นําเขาตูอบเพาะเช้ือท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 ช่ัวโมง
นับจํานวนโคโลนีท่ีเกิดขึน้เฉพาะจานท่ีมี 30 ถึง 300 โคโลนี
หาคาเฉล่ียแตละความเจือจางแลวคูณดวย dilution factor
จะไดจํานวนโคโลนีของแบคทีเรียตอตัวอยาง 1 กรัม 4.2.4
การทดสอบความเปนกรด-ดาง
ตองมีคาความเปนกรด-ดางอยูระหวาง 5.0 ถึง 8.0
ใหเตรียมสารละลายแชมพูตัวอยางรอยละ 10 โดยปริมาตรในน้าํกล่ัน
วัดความเปนกรด-ดาง ดวยเคร่ืองวดัความเปน กรด-ดาง หรือ
กระดาษลิตมัสเพื่อเทียบสี
4.2.5 การทดสอบการใชงาน ดวยการทดสอบแบงคร่ึงผม 1)
ใหแตงต้ังคณะกรรมการผูตรวจสอบ ในการตรวจสอบแชมพูอยางนอย 5 คน
แตละคนจะแยกกันตรวจสอบและใหคะแนนโดยอิสระ
2) ใชอาสาสมัคร 3 คน ท่ีมีผมคอนขางมัน ซ่ึงไมไดสระผมมาอยางนอย 24
ช่ัวโมง แตไมมากกวา 72 ช่ัวโมง
3) แบงผมอาสาสมัครของแตละคนออกเปน 2 สวน ซายและขวาปริมาณเทาๆ กัน
สวนขวาสระดวยแชมพตูัวอยาง
โดยชโลมแชมพูตัวอยางลงบนผมท่ีทําใหเปยกดวยน้าํประปา แลวขยี้ผมเบาๆ
นวดหนังศีรษะดวยปลายน้ิวมือจนท่ัวนาน 2 นาที
ลางแชมพูออกจนหมดดวยน้ําประปา แลวใชผาขนหนซัูบใหแหง
สวนซายใชสําหรับเปรียบเทียบใหทําโดยวิธีเดียวกัน แตไมใชแชมพ ู
-
19
4) ใหคณะผูตรวจสอบอยางนอย 5 คน ตรวจสอบโดยเปรียบเทียบระหวางผม
สวนซายและสวนขวา และใหคะแนนตามหลักเกณฑท่ีกําหนดในตารางผนวกท่ี จ2
และบันทึกผลในตารางผนวกท่ี จ3 (ภาคผนวก จ)
สถานท่ีและระยะเวลาทําการศึกษา
สถานท่ี
หองปฏิบัติการสาขาวิชาพันธุศาสตร หองปฏิบัติการสาขาวิชาเคมี
คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร และศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน
ระยะเวลาทําการศึกษา
การทดลองนี้เร่ิมต้ังแต พฤษภาคม 2550- เมษายน 2551
-
20
ผลและวิจารณ
ผลการทดลอง
1. การเล้ียงสาหรายสไปรูลินาใหมีการเจริญเติบโตสูงสุด
ผลการทดลองเล้ียงสาหรายสไปรูลินาดวยอาหารเหลว Zarrouk ท่ีอุณหภูมิ
27-32 องศาเซลเซียส pH
9-11ในหองปฏิบัติการสาขาพันธุศาสตรท่ีมีแสงสองสวางอยางท่ัวถึงได
(ภาพท่ี 2ก-ง)
พบวาสาหรายสไปรูลินาเจริญไดดีและไดปริมาณเซลลจํานวนเพ่ิมมากขึ้นพอที่จะนํามาใชในการสกัดสารสี
ดังตารางบันทึกผลคาการวัดการเจริญเติบโตของสาหราย (ตารางผนวกท่ี ง1)
ซ่ึงผลการเจริญเติบโตท่ีไดดูจากกราฟการวัดความขุนของเซลล (ภาพท่ี 3)
การชั่งน้ําหนกัแหงของเซลล (ภาพท่ี 4) และการวดัปริมาณคลอโรฟลล
(ภาพท่ี 5)
ก ข
ค ง
ภาพท่ี 2 สภาวะการเล้ียงสาหรายสไปรูลินา ก.
