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N° ordre : 4351
THÈSE
présentée à
L'UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES par
Honda THONG DENG
pour obtenir le grade de
DOCTEUR
Spécialité : GENIE DES PROCEDES
———————————————
EXTRACTION ET MISE EN FORME (EN LIPOSOMES) DE
PHOSPHOLIPIDES ISSUS D’UN CO-PRODUIT PAR VOIE
SUPERCRITIQUE ———————————————
Soutenue le 15 novembre 2011
Devant la commission d'examen formée de :
M. E. DUFOURC Directeur de recherche, CNRS, Pessac Président
Mme D. BARTH Professeur, EEIGM, Nancy Rapporteur M. P. CHAMINADE Professeur, Univ Paris Sud Rapporteur
M. P. BOURSEAU Professeur, Univ Bretagne Sud Examinateur
Mme M. CANSELL Professeur, Univ bordeaux, Pessac Directeur de thèse Mme P. SUBRA Directeur de recherche, CNRS, Pessac Directeur de thèse
N° ordre : 4351
THÈSE
présentée à
L'UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES par
Honda THONG DENG
pour obtenir le grade de
DOCTEUR
Spécialité : GENIE DES PROCEDES
———————————————
EXTRACTION ET MISE EN FORME (EN LIPOSOMES) DE
PHOSPHOLIPIDES ISSUS D’UN CO-PRODUIT PAR VOIE
SUPERCRITIQUE ———————————————
Soutenue le 15 novembre 2011
Devant la commission d'examen formée de :
M. E. DUFOURC Directeur de recherche, CNRS, Pessac Président
Mme D. BARTH Professeur, EEIGM, Nancy Rapporteur M. P. CHAMINADE Professeur, Univ Paris Sud Rapporteur
M. P. BOURSEAU Professeur, Univ Bretagne Sud Examinateur
Mme M. CANSELL Professeur, Univ bordeaux, Pessac Directeur de thèse Mme P. SUBRA Directeur de recherche, CNRS, Pessac Directeur de thèse
i
Remerciements
Ce travail de thèse a débuté au laboratoire TREFLE et s’est achevé au laboratoire
CBMN, tous deux localisés sur le campus de Talence Pessac. Je souhaite remercier ici
l’ensemble des personnes de ces structures qui ont contribué à la réalisation de cette étude
ainsi que la région Aquitaine pour son support financier.
Je remercie en premier lieu mes directrices de thèse, Pascale Subra et Maud Cansell,
qui m’ont encadré et fait confiance pour cette thèse.
Je remercie, tout particulièrement, Mme Danielle Barth et M. Pierre Chaminade pour
avoir accepté d’examiner ce travail en qualité de rapporteurs.
Je souhaite également remercier Serge Laugier, Maitre de Conférences à l’ENSCBP,
pour son aide et son encadrement sur la partie thermodynamique de ce travail. Merci pour vos
conseils précieux et votre disponibilité.
Je remercie l’équipe d’Eric Dufourc et plus tout particulièrement Axelle Grélard et
Cécile Courreges qui m’ont apporté une aide indispensable lors de la caractérisation des
extraits. Votre patience et votre sympathie m’ont sincèrement fait apprécier ce temps passé
avec vous.
Mes remerciements vont également à Alain Sommier qui a su être l’homme de pas mal
de situations…
Je ne peux oublier les nombreux thésards du laboratoire TREFLE et CBMN avec qui
j’ai passé de bons moments. Je vous souhaite bonne chance pour la suite de vos carrières.
Je n’oublierai pas de remercier mes amis bordelais que j’ai pu rencontrer grâce à cette
thèse, à mon activité de monitorat ou qui avaient déjà fait un joli bout de chemin avec moi :
Nicolas, Mathieu (t et plusieurs t), Jenny, Vincent, JC… et mon « copain Viallon » !!! Merci
pour votre soutien et tous les bons moments que nous avons partagés ensemble.
Enfin, merci à ma compagne Aurélie, sans qui la vie ne serait pas ce qu’elle est.
ii
Sommaire
REMERCIEMENTS ............................................................................................ I
SOMMAIRE ....................................................................................................... II
INTRODUCTION .......................................................................................... - 1 -
CHAPITRE 1 : LIPIDES ET LIPOSOMES : DES TECHNIQUES CONVENTIONNELLES D’EXTRACTION ET DE MISE EN FORME AUX TECHNIQUES SUPERCRITIQUES – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................... - 5 -
I.1 Définition : Lipides et liposomes ................................................................................. - 6 -
I.1.1 Triglycérides ......................................................................................................... - 6 -
I.1.2 Phospholipides ..................................................................................................... - 8 -
I.1.3 L’autoassemblage des phospholipides en solution aqueuse ................................. - 9 -
I.1.4 Les liposomes ou vésicules lipidiques ............................................................... - 12 -
I.2 Extraction des lipides ................................................................................................. - 14 -
I.2.1 Méthodes classiques d’extraction des lipides ..................................................... - 14 -
I.2.1.1 Extraction de l’huile et des triglycérides ................................................... - 14 -
I.2.1.2 Extraction des phospholipides ................................................................... - 17 -
I.2.1.3 Extraction des lipides à l’échelle du laboratoire ........................................ - 22 -
I.2.2 Les méthodes supercritiques d’extraction .......................................................... - 23 -
I.2.2.1 Définition et propriétés générales des fluides supercritiques .................... - 23 -
I.2.2.2 CO2 supercritique pur et en mélange ......................................................... - 25 -
I.2.2.3 Principes généraux de l’extraction solide-liquide ...................................... - 26 -
I.2.2.4 Extraction supercritique des lipides ........................................................... - 29 -
I.2.3 Conclusion sur l’extraction ................................................................................ - 37 -
I.3 Les techniques de préparation des liposomes ............................................................ - 40 -
I.3.1 Les techniques conventionnelles ........................................................................ - 40 -
I.3.2 Les techniques supercritiques ............................................................................. - 43 -
iii
CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES ................ ...................... - 51 -
II.1 Matière première ........................................................................................................ - 52 -
II.1.1 Nouvelle source : la coquille Saint Jacques ....................................................... - 52 -
II.1.2 Approvisionnement et stockage de la matière première .................................... - 53 -
II.1.3 Préparation de la matière première ..................................................................... - 53 -
II.1.4 Caractérisation de la matière première ............................................................... - 55 -
II.2 Les produits utilisés ................................................................................................... - 59 -
II.3 Dispositifs expérimentaux et protocoles .................................................................... - 60 -
II.3.1 Extraction CO2 pur et CO2-co-solvant en dispositif petit volume (charge en matière
traitée de 3 à 6 g) ............................................................................................................ - 60 -
II.3.1.1 Description du dispositif expérimental ...................................................... - 60 -
II.3.1.2 Protocole d’extraction au CO2 pur ............................................................. - 62 -
II.3.1.3 Protocole d’extraction au CO2-co-solvant ................................................. - 63 -
II.3.2 Extraction CO2 grand volume : déshuilage de 60 g de matière première .......... - 64 -
II.3.2.1 Description du dispositif expérimental ...................................................... - 64 -
II.3.2.2 Protocole d’extraction au CO2 pur ............................................................. - 65 -
II.3.3 Extraction CO2-co-solvant en dispositif « grand volume » : traitement de 15 à 60 g
de matière déshuilée ....................................................................................................... - 66 -
II.3.3.1 Description du dispositif expérimental ...................................................... - 66 -
II.3.3.2 Montage avec le réacteur tubulaire (V = 500 ml) ...................................... - 67 -
II.3.3.3 Montage avec le réacteur agité (V = 250 ml) ............................................ - 69 -
II.3.4 Mise en forme de liposomes en milieu CO2-éthanol-eau ................................... - 70 -
II.3.4.1 Extraction et mise en forme en ligne ......................................................... - 70 -
II.3.4.2 Modification de la taille des liposomes à base de lécithine commerciale (LC
60) ................................................................................................................... - 71 -
II.3.5 Caractérisation réacteur agité et étude du mélange CO2-éthanol-eau ................ - 73 -
II.3.5.1 Distribution des temps de séjour dans le réacteur agité ............................. - 73 -
II.3.5.2 Etude du mélange CO2-éthanol-eau-lécithine............................................ - 74 -
II.3.5.3 Etude cinétique du mélange CO2-éthanol-eau ........................................... - 76 -
II.4 Méthodes de caractérisation ....................................................................................... - 77 -
II.4.1 Analyse de la matière première solide et résidu d’extraction ............................ - 77 -
II.4.2 Analyse des extraits ............................................................................................ - 79 -
II.4.3 Analyse des dispersions de liposomes ............................................................... - 83 -
iv
CHAPITRE 3 : EXTRACTION DES LIPIDES PAR VOIE SUPERCRITIQUE ....................................................................................... - 84 -
III.1 Extraction des lipides à l’aide de CO2 supercritique ................................................. - 85 -
III.1.1 Résultats ............................................................................................................. - 85 -
III.2 Extraction des phospholipides avec un mélange CO2-co-solvant.............................. - 92 -
III.2.1 Plan des essais et paramètres étudiés ................................................................. - 93 -
III.2.2 Résultats ............................................................................................................. - 95 -
III.2.2.1 Intérêt du prétraitement de déshuilage au CO2 pur .................................... - 96 -
III.2.2.2 Reproductibilité de l’extraction ................................................................. - 98 -
III.2.2.3 Influence de la pression ........................................................................... - 100 -
III.2.2.4 Influence du pourcentage d’éthanol ......................................................... - 102 -
III.2.2.5 Influence de la température à différentes pressions ................................. - 105 -
III.2.2.6 Exploitation de la courbe d’extraction ..................................................... - 111 -
III.2.2.7 Récapitulatif des résultats obtenus avec le mélange CO2- éthanol .......... - 113 -
III.2.2.8 Remplacement de l’éthanol par l’isopropanol ......................................... - 117 -
III.2.3 Conclusion ........................................................................................................ - 121 -
III.3 Transposition de l’extraction des phospholipides sur de plus grands volumes ....... - 122 -
III.3.1 Utilisation d’un réacteur tubulaire de 500 mL ................................................. - 122 -
III.3.1.1 Etude de la reproductibilité de l’extraction .............................................. - 123 -
III.3.1.2 Influence de la masse introduite .............................................................. - 124 -
III.3.1.3 Comparaison des résultats obtenus selon les réacteurs 10 ml et 500 ml . - 126 -
III.3.2 Utilisation d’un réacteur agité de 250 ml ......................................................... - 130 -
III.3.2.1 Caractérisation du réacteur agité : étude hydrodynamique (DTS) .......... - 130 -
III.3.2.2 Modes opératoires proposés..................................................................... - 133 -
III.4 Variantes du procédé d’extraction ........................................................................... - 146 -
III.4.1 Fractionnement de l’utilisation de l’éthanol ..................................................... - 146 -
III.4.2 Utilisation d’un mélange eau-éthanol comme co-solvant ................................ - 148 -
v
CHAPITRE 4 : MISE EN FORME DE LIPOSOMES A PARTIR DE SOURCES MARINES PAR VOIE SUPERCRITIQUE ........................ - 151 -
IV.1 Mise en forme des extraits obtenus par voie supercritique ...................................... - 153 -
IV.2 Etude du mélange CO2-éthanol-eau-phospholipides ............................................... - 157 -
IV.2.1 Diagramme de phase CO2-éthanol-eau-lécithine sous pression ....................... - 157 -
IV.2.2 Etude cinétique du mélange CO2-éthanol-eau.................................................. - 160 -
IV.2.2.1 Impacts sur la mise en forme de liposomes ............................................. - 162 -
IV.3 Couplage de l’extraction des PL et de la mise en forme en liposomes.................... - 163 -
IV.4 Modification de la taille des liposomes par voie supercritique ............................... - 166 -
IV.4.1 Influence de la taille capillaire ......................................................................... - 169 -
IV.4.2 Influence débit CO2 .......................................................................................... - 171 -
IV.4.3 Influence débit phase aqueuse .......................................................................... - 174 -
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES.............................. - 177 -
REFERENCES ........................................................................................... - 181 -
TABLE DES FIGURES ............................................................................. - 185 -
TABLE DES TABLEAUX ........................................................................ - 189 -
ANNEXE 1 .................................................................................................. - 192 -
ANNEXE 2 .................................................................................................. - 196 -
ANNEXE 3 .................................................................................................. - 198 -
ANNEXE 4 .................................................................................................. - 201 -
ANNEXE 5 .................................................................................................. - 206 -
- 1 -
Introduction
Au cours des trente dernières années, la production mondiale de corps gras a été
multipliée par 2,7, passant de 29 millions à 70 millions de tonnes. 75% des ressources
mondiales sont d’origine végétale (tournesol, soja, palme…), le reste étant principalement de
source animale (Karleskind, 1993).
Composés des corps gras, les phospholipides (PL) sont des constituants mineurs mais
ils tiennent une place prépondérante de par leurs propriétés physico-chimiques. Ils sont
notamment capables de former des vésicules lipidiques (liposomes) qui peuvent être utilisées
dans de nombreux domaines d’applications (cosmétique, nutrition ou pharmaceutique).
Actuellement, les sources de phospholipides sont le soja, l’œuf et, dans une moindre mesure,
le colza et le tournesol.
Parallèlement, la pêche génère des sous et co-produits contenant des proportions de
lipides non négligeables. La pêche mondiale représente 91 millions de tonnes et seulement 50
% sont destinés à l’alimentation humaine (Ferraro et al., 2010) de par la capture d’espèces
non désirées et les parties (têtes, viscères etc.) non consommées par l’Homme. Généralement,
ces co-produits sont destinés à l’alimentation animale ou utilisés pour la fabrication d’engrais.
Par conséquent, la question se pose de savoir si les sous et co-produits de la pêche pourraient
constituer une nouvelle ressource marine de phospholipides.
Actuellement, les techniques d’extraction des lipides utilisent des solvants organiques
soumis à une réglementation stricte. Dans le cadre d’une démarche de développement
durable, les procédés supercritiques peuvent être une solution alternative à l’extraction des
lipides nécessitant l’utilisation de solvants organiques. En effet, le CO2 permet d’extraire les
lipides neutres (triglycérides principalement) tandis que le mélange CO2-éthanol
(généralement reconnu comme non dangereux, GRAS) est utilisé pour extraire les
phospholipides.
Ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre de la valorisation de la biomasse. Il porte sur
le développement d’un procédé supercritique pour l’extraction de phospholipides et la
formation de liposomes. Il se décompose en deux parties : la première concerne l’extraction
- 2 -
des phospholipides et la seconde traite de la mise en forme de liposomes. A terme, l’objectif
est de développer un procédé continu couplant l’extraction et la formation de liposomes selon
le principe suivant :
Néanmoins, comme nous le verrons dans l’étude bibliographique, la présence de
triglycérides dans le fluide enrichi nuit à la formation de liposomes. Il est donc nécessaire de
les éliminer par un premier traitement au CO2 pur. Les phospholipides sont extraits grâce à
l’ajout d’un co-solvant : l’éthanol. La mise en forme des PL par ajout d’eau conduit ensuite à
la formation des liposomes. Ainsi le procédé que nous souhaitons développer est représenté
par le schéma suivant :
- 3 -
Il se compose de trois étapes :
Ext
ract
ion
� Une extraction des lipides neutres : Cette étape permet d’extraire les
lipides indésirables de la matière première. De plus, il a été démontré que
réaliser cette première extraction permettait d’améliorer la sélectivité en
phospholipides de la seconde. Elle est réalisée avec du CO2 pur.
� Une extraction des phospholipides : C’est l’étape clé du procédé pendant
laquelle les phospholipides sont extraits avec un mélange CO2-éthanol.
Mis
e en
form
e
� Formation des liposomes par ajout d’eau : Il s’agit de la dernière étape
qui permet d’agencer les phospholipides extraits en liposomes.
Matièrepremière
Matièredéshuilée
CO2 CO2 +EtOH
CO2 + EtOH + phospholipides
Résidu
CO2 + lipides indésirables
Liposomes
eau
1ère extraction 2ème extractionM
iseen
form
e
- 4 -
Avant de réaliser les différentes expériences d’extraction et d’élaboration des
liposomes, nous avons recherché les différentes sources de sous-produits d’origine marine qui
présentent une composition en lipides intéressantes.
Concernant la partie « extraction », une étude a tout d’abord été menée avec un
dispositif de petit volume (5 et 10 ml) puis deux transpositions d’échelle ont été réalisées, une
avec le même type de réacteur (tubulaire) et l’autre avec un réacteur agité.
Pour la partie « mise en forme », une étude de faisabilité de la mise en forme de
liposomes à partir d’extraits supercritiques par une technique d’hydratation conventionnelle
est tout d’abord réalisée. Ensuite, une étude préliminaire du comportement du système {CO2-
éthanol-eau-phospholipides} a été réalisée afin de déterminer les domaines favorables à la
formation des liposomes. De plus, des essais de mise en forme en liposomes à partir d’extraits
lipidiques obtenus par voie supercritique ont été menés. Enfin, toujours sur la base du
quaternaire {CO2-éthanol-eau-phospholipides}, nous avons étudié une nouvelle technique de
modification de la taille de liposomes.
Ce travail de thèse a pour but de répondre aux interrogations suivantes :
• Avec quel rendement et quel degré de pureté extrait-on les phospholipides à
l’aide d’un procédé utilisant du CO2 et de l’éthanol ?
• Peut-on former des liposomes à partir des phospholipides extraits avec un
mélange CO2-co-solvant ?
• Peut-on envisager une application industrielle du procédé ?
Ce manuscrit s’organise autour de quatre chapitres. Le premier est dédié à une étude
bibliographique s’efforçant de fournir les bases nécessaires à la compréhension de ce travail.
Après une définition des différentes notions liées aux lipides, ce chapitre se poursuit par une
description de l’extraction des lipides puis un état de l’art sur la mise en forme de liposomes.
Le second présente les dispositifs et protocoles expérimentaux utilisés au cours de la thèse.
Les réactifs utilisés ainsi que les techniques de caractérisation mises en place y sont détaillés.
Le troisième chapitre traite de l’étude de l’extraction des lipides par des techniques
supercritiques développées dans le cadre de ce projet. Enfin, la mise en forme de liposomes en
milieu supercritique est abordée lors du dernier chapitre de ce mémoire de thèse.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 5 -
IChapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles
d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 6 -
I.1 Définition : Lipides et liposomes
Les lipides (appelés également corps gras) sont des composés insolubles dans l’eau
mais solubles dans des solvants organiques apolaires tels que l’isopropanol ou le chloroforme.
Ils regroupent un nombre varié de molécules tant du point de vue de leur composition que de
leur fonctionnalité. Nous nous limiterons à la présentation des triglycérides, classés dans les
lipides neutres, et des phospholipides qui appartiennent aux lipides polaires.
I.1.1 Triglycérides
Les triglycérides (TG) sont des triesters d’acides gras (Figure I-1). Ils constituent 95 à
99% des corps gras alimentaires. Ils se présentent soit sous forme solide, on parle alors de
graisses, soit à l’état liquide et on les qualifie d’huiles.
Figure I-1 : Représentation schématique d’un triglycéride
Un des rôles principaux des lipides dans l’organisme est de constituer une réserve
d’énergie (dans les tissus adipeux des animaux).
Les acides gras des triglycérides possèdent généralement une chaîne de carbone à
nombre pair (4 à 24 atomes). Selon le nombre de carbones, on parle de chaîne courte (4 à 8),
moyenne (10 à 14) ou longue (16 à 24). Une chaîne d’acide gras peut contenir jusqu’à 6
doubles liaisons ou insaturations. Ceci permet de distinguer trois classes : les Acides Gras
Saturés (AGS), Monoinsaturés (AGMI) et Polyinsaturés (AGPI). On définit la notion de série
(n ou ω) par la position de la première double liaison par rapport à l’extrémité méthyle
terminal. On distingue ainsi les familles d’acides gras n-9 (ω 9), n-7 (ω 7), n-6 (ω 6) et n-3 (ω
3). En résumé, un acide gras est symbolisé par « XX :Y n-Z» avec XX nombre de carbone, Y
le nombre de doubles liaisons et Z le numéro du carbone portant la première insaturation par
rapport au CH3.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 7 -
Parmi les AGPI, les familles d’acides gras n-6 (ω 6) et n-3 (ou ω 3) présentent un fort
intérêt nutritionnel. L’acide linoléique (18:2 n-6) et l’acide alpha-linolénique (18:3 n-3) sont
qualifiés d’Acides Gras Indispensables (AGI) car ils ne peuvent être synthétisés par
l’organisme et doivent donc être apportés par l’alimentation. Ces acides gras sont les
précurseurs des Acides Gras Essentiels (AGE) puisqu’ils sont transformés par le métabolisme
en dérivés actifs à longues chaînes plus insaturées. Récemment, certains nutritionnistes
préconisent de considérer aussi l’acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6 n-3) comme
indispensable bien qu’il soit synthétisable par l’Homme mais avec un taux de conversion du
18:3 n-3 en DHA faible (ANSES, 2011).
Le Tableau I-1 présente les principaux acides gras de corps gras naturels.
Acide Gras Symbole
Saturés
Laurique 12:0
Myristique 14:0
Palmitique 16:0
Stéarique 18:0
Monoinsaturés
Oléique 18:1 n-9
Polyinsaturés
Linoléique 18:2 n-6
γ-Linolénique 18:3 n-6
Arachidonique 20:4 n-6
α-Linolénique 18:3 n-3
Eicosapentanéoique (EPA) 20:5 n-3
Docosahexaénoïque (DHA) 22:6 n-3
Tableau I-1 : Principaux acides gras et symbolique associée
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 8 -
I.1.2 Phospholipides
Les phospholipides (PL) sont formés d'un glycérol lié à deux acides gras (R1 et R2) et à
un groupement phosphoryle. C’est ce groupement qui donne le nom aux différents PL :
phosphatidylcholine (PC), phosphatidyléthanolamine (PE), phosphatidylsérine (PS),
phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycérol (PG)…(Figure I-2).
Figure I-2 : Structure chimique de différents phospholipides et représentation du caractère amphiphile (Delattre et al., 1993)
Les phospholipides diffèrent les uns des autres par la nature des acides gras mais
essentiellement par leur tête polaire. Du fait de la présence au sein d’une même molécule
d’une partie hydrophile (groupe phosphoryle) et d’une partie hydrophobe (chaînes d’acides
gras), les PL présentent un caractère amphiphile (Figure I-2).
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 9 -
Cette classe de lipides est impliquée dans la constitution des membranes biologiques et
dans le fonctionnement du système nerveux (Fanni et al., 2004).
Dans le langage courant, on désigne par lécithine un mélange de lipides. A titre
d’exemple, en alimentaire la lécithine est répertoriée sous le code E322 dont la composition
est 49 % de PL, 39% de TG, 5% glycolipides, 4% de carbohydrates et 3% de stérols et
tocophérols.
I.1.3 L’autoassemblage des phospholipides en soluti on aqueuse
La nature amphiphile des phospholipides est à l’origine de leur propriété à
s’autoassembler en phase aqueuse. Les phospholipides s’agencent de manière à ce que les
têtes polaires interagissent avec la phase aqueuse minimisant ainsi les interactions des chaînes
hydrophobes avec cette dernière. Il en résulte différentes organisations spatiales. Ce
comportement dépend toutefois de la température, de la pression, de la structure du PL
(notamment de la nature de la tête polaire), de sa concentration ainsi que de la proportion
d’eau dans le mélange (Koynova et Caffrey, 2002).
La forme finale des assemblages dépend de la structure moléculaire des PL. En suivant
une approche géométrique introduite par Israelachvili (Ishaelachvili, 1991), la forme est
déterminée par le paramètre d’empilement P. Il est le rapport entre le volume de la tête (v)
polaire du PL et l’aire de cette dernière (a0) multipliée par la longueur critique (lc) de la
chaîne hydrophobe :
claP
0
ν=
Selon le paramètre P du PL, il s’organisera plutôt sous forme de bicouches planes, de
vésicules, de micelles sphériques, cylindriques ou inverses (Tableau I-2). La structure la plus
fréquente dans la nature est la bicouche lipidique. Dans cette configuration, deux
monocouches de PL sont apposées, les queues hydrophobes des acides gras étant alors prises
en sandwich entre les deux couches de têtes polaires. Si le PL possède un volume
tronconique, les bicouches peuvent présenter un rayon de courbure permettant la formation de
structures sphériques appelées liposomes.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 10 -
Type de lipides cla
P0
ν= Forme Structure
Lipides monocaténaires à large tête polaire, surfactant à faible force ionique
P < 1/3
Micelles sphériques
Lipides monocaténaires à petite tête polaire, Surfactant à grande force ionique ou lipides non ioniques
1/3 < P < 1/2
Micelles cylindriques
Lipides bicaténaires à large tête polaire, chaînes fluides PC, PS, PA
½ < P < 1
Vésicules
Lipides bicaténaires à petites polaire, lipides anioniques à grande force
ionique, chaînes gelées PE, PS + Ca2+ P ~ 1
Bicouches planes
Lipides bicaténaires à petites tête polaire, lipides non ioniques, chaines
poly-cis-iunsaturées, température élevée PE insaturée, PA+ CA2+
P > 1
Micelles inverse
Tableau I-2 : Différents arrangements des phospholipides en solution aqueuse (Delattre et al., 1993)
A partir du diagramme de phase de la dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) (Figure
I-3), on constate que la majorité des phases correspondent à des types lamellaires (tous sauf
Hα et Qα qui sont respectivement des phases hexagonales et cubiques). Néanmoins, la
formation de liposomes ne pourra avoir lieu que pour des températures supérieures à la
température de transition de phase des chaînes d’acides gras et un taux d’hydratation
suffisant.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes
Figure I-3 : Diagramme de phase fraction massique en eau et de la températur
structures lamellaires, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonallamellaire ondulée) (Delattre et al., 1993)
Le diagramme de phase de la lécithine d’œuf est beaucoup plus simple dans la mesure
où toutes les chaines d’acides gras sont au
(Figure I-4). Ainsi, la phase Lα
comporte comme un seul lipide même si elle est constituée de plusieurs espèces moléculaires
de PL.
Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques –
: Diagramme de phase de la dipalmitoylphosphatidylcholine fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide et L
, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonallamellaire ondulée) (Delattre et al., 1993)
Le diagramme de phase de la lécithine d’œuf est beaucoup plus simple dans la mesure
où toutes les chaines d’acides gras sont au dessus de leur température de transition de phase
. Ainsi, la phase Lα est majoritaire. D’autre part, on constate que la l
l lipide même si elle est constituée de plusieurs espèces moléculaires
: des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
– Etude Bibliographique
- 11 -
en fonction de la : phase lamellaire fluide et Lβ, Lβ’ :
, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonal ; Pβ : structure
Le diagramme de phase de la lécithine d’œuf est beaucoup plus simple dans la mesure
dessus de leur température de transition de phase
est majoritaire. D’autre part, on constate que la lécithine se
l lipide même si elle est constituée de plusieurs espèces moléculaires
Chapitre 1 : Lipides et liposomes
Figure I-4 : Diagramme de phase eau et de la températur
I.1.4 Les liposomes ou
Les liposomes, ou vésicules lipidiques, sont définis comme des structures
généralement sphériques composées de bicouches lipidiques emprisonnant un certain volume
aqueux (Keller, 2001) (Figure
Figure I
Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques –
: Diagramme de phase de la lécithine d’oeuf en fonction de la fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide) (Delattre, 1993)
Les liposomes ou vésicules lipidiques
Les liposomes, ou vésicules lipidiques, sont définis comme des structures
composées de bicouches lipidiques emprisonnant un certain volume
Figure I-5).
I-5 : Schéma d'un liposome (Keller, 2001)
: des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
– Etude Bibliographique
- 12 -
en fonction de la fraction massique en (Delattre, 1993)
Les liposomes, ou vésicules lipidiques, sont définis comme des structures
composées de bicouches lipidiques emprisonnant un certain volume
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 13 -
On attribue leur découverte à Bangham en 1961, lorsqu’il effectuait des recherches sur
le comportement de colloïdes dans le sang (Segota et Tezak, 2006). Les liposomes ont la
particularité de pouvoir encapsuler des molécules hydrosolubles dans l’espace interne aqueux
mais également liposolubles dans la membrane phospholipidique.
Les liposomes peuvent être classés selon leur nombre de lamelles (ou bicouches) et
leur taille. On distingue les liposomes multilamellaires (Multi Lamelar Vesicles, MLV), les
unilamellaires de diamètre inférieur (Small Unilamellar Vesicles, SUV) ou supérieur à 100
nm (Large Unilamelar Vesicles, LUV) (Laurin et al., 2004).
L’encapsulation simultanée de molécules lipophiles et hydrophiles rend les liposomes
attractifs notamment pour de nombreuses applications (Tableau I-3) (Keller, 2001 ; Massing
et Fuxius, 2000).
Domaine Exemples d’application
Sciences fondamentales Biophysique (taille, forme des liposomes)
Stabilité des systèmes membranaires
Chimie Catalyse chimique
Pharmacie et médecine
Systèmes de libération contrôle de principes actifs
Traitement des maladies infectieuses
Immun adjuvants
Thérapie anticancéreuse
Diagnostic médical Liposomes magnétiques
Cosmétique Application topique
Agroalimentaire
Encapsulation de molécules d’intérêt nutritionnel
Protection de molécules labiles
Masquage de goût
Tableau I-3 : Exemple de domaines d’application des liposomes (Delattre, 1993)
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 14 -
I.2 Extraction des lipides
I.2.1 Méthodes classiques d’extraction des lipides
I.2.1.1 Extraction de l’huile et des triglycérides
La Figure I-6 décrit le principe d’une extraction d’huile à partir de graines
oléagineuses, ou trituration. La trituration permet d’extraire tous les types de lipides sans
distinction, ce qui en fait un procédé non-sélectif.
Figure I-6 : Fabrication d'huile et de tourteaux à partir de graines (Pages, 2008)
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 15 -
Ce procédé présente deux étapes d’extraction, une principale qui correspond à l’action
mécanique d’une presse, et une en voie solvant complémentaire. En effet, en sortie de presse,
une quantité non négligeable de matières grasses est encore contenue dans les tourteaux.
La gamme de solvants utilisables d’extraction est très restreinte. L’hexane est le
solvant le plus couramment utilisé. De nombreux solvants ne sont pas envisageables pour des
raisons de sécurité industrielle, de toxicité ou d’impact négatif sur l’environnement (Norme :
Directive 88/344). Pour des applications alimentaires, l’utilisation industrielle de solvants est
réglementée par une série de directives européennes qui définissent les critères de pureté et les
conditions d’emploi (Normes : Règlement 1881/2006 et CODEX STAN 19).
Une fois l’extraction par solvant terminée, le tourteau déshuilé contient autour de 30 %
d’hexane (en poids) qu’il faut éliminer aussi parfaitement que possible pour le rendre
conforme aux spécifications requises pour l’alimentation animale et éviter tout risque
d’inflammation et d’explosion pendant son entreposage.
Bien que la majorité de l’hexane soit récupérée (par exemple, 99,92% pour le soja),
des quantités résiduelles d’hexane se retrouvent malgré tout dans :
� l’huile d’extraction (200 ppm)
� les tourteaux (400 ppm)
� l’air sortant de l’installation de désolvantation (100 ppm)
� l’air de l’installation de piégeage des vapeurs par absorption à l’huile minérale
(30% de la limite inférieur d’explosivité),
L’huile en sortie de presse contient une faible quantité de particules solides. Ces
particules, riches en lipases (enzymes hydrolysant les TG) doivent être éliminées efficacement
pour une bonne conservation de l’huile. On les élimine généralement en deux étapes : passage
de l’huile sur tamis statique ou vibrant, suivi d’une filtration.
Pour répondre aux attentes du consommateur et des industriels à savoir : une huile
inodore, incolore, insipide et stable à l’oxydation, l’huile brute doit être raffinée, selon le
protocole présenté Figure I-7.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 16 -
Figure I-7 : Schéma des différentes opérations du raffinage (Pages, 2008)
Il existe deux types principaux de raffinage : le raffinage chimique et le raffinage
physique. Dans le raffinage chimique, les acides gras libres, la plupart des phospholipides et
d’autres impuretés sont éliminés à l’étape de neutralisation avec des solutions de bases, le plus
souvent de la soude. Dans le raffinage physique, les acides gras libres sont éliminés par
distillation à température élevée.
Le raffinage d’un corps gras met en œuvre une série d’étapes qui présentent chacune
ses objectifs. La démucilagination (ou dégommage) des huiles brutes consiste à appliquer un
traitement à l’eau, aux acides dilués (citrique ou phosphorique) ou, plus rarement, à la soude
diluée afin d’éliminer les phospholipides et les matières mucilagineuses. Cette étape permet
d’éviter la formation de précipités dans le produit fini liés à la présence de phospholipides et
d’eau. Les PL retiennent les métaux pro-oxydants, nuisent à la stabilité organoleptique de
Auxiliaire principal de fabrication
H3PO4 (H2O)Acide phosphorique
NaOHsoude
Eau
Terresactivées
Vapeursèchesous vide,
À haute température
Azote
Constituantséliminés
Phospholipides
Acides gras, phospholipidesH3PO4, métaux, certains pigments,
produitsd’oxydation,certains contaminants
Cires végétales
Savons,phospholipides
Pigments colorés,Traces de savons,
Phopholipidesrésiduels,Produits d’oxydation polaires
Cires végétales
Flaveurs,Peroxydes,
contaminant
Prédécirage
(tournesol)
Décirage
(tournesol)
Huile brute
Démucilagination
Neutralisation
LavagesSéchage sous vide
Décoloration
Filtration
désodorisation del’huile décolorée
Inertage
Huile raffinée
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 17 -
l’huile et provoquent des problèmes de coloration de l’huile au cours de son chauffage. Enfin,
ils présentent des propriétés émulsifiantes entraînant une augmentation des pertes au cours du
raffinage.
La trituration et le raffinage permettent ainsi d’obtenir une huile composée à 95-99%
de triglycérides. Industriellement, les PL sont ainsi un sous produit des huileries.
I.2.1.2 Extraction des phospholipides
Actuellement, les principales sources de lécithine sont le soja et le jaune d’œuf
(Gladkowki et al., 2011). Néanmoins, on commence à trouver sur le marché des lécithines
issues du tournesol et du colza. Par ailleurs, on note un intérêt croissant pour les lécithines
marines et les PL du lait. Ces lécithines diffèrent par le type de phopholipides et par leurs
profils d’acides gras (Tableau I-4) (Huopalahti et al., 2007).
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 18 -
Type phospholipides Lécithine
d’œuf Lécithine de soja
Lécithine marine
PL de lait
Phosphatidylcholine (PC) 73 23 85 26
Phosphatidyléthanolamine (PE)
18 22 10 23
Phosphatidylinositol (PI) 3 8 3 7
Acide Phosphatidique (PA) 1 6 - 2
Phosphatidylsérine (PS) - 1 1 8
Shingomyéline 3 - 1 26
Glycolipides - 11 - 8
Carbohydrates - 6 - -
Acides Gras
Palmitique 26 18 16 23
Stéarique 14 5 1 15
Oléique 36 11 20 36
Linoléique 15 58 3 9
Linolénique 1 7 1 1
Arachidonique 5 - 1 -
Eicosapentaenoique (EPA) - - 16 -
Docosahexaénoïque (DHA) 3 - 25 -
Tableau I-4 : Composition de quelques lécithines en fonction de l’origine (Schneider, 2011)
On remarque que les lécithines d’œuf et d’origine marine possèdent une grande
majorité de PC, et qu’elles contiennent du DHA (3% et 25%). De plus, la lécithine marine est
aussi source d’EPA : elle est donc particulièrement intéressante d’un point de vue
nutritionnel.
Les lécithines végétales sont des sous-produits des huileries. La Figure I-8 décrit
l’obtention de la lécithine de soja ainsi que les différents traitements possibles pour enrichir
les lécithines en PL.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 19 -
.
Figure I-8 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine de soja et de ses dérivés (Schneider, 2011)
Les lécithines végétales sont obtenues après l’étape de dégommage qui consiste à
séparer les lipides polaires de l’huile par ajout d’eau. Cette opération est une étape de
raffinage des huiles. Ensuite, en fonction des applications visées, la lécithine obtenue peut
subir différents traitements :
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 20 -
• modification chimique : Il existe de nombreux procédés chimiques de
modification, mais le plus répandu consiste à effectuer une hydrogénation des
chaines d’acides gras des phospholipides
• extraction à l’éthanol : Seules la PC et la PE (dans une moindre mesure) sont
solubles dans l’éthanol. Ce traitement permet donc d’enrichir les lécithines en
PC.
• extraction à l’acétone : Les phospholipides sont insolubles dans l’acétone
contrairement aux TG. L’objectif est donc de déshuiler les lécithines.
• modifications enzymatiques : Selon l’enzyme (phospholipase A1, A2, C ou D)
utilisée, il est possible de faire des hydrolyses ou des modifications de tête
polaire du phospholipide
L’objectif de ces traitements est de modifier la composition de la lécithine de départ de
manière à obtenir des produits aux propriétés fonctionnelles différentes.
La lécithine d’œuf est obtenue par déshuilage à l’acétone de poudre de jaune d’œuf
puis extraction à l’éthanol pour obtenir les phospholipides (Figure I-9).
Figure I-9 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine d’œuf (Schneider, 2011)
Les lécithines marines sont extraites à partir du résidu de presse d’un poisson après
extraction de l’huile. Une première extraction à l’hexane permet d’obtenir l’ensemble des
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 21 -
lipides. Ensuite, tout comme pour les lécithines végétales, une étape de dégommage permet de
séparer les phospholipides de l’huile (Figure I-10).
