THE RELATIONSHIP BETWEEN DAZ & MALE INFERTILITY

Fertil Steril 2002 Jan;77(1):68-75

Reduced copy number of DAZ genes in subfertile and infertile men Jan W. A. de Vries M.Sc., Mariëtte J. V. Hoffer Ph.D., Sjoerd Repping M.Sc., Jan M. N. Hoovers Ph.D., Nico J. Leschot M.D., Ph.D. and Fulco van der Veen M.D., Ph.D.

AbstractObjective(s): To determine the copy number and identity of the DAZ genes on the Y chromosomes of infertile patients.

Patient(s): One hundred and thirty-nine patients with male factor infertility

Intervention(s): The separate genes were detected by polymerase chain reaction (PCR) digestion assays of sequence family variants in leukocyte DNA and by fluorescence in situ hybridization of interphase nuclei and chromatin fibers.

Result(s): One hundred twenty-nine patients had four genes, 6 patients had two genes, and 4 patients had none. Three patients had a deletion of the two proximal DAZ genes, and three were missing both distal genes. Semen analysis showed a less severe phenotype in patients with only two DAZ genes compared with patients missing all four genes.

Conclusion(s): In six patients, two different partial deletions were found that were not detected by PCR with conventional markers. One patient with an AZFb deletion appeared to also have a partial AZFc deletion that was not detected by routine PCR. Phenotypic differences between patients with different deletions suggest a dose effect of the DAZ genes.

IntroductionY 염색체의 nonrecombining 지역에 위치에 있는 10 개의 유전자 패밀리는 testis 안에서 발현되고 있으며 그 중 DAZ gene family 는 Yq11 위 interval 6 에서 4 개의 copy 로 존재하며 함께 관련성있게 deletion 되고 있다 .

적어도 다른 세 개의 DAZ complementary DNAs 가 이제까지 동정되었으며 이들은 spermatogenesis 동안 testis 안에서 전사되고 있다 .

Subfertile 또는 infertile 남성은 conventional PCR techniques 을 통해 DAZ gene 들의 4 개 보다 더 적은 deletion 가지고 있음이 알려졌다 .

이것은 gene-specific PCR digestion assay 에 의해 밝혀졌는데 이 방법은 4 개의 다른 DAZ gene 들의 sequence family variants 에 의해 동정하게 한다 .

그리고 DAZ genes 4 개 모두의 deletion 은 azoospermia 또는 svere oligozoospermia 와 관련되어 있다 .

Material & Methods

Patients and Semen Donors1997 에서 1998 까지 139 명의 subfertility 또는 infertility 이라고 진단된 환자

Conventional PCR AssaysLeukocytes 로부터 분리된 DNA 를 PCR amplification 를 이용하여 검사함 Deletions 를 검출해내기 위해 다음과 같은 loci 를 이용하였음 : sY81, sY84, sY182, sY94, sY102, sY117, sY143, sY147 sY152, sY153, and sY157.

FISH세개의 sequenced DAZ cosmids 를 FISH 를 위한 probes 로 이용하였음 .두개의 연결된 DAZ 유전자의 5 번 말단 부위에 위치한 Cosmid 18E8 (Genbank AC010089) exons 2 에서 11 에 걸쳐 있는 Cosmos 63C9 (Genbank AC000021) exons 2 에서 11 을 포함하며 유전자의 35 kb downstream 에 있고 DAZ 유전자의 3 번 말단 부위에 위치한 Cosmid 46A6 (Genbank AC000022) 18E8 과 46A6 의 combination probes 는 DAZ gene 의 5 번 말단과 3 번 말단 부위를 detection 하고 18E8 과 63C9 의 combination of probes 는 5 번 말단과 single clusters 안에서의 DAZ gene 들을 detection 함으로 Fiber FISH 는 수행되었음 .Probe 들은 biotin digoxigenin 으로 labeling 되었고 , target DNA 는 avidin 또는 antidigoxigenin antibodies 와 결합되어 있는 fluorochromes Cy3 (red) 또는 fluorescein (green) 로 hybridization 되어 detectecting 되었다 .

Statistical Analysist-test 가 통계학적 분석으로 이용되었다

FIGURE 1. Schematic drawing of the two DAZ gene clusters. Sequence family variants (SFVs) between the four different genes. sY587 distinguishes between clusters 1 and 2, sY581 distinguishes between the genes within the clusters, and sY586 distinguishes between DAZ2 and the other three genes. The location of the three cosmids used for fluorescence in situ hybridization is also shown. .