สไปรูลินาเล้ียงในอางเล้ียงปลา ข. สไปรูลินาเล้ียง
ในขวดรูปชมพู ค. การเก็บตัวเซลลสาหราย ง.
ลักษณะรูปรางเซลลสาหรายสไปรูลินา
-
21
ความขุน
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 5 10 15 20 25 30
จํานวนวันที่ทําการทดลอง
คา A
bsor
banc
e
560 nm
670 nm
ภาพท่ี 3 กราฟแสดงคาการวัดความขุนของเซลลสาหรายสไปรูลินา
ท่ีชวงการดดูกลืนแสง 560 และ
670 นาโนเมตร ระยะเวลา 4 สัปดาห
นํ้าหนักแหง
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 5 10 15 20 25 30
จํานวนวันที่ทําการทดลอง
ปริมาณส
าหราย (
mg/m
l)
น้ําหนักแหง
ภาพท่ี 4 กราฟแสดงคาน้ําหนักแหงของสาหรายสไปรูลินา ในชวงระยะเวลา 4
สัปดาห
-
22
คลอโรฟลล
02468
10121416
0 5 10 15 20 25 30
จํานวนวันที่ทําการทดลอง
ปริมาณค
ลอโรฟล
ล (m
g/ml)
B
A
ภาพท่ี 5 กราฟแสดงคาการวัดปริมาณคลอโรฟลลของสาหรายสไปรูลินา
ในชวงระยะเวลา 4
สัปดาห
การสกัดสารสีสาหรายสไปรูลินาดวยตวัทําละลายชนดิตางๆ 2. 2.1
การสกัดสารสีสาหรายสไปรูลินาดวยตัวทําละลายชนิดตางๆ
แลวนําไปเขยาท่ีอุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส
เนื่องจาก
ซี-ไฟโคไซยานินเปนสารท่ีอยูภายในเซลลดังนั้นการสกัดหรือการแยกสารท่ีอยู
ภายในเซลลจําเปนจะตองทําใหเซลลแตกกอนแลวจึงสกัดสารภายในออกมา
(Alkinson et al., 1987) ไดแบงการทําใหเซลลแตกออกเปน 3 วิธีคือ
การใชเอนไซม (Enzymatic cell disruption) วิธีทางเคมี (Chemical
method) และวิธีทางฟสิกส (Physical method) ดังนั้นในการทดลองน้ีจึงใช
3 วิธีการคือ การสกัดโดยใชเอนไซมไลโซไซม
วิธีทางเคมีโดยการสกัดใชตัวทําละลายชนิดตางๆ
วิธีทางกลศาสตรคือการแชแข็งแลวละลายท่ีอุณหภูมิตางๆ
ผลการทดลองการสกัดสารสีจากสาหรายสไปรูลินาดวยตัวทําละลายชนดิตางๆ
แลวนาํไป
เขยาท่ีอุณหภมิู 30 องศาเซลเซียส เวลาท่ีใชในการสกัดต้ังแต 24, 48
และ 72 ช่ัวโมง พบวาลักษณะของสารสีท่ีไดจากการสกัดดวยตัวทําละลาย
น้ํากล่ัน NaCl 0.15 และ 0.17 M, 10 mM Sodium
-
23
phosphate buffer pH 7.0, 50 mM Sodium phosphate buffer pH 6.8,
50 mM phosphate buffer pH 6.8, Lysozyme 0.05, 0.07, 0.1 เปอรเซ็นต
สารสีท่ีไดเปนสีเขียวเหลือง ตัวทําละลาย กรด HCl ความเขม