Figure I-10 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine marine (Schneider, 2011)
Quant aux PL du lait, ils sont obtenus à partir de la crème qui est centrifugée pour
séparer l’eau de la matière grasse. Ensuite, une ultrafiltration sur la fraction sérique permet
d’obtenir la fraction phospholipidique (Figure I-11).
Figure I-11 : Schéma des différentes opérations d’obtention des PL du lait (Schneider, 2011)
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 22 -
Les techniques conventionnelles d’extraction des phospholipides sont complexes et
mettent en œuvre de nombreuses étapes. Elles sont dépendantes de la nature de la matière
première.
I.2.1.3 Extraction des lipides à l’échelle du labor atoire
Des techniques normalisées existent pour la détermination du taux de matière grasse
en fonction de la nature de l’échantillon. Elles sont réalisées et distribuées par l’AFNOR
(Tableau I-5).
Type d’échantillon
Produit animale ou
végétale
Produit agricole ou alimentaire
Amidons et fécules, natifs
ou transformés
Produits laitiers et produits à base de lait
Référence normes
NF ISO 935 V03-030 NF EN ISO
3947 NF ISO 8262
Tableau I-5 : Références des techniques normalisées d’extraction des lipides
En laboratoire, l’extrait lipidique est obtenu généralement selon les protocoles de
Folch ou de Bligh et Dyer qui font appel à des extractions au chloroforme et au méthanol.
L’avantage de la méthode de Bligh et Dyer par rapport à la méthode de Folch est la réduction
de la quantité de solvants utilisée (Iverson et al., 2001). En effet, pour des masses
d’échantillons identiques, la technique de Bligh et Dyer utilise trois volumes équivalents d’un
mélange chloroforme/méthanol (1:2) suivi par un ou deux volumes de chloroforme tandis que
pour la méthode de Folch utilise vingt volumes équivalents d’un mélange
chloroforme/méthanol (2 :1).
Il est également possible d’utiliser un extracteur de type soxhlet. Il s’agit d’un appareil
spécialement conçu pour l'extraction continue solide-liquide. Le solvant est porté à ébullition,
puis condensé avec un réfrigérant, dans le réservoir à siphon, contenant le solide à extraire
dans une cartouche de papier épais. Pour l’extraction des lipides avec ce type d’appareillage,
on utilise comme solvant de l’éther de pétrole.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 23 -
I.2.2 Les méthodes supercritiques d’extraction
Les techniques supercritiques d’extraction ont été développées dans le but d’éviter
l’utilisation de solvants organiques toxiques. L’objectif de cette partie est de présenter
brièvement les propriétés d’un fluide supercritique puis de développer plus spécifiquement les
études relatives aux huiles (triglycérides) et aux phospholipides afin de déduire le domaine de
variation des paramètres essentiels du procédé.
I.2.2.1 Définition et propriétés générales des flui des supercritiques
Les corps purs peuvent se trouver à l’état solide, liquide ou gazeux. Sur le diagramme
température-pression (Figure I-12, cas du CO2), il est possible de distinguer les régions
correspondant à ces trois états grâce aux courbes de changement d’état. La courbe de
vaporisation (liquide-gaz) présente un point d’arrêt dit point critique correspondant à un
couple de pression-température. Dans le cas du dioxyde de carbone (CO2), la pression critique
(Pc) est de 74 bar et la température critique (Tc) de 31,1°C. Au-delà de cette pression et de
cette température, le fluide est dit supercritique. Les fluides supercritiques possèdent des
caractéristiques intermédiaires (viscosité, masse volumique, diffusivité etc…) entre celles de
l’état liquide et de l’état gazeux. Une propriété intéressante de cette zone du diagramme de
phase est le contrôle aisé de ces propriétés physico-chimiques par action sur la pression et/ou
la température. Les fluides supercritiques sont donc des solvants aux caractéristiques très
modulables.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 24 -
Figure I-12 : Diagramme de phase du CO2 (Penchev, 2001)
Dans les procédés d’extraction, on tire profit des propriétés physico-chimiques des
fluides supercritiques :
� La masse volumique : Les fluides supercritiques ont une densité proche de
celle des liquides. Plus elle est élevée, plus le pouvoir solvant est important.
� La viscosité : Les fluides supercritiques ont une viscosité supérieure à celle des
gaz mais inférieure à celle des liquides. Une faible valeur de viscosité favorise
le transfert de matière par une meilleure pénétration dans la matrice et permet
de diminuer l’apport énergétique nécessaire pour déplacer le fluide.
� La diffusivité : Les fluides supercritiques ont une diffusivité inférieure à celle
des gaz mais supérieure à celle des liquides. Le transfert de matière est donc
plus favorable dans des conditions supercritiques que dans un liquide.
C’est la combinaison de ces propriétés qui détermine le pouvoir solvant qui est donc
directement lié à la pression et à la température de travail.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 25 -
I.2.2.2 CO2 supercritique pur et en mélange
Le CO2 est le composé le plus couramment employé dans des conditions
supercritiques en recherche et dans l’industrie puisqu’il présente de nombreux avantages
comme des coordonnées critiques facilement accessibles [Tc = 31°C et Pc = 73,8 bar]. Son
utilisation possible à une température proche de l’ambiante fait qu’il est particulièrement
adapté aux produits thermosensibles. De plus, le CO2 présente les avantages suivants :
� Une forte disponibilité et un prix peu onéreux
� Une non toxicité
� Il est non combustible
� Il est non polaire
� Il est non explosif
� Une élimination aisée (redevient gazeux à pression atmosphérique)
De nombreux procédés ont été développés sur la base des propriétés des fluides
supercritiques. Néanmoins, de nombreuses applications nécessitent l’utilisation de mélanges
qui permettent de renforcer les pouvoirs solvants vis-à-vis de certains composés à extraire.
La Figure I-13 présente le diagramme de phase du CO2- éthanol en fonction de la
pression et de la composition. Quelle que soit la composition, après 100 bar, le mélange est
monophasique. On a donc une très grande miscibilité de l’éthanol avec le CO2.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 26 -
Figure I-13 : Diagramme de phase du CO2-éthanol (49,5 °C) (Seung et al., 2001)
I.2.2.3 Principes généraux de l’extraction solide-l iquide
L’extraction est l’opération qui a pour but, par contact avec un solvant, d’extraire un
ou plusieurs constituants d’une matrice. Il s’agit d’une opération de transfert ou d’échange de
matière entre une phase généralement solide contenant la masse à extraire et le solvant. Le
solvant dissout un ou plusieurs constituants dénommé(s) soluté(s) pour donner une solution
ou extrait. Le solide appauvri en soluté est appelé résidu ; il est inerte ou insoluble.
L’extraction est réalisée par contact du solvant avec le solide. Elle se définit comme le
résultat du transfert du soluté présent dans le solide vers le solvant. Ce transfert exige un
certain temps et introduit une notion de vitesse d’extraction qui est régie par trois processus
(Figure I-14) :
� Passage du solvant dans le solide et dissolution du soluté au sein des
particules du solide (1)
� Diffusion du soluté du cœur vers la surface de la particule (2)
� Diffusion du soluté depuis la surface de la particule vers le cœur du solvant
(3)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Pre
ssio
n (
ba
r)
Composition molaire en CO2
Données expérimentales (Seung N. J., 2001)
Données calculées par Prophys
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 27 -
Figure I-14 : Mécanisme de transfert du soluté de la matrice vers le solvant au cours de l’extraction
La Figure I-15 présente un exemple de courbe d’extraction par percolation à travers un
lit fixe, c'est-à-dire la quantité totale extraite en fonction de la masse de solvant passée.
Figure I-15 : Exemple de courbe d’extraction (masse cumulée)
La courbe d’extraction met en évidence deux régimes d’extraction gouvernés par deux
phénomènes. La première partie de la courbe est linéaire [1], la pente initiale est limitée par la
solubilité et le transfert de matière à travers le lit de matière. Le coefficient directeur de la
solide
soluté à extraire
solvant pur
solvant + soluté
(1) (2) (3)
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
ma
sse
ex
tra
ite
(g
)
masse de solvant (g)
(1) (2)
(1) (2) (3)
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 28 -
droite est inférieur ou égale à la solubilité du soluté dans le solvant.
La seconde partie de courbe caractérisée par un ralentissement puis un arrêt de
l’extraction (asymptote horizontale) [2]. Le transfert de matière du soluté vers le solvant est
beaucoup plus long à cause de son accessibilité. En effet, tout le soluté des premières couches
en contact avec le solvant étant totalement extrait, le soluté doit migrer du cœur de la matière
vers l’extérieur. Ce processus est long, c’est pourquoi on observe un ralentissement de la
courbe puis l’arrêt de l’extraction quand il n’y a plus de soluté accessible ou quand tout le
soluté a été extrait.
L’extraction est un procédé dépendant des caractéristiques phyico-chimiques de la
matière à extraire (granulométrie, forme des particules, hydratation, interactions soluté-
matrice), du lit (compactage/porosité), du soluté (interaction avec la matrice, diffusion,
solubilité dans le fluide extractant), du fluide extraction (solvatation du soluté etc.), de son
débit d'alimentation et des conditions de température et de pression.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 29 -
I.2.2.4 Extraction supercritique des lipides
Dans cette partie, l’extraction des lipides neutres puis de celle des phospholipides sont
détaillées afin de cerner les conditions opératoires susceptibles de conduire à une extraction
sélective des PL. Il est généralement admis que le CO2 étant un composé apolaire, il ne
dissout donc pas les composés polaires de type PL. Depuis une vingtaine d’années, il a été
utilisé comme solvant d’extraction pour les lipides d’origines animale et végétale.
I.2.2.4.1 Extraction des lipides neutres
Le CO2 a donc la particularité d’extraire préférentiellement (voire de manière
sélective) les lipides neutres. A titre d’exemple, l’extraction des lipides de la peau de colin en
utilisant le CO2 supercritique montre que 96% des TG (initialement présent dans la matière)
sont extraits (Rodriguez et al., 2008). Une autre étude sur des sous produits de calamar
indique qu’il est aussi possible d’extraire 51 % de cholestérol (initialement présent dans la
matière) (Kang et al., 2005)). Les phospholipides quant à eux ne sont pas ou très peu extraits
(Boutin et al., 2009 ; Dunford et Temelli, 1995).
Le Tableau I-6 résume les rendements d’extraction ainsi que les conditions opératoires
considérées comme optimales pour l’extraction des lipides neutres déterminées par différentes
études.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 30 -
Matière première P / T Débit
Durée extraction
(min)
Masse traitée (g)
Quantité de CO2 utilisée /
matière traitée (g/g)
Rendement (masse de lipides
extraite/masse lipides initiale) (%)
Analyse des espèces de
lipides extraits
Référence
Flocons de soja 320 bar / 80°C NC NC 600 NC 96,7 Oui : pas de
PL (Montanari et
al., 1999) Graines de tournesol
450 bar / 75°C 19 kg/min 120 1000 38 78,5 Oui : pas de
PL (Boutin et al.,
2009) Graines de
colza 450 bar / 75°C 19 kg/min 120 1000 38 89,8
Oui : pas de PL
(Boutin et al.,
2009) Graines de
colza 552-621 bar /
45-70°C NC 180 45 NC NC
Oui :pas de PL
(Dunford et
Temelli, 1997) Graines de
colza 360 bar / 55°C 0,7 g/min 360 4 ou 7 36 ou 63 95 Non
(Fattori et al.,
1988)
Œufs déshydratés
414 bar / 45°C 10 g/min 40 10 40 68
Oui : lipides neutres
(98%) et PC (2%)
(Shah et al.,
2004)
Œufs déshydratés
517 bar / 40°C 0,35 mg/min 120 1 42 100 Oui : TG, PL (26,3%) et cholestérol
(Boselli et
Carbon, 2000)
Peau de colin 250 bar / 40°C 10 kg/h 180 100 300 96,5 Oui :
« huile » (Rodriguez et al.,
2008) Chair de sardine
lyophilisée 180bar / 40°C 10 g/min NC NC NC NC
Oui : TG et cholestérol
(Esquivel et al.,
1997)
Crevettes (têtes et queues)
300 bar / 50°C 2,5 g/min 200 7 71 46 Oui : lipides non polaires
(Sanchez-
Camargo et al.,
2001)
Tableau I-6: Récapitulatif des conditions d'extraction des lipides par CO2 supecritique
NC : Non Calculable
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 31 -
D’une manière générale, l’ensemble des études présentées dans le Tableau I-6
concerne une extraction en continu dans des réacteurs tubulaires de type piston à des échelles
analytiques ou pilotes. Les rendements d’extraction sont variables d’une étude à l’autre mais
peuvent atteindre des valeurs importantes, signe d’un fort potentiel de ce genre de technique.
Les différences de performance peuvent être expliquées par la nature de la matière première
mais également le taux de phospholipides présent dans la matrice qui ne sont pas extraits par
le CO2. Dans la majorité des cas, la quantité de solvant est similaire et de l’ordre de 40 g de
CO2 par g de matière première. Pour la peau de colin et les sous-produits de crevettes, les
masses de solvant utilisées sont plus importantes mais on peut penser que ce paramètre n’a
pas été optimisé.
En résumé, les gammes de pression, de température et de masse de solvant utilisées
pour l’extraction des lipides neutres sont :
180 bar < P < 621 bar
35°C < T < 80°C
pour 1 g de matière première 36 g de CO2 < masse de solvant < 300 g de CO2
Il est intéressant de noter que, dans des conditions d’extraction utilisant des mêmes
gammes de pression et température, Boselli et al., (Boselli et Carbon, 2000) ont obtenu un
extrait lipidique à partir d’œuf contenant 26% de PL alors que Dunford et al. (Dunford et
Temelli, 1997), n’ont pas extrait de phospholipides à partir de graines de colza. Ceci met en
évidence l’importance de la matière première. En effet, on peut penser que dans le premier cas
les phospholipides sont plus « accessibles » que dans le second ou que la teneur initiale en PL
des matières premières est différente. Pour une même matière première (par exemple les
graines de colza), on peut obtenir des rendements d’extraction élevé en utilisant des
paramètres d’extraction variables (Montanari et al., 1999 ; Boselli et Carbon, 2000 ;
Rodriguez et al., 2008).
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 32 -
Un autre point intéressant de ces études est l’importance du couple pression-
température. En effet, à faible température, il faut généralement travailler à haute pression et
inversement. Pour expliquer ce comportement, il existe un modèle reliant la solubilité (noté C
en g d’huile par litre de CO2) de l’huile végétale en fonction de la température (T en K) et de
la masse volumique (ρ en g/l) qui dépend de la pression et de la température (Numan et al.,
1988) :
ln � = 40,361 − 18708� + 2186840
�² + 10,724 ln �
Cette équation est valable pour :
148 bar < P < 868 bar
20°C < T < 80°C
Cette loi illustre le lien entre la température et la pression dans la mesure où la masse
volumique dépend de pression (pour une température donnée) sur la solubilité.
I.2.2.4.2 Extraction supercritique des phospholipid es
Pour extraire les phospholipides, il est nécessaire de modifier la polarité du solvant du
CO2 qui permet plutôt l’extraction des lipides neutres. Pour cela, l’ajout d’un co-solvant est
nécessaire. Généralement, c’est l’éthanol qui est utilisé puisqu’il solubilise certains
phospholipides. De plus, il est considéré comme GRAS (generally recognized as safe) ce qui
permet d’élargir les domaines d’application visés. D’après ce qui est connu sur l’utilisation de
l’éthanol dans le fractionnement des lécithines (cf I.2.1.2), l’association CO2-éthanol devrait
extraire majoritairement la PC et la PE (dans une moindre mesure).
Cependant, en utilisant comme solvant d’extraction un mélange CO2-éthanol
directement sur la matrice, les PL sont extraits et les lipides neutres également. L’extrait ainsi
obtenu présente une proportion faible en phospholipides. C’est pourquoi, pour l’obtention
d’extraits enrichis en phospholipides, une procédure en deux étapes est généralement réalisée.
La première consiste à extraire les lipides neutres avec du CO2 pur. La seconde consiste à
extraire les phospholipides avec du CO2-éthanol. La première étape peut être assimilée à un
« déshuilage » de la matrice, la seconde, est l’extraction des phospholipides proprement dite.
Le Tableau I-7 résume les conditions opératoires utilisées dans différentes études pour
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 33 -
l’extraction des phospholipides.
Matière première Flocons de soja*
Tourteaux de colza
Lécithine de soja Œufs déshydratés*
P (bar) /T (°C) 689 / 70 552 / 70 207 / 60 414 / 60
Ethanol (% molaire)
10 7,5 10 50
Masse traitée (g) 4,5 65 3 8
Durée de l’extraction (min)
30 90 150 40
Débit de CO2
(g/min) 1,7 7,3 2 10
Débit d’éthanol (g/min)
0,19 0,6 0,22 12
Quantité de CO2 utilisée / matière
traitée (g/g) 11,33 10,10 100 50
Quantité d’éthanol utilisée / matière
traitée (g/g) 1,27 0,83 11 60
Rendement (masse PL extraite / masse
PL échantillon) (%)
100 22,5 NC 17,9
Pureté NC 39% de PL
dans l’extrait lipidique
95% de PC dans la fraction PL
93% de PL dans l’extrait lipidique
Référence (Montanari et
al., 1999) (Dunford et
Temelli, 1995) (Tebericker et al.,
2001) (Shah et al.,
2004)
Tableau I-7 : Conditions d'extraction des phospholipides
(*procédé en 2 étapes : CO2 pur puis CO2-éthanol)
L’ensemble des extractions est réalisé dans des réacteurs tubulaires. Les quantités de
matière première traitées vont de 3 à 65 g. Les rendements d’extraction sont variables d’une
étude à l’autre mais une valeur de 100% est obtenue pour une extraction à partir de flocon de
soja à 689 bar et 70°C. Le traitement préalable au CO2 n’est pas toujours efficace pour
éliminer les lipides neutres comme le montrent les résultats obtenus sur les œufs (Shah et al.,
2004)
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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A l’exception du cas de l’œuf, les pourcentages d’éthanol utilisés sont de l’ordre de
10%. Le taux élevé d’éthanol utilisé pour l’extraction des PL de l’œuf peut être nécessaire
pour détruire des interactions lipides/protéines. Par ailleurs, l’intérêt du déshuilage est mis en
évidence sur la pureté des extraits obtenus (Shah et al., 2004).
D’après ces données, les conditions opératoires pour extraire les phospholipides sont :
200 bar < P < 700 bar
60°C < T < 80°C
7,5 % < % éthanol < 50%
Pour 1 g de matière première 10 g de CO2 < masse de CO2< 100 g de CO2
Pour 1 g de matière première 0,8 g d’éthanol < masse d’éthanol< 60 g d’éthanol
Il est intéressant de noter qu’il possible d’extraire les phospholipides à « basse
pression ». Par contre, il faut faire attention lorsqu’on utilise des proportions de co-solvant
importantes car cela risque de diminuer la pureté des extraits. En effet, plus le pourcentage
d’éthanol est grand, plus d’espèces polaires seront extraites. Les températures mises en jeu
semblent être importantes et risquent de dégrader la matière première et donc aboutir à un
extrait de qualité moindre. Il n’y a pas d’information à ce sujet dans la littérature.
Les paramètres opératoires sont probablement tous liés. Par exemple, une grande
proportion d’éthanol peut compenser une faible pression ou inversement une faible pression
peut permettre de réduire la teneur en alcool.
I.2.2.4.3 Influence de la préparation de la matière première sur l’extraction des lipides
L’extraction supercritique des lipides dépend des paramètres tels que la pression et la
température notamment à cause de leur action sur la solubilité. Cependant, la matière
première a également un impact important sur l’extraction puisqu’elle va principalement
influer sur la résistance au transfert de matière. Dès lors, on peut être amené à prétraiter la
matière première notamment en réalisant un broyage, un séchage ou un trempage.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 35 -
Fragmenter un l’échantillon à traiter permet d’augmenter la surface spécifique afin de
favoriser le transfert de matière. Cette action conduit également à une destruction de la
structure de la matière première susceptible de rendre accessibles des zones de la structure qui
ne l’était auparavant.
Dans le cas spécifique de l’extraction de lipides, Fattori (Fattori et al., 1988) a
comparé l’impact sur le rendement d’extraction (η, masse de lipides extraits/masse de lipides
de l’échantillon) de cinq prétraitements de réduction de tailles différents effectués sur des
graines de colza :
� Broyage à l’aide d’un broyeur à rouleaux puis cuisson à 90°C pendant 30
min [η=86%]
� Broyage à l’aide de couteaux mis en rotation sur une période de 5 min
[η=79%]
� Dépressurisation rapide de l’échantillon [η=79%] saturé en gaz
� Broyage à l’aide d’un pilon et mortier [η=55%]
Le meilleur prétraitement pour l’extraction des lipides est le broyage à l’aide de
rouleaux. De plus, cette étape permet d’inactiver certaines enzymes. Si le broyage permet
globalement d’améliorer l’extraction, c’est une opération qui n’est dépourvue d’inconvénients
(rendement énergétique très faible, contrôle de la taille limité, pas applicable aux produits
thermosensibles, nécessite parfois l’utilisation d’adjuvant…).
La teneur en eau de la matière première est également susceptible de modifier
l’extraction. Le pourcentage d’eau contenu dans l’échantillon influe sur l’affinité de l’huile
avec le CO2 supercritique. Par exemple, sur la peau de colin, 96,5% de lipides sont extraits
pour des humidités faibles (8,4 et 17,8%) alors que seulement 73,3% des lipides sont
récupérés pour des humidités plus élevées (51,5%) (Rodriguez et al., 2008). Par conséquent,
un prétraitement de séchage améliore l’extraction mais une élimination complète de l’eau
n’est pas recommandée : cela n’améliore pas les rendements d’extraction et ce n’est pas
économiquement rentable.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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Une technique de préparation d’échantillons spécifique à l’extraction des
phospholipides consiste à faire macérer la matière première dans de l’éthanol (Dunford et
Temelli, 1995). Cela permet d’améliorer les rendements en lipides polaires (20,8% à 30,4%)
mais l’apparition d’un « gâteau » très compact finit par créer des problèmes de colmatage
dans le réacteur.
Dans certaines études, l’échantillon est mélangé à des billes de verre, de la celite (1 :1
en masse) ou du sable (1 :1 en masse) (Boselli et Carbon, 2000 ; Shah et al., 2004). Il est
probable que cela permette d’éviter que le solvant ait des chemins préférentiels dans la
matière première.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 37 -
I.2.3 Conclusion sur l’extraction
Le Tableau I-8 présente une comparaison de l’extraction des lipides neutres par
solvant et par fluides supercritiques.
Extraction conventionnelle
(Solvant)
Extraction supercritique par du CO2 pur
(180 bar < P < 621 bar/ 35°C < T < 80°C)
Résidus de solvants toujours présents dans
l’extrait (quelques ppm) dépendant du type
de solvant utilisé (généralement hexane)
L’extrait ne contient aucune trace de solvant
Présence de métaux lourds et de sels
inorganiques dans l’extrait inévitable et
dépendant du type de solvant utilisé
Pas d’extraction de ces deux types de
composés
Nécessite l’élimination des phospholipides Forte sélectivité pour les lipides neutres
Opération supplémentaire pour éliminer les
solvants résiduels dans l’équipement mais
également dans la matière délipidée
Nécessite un retraitement/recyclage de
l’hexane
Pas d’utilisation de solvant toxique
Prétraitement : aplatissage et/ou broyage Prétraitement : déshydratation et broyage
Coût élevé d’utilisation Coût élevé de l’installation
Tableau I-8 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des lipides neutres
Les avantages de l’extraction supercritique des lipides neutres par rapport aux
techniques conventionnelles sont la diminution du nombre d’étapes, la non utilisation de
solvants toxiques et polluants. De plus, il est possible de recycler le CO2 et son coût est
largement inférieur à celui de l’hexane. Par contre, le coût d’une installation haute pression
est important et doit donc être rentabilisé sur une longue période ou sur l’extraction de
matières à forte valeur ajoutée.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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Plusieurs études (Rodriguez et al., 2008 ; Esquivel et al., 1997) indiquent qu’il n’y a
pas de différences significatives du profil d’acides gras obtenus avec les deux types
d’extraction. Les rendements atteints peuvent être très élevés (98%) mais dépendent des
paramètres opératoires et de la matière première utilisée.
Dans le cas des phospholipides, le Tableau I-9 présente une comparaison des
techniques conventionnelles et supercritiques.
Extraction conventionnelle
(Solvant)
Extraction supercritique avec un mélange CO2-éthanol
(200 bar < P < 700 bar/ 60°C < T < 80°C/ 7,5 % < éthanol < 50%)
Résidus de solvants toujours présents dans
l’extrait (quelques ppm) dépendant du type
de solvant utilisé (généralement éthanol ou
acétone)
Extrait mélangé au co-solvant (généralement
l’éthanol)
Extraction de tous les types de
phospholipides
Extraction de PC et PE (dans une moindre
mesure)
Nécessite une étape de fractionnement pour
obtenir de la PC pure
Présence de triglycérides
Possibilité d’obtenir des extraits très purs en
PC
Opération supplémentaire pour éliminer les
solvants résiduels dans l’équipement mais
également dans la matière délipidée
Pas d’utilisation de solvant toxique
Tableau I-9 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des phospholipides
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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Pour l’extraction des phospholipides, hormis dans le cas d’une matière première
contenant très peu de lipides neutres, les deux techniques nécessitent plusieurs étapes. En
effet, pour les méthodes conventionnelles, on extrait tous les lipides et ensuite on sépare les
PL des autres espèces. Pour les techniques supercritiques, une étape préalable d’extraction des
lipides neutres est nécessaire pour obtenir un extrait de PL contenant peu voire pas d’autres
lipides.
En résumé, cette analyse bibliographique permet d’envisager un procédé d’extraction
de lipides par techniques supercritiques. Pour obtenir un extrait pur en phospholipides, il est
nécessaire d’effectuer une première extraction des lipides neutres avec du CO2 pur, puis une
seconde avec un mélange CO2-éthanol (5-50% massique de co-solvant) pour extraire les
phospholipides. Que ce soit dans le cas des lipides neutres ou des phospholipides, les
conditions de pression et de température requises sont de :
180 bar < P < 700 bar
35°C < T < 80°C
De plus, un prétraitement de séchage et de broyage de la matière première à traiter doit
être effectué. L’objectif est de diminuer le taux d’humidité afin d’améliorer l’extraction et de
diviser la matrice.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 40 -
I.3 Les techniques de préparation des liposomes
I.3.1 Les techniques conventionnelles
Il existe de nombreuses techniques de préparation de liposomes. Tous les moyens
conventionnels nécessitent l’utilisation d’une phase aqueuse et d’une phase organique. Cette
dernière sert généralement à solubiliser les lipides avant d’être dispersée dans la seconde
phase.
Quelle que soit la technique utilisée pour mettre en contact les deux phases, un post
traitement complémentaire peut être réalisé afin de réduire la taille des liposomes ou de
modifier leur lamellarité. Les plus courantes sont la sonication, l’extrusion sur membrane ou
encore l’homogénisation à l’aide d’un microfluidiseur.
Le Tableau I-10 résume les principales techniques de préparation de liposomes telles
que :
� Technique du film (hydratation d’un film phospholipidique)
La technique du film aussi appelée méthode de Bangham est un procédé courant. La
première étape consiste à dissoudre les lipides dans un solvant organique. Ensuite, on évapore
ce même solvant méticuleusement pour aboutir à la formation d’un film lipidique. La
formation des liposomes s’obtient par simple hydratation du film avec une solution aqueuse
tout en maintenant une agitation nécessaire au détachement des couches lipidiques.
Les liposomes obtenus sont multilamellaires avec une taille de l’ordre de quelques
micromètres. Il s’agit d’une technique simple (formation spontanée de liposomes) mais la
qualité du film est le point crucial.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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� Technique d’injection d’éthanol ou d’éther
Les phospholipides sont initialement dissous dans l’éthanol ou l’éther, puis la solution
est injectée dans une phase aqueuse via une aiguille. En utilisant de l’alcool éthylique, les
liposomes obtenus sont hétérogènes du fait de la pauvre solubilité de certains lipides dans ce
dernier. De plus, il est possible d’avoir des traces de solvant dans la dispersion si rien n’est
entrepris pour le retirer entièrement. En substituant l’éther à l’éthanol, la technique est plus
performante. En effet, ce dernier n’est pas miscible avec l’eau ce qui permet, par simple
chauffage, d’éliminer le solvant. Cependant, la technique est difficilement contrôlable.
Les liposomes obtenus sont de tailles variables (dépendant des dimensions de
l’aiguille et de l’injection en général), unilamellaires et très concentrés.
� Evaporation en phase inverse
La formation des liposomes est rendue possible par la dispersion de gouttelettes d’eau
sous forte agitation dans un solvant organique contenant les phopholipides. Initialement, des
micelles d’eau/phospholipides sont produites. Puis, par évaporation de la phase organique,
généralement réalisée à l’aide d’un évaporateur rotatif, les liposomes se forment.
Les liposomes obtenus sont unilamellaires ou multilamellaires selon la concentration
en phospholipides.
� Passage par des émulsions doubles
Une autre possibilité consiste à former au préalable une émulsion eau/huile : à une
grande quantité de phase organique contenant les phospholipides solubilisés, il faut ajouter
une petite proportion de solution aqueuse tout en ayant une forte agitation. Spontanément, les
phopholipides vont se mettre à l’interface pour former une monocouche lipidique. Ensuite,
l’émulsion simple est transformée en une émulsion double en ajoutant le mélange précédent à
un excès de phase aqueuse. Un flux de diazote, barbotant dans l’émulsion double permet
d’éliminer le solvant organique et de former les liposomes.
On obtient des liposomes unilamellaires.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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� Elimination du détergent de micelles mixtes
Dans cette méthode, les phospholipides sont d’abord formulés dans des micelles
mixtes lipides/tensio-actifs dans un milieu aqueux. En éliminant le tensio-actif à vitesse
contrôlée des liposomes unilamellaires se forment.
La taille des liposomes varie selon la technique d’élimination du détergent. La plus
courante est la dialyse mais elle présente l’inconvénient d’être lente. On peut aussi utiliser
l’adsorption du détergent sur des résines hydrophobes (Delattre, 1993). L’inconvénient de
cette technique est qu’il faut s’assurer de l’élimination totale du tensio-actif des membranes
des liposomes.
Méthode Type de
liposomes Taille des liposomes
(µm) Référence
Technique du film MLV 1-3 (Delattre, 1993)
Technique d’injection d’éthanol ou d’éther
LUV ou SUV Variable (dépend de
l’injection) (Laurin et al.,
2004)
Evaporation en phase inverse
MLV ou LUV (dépend de la concentration)
<1 (Meure et al.,
2008)
Passage par des émulsions doubles
SUV 0,05 (Shum et al., 2008)
Elimination du détergent de micelles
mixtes SUV ou LUV
Variable (dépend de l’élimination)
(Delattre, 1993)
Tableau I-10 : Les méthodes classiques de formation de liposomes (MLV : Multi Lamellar Vesicles, LUV : Large Unilamellar Vecicles et SUV : Small Unilamellar Vesicles)
En conclusion, les techniques conventionnelles de formation des liposomes permettent
d’avoir des vésicules de l’ordre d’une vingtaine de nanomètres à quelques micromètres.
Certaines ont l’avantage d’être simples à mettre en œuvre. Elles comptent toutes plusieurs
étapes et sont principalement utilisées sur de petits volumes de solution. Il est difficilement
concevable d’utiliser ce genre de technique à grande échelle notamment pour la plus courante
(Bangham). De plus, elles ont l’inconvénient majeur d’utiliser des solvants organiques ce qui
limite les applications (notamment au domaine médical).
On peut également ajouter que certaines étapes telles que l’agitation impliquent
parfois un cisaillement important et une élévation locale de température qui risquent de
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 43 -
dénaturer les composés lipidiques notamment les acides gras polyinsaturés. Pour ces raisons,
il est nécessaire de développer de nouvelles techniques. L’utilisation de fluides supercritiques
peut permettre de formuler des liposomes en réduisant les inconvénients évoqués
précédemment.
I.3.2 Les techniques supercritiques
Les techniques de préparation de liposomes par voie supercritique ont été développées
pour résoudre les problèmes induits par les techniques conventionnelles de préparation
(utilisation de solvants toxiques, nombreuses étapes…). Plusieurs méthodes ont vu le jour
pour l’obtention de liposomes en utilisant des conditions supercritiques, nous détaillerons
certaines de ces méthodes en explicitant leurs avantages et inconvénients.
Le Tableau I-11 compare les différentes techniques basées sur l’utilisation de CO2
supercritique, à noter que nous ne faisons pas apparaître celles nécessitant une phase de
réhydratation.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 44 -
Méthode Solvant
(hormis CO2) Phospholipides
Pression (bar)
Température (°C)
Taille des liposomes (µm)
(type) Référence
Méthode des liposomes
« supercritiques » Ethanol
Palmitoyl oléoyl phosphatidylcholine
250 60 0,02 – 0,25
(unilamellaire et multilamellaire)
(Frederiksen et
al., 1997)
Décompression et d’injection
Ethanol Phosphatidylcholine et
phophastidyléthanolamine 130-200 60
Décompression : 0,01 – 0,3
(unilamellaire) Injection :
0,06- 2 (multilamellaire)
(Castor, 1994)
SCRPE Ethanol L-α-
dipalmitoyphosphatidylcholine 150-250 20-55
0,1 – 1,5 (unilamellaire)
(Otake et al.,
2001)
ISCRPE Aucun L-α-dipalmito/α-dipalmito/1-α-distéaroyl/1-α-dioléoyl-
phosphatidylcholine 200 60
0,1 – 1,5 (unilamellaire)
(Otake et al.,
2006)
DESAM Ethanol ou
chloroforme Distéaroyl-
phosphatidylcholine 60 22 et 75
0,05 – 0,4 (unilamellaire)
(Laurin et al.,
2004)
Tableau I-11 : Conditions opératoires des techniques supercritiques d’obtention de liposomes
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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� Méthode des liposomes « supercritiques »
La première technique de préparation de liposomes a été développée par Frederiksen
en 1994 (Frederiksen et al., 1997). Cette méthode en deux étapes consiste à préparer une
solution {CO2-éthanol 5-7 (% molaire)} et phospholipides dans une unité de dissolution (P =
250 bar et T = 50°C) au moyen d’une recirculation en boucle fermée, puis à introduire la
phase dans le capillaire de détente (Figure I-16). Le capillaire de détente est également
l’endroit où se forment les liposomes. Pour éviter d’introduire une trop grande quantité d’eau
et par conséquent trop diluer la quantité de phospholipides, un système de recirculation est
mis en place.
A partir de cette méthode, deux populations de liposomes sont obtenues : une très
grande majorité de SUV d’une taille comprise entre 0,02 µm et 0,05 µm et des MLV d’une
taille d’environ 0,25 µm.
Figure I-16: Schéma simplifié de la technique de préparation de liposomes développée par Frederiksen (Meure et al., 2008)
Unité de dissolution
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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� Méthode d’injection et de décompression
La technique d’injection consiste à mélanger les phospholipides et un fluide
supercritique qui est généralement du CO2 puis à injecter ce mélange à travers une buse dans
une solution aqueuse, maintenue dans des conditions ambiantes : les liposomes sont formés.
La méthode de décompression est une variante de la précédente dans la mesure où la
solution aqueuse est mise en contact avec le mélange (CO2 + PL) sous pression. C’est ce
mélange ternaire (Eau + CO2 + PL) qui est ensuite injecté par une buse dans une enceinte.
La dépressurisation, la taille de la buse, le fluide, le co-solvant éventuellement utilisés
et la pression sont des facteurs qui influent sur la taille finale des objets (Castor, 1994). En
optimisant le procédé, en formulant des liposomes d’une taille de l’ordre de 100-200 nm
peuvent être obtenus.
Une pression comprise en 130 et 200 bar et une température de 60°C sont nécessaires.
L’étape clé du procédé est clairement la solubilisation des lipides lors de la première étape qui
est de l’ordre d’au moins une heure. Les liposomes sont de type SUV.
� « Supercritical Phase Reverse Evaporation »
Ce procédé, contrairement aux deux autres, est de type Batch, c'est-à-dire qu’il est
impossible de récupérer le produit fini sans stopper le processus. Le principe est illustré
Figure I-17 dans les deux variantes. « SuperCritical Phase Reverse Evaporation » (SCPRE)
est une technique très simple à mettre en place. Il suffit de mélanger les phospholipides (0,3%
massique), l’éthanol (0-15% massique) dans une cellule puis d’introduire le CO2 jusqu’à une
pression de 200 bar (T = 60°C) : le mélange devient homogène. Après 30 min à l’équilibre,
une solution aqueuse est introduite toujours à pression constante. La quantité d’eau ajoutée
n’est pas précisée par les auteurs mais on peut imaginer qu’elle est en excès par rapport à
l’éthanol. Ensuite, la cellule est dépressurisée et on obtient une suspension homogène de
liposomes. Toutes les étapes sont réalisées sous agitation magnétique (Otake et al., 2001).
Le procédé a ensuite été simplifié en ce sens qu’il ne fait plus intervenir d’alcool
(nouvelle appellation : Improved SuperCritical Phase Reverse Evaporation) (Otake et al.,
2006) (Figure I-17). Les phospholipides et la solution aqueuse sont introduits dans le réacteur.
On chauffe le système puis on introduit le CO2 pour atteindre une pression de 200 bar.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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L’agitation est maintenue pendant 40 min et est suivie d’une dépressurisation pour obtenir la
dispersion.