Results

TABLE 1. Fragment sizes after restriction digestion

Note: In cluster (DAZ1 and DAZ2), sY587 has the T variant, producing an extra restriction site for Dra1. In cluster 2 (DAZ3 and DAZ4), sY587 shows the C variant. In DAZ2 and DAZ3, sY581 has the T variant, producing an extra restriction site for Sau3A. In DAZ1 and DAZ4, sY581 shows the C variant. In DAZ2, sY586 is in the T variant, causing loss of a restriction site for Dra1. Fragment sizes are expressed in base pairs. .

TABLE 2. Microdeletions detected by routine polymerase chain reaction

Note: Table shows presence (+) or absence (-) of sequence tagged sites detected in polymerase chain reaction in the three deletion intervals of the Y chromosome. .

TABLE 3. Combinations of DAZ signatures in 139 patients and the presence of one or two clusters on fluorescence in situ hybridization. . a Columns show presence (+) or absence (-) of the DAZ genes as detected by polymerase chain reaction digestion assay of sY581 and SY587. . b Data are expressed as the number of patients in whom the 301-base pair band, typical for the DAZ2 gene, was found or was absent. . c This result conflicts with that of the sY587 and sY581 assay. . d Patient with a 47,XYY karyotype had two clusters per Y chromosome.

FIGURE 2. Results of fiber fluorescence in situ hybridization on DNA from patient 4937, who had an AZFb deletion and a normal DAZ gene cluster. Red signal, 18E8; green signal, 63C9. .

TABLE 4. Semen characteristics relative to the presence of DAZ gene clusters. a Data are the number of patients. b Mild oligozoospermia is a sperm count of 5 × 106 cells mL to 20 × 106 cells mL; severe oligozoospermia is a sperm count less than 5 × 106 cells/mL. c One of the two patients was the AZFb deleted patient with the AZFb deletion. Note: The DAZ gene cluster number was determined by FISH and the clusters were identified by SFVs.

Discussion1. Y 염색체위의 DAZ gene 들은 염색체 3 번 위 autosomal DAZL 이 transposition 됨으로 생성되게 되었다 . Intragenic amplification, exon pruning 과 duplication 은 Y 염색체 위에 각각의 두 유전자가 head-to-head manner 의 방향으로 생성되어 4 개의 유전자가 구성되게 하였다 . 2. sY581 marker 가 위치하는 exons 2 에서 6 까지의 DAZ gene 을 포함하는 10.8-kb segment 를 detect 하는 probes 를 알아내었다 . 이 region 은 RNA recognition motif 를 나타내고 DAZ gene clusters 안에 이 motif 가 7 번 존재한다 .: 세 번은 DAZ1 안에서 , 두 번은 DAZ4 안에서 , 그리고 각각 한 번씩 DAZ2 와 DAZ3 안에서 존재한다 . 3. 이러한 partial deletions 로부터 DAZ gene clusters 의 관련성 있는 방향성에 대한 새로운 정보를 얻을 수 있었다 . AZFb deletion 을 지닌 환자는 cluster 1 을 소실했었고 그의 아버지는 Y 염색체의 감별할 수 없는 deletion 을 가지고 있었다 . 이것은 cluster 1 이 AZFb 영역과 가까운 cluster 이고 cluster 2 는 먼 cluster 라는 결론을 내릴 수 있게 한다 .그러므로 AZFb deletion 을 지닌 환자는 AZFc 로부터 연장된 deletion 을 지닌 환자이다 . 만약 이 지역에서 많은 breakpoints 가 존재하고 overlap 이 나타난다면 이 둘 , 사이의 intervals 은 더욱 구별되기 힘들 것이다

4. 성인 고환에서 4 개의 유전자 중 적어도 세 개가 존재하면 전사된다 . 그리고 이 유전자는 DAZ로써의 역할을 기여할 수 있다 . 이러한 4 개의 DAZ 유전자의 예견된 생산은 RNA recognition motifs의 수와는 다르다 . 그리고 기능적으로 다른 생산물은 아직 알려진 바가 없다 .

5. 두 clusters 의 존재가 항상 정자 형성의 완전함을 이끄는 것은 아니다 . less severe phenotype 은 만약 오직 한 cluster 의 부재가 나타낸다면 DAZ 유전자의 유전자로써의 효과를 나타낼 수 있다 . 나아가 cluster1 의 부재는 cluster2 의 부재 보다 더 심각한 표현형을 보인다 .

6. 오직 하나의 DAZ gene cluster 를 지닌 6 명의 환자 중 3 명은 sperm 농도가 5 X 106 cells/mL 보다 높다 . 이러한 deletions 은 아들에게 전달도리 것이고 미래의 자손이 지닐 넓은 의미의 deletion의 위험성은 아직 모른다 .

References

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