Pour le premier procédé, la solution aqueuse est progressivement introduite dans un
mélange homogène de phospholipides, d’éthanol et de CO2. Ceci entraine la formation d’une
émulsion eau/CO2. Quand suffisamment d’eau est introduite dans le milieu, l’émulsion
s’inverse et devient CO2/eau (Figure I-17 c). La dépressurisation conduit à la formation de la
dispersion souhaitée. Pour la technique ISCPRE, le mélange de PL et de solution aqueuse est
inhomogène (Figure I-17 e). L’ajout de CO2 permet d’obtenir l’émulsion CO2/eau, la
dépressurisation aboutit à la formation des liposomes.
La taille des vésicules est de l’ordre du micromètre et elles sont de type unilamellaire
(Otake et al., 2001).
Figure I-17 : Schéma du mécanisme SCPRE (a-d) et ISCPRE (e-g) (Otake et al., 2006)
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
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� “Depressurisation of an Expanded Solution into an Aqueous Media”
(DESAM)
Cette technique consiste à dépressuriser un fluide contenant les phospholipides dissous
dans un solvant organique (chloroforme ou éthanol) dans une solution aqueuse. A la
différence des techniques précédentes, on ne cherche pas à faire un mélange CO2 + PL
monophasique. La solution solvant organique + phospholipides est simplement saturée en
CO2 et c’est la détente de cette solution CO2 saturée dans la phase aqueuse qui provoque la
formation de liposomes.
Les liposomes obtenus sont unilamellaires et ont une taille comprise entre 50 et 200
nm en utilisant de l’éthanol et un diamètre moyen de 400 nm avec du chloroforme.
Un schéma de l’installation est présenté Figure I-18. On discerne les deux parties
majeures du procédé à savoir la chambre d’expansion et celle de formation des liposomes.
Dans la première chambre, les phospholipides sont solubilisés dans un solvant organique
(avec une concentration de 5 à 20 mg.ml-1). Ensuite le CO2 est introduit à une pression de 60
bar et une température de 22°C pour ne pas risquer la précipitation des PL. Le mélange (CO2
+ PL+ solvant) biphasique est ensuite injecté dans la chambre de dépressurisation via une
buse qui trempe dans la solution aqueuse (Meure et al., 2009). La température de 75°C de la
chambre des liposomes favorise l’élimination du solvant.
L’inconvénient majeur de ce procédé est la présence résiduelle de traces de solvant
dans la dispersion de liposomes et l’utilisation de solvant organique de manière générale.
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 49 -
Figure I-18 : Schéma de l'installation DESAM (Meure et al., 2008)
� Recristallisation puis hydratation de poudre de phospholipides
Cette technique est radicalement différente des précédentes en ce sens qu’elle est
basée, comme dans une méthode traditionnelle, sur l’hydratation de poudre de PL préparée
par une voie dite « CO2 antisolvant » ou bien par évaporation d’une solution chloroformique
toujours à l’aide de dioxyde de carbone. Ensuite, de l’eau est ajoutée à la poudre de PL pour
former des liposomes.
Les liposomes obtenus peuvent être unilamellaires ou multilamellaires et de taille
variable, la phase d’hydratation étant déterminante (Badens et al., 2001).
T= 22°C
P= 60 bar
T= 75°C
P= P atmosphérique
Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux
techniques supercritiques – Etude Bibliographique
- 50 -
En conclusion, les techniques supercritiques de formation de liposomes font
généralement intervenir quatre constituants qui sont le CO2, l’éthanol, les phospholipides et
l’eau. Ce système quaternaire est complexe et son comportement est actuellement peu connu.
Pour la réalisation de ce mélange, il y a deux possibilités, la première étant l’ajout d’eau sous
pression au système (CO2-éthanol-PL) ou lors de la dépressurisation de ce dernier. Cependant,
certaines interrogations se posent :
� Quel est l’impact du moment de l’ajout d’eau au système sur la formation
de liposomes ?
� A quelle étape y a-t-il formation des liposomes? Est-ce sous pression ou
lors de la dépressurisation ?
Ces questions restent ouvertes aujourd’hui et nécessitent une investigation sur le
système quaternaire pour tenter d’apporter des éléments de réponse.
De plus, les phospholipides forment spontanément des liposomes en excès d’eau, ce
qui nous amène à nous demander quel est le degré d’impact du CO2 sur les vésicules.
Les procédés supercritiques de formation de liposomes utilisent généralement de
l’éthanol. Ce solvant est donc présent dans les dispersions obtenues, cela peut constituer un
problème selon l’application visée.
Enfin, les techniques supercritiques de formation de liposomes permettent d’éviter ou
d’annuler l’utilisation de solvant(s) non GRAS ce qui constitue l’intérêt majeur de cette voie.
De plus, il est possible d’avoir un contrôle de la granulométrie. Cependant, les procédés
supercritiques nécessitent un apport énergétique supérieur aux techniques conventionnelles
notamment à cause des pressions requises et un investissement initial dans l’équipement
conséquent.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 51 -
IIChapitre 2 : Matériels et méthodes
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 52 -
II.1 Matière première
II.1.1 Nouvelle source : la coquille Saint Jacques
La coquille Saint-Jacques (nom scientifique Pecten maximus) est un mollusque
bivalve de la famille des Pectinidés. Parmi toutes les espèces de cette famille, celle qui est
utilisée dans cette étude reconnaissable à sa coquille pourvue de côtes en éventail, dont la
valve supérieure est totalement plate, et par sa grande taille comparée aux autres espèces du
genre Pecten et aux pétoncles ou vanneaux dont les deux valves sont bombées.
La coquille Saint-Jacques, est présente dans les eaux tempérées européennes depuis les
côtes de Norvège jusqu'au nord de l'Espagne. Sa pêche est strictement réglementée en France,
où elle n'est autorisée, que du 1er octobre au 15 mai par arrêté ministériel. En revanche, sa
pêche est autorisée toute l'année à Jersey, aussi bien à la plongée qu'au dragage. Les coquilles
mettent deux ans en Manche est et trois ans en Manche ouest et Atlantique pour atteindre leur
maturité. La taille marchande de la coquille Saint Jacques est de 11 cm pour la Manche et de
10,2 cm pour la Manche ouest et les autres gisements. C'est une taille communautaire qui
s'applique donc à tous les pêcheurs européens. La production française est de 17 000 tonnes
au total par an (FranceAgiMer, 2009).
La Figure II -1 présente l’anatomie de la coquille Saint Jacques. Le muscle et le corail
sont les parties généralement consommées le reste étant la plupart du temps jeté. La matière
première utilisée de cette étude est donc l’ensemble des parties « non comestibles » du
mollusque c'est-à-dire tout sauf le corail et le muscle.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 53 -
Figure II -1 : Photographie de la coquille Saint Jacques
II.1.2 Approvisionnement et stockage de la matière première
La matière première a été récupérée entre octobre 2008 et avril 2009 chez un
poissonnier local. Elle provient de la côte Atlantique française. Une fois récupérée, elle est
datée et congelée à -18°C en attendant d’être prétraitée. Elle n’est pas triée, ni rincée.
II.1.3 Préparation de la matière première
La matière première est prétraitée pour réaliser les essais d’extraction. Elle est tout
d’abord séchée par zéodratation puis broyée puis conservée sous vide, à l’abri de la lumière.
La zéodratation est une opération de déshydratation à basse température qui consiste à
éliminer l’eau par sublimation. Cela permet une conservation à long terme de la matière
première grâce à un abaissement de l’activité de l’eau du produit. Un zéodratateur (Bucher
zeodratation) comprend trois éléments : une source chauffante, un piège de récupération d’eau
(contenant des zéolythes) et une pompe à vide (Figure II -2).
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 54 -
Figure II -2 : Principe de la zéodratation (Marin et René, 2008)
La séquence de séchage se déroule de la manière suivante : quatre barquettes
alimentaires contenant 250 g de matière première congelée sont introduites dans l’enceinte.
La pression est diminuée fortement et maintenue à une valeur 1 mBar pendant toute
l’opération. Ensuite, il y a apport de chaleur pour réaliser la sublimation de l’eau par
conduction. La durée de l’opération est de 2,5 jours et la température est de 25°C.
Le broyage est la matière première est réalisé dans un broyeur de type « robot coupe »
(R8, Robotcoupe). C’est une opération consistant à diviser un solide, pour augmenter sa
surface spécifique (surface développée de la poudre par unité de masse) et donc sa réactivité.
Le broyage est réalisé sous vide, à 4°C et pendant 2 min. La masse de matière première
zéodratée introduite est d’environ 50 g.
Une évaluation de la distribution granulométrique de la matière après broyage est
réalisée par tamisage d’environ 350 g de poudre (durée 45 min). La méthode consiste à
superposer des tamis de maille décroissante et l’on mesure le poids de matière retenue sur
chaque tamis. La Figure II-3 présente les résultats obtenus. On constate une distribution large
et hétérogène des particules avec une majorité de la population présentant un diamètre
compris entre 150 et 200 µm.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 55 -
Figure II-3 : Distribution granulométrique de la matière première zéodratée et broyée
II.1.4 Caractérisation de la matière première
L’ensemble des techniques utilisées pour caractériser la matière première sont
détaillées dans la partie II.4.1.
La matière première avant prétraitement est caractérisée par une humidité de 80 ± 3%
(n = 3), un taux de cendres de 33,0 ± 0,6% (n = 5) et comporte 53,4% (n = 1) de composés
hydrosolubles. L’humidité de la matière première après prétraitement (zéodratation et
broyage) est de 4,9 ± 0,9% (n = 5).
La matière première possède un taux de lipides totaux de 8,6 ± 1,7 (n = 3) (g de
lipides/100 g de matière zéodratée) déterminé par la technique de Folch. La Figure II -4
présente les différentes espèces lipidiques séparées par chromatographie sur couche mince
(CCM) montrant la présence d’esters de cholestérol, TG, acides gras libres, cholestérol,
glycérides partiels et phospholipides.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
50<d<100 100<d<150 150<d<200 200<d<300 300<d<400 400<d<500 500<d<600 600<d<1000 1000<d
% m
ass
iqu
e
d (µm)
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 56 -
Figure II -4 : Photographie de la chromatographie sur couche mince de l’extrait lipidique de la matière première. Deux mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di
éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v)
Le taux de phospholipides (déterminé par la méthode de Ames) est de 21,3 ± 6,4% (n
= 3) (g de lipides/100 g de lipides totaux). Cela équivaut à 18,13 ± 1,78 mg de phospholipides
par gramme de matière première.
Le Tableau II -1 présente les profils d’acides gras des lipides totaux et des
phospholipides déterminés par chromatographie en phase gazeuse sur deux échantillons
(mesures réalisées par l’ITERG).
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 57 -
Lipides totaux Phospholipides
Acides gras saturés 70,33 62,96
12 :0 0,07 - 14 :0 11,32 9,43 15 :0 1,52 1,14 16 :0 DMA 0,77 0,45 16 :0 iso 0,35 0,29 16 :0 37,72 36,94 17 :0 2,82 2,35 18 :0 DMA 2,49 1,42 18 :0 13,08 10,85 22 :0 0,18 0,09
Acides gras mono-insaturés 17,70 23,44
14 :1 0,22 0,21 16 :1 (n-9) 0,25 0,40 16 :1 (n-7) 5,76 8,53 17 :1 0,78 0,62 18 :1 DMA 0,20 0,28 18 :1 (n-11) 0,08 0,09 18 :1 (n-9) 2,72 3,78 18 :1 (n-7) 4,83 6,27 20 :1 (n-11) 0,50 0,48 20 :1(n-9) 1,06 1,20 20 :1 (n-7) 1,14 1,35 22 :1 (n-11) 0,06 0,13 22 :1 (n-9) 0,11 0,10
Acides gras poly-insaturés 11,97 13,60
16 :2(n-4) 1,37 0,97 16 :3 (n-4) 0,27 0,32 18 :2 (n-4) 0,19 0,30 20 :2 (n-7) (7, 13) 0,14 0,24 20 :2 (n-7) (7, 15) 0,07 0,05
Acides gras poly-insaturés (n-6) 2,38 2,46
18 :2 (n-6) 0,64 0,79 18 :3 (n-6) 0,08 0,07 20 :3 (n-6) 0,03 0,05 20 :4 (n-6) 1,29 - 22 :4 (n-6) 0,10 0,14 22 :5 (n-6) 0,24 0,11
Acides gras poly-insaturés (n-3) 7,54 9,27
18 :3 (n-3) 0,07 0,28 18 :4 (n-3) 0,38 0,56 20 :3 (n-3) 0,00 0,03 20 :5 (n-3) 2,07 3,11 22 :4 (n-3) 1,47 1,19 22 :5 (n-3) 10,10 0,13 22 :6 (n-3) 3,45 3,96
Tableau II -1 : Profil d’acides gras des lipides totaux et des PL de la matière première
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 58 -
Le spectre RMN 31P des lipides totaux de la matière première est présenté Figure II-5.
Outre le pic de la référence (-6,8 ppm), le spectre se caractérise par un pic majoritaire (-0,69
ppm), relativement large à sa base et par un second pic à 20 ppm. Le déplacement de ce
second pic permet d’affirmer qu’il ne s’agit pas d’espèces de nature phospholipidique. La
nature exacte de ces composés n’a pas été identifiée mais il pourrait s’agir de phosphonate.
Concernant le pic majoritaire, sa position par rapport à la référence indique qu’il s’agit en très
grande proportion de phosphatidylcholine. La largeur du pic peut traduire la présence d’autres
phospholipides tels que sphingomyéline, phosphotidisérine ou phosphatidyléthanolamine.
Figure II-5 : Spectre RMN 31P des lipides totaux de la matière première
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 59 -
II.2 Les produits utilisés
Le dioxyde de carbone de qualité technique (pureté de 99,5%) est fourni par la société
Air Liquide. L’éthanol de qualité technique (pureté de 96%) provient de Xylab. L’isopropanol
(pureté de 99,8%) est fourni par Scharlau. Le chloroforme (99%) et le méthanol (99%) utilisés
pour l’extraction des lipides totaux sont fournis par Aldrich Sigma. Le chloroforme (99,8%,
1% TMS v/v) et le méthanol (99,8% d4) deutéré utilisés pour les analyses RMN sont fournis
par Eurisotop.
Les liposomes sont préparés dans une solution tampon HEPES (10 mM de N-[2-
hydroxyéthyl] pipérazine-N’-[acide 2-éthane sulfonique] Sigma Aldrich ajusté à pH 7,4).
La lécithine (LC 60), d’origine marine, est fournie par la société Phosphotech. Le
Tableau II -2 présente sa composition en lipides totaux.
Lipides neutres
(%massique)
Phospholipides
(%massique)
LC 60 35 – 40 %
(3-4% de TG, 27 % de cholestérol) 60 – 65 %
(35-40% de PC, 15-20% PE)
Tableau II -2 : Composition en lipides de la lécithine LC 60
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 60 -
II.3 Dispositifs expérimentaux et protocoles
II.3.1 Extraction CO 2 pur et CO 2-co-solvant en dispositif petit volume (charge en matière traitée de 3 à 6 g)
II.3.1.1 Description du dispositif expérimental
Le dispositif « petit volume » est utilisé pour l’extraction des lipides neutres avec du
CO2 pur et celles des phospholipides avec un mélange CO2-co-solvant pour des charges en
matière traitée de 3 à 6 g.
La Figure II -6 présente le montage expérimental. Le CO2 liquifié par le bain
thermostaté à -0,4°C est pompé par une pompe volumétrique de type HPLC (Gilson, modèle
305 possédant une tête SC 5 de plage de débit entre 0 et 5 ml/min) qui est associée à un
module d’amortissement (Gilson modèle 806) permettant de limiter les variations de débit. Le
co-solvant est quant à lui acheminé par un système équivalent (Gilson, modèle 305 possédant
une tête SC 10 de plage de débit entre 0 et 10 ml/min). Un clapet anti-retour, une vanne
d’arrêt et une vanne de purge sont installés sur la ligne du co-solvant permettant de s’assurer
du bon acheminement du co-solvant. Cela permet également de couper ou de ne pas utiliser
cette pompe. Le CO2 avec ou sans co-solvant est ensuite réchauffé en entrée de l’étuve (WTC
binder, Tfonctionnement < 150°C) et arrive au pied de la colonne d’extraction (Top Industrie,
diamètre de 1 cm et longueur de 5 cm ou 10 cm selon la charge introduite) en acier
inoxydable qui est placée dans une étuve. La colonne est équipée en tête et en pied de deux
frités métalliques (Top Industrie, diamètre de 1 cm et porosité de 5 µm) surmontés d’un
disque filtrant de type filtre à café empêchant l’entrainement de particules solides dans le
circuit. En sortie, un débitmètre (Kobolt, modèle MS-4009, plage de fonctionnement de 0 à
3,75 g/min de CO2) monté sur la ligne de sortie du solvant indique le volume cumulé de
solvant gazeux utilisé lors de l’extraction. Connaissant le temps, on calcule le débit de CO2
gazeux (����(������)) et on en déduit le débit de CO2 massique (����
(!�""#$��)) par la formule :
����(!�""#$��) = ����
(������)
%!(��!&)���'(���
avec Vm(Tamb) : Volume molaire à température ambiante (22,4 L/mol)
et MCO2 : Masse molaire du dioxyde de carbone, 44 g/mol
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 61 -
Le débitmètre fonctionne seulement pour une extraction au CO2 pur. Une vanne de
laminage précédé par une vanne d’arrêt (V5) en sortie de l’enceinte permet de réguler le débit
et la pression au sein de la colonne. D’autres robinets permettent d’isoler le réacteur (V2 et
V3), l’admission de CO2 (V1) ou la stabilisation du flux dans le circuit (V4).
Figure II -6 : Montage expérimental « petit volume » pour l’extraction des lipides (masse traitée : 3 à 6 g)
Deux capteurs de pression à membrane Pcol et Pcir (Asco PR 711F), mesurent
respectivement la pression d’extraction et la pression du circuit (comprises entre 0 et 400 ±
0,1 bar). Un thermocouple de type K (Watlow, précision de 1°C) placé sur la ligne
d’alimentation de la colonne mesure la température d’extraction. La ligne de sortie est
chauffée à l’aide d’un ruban chauffant pour éviter la formation de carboglace (CO2 solide)
consécutive à la dépressurisation.
CO2
Bouteille de CO2
Colonne (P, T)contenant la matière 1ère
Flacon laveur ou éprouvette contenant
l’extrait phospholipidiques
V1
V2
V3
V4
T Pcir
Pcol
D
Co-solvant
V6
purge
V5
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 62 -
II.3.1.2 Protocole d’extraction au CO 2 pur
Les essais concernent la matière première zéodratée et broyée. Pour ces essais, le CO2
pur est utilisé pour l’extraction, la ligne de co-solvant est donc fermée. Le temps nécessaire
pour un essai avec 6 g de matière est d’environ 7 h et 3,5 h pour 3 g. L’extraction se déroule
de la manière suivante :
� Remplissage et introduction de la colonne contenant la matière première dans
l’enceinte thermostatée
� Mise en température du système
� Pressurisation du système et de la colonne en deux temps : de la pression
atmosphérique jusqu’à la pression de bouteille (de l’ordre de cinq secondes)
puis de la pression de bouteille à celle d’extraction souhaitée (utilisation de la
pompe CO2)
� Isolation de la colonne d’extraction pendant une dizaine de minutes à l’aide de
V2 et V3 le temps de stabiliser le flux de CO2
� Stabilisation du flux de CO2 dans le circuit et réglage du débit d’extraction
désiré à l’aide de la vanne de laminage V5
� Début de l’extraction, le CO2 passe à travers le lit pendant un temps donné
� Fin de l’extraction, la colonne est dépressurisée par sa tête
Il faut noter que ce système n’est pas adapté à la collecte quantitative de l’extrait,
notamment de par les faibles masses d’échantillons traitées. La quantification de l’extraction
est réalisée sur la matière récupérée dans le réacteur après traitement au CO2.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 63 -
II.3.1.3 Protocole d’extraction au CO 2-co-solvant
Les essais sont réalisées sur la matière déshuilée c'est-à-dire celle ayant subi un
traitement préalable au CO2 pur. L’utilisation d’un co-solvant fait que les deux pompes sont
utilisées. Par contre, le débitmètre de sortie est seulement utilisé pour la stabilisation du flux
de CO2, ensuite il est déconnecté. Par la suite, on supposera que le débit de CO2 reste
inchangé lors du démarrage de la pompe co-solvant. En sortie de la vanne de laminage, on
récupère un extrait dans du co-solvant.
L’extraction se déroule de la manière suivante :
� Remplissage et introduction de la colonne contenant environ 6g de matière
première dans l’enceinte thermostatée
� Mise en température du système
� Mise en pression de la colonne avec du CO2 pur jusqu’à la pression souhaitée
� Isolement de la colonne
� Stabilisation du flux de CO2 et vérification du débit
� Démarrage de la pompe amenant le co-solvant et stabilisation du flux CO2 +
co-solvant
� Mise en circuit de la colonne et début de l’extraction
� Collecte des effluents sous forme de fractions d’éthanol contenant la masse
extraite : fractions notées Fi, i= 1 à 5.
� Arrêt de la pompe amenant le co-solvant et séchage du résidu et du circuit par
flux de CO2 à 2 g/min pendant 45 min
� Dépressurisation de la colonne
Sur l’ensemble des essais menés, le débit de CO2 est fixé à 1 g/min et le débit de co-
solvant est ajusté pour obtenir le pourcentage de co-solvant souhaité dans le flux. La collecte
est effectuée à volume de co-solvant constant, c'est-à-dire que les fractions colletées dans les
expériences à pourcentages de co-solvant différents sont récupérées sur des plages de temps
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 64 -
variables. Ce protocole est adopté afin d’avoir toujours un volume d’extrait suffisant pour les
analyses ultérieures.
Les analyses sont réalisées sur les fractions prélevées et non pas sur le résidu
d’extraction contrairement à l’étude de l’extraction au CO2 pur. Par contre, la partie lipidique
des derniers prélèvements n’est pas analysée au delà de la 3ème fraction car la quantité de
lipides est trop faible.
II.3.2 Extraction CO 2 grand volume : déshuilage de 60 g de matière première
II.3.2.1 Description du dispositif expérimental
Le dispositif décrit ci-après est utilisé pour l’extraction des lipides neutres avec du
CO2 pur sur une quantité de matière première zéodratée et broyée d’environ 60 g.
Le principe du montage expérimental est identique à celui qui permet de traiter 3 à 6 g
de matière première broyée (Figure II -6), le volume du réacteur et les caractéristiques des
pompes étant adaptés pour traiter plus de matière. Le dispositif est constitué d’une enceinte
haute pression cylindrique (Top Industrie) en acier inoxydable (Volume interne : 490 ml,
hauteur : 20,5 cm et diamètre interne : 4,5 cm). Les pressions et températures maximales de
service sont de 315 bar et 250°C, respectivement. Un capteur de pression (716-139 HD
9408T, mesure une pression entre 0 et 400 ±0,1 bar) et un thermocouple (Watlow, type K,
précision 1°C) mesurent les conditions au sein du réacteur. Un système de régulation de
température (Watlow) couplé à un ruban chauffant (Horst, longueur : 3 m et puissance : 400
W relié à un régulateur électrique) enroulé autour du réacteur, permet de travailler à une
température donnée.
La matière première est placée (et séparée par des disques de papier type « filtre à
café ») entre deux lits de billes de verre (d = 2 mm) en entrée et en sortie qui servent de
garnissage inerte tout en permettant de distribuer le flux sur toute la section de la colonne. En
effet, avec 60 g de matière, la colonne n’est pas complètement remplie.
Le réacteur est alimenté en CO2 préalablement liquéfié à -0,4°C par une pompe à
membrane (Lewa EK3, course des trois pistons et fréquences modulables, débit maximum de
33 ml/min pour chaque tête). Le fluide, préchauffé à la température de travail à l’aide d’un
bain thermostaté, est introduit par le haut du réacteur.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 65 -
Une vanne d’arrêt et une vanne de laminage sont présentes en sortie du réacteur
permettant de réguler la pression et d’évacuer le CO2 par le bas du réacteur. Un système de
séparation de type cyclonique et un ruban chauffant sont installés en sortie dispositif
expérimental. Un compteur gaz est installé sur ligne de sortie permettant de contrôler le débit
d’extraction.
II.3.2.2 Protocole d’extraction au CO 2 pur
Le protocole est identique à celui décrit II.3.1.2. Les essais réalisés avec le dispositif
permettant de traiter environ 6 g de matière étaient faits avec un débit de CO2 de 1 g/min.
Pour la transposition à 60 g, nous avons choisi de conserver la vitesse de CO2 au sein de la
colonne et le taux de solvant (la masse de CO2 par gramme de matière première). Quel que
soit le montage expérimental, nous avons :
�)!*/!#, =%)!/!#,'-)!²
avec F : débit volumique de CO2 dans la colonne
V : vitesse du CO2 à l’intérieur de la colonne
S : section de la colonne
Pour un débit massique (F) exprimé en g/min, il vient :
��/!#, = �)!*/!#,'��/)!* =%)!/!#,'-)!²'��/)!*
ρ étant la masse volumique.
Pour des conditions de température et de pression identiques, le rapport des débits
massiques varie comme le rapport des vitesses multipliées par le carré des rapports des
sections, soit :
�./� = �.�' %./�%.�
'(-./-.
)²
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 66 -
Pour un débit massique pour 6 g de matière de 1 g/min et pour conserver une même
vitesse dans les deux cas :
�./� = 1'1' 04,51 23= 204/567
Ainsi, des lots de 60 g de matière sont traités à 300 ± 10 bar, 45 ± 1°C et 20 g/min de
CO2. Pour conserver un taux de solvant de 60 g de CO2 par gramme de matière (quantité
déterminée lors de l’étude de l’étape de déshuilage), on doit passer 60 x 60 = 3600 g de CO2.
Avec un débit de 20 g/min, cela correspond à une durée de traitement de 3 heures.
II.3.3 Extraction CO 2-co-solvant en dispositif « grand volume » : traitement de 15 à 60 g de matière déshuilée
II.3.3.1 Description du dispositif expérimental
Le dispositif décrit ci-après est utilisé pour l’extraction des phospholipides avec un
mélange CO2-co-solvant. Les quantités traitées vont de 15 à 60 g. Deux types de réacteur sont
utilisés.
L’installation (Figure II-7) est constituée de deux pompes volumétriques de type
HPLC (Gilson, modèle 305 possédant une tête SC10 de plage de débit entre 0 et 10 ml/min)
associées à un module d’amortissement (Gilson modèle 806) permettant de limiter les
variations de débit. Cela permet la circulation du CO2 [A] (préalablement refroidi à l’aide
d’un cryostat [B]) et du co-solvant [C]. Une vanne d’arrêt, un clapet anti-retour et un système
de purge assurent le bon acheminement du co-solvant dans le circuit. Avant l’entrée dans le
réacteur, un réchauffeur (Top Industrie, Puissance de 400 W) met le fluide à la température de
travail [D]. En sortie, une vanne d’arrêt et une vanne de laminage permettent de réguler le
débit de sortie ainsi que la pression au sein du réacteur. L’extrait est évacué par un capillaire
d’une longueur de 35 cm et d’un diamètre interne de 1 mm. Il est récupéré dans une
éprouvette graduée en verre (100 : 1 ml, +/- 0,5 ml) [E].
Un système de vannes permet d’isoler le réacteur et de stabiliser le flux de solvants
dans le circuit. Un compteur gaz (non représenté) est placé en sortie lors de la pressurisation
au CO2 du réacteur pour vérifier le débit imposé. Il est ensuite déconnecté avant le démarrage
de la pompe co-solvant. La ligne de sortie est chauffée à l’aide d’un ruban chauffant pour
éviter la formation de carboglace (CO2 solide) consécutive à la dépressurisation. Par la suite,
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 67 -
on suppose que le débit ne change pas lors de l’essai.
Deux capteurs de pression à membrane Préac et Psort (TC direct, 716-139 HD 9408T),
mesurent respectivement la pression d’extraction et la pression en sortie (comprise entre 0 et
400 ± 0,1 bar). Un ensemble de thermocouples de type K (watlow, précision de 1°C)
mesurent les températures du circuit, du réacteur et de sortie (Tcirc, Tréac et Tsort). Les pressions
et températures sont enregistrées sous Labview.
Figure II-7 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g)
II.3.3.2 Montage avec le réacteur tubulaire (V = 50 0 ml)
Le réacteur tubulaire ainsi que le système de régulation thermique sont les mêmes que
ceux décrits II.3.2.1. Le protocole opératoire est similaire à celui décrit II.3.1.3. Les fractions
sont récupérées toutes les 20 minutes, le séchage du résidu au CO2 pur est fait sur une durée
d’environ 1 h avec un débit de 10 g/min.
Dans cette partie, nous avons effectué un scale-up d’une colonne de 10 ml (1 cm de
Co-solvant
Bouteille de CO2
[A]
[C]
[B] [D]
[E]
Extrait alcooliquecontenant l’extrait
Tcirc
Réacteur
purge
Psort
Préac
Tréac
Tsort
Co-solvantcontenant l’extrait
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 68 -
diamètre) à une colonne de 500 ml (4,5 cm de diamètre). Pour ne pas modifier l’extraction, il
aurait fallu travailler à vitesse de flux constant. Cependant cela n’a pas été techniquement
possible (limitation due aux pompes du dispositif). En effet, il faudrait un facteur 20 entre le
débit du dispositif « petit volume » et celui du dispositif« grand volume » :
� = 8'-
89 = :;<�=;� et 8� = :>
<�=>�
898� =
�9 ��?@93 @�3?
F : débit volumique de solvant
v : vitesse du flux de solvant dans la colonne
S : section de la colonne
r : rayon de la colonne
A vitesse de flux de solvant identique on obtient :
@93@�3 = �9
��
120,25 = �9
��
Ce qui donne, �� ≈ 20'�9
Nous avons travaillé à un débit inférieur, ce qui devrait améliorer l’extraction puisque
les temps de contact soluté-solvant seront plus grands.
Tout comme pour l’extraction utilisant le dispositif « grand volume », la matière
première est placée entre deux lits de billes de verre (d = 2 mm) en entrée et en sortie qui
servent de garnissage inerte en permettant de distribuer le flux sur toute la section de la
colonne. Pour 15, 30 et 60 g, la hauteur du lit de matière première est respectivement
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 69 -
d’environ 4 cm, 7 cm et 10 cm.
II.3.3.3 Montage avec le réacteur agité (V = 250 ml )
Le réacteur agité est en inox et est de forme cylindrique. Il a été construit par la société
Top Industrie. Le volume intérieur (V = 250 ml) accueille un panier (taille des pores de 1
mm) retenant les solides en suspension (fine poudre par exemple) dans le réacteur. Un
système d’agitation avec une turbine de type Rushton permet une agitation du milieu dans un
domaine de 0 à 1500 tours/min. Des orifices sur l’agitateur assurent l’injection du solvant
dans le réacteur. La Figure II -8 présente l’ensemble des dimensions du réacteur.
� Ha = 7,7 cm
� Hp = 8,1 cm
� Hr = 10,7 cm
� Da = 2,5 cm (8 pâles et hauteur de
pale =1 cm)
� Dp = 3,5 cm en intérieur et 4,2 cm
en extérieur
� Dr = 6 cm
Figure II -8 : Caractéristiques géométriques du réacteur
Un collier chauffant d’une puissance de 800 W régulé par un système « Proportionnel
Intégrale Dérivé » dit PID (Tmax = 100°C) permet de contrôler la température de l’enceinte.
Le protocole utilisé est décrit lors de l’étude de l’extraction avec ce réacteur (III.3.2.2).
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 70 -
II.3.4 Mise en forme de liposomes en milieu CO 2-éthanol-eau
II.3.4.1 Extraction et mise en forme en ligne
Le dispositif Figure II-9 est utilisé pour l’extraction des phospholipides avec un
mélange CO2-co-solvant couplée à une mise en forme des liposomes par ajout d’eau dans le
flux de sortie. Les quantités de matières traitées sont de 30 g. Il s’agit d’un montage très
proche de celui décrit II.3.3.1, un système d’ajout d’eau dans le flux est intégré en fin de
process. Le réacteur tubulaire ou le réacteur agité peuvent être utilisés.
Figure II-9 : Montage expérimental du procédé de couplage d’extraction des phospholipides et de mise en forme des liposomes
La partie relative à l’extraction reste inchangée, on se focalise donc sur la ligne d’ajout
d’eau permettant la mise en forme de liposomes. La phase aqueuse, contenue dans une
éprouvette graduée (pour mesurer le débit réel), est acheminée sous pression par une pompe
volumétrique (LDC Analytical, débit compris entre 0 et 10 ml/min). Cette ligne, réalisée avec
des tubes en inox de 1/8’’ (diamètre interne de 1,3 mm), est munie d’une vanne d’arrêt et d’un
clapet anti-retour. En sortie de la vanne de laminage, on trouve un capillaire de 35 cm de long
et d’un diamètre de 1 mm. La récupération de la dispersion se fait soit à l’aide d’un flacon en
verre de 1 litre agité par une pale, contenant environ 100 ml d’eau tamponnée à l’instant
initial, le capillaire plonge de manière continue dans la phase aqueuse tout au long de l’essai
Co-solvant
Bouteille de CO2
[A]
[C]
[B] [D][E]
Tcirc
Réacteur
purge
Psort
Préac
Tréac
Tsort
Eau (Tampon Hepes)
purge
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 71 -
ou encore dans un système d’évaporation d’éthanol (ampoule à décanter tri-col enroulée par
un ruban chauffant).
II.3.4.2 Modification de la taille des liposomes à base de lécithine commerciale (LC 60)
II.3.4.2.1 Préparation des liposomes
Les suspensions de liposomes sont préparées à partir de la lécithine LC 60. Cinq g de
lécithine sont dissous dans 35 ml d’hexane puis 150 ml d’acétone à 4°C sont ajoutés sous
agitation pour faire précipiter les phospholipides. Le mélange est ensuite placé 15 minutes
dans un bain glacé et centrifugé pendant 5 min à 1500 g. Le surnageant est éliminé, le solvant
résiduel étant évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif.
La technique de préparation des liposomes utilisée est basée sur l’hydratation d’un
film lipidique. Un film de lipides est préparé en dissolvant les lipides dans du chloroforme
dans un ballon de 250 ml. Celui-ci est ensuite évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif puis
zéodraté une nuit afin d’éliminer toute trace de solvant résiduel. Le film lipidique obtenu est
ensuite hydraté avec une solution tampon HEPES sous agitation jusqu’au décollement du film
(environ 2 heures). La concentration de lipides finale est de 5 g/l.
II.3.4.2.2 Descriptif du montage expérimental
Un schéma du montage expérimental utilisé pour réduire la taille des liposomes est
présenté Figure II -10. Le CO2, préalablement liquéfié par un bain thermostaté à -0,4°C, est
acheminé par une pompe volumétrique de type HPLC (Gilson, modèle 305 possédant une tête
SC 10 de plage de débit entre 0 et 10 ml/min) associée à un module manométrique
d’amortissement (Gilson modèle 806) permettant de limiter les variations de débit. Le CO2 est
ensuite mis à la température souhaitée avec un réchauffeur (Top Industrie, Puissance de 400
W). La dispersion de liposomes est, quant à elle, introduite à l’aide d’une pompe
volumétrique (LDC Analytical, débit compris entre 0 et 10 ml/min). Pour vérifier le débit
réel, la dispersion de liposomes est pompée dans une éprouvette graduée de 100 ml (100 : 1
ml, +/- 0,5 ml). Cette ligne, réalisée avec des tubes en inox de 1/8’’ (diamètre interne de 1,3
mm), est munie d’une vanne d’arrêt et d’un clapet anti-retour. En sortie, un capillaire de 38
cm et de diamètre interne variable est installé.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 72 -
Figure II -10 : Montage expérimental de modification de la taille de liposomes avec du CO2
A cause des phénomènes thermiques liés à l’utilisation de CO2 et d’eau (formation de
carboglace qui génère des problèmes de colmatage), les dispersions sont diluées avec de
l’éthanol technique : 10 ml d’alcool sont ajoutés à 90 ml de dispersion.
La ligne de sortie est chauffée à l’aide d’un ruban chauffant pour éviter la formation
de carboglace (CO2 solide) consécutive à la dépressurisation. Le protocole et le système de
récupération utilisé sont détaillés dans le chapitre relatif à cette étude.
Bouteille de CO2
Liposomes(10 % volumiqueéthanol)
Psort
TCO2
Liposomes obtenus
purge
Tsort
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 73 -
II.3.5 Caractérisation réacteur agité et étude du m élange CO 2-éthanol-eau
II.3.5.1 Distribution des temps de séjour dans le r éacteur agité
Le réacteur agité (II.3.3.3) est inséré dans le montage présenté Figure II-11. Une
pompe volumétrique de type HPLC (Gilson modèle 305, débit de fonctionnement entre 0 et
25 ml/min) [A] assure la circulation de l’eau. Une vanne 6 voies [B] permet l’introduction de
la solution. Elle assure une injection très rapide sans perturber le flux d’entrée. En sortie, une
cellule de conductivité [C] associée à un système d’acquisition qui permet de relever des
valeurs au cours du temps (∆t=8s). Le volume entre l’injecteur de la solution saline et l’entrée
du réacteur ainsi que celui entre la cellule de conductivité et la sortie du réacteur est
négligeable (de l’ordre de 1 à 2 ml) devant le volume intérieur du réacteur.
Figure II-11 : Montage expérimentale pour l’étude des DTS
Pour réaliser cette étude, le système étudié est mis en fonctionnement (remplissage du
réacteur par de l’eau distillée, circulation de fluide en continue). On introduit à l’entrée du
réacteur une solution saline (NaCl, 1 mM) à l’instant t = 0. On suit la conductivité en sortie du
réacteur en fonction du temps. Elle est proportionnelle à la concentration de notre traceur ce
qui nous permet de suivre le temps passé par les molécules entre l’entrée et la sortie ce qui
aboutie à la Distribution des Temps de Séjour (DTS).
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 74 -
II.3.5.2 Etude du mélange CO 2-éthanol-eau-lécithine
Le dispositif expérimental Figure II-12 est constitué d’une cellule d’observation (en
saphir, de diamètre intérieur : 1cm et longueur : 5 cm) [A] à volume variable de façon à
pouvoir visualiser les changements macroscopiques au sein du mélange. Elle est placée dans
un bain thermostaté [B] dont la température est régulée à 27°C ou 45°C. Un agitateur entraine
un barreau aimanté placé dans la cellule. L’introduction du CO2 est réalisée à l’aide d’une
pompe à cabestan [C] maintenue à une température et pression constantes ce qui permet une
maitrise de la quantité introduite. Le déplacement du piston de la cellule est réalisé par
l’introduction d’eau sous le piston via une pompe volumétrique de type HPLC (LDC
analytical, CP 3000) [D] qui permet son déplacement vertical. Lors de l’ajout de CO2 dans la
cellule, la pression est maintenue constante par évacuation de l’eau située sous le piston.
Figure II-12 : Montage expérimental pour l’étude du système quaternaire CO2-Eau-éthanol-phospholipides
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 75 -
� Préparations des mélanges initiaux introduits dans la cellule d'observation
Cinq mélanges comportant des proportions massiques croissantes d’éthanol sont
utilisés (Tableau II-3. La concentration en lécithine LC 60 est de 5 mg/ml pour tous les
mélanges.
Mélange % massique d’éthanol Aspect initial
Mél. 5 0,0% Turbide Mél. 4 15,7% Turbide Mél. 3 42,1% Turbide Mél. 2 83,3% Limpide Mél. 1 95,0% Limpide
Tableau II-3 : % initiaux d’éthanol des mélanges étudiés
Pour préparer les mélanges, 100 mg de lécithine sont pesés puis l’éthanol est ajouté.
Ensuite, le mélange est homogénéisé pendant 20 minutes. Enfin, 1 ml par minute de solution
tampon Hepes est ajouté.
� Protocole des essais
1 g du mélange éthanol/eau/lécithine est introduit dans la cellule, à température
ambiante. Ensuite, le bain thermostaté est mis en température (27 ou 45°C). On introduit 0,3
cm3 de CO2 (P = 150 bar) puis le mélange est agité pendant 5 min et une observation visuelle
est réalisée. Cette opération est reproduite 5 fois. Après le dernier ajout de CO2, l’agitation est
maintenue pendant 30 min avant l’observation visuelle. La cellule est ensuite dépressurisée
par déplacement du piston, une diminution de la température et l’évacuation du CO2 gazeux.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 76 -
II.3.5.3 Etude cinétique du mélange CO 2-éthanol-eau
La configuration du mélangeur eau et CO2-éthanol est un Té correspondant au
montage mis en place dans le dispositif de mise ne forme de liposomes. Le capillaire
d’observation est en silice (diamètre interne : 250 ± 6 µm.). Le capillaire est plongé dans un
bain thermostaté et un système de vidéo d’acquisition ultrarapide permet d’observer le
comportement du mélange à 6 cm et à 30 cm après le Té. Le principe du montage de
l’ICMCB est présenté Figure II-13, des modifications pour les besoins de cette étude ont été
réalisé (modification du système de pompage).
Figure II-13 : Schéma du montage du montage microfluidique de l'ICMCB (Marre et al., 2009), pour l’étude un pré-mélange CO2-éthanol remplace la partie CO2 et l’eau est
acheminée par la pompe HPLC
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 77 -
II.4 Méthodes de caractérisation
II.4.1 Analyse de la matière première solide et rés idu d’extraction
Cette partie traite de la caractérisation de la matière solide qui peut être, soit la matière
première zéodratée et broyée, soit un résidu d’extraction.
� Teneur en eau
La détermination de l’humidité d’un échantillon est réalisée à l’aide d’une
thermobalance (Ohaus, MB45). Il s’agit d’une combinaison d’une balance et d’un four
(utilisant un chauffage à infrarouges). Une double pesée séparée d’une phase de chauffe à
105°C permet de mesurer, par différentiel, le poids de la quantité de matière évaporée après
stabilisation et donc le taux d’humidité.
� Taux de matière grasse
Les lipides totaux sont extraits selon la méthode de Folch (Folch et al., 1957) par un
mélange chloroforme/méthanol (2/1 ; v/v) à raison de 20 volumes par volume de matériel.
Afin de prévenir de l’oxydation des lipides, on additionne au mélange de solvant 1%
(masse/volume) de butyl hydroxy toluène (BHT). L’extraction est réalisée sous agitation
magnétique pendant une heure au terme de laquelle 0,2 volume d’une solution aqueuse de
KCl à 0,8% sont ajoutés par volume de mélange d’extraction. On provoque ainsi une
séparation de la phase hydroalcoolique et de la phase chloroformique. Cette dernière est lavée
3 fois par 0,2 volume du mélange chloroforme/méthanol/KCl 0,8% (3/48/47 ; v/v/v). La phase
chloroformique finale est filtrée puis le solvant est évaporé sous vide à l’aide d’un
évaporateur rotatif. L’extrait brut est ensuite repris par de petits volumes de chloroforme pur.
L’extrait chloroformique est filtré et évaporé à sec sous courant d’azote. L’extrait sec dit
« extrait de Folch » est conservé dans un mélange chloroforme/ méthanol (2/1 ; v/v) à 4°C. Le
taux de phospholipides est donné par :
�BC'DE5BF6è@E4@BHHE = 5BHHEI6J6DEHE'F@B6FE5BHHEéLℎB7F6IIN7676F6BIE x100
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 78 -
� Séparation des classes de lipides
Les lipides totaux (l’extrait de Folch) sont déposés sur une plaque en verre recouverte
de silicagel (60H Merck, France) activée à 110°C pendant une heure et conservée à 80°C
jusqu’à utilisation. La séparation des lipides par chromatographie sur couche mince (CCM)
est réalisée avec un mélange d’éther/acétone dans les proportions 60/20 en volume. Tous les
composés, à l’exception des phospholipides, migrent sur la phase stationnaire. Les différentes
classes de lipides sont révélées à la vapeur d’iode. La zone correspondant aux lipides
recherchés (les phospholipides ici) est délimitée et transférée dans un tube pour être analysée.
� Teneur en phospholipides
Les phospholipides séparés par CCM sont quantifiés par le dosage du phosphore
(Ames, 1966). Il s’agit d’un dosage colorimétrique dans lequel le phosphore organique est
minéralisé à une température élevée en présence de nitrate de magnésium et d’eau bidistillée.
Les pyrophosphates éventuellement formés sont hydrolysés par l’acide chlorhydrique. Le
phosphore minéral est alors converti en acide phosphomolybdique par l’addition du
molybdate d’ammonium. L’acide réagit avec l’acide ascorbique pour donner un complexe
bleu qui est détecté par spectrométrie à 820 nm (Hitachi U-2810).
Les principales étapes de ce dosage sont résumées dans la séquence de réactions
suivante :
Une courbe de référence (obtenue dans les mêmes conditions expérimentales à partir
d’une gamme de phosphate de potassium) permet de calculer le nombre de nano-atomes de
phosphore présents dans l’échantillon. Le nombre de moles de phospholipides est obtenu en
supposant un atome de phosphore par molécule de phospholipide et en considérant une masse
molaire moyenne de 775 g.mol-1 pour les phospholipides.
Minéralisation
15 min., 100°C
20 min., 45°C
Phosphore minéral + pyrophosphate
Phosphore minéral
Complexe acide phosphomolybdique-acide ascorbique
Phosphore organique + eau bidistillée
Pyrophosphate + HCl (0,5 N)
Phosphore minéral + molybdate d’ammonium
(3,4 mM dans un mélange acide sulfurique 1 N)
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 79 -
Le taux de phospholipides par rapport aux lipides totaux est donné par :
�BC'PQ = RSHé)T�,U#VVW, − RSH=éX(5BHHECF6I6HéE)'YE7FE)W�=&�=éX
'775'10Z[
avec Absréf : ordonné à l’origine de la droite de référence
et Pentecourbe réf : coefficient directeur de la droite
� Taux de cendres (Geneau-Sbartai et al., 2008)
Le taux de cendres est basé sur l'élimination des matières organiques d'un échantillon
de matériau par calcination à température définie durant un temps donné. La calcination est
réalisée sur trois échantillons de 1 g de matière dans une étuve à 550°C sur une durée de 5 h.
Le taux de cendres est donné par :
�BC'DELE7D@EH = 5BHHE@éH6DCBJ@èHLBIL67BF6N75BHHEéLℎB7F6IIN7676F6BIE '100
� Taux de composés hydrosolubles (Geneau-Sbartai et al., 2008)
Une extraction de 2 g de matière à l’eau bouillante pendant une heure est réalisée. La
pesée de la matière première et du résidu obtenu par filtration sous vide puis séché permet de
connaître le taux de composés solubles dans l’eau par différence. Le taux de composés
hydrosolubles est donnée par :
�BC'DELN5JNHéHℎ\D@NHNICSIEH = 5BHHE676F6BIE − 5BHHE@éH6DC5BHHE676F6BIE '100
II.4.2 Analyse des extraits
Cette partie décrit les caractérisations réalisées sur les extraits alcooliques (les
différentes fractions récoltées).
� Masse totale extraite : gravimétrie
Deux ml d’extrait alcoolique sont prélevés puis évaporés dans un tube préalablement
taré sous un flux d’azote. Une fois le solvant évaporé, le récipient est pesé pour déterminer la
masse extraite.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 80 -
� Quantité de lipides extraits : Extraction de Folch (Folch et al., 1957) (cf. II.2)
On utilise 20 ml d’extrait pour réaliser cette caractérisation. Les volumes de
chloroforme et méthanol utilisés sont respectivement de 20 et 10 ml. Les règles de calcul des
volumes de solutions de KCL et de phase de Folch s’appliquent ensuite.
� Identification et quantification des phospholipides extraits par RMN
(collaboration équipe Dufourc E. (CBMN) : Grélard A. et Courreges C.)
Pour l’identification et la quantification des phospholipides des extraits obtenus par
voie supercritique, des spectres RMN du phosphore sont réalisés. Cette technique est basée
sur le spin nucléaire non nul de certains noyaux (1H, 13C ou 31P). Une expérience de RMN 1D
se décompose classiquement en 3 étapes :
1. L’équilibre : Lorsqu’on applique à ces noyaux un champ magnétique B0, leurs
spins précessent à une certaine fréquence dite de Lamor :
]/ =^_/2`
γ étant le rapport gyromagnétique, caractéristique de chaque noyau.
L’aimantation résultante le long de l’axe z (colinéaire à B0) est notée M0.
2. La perturbation : On applique un second champ B1 qui est perpendiculaire à
B0 et oscille à une fréquence ν0. Le champ B1 perturbe la distribution des spins
due à B0 pendant une durée de τ =θ/γB1 de sorte que M0 bascule le long de
l’axe y’.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 81 -
3. La relaxation : On arrête B1, le système retourne à l’équilibre initial. Il se
décompose en deux parties, une relaxation longitudinale selon l’axe z
(caractérisé par un temps T1z) et une transversale (caractérisé par un temps T2)
selon le plan xy. L’évolution de la première relaxation par rapport à l’axe des z
est de type exponentielle, la seconde est sinusoïdale amortie par rapport à l’axe
des y.
Le passage du domaine temporel au fréquentiel est assuré par un outil mathématique,
la transformée de Fourier. Cela conduit à l’obtention d’un spectre composé de raies dont la
position en fréquence est lié à l’environnement électronique du noyau et dont la largeur
dépend de la dynamique des molécules.
L’identification des phospholipides est déterminée par le déplacement chimique
spécifique de leur noyau phosphore. La quantification est réalisée par intégration des pics
(d’intensité proportionnelle à la quantité de phosphore) de l’ensemble des phospholipides par
rapport à celui d’une référence interne.
L'ensemble des spectres RMN du phosphore est réalisé sur un spectromètre RMN
Bruker 400 MHz (DPX) équipé d'une sonde 5 mm QNP 1H-13C/31P/19F. Les expériences sont
θ
Relaxation longitudinale
Relaxation transversale: FID
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 82 -
faites avec une régulation en température à 25°C ± 0.5°C, dans des tubes de 5 mm, contenant
un volume fixe de 400 µl d'échantillon et en présence d'un capillaire interne contenant 0,24
mg d’une référence interne, le pyrophosphate (Sigma Aldrich, pureté de 99%), dans 60 µL
d’eau deutérée. La séquence impulsion utilisée est l'impulsion simple (90°-acq) avec
découplage des protons pendant l'acquisition, à la fréquence de résonance de 161.9 MHz pour
le 31P, une fenêtre spectrale de 50 kHz, un nombre de scans variant de 64 à 1000 selon les
échantillons, un nombre de point de 32K, un temps de recyclage de 5 s et une impulsion 90°
de 14 µs pour le phosphore. Le traitement des données est réalisé à l'aide du logiciel Topspin
2.1, un filtrage numérique (LB = 10 Hz) est appliqué avant transformée de Fourier.
Pour l’analyse, une quantité connue d’extrait obtenu par voie supercritique
préalablement séché sous flux d’azote puis zéodraté (pendant 12 h) est dissoute dans 400 µl
d’un mélange (2/1 : volume) de chloroforme et de méthanol (solvants deutérés) dans un tube
RMN. On détermine la quantité de phospholipides par la relation suivante :
5PQDEIaE'F@B6FHCJE@L@6F6bCE= (7SBFN5EDEY)'c5NI=éXd'(((5N\E77EDEHYe)'R6@EPQ
5BHHEFNFBIEDEIaE'F@B6F5BHHEDB7HFCSEf(g
5PQDEIaE'F@B6FHCJE@L@6F6bCE= 2'5,38'10Zh'775000'R6@EPQ
5BHHEFNFBIEDEIaE'F@B6F5BHHEDB7HFCSEf(g
Pour déterminer le déplacement chimique phosphore associé aux différents
phospholipides, des standards seuls et en mélange (binaire) sont analysés par RMN du
phosphore. Les spectres sont fournis en annexe 1. Analysés de manière isolée et en mélange,
les déplacements chimiques sont identifiables et attribuables à chaque type de phospholipides
(Tableau II -4). Dans les extraits obtenus par voie supercritique (mélanges complexes),
compte tenu de la largeur de pics liée à la distribution des longueurs de chaînes et à la
présence d’autres espèces chimiques dans le mélange, il n’est pas possible de quantifier de
manière exacte chaque type de phospholipides. Par conséquent, les classes de phospholipides
obtenues sont indiquées de manière qualitative.
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
- 83 -
Déplacement chimique
des phospholipides seuls
(ppm)
Déplacement chimique des
phospholipides en mélange
(ppm)
PC -0,54 PC + PE PC : -0,51 et PE : 0,56 PE 0,52 PA + PE PA : 2,41 et PE : 0,75 PA 2,86 PC + PE + PA PC : -0,52, PE : 0,69 et PA : 2,04
Tableau II -4 : Déplacement chimique des phospholipides seuls et en mélange déterminés par RMN 31P
L’ensemble de ces caractérisations permettre de calculer les proportions de chaque
espèces
Les différents résultats d’analyse obtenus nous permettent de déterminer les quantités
de chaque espèce (Lipides non phosphorés, espèce non lipidique) par les relations suivantes :
(BHHEV#9#i�",W,9TW"9TW=é" =5BHHEV#9#i�"UWU��� −5BHHEPQ
(BHHE,W,V#9#i#$�� =5BHHEUWU�V���U=�#U� −5BHHEV#9#i�"UWU���
II.4.3 Analyse des dispersions de liposomes
Cette partie décrit les caractérisations relatives aux suspensions de liposomes.
� Détermination de la distribution de taille par granulométrie laser
Une lumière laser qui éclaire une particule n'est pas seulement diffractée, mais aussi
réfléchie et diffusée. La quantité de lumière déviée et l'importance de l'angle de déviation
permettent de mesurer la taille des particules. Selon les échantillons analysés, le milieu de
dispersion est soit une solution tampon HEPES seul ou un mélange solution tampon HEPES-
éthanol. Les mesures sont réalisées trois fois sur un granulomètre Mastersizer 2000 SM
(Malvern). Les diamètres caractéristiques des liposomes ainsi que la distribution des
particules sont obtenus.
� Observation par microscopie optique
L'appareil utilisé est un Olympus® BX-51 (Zeiss, Germany) à contraste de phase,
équipé d’un objectif à immersion d’huile x60 et x100. Il est relié à une caméra numérique
permettant la capture d'image. Les images sont ensuite traitées par le logiciel Analysis, qui
permet d’estimer la taille et le type des objets.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 84 -
IIIChapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 85 -
Ce chapitre porte sur le développement du procédé d’extraction de phospholipides.
Dans un premier temps, nous présenterons l’extraction des lipides au CO2 pur qui,
comme indiqué dans la partie bibliographique, permet d’augmenter la sélectivité vis-à-vis des
PL. Dans un second temps, les résultats concernant l’extraction des PL avec un mélange CO2-
éthanol sont discutés. Les essais sont réalisés avec une quantité de matière faible (de l’ordre
de 2 à 6 g).
La seconde partie de ce chapitre traite du changement d’échelle pour l’extraction des
PL. L’objectif est de traiter davantage de matière pour obtenir une masse de phospholipides
suffisante pour réaliser des essais de mise en forme de liposomes. Pour cela nous avons
travaillé avec deux types de réacteur (tubulaire et agité) aux fonctionnements différents, avec
des conditions opératoires spécifiques.
III.1 Extraction des lipides à l’aide de CO2 supercritique
L’analyse bibliographique a permis de cerner les conditions opératoires susceptibles
de conduire à l’extraction des lipides neutres :
180 bar < P < 621 bar
35°C < T < 80°C
pour 1 g de matière première 36 g de CO2 < masse de solvant < 300 g de CO2
Ces conditions opératoires servent de base pour l’étude de l’extraction des lipides mais
sont appliquées avec les limitations techniques du matériel à disposition.
III.1.1 Résultats
Le Tableau III-1 présente les conditions opératoires utilisées et les résultats obtenus.
Les masses de solvant utilisées et de lipides totaux extraits sont normalisées, c'est-à-dire
ramenées à la masse d’échantillon initialement introduite pour s’affranchir des variations de
quantité initiale utilisée (et par conséquent des volumes différents de colonne d’extraction).
Les essais sont réalisés sur 6 g (volume de colonne 10 ml, extractions suivies par « * ») et sur
2-3 g (volume de colonne 5 ml).
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 86 -
L’extraction est faite dans un réacteur cylindrique contenant la matière première
préalablement zéodratée et broyée. L’enceinte est mise sous pression puis un flux continu de
CO2 traverse le lit de matière première pendant toute la durée de l’expérience.
Les taux de lipides initialement présents dans la matière première (exprimés en masse
de lipides / masse de matière première) et sur le résidu solide d’extraction (exprimés en masse
de lipides / masse de résidu) sont déterminés. Ces données permettent de déduire le taux de
lipides extrait par rapport à la masse de matière première selon les relations suivantes :
initiale
extraiteextrait
finaleinitialeextraite
finalfinalefinale
initialinitialeinitiale
première) m(matière
m(lipides) lipides deTaux
m(lipides) m(lipides) m(lipides)
lipides deTaux m(résidu)m(lipides)
lipides deTaux première) m(matièrem(lipides)
=
−=⇒
×=×=
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 87 -
Extraction
Pression (bar) (± 5 bar)
T (°C) (±
1°C)
m (CO2) utilisée (g/g de matière
première)
Taux de lipides initial (g de
lipides / 100 g de matière
première)
Taux d’eau initial
(g d’eau / 100 g de matière
première)
Taux de
lipides final (g de
lipides / 100 g
de résidu)
Taux d’eau final (g
d’eau/ 100 g
de résidu)
Taux de lipides extrait (g de
lipides extrait/ 100 g de matière
première) Masse initiale : 3 g
Extract7 300 60 62,7 17,1 18,6 7,9 6,1 11,3
Extract8 300 45 61,1 10,6 12,4 8,2 5,9 3,7
Extract9 300 60 59,8 16,2 18,7 6,5 14,7 10,5 Extract10 300 60 58,5 2,7 19,5 2,1 12,7 0,8 Extract11 300 60 57,7 2,7 19,5 2,2 13,7 0,7
Extract14 300 35 56,4 3,0 17,3 2,6 14,3 0,6 Extract15 300 70 58,9 2,6 17,3 1,9 9,2 0,9 Extract16 200 45 64,9 4,0 7,8 3,1 5,1 1,0 Extract17 200 60 59,9 3,4 6,3 2,6 3,4 0,9
Extract22 300 45 128,0 7,6 4,5 3,6 3,1 4,2
Extract25 300 60 128,3 7,6 4,3 4,4 2,3 3,4
Masse initiale : 6 g Extract20* 300 45 63,8 7,6 3,9 3,1 3,7 4,7 Extract23* 300 60 63,8 7,6 5,3 4,2 2,3 3,6
Une deuxième extraction est réalisée après la première
(extract21 après extract20 et extract24 après extract23 ; masse initiale de 3 g)
Extract21 300 45 62,6 3,1 3,7 3,5 3,4 0
Extract24 300 60 64,4 4,2 2,3 3,8 2,2 0
Tableau III-1 : Conditions opératoires et masse de lipides extraite à l’aide de CO2 pur (Débit CO2 = 1 g/min sauf pour extract9 : 1,6 g/min)
A partir des résultats du Tableau III-1, il est possible de calculer les rendements
d’extraction correspondant aux rapports de la masse de lipides extraite par rapport à celle des
lipides initialement contenue dans la matière première avant extraction (Figure III-1).
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 88 -
Figure III-1 : Rendement d’extraction des lipides par CO2 supercritique (en bleu : extraction sur 3 g ; en rouge : extraction sur 6g ; en vert : 2ème extraction)
Dans la mesure où il a été montré une meilleure extraction des lipides pour des taux
d’humidité entre 8 et 18%, nous avons zéodraté la matière première pour nous placer dans
cette plage de valeurs. Les taux de lipides et d’eau initiaux sont variables car nous avons
commencé les essais en travaillant sur des petits lots de matière première différents.
Néanmoins, à partir de l’essai 20, un même lot est utilisé.
D’une manière générale, le traitement au CO2 supercritique entraine une extraction à
la fois de l’eau et de lipides quelles que soient les conditions opératoires, ce qui est en accord
avec la littérature (Rodriguez et al., 2008 ; Dunfort et Temelli, 1997). Pour les extractions 7 à
17 (sauf 7 et 9 correspondant à un taux de lipides élevé), le taux d’extraction se situe entre 20
et 35%. Pour ces essais, le broyage des échantillons est réalisé avec un broyeur ménager
(Moulinex, « moulin à café »). Pour les extractions 20 à 25, l’utilisation d’un broyeur
industriel permet de travailler sur matière première homogénéisée. Le rendement d’extraction
se situe entre 45 et 60%.
Il est difficile de dégager une influence des paramètres opératoires à cause de la
disparité (humidité et taux de lipides initiaux) de la matière première. A conditions
opératoires identiques, les taux d’extraction d’eau et de lipides dépendent des quantités d’eau
et de lipides initiales (extrait 7 et 10 par exemple). Néanmoins, la comparaison des extractions
20 et 23 (6 g) d’une part et des extractions 22 et 25 (6 g) d’autre part, caractérisées par une
0
10
20
30
40
50
60
70
ren
de
me
nt
d'e
xtr
act
ion
(%
)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 89 -
teneur en eau initiale comparable (de l’ordre de 4-7%), c’est la combinaison 45°C et 300 bar
qui conduit à une masse de lipide extraite plus importante que pour le couple 60°C et 300 bar.
En revanche, la comparaison des extractions 7 et 8 correspondant à des teneurs en eau
comprises en entre 12 et 18% indique des meilleurs rendements d’extractions à 60°C.
De plus, l’influence de la masse de CO2 est évaluée pour les extractions 20 et 22 (T =
45°C) et pour les extractions 24 et 25 (T = 60°C). Il n’y a pas d’incidence notable sur la
quantité de lipides extraite en passant d’une masse de solvant d’environ 60 g à 130 g. Une
quantité de 60 g de CO2 suffit pour extraire le maximum de lipide dans ces conditions
opératoires.
L’influence de la masse de matière première (3 ou 6 g) est également évaluée pour les
extractions 20 et 22 et pour les extractions 23 et 25. Il n’y a pas d’incidence notable sur la
quantité de lipides extraite en doublant la quantité de matière introduite dans le réacteur.
Les essais 21 et 24 montrent l’effet d’une 2ème extraction. L'objectif est de doubler la
durée du déshuilage avec une étape de dépressurisation/compression rapide susceptible de
casser la structure ou des liaisons protéines-lipides. D’après la littérature, cela doit permettre
d’améliorer l’extraction (Fattori et al., 1988). Nos résultats indiquent que cela n’a pas permis
d’extraire plus de lipides.
A 300 bar et à 45°C avec un débit de 1 g/min, 60 g de CO2 par gramme de matière
première permet d’extraire le plus de lipides. Les rendements d’extraction obtenus sont de
61,9 % (extraction 20) et 55,8% (extraction 22). Des résultats similaires sont obtenus à 60 °C
mais pour limiter la dégradation de molécules thermolabiles (vitamines par exemple) et pour
diminuer le coût énergétique du procédé on décide de travailler à 45°C. Des conditions
opératoires d’extraction de lipides à partir de sous-produits marins proches de celles-ci ont été
utilisées par d’autres auteurs : Sanchez-Camargo et al. (Sanchez-Camargo et al., 2011), 300
bar et 50°C pour des crevettes ; Rubio Rodriguez et al. (Rodriguez et al., 2008), 250 bar et
40°C pour de la peau de colin. Les rendements d’extraction obtenus étaient respectivement de
64% et de 96,4%.
Le Tableau III-2 présente les taux et les masses de PL avant et après extraction au CO2
pur. Les taux en PL initiaux et finaux correspondent pour chaque échantillon au rapport de la
masse de PL divisée par la masse de lipides totaux, respectivement avant et après extraction.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 90 -
Extraction
Taux PL initial
(g de PL / 100 g de lipides totaux
de la matière première)
Taux PL final
(g de PL / 100 g de lipides totaux du résidu)
Masse de PL avant
extraction (mg)
Masse de PL après
extraction (mg)
Masse initiale : 3 g Extract7 14,1 39,7 45,9 ±4,6 43,8 ±4,4 Extract8 10,0 20,0 17,7 ±1,8 22,9 ±2,3 Extract9 6,0 15,0 20,7 ±2,1 18,2 ±1,8 Extract10 36,0 67,0 21,4 ±2,1 27,5 ±2,8 Extract11 34,0 63,0 22,1 ±2,2 29,7 ±3,0 Extract14 35,0 55,0 21,4 ±2,1 26,5 ±2,7 Extract15 37,0 58,0 19,2 ±1,9 19,0 ±1,9 Extract16 45,0 67,0 36,1 ±3,6 40,5 ±4,1 Extract17 52,0 64,0 41,4 ±4,1 37,3 ±3,7 Extract22 25,0 60,0 59,4 ±5,9 63,1 ±6,3 Extract25 25,0 40,0 51,0 ±5,1 44,9 ±4,5
Masse initiale : 6 g Extract20 25,0 56,0 113,2 ±11,3 96,7 ±9,7 Extract23 25,0 45,0 99,3 ±9,9 93,7 ±9,4
Une deuxième extraction est réalisée après la première
(extract21 après extract20 et extract24 après extract24 ; masse initiale de 3 g) Extract21 56,0 57,0 44,1 ±4,4 50,2 ±5,0 Extract24 45,0 45,0 47,2 ± 4,7 42,4 ±4,2
Tableau III-2 : Taux et masses de PL avant et après extraction au CO2 pur
Quelles que soient les conditions opératoires, il n’y a pas d’extraction de PL, les
différences entre les masses de PL avant et après extraction n’étant pas significatives. Par
conséquent, les proportions relatives des PL par rapport aux lipides totaux augmentent après
traitement pour représenter jusqu’à 67% des lipides du résidu.
De plus, les essais 21 et 24 montrent également qu’il n’y a pas d’influence d’une
dépressurisation/compression rapide sur la perte de phospholipides pendant le traitement.
Sur les extraits obtenus avec les extractions 16 et 21, une analyse qualitative des
lipides restant dans les résidus est donnée par CCM. L’extraction au CO2 supercritique
élimine majoritairement les TG, les esters de cholestérol (Figure III-2). Ces résultats sont en
accord avec la littérature vis-à-vis de l’extraction des TG (Boutin et al., 2009). En revanche,
nos extraits restent relativement riches en cholestérol. Dans la suite, nous appellerons la
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 91 -
matière première traitée au CO2 supercritique : matière déshuilée.
Figure III-2 : Séparation par CCM des lipides des extraits 16 (16ap) et 21 (21ap) obtenus par CO2 supercritique (en comparaison la séparation de l’extrait des lipides totaux est rappelé). Deux
mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v)
Compte tenu de l’ensemble de ces résultats, nous avons décidé de travailler dans les
conditions opératoires suivantes :
P = 300 bar, T = 45°C et une masse de 60 g de CO2 par gramme de matière première.
après
extraction
après
extraction
avant
extraction
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 92 -
III.2 Extraction des phospholipides avec un mélange CO2-co-solvant
Cette partie s’attache au développement de l’étape d’extraction des phospholipides à
l’aide d’un mélange de CO2 et de co-solvant. Il y a peu d’études sur l’extraction des
phospholipides issus d’organismes marins, la majorité des travaux portant sur d’autres types
de matière première (sources végétales ou à partir de sous produits d’œufs). L’objectif de
cette partie est donc de démontrer la possibilité d’extraire des phospholipides à partir d’une
nouvelle source complexe à savoir les parties « non comestibles » de la coquille Saint
Jacques.
D’après la littérature, l’extraction des phospholipides peut être réalisée avec un
mélange CO2-éthanol dans les conditions suivantes (cf. chapitre I) :
200 bar < P < 700 bar
60°C < T < 80°C
7,5 % < % éthanol < 50%
Pour 1 g de matière première 10 g de CO2 < masse de CO2< 100 g de CO2
Pour 1 g de matière première 0,8 g d’éthanol < masse d’éthanol< 600 g d’éthanol
Compte tenu de la complexité de la matière première, l’utilisation d’un co-solvant tel
que l’éthanol peut effectivement permettre d’extraire les phospholipides mais conduira
probablement à la co-extraction d’autres composés présents dans la matière première. Ainsi,
nous devons définir deux critères sur lesquels optimiser l’extraction :
� Le rendement d’extraction exprimé en masse de PL extraite pour 1 g de
matière déshuilée qui doit être maximal
� La pureté qui doit être la meilleure ce qui correspond à une masse d’espèces
non phospholipides dans l’extrait la plus faible
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 93 -
III.2.1 Plan des essais et paramètres étudiés
Pour s’affranchir de la disparité des lots de matière première en termes de teneur en
eau et de charge lipidique, nous avons utilisé de la matière première plus homogène et réalisé
des déshuilages sur des grands lots. Ce sont des aliquots (d’environ 6 g) de ces lots déshuilés
qui sont utilisés.
Nous avons réalisé une vingtaine d’essais en faisant varier différents paramètres. Le
Tableau III-3 résume l’ensemble des essais. La colonne « lot » se réfère à la provenance de la
matière première et au déshuilage associé, le volume de réacteur utilisé est de 10 ml, le débit
de CO2 est de 1 g/min. Sauf indication contraire, le co-solvant utilisé est l’éthanol. Trois
essais avec de l’isopropanol sont aussi réalisés.
Pour choisir les paramètres opératoires, nous avons dû tenir compte des limitations
techniques des appareils à notre disposition (Pmax = 315 bar et Tmax = 150°C). Nous avons
donc décidé de travailler à des pressions basses (250 et 300 bar) et à une température
maximale de 60°C. Les différents paramètres étudiés à travers ces différents essais sont :
� La reproductibilité de l’extraction
� La pression
� Le pourcentage massique de co-solvant du flux d’extraction
� La température
� Le co-solvant utilisé (éthanol ou isopropanol)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 94 -
Extraction
Masse de matière
déshuilée (g)
P (bar)
T (°C)
% massique co-solvant
dans le mélange
Volume total de co-
solvant utilisé (ml)
Débit de co-solvant
(g/min) Remarques
Lot 1
Pls15 6,18 1 27 100 90 1,0
Pas de traitement de déshuilage au
CO2
Pls16 6,02 1 27 100 90 1,0
Pls17 6,03 300 27 30 49 0,5
Pls20 6,37 300 45 50 94 1,0
Pls21 6,16 300 60 30 50 0,5
Pls22 6,33 250 27 50 138 1,0
Pls23 6,50 250 60 50 120 1,0
Pls24 6,29 300 60 50 124 1,0
Lot 2
Pls32 7,03 250 45 50 116 1,0
Pls31a 6,66 250 45 50 117 1,0
Pls33 6,20 250 27 50 115 1,0
Pls34 6,46 250 27 30 73 0,5
Pls35 6,55 250 45 15 45 0,2
Pls36 6,38 250 45 30 81 0,5
Pls37 6,05 250 45 30 79 0,5
Pls38 6,71 250 45 50 116 1,0
Pls39 6,50 1 27 100 126 1,0
Pls40 6,68 250 45 30 80 0,5
Pls41 6,68 250 27 50 113 0,9 Co-solvant = Isopropanol
Pls42 6,71 1 27 100 127 0,9 Co-solvant = Isopropanol
Pls43 6,55 250 45 50 133 1,9 Co-solvant = Isopropanol
Pls44 6,63 250 60 30 79 0,5
Tableau III-3 : Conditions opératoires des extractions des phospholipides
(débit de CO2 = 1 g/min, volume du réacteur : 10 ml)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 95 -
III.2.2 Résultats
Cette partie présente les résultats obtenus pour l’extraction des phospholipides. Pour
l’ensemble des essais, l’extraction est faite dans un réacteur cylindrique de 10 ml contenant la
matière première déshuilée. Ensuite, l’enceinte est mise sous pression avec du CO2 pur puis
un flux continu de CO2-co-solvant traverse le lit de matière pendant toute la durée de
l’expérience. Le temps initial correspond au temps de perçage du lit de l’alcool, c’est à dire à
l’apparition des premières gouttes d’alcool en sortie. Cinq collectes sont réalisées au cours de
l’extraction. La masse totale extraite est déterminée sur la totalité de l’extrait alcoolique en
sortie de colonne. Pour des raisons de sensibilité de techniques d’analyse, généralement, les
deux premières fractions sont analysées en termes de masses de lipides totaux et de PL.
Pour comparer les différentes conditions opératoires, nous avons introduit plusieurs
facteurs qui nous permettrons d’évaluer les performances de l’extraction :
� La masse de phospholipides extraite sur la masse totale extraite : rapport de
phospholipides de l’extrait
fPQ/��U = 5PQ5UWU��U=�#U�
� La masse de phospholipides extraite sur la masse de lipides extraite : rapport de
phospholipides de la partie lipidique de l’extrait
fPQ/V#9 = 5PQ5V#9#i�"��U=�#U
� La masse de lipides extraite sur la masse totale extraite : rapport de lipides de
l’extrait
fV#9/��U = 5V#95UWU��U=�#U
L’ensemble des courbes présentées par la suite correspond à des masses normalisées
par la masse initiale d’échantillon introduite et cumulées d’une fraction à une autre.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 96 -
III.2.2.1 Intérêt du prétraitement de déshuilage au CO2 pur
La première étape du procédé consiste à extraire les lipides neutres avec du CO2 pur.
Pour s’assurer de l’intérêt de ce premier traitement nous avons comparé les résultats d’une
extraction à l’éthanol sur deux échantillons, un ayant subi un prétraitement de déshuilage au
CO2 et l’autre non.
Les Figure III-3 et Figure III-4 présentent respectivement l’influence d’un
prétraitement au CO2 sur la masse totale extraite (rapporté à 1 g de matière première) et sur la
partie lipidique en fonction du temps.
Figure III-3 : Influence du prétraitement sur la masse totale extraite (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol, débit : 0,8 g/min)
Les allures des courbes d’extraction sont proches. La quantité extraite pour l’essai sans
déshuilage est plus importante.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
sans déshuilage au CO2 (pls15)
avec déshuilage au CO2 (pls16)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 97 -
Figure III-4 : Influence du prétraitement sur l'extraction des lipides totaux et des phospholipides (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol)
L’allure des courbes d’extraction est semblable dans les deux cas. Sans prétraitement
de déshuilage, la quantité de lipides disponibles pour l’extraction est supérieure, et donc la
masse extraite est plus importante que dans le cas de la matière prétraitée. On constate par
contre que la quantité de phospholipides extraite est du même ordre de grandeur. Le
traitement de déshuilage conduit donc principalement à un abattement en lipides de nature
non phospholipidique.
Le Tableau III-4 compare la qualité des extraits obtenus avec et sans prétraitement.
Les fractions F1 et F2 correspondent respectivement aux collectes de 0 à 25 min et de 25 à 50
min.
jkl/mno
F1
jkl/mno
F2
jkl/mno
Total
jkl/pqr Total
Masse de PL extraite (mg) / g de matière
Sans prétraitement
0,35 0,27 0,34 0,11 16,0
Avec prétraitement
0,45 0,57 0,48 0,11 13,0
Tableau III-4 : Bilan en phospholipides des extractions avec et sans déshuilage au CO2 (P = 1 bar, T = 27°C, 100% éthanol) (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des
fractions)
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60
Ma
sse
s d
e l
ipid
es
to
tau
x e
t d
e P
L (m
g)
ex
tra
ite
s /
g d
e m
ati
ère
Temps (min)
sans déshuilage au CO2 lipides totaux (pls15)
avec déshuilage au CO2 lipides totaux (pls16)
sans déshuilage au CO2 PL (pls15)
avec déshuilage au CO2 PL (pls16)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 98 -
Que ce soit pour les fractions 1 et 2 ou pour l’ensemble, le taux phospholipides par
rapport aux lipides totaux (fPQ/V#9) est supérieur avec prétraitement au CO2 pur. Par ailleurs,
la quantité de phospholipides extraite par gramme d’échantillon est légèrement inférieure
quand il y a prétraitement. Une explication pourrait être un effet « co-solvant » provenant des
lipides neutres plus abondants dans une matière non déshuilée.
Pour conclure, le prétraitement permet d’obtenir des extraits plus sélectifs en
phospholipides par rapport aux lipides totaux.
III.2.2.2 Reproductibilité de l’extraction
Dans un premier temps, nous avons analysé la reproductibilité des expériences, en
répétant trois fois deux séries d’extraction pour deux taux d’éthanol différentes (Tableau
III-5).
Extraction [Masse de matière
déshuilée utilisée (g)]
P (bar) T (°C)
% massique éthanol dans le
mélange
Débit de CO2
(g/min)
Débit d’éthanol
moyen (g/min)
Volume total d’éthanol utilisé (ml)
Pls32 [7,03]
Pls31a [6,66] 250± 5 45± 1 50 1,0 0,97 116+/- 1
Pls38 [6,71]
Pls36 [6,38]
Pls37 [6,05] 250 ± 5 45 ± 1 30 1,0 0,50 79+-/2
Pls40 [6,68]
Tableau III-5 : Conditions opératoires d’étude de la reproductibilité de l’extraction des phospholipides (durée d’extraction : environ 100 min)
La Figure III-5 présente l’évolution des masses moyennes extraites (totale, lipides et
phospholipides) en fonction du temps pour les deux conditions testées. Les extractions ont été
répétées 3 fois.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 99 -
Figure III-5 : Reproductibilité de l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min) ou 50% (débit total = 2 g/min) d’éthanol) (n = 3)
Pour les deux conditions opératoires, les courbes suivent une tendance classique
d’extraction à savoir une première partie qui correspond à l’extraction du soluté le plus
« disponible », par exemple proche de la surface de la poudre où il y a peu de limitation au
transfert. Par la suite, le transfert plus difficile dans la matrice limite la quantité de soluté qui
migre vers le fluide d’où l’apparition d’une pente plus faible, voire d’un plateau si la matrice
est épuisée ou si le transfert est trop lent.
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Temps (min)
P = 250 bar T = 45°C %étOH = 50% (pls32, pls31a et pls38)
P = 250 bar T = 45°C %étOH = 30% (pls36, pls37 et pls40)
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Temps (min)
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(m
g)
/ g
de
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Temps (min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 100 -
Quelle que soit la masse extraite considérée (totale, lipides ou phospholipides), le
procédé d’extraction peut être considéré comme répétable pour les conditions opératoires
testées. De ces résultats, nous avons calculé un pourcentage d’erreur relatif moyen pour
chaque type d’extrait :
� Erreur relative moyenne sur la masse totale extraite : 5,8% ± 1,3 (n = 10)
� Erreur relative moyenne sur la masse de lipides totaux : 4,5% ± 2,2 (n = 4)
� Erreur relative moyenne sur la masse de PL : 3,3% ± 2,6 (n = 4)
Ce pourcentage a été appliqué sur les autres résultats d’extraction.
III.2.2.3 Influence de la pression
Deux pressions (250 et 300 bar) sont utilisées (Tableau III-6 ).
Extraction [Masse de matière
déshuilée utilisée (g)]
P (Bar) T (°C) % massique
éthanol dans le mélange
Débit de CO2
(g/min)
Débit d’éthanol
moyen (g/min)
Volume total
d’éthanol utilisé (ml)
Pls23 [6,50]
250 ± 5 60 ± 1 50% 1,0 0,99 120
Pls24 [6,29]
300 ± 5 60 ± 1 50% 1,0 1,02 123
Tableau III-6 : Conditions opératoires pour étudier l'influence de la pression sur l’extraction des lipides
La Figure III-6 présente l’influence d’une variation de pression entre 250 et 300 bar
sur les rendements d’extraction des différentes fractions.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 101 -
Figure III-6 : Influence de la pression sur l’extraction (T = 60°C, 50% éthanol, débit total = 2 g/min)
Pour la quantité totale et de lipides totaux, les courbes obtenues pour les deux
pressions étudiées sont superposables. Dans ces conditions, l’extraction des PL est légèrement
plus importante à 250 bar (pour 1 g de matière, 11,65 ± 0,38 mg contre 10,21 ± 0,34 mg).
Augmenter la pression ne modifie pas de manière significative les propriétés
physiques du mélange CO2-éthanol. Le Tableau III-7 compare les viscosités et les masses
volumiques à 250 et 300 bar calculées à l’aide du logiciel Prophys, basé sur le modèle
thermodynamique MHV 2 (Modified Huvon-Vidal mixing rule).
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/ g
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Temps(min)
P = 250 bar T = 60°C %étOH = 50% (pls23)
P = 300 bar T = 60°C %étOH = 50% pls(24)
0
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Temps (min)
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Temps (min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 102 -
P (bar)
T
(°C) % massique d’éthanol
dans le mélange Viscosité (Pa.s) Masse volumique (kg/m3)
250 60 50 2,61 x 10-4 825
300 60 50 2,68 x 10-4 833
Tableau III-7 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol
(P = 250 ou 300 bar, T = 60°C, 50% éthanol ; obtenues par Prophys)
Les propriétés des fluides étant assez proches ni le transfert de matière ni la solvatation
ne devraient subir de variations importantes d’où le peu de différence observée sur
l’extraction. Les études menées par d’autres auteurs qui étudient l’influence de la pression
n’utilisent pas cette proportion d’éthanol. Cependant, dans le cas d’une extraction
supercritique à 10% massique d’éthanol et une température de 80 °C sur le soja (Montanari et
al., 1999), augmenter la pression de 239 bar à 301 bar permettait d’augmenter la quantité de
phospholipides extraits, qui passe de 2,9 mg de PL par gramme de matière première déshuilé
à 3,2 mg/g. Notre résultat, obtenu dans le cas d’un fluide extractant très riche en éthanol, peut
niveler ou masquer un effet à plus faible pourcentage.
Pour des raisons économiques, il est préférable de travailler à 250 bar.
III.2.2.4 Influence du pourcentage d’éthanol
Dans cette partie nous étudions l’effet de la proportion d’éthanol utilisée pour
l’extraction. Le Tableau III-8 fournit les conditions opératoires utilisées.
Extraction [Masse de matière
déshuilée utilisée (g)]
P (Bar) T (°C) % massique
éthanol dans le mélange
Durée extraction
(min)
Débit d’éthanol
moyen (g/min)
Volume total d’éthanol utilisé (ml)
Pls35 [6,55] 250 ± 5 45 ± 1 15 240 0,15 45
Pls36 [6,38] 250 ± 5 45 ± 1 30 90 0,51 81
Pls31a [6,66] 250 ± 5 45 ± 1 50 90 0,98 117
Tableau III-8 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (débit de CO2 = 1 g/min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 103 -
La Figure III-7 présente les résultats obtenus. A noter que nous avons fait le choix de
travailler à débit de CO2 fixe (1 g/min) et que nous avons donc du adapter celui de l’éthanol
en fonction de la proportion souhaitée. Pour avoir des volumes d’extraits identiques, le temps
de prélèvement est par conséquent différent.
Figure III-7 : Influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 1 g/min)
Plus le pourcentage d’éthanol est important, plus les quantités totales, de lipides et de
phospholipides extraites sont importantes, hormis pour le cas à 15% où le mélange « peine » à
extraire les phospholipides.
Le Tableau III-9 présente les masses volumiques et les viscosités des essais présentés
dans cette partie.
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(m
g)
/ g
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Temps (min)
P = 250 bar T = 45°C %étOH = 15% (pls35)
P = 250 bar T = 45°C %étOH = 30% (pls36)
P = 250 bar T = 45°C %étOH = 50% (pls31a)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 104 -
P (bar)
T (°C)
% massique d’éthanol dans le mélange
Viscosité (Pa.s) Masse volumique (kg/m3)
250 45 15 1,29 x 10-4 982
250 45 30 1,78 x 10-4 939
250 45 50 2,61 x 10-4 850
Tableau III-9 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar,
T = 45°C ; obtenues par Prophys)
En considérant seulement les caractéristiques physiques du solvant, les conditions les
plus favorables à l’extraction sont obtenues à 15% d’éthanol. En effet, à ce pourcentage
d’éthanol, le mélange conjugue une masse volumique forte (meilleure solvatation) et une
viscosité faible (moins de résistance au transfert de matière). Cependant, l’ajout d’un co-
solvant tel que l’éthanol permet d’augmenter la polarité du solvant. Plus cette proportion est
élevée, plus la polarité est élevée, et donc, plus il y aura d’espèces polaires susceptibles d’être
extraites. Il y a donc peu d’extraction de PL à 15% d’éthanol car le pouvoir solvant n’est pas
suffisant. Pour une pression d’environ 400 bar et une température de 60°C, il est impossible
d’extraire des PL à partir de résidu d’œufs avec de bas pourcentages d’éthanol (5 à 20%
massique) (Shah et al., 2004). Inversement, pour une pression d’environ 200 bar et une
température de 60°C et à partir d’une lécithine de soja (contenant 73% de phospholipides),
Teberikler et al. (Teberikler et al., 2001) ont observé une augmentation du rendement
d’extraction d’un facteur quatre en utilisant 12,5% d’éthanol par rapport à une utilisation de
10% de co-solvant. Dans ces conditions, plus la quantité d’alcool utilisée est importante plus
l’extraction des PL est favorisée.
Le Tableau III-10 fournit les caractéristiques des fractions obtenues pour chaque essai.
P (bar)
T (°C)
% massique d’éthanol dans le
mélange
jkl/pqr jmno/pqr jkl/mno
F1 F2 Total F1 F2 Total F1 F2 Total
250 45 50 0,39 0,15 0,32 0,58 0,19 0,47 0,68 0,77 0,69
250 45 30 0,48 0,30 0,43 0,57 0,30 0,49 0,85 0,99 0,87
250 45 15 0,59 0,51 0,58 0,67 1,00 0,72 0,88 0,50 0,80
Tableau III-10 : Influence du pourcentage d'éthanol sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 105 -
Plus la proportion d’éthanol est importante, plus le rapport des PL de l’extrait
( fPQ/��U ) est faible car on solubilise alors bien plus d’autres matières lipidiques non
phospholipidiques ou non lipidiques. Le taux de lipides de l’extrait (fV#9/��U diminue au
cours de l’extraction, dans tous les cas sauf pour 15% d’éthanol. Le taux de PL par rapport
aux lipides totaux de l’extrait (fPQ/V#9 est supérieur pour F2 par rapport à F1 pour 30% et 50%
d’éthanol tandis que pour 15% c’est l’inverse.
A 15 % d’éthanol, la totalité de la masse extraite est de nature lipidique pour la
deuxième fraction, et il s’agit des conditions où l’on a la meilleure sélectivité en lipides
totaux. Par contre, sur la deuxième fraction, nous avons une proportion phospholipides/lipide
totaux de seulement 0,5. Avec 30% d’éthanol, on peut avoir une fraction lipidique très riche
en phospholipides (>87%) mais dans laquelle il reste une part importante de composés non
lipidiques.
III.2.2.5 Influence de la température à différentes pressions
L’effet de la température à 250 et 300 bar est analysé. Le Tableau III-11 regroupe les
conditions opératoires testées et regroupe les essais qui peuvent être comparés.
Extraction [Masse de matière
déshuilée utilisée (g)]
P (Bar) T (°C) % massique éthanol dans le mélange
Débit d’éthanol
moyen (g/min)
Volume total
d’éthanol utilisé (ml)
Pls34 [6,46] 250 ± 5 27 ± 1 30 0,65 73
Pls36 [6,38] 250 ± 5 45 ± 1 30 0,65 81
Pls44 [6,63] 250± 5 60 ± 1 30 0,61 80
Pls17 [6,03] 300 ± 5 27 ± 1 30 0,65 49
Pls21 [6,16] 300 ± 5 60 ± 1 30 0,67 50
Pls20 [6,37] 300 ± 5 45 ± 1 50 1,25 94
Pls24 [6,29] 300 ± 5 60 ± 1 50 1,26 124
Tableau III-11 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence de la température sur l’extraction (Débit de CO2 : 1 g/min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 106 -
III.2.2.5.1 Pression de 250 bar
La Figure III-8 présente les résultats obtenus à 250 bar et 30% d’éthanol à 3
températures (27, 45 et 60°C).
Figure III-8 : Influence de la température sur l’extraction (P= 250 bar, 30% d’éthanol, débit total de 1,5 g/min)
Les courbes ont des évolutions au cours du temps comparables. L’impact de la
température est significatif à 60°C pour les phospholipides, alors que l’extraction des lipides
totaux y est sensible dès 45°C.
D’une façon générale, l’extraction des lipides est d’autant plus rapide que la
température est basse (pente à l’origine plus élevée à 27°C). L’extraction des lipides totaux ne
semble pas être totalement terminée pour l’ensemble des températures.
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/ g
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Temps (min)
P = 250 bar T = 27°C %étOH = 30% (pls34)
P = 250 bar T = 45°C %étOH = 30% (pls36)
P = 250 bar T = 60°C %étOH = 30% (pls40)
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g)
/ g
de
ma
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Temps (min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 107 -
La température modifie la masse volumique et la viscosité du mélange CO2-éthanol
(Tableau III-12).
P
(bar)
T
(°C)
% massique d’éthanol dans le mélange
Viscosité (Pa.s) Masse volumique (Kg/m3)
250 27 30 1,43 x 10-4 986
250 45 30 1,20 x 10-4 939
250 60 30 1,12 x 10-4 896
Tableau III-12 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol à 3 températures (P = 250 bar, 30 % éthanol)
A débit massique constant, une diminution de la masse volumique entraine une
augmentation de la vitesse d’écoulement dans le lit de matière qui est défavorable au transfert
de matière. Par contre, une faible viscosité, comme c’est le cas à 60°C, est quant à elle
propice à faciliter le transfert. La masse volumique qui diminue aura tendance à diminuer le
pouvoir solvant du fluide extractant. Au vu des résultats exprimé ici, il semblerait que l’effet
de diminution de pouvoir solvant du mélange CO2-éthanol à 60°C et l’augmentation de la
vitesse du flux de solvant l’emporte sur le gain en terme de transfert de matière.
En s’intéressant aux différents taux (Tableau III-13), on observe une variation de ce
paramètre en fonction la température. Il n’y a pas de tendances simples liées à la température.
Cependant on note tout de même le faible rapport de PL par rapport aux lipides totaux
(fPQ/V#9) pour la fraction F2 obtenue à 60°C.
P
(bar)
T
(°C)
% massique
d’éthanol dans le mélange
jkl/pqr jmno/pqr jkl/mno
F1 F2 Total F1 F2 Total F1 F2 Total
250 27 30 0,55 0,44 0,51 0,80 0,41 0,64 0,69 1,00 0,79
250 45 30 0,48 0,30 0,43 0,57 0,30 0,49 0,85 0,99 0,87
250 60 30 0,48 0,22 0,40 0,48 0,50 0,49 0,99 0,44 0,82
Tableau III-13 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 108 -
L’ensemble des essais met en évidence qu’il n’est pas nécessaire de travailler à des
températures très élevées pour extraire les phospholipides de la matrice. Une température de
27 ou 45°C suffit. Dans la littérature, de telles températures « basses » ne sont pas explorées
puisque les auteurs font généralement leurs essais entre 45 et 80°C. Par conséquent, les
risques de dégradation sont donc plus importants dans leur cas.
Quelle que soit la température, les résultats obtenus à 250 bar et 50 % d’éthanol ne
sont pas significativement différents (figures non représentées). Le Tableau III-14 présente les
caractéristiques des solvants d’extraction.
P
(bar)
T
(°C)
% massique d’éthanol dans le mélange
Viscosité (Pa.s) Masse volumique
(kg/m3)
250 27 50 3,11 x 10-4 878
250 45 50 2,61 x 10-4 850
250 60 50 2,27 x 10-4 825
Tableau III-14 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, 50% éthanol ; obtenues par Prophys) à 3 températures
Tout comme explicité précédemment, le gain sur le transfert de matière obtenu à
température plus élevée est compensé par la diminution du pouvoir solvant.
III.2.2.5.2 Pression de 300 bar
La Figure III-9 compare, pour deux pourcentages d’éthanol, les résultats obtenus à 300
bar à 27°C, 45°C et 60°C.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 109 -
Figure III-9 : Influence de la température sur l’extraction (P = 300 bar, 50% éthanol (débit total : 2 g/min) et 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min))
A 30 % d’éthanol, c’est surtout l’extraction des lipides totaux qui est affectée par la
variation de température.
A 50 % d’éthanol, il apparait qu’on extrait moins de matière totale et de
phospholipides à la température la plus haute, ce qui se traduit une vitesse d’extraction plus
importante à 45°C qu’à 60°C.
Le Tableau III-16 compare les caractéristiques du solvant d’extraction.
0
20
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120
0 20 40 60 80
Ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
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re
Temps (min)
P = 300 bar T = 45°C %étOH = 50% lot 2 (pls20)
P = 300 bar T = 60°C %étOH = 50% lot 2 (pls24)
P = 300 bar T = 27°C %étOH = 30% lot 1 (pls17)
P = 300 bar T = 60°C %étOH = 30% lot 1 (pls21)
0
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0 20 40 60
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Temps (min)
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0 20 40 60
Ma
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de
PL
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tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 110 -
P
(bar)
T
(°C)
% massique d’éthanol
dans le mélange
Viscosité
(Pa.s)
Masse volumique (kg/ m3)
300 27 30 1,43 x 10-4 997
300 60 30 1,12 x 10-4 913
300 45 50 2,03 x 10-4 857
300 60 50 1,79 x 10-4 833
Tableau III-15 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 300 bar, 30% et 50% d’éthanol; obtenues par Prophys) à 3 températures
On remarque qu’à 30 % d’éthanol, la masse volumique et la viscosité du mélange
CO2-éthanol sont légèrement supérieures à 27°C qu’à 60°C. Ainsi, à 60°C, la plus faible
viscosité du mélange favoriserait le transfert de matière mais cet effet est contrebalancé par
une plus faible masse volumique. Selon les espèces à extraire (lipidiques ou non), l’effet
viscosité prédomine ou non sur l’effet masse volumique.
A 50 % d’éthanol, la masse volumique varie très peu entre 45 et 60°C tandis que la
viscosité diminue avec la température. En considérant seulement ces deux paramètres, le
transfert de matière devrait être plus important à 60°C. Or expérimentalement, l’extraction est
favorisée à 45°C. Dans la littérature (Letisse et al., 2006 ; Sanchez-Camargo et al., 2011), la
température a, soit un effet positif, soit négatif sur l’extraction, ce qui montre la difficulté à
anticiper des tendances pour ce paramètre opératoire.
Le Tableau III-16 présente les sélectivités pour ces conditions d’extraction.
P
(bar)
T
(°C)
% massique
d’éthanol
dans le mélange
jkl/pqr jmno/pqr jkl/mno
F1 F2 Total F1 F2 Total F1 F2 Total
300 27 30 0,19 0,10 0,16 0,43 0,24 0,36 0,45 0,42 0,44
300 60 30 0,20 0,18 0,20 0,63 0,63 0,63 0,33 0,30 0,32
300 45 50 0,13 0,15 0,13 0,37 0,28 0,36 0,35 0,52 0,37
300 60 50 0,17 0,12 0,16 0,56 0,26 0,48 0,30 0,45 0,32
Tableau III-16 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)
Pour un pourcentage d’éthanol donné, les rapports fPQ/��Uet fV#9/��U de l’extrait sont
plus importants à 60°C. Par contre, la tendance s’inverse pour le rapport
phospholipides/lipides totaux (fPQ/V#9) puisque c’est à basse température que cette sélectivité
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 111 -
est la plus importante. La température influe donc sur la sélectivité de l’extraction ce qui est
en accord avec les observations de la littérature, menées généralement sur la gamme 60-80°C
pour l’extraction des phospholipides.
III.2.2.6 Exploitation de la courbe d’extraction
Dans la mise au point du procédé d’extraction et de la compréhension des effets, il est
utile d’exploiter la première partie de la cinétique d’extraction car elle correspond à la fraction
la plus facilement accessible des composés à extraire. A titre d’exemple, la Figure III-10
présente la masse de PL extraite par g de matière déshuilée en fonction de la quantité de
solvant. En effet, puisque le débit de fluide extractant est connu, il est facile de convertir le
temps d’extraction en quantité de solvant utilisée.
Figure III-10 : Exemple de courbe d’extraction (Pls33) exprimée en fonction de la masse de solvant utilisée (P = 250 bar, T = 27°C, 50% éthanol (débit total : 2 g/min)
La pente de cette courbe s’apparente alors à une solubilité apparente puisqu’elle
représente une quantité solubilisée par unité de solvant. Nous avons donc calculé le rapport
masse extrait / m(CO2-éthanol) pour les lipides totaux et les phospholipides de la première
fraction F1 des différents essais (Tableau III-17).
0
20
40
60
80
100
120
140
0 20 40 60 80 100 120
Ma
sse
de
PL
ex
tra
ite
(m
g)
Masse de solvant (g)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 112 -
Extraction P (bar)
T (°C)
% massique d’éthanol dans le
mélange
Solubilité apparente des lipides (mg / g de
solvant)
Solubilité apparente des PL (mg / g de
solvant)
100 % éthanol
Pls15 (lot 1) 1 27 100 11,63 4,03
Pls16 (lot 1) 1 27 100 6,17 2,79
Pls39 (lot 2) 1 27 100 7,20 4,47
Lot 1
Pls17 300 27 30 2,56 1,14
Pls20 300 45 50 4,21 1,48
Pls21 300 60 30 3,14 1,02
Pls22 250 27 50 3,61 1,27
Pls23 250 60 50 4,10 1,41
Pls24 300 60 50 3,92 1,19
Lot 2
Pls32 250 45 50 5,12 3,06
Pls31a 250 45 50 4,84 3,28
Pls33 250 27 50 4,31 2,89
Pls34 250 27 30 4,36 3,02
Pls35 250 45 15 0,53 0,47
Pls36 250 45 30 2,98 2,53
Pls37 250 45 30 3,26 2,47
Pls38 250 45 50 4,55 3,13
Pls40 250 45 30 3,30 2,68
Pls44 250 60 30 2,39 2,38
Tableau III-17 : Solubilités apparentes des lipides et phospholipides pour les différentes conditions opératoires étudiées
Les valeurs de solubilité apparente varient de 0,5 à 5,1 mg/g de solvant pour les lipides
totaux et de 0,5 à 3,3 mg/g de solvant pour les phospholipides. A 15% d’éthanol, on observe
la plus faible solubilité apparente des lipides et des phospholipides. A titre de comparaison,
les expériences réalisées avec 100% d’éthanol sur une matière première sans déshuilage
conduisent à des solubilités apparentes élevées (11,6 mg/g de solvant pour les lipides totaux et
de 4,0 mg/g de solvant pour les phospholipides.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 113 -
Les solubilités apparentes des lipides et des PL augmentent avec le pourcentage
d’éthanol (PLs35 (15%) < PLs37 (30%) PLs32 (50%)). Cette tendance est retrouvée dans les
études sur des graines de maïs pour des pourcentages d’éthanol allant de 0 à 10% massique
(Ronyai et al., 1998).
L’influence de la température sur les solubilités apparentes n’est pas clairement
établie. A 30% d’éthanol et 250 bar, les solubilités augmentent quand la température
augmente (PLs34 (27°C) > PLs37 (45°C)). En revanche, à 30% d’éthanol et 300 bar, les
solubilités diminuent quand la température augmente (PLs17 (27°C) < PLs21 (60°C)).
Montanari et al. (Montanari et al., 1999), ont trouvé expérimentalement une solubilité de PL
de 0,25 mg/g de solvant à 239 bar, 80°C et 10% d’éthanol. Cette valeur est cohérente avec nos
résultats : une solubilité apparente de PL égale à 0,47mg/g (250 bar, 15% d’éthanol, 45°C)
dans la mesure où nous utilisons davantage de co-solvant.
Peu d’auteurs utilisent une proportion d’éthanol de 50%. Shah et al., (Shah et al.,
2004) extraient des phospholipides à partir d’œufs non commercialisables par un procédé
similaire au notre (un traitement de déshuilage au CO2 seul puis une extraction CO2-éthanol).
Cependant, les données de solubilité ne sont mentionnées dans leurs travaux.
En résumé, si on tient compte uniquement du critère « solubilité », les meilleures
conditions opératoires sont : 250 bar, 45°C et 50 % d’éthanol. Néanmoins, le critère de pureté
est aussi à prendre en considération pour donner des recommandations en termes de pression,
température et % de co-solvant.
III.2.2.7 Récapitulatif des résultats obtenus avec le mélange CO2- éthanol
Nous avons calculé un rendement d’extraction sur la base des extractions réalisées par
la méthode de Folch qui donnent la totalité des PL disponibles dans la matière déshuilée (3,8
± 0,6 % de lipides totaux par rapport à la matière déshuilée et 50,3 ± 9,3 % de PL par rapport
aux lipides totaux, soit 18,9 ± 1,9 mg de PL / g de matière déshuilée). Le Tableau III-18
récapitule les conditions opératoires, les puretés et les rendements d’extraction obtenus en
utilisant l’éthanol comme co-solvant. Les résultats sont classés, pour un lot donné, en fonction
de la quantité de phospholipides extraite par rapport à la masse de matière déshuilée traitée.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 114 -
Les conclusions suivantes peuvent être énoncées :
� Sur l’ensemble des essais menés, la première étape d’extraction permet
généralement de récupérer plus de 50% de matière totale. Cela se retrouve dans
le fait que fV#9/��U diminue au cours de l’extraction (F1>F2) (sauf pour Pls35
qui correspond à 15% d’éthanol).
� On observe des rendements très variables en fonction du lot de matière
utilisée : 90-100 % pour le lot 2 et 40-65 % pour le lot 1. Cette disparité
pourrait être liée au fait que le sous produit utilisé est un mélange de barbes,
foies … ce qui rend les prélèvements « homogènes » délicats.
� Si on considère le lot 2, toutes les conditions opératoires sauf celle qui n’utilise
que 15 % d’éthanol conduisent à des rendements élevés. Cela suggère qu’il
faut une quantité minimum de co-solvant pour que l’extraction des PL soit
efficace.
� Les conditions opératoires jouent sur la pureté des extraits qui présentent ou
non une partie de lipides neutres et de composés non-lipidiques. Notre objectif
est de sélectionner les conditions qui conduisent aux extraits les plus purs en
PL que ce soit par rapport à la masse totale extraite ou par rapport aux lipides
totaux. Les conditions qui répondent à ces critères sont (Figure III-11). :
o 250 bar 30% d’éthanol et 27°C (Pls34) : plus de 50% de phospholipides
(par rapport à la matière totale extraite) et 79% de PL par rapport aux
lipides totaux. De plus, on travaille à faible température (en dessous de
la température critique, liquide dense).
o 250 bar 15% d’éthanol et 45°C (Pls35) : 58% de phospholipides (par
rapport à la matière totale extraite) et 80% de PL par rapport aux lipides
totaux. Dans ce cas, on a aussi le meilleur fPQ/��U.
o 250 bar 30% d’éthanol et 45°C (Pls36, Pls37 et Pls40) : environ 42%
de phospholipides (par rapport à la matière totale extraite) et environ
83% de PL par rapport aux lipides totaux. Dans ce cas, on a aussi le
meilleur fPQ/V#9.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 115 -
Figure III-11 : Répartition des masses extraites (mg/g matière déshuilée) (non lipidiques, lipides non phosphorés et phospholipides) des extraits aux conditions opératoires
sélectionnées (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)
0
5
10
15
20
25
30
35
250 bar 30% 27°C
250 bar 15% 45°C
250 bar 30% 45°C
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
reFraction 1 (0 à 25 min)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
250 bar 30% 27°C
250 bar 15% 45°C
250 bar 30% 45°C
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Fraction 2 (25 à 50 min)
0
10
20
30
40
50
250 bar 30% 27°C 250 bar 15% 45°C 250 bar 30% 45°C
ma
sse
ex
tra
ite
/ g
de
ma
tiè
re
(mg
)
Ensemble des fractions (0 à 50 min)
non lipidiques
lipides non phosphorés
PL
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 116 -
Extraction P
(bar)
T
(°C)
% massique
d’éthanol dans le mélange
RPL/ext (g/g) Rlip/ext (g/g) RPL/lip (g/g) mg de PL extrait/g matière déshuilée
Rendement (g de PL extrait/g de PL
disponibles)
(%) F1 F2 Total F1 F2 Total F1 F2 Total
Lot 1
Pls16 1 27 100 0,15 0,10 0,14 0,34 0,17 0,28 0,45 0,57 0,48 12,42 65,7
Pls20 300 45 50 0,13 0,15 0,13 0,37 0,28 0,36 0,35 0,52 0,37 12,30 65,1
Pls23 250 60 50 0,20 0,13 0,18 0,58 0,21 0,48 0,35 0,61 0,38 11,65 61,6
Pls22 250 27 50 0,18 0,15 0,17 0,51 0,36 0,48 0,35 0,42 0,36 10,82 57,2
Pls24 300 60 50 0,17 0,12 0,16 0,56 0,26 0,48 0,30 0,45 0,32 10,21 54,0
Pls21 300 60 30 0,20 0,18 0,20 0,63 0,63 0,63 0,33 0,30 0,32 7,98 42,2
Pls17 300 27 30 0,19 0,10 0,16 0,43 0,24 0,36 0,45 0,42 0,44 7,68 40,6
Lot 2
Pls36 250 45 30 0,48 0,30 0,43 0,57 0,30 0,49 0,85 0,99 0,87 19,56 100
Pls33 250 27 50 0,44 0,27 0,39 0,66 0,30 0,55 0,67 0,89 0,71 19,41 100
Pls38 250 45 50 0,38 0,23 0,34 0,56 0,26 0,47 0,69 0,87 0,72 19,37 100
Pls37 250 45 30 0,46 0,23 0,40 0,61 0,24 0,51 0,76 0,95 0,78 19,20 100
Pls40 250 45 30 0,53 0,24 0,44 0,65 0,23 0,52 0,81 1,00 0,84 19,03 100
Pls31a 250 45 50 0,39 0,15 0,32 0,58 0,19 0,47 0,68 0,77 0,69 18,88 99,9
Pls34 250 27 30 0,55 0,44 0,51 0,80 0,41 0,64 0,69 1,00 0,79 18,86 99,7
Pls39 1 27 100 0,29 0,07 0,21 0,47 0,13 0,35 0,62 0,51 0,61 18,51 97,9
Pls32 250 45 50 0,30 0,21 0,28 0,51 0,24 0,43 0,60 0,85 0,64 18,07 95,6
Pls44 250 60 30 0,48 0,22 0,40 0,48 0,50 0,49 0,99 0,44 0,82 17,11 90,5
Pls35 250 45 15 0,59 0,51 0,58 0,67 1,00 0,72 0,88 0,50 0,80 11,87 62,8
Tableau III-18 : Récapitulatif des résultats de l’extraction avec un mélange CO2-éthanol (pureté et rendement, (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions))
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 117 -
III.2.2.8 Remplacement de l’éthanol par l’isopropanol
Nous avons réalisé plusieurs essais en substituant l’éthanol par de l’isopropanol dans
les conditions opératoires sont résumées dans le Tableau III-19. A notre connaissance, il n’y a
pas, dans la littérature, d’études d’extraction de phospholipides réalisée avec un mélange
CO2-isopropanol. Néanmoins, l’isopropanol associé à l’hexane est utilisé pour extraire les
lipides totaux (Wolff, 1993).
Extraction [masse de matière
déshuilée (g)]
P
(Bar)
T
(°C)
% massique isopropanol dans le flux d’extraction
Débit de
CO2
(g/min)
Débit d’isopropanol moyen (g/min)
Volume total d’isopropanol
utilisé (ml)
pls41
[6,68] 250± 5 27 ± 1 50 1,0 0,91 96
Pls42
[6,71] 1 27± 1 100 0 0,98 132
Pls43
[6,55] 250± 5 45 ± 1 50 1,0 0,95 117
Tableau III-19 : Conditions opératoires des essais d’extraction des phospholipides avec un mélange CO2-isopropanol
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 118 -
Figure III-12 : Courbes d’extraction obtenues avec un mélange CO2-isopropanol (P = 250 bar, 50% de co-solvant)
L’allure des courbes est similaire à celles obtenues en utilisant de l’éthanol comme co-
solvant, c'est-à-dire une augmentation rapide de la quantité de matière extraite en début de
cinétique puis un ralentissement de l’extraction pour enfin atteindre un pallier. A 27°C, la
quasi-totalité de la masse extraite est de nature phospholipidique d’où une très forte pureté.
Quelle que soit la température (45 ou 27°C), la quantité de phospholipides extraite est la
même. Par contre, la partie non phospholipidique varie fortement, et croît quand la
température augmente.
Comparons à présent les extractions utilisant de l’éthanol et de l’isopropanol dans les
mêmes conditions de pression, de température et de pourcentage de co-solvant (Figure
III-13).
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60 80 100 120
Ma
sse
to
tale
et
de
PL
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
P = 250 bar T = 27°C %isoP = 50% masse totale (pls41)
P = 250 bar T = 45°C %isoP = 50% masse totale (pls43)
P = 250 bar T = 27°C %isoP = 50% masse PL (pls41)
P = 250 bar T = 45°C %isoP = 50% masse PL (pls43)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 119 -
Figure III-13 : Comparaison des résultats obtenus avec de l'éthanol ou de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 20 40 60 80 100 120
Ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)P = 1 bar T = 27°C 100% isopropanol (pls42)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60Ma
sse
PL
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
P = 1 bar T = 27°C 100% éthanol (pls39)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120
ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
/ g
de
ma
tiè
re
(mg
)
Temps (min)
P = 250 bar T = 45°C % co-solvant = 50% co-solvant: isopropanol (pls43)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 20 40 60
ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
/ g
de
ma
tiè
re
(mg
)
Temps (min)
P = 250 bar T = 45°C % co-solvant = 50% co-solvant: éthanol (pls32)
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100
ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
/ g
de
ma
tiè
re (
mg
)
Temps (min)
P = 250 bar T = 27°C % co-solvant = 50% co-solvant: isopropanol (pls41)
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60 80ma
sse
PL
ex
tra
ite
/ g
de
ma
tiè
re
(mg
)
Temps (min)
P = 250 bar T = 27°C % co-solvant = 50% co-solvant: éthanol (pls34)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 120 -
D’une manière générale, que ce soit pour la masse totale extraite ou pour la quantité de
phospholipides, les quantités extraites sont plus importantes avec l’utilisation de l’éthanol
comme co-solvant. L’isopropanol a donc un pouvoir solvant vis-à-vis des phospholipides plus
faible que celui de l’éthanol.
Les histogrammes de la Figure III-14 présentent la proortion de phospholipides dans
chaque fraction.
Figure III-14:Comparaison de la répartition des masses extraites (PL et autres (non lipidiques et lipides non phosphorés) obtenues avec de l'éthanol et de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température
0
10
20
30
40
50
60
10
0%
Iso
pro
pan
ol
10
0%
éth
ano
l
25
0b
ar 4
5°C
50
%
iso
pro
pan
ol
25
0b
ar 4
5°C
50
%
éth
ano
l
25
0b
ar 2
7°C
50
%
iso
pro
pan
ol
25
0b
ar 2
7°C
50
%
éth
ano
l
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Fraction 1 (0 à 25 min)
0
5
10
15
20
25
30
35
10
0%
Iso
pro
pan
ol
10
0%
éth
ano
l
25
0b
ar 4
5°C
50
%
iso
pro
pan
ol
25
0b
ar 4
5°C
50
%
éth
ano
l
25
0b
ar 2
7°C
50
%
iso
pro
pan
ol
25
0b
ar 2
7°C
50
%
éth
ano
lMa
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Fraction 2 (25 à 50 min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
100% Isopropanol
100% éthanol
250bar 45°C 50%
isopropanol
250bar 45°C 50% éthanol
250bar 27°C 50%
isopropanol
250bar 27°C 50% éthanol
ma
sse
(m
g)
Masse totale extraite (mg)
autres PL
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 121 -
Il apparaît clairement que la pureté de l’extrait est bien meilleure avec l’isopropanol
qu’avec l’éthanol. Néanmoins, le prix de cette haute pureté est un moins bon rendement en
quantité extraite puisqu’il est d’environ 40% avec le traitement au CO2-isopropanol contre 90-
100% avec le mélange CO2-éthanol (les essais ayant tous été réalisé sur le lot 2). Ainsi, le
mélange CO2-isopropanol n’épuise pas totalement la matrice.
III.2.3 Conclusion
Cette étude nous permet à présent d’affirmer que :
� Il est possible d’extraire les phospholipides à partir de sous-produits de la
coquille Saint Jacques
� Le traitement en CO2 pur permet de concentrer les PL dans la matière
déshuilée et donc d’améliorer la pureté en PL des extraits lorsqu’on passe sur
des mélanges CO2-co-solvants
� Les conditions opératoires influent sur le rendement et sur la sélectivité de
l’extraction
� Il est possible d’utiliser en tant que co-solvant l’éthanol et ou l’isopropanol
� D’après les analyses RMN 31P, la PC représente la majorité des lipides extraits
Les conditions opératoires retenues pour le passage sur de plus grands volumes de
matière à extraire sont :
� 250 bar 30% d’éthanol et 27°C (température basse et rendement d’extraction
de 100%)
� 250 bar 15% d’éthanol et 45°C (pureté en PL de 50%)
� 250 bar 30% d’éthanol et 45°C (rendement d’extraction 100% et meilleur
rapport RPL/lip)
� 250 bar 50% d’isopropanol et 27°C (température basse et pureté en PL de
90%)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 122 -
III.3 Transposition de l’extraction des phospholipides sur de plus grands volumes
Le jeu d’expériences précédemment réalisés sur des lots de 6 g a permis de cerner les
conditions opératoires donnant un bon compromis entre quantité extraite et pureté en
phospholipides. L’objectif ici est de transposer les résultats sur de plus grands volumes
(quantité traité d’environ 30 g) pour les raisons suivantes :
� Réduire l’impact de la variabilité des lots sur les résultats
� Valider, dans un objectif de valorisation industrielle, le traitement de charge
plus importante
� Améliorer l’efficacité de l’extraction en se rapprochant de la saturation du
fluide extractant, et ce en utilisant un réacteur agité isolé
� Produire un flux plus riche en phospholipides dans l’optique de la mise en
forme continue de phospholipides en liposomes qui suppose l’addition d’eau.
III.3.1 Utilisation d’un réacteur tubulaire de 500 mL
La première transposition est réalisée avec le même type de réacteur qu’utilisé
précédemment à savoir de type piston (tubulaire). La différence se situe donc sur les
dimensions (diamètre et longueur) de la colonne qui sont donc plus grandes. Le protocole
opératoire utilisé est le même, à savoir une première pressurisation au CO2 puis un flux de
CO2-co-solvant traverse le lit pendant toute la durée de l’extraction.
Nous avons décidé de limiter notre nombre d’essais par rapport au plan d’expériences
déjà réalisé avec la petite colonne. Nous avons donc testé la reproductibilité, étudié
l’influence de la masse initiale introduite dans le réacteur pour les conditions opératoires
sélectionnées qui correspondaient à des sélectivités et des rendements en phospholipides
importants. Comme précédemment, nous allons représenter l’évolution des masses extraites
(totale, lipidique et phospholipidique) normalisées par la masse de matière traitée en fonction
de la masse de solvant (elle aussi normalisée) de façon à s’affranchir aux différences de débit
ou de masse initialement introduite.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 123 -
III.3.1.1 Etude de la reproductibilité de l’extraction
La reproductibilité de l’extraction est évaluée sur trois essais à P = 250 bar, T = 45°C
et 30% d’éthanol sur des lots de 30 g. La Figure III-15 présente l’évolution des différentes
masses extraites en fonction du temps pour les trois essais. Il apparaît que les essais sont
reproductibles quelle que soit la famille considérée (totale, lipidique ou phospholipidique).
Figure III-15 : Reproductibilité du réacteur tubulaire de grand volume (à P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol et une masse traitée de 30 g) (n = 3)
De ces résultats, nous avons calculé un pourcentage d’erreur relatif moyen pour
chaque type d’extrait :
� Erreur relative moyenne sur la masse totale extraite : 1,5 % ± 0,5 (n = 24)
� Erreur relative moyenne sur la masse de lipides totaux : 0,6 % ± 0,4 (n = 24)
� Erreur relative moyenne sur la masse de PL : 3,0 % ± 0,3 (n = 24)
Ce pourcentage a été appliqué sur les autres résultats.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 50 100 150 200
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
Temps (min)
PL
Masse totale
Lipides totaux
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 124 -
Les erreurs relatives obtenues avec 30 g sont inférieures à celles obtenues pour les
extractions sur 6 g de matière déshuilée. On peut attribuer cet écart au lot plus important
traité, il y a moins d’hétérogénéité dans l’échantillon. De plus, les masses pesées sont plus
importantes.
III.3.1.2 Influence de la masse introduite
Dans l’étude à petit volume, la colonne est complètement remplie par les 6 g. Avec
cette quantité, les extraits nous permettent tout juste de réaliser les caractérisations. Le
changement de réacteur (500 mL) nous permet de faire varier ce paramètre, entre 15 et 60 g.
Le volume non occupé est comblé par des billes de verre (d = 2 mm). Les débits, le temps de
fractionnement, la durée de l’extraction et les conditions d’extraction (P = 250 bar, T = 45°C
et 30% d’éthanol) restent les mêmes. Les courbes d’extraction des masses extraites non
normalisées et normalisées par la masse de matière déshuilée initiale en fonction du temps
sont présentées Figure III-16.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 125 -
Figure III-16 : Influence de la masse introduite sur l’extraction avec le réacteur piston de
« grand volume » (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit de CO2 = 7 g/min, débit total = 10 g/min)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 50 100 150
Ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
(m
g)
Temps (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200
Ma
sse
to
tale
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
15g
30g
60g
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 50 100 150
Ma
sse
lip
ide
s to
tau
x e
xtr
ait
e (
mg
)
Temps (min)
0
5
10
15
20
25
0 50 100 150
Ma
sse
lip
ide
s to
tau
x e
xtr
ait
e (
mg
)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
15g
30g
60g
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 50 100 150
Ma
sse
PL
ex
tra
ite
(m
g)
Temps (min)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 50 100 150Ma
sse
PL
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
15 g
30g
60 g
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 126 -
D’après la représentation en masse non normalisée, plus la masse initiale introduite est
importante, plus les quantités extraites sont grandes quelle que soit la famille considérée
(masse totale extraite, lipides non phosphorés et PL). De plus, le rapport de proportionnalité
entre les masses initiales introduites dans le réacteur et les différentes masses récupérées est
conservé. Avec cette représentation, il semble avantageux d’augmenter la charge initiale dans
la mesure où, pour un temps donné, la quantité de PL en sortie est plus grande.
Si l’on observe les courbes d’extraction représentées avec les masses extraites
normalisées, concernant la masse totale extraites et de lipides totaux, les quantités de matière
obtenues sont d’autant plus importantes que la masse traitée (initiale) est faible. Par rapport
aux PL extraits, la courbe d’extraction avec 60 g de matière traitée est toujours inférieure aux
deux autres. Cette représentation met en évidence un impact de la masse initiale sur le
transfert de matière. Il semblerait qu’avec 60 g, bien que les quantités de soluté disponible
soient plus importantes, on en extrait moins. La résistance aux transferts serait donc plus
grande. La densité de lit (notion de remplissage de la colonne) mesurée pour 15, 30 et 60 g est
respectivement de 0,24 g/ml, 0,27 g/ml et 0,38 g/ml. Plus la quantité introduite est grande,
moins il y a de « vide » dans le lit. Par conséquent le transfert de matière devrait être le plus
favorable pour 60 g de matière traitée, contrairement à ce qui est obtenu expérimentalement.
A l’heure actuelle, nous n’avons pas d’explication pour ces résultats.
III.3.1.3 Comparaison des résultats obtenus selon les réacteurs 10 ml et 500 ml
Dans cette partie, nous comparons des essais réalisés sur 6 g avec le réacteur de 10 ml
avec ceux obtenus sur 15 à 60 g avec le réacteur de 500 ml pour plusieurs conditions
d’extraction (Tableau III-20).
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 127 -
Extraction T
(°C)
% massique de co-solvant dans le flux d’extraction
Débit CO2
(g/min)
Débit de co-solvant
moyen (g/min)
Masse initiale
(g) Co-solvant
Réacteur 500 ml lipoplsI 45 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol lipoplsJ 45 ± 1 30 7 2,9 15 éthanol lipoplsK 45 ± 1 30 7 3,0 60 éthanol lipoplsL 27 ± 1 30 7 3,1 30 éthanol lipoplsM 45 ± 1 15 7 3,0 30 éthanol lipoplsN 27 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol lipoplsP 45 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol lipoplsQ 27 ± 1 50 7 2,9 30 isopropanol lipoplsS 45 ± 1 30 7 3,1 30 éthanol lipoplsT 45 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol
Réacteur 10 ml Pls36 45 ± 1 30 1 0,5 6,38 éthanol Pls34 27 ± 1 30 1 0,5 6,46 éthanol Pls35 45 ± 1 15 1 0,15 6,55 éthanol Pls41 27 ± 1 50 1 1,0 6,68 isopropanol
Tableau III-20 : Conditions opératoires testées avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar)
La Figure III-17 présente un exemple d’extraits obtenus. La coloration de l’extrait
diminue au cours de l’extraction, les premières fractions sont de couleur marron foncée et les
dernières sont jaune/vert clair.
Figure III-17 : Photographie d’extraits obtenus avec un mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, T= 45°C, 15% d’éthanol, réacteur tubulaire de 500 ml)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 128 -
A titre d’exemple, la Figure III-18 présente les résultats d’extraction obtenus à 6 et 30
g (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol). Nous avons normalisé les données (masse
extraite et de solvant) en ramenant les données à 1 g de matière déshuilée. On s’affranchit
ainsi des différences de débit mais également de masse initiale introduite. Les courbes
obtenues pour les autres conditions sont présentées en annexe.
Figure III-18 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol)
Quelle que soit la masse considérée, l’extraction est plus efficace avec la colonne de
petit volume. Cela ne correspond pas à ce qui est attendu dans la mesure où la vitesse de
passage du solvant est inférieure avec la colonne de 500 ml (30 g) par rapport à celle utilisée
avec le réacteur de 10 ml (6 g) (limitation due aux pompes du montage « grand volume »).
Quand on effectue une montée en échelle, les paramètres importants à prendre en
considération sont la vitesse du solvant mais également la densité du lit (masse introduite /
volume occupé). Pour le réacteur de 10 ml, il est égal à environ 0,6 g/ml et avec le réacteur de
500 ml, il est de l’ordre de 0,27 g/ml (pour une masse de 30 g). Expérimentalement, le tassage
est beaucoup plus difficile avec la grande colonne. On a donc moins de « vide » pour le
premier cas ce qui favorise l’extraction (Pronyk et Mazza, 2009).
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
g de solvant (CO2 éthanol) / g de matière
30 g (masse totale)
30 g (lipides totaux)
30 g (PL)
6 g (masse totaux)
6 g (lipides totaux)
6 g (PL)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 129 -
De plus, le ratio longueur de lit par rapport au diamètre de colonne est de 10 avec la
colonne de 10 ml et de 1,6 celle de 500 ml. Les effets de bords (des parois de la colonne) ne
sont pas les mêmes, ce qui entraine des modifications des profils de vitesse du flux de solvant
différents selon le réacteur utilisé. Ce ratio est important pour les opérations de montée en
échelle (Pronyk et Mazza, 2009).
Ensuite, le flux de solvant pour la colonne de 500 ml se fait de haut en bas et
inversement pour la colonne de 10 ml. Le sens de passage du solvant peut influer sur
l’extraction (Rodriguez et al., 2008). La direction du flux a notamment un impact sur le
compactage du lit et donc la mise en contact du solvant et de la matière première.
Le Tableau III-21 présente la comparaison des résultats d’extraction obtenus pour
chaque condition opératoire testée.
T (°C)
Co-solvant
% massique de co-solvant
dans le flux d’extraction
mg de PL extrait / g de matière
déshuilée
mg de lipides totaux extrait / g de
matière déshuilée
mg extrait total / g de matière déshuilée
10 ml 500 ml 10 ml 500 ml 10 ml 500 ml
27 ± 1 éthanol 30 18,86 12,7 24,0 20,55 54,57 60,68 45 ± 1 éthanol 15 11,87 6,93 14,9 10,79 20,59 19,01 45 ± 1 éthanol 30 19,56 13,94 22,4 20,85 57,95 51,39 27 ± 1 isopropanol 50 8,08 4,79 8,08 4,71 8,88 8,84
Tableau III-21: Comparaison des résultats obtenus avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar)
A 250 bar, 45°C, on extrait deux fois plus de matière (PL et lipides totaux) à 30 %
d’éthanol qu’à 15 %, quel que soit le volume de réacteur utilisé. On retrouve avec le réacteur
de 500 ml, le fait que l’isopropanol est moins efficace pour extraire les lipides.
De manière générale, pour ce qui est de la partie lipidique, les quantités de PL
extraites sont significativement inférieures avec le réacteur de 500 ml quelles que soient les
conditions opératoires. Par contre, les masses totales extraites sont assez proches. D’un point
de vue rendement, il semblerait que les conséquences d’une augmentation d’échelle
interviennent principalement sur la partie lipidique de l’extrait. Ceci suggère que la partie non
lipidique serait plus facilement extractible. Il en résulte que la « qualité » des extraits (la
pureté) est impactée et qu’elle est moins bonne avec le réacteur de 500 ml.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 130 -
III.3.2 Utilisation d’un réacteur agité de 250 ml
La seconde transposition est réalisée en modifiant le type de réacteur. En effet, dans
cette partie, en plus d’augmenter la charge de 6 g à 15 g (ou 30 g), un réacteur agité est utilisé
pour l’extraction. Contrairement aux dispositifs expérimentaux précédemment utilisés qui
possèdent tous un fonctionnement relativement simple, les réacteurs agités ont un
comportement hydrodynamique qui peut varier en fonction des conditions opératoires et de
d’agitation. Par conséquent, avant la présentation des résultats d’extraction, cette partie débute
par une étude succincte de la caractérisation du réacteur utilisé. Les détails sont présentés en
annexe.
III.3.2.1 Caractérisation du réacteur agité : étude hydrodynamique (DTS)
L’approche théorique de la caractérisation des réacteurs utilise le concept de réacteur
idéal faisant appel à deux types d’écoulement simples (en régime permanent) :
� l’écoulement piston caractérisé par un temps de séjour unique pour toutes les
molécules ;
� l’écoulement en mélange parfait où les temps de séjour sont a priori très
différents d’une molécule à l’autre et où l’on suppose la composition uniforme
en tout point.
Les molécules séjournent en réalité dans le volume réactionnel pendant des temps
variés qui dépendent notamment du profil hydrodynamique et de la géométrie du réacteur. Il
existe donc une DTS E(t) correspondant à la répartition des différents temps passés dans le
réacteur de toutes les molécules. En particulier nous avons, E(t) x dt la fraction du débit de
sortie contenant des molécules ayant séjourné un temps t dans le réacteur. Pour déterminer
une DTS, on introduit dans le système un traceur (qui ne modifie pas l’hydrodynamique du
milieu) selon une fonction de type « échelon » ou « impulsion » et l’on suit en sortie les
modifications de la fonction.
Le principe pour l'établissement d'une fonction de DTS est le suivi au cours du temps
de la concentration en sortie de l'installation que l’on normalise en divisant par la
concentration totale. Mathématiquement cela correspond à :
s(F) = �(F)t �(F)DF∞
/
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 131 -
Etudier la DTS correspond donc à une caractérisation de l’écoulement au sein d’un
milieu par une étude statistique des temps passés par chaque molécule.
On mesure le temps passé pour un élément du fluide entre l’entrée et la sortie du
réacteur. Par intégration de l’ensemble des différents éléments, on obtient la DTS. Certaines
hypothèses sont faites :
� Le système est en état stationnaire
� Le fluide considéré est incompressible
Il existe deux cas idéaux, le réacteur tubulaire (ou piston) et le parfaitement agité
(RAC). Le premier n’a qu’une fonction retardatrice (tout ce qui est injecté à l’entrée se
retrouve à la sortie après un certain temps). Toutes les molécules ont le même temps de séjour
qui correspond au temps de séjour moyen (τ) donné par le rapport entre le volume réactionnel
Vr sur le débit volumique d’entrée Q.
u = %=v
Pour un réacteur parfaitement agité continu, lors de l’introduction au temps t= 0 d’un
échantillon nb0 moles de traceur dans le réacteur nous avons :
�(F = 0) = 7S/%@
Avec C concentration du traceur et Vr Volume du réacteur.
Le milieu étant parfaitement agité, la composition est identique en tout point du
réacteur en particulier en sortie. L’équation bilan en traceur conduit à la relation suivante :
%= × D�(F)DF = −v × �(F)
Ce qui donne, par résolution de cette équation différentiel :
�(F) = �(F = 0) × E'JZUx
Puis s(F) = yx × �(F)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 132 -
La Figure III-19 représente la DTS pour trois cas (I= RAC, II = Piston et III= Réacteur
réel).
Figure III-19 : DTS d’un réacteur piston, agité et réel
D’après la Figure III-19, on peut voir que la distribution des temps de séjour du
réacteur parfaitement agité est de type exponentiel décroissante. Nous avons donc, dans ce
cas, « instantanément » en sortie des molécules. Pour un réacteur piston, on obtient le même
échantillon introduit initialement mais « décalé », « retardé » d’un temps τ. Le comportement
d’un réacteur réel est intermédiaire entre ces deux cas. Connaître la DTS d’un réacteur est un
élément nous permettant d’optimiser son utilisation.
Dans le cas du réacteur agité utilisé dans cette étude, les trois paramètres qui
influencent de manière importante les DTS sont le débit d’entrée, le panier et la vitesse
d’agitation:
Le débit d’entrée : C’est celui qui a la plus grande influence. Il a été étudié à [5, 10, 15
et 25 ml/min]
Le panier : Deux paniers de dimension identique mais ayant des porosités différentes
(1mm et 200 µm) ont été testés. Ils seront désignés dans le tableau par [petite et grosse
maille]
La vitesse du mobile d’agitation : Elle peut varier de 0 à 1500 tr/min, l’agitateur
homogénéise le milieu et modifie le régime [100, 200 et 500 tr/min]. On se restreint à ces
valeurs pour des raisons techniques.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 133 -
La Figure III-20 présente les DTS d’un réacteur agité (I), piston (II), réel (III)
(Villermaux, 1994) et celles obtenues avec deux paniers différents. Ils diffèrent par la taille de
leurs mailles qui est soit « petite » (taille caractéristique : 200 µm) soit « grande » (taille
caractéristique : 1 mm).
Figure III-20 : Courbes de DTS d’un réacteur parfaitement agité (I), piston (II) et réel (III) (VILLERMAUX, 1994) et comparaison de l’influence du panier sur la DTS du réacteur agité
Les résultats expérimentaux sont détaillés en annexe. Pour avoir un comportement qui
se rapproche de l’idéalité, nous avons donc choisi de travailler avec le panier « grosse
maille ». Les notions théoriques et les détails de ce travail sont présentés en annexe 4. A
présent, le réacteur peut être considéré comme parfaitement agité.
III.3.2.2 Modes opératoires proposés
Nous avons envisagé trois protocoles opératoires (Mode) qui pourraient avoir des
effets favorables pour l’extraction. Nous rechercherons le mode d’extraction qui présente le
meilleur compromis entre performance (le plus de phospholipides) et pureté (moins de lipides
non phospholipidiques dans l’extrait).
Pour l’ensemble de ces essais, nous avons procédé à 8 récupérations d’extrait à
intervalle de temps réguliers (20 min) en prenant pour temps initial le début de sortie
d’éthanol. Nous avons choisi arbitrairement les conditions indiquées dans le Tableau III-22
(correspondant à Pls36), les débits de CO2 et d’éthanol étant choisis en fonction de
caractéristiques des pompes du montage.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 134 -
P (bar) T (°C) Débit CO2
(g/min)
Débit éthanol (g/min)
% massique d’éthanol
dans le flux d’extraction
Masse de matière
déshuilée introduite (g)
250 45 7 3 30 15
Tableau III-22: Conditions opératoires des essais de transpositions au réacteur agité
Comme il a été décrit II.3.3.3, le réacteur possède un panier poreux de 125 ml (taille
de maille : 1 mm) qui accueille la matière première, c’est donc lui qui détermine la charge. De
plus, il faut tenir compte du volume occupé par la pale d’agitation. Une charge de 15 g est
choisie car elle permet de ne pas remplir complètement le panier et d’assurer une bonne
agitation. Le schéma du montage expérimental est rappelé Figure III-21.
Figure III-21 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g)
Mode A : Pressurisation avec du CO2-éthanol et phase d’isolement de 20 min
A l’état initial, le réacteur est à pression atmosphérique et 45°C correspondant à la
température d’extraction. Les deux pompes CO2 et éthanol sont activées simultanément
jusqu’à atteindre 250 bar dans le réacteur. A pression atmosphérique, le mélange arrive dans
Co-solvant
Bouteille de CO2
[A]
[C]
[B] [D]
[E]
Extrait alcooliquecontenant l’extrait
Tcirc
Réacteur
purge
Psort
Préac
Tréac
Tsort
Co-solvantcontenant l’extrait
Panierporeux
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 135 -
le réacteur sous forme biphasique, avec une phase liquide riche en éthanol et une phase gaz
principalement constituée de CO2. Au fur et à mesure que la pression augmente, le mélange
devient monophasique. Etant donné que l’introduction du mélange CO2-éthanol est faite par la
pale d’agitation, la phase liquide rentre en contact direct avec la matière première. On peut
supposer qu’il y a alors l’équivalent d’une macération à l’éthanol de la charge, le temps
d’atteindre une pression à laquelle les deux solvants sont miscibles. Dans la littérature, il a été
montré qu’un prétraitement de trempage de la charge en éthanol à pression atmosphérique
était favorable à l’extraction des phospholipides (Dunford et Temelli, 1995).
Une fois la pression de 250 bar atteinte, le réacteur est isolé pendant 20 min afin de
permettre la diffusion des espèces dans le milieu extractant.
Mode B : Pressurisation au CO2 pur et pas de phase d’isolement
Le réacteur est pressurisé à 250 bar en utilisant du CO2 seul, puis les deux pompes
sont activées et les vannes de sortie sont ouvertes. Il n’y a pas de période statique. Etant donné
que nous avons un réacteur de type agité, le pourcentage d’éthanol va évoluer au sein du
réacteur. En effet, durant les premiers instants, nous avons en sortie un flux avec un faible
essentiellement composé de CO2 pur puisque les premiers volumes de co-solvant introduits
sont immédiatement répartis dans le réacteur. Par ailleurs, le temps pour atteindre la
composition d’éthanol fixée est de l’ordre de 3 temps de séjour moyen puisque l’étude de la
DTS a montré qu’il s’agit d’un réacteur de type « parfaitement agité » ; et tant que t < 3 τ,
nous sommes en régime transitoire et l’extraction aura lieu avec une composition en éthanol
inférieure à celle visée. Au delà, le régime permanent devrait s’établir à la composition égale
à celle du binaire CO2 + éthanol imposé par les pompes. Dans les conditions étudiées (P = 250
bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit massique totale de 10 g/min), 3 τ moyen correspondent à
environ 75 minutes.
Mode C : Montée en pression du réacteur en CO2 pur, pied du réacteur contenant de l’éthanol
On introduit initialement une quantité de 55 ml d’éthanol dans le fond du réacteur.
Cela correspond à une hauteur d’environ 2 cm, on n’a pas de contact entre le co-solvant et la
matière première. Ce volume d’éthanol est calculé pour correspondre à une composition finale
massique à 250 bar de 30%-70% éthanol - CO2, en supposant que la totalité du volume du
réacteur (250 ml) est occupé par le fluide et que la masse volumique du mélange finale est de
930 kg.m-3 (calculée par ProPhys). On obtient une masse de solvant totale de 232 g et une
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 136 -
quantité d’éthanol de 69g.
Du CO2 pur est ensuite ajouté jusqu’à obtenir une pression de 250 bar puis le réacteur
est isolé 20 min, ensuite un flux de CO2 et d’éthanol est réalisé pour permettre la récupération
de l’extrait. Comme dans le premier protocole, pendant la phase de pressurisation, au fur et à
mesure de l’ajout du CO2, le CO2 se répartit entre une phase gaz et une phase liquide,
initialement de 100% éthanol, qui voit sa composition s’enrichir en CO2 (Figure I-13). La
phase liquide subit alors une augmentation de volume, à un moment donné, la phase
inférieure liquide contenant du CO2 et de l’éthanol entre en contact avec la matière première.
III.3.2.2.1 Résultats
Les résultats sont présentés sous deux formes : des courbes représentant les masses
cumulées en distinguant toujours les familles : masse totale extraite, lipides totaux et
phospholipides, des histogrammes expriment le contenu de chaque fraction.
Quel que soit le mode appliqué, chaque fraction correspond à des temps identiques
(F1 : 0 à 20 min, F2 : 20 à 40 min…), le temps initial correspond à l’apparition d’éthanol en
sortie. Pour chaque mode, les essais ne sont réalisés qu’une seule fois, hormis pour celui du
protocole A où ils sont répétés 3 fois.
Mode A : Pressurisation avec du CO2-éthanol et phase d’isolement de 20 min
La Figure III-22 présente les résultats obtenus avec le mode A.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 137 -
Figure III-22 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode A, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar,
T = 45°C et 30% d’éthanol)
� Evolution par fraction
La masse totale extraite diminue avec le temps de façon exponentielle, ce qui est
conforme aux résultats obtenus lors de l’étude de la DTS et au fait que le réacteur fonctionne
de manière parfaitement agité. Cependant, selon la nature de l’extrait (non lipidique, lipides
non phosphorés et PL), l’évolution temporelle est plus complexe. La masse de phospholipides
extraite diminue avec le temps de manière qui semble exponentielle. La variation de la part
des lipides non phosphorés est différente : elle diminue jusqu’à la quatrième fraction puis
augmente fortement pour diminuer à nouveau. Par conséquent, on est amené à supposer qu’il
y a une reprise de l’extraction entre les fractions 4 et 5. De plus, ce comportement nous
informe que l’extraction des lipides neutres n’est pas totalement réalisée pendant la phase
statique, contrairement à celle des phospholipides.
A part pour les fractions inférieures à 4, la quasi totalité de l’extrait est de nature
lipidique. La partie non lipidique est extraite principalement de F1 à F4, c'est-à-dire pendant
les 80 premières minutes. Cela pourrait s’expliquer par l’effet de la macération en éthanol qui
permettrait de solubiliser une matière non lipidique (polaire), ce qui entraine une extraction
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lipides non phosphorés
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masse de lipides totaux cumulée
masse totale cumulée
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 138 -
100 % lipidique au-delà 80 minutes.
� Evolution cumulée
Les masses cumulées sont croissantes au cours du temps, il n’y a pas de plateau
atteint. A l’issue de l’extraction, on obtient majoritairement des lipides : on a, avec ce mode
de fonctionnement, un faible pourcentage de matière non lipidique (de l’ordre de 20 – 25%).
Mode B : Pressurisation au CO2 pur et pas de phase d’isolement
La Figure III-23 présente les résultats obtenus avec le mode B.
Figure III-23 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode B, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar,
T = 45°C et 30% d’éthanol)
� Evolution par fraction
Dans ce mode de fonctionnement, on constate que l’évolution des masses extraites
n’est pas aussi simple que dans le mode A. On note notamment la présence d’un « pic » de
matière non lipidique notamment dans les fractions 4 et 6. Par contre, les premières fractions
n’ont pas d’espèces non lipidiques. Ceci est la conséquence d’une augmentation croissante de
la proportion d’éthanol dans le réacteur. Etant donné qu’elle commence par être faible au
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lipides non phosphorés
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masse de lipides totaux cumulée
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Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 139 -
début, on extrait préférentiellement des lipides avec un mélange CO2-éthanol (à faible
proportion). Ensuite, la proportion d’éthanol est suffisamment importante pour permettre
l’extraction de la partie non lipidique, qui est majoritairement présente dans la fraction 4, qui
devrait correspondre au moment où le pourcentage d’éthanol doit commencer à être constant.
On a une extraction importante de matière non lipidique à partir de ces fractions probablement
car c’est la matière la plus facilement disponible.
� Evolution cumulée
On observe une augmentation de la masse totale extraite, qui est plus rapide après la
contribution de F4. L’avantage de ce protocole est la faible proportion de fractions non
lipidiques au début de l’extraction. Dans ce cas ci, on obtient un extrait qui contient
majoritairement des espèces non lipidiques.
Mode C : Montée en pression du réacteur en CO2 pur, pied du réacteur
contenant de l’éthanol
La Figure III-24 présente les résultats obtenus avec le mode C.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 140 -
Figure III-24 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode C, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar,
T = 45°C et 30% d’éthanol)
� Evolution par fraction
Ce comportement d’extraction se rapproche de celui du mode A, cohérent avec un
mode de pressurisation impliquant un système biphasique, avec une phase liquide qui imbibe
en partie la matière première. La différence dans les résultats réside dans le fait qu’une
matière non lipidique est extraite tout au long de l’extraction alors que dans les précédents
modes, les fractions 1 et 2 en contenaient peu (correspondant à 40 minutes d’extraction).
� Evolution cumulée
Dans ce cas de figure, on a un comportement encore différent par rapport uax deux
autres modes. La masse et la proportion de phospholipides diminuent avec le temps. On
remarque que dans la première fraction, il n’y a pas de lipides non phosphorés.
III.3.2.2.2 Comparaison des trois modes
Quand on compare les trois modes, ce qui est remarquable c’est la cinétique
d’extraction des phospholipides qui est assez peu sensible au protocole contrairement à ce qui
est observé pour les autres lipides et pour les composés non lipidiques.
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autres (non lipidiques)
lipides non phosphorés
PL
masse de PL cumulée
masse de lipides totaux cumulée
masse totale cumulée
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 141 -
Le Tableau III-23 présente les quantités de matière totale, de lipides et de
phospholipides extraites par gramme de matière première et les rapports masses de
phospholipides divisée par la masse totale extraite ou par la masse de lipides totaux.
Mode
mg de masse totale extraite / g de matière
déshuilée
mg de lipides totaux extraite / g de matière
déshuilée
mg de PL extraite / g de
matière déshuilée
RPL/ext RPL/lip
A (pressurisation
au CO2+éthanol)
45,94 35,73 12,08 0,26 0,34
B (CO2 pur puis CO2 éthanol)
46,81 22,18 6,82 0,15 0,31
C (éthanol au
pied du réacteur)
47,48 26,84 10,12 0,21 0,38
Tableau III-23 : Quantités totales extraites avec les trois modes sur l’ensemble des 8 fractions
Les quantités totales extraites sont similaires quel que soit le mode d’extraction
envisagé. Dans le mesure où nous cherchons le mode d’extraction qui conduit au meilleur
compromis entre performance (le plus de phospholipides) et qualité (moins de lipides non
phospholipidiques dans l’extrait), le mode B peut d’ores et déjà être écarté dans la mesure où
nous avons une quantité de PL extraite faible : 6,8 mg de PL par g de matière première. Par
ailleurs, sa pureté est médiocre : 15% de PL, 32% de lipides non phosphorés et 53% d’espèces
non lipides (Figure III-23).
Les modes A et C se différencient peu lorsqu’on considère le processus global
d’extraction. Néanmoins, si on analyse plus finement ce qui se passe aux niveau des fractions,
on note qu’on obtient, avec le mode A, sur les 5 premières fractions une pureté élevée et une
quantité de PL importante qui ne sont atteintes que sur les 8 premières fractions avec le mode
C (Tableau III-24). Le choix du mode A permet ainsi d’arrêter la collecte des échantillons
après 100 min d’extraction.
Mode RPL/ext RPL/lip A après 5 fractions 0,41 0,62 C après 8 fractions 0,27 0,60
Tableau III-24 : Qualité des extraits des modes A et C, respectivement pour les fractions 1 à 5 et 1 à 8
Le Tableau III-25 compare les rendements des extractions réalisées avec le réacteur
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 142 -
tubulaire de 10 ml et celles réalisés avec le réacteur agité (250 ml) en mode A.
Réacteur
mg de PL extraite / g de
matière déshuilée
mg de lipides totaux
extraite / g de matière
déshuilée
mg de masse totale extraite / g de matière
déshuilée
g de solvant / g de matière
déshuilée
Agité (250 ml) : Mode A
12,08 35,73 45,94 53,1
Tubulaire (10 ml)
19,26 35,50 51,79 30,4
Tableau III-25 : Comparaison des résultats obtenus avec le réacteur agité de 250 ml et le réacteur tubulaire de 10ml
Les quantités de solvant (CO2-éthanol) utilisées pour le réacteur agité sont supérieures
par rapport à celles du réacteur tubulaire. Les quantités extraites sont similaires sauf pour les
phospholipides où le réacteur tubulaire se révèle être plus efficace. Il est possible que les
phospholipides soient moins « accessibles » dans le réacteur agité, ce qui sous entend un
transfert de matière plus lent dans ce réacteur.
III.3.2.2.3 Amélioration du mode A
� Ajout de billes de verre
Sur les trois modes testés, une fois l’extraction réalisée, à l’ouverture du réacteur, nous
constatons que la matière première reste agrégée sur le mobile d’agitation en formant un
« gâteau » (Figure III-25), ce qui peut nuire au transfert de matière. Pour éviter la formation
de ce « gâteau », il est possible de faire un pré-mélange de la matière première avec des billes
de verre.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 143 -
A B
Figure III-25 : Photographie de la matière première après extraction sans bille (A) et avec
ajout de billes de verre (B)
Après ajout de billes, on constate que la poudre est alors plaquée contre les parois du
panier (Figure III-25). Cela devrait améliorer l’extraction dans la mesure où la couche de
matière doit être traversée et que l’introduction du solvant dans le milieu par le mobile sera
facilitée.
� Augmentation de la charge
Cette partie n’est pas une optimisation à proprement parler. En effet, lors de nos
premiers essais, nous avons pu constater que le rendement d’extraction était inférieur à ceux
obtenus avec le réacteur tubulaire de « petit volume ». Nous avons décidé de travailler sur une
masse initiale introduite de 30 g pour augmenter les quantités de PL recueillies en sortie.
� Augmentation de la phase statique
Le protocole que l’on a mis en place prévoit une phase d’isolement du réacteur
pendant laquelle l’extraction peut se produire. Elle était initialement de 20 min, elle a été
multipliée par 3.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 144 -
La Figure III-26 présente les résultats obtenus par fraction et en masses cumulées. La
comparaison avec la fraction 1 en mode A (Figure III-22), il semble que la matière première
ait tendance à absorber l’éthanol dans le mode A « optimisé », ce qui se traduit par un
rendement moindre sur cette fraction.
Figure III-26 : Répartition des masses extraites par fraction pour le mode A « optimisé » en réacteur agité (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol)
En revanche, ce « retard » à l’extraction de modifie pas de manière importante les
proportions des 3 familles extraites : espèces non lipidiques, lipides non phosphorés dans les
premières fractions (Tableau III-26). En revanche, à partir de la fraction 4, les fractions
obtenues par le mode A « optimisé » ou non sont nettement différentes en termes de
composition.
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autres (non lipidiques)
lipides non phosphorés
PL
masse de PL cumulée
masse de lipîdes totaux cumulée
masse totale cumulée
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 145 -
Tableau III-26 : Masse de PL extraite par g de matière déshuilée et répartition des familles (PL, lipides non phosphorés et espèces non lipidiques) de l’extrait pour chaque fraction, Mode A (sans bille, temps d’isolement de 20 min et 15 g de matière déshuilée et Mode A
« optimisé » (ajout de billes en verre, temps d’isolement de 60 min et 30 g de matière déshuilée)
De manière générale, les modifications apportées au mode A ne permettent pas
d’augmenter le rapport PL / matière grasse déshuilée (12,0 mg/g pour le mode A et 6,1 pour
mg/g pour le mode A « optimisé ») comme espéré même si on obtient en fin d’extraction la
même quantité de PL.
Fraction
g extrait / g de matière totale extraite (%)
Mode A Mode A « optimisé »
Espèces non lipidiques 21 20
F1 Lipides non phosphorés 46 53
Phospholipides 33 27
Espèces non lipidiques 12 12
F2 Lipides non phosphorés 59 66
Phospholipides 29 22
Espèces non lipidiques 33 25
F3 Lipides non phosphorés 41 53
Phospholipides 26 22
Espèces non lipidiques 62 14
F4 Lipides non phosphorés 14 65
Phospholipides 24 22
Espèces non lipidiques 0 55
F5 Lipides non phosphorés 73 26
Phospholipides 27 19
Espèces non lipidiques 0 45
F6 Lipides non phosphorés 80 39
Phospholipides 20 16
Espèces non lipidiques 9 87
F7 Lipides non phosphorés 78 0
Phospholipides 13 13
Espèces non lipidiques 31 91
F8 Lipides non phosphorés 56 0 Phospholipides 13 9
mg de PL extrait / g de matière déshuilé
12,0 6,1
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 146 -
III.4 Variantes du procédé d’extraction
L’extraction des phospholipides s’accompagne de la co-extraction d’autres composés
lipidiques et non lipidiques. Par ailleurs, la législation française limite l’utilisation de solvants
dans les procédés traitant des matières destinées à l’alimentation humaine. Ainsi, des
quantités d’éthanol supérieures à 30% ne sont pas autorisées pour une application alimentaire.
Pour élargir les possibilités d’application de cette technique, deux autres essais sont réalisés
avec le montage expérimental comprenant le réacteur tubulaire de 500 ml. Le premier a pour
objectif d’obtenir des extraits plus sélectifs en réalisant une extraction en deux étapes, l’une
avec 15% d’éthanol l’autre avec 30%, et le second doit permettre une application alimentaire
en utilisant un mélange eau-éthanol (70%-30%).
III.4.1 Fractionnement de l’utilisation de l’éthanol
La sélectivité de l’extraction dépend du pourcentage d’éthanol utilisé comme il a été
vu au paragraphe III.2.2.4. A 15% d’éthanol, on extrait une quantité non négligeable
d’espèces non lipidiques avec une perte en PL faible (ce pourcentage correspondant au
rendement d’extraction de la matière totale le plus faible). On propose une extraction en deux
temps : le premier avec un pourcentage d’éthanol de 15% pour la première fraction (20
premières minutes) de manière à éliminer des d’espèces non lipidiques et le second avec 30%
d’éthanol pour le reste des fractions. Le Tableau III-27 donne les conditions opératoires
utilisées.
Phase Réacteur P (bar) T(°C)
Masse initiale de matière
déshuilée (g)
Débit de CO2
(g/min)
Débit éthanol (ml/min)
% massique d’éthanol dans le
mélange
Temps de
collecte (min)
Tubulaire 500 ml
250 ± 5 45 ± 1 30 7
1 1,5 15 0 - 20
2 3,7 30 20 - 160
Tableau III-27 : Conditions opératoires extraction en deux temps avec le réacteur tubulaire 500 ml
La Figure III-27 présente les résultats obtenus (masse cumulée) et rappelle ceux
obtenus pour des extractions réalisés séparément avec 15 et 30 % d’éthanol.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 147 -
Figure III-27 : Courbes d’extraction en mode fractionné (15 puis 30% d’éthanol) et à pourcentage d’éthanol fixe (P = 250 bar, T = 45°C, réacteur tubulaire de 500 ml avec 30 g
de matière déshuilée, débit de CO2 = 7 g/min, débit éthanol = 3 g/min et 1,2 g/min pour respectivement 30 et 15% d’éthanol)
Les courbes d’extraction présentent des profils similaires à savoir une forte
augmentation en début de cinétique puis un ralentissement jusqu’à un plateau. Pour la masse
totale extraite, sur les 50 premières minutes pour l’essai en mode fractionné et celui à 15%,
les courbes sont identiques. Puis la courbe en mode fractionné rejoint celle obtenue à 30%.
Pour les phospholipides, les courbes en mode fractionné et à 15 % sont identiques tandis que
celle à 30% est deux fois plus élevée. L’extraction des lipides totaux en mode fractionné est
intermédiaire entre les extractions à 15 et 30% d’éthanol.
La Figure III-28 suivante présente la répartition de la masse totale extraite pour chaque
fraction.
0
5
10
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0 50 100 150 200
Ma
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to
tale
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
Temps (min)
extraction en mode fractionnée: 15% puis 30% d'éthanol
extraction à 15% d'éthanol
extraction à 30% d'éthanol
0
5
10
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20
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0 50 100 150 200
Ma
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g d
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ère
Temps (min)
0
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6
8
10
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0 50 100 150 200
Ma
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PL
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
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re
Temps (min)
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 148 -
Figure III-28 : Répartition des PL, lipides non phosphorés et matière non lipidique pour les extractions en mode fractionné, et séparément à 15 % et 30 % d’éthanol
En mode fractionné, et pour une fraction collectée donnée, la proportion de
phospholipides est généralement inférieure aux conditions utilisant l’éthanol à 15 ou 30%,
séparément. Contrairement à notre hypothèse de départ, les espèces non lipidiques sont
systématiquement plus présentes dans les fractions obtenues en mode d’extraction fractionné.
Avec cet essai, on s’aperçoit que l’extraction des phospholipides dépend des
paramètres opératoires : l’application de 15% d’éthanol au système induirait des
modifications dans la matrice de sorte que même en repassant à 30% on ne récupère pas tous
les PL escomptés. Les mécanismes de transfert de matière sont surement complexes puisqu’en
revanche, en mode d’extraction fractionné, on récupère une masse extraite du même ordre de
grandeur que celle obtenue à 30%. Cela suggère que de nouvelles espèces non lipidiques sont
extraites.
III.4.2 Utilisation d’un mélange eau-éthanol comme co-solvant
Dans cette partie, une extraction est réalisée en utilisant un mélange eau-éthanol (70%
- 30%, massique) en tant que co-solvant. Le Tableau III-28 fournit les conditions opératoires
utilisées.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
F1 (
frac
tio
nn
é)
F1 (
15
%)
F1 (
30
%)
F2 (
frac
tio
nn
é)
F2 (
15
%)
F2 (
30
%)
F3 (
frac
tio
nn
é)
F3 (
15
%)
F3 (
30
%)
F4 (
frac
tio
nn
é)
F4 (
15
%)
F4 (
30
%)
F5 (
frac
tio
nn
é)
F5 (
15
%)
F5 (
30
%)
F6 (
frac
tio
nn
é)
F6 (
15
%)
F6 (
30
%)
F7 (
frac
tio
nn
é)
F7 (
15
%)
F7 (
30
%)
autres (non lipidiques)
lipides non phosphorés
PL
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 149 -
P (bar)
T (°C)
Masse Initiale
(g) % CO2
% massique
co-solvant dans le
mélange
Débit CO2
(g/min)
Débit co-solvant (eau-éthanol/70%-
30%) (g/min)
Réacteur
250 45 30 70 30 7 3 Tubulaire 500
ml
Tableau III-28 : Conditions opératoires extraction avec un mélange eau-éthanol
La Figure III-29 présente une photographie des extraits obtenus. Par rapport aux
extractions CO2-éthanol, la coloration des extraits est plus foncée pour les 3 premières
fractions mais diminue fortement après pour devenir jaune très clair.
Figure III-29 : Extrais obtenus avec un mélange eau-éthanol (70-30% massique) comme co-solvant (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 7 g/min, débit de co-solvant = 3,7 ml/min)
Le Tableau III-29 présente les masses extraites ainsi que sa répartition
(phospholipides, lipides neutres et non lipides). Il apparait que plus de 98% dans les extraits
sont représentés par des espèces de nature non lipidique, ce qui n’a jamais été atteint dans les
extractions précédentes. Dans les conditions de pression et de température utilisées, le
mélange eau-éthanol est diphasique. L’eau n’extrait pas les lipides hydrophobes.
Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique
- 150 -
Masse (mg) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Lipides non phosphorés
58 25 - - - - - -
Phospholipides 62 14 - - - - - -
Non lipidiques 8487 2347 873 380 194 382 280 124
Tableau III-29 : Répartition de la masse extraite pour l’extraction avec un mélange eau-éthanol comme co-solvant
Ce type d’extraction peut être une solution pour améliorer la pureté des extraits en la
faisant suivre d’une extraction au CO2-éthanol. En effet, elle s’apparente à une étape
d’élimination des éléments indésirables (hydrophiles) en limitant la perte en lipides.
Cependant, après une extraction avec le mélange eau-éthanol, le lit de matière est saturé en
eau et une étape de séchage doit donc être réalisée.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 151 -
IVChapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines
par voie supercritique
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 152 -
Ce chapitre vise à élaborer des liposomes à partir de phospholipides d’origine marine.
La première partie traite de l’aptitude des PL extraits de la coquille Saint-Jacques à
s’agencer en liposomes. En effet, la présence d’espèces non phospholipidiques (hydrophiles
ou hydrophobes) peut nuire à la formation de bicouches malgré une forte proportion de PC
parmi les PL (Annexe), PC connue pour son aptitude à former spontanément des liposomes.
Pour cette approche, nous avons utilisé une technique conventionnelle de formation de
liposomes (hydratation d’un film de lipides et agitation).
Comme présenté dans le chapitre bibliographique (I.1.3), l’assemblage des PL sous
forme de liposomes nécessite la présence d’eau. Dans le cadre de la mise en forme de ces
structures par voie supercritique, cela suppose donc une connaissance du diagramme de
composition du mélange quaternaire CO2-éthanol-eau-PL. L’établissement d’un diagramme
quaternaire est long et complexe, seuls plusieurs types d’information nous intéressent pour la
mise au point du procédé :
• Le diagramme ternaire CO2-éthanol-eau, nécessaire pour connaître la
miscibilité des constituants en fonction des conditions T, P
• Le comportement macroscopique des PL dans le milieu CO2-éthanol-eau : Y a-
t-il précipitation des PL lorsque l’eau est ajoutée à CO2-éthanol-eau ?
La seconde partie vise à répondre à ces questions. Dans la mesure où nous ne
disposons pas de quantités importantes de PL extraits de la coquille Saint-Jacques, ces études
sont réalisées sur une lécithine marine commerciale. Par ailleurs, ces études sont complétées
par une étude dynamique de l’injection d’eau dans un flux CO2-éthanol par microfluidique
(collaboration avec l’Institut de la Chimie et de la Matière Condensée de Bordeaux
Dans une troisième partie, des résultats sur les essais de couplage entre l’extraction de
PL et la mise en forme de liposomes sont présentés.
La dernière partie concerne une étude de modification de taille de liposomes par voie
supercritique.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 153 -
IV.1 Mise en forme des extraits obtenus par voie supercritique
Nous travaillons sur les 3 premières fractions (F1, F2 et F3 correspondant
respectivement à : 0 à 20 min, 20 à 40 min et 40 min à 60 min de l’extraction) obtenues avec
le réacteur de type tubulaire de 500 ml à différentes conditions de pression, débit et de masse
de matière déshuilée initialement introduite. On dispose ainsi de fractions caractérisée par des
proportions variables de PL par rapport à la masse totale de l’extrait et par rapport aux lipides
totaux (Tableau IV-1).
Les « liposomes » (ou tout autre objet) sont préparés par hydratation d’un film de
lipides. Il est important de noter que la concentration en phospholipides est fixée à 5 mg/ml
pour tous les essais. Par conséquent, selon les extraits, la concentration en espèces « autres »
(espèces lipidiques non phosphorées ou espèces polaires) varie.
Pour déterminer s’il y a présence ou non de liposomes des observations au microscope
optique sont réalisées. Nous avons fait le choix de ne pas mesurer de distribution
granulométrique car elle pourrait être faussée par la présence d’autres objets non lipidiques
dans nos dispersions.
D’une manière générale, les échantillons sont turbides après hydratation. Leur
coloration est d’intensité variable (Figure IV-1). Par ailleurs, au cours du temps, on observe
une sédimentation dans tous les échantillons.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 154 -
Figure IV-1 : Echantillons réalisés à partir d’extraits obtenus par voie supercritique
Les observations microscopiques révèlent la présence d’agrégats sur l’ensemble des
dispersions. Nous avons pu créer 3 catégories de conclusion pour les différents clichés
réalisés :
� Les clichés sont vides : soit la taille des objets formés est inférieure à la limite
de résolution du microscope optique (300 nm), soit il n’y a pas d’objet formé.
� Présence de liposomes : Des vésicules lipidiques sont observées. Il s’agit
majoritairement de MLV de formes sphérique et ellipsoïdale. La taille des
objets varie entre quelques µm et 10-15 µm (Figure IV-2)
Sédiments
échantillon après
agitation
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 155 -
Figure IV-2 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls I F2
� Emulsion huile dans eau: On observe de nombreuses et très petites gouttes et
quelques unes plus grosses (Figure IV-3).
Figure IV-3 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls K F1
agrégat
Goutte
d’huile
MLV
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 156 -
Extraction [masse de matière
déshuilée (g)]
Fraction T (°C)
%massique de co-
solvant dans le mélange
Masse de PL (g) /
g de lipides totaux
Masse de PL (g) /
g de masse totale
extraite
R L E
LipoplsI** [30]
F1 45 30 0,75 0,51 � F2 45 30 0,78 0,38 � F3 45 30 0,69 0,17 �
LipoplsJ** [15]
F1 45 30 0,75 0,51 � F2 45 30 0,78 0,38 � F3 45 30 0,69 0,17 �
LipoplsK** [60]
F1 45 30 0,50 0,38 � F2 45 30 1,00 0,51 � F3 45 30 0,66 0,30 �
LipoplsL** [30]
F1 27 30 0,67 0,46 � F2 27 30 0,79 0,29 � F3 27 30 0,64 0,11 �
LipoplsM** [30]
F1 45 15 0,33 0,23 � F2 45 15 0,90 0,41 � F3 45 15 0,75 0,38 �
LipoplsN** [30]
F1 27 30 0,62 0,56 �
F2 27 30 0,88 0,32 � F3 27 30 0,66 0,16 �
LipoplsP** [30]
F1 45 30 0,29 0,22 � F2 45 30 1,00 0,69 � F3 45 30 0,73 0,46 �
LipoplsQ* [30]
F1 27 50 0,79 0,64 � F2 27 50 0,80 0,58 � F3 27 50 0,95 0,46 �
Tableau IV-1 : Structures observées après hydratation des extraits obtenus par voie supercritique (F1, F2 et F3 : 1ère, 2ème et 3ème fractions, P = 250 bar, R : pas d’objets visibles,
L : liposomes, E : émulsion huile dans eau, * co-solvant : isopropanol et ** co-solvant : éthanol)
La majorité des extraits obtenus par voie supercritique permettent la mise en forme de
liposomes. On remarque qu’une proportion importante d’espèces non lipidiques dans l’extrait
ne semble pas rédhibitoire à la formation de liposomes puisqu’il est possible d’en former
même moins de 20% de phospholipides (Lipopls I F3, J F3, L F3). On constate qu’à chaque
fois, il s’agit à des fractions 3, qui sont plus pauvres en PL.
Pour les clichés où aucun objet n’est visible en microscopie optique, le taux élevé de
PL dans les extraits suggère qu’il y aurait une formation de liposomes mais de très petites
tailles. La taille finale des liposomes pourrait être conditionnée par la nature des espèces co-
extraites avec les PL.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 157 -
Les extraits qui conduisent à des émulsions ont une composition en PL faible par
rapport aux lipides totaux (inférieure à 50%). On suppose que les PL présents servent à
stabiliser les structures engendrées par les lipides non phosphorés.
IV.2 Etude du mélange CO 2-éthanol-eau-phospholipides
IV.2.1 Diagramme de phase CO 2-éthanol-eau-lécithine sous pression
Il s’agit d’observer au niveau macroscopique un mélange contenant du CO2, de
l’éthanol, de l’eau et une lécithine marine commerciale, sous pression. L’objectif est de
connaître la ou les proportions pour lesquelles il y a une précipitation ou tout autre
phénomène (agrégation par exemple).
D’après l’étude portant sur l’extraction des phospholipides, les conditions opératoires
envisagées sont P = 250 bar, T = 27°C ou 45°C et 30% éthanol (massique). La cellule
d’observation haute pression utilisée ici a une limitation de 150 bar, c’est donc à cette
pression que l’on travaille. Les deux températures 27°C et 45°C sont testées.
Le Tableau IV-2 présente l’aspect initial des mélanges d'eau, éthanol et lécithine
initiaux introduits dans la cellule de mesure pour les différents % d’éthanol testés avant ajout
du CO2.
Mélange % massique d’éthanol Aspect initial Mél. 5 0,0 Turbide Mél. 4 15,7 Turbide Mél. 3 42,1 Turbide Mél. 2 83,3 Limpide Mél. 1 95,0 Limpide
Tableau IV-2 : Compositions massiques en éthanol et aspect macroscopique des mélanges introduits dans la cellule
Cinq ajouts successifs de CO2 sont réalisés. Les échantillons sont agités pendant 5
minutes après chaque ajout et observés visuellement. Après le dernier ajout de CO2,
l’agitation est maintenue 30 min. La Figure IV-4 présente sur un diagramme ternaire les
compositions du mélange après chaque ajout de CO2, la quantité de lécithine n’étant pas prise
en compte dans le calcul des proportions. Le point de départ des mélanges se situe sur l’axe
éthanol-eau et chaque composition est représentée par un point sur la droite d’évolution des
compositions du mélange. La courbe rouge représente la limite entre le milieu monophasique
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 158 -
(partie supérieure) et diphasique (composée de deux liquides). Elle est calculée grâce au
modèle de thermodynamique MHV 2 (Modified Huvon-Vidal mixing rule). Il n’y a pas de
modification significative du diagramme ternaire pour les 2 températures étudiées (27 ou
45°C).
Figure IV-4 : Evolution des compositions des mélanges après chaque ajout de CO2
Le Tableau IV-3 présente les compositions finales des mélanges juste avant
dépressurisation.
Mélange % de CO2 % d’éthanol % d’eau Mél. 5 58,0 0,0 42,0 Mél. 4 58,0 6,5 35,5 Mél. 3 58,0 17,5 24,5 Mél. 2 58,0 35,0 7,0 Mél. 1 58,0 40,0 2,0
Tableau IV-3 : Compositions finales (après les 5 ajouts de CO2) des mélanges étudiés
MHV2
conodales cal.MHV2
sol.5
sol.4
sol.3
sol.2
sol.1
0.1
0.7
0.6
0.50.40.30.20.1
1.0
0.2
0.3
0.4
0.50.5
0.6
0.6
0.7
0.7
0.8
0.8
0.8
0.9
0.9
0.9
0.1
0.2
0.3
0.4
0.0
0.0
0.01.0
1.0
XCO2
XEau (Massique)
XEt
EAUCO2
Ethanol
15.2MPa27 C
Mél.5
Mél.4
Mél.3
Mél.2
Mél.1
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 159 -
� Mélanges riches en éthanol (% massique initial > 80%)
Les compositions finales des mélanges riches en éthanol sont respectivement de 58%
de CO2, 40% d’éthanol et 2% d’eau et 58% de CO2, 35% d’éthanol et 7% d’eau pour les
mélanges 1 et 2. La lécithine initialement soluble dans les mélanges reste solubilisée en
présence de CO2 : il n’y a pas de changement de phase. Nous n’avons pas observé l’apparition
de mousse pendant la dépressurisation.
� Mélanges pauvres en éthanol (% massique initial < 45%)
Les mélanges (3 à 5) sont turbides avant traitement, deviennent plus clairs lors de
l’introduction du CO2. Lors de la détente, le système redevient turbide et de la mousse
apparait. Une observation microscopique des échantillons avant et après traitement par du
CO2 ne fait pas apparaitre de différences de morphologie des objets. La modification d’aspect
pendant l’ajout de CO2 traduit une réorganisation des espèces au sein du mélange.
L’éthanol qui est miscible à la fois avec le CO2 et l’eau : il va se répartir dans chacune
des phases. Pour ces mélanges, d’après le diagramme ternaire (P = 150 bar et T = 27 ou
45°C), le système est constitué de deux phases : une phase inférieure riche en eau et une
supérieure riche en CO2 (Figure IV-5) avec des proportions finales équivalentes d’eau et de
CO2.
Figure IV-5 : Mélange 5 (58% CO2 - 42% eau, massique) à 150 bar et 45°C
Les systèmes initialement turbides supposent une organisation en bicouches puisqu’ils
contiennent des phospholipides dans un excès d’eau. Au fur et à mesure de l’introduction du
Phase supérieure riche en CO2
Phase inférieure riche en eau
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 160 -
CO2, la turbidité des systèmes disparait. Certaines études (Lesoin et al., 2011 ; Otake et al.,
2001) suggèrent que l’introduction de CO2 sur des bicouches préformées favoriserait la
formation d’une émulsion CO2/eau. La formation de liposomes se ferait au moment de la
dépressurisation. Dans notre cas, la diminution de turbidité pourrait aussi s’apparenter à la
formation de cette émulsion CO2/eau. Les phospholipides étant des espèces amphiphiles, ils
se devraient se placer naturellement à l’interface entre la phase aqueuse-éthanol et la phase
CO2-éthanol. Ainsi, la présence d’éthanol semble ne pas perturber la formation de cette
émulsion. Le phénomène d’apparition de mousse pendant la dépressurisation semble être en
accord avec une déstructuration transitoire des liposomes qui permet à une partie des PL de se
positionner à l’interface eau/air qui se traduit par l’apparition de mousse).
Par rapport à nos objectifs de mise en forme de liposomes en milieu supercritique,
nous avons mis en évidence qu’il n’y a pas de précipitation des lipides dans un mélange CO2-
éthanol-eau. De plus, la présence de PL ne modifie pas significativement les transitions
mono- et di-phasique du ternaire CO2-éthanol-eau.
IV.2.2 Etude cinétique du mélange CO 2-éthanol-eau
Les diagrammes de phases sont des données thermodynamiques donnant la
composition à l’équilibre et le volume des phases éventuellement en présence. Le couplage de
l’extraction et de la mise en forme est de type dynamique puisqu’il s’agit d’un ajout d’eau
sous pression au flux CO2-éthanol contenant l’extrait. Il est donc important de visualiser à
quoi conduit l’injection d’eau dans un flux de CO2-éthanol. Cela apportera des réponses aux
conditions à appliquer pour favoriser la mise en forme en liposomes. Pour cela, nous avons pu
accéder au dispositif microfluidique de l’ICMCB (S. Marre). Les conditions choisies pour
cette études sont : P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit de CO2 = 7 g/min et débit
d’éthanol = 3,7 ml/min, correspondant à des conditions d’extraction préalablement
sélectionnées. La transposition des conditions d’écoulement du réacteur d’extraction (et de
mise en forme) à celui de microfluidique se fait sur la base de conservation de vitesse
d’écoulement.
Dans cette partie, on visualise, à l’aide d’une caméra ultra-rapide, le capillaire de
sortie à 6 et 30 cm après la zone d’injection de l’eau dans le flux de CO2-éthanol. Le débit
d’eau est le paramètre étudié. Observations en microfluidique
Il n’y a pas de différence entre les observations à 6 et 30 cm. Le régime permanent
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 161 -
semble être établi au maximum à partir de 6 cm après la zone de contact entre l’eau et le CO2-
éthanol. Les résultats obtenus à 6 cm sont résumés dans le Tableau IV-4.
Proportion de CO2 (%)
[débit]
Proportion d’éthanol
(%) [débit]
Proportion d’eau (%)
[débit] Résultat
67,3% [305 µL/min]
27,9% [137 µL/min]
4,8% [18 µL/min]
Observation du régime : Deux rubans
64,2% [305 µL/min]
26,6% [137 µL/min]
9,2% [37 µL/min]
Observation du régime : Rubans et « Slugs »
47,0% [305 µL/min]
19,5% [137 µL/min]
33,5% [185 µL/min]
Observation du régime : « Slug » de CO2 dans de l’eau à cause de la
mouillabilité de la silice par l’eau
35,2% [305 µL/min]
14,6% [137 µL/min]
50,2% [370 µL/min]
Observation du régime : « Slug » plus court
23,5% [305 µL/min]
9,7% [137 µL/min]
66,8% [740 µL/min]
Observation du régime : gouttes
Tableau IV-4 : Photographies du capillaire à 6 cm de la zone d’injection en fonction des mélanges CO2-éthanol-eau
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 162 -
On distingue clairement deux comportements :
� les fluides ne se mélangent pas mais restent sous forme de deux rubans
� des gouttelettes apparaissent (à partir d’un débit d’eau de 185 µl/min). L’eau
mouillant préférentiellement la silice (matériau du capillaire), le CO2 constitue
la phase dispersée dans le continuum d’eau
Ces comportements peuvent probablement être expliqués d’un point de vue
énergétique. En effet, à grande vitesse (c'est-à-dire à forte proportion d’eau), le flux d’eau
possède une grande énergie cinétique (proportionnelle au carré de la vitesse et à la masse) ce
qui lui permet de « pénétrer » dans le flux de {CO2-éthanol} et ensuite il se décompose en
gouttelettes. Le raisonnement inverse peut être fait pour les faibles débits.
IV.2.2.1 Impacts sur la mise en forme de liposomes
Cette étude a été mise en place dans le but de trouver des conditions opératoires
favorables à la mise en forme de liposomes. Il faudrait se placer dans le domaine de formation
de gouttes. En effet, les phospholipides étant des entités amphiphiles, l’apparition d’une
émulsion CO2 dans eau peut leur permettre de se placer à l’interface des gouttes ce qui
favoriserait la mise en forme des liposomes. En effet, d’après Lesoin et al., (Lesoin et al.,
2001) l’agencement des phospholipides en liposomes sous pression résulterait d’une
succession d’étapes de changement de phase conduisant à la formation de micelles et
d’émulsion pour aboutir aux liposomes lors de la dépressurisation lorsque le CO2 passe en
forme gazeuse. Ce même mécanisme de passages successifs d’une émulsion eau dans CO2
vers une autre de type CO2 dans eau puis une dernière transition vers une émulsion CO2 dans
eau a aussi été proposé par Otake et al. (Otake et al., 2006), pour leur procédé de mise en
forme qui consiste à ajouter continuellement une phase aqueuse à un mélange de CO2-éthanol
contenant les phospholipides.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 163 -
IV.3 Couplage de l’extraction des PL et de la mise en forme en liposomes
Le principe du couplage est d’ajouter une solution aqueuse au flux de CO2-éthanol
contenant les phospholipides issus de l’extraction. Cette partie présente les essais menés. On
s’appuiera, pour la définition du plan d’essais sur les résultats de l’étude des mélanges CO2-
éthanol-eau. Si on se base sur les études de microfluidique, il faudrait travailler à un débit de
5 ml/min (IV.2.2.1).
Deux séries d’essais sont réalisés, l’un en réacteur agité, l’autre en réacteur tubulaire
dans les conditions décrites dans le Tableau IV-5.
Extraction [Masse de matière
déshuilée utilisée (g)]
P (Bar) T (°C) % massique
éthanol dans le mélange
Débit d’éthanol
moyen (ml/min)
Débit d’eau moyen
(ml/min)
Réacteur
30 250 45 30 3,7 10 Agité de 250
ml
30 250 45 30 3,7 2,5 Tubulaire de
500 ml
Tableau IV-5 : Conditions opératoires du couplage de l’extraction et de la mise en forme
Avec le réacteur agité, la première fraction récoltée est turbide, les suivantes sont
limpides, de coloration jaune pâle d’intensité décroissante en fonction du temps de
récupération (Figure IV-6). Néanmoins, les clichés de microscopie optique n’ont pas permis
de déceler la présence de vésicules même dans la fraction 1. Ce résultat pourrait s’expliquer
par les faibles proportions de phospholipides obtenues dans chaque fraction (Tableau IV-6).
Par ailleurs, les volumes de fraction récupérés étant d’environ 400 ml, les concentrations en
phospholipides sont inférieures à 1 mg/ml ce qui fait que le système est peut être trop dilué
pour permettre l’observation de liposomes.
Pour augmenter la pureté des fractions en PL et diminuer le facteur de dilution, un
second essai est réalisé en recueillant les fractions toutes les 5 minutes. Ce second essai a
également été infructueux.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 164 -
Figure IV-6 : Photographie de la phase aqueuse recueillie (F1) au cours de l’essai de mise en forme
F1 (0 à 40 min) F2 (40 à 80 min) F3 (80 à 120 min)
Masse (mg)
masse de l’espèce/
masse totale extrait
Masse (mg)
masse de l’espèce/
masse totale extrait
Masse (mg)
masse de l’espèce/
masse totale extrait
Phospholipides 85 24% 65 22% 33 18% Lipides non phosphorés
220 62% 171 58% 60 32%
Espèces non lipidiques
53 14% 61 20% 93 50%
Total 358 297 186 Masse de PL (g)/ masse de lipides totaux
(g)
0,28 0,28 0,35
Tableau IV-6 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur agité (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 10 ml/min, P = 250 bar, T = 45°C, 30%
d’éthanol)
Avec le réacteur tubulaire, utilisé dans les conditions d’extraction décrites dans le
Tableau IV-5, les fractions 1 et 2 sont turbides, contrairement aux suivantes. Néanmoins,
aucun liposome n’est observé en microscopie optique. Si on se réfère aux études de faisabilité
de mise en forme des liposomes réalisés par voie classique (IV.1), les teneurs en PL des
extraits auraient du être suffisantes (notamment pour F2) pour former des liposomes (Tableau
IV-7), d’autant plus que nous avons mis en place en système d’évaporation de l’éthanol en
sortie de réacteur (moins de 25 % massique d’éthanol dans la fraction) pour ne pas perturber
le système. La non formation de liposomes pourrait s’expliquer par le débit d’eau utilisé
inférieur à celui déterminé par microfluidique et qui ne favoriserait pas la présence de
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 165 -
gouttelettes ou par la faible concentration finale en phospholipides (3,6 et 2,25 mg/ml
respectivement pour F1 et F2).
Tableau IV-7 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur tubulaire de 500 ml (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 2,5 ml/min, P = 250 bar, T
= 45°C, 30% d’éthanol).
En conclusion, le couplage extraction de PL-mise en forme de liposomes est sans
doute possible sur le principe mais il apparait très délicat à réaliser à cause :
� du pourcentage d’éthanol nécessaire à l’extraction de PL qui peut empêcher la
formation des liposomes si il y en a trop
� du faible niveau de concentration des phospholipides dans le milieu extractant
en sortie de réacteur
� de la variation des concentrations des phospholipides au cours du temps
d’extraction
� de la présence d’espèces non lipidiques et lipidiques non phosphorées qui
peuvent nuire à l’organisation des bicouches
F1 (0 à 15 min) F2 (15 à 30 min) F3 (30 à 45 min)
Masse (mg)
masse de l’espèce/
masse totale extrait
Masse (mg)
masse de l’espèce/
masse totale extrait
Masse (mg)
masse de l’espèce/
masse totale extrait
Phospholipides 60 26% 90 38% 120 56% Lipides non phosphorés
90 40% 15 12% 31 14%
Espèces non lipidiques
75 34 20 16% 62 29%
Total 225 125 213 Masse de PL (g)/ masse de lipides totaux
(g)
0,40 0,86 0,77
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie
IV.4 Modification de la taille des liposomes par voie supercritique
Il existe dans la littérature des études qui montrent qu’il est possible de mettre en
forme des liposomes grâce à des techniques supercritiques (
connaissance, il n’existe pas de post
supercritique. Nous avons envisagé cette technique pour réduire la taille d’une dispersion de
liposomes.
Quand un flux de CO2
de la dépressurisation, il y a formation d’un spray. C’est l’existence de ce spray en fin de
procédé que nous souhaitons exploiter. La
formation du spray en présence de CO
Figure IV-7 : Principe du post traitement supercritique de liposomes
Pour un mélange CO2
fonction des paramètres opératoires tels que le débit et les dimensions géométriques du
système. Les photographies Figure
spray. En modifiant les caractéristiques géométriques du montage, il est possible de contrôler
l’atomisation du spray (angle et longueur) du spray de sortie. En effet, ce qui influence les
caractéristiques apparentes du spray (atomisation
atomisation, longueur du spray…), ce sont les compositions du mélange CO
en sortie du capillaire liée aux dimensions de ce dernier.
: Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie
Modification de la taille des liposomes par voie supercritique
Il existe dans la littérature des études qui montrent qu’il est possible de mettre en
forme des liposomes grâce à des techniques supercritiques (cf I.3.2). Cependant, à notre
connaissance, il n’existe pas de post-traitement des suspensions de liposomes au CO
supercritique. Nous avons envisagé cette technique pour réduire la taille d’une dispersion de
2 rencontre un flux contenant une dispersion de liposomes, lors
de la dépressurisation, il y a formation d’un spray. C’est l’existence de ce spray en fin de
procédé que nous souhaitons exploiter. La Figure IV-7 présente le principe global de
formation du spray en présence de CO2 supercritique.
: Principe du post traitement supercritique de liposomes
2-éthanol-eau qui se détend dans un milieu, le spray varie en
fonction des paramètres opératoires tels que le débit et les dimensions géométriques du
Figure IV-8 illustrent l’impact des conditions op
spray. En modifiant les caractéristiques géométriques du montage, il est possible de contrôler
l’atomisation du spray (angle et longueur) du spray de sortie. En effet, ce qui influence les
caractéristiques apparentes du spray (atomisation dans la sortie du capillaire, jet plein avant
atomisation, longueur du spray…), ce sont les compositions du mélange CO
en sortie du capillaire liée aux dimensions de ce dernier.
: Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 166 -
Modification de la taille des liposomes par voie
Il existe dans la littérature des études qui montrent qu’il est possible de mettre en
I.3.2). Cependant, à notre
traitement des suspensions de liposomes au CO2
supercritique. Nous avons envisagé cette technique pour réduire la taille d’une dispersion de
rencontre un flux contenant une dispersion de liposomes, lors
de la dépressurisation, il y a formation d’un spray. C’est l’existence de ce spray en fin de
présente le principe global de
: Principe du post traitement supercritique de liposomes
eau qui se détend dans un milieu, le spray varie en
fonction des paramètres opératoires tels que le débit et les dimensions géométriques du
illustrent l’impact des conditions opératoires sur le
spray. En modifiant les caractéristiques géométriques du montage, il est possible de contrôler
l’atomisation du spray (angle et longueur) du spray de sortie. En effet, ce qui influence les
dans la sortie du capillaire, jet plein avant
atomisation, longueur du spray…), ce sont les compositions du mélange CO2-eau, la vitesse
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 167 -
Débit de phase aqueuse = 1 ml/min, diamètre
du capillaire = 0,25 mm Débit de phase aqueuse = 5 ml/min, diamètre
du capillaire = 1 mm
Débit de phase aqueuse = 1ml/min, diamètre
du capillaire =0,5 mm, Pas de CO2, Débit de phase aqueuse = 10
ml/min, diamètre du capillaire =1 mm
Figure IV-8 : Photographies de sprays pour différents débits de phase aqueuse et différents diamètres de capillaire de sortie (débit de CO2 = 7 g/min)
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 168 -
Nous avons réalisé une trentaine d’essais à une pression de 200 bar et une température
de 45°C à partir d’une suspension de liposomes préparés avec une lécithine commerciale (LC
60). Nous avons fait varier les paramètres suivants :
� le diamètre interne du capillaire de sortie [0,18 mm - 0,25 mm - 0,5 mm - 1
mm]
� le débit de CO2 [2 g/min - 7 g/min - 10 g/min]
� le débit de la phase aqueuse [2,5 ml/min - 5 ml/min - 10 ml/min]
On note qu’il n’est pas possible de comparer de manière quantitative les vitesses de
sortie du fluide car ses propriétés physiques varient en fonction de la pression (qui n’est pas
constante dans le capillaire) et donc on ne peut pas appliquer les lois permettant le calcul de
ces vitesses. Nous pourrons donc seulement comparer les vitesses de manière relative.
Les distributions granulométriques observées étant multimodales, nous utiliserons des
diamètres particuliers pour discuter les résultats :
� D10 : diamètre équivalent en dessous duquel on trouve 10% de la population
totale
� D50 : diamètre équivalent en dessous duquel on trouve 50% de la population
totale
� D90 : diamètre équivalent en dessous duquel on trouve 90% de la population
totale
La Figure IV-9 présente un exemple de l’aspect final des dispersions obtenues en
sortie du spray. Elles sont turbides et de couleurs jaunes.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 169 -
Figure IV-9 : Exemple de dispersions obtenues en sortie du spray
IV.4.1 Influence de la taille capillaire
La Figure IV-10 et le Tableau IV-8 présentent les résultats obtenus à un débit de CO2
de 7 g/min et un débit de suspension de liposomes à 10 ml/min, le diamètre interne du
capillaire étant modifié.
Figure IV-10 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les distributions granulométriques des liposomes (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de suspension de liposomes =
10 ml/min)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,01 0,1 1 10 100 1000
% e
n v
ol
D (µm)
spray8j (diamètre interne du capillaire = 1 mm)
spray1c (diamètre interne du capillaire = 0,5 mm)
spray1d (diamètre interne du capillaire = 0,25 mm)
spray5d (diamètre interne du capillaire = 0,18 mm)
témoins
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 170 -
Spray Conditions opératoires Diamètre (µm)
Débit de
CO2 (g/min)
Débit suspension liposomes
moyen (ml/min)
Diamètre interne du capillaire
(mm)
D10 D50 D90
Spray5d 7 10 0,18 1,3 9,0 45,9
Spray1d 7 10 0,25 0,8 5,9 29,8
Spray1c 7 10 0,5 1,8 7,3 21,5
Spray8j 7 10 1 0,5 2,8 12,5
Témoins
2,5 5,3 9,8
Tableau IV-8 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement
La dispersion témoin est unimodale avec une population de liposomes centrée sur 5
µm. Après traitement, on a apparition de nouvelles populations par rapport au témoin,
notamment une plus petite centrée sur un diamètre d’environ 0,15 µm. L’intensité et la largeur
des pics varient avec le diamètre du capillaire : on observe une diminution du D10 qui
correspond à l’apparition d’une population de faible diamètre entre 0,1 et 0,5 µm qui n’existe
pas dans la suspension initiale. On observe aussi une augmentation du D90 qui s’explique par
un élargissement de la distribution des liposomes après traitement. Le D50 est toujours
augmenté après traitement sauf pour un diamètre interne de capillaire de 1 mm.
A titre d’exemple, la Figure IV-11 compare une suspension de liposomes avant et
après traitement. Les liposomes initiaux sont isolés contrairement à ceux issus du spray qui
sont agrégés. Cette agrégation est cohérente avec l’augmentation du D90 mentionnée.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 171 -
Figure IV-11 : Clichés de microscopie (grossissement de 100) de la suspension initiale (gauche) et de la suspension après spray (Spray5d) (droite) (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de
suspension de liposomes = 10 ml/min, diamètre interne du capillaire = 0,18 mm)
Le capillaire de 1 mm est le diamètre qui permet aux vésicules lipidiques de rester le
plus éloignées les unes des autres. C’est donc celui qui est le moins favorable à l’agrégation
des liposomes. L’apparition de liposomes de petites tailles correspondrait à une
restructuration des bicouches par un effet de cisaillement. Le capillaire de 1 mm qui
correspond à la vitesse de sortie des liposomes la plus faible laisserait le temps aux liposomes
de se reformer.
IV.4.2 Influence débit CO 2
La Figure IV-10 et le Tableau IV-9 présentent l’influence du débit de CO2 pour un
débit d’eau constant de 10 ml/min et deux diamètres de capillaire 0,25 mm et 1 mm.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 172 -
Spray Conditions opératoires Diamètre (µm)
Débit de CO2
(g/min)
Débit suspension liposomes
moyen (ml/min)
Diamètre interne du
capillaire (mm) D10 D50 D90
Spray8f 10 10 0,25 0,7 4,2 45,9
Spray8h 7 10 0,25 1,2 8,1 41,2
Spray8c 2 10 0,25 0,8 8,1 26,7
Spray9d 10 10 1 0,6 2,8 21,5
Spray9e 7 10 1 0,6 3,4 63,4
Spray9f 2 10 1 0,7 6,5 121,4
Témoins
2,6 5,6 11,3
Tableau IV-9 : Influence du débit de CO2 sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement (diamètre interne du capillaire = 0,25 mm et 1 mm)
Figure IV-12 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 1 mm)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0,01 0,1 1 10 100 1000
% e
n v
ol
D (µm)
spray9 temoins
spray9f (débit de CO2 = 2 g/min)
spray9e (débit de CO2 = 7 g/min)
spray9d (débit de CO2 = 10 g/min)
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 173 -
Avec le capillaire de 1 mm, dans tous les cas, on observe une petite population centrée
sur 0,2 µm qui fait que le D10 diminue par rapport à la suspension témoin. L’influence du
débit de CO2 est surtout visible sur la partie des liposomes agrégés, de sorte que, plus le débit
diminue, plus l’agrégation est importante. Cette agrégation est visible sur les clichés de
microscopie (Figure IV-14) dans lesquels on note aussi l’apparition de structures aux formes
variées et qui seraient plutôt de nature unilamellaire.
Figure IV-13 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 0,25 mm)
Pour un diamètre de capillaire de 0,25 mm, on retrouve les mêmes tendances qu’avec
le capillaire de 1 mm à l’exception qu’avec un débit de CO2 de 10 g/min, on favorise
l’apparition de petite population.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,01 0,1 1 10 100 1000
% e
n v
ol
D (µm)
témoin
spray8f (débit de CO2 = 10 g/min)
spray8h (débit de CO2 = 7 g/min)
spray8c (débit de CO2 = 2 g/min)
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 174 -
Figure IV-14 : Cliché de microscopie (grossissement de 100) de la suspension après spray (spray9f) (débit de CO2 = 2 g/min, débit de suspension de liposomes =10 ml/min, diamètre
interne du capillaire = 1 mm)
Modifier le débit de CO2 a deux conséquences. La première est une modification de la
composition du mélange CO2-eau. La seconde est une augmentation de la vitesse de sortie
puisque le débit total est supérieur. Le fait de jouer simultanément sur ces deux facteurs rend
les interprétations difficiles.
IV.4.3 Influence débit phase aqueuse
La Figure IV-10 et le Tableau IV-10 présentent l’influence du débit d’eau pour un
débit de CO2 fixe de 10 g/min et deux diamètres de capillaire 0,25 et 0,5 mm sur les diamètres
des liposomes.
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 175 -
Spray Conditions opératoires Diamètre (µm)
Débit de CO2
(g/min)
Débit suspension liposomes
moyen (ml/min)
Diamètre interne du
capillaire (mm) D10 D50 D90
Spray9a 10 10 0,5 0,25 1,29 63,45
Spray9b 10 5 0,5 0,28 2,75 21,50
Spray9c 10 2,5 0,5 1,04 4,24 12,52
Spray8f 10 10 0,25 0,67 4,24 45,86
Spray8e 10 5 0,25 1,60 5,27 26,70
Spray8d 10 2,5 0,25 1,79 5,27 26,70
Témoins
2,6 5,6 11,3
Tableau IV-10 : Influence du débit de la phase aqueuse sur les diamètres granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 et 0,25 mm)
Figure IV-15 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 mm)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0,01 0,1 1 10 100 1000
% e
n v
ol
D (µm)
spray9 temoins
spray9a (débit de suspension de liposomese = 10 ml/min)
spray9b (débit de suspension de liposomes = 5 ml/min)
spray9c (débit de suspension de liposomes = 2,5 ml/min)
Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique
- 176 -
Figure IV-16 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,25 mm)
Avec le capillaire de diamètre 0,5 mm, le spray permet nettement de diminuer la
granulométrie de la suspension initiale d’autant plus que le débit d’eau est important. De plus,
on réduit aussi les phénomènes d’agrégation avec le débit élevé.
Les mêmes tendances sont observées avec le capillaire de diamètre 0,25 mm mais les
variations de granulométrie sont moins prononcées.
En conclusion, il apparait que passer une suspension de liposomes à travers un
capillaire en présence d’eau et de CO2 supercritique permet de faire varier la distribution
granulométrique. Les phénomènes mis en jeu sont complexes avec, d’une part, une
réorganisation des structures en d’autres objets soit plus grands soit plus petits (selon les
conditions opératoires), et, d’autre part, un phénomène d’agrégation. Dans l’objectif d’obtenir
des liposomes de petite taille, il semble que l’utilisation d’un capillaire avec un grand
diamètre, un débit de CO2 et d’eau importants sont à préconiser.
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1
2
3
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5
6
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8
9
0,01 0,1 1 10 100 1000
% e
n v
ol
D (µm)
spray8 temoin
spray8f (débit de suspension de liposomes = 10 ml/min)
spray8e (débit de suspension de liposomes = 5 ml/min)
spray8d (débit de suspension de liposomes = 2,5 ml/min)
Conclusion générale et perspectives
- 177 -
VConclusion générale et perspectives
Conclusion générale et perspectives
- 178 -
Ce travail de thèse s’inscrit dans trois thématiques principales : i) la valorisation de la
biomasse ; ii) la diminution de l’utilisation des solvants organiques dans les procédés
d’extraction et iii) le développement d’un procédé supercritique continu couplant l’extraction
de phospholipides d’une part et la formation de liposomes, d’autre part.
En ce qui concerne la valorisation de la biomasse, nous avons identifié dans la coquille
Saint-Jacques un sous-produit potentiellement intéressant du fait de sa teneur relativement
élevée en phospholipides (9% de lipides totaux dont 20% de phospholipides, sur matière
sèche), correspondant à tout ce qui n’est pas le muscle et le corail. En effet, par rapport aux
sources plus classiques de phospholipides (16 à 30 mg de phospholipides pour 1 g de graine
de soja (10% d’eau) et 16 mg pour 1 g d’œuf (51,1 % d’eau) (Chanussot, 2008)), cette
matière première se situe dans le même ordre de grandeur en termes de teneur. De plus, cette
source a l’avantage d’être abondante sur les côtes européennes. Par ailleurs, en tant que
produit de la mer, elle présente une composition en acides gras polyinsaturés à longues
chaines intéressante d’un point de vue nutritionnel, pour des applications alimentaires ou
diététiques. Nous avons montré que la matière première d’origine est très hétérogène. Elle
doit donc être soigneusement homogénéisée avant extraction. Par ailleurs, la richesse en eau
de la matière première (80 %) impose une de déshydratation, réalisée par zéodratation. De
plus, avant de procéder à l’extraction par du CO2, un broyage est aussi appliqué de façon à
réduire la matière première en une poudre, ce qui favorisera le processus d’extraction ultérieur
par augmentation des surfaces d’échange.
En ce qui concerne la diminution de l’utilisation des solvants organiques dans les
procédés d’extraction, l’ensemble des expérimentations utilise du CO2 supercritique ou
liquide comme fluide principal. Lorsqu’un co-solvant est utilisé, il s’agit de l’éthanol ou de
l’iso-propanol, solvants reconnus comme GRAS (Generally Recognized as Safe).
En ce qui concerne le développement d’un procédé supercritique continu couplant
l’extraction de phospholipides et la formation de liposomes, les questions suivantes étaient
posées :
Conclusion générale et perspectives
- 179 -
• Avec quel rendement et quel degré de pureté est-il possible d’extraire les
phospholipides à l’aide d’un procédé utilisant du CO2 et un co-solvant ?
• La formation des liposomes à partir des phospholipides extraits est-elle
envisageable avec un mélange CO2-co-solvant ?
• Le procédé peut-il être exploité industriellement ?
Ces problématiques ont été abordées par étape. Dans un premier temps, nous avons
travaillé sur l’étape de déshuilage à l’aide de CO2 pur. Nous avons montré que cette étape
permet ensuite d’augmenter de manière significative la pureté des extraits de phospholipides
avec une diminution d’espèces non phospholipides dans l’extrait. Dans un deuxième temps,
nous avons évalué l’impact de divers paramètres (pression, température, pourcentage de co-
solvant, nature du co-solvant, type et dimension de réacteur) sur les rendements d’extraction
des phospholipides et la pureté des extraits obtenus. Il est important de souligner que les
extraits obtenus par voie supercritique sont complexes, car ils comprennent une partie non
lipidique et une partie lipidique, elle-même constituée de molécules qui ne sont pas toutes de
nature phospholipidique. Malgré cette complexité et selon les conditions expérimentales
appliquées, nous avons pu obtenir extraire jusqu’à 100% des phospholipides présents dans la
matrice déshuilée. Comparativement à l’éthanol, l’utilisation d’isopropanol conduit à des
extraits de pureté supérieure en phospholipides (jusqu’à 90% de phospholipides) mais les
rendements d’extraction sont plus faibles (de l’ordre de 40%). Dans un troisième temps, nous
avons montré que les extraits obtenus à l’issue du traitement supercritique s’organisent
effectivement sous forme de liposomes lorsque l’extrait sec est hydraté par une technique
conventionnelle, à condition que les extraits présentent une proportion de phospholipides (par
rapport aux lipides totaux) supérieure ou égale à 50%. Le couplage des étapes d’extraction et
de mise en forme en milieu supercritique n’a pas donné de résultats concluants. En effet, les
concentrations en phospholipides dans le flux CO2-éthanol du réacteur d’extraction ne sont
pas suffisante pour permettre l’organisation en liposomes.
L’ensemble des résultats obtenus reste malgré tout encourageant. Le procédé
d’extraction des phospholipides par voie supercritique est une alternative intéressante aux
techniques conventionnelles dans la mesure où il est plus respectueux de l’environnement. Il
permet aussi de travailler à des températures modérées préservant les molécules
thermolabiles. Il nécessite un investissement en équipement important et un prétraitement de
Conclusion générale et perspectives
- 180 -
la matière première (déshydratation et broyage), deux opérations coûteuses en matériel et en
énergie. Néanmoins, le coût de fonctionnement est ensuite faible (pas d’élimination des
solvants des extraits, pas de recyclage des solvants). Compte-tenu de la demande croissante en
phospholipides pour des applications alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques et de la
forte valeur ajoutée de ces molécules, leur extraction par voie supercritique pourrait être
intéressante à développer à l’échelle industrielle.
Les perspectives de ce travail sont nombreuses. La caractérisation des extraits obtenus
doit être approfondie aussi bien sur la partie lipidique que non lipidique. Les extraits
contiennent éventuellement des composés (céramides, collagène) pouvant présenter des
activités biologiques intéressantes. Au niveau de la matière première, si une étape de
déshydratation est nécessaire, il serait aussi intéressant d’envisager des prétraitements
supplémentaires pour diminuer les interactions lipides avec les autres composants de la
matrice (action de protéases pour hydrolyser les protéines par exemple). La recherche d’autres
matières premières notamment d’origine végétale (telle que les tourteaux) devrait être réalisée
pour diversifier les sources de phospholipides et donc leur composition et acides gras
associés, sachant qu’un changement de matrice nécessitera certainement une adaptation des
conditions d’extraction. Par ailleurs, pour valider un intérêt industriel, il est indispensable de
travailler sur des lots traités plus importants permettant également de valider l’idée du
couplage extraction et mise en forme en liposomes.
L’optimisation des rendements d’extraction sur des quantités traitées importantes est
indispensable pour valider la possibilité de couplage de l’étape d’extraction avec celle de mise
forme des liposomes. Par exemple, une optimisation des paramètres d’extraction avec le
mélange CO2-isopropanol peut être envisagée puisqu’on a vu que tous les PL n’étaient pas
extraits de la matrice. Par ailleurs, il pourrait être intéressant de focaliser les prochains essais
sur le réacteur tubulaire puisqu’il permet d’obtenir des profils de concentration en PL élevés
par rapport au réacteur agité (Annexe 5).
Enfin, les liposomes obtenus peuvent contenir de l’éthanol. Une étude des propriétés
physicochimiques de ces structures ainsi que des domaines d’application devra être entreprise
de manière à mettre en lumière les potentialités de ces « nouveaux » liposomes.
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Table des figures
- 185 -
VIITable des figures
Figure I-1 : Représentation schématique d’un triglycéride ................................................... - 6 - Figure I-2 : Structure chimique de différents phospholipides et représentation du caractère amphiphile (Delattre et al., 1993) .......................................................................................... - 8 - Figure I-3 : Diagramme de phase de la dipalmitoylphosphatidylcholine en fonction de la fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide et Lβ, Lβ’ : structures lamellaires, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonal ; Pβ : structure lamellaire ondulée) (Delattre et al., 1993) ........................................................................... - 11 - Figure I-4 : Diagramme de phase de la lécithine d’oeuf en fonction de la fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide) (Delattre, 1993) ............................. - 12 - Figure I-5 : Schéma d'un liposome (Keller, 2001) .............................................................. - 12 - Figure I-6 : Fabrication d'huile et de tourteaux à partir de graines (Pages, 2008) .............. - 14 - Figure I-7 : Schéma des différentes opérations du raffinage (Pages, 2008)........................ - 16 - Figure I-8 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine de soja et de ses dérivés (Schneider, 2011) ................................................................................................... - 19 - Figure I-9 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine d’œuf (Schneider, 2011) .................................................................................................................................... - 20 - Figure I-10 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine marine (Schneider, 2011) ................................................................................................................ - 21 - Figure I-11 : Schéma des différentes opérations d’obtention des PL du lait (Schneider, 2011) - 21 - Figure I-12 : Diagramme de phase du CO2 (Penchev, 2001) .............................................. - 24 - Figure I-13 : Diagramme de phase du CO2-éthanol (49,5 °C) (Seung et al., 2001) ............ - 26 - Figure I-14 : Mécanisme de transfert du soluté de la matrice vers le solvant au cours de l’extraction .......................................................................................................................... - 27 - Figure I-15 : Exemple de courbe d’extraction (masse cumulée)......................................... - 27 - Figure I-16: Schéma simplifié de la technique de préparation de liposomes développée par Frederiksen (Meure et al., 2008) ......................................................................................... - 45 - Figure I-17 : Schéma du mécanisme SCPRE (a-d) et ISCPRE (e-g) (Otake et al., 2006) .. - 47 - Figure I-18 : Schéma de l'installation DESAM (Meure et al., 2008) .................................. - 49 - Figure II -1 : Photographie de la coquille Saint Jacques ..................................................... - 53 - Figure II -2 : Principe de la zéodratation (Marin et René, 2008) ........................................ - 54 - Figure II-3 : Distribution granulométrique de la matière première zéodratée et broyée ..... - 55 - Figure II -4 : Photographie de la chromatographie sur couche mince de l’extrait lipidique de la matière première. Deux mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v) ................. - 56 - Figure II-5 : Spectre RMN 31P des lipides totaux de la matière première........................... - 58 - Figure II -6 : Montage expérimental « petit volume » pour l’extraction des lipides (masse traitée : 3 à 6 g) .................................................................................................................... - 61 -
Table des figures
- 186 -
Figure II-7 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g) .................................................................................................... - 67 - Figure II -8 : Caractéristiques géométriques du réacteur .................................................... - 69 - Figure II-9 : Montage expérimental du procédé de couplage d’extraction des phospholipides et de mise en forme des liposomes ...................................................................................... - 70 - Figure II -10 : Montage expérimental de modification de la taille de liposomes avec du CO2 .. - 72 - Figure II-11 : Montage expérimentale pour l’étude des DTS ............................................. - 73 - Figure II-12 : Montage expérimental pour l’étude du système quaternaire CO2-Eau-éthanol-phospholipides ..................................................................................................................... - 74 - Figure II-13 : Schéma du montage du montage microfluidique de l'ICMCB (Marre et al., 2009), pour l’étude un pré-mélange CO2-éthanol remplace la partie CO2 et l’eau est acheminée par la pompe HPLC ........................................................................................... - 76 - Figure III-1 : Rendement d’extraction des lipides par CO2 supercritique (en bleu : extraction sur 3 g ; en rouge : extraction sur 6g ; en vert : 2ème extraction) ......................................... - 88 - Figure III-2 : Séparation par CCM des lipides des extraits 16 (16ap) et 21 (21ap) obtenus par CO2 supercritique (en comparaison la séparation de l’extrait des lipides totaux est rappelé). Deux mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v) .......................................................... - 91 - Figure III-3 : Influence du prétraitement sur la masse totale extraite (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol, débit : 0,8 g/min) ...................................................................................... - 96 - Figure III-4 : Influence du prétraitement sur l'extraction des lipides totaux et des phospholipides (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol) ...................................................... - 97 - Figure III-5 : Reproductibilité de l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min) ou 50% (débit total = 2 g/min) d’éthanol) (n = 3) .................................. - 99 - Figure III-6 : Influence de la pression sur l’extraction (T = 60°C, 50% éthanol, débit total = 2 g/min) ................................................................................................................................ - 101 - Figure III-7 : Influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 1 g/min) .................................................................................................... - 103 - Figure III-8 : Influence de la température sur l’extraction (P= 250 bar, 30% d’éthanol, débit total de 1,5 g/min) ............................................................................................................. - 106 - Figure III-9 : Influence de la température sur l’extraction (P = 300 bar, 50% éthanol (débit total : 2 g/min) et 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min)) ............................................. - 109 - Figure III-10 : Exemple de courbe d’extraction (Pls33) exprimée en fonction de la masse de solvant utilisée (P = 250 bar, T = 27°C, 50% éthanol (débit total : 2 g/min) .................... - 111 - Figure III-11 : Répartition des masses extraites (mg/g matière déshuilée) (non lipidiques, lipides non phosphorés et phospholipides) des extraits aux conditions opératoires sélectionnées (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ................ - 115 - Figure III-12 : Courbes d’extraction obtenues avec un mélange CO2-isopropanol (P = 250 bar, 50% de co-solvant) ............................................................................................................ - 118 - Figure III-13 : Comparaison des résultats obtenus avec de l'éthanol ou de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température.................. - 119 -
Table des figures
- 187 -
Figure III-14:Comparaison de la répartition des masses extraites (PL et autres (non lipidiques et lipides non phosphorés) obtenues avec de l'éthanol et de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température ................................................ - 120 - Figure III-15 : Reproductibilité du réacteur tubulaire de grand volume (à P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol et une masse traitée de 30 g) (n = 3) ............................................... - 123 - Figure III-16 : Influence de la masse introduite sur l’extraction avec le réacteur piston de « grand volume » (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit de CO2 = 7 g/min, débit total = 10 g/min) ........................................................................................................................ - 125 - Figure III-17 : Photographie d’extraits obtenus avec un mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, T= 45°C, 15% d’éthanol, réacteur tubulaire de 500 ml) ................................................... - 127 - Figure III-18 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .......................................................................................................................... - 128 - Figure VIII-1 : DTS d’un réacteur piston, agité et réel ..................................................... - 132 - Figure III-19 : Courbes de DTS d’un réacteur parfaitement agité (I), piston (II) et réel (III) (VILLERMAUX, 1994) et comparaison de l’influence du panier sur la DTS du réacteur agité - 133 - Figure III-20 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g) .................................................................................................. - 134 - Figure III-21 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode A, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................................................................. - 137 - Figure III-22 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode B, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................................................................. - 138 - Figure III-23 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode C, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................................................................. - 140 - Figure III-24 : Photographie de la matière première après extraction sans bille (A) et avec ajout de billes de verre (B) ................................................................................................ - 143 - Figure III-25 : Répartition des masses extraites par fraction pour le mode A « optimisé » en réacteur agité (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................. - 144 - Figure III-26 : Courbes d’extraction en mode fractionné (15 puis 30% d’éthanol) et à pourcentage d’éthanol fixe (P = 250 bar, T = 45°C, réacteur tubulaire de 500 ml avec 30 g de matière déshuilée, débit de CO2 = 7 g/min, débit éthanol = 3 g/min et 1,2 g/min pour respectivement 30 et 15% d’éthanol) ................................................................................ - 147 - Figure III-27 : Répartition des PL, lipides non phosphorés et matière non lipidique pour les extractions en mode fractionné, et séparément à 15 % et 30 % d’éthanol ........................ - 148 - Figure III-28 : Extrais obtenus avec un mélange eau-éthanol (70-30% massique) comme co-solvant (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 7 g/min, débit de co-solvant = 3,7 ml/min) ..... - 149 - Figure IV-1 : Echantillons réalisés à partir d’extraits obtenus par voie supercritique ...... - 154 - Figure IV-2 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls I F2 - 155 -
Table des figures
- 188 -
Figure IV-3 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls K F1 . - 155 - Figure IV-4 : Evolution des compositions des mélanges après chaque ajout de CO2....... - 158 - Figure IV-5 : Mélange 5 (58% CO2 - 42% eau, massique) à 150 bar et 45°C .................. - 159 - Figure IV-6 : Photographie de la phase aqueuse recueillie (F1) au cours de l’essai de mise en forme ................................................................................................................................. - 164 - Figure IV-7 : Principe du post traitement supercritique de liposomes ............................. - 166 - Figure IV-8 : Photographies de sprays pour différents débits de phase aqueuse et différents diamètres de capillaire de sortie (débit de CO2 = 7 g/min) ............................................... - 167 - Figure IV-9 : Exemple de dispersions obtenues en sortie du spray .................................. - 169 - Figure IV-10 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les distributions granulométriques des liposomes (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de suspension de liposomes = 10 ml/min) ......................................................................................................................... - 169 - Figure IV-11 : Clichés de microscopie (grossissement de 100) de la suspension initiale (gauche) et de la suspension après spray (Spray5d) (droite) (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de suspension de liposomes = 10 ml/min, diamètre interne du capillaire = 0,18 mm) .......... - 171 - Figure IV-12 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 1 mm) ....... - 172 - Figure IV-13 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 0,25 mm) .. - 173 - Figure IV-14 : Cliché de microscopie (grossissement de 100) de la suspension après spray (spray9f) (débit de CO2 = 2 g/min, débit de suspension de liposomes =10 ml/min, diamètre interne du capillaire = 1 mm) ............................................................................................ - 174 - Figure IV-15 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 mm) .. - 175 - Figure IV-16 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,25 mm) - 176 - Figure V-1 : Spectre RMN 31P de la PE seul .................................................................... - 193 - Figure V-2 : Spectre RMN 31P de la PC seul (avec référence interne : pyrophosphate) .. - 193 - Figure V-3 : Spectre RMN 31P de la PA ........................................................................... - 194 - Figure V-4 : Spectre RMN 31P de la PE et PA .................................................................. - 194 - Figure V-5 : Spectre RMN 31P de la PC et PA .................................................................. - 195 - Figure V-6 : Spectre RMN 31P de la PE et PC .................................................................. - 195 - Figure VII-1 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 50% d’isopropanol) ................................................................................................................... - 199 - Figure VII-2 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 30% d’éthanol ............................................................................................................................ - 199 - Figure VII-3 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 15% d’éthanol ............................................................................................................................ - 200 - Figure IX-1 : Comparaison des concentrations moyennes de PL obtenues pour les réacteurs agité et tubulaire ............................................................................................................... - 207 -
Table des tableaux
- 189 -
VIIITable des tableaux Tableau I-1 : Principaux acides gras et symbolique associée ............................................... - 7 - Tableau I-2 : Différents arrangements des phospholipides en solution aqueuse (Delattre et al., 1993) .................................................................................................................................... - 10 - Tableau I-3 : Exemple de domaines d’application des liposomes (Delattre, 1993) ............ - 13 - Tableau I-4 : Composition de quelques lécithines en fonction de l’origine (Schneider, 2011) .. - 18 - Tableau I-5 : Références des techniques normalisées d’extraction des lipides ................... - 22 - Tableau I-6: Récapitulatif des conditions d'extraction des lipides par CO2 supecritique ... - 30 - Tableau I-7 : Conditions d'extraction des phospholipides .................................................. - 33 - Tableau I-8 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des lipides neutres ............................................................................................................................................. - 37 - Tableau I-9 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des phospholipides ............................................................................................................................................. - 38 - Tableau I-10 : Les méthodes classiques de formation de liposomes (MLV : Multi Lamellar Vesicles, LUV : Large Unilamellar Vecicles et SUV : Small Unilamellar Vesicles)......... - 42 - Tableau I-11 : Conditions opératoires des techniques supercritiques d’obtention de liposomes - 44 - Tableau II -1 : Profil d’acides gras des lipides totaux et des PL de la matière première .... - 57 - Tableau II -2 : Composition en lipides de la lécithine LC 60 ............................................. - 59 - Tableau II-3 : % initiaux d’éthanol des mélanges étudiés .................................................. - 75 - Tableau II -4 : Déplacement chimique des phospholipides seuls et en mélange déterminés par RMN 31P .............................................................................................................................. - 83 - Tableau III-1 : Conditions opératoires et masse de lipides extraite à l’aide de CO2 pur (Débit CO2 = 1 g/min sauf pour extract9 : 1,6 g/min) .................................................................... - 87 - Tableau III-2 : Taux et masses de PL avant et après extraction au CO2 pur ....................... - 90 - Tableau III-3 : Conditions opératoires des extractions des phospholipides ........................ - 94 - Tableau III-4 : Bilan en phospholipides des extractions avec et sans déshuilage au CO2 (P = 1 bar, T = 27°C, 100% éthanol) (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) - 97 - Tableau III-5 : Conditions opératoires d’étude de la reproductibilité de l’extraction des phospholipides (durée d’extraction : environ 100 min) ...................................................... - 98 - Tableau III-6 : Conditions opératoires pour étudier l'influence de la pression sur l’extraction des lipides .......................................................................................................................... - 100 - Tableau III-7 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol .......................... - 102 - Tableau III-8 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (débit de CO2 = 1 g/min) ................................................................................ - 102 - Tableau III-9 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, T = 45°C ; obtenues par Prophys) ............................................................................................ - 104 - Tableau III-10 : Influence du pourcentage d'éthanol sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ...................................... - 104 -
Table des tableaux
- 190 -
Tableau III-11 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence de la température sur l’extraction (Débit de CO2 : 1 g/min) ................................................................................ - 105 - Tableau III-12 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol à 3 températures (P = 250 bar, 30 % éthanol) ...................................................................................................... - 107 - Tableau III-13 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ............................................. - 107 - Tableau III-14 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, 50% éthanol ; obtenues par Prophys) à 3 températures ............................................................. - 108 - Tableau III-15 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 300 bar, 30% et 50% d’éthanol; obtenues par Prophys) à 3 températures .................................................. - 110 - Tableau III-16 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ................................................. - 110 - Tableau III-17 : Solubilités apparentes des lipides et phospholipides pour les différentes conditions opératoires étudiées ......................................................................................... - 112 - Tableau III-18 : Récapitulatif des résultats de l’extraction avec un mélange CO2-éthanol (pureté et rendement, (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)) .. - 116 - Tableau III-19 : Conditions opératoires des essais d’extraction des phospholipides avec un mélange CO2-isopropanol ................................................................................................. - 117 - Tableau III-20 : Conditions opératoires testées avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar) .................................................................................................................... - 127 - Tableau III-21: Comparaison des résultats obtenus avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar) ............................................................................................................... - 129 - Tableau III-22: Conditions opératoires des essais de transpositions au réacteur agité ..... - 134 - Tableau III-23 : Quantités totales extraites avec les trois modes sur l’ensemble des 8 fractions- 141 - Tableau III-24 : Qualité des extraits des modes A et C, respectivement pour les fractions 1 à 5 et 1 à 8 ............................................................................................................................... - 141 - Tableau III-25 : Comparaison des résultats obtenus avec le réacteur agité de 250 ml et le réacteur tubulaire de 10ml ................................................................................................. - 142 - Tableau III-26 : Masse de PL extraite par g de matière déshuilée et répartition des familles (PL, lipides non phosphorés et espèces non lipidiques) de l’extrait pour chaque fraction, Mode A (sans bille, temps d’isolement de 20 min et 15 g de matière déshuilée et Mode A « optimisé » (ajout de billes en verre, temps d’isolement de 60 min et 30 g de matière déshuilée) .......................................................................................................................... - 145 - Tableau III-27 : Conditions opératoires extraction en deux temps avec le réacteur tubulaire 500 ml ................................................................................................................................ - 146 - Tableau III-28 : Conditions opératoires extraction avec un mélange eau-éthanol ............ - 149 - Tableau III-29 : Répartition de la masse extraite pour l’extraction avec un mélange eau-éthanol comme co-solvant ................................................................................................. - 150 - Tableau IV-1 : Structures observées après hydratation des extraits obtenus par voie supercritique (F1, F2 et F3 : 1ère, 2ème et 3ème fractions, P = 250 bar, R : pas d’objets visibles, L : liposomes, E : émulsion huile dans eau, * co-solvant : isopropanol et ** co-solvant : éthanol) .............................................................................................................................. - 156 -
Table des tableaux
- 191 -
Tableau IV-2 : Compositions massiques en éthanol et aspect macroscopique des mélanges introduits dans la cellule .................................................................................................... - 157 - Tableau IV-3 : Compositions finales (après les 5 ajouts de CO2) des mélanges étudiés .. - 158 - Tableau IV-4 : Photographies du capillaire à 6 cm de la zone d’injection en fonction des mélanges CO2-éthanol-eau ................................................................................................ - 161 - Tableau IV-5 : Conditions opératoires du couplage de l’extraction et de la mise en forme - 163 - Tableau IV-6 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur agité (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 10 ml/min, P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol) .......................................................................................................................... - 164 - Tableau IV-7 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur tubulaire de 500 ml (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 2,5 ml/min, P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol). ................................................................................................................. - 165 - Tableau IV-8 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement ................................................... - 170 - Tableau IV-9 : Influence du débit de CO2 sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement (diamètre interne du capillaire = 0,25 mm et 1 mm) .... - 172 - Tableau IV-10 : Influence du débit de la phase aqueuse sur les diamètres granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 et 0,25 mm) ................... - 175 - Tableau VI-3 : Composition massique des mélanges étudiés en microfluidique en fonction du débit du réacteur de formation de liposomes .................................................................... - 197 - Tableau VI-4 : Débit et nombre de Reynolds (Re) associés au montage expérimental de mise en forme et microfluidique (P = 250 bar, 30% d’éthanol) ................................................ - 197 - Tableau VIII-1 : Conditions opératoires utilisées pour l’étude de la DTS ........................ - 202 - Tableau VIII-2 : Résumé des résultats des DTS ............................................................... - 203 - Tableau VIII-3 : Reynolds d’agitation de l’étude des DTS en fonction de la vitesse d’agitation ........................................................................................................................................... - 205 - Tableau VIII-4 : Reynolds d’agitation des essais d’extraction en CO2-éthanol en fonction de la vitesse d’agitation .............................................................................................................. - 205 -
Annexe 1
- 192 -
IXAnnexe 1 : Spectres RMN 31P
Annexe 1
- 193 -
Dans cette annexe, il est présenté les différents spectres RMN 31P des standards de
phospholipides seuls et en mélanges. Les conditions d’analyses sont détaillées dans le chapitre
2 : Matériel et méthodes.
Figure IX-1 : Spectre RMN 31P de la PE seul
Figure IX-2 : Spectre RMN 31P de la PC seul (avec référence interne : pyrophosphate)
Annexe 1
- 194 -
Figure IX-3 : Spectre RMN 31P de la PA
Figure IX-4 : Spectre RMN 31P de la PE et PA
Annexe 1
- 195 -
Figure IX-5 : Spectre RMN 31P de la PC et PA
Figure IX-6 : Spectre RMN 31P de la PE et PC
Annexe 2
- 196 -
XANNEXE 2 : Complément à l’étude
cinétique du mélange CO2-éthanol-eau
Annexe 2
- 197 -
• Correspondance des conditions réacteur de mise en forme des liposomes et
conditions de l’étude microfluidique
Les conditions d’analyse sont ajustées par rapport à celle du dispositif de mise en
forme de liposomes. Dans notre montage expérimental, le débit de CO2 et d’éthanol est de 7
g/min et de 3,7 ml/min et que le débit d’eau sera modifié entre 0,5 ml/min et 20 ml/min (plage
de fonctionnement de la pompe). Le Tableau X-1 fournit les compositions massiques des
mélanges qui seront alors obtenus.
Débit d’eau
(ml/min)
Composition massique (%)
CO2 Ethanol Eau
0,5 67,3 27,9 4,8
1 64,2 26,6 9,2
5 47,0 19,5 33,5
10 35,2 14,6 50,2
20 23,5 9,7 66,8
Tableau X-1 : Composition massique des mélanges étudiés en microfluidique en fonction du débit du réacteur de formation de liposomes
Sur le dispositif de mise en forme, les capillaires ont un diamètre interne de 1,3 mm.
Le dispositif microfluidique utilise des capillaires de 250 µm de diamètre interne. Le calcul
des débits de CO2+ éthanol et d’eau à imposer en microfluidique sont calculés sur la base
d’une conservation des vitesses dans les capillaires (Tableau X-2).
La modification du diamètre de l’écoulement peut entrainer une modification du
régime hydrodynamique. Le calcul du nombre de Reynolds dans les deux installations
(Tableau X-2) montre que le régime restera laminaire quelque soit le dispositif utilisé.
Réacteur de mise
en forme
Microfluidique
Flux {CO2+ethanol}
(ρ=0,900 g.cm-3
et η=0,12 mPa.s)
Re 1348 259
Débit 11 ml/min 410 µL/min Flux d’eau
(ρ=0,997g.cm-3
et η=0,89 mPa.s)
Re 9-458 2-88
Débit 0,5-20 ml/min 18-740 µL/min
Tableau X-2 : Débit et nombre de Reynolds (Re) associés au montage expérimental de mise en forme et microfluidique (P = 250 bar, 30% d’éthanol)
Annexe 3
- 198 -
XIANNEXE 3 : Comparaison des réacteurs
tubulaire de 10 et 500 ml
Annexe 3
- 199 -
Figure XI-1 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 50% d’isopropanol)
Figure XI-2 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 30% d’éthanol
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 10 20 30
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
g de solvant (CO2-éthanol) / g de matière
60 g (PL)
60 g (masse totale)
6 g (PL)
6 g (masse totale)
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
g de solvant (CO2-éthanol) / g de matière
60 g (masse totale)
60 g (lipides totaux)
60 g (PL)
6 g (masse totale)
6 g (lipides totaux)
6 g (PL)
Annexe 3
- 200 -
Figure XI-3 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 15% d’éthanol
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40 50
Ma
sse
ex
tra
ite
(m
g)
/ g
de
ma
tiè
re
g de solvant (CO2-éthanol) / g de matière
60 g (masse totale)
60 g (lipides totaux)
60 g (PL)
6 g (masse totale)
6 g (lipides totaux)
6 g (PL)
Annexe 4
- 201 -
XIIAnnexe 4 : Résultats expérimentaux
de l’étude des DTS du réacteur agité de
250 ml
Annexe 4
- 202 -
• Le plan des essais
Numéro
manip
Débit d’entrée
(ml/min)
Vitesse d’agitation
(tr/min)
Panier
1 5 100 grosses mailles 2 5 200 grosses mailles
3 5 500 grosses mailles
4 10 100 grosses mailles
5 10 200 grosses mailles
6 10 500 grosses mailles
7 15 100 grosses mailles
8 15 200 grosses mailles
9 15 500 grosses mailles
10 15 500 grosses mailles
11 15 500 grosses mailles
12 25 200 grosses mailles
13 25 100 grosses mailles
14 25 500 grosses mailles
15 5 500 petites mailles
16 10 100 petites mailles
17 10 200 petites mailles
18 10 500 petites mailles
19 15 100 petites mailles
20 15 200 petites mailles
21 15 500 petites mailles
22 25 100 petites mailles
23 25 200 petites mailles
24 25 500 petites mailles
Tableau XII-1 : Conditions opératoires utilisées pour l’étude de la DTS
• Les résultats obtenus
Le Tableau XII-2 présente les temps de séjour moyens théoriques et ceux obtenus
expérimentalement.
Annexe 4
- 203 -
Numéro
manip
Débit
d’entrée
(ml/min)
Vitesse
d’agitation
(tr/min)
Panier τthéorique
(min)
τexpérimentale
(min)
1 4,73 100 grosses mailles 54 56 2 4,79 200 grosses mailles 54 56 3 4,94 500 grosses mailles 52 52 4 9,29 100 grosses mailles 28 29 5 9,77 200 grosses mailles 26 27 6 9,79 500 grosses mailles 26 26 7 13,98 100 grosses mailles 18 19 8 14,31 200 grosses mailles 18 18 9 14,64 500 grosses mailles 18 18
10 14,31 500 grosses mailles 18 17 11 14,29 500 grosses mailles 18 18 12 24,58 200 grosses mailles 10 11 13 23,47 100 grosses mailles 11 11 14 20,20 500 grosses mailles 13 14 15 4,98 500 petites mailles 54 109 16 9,74 100 petites mailles 26 62 17 9,69 200 petites mailles 26 48 18 9,67 500 petites mailles 26 51 19 14,90 100 petites mailles 17 30 20 15,05 200 petites mailles 17 20 21 15,06 500 petites mailles 17 31 22 24,91 100 petites mailles 10 12 23 24,20 200 petites mailles 10 13 24 24,51 500 petites mailles 11 11
Tableau XII-2 : Résumé des résultats des DTS
D’une manière générale, l’ensemble des essais réalisés avec le panier de type « grosses
mailles » permet d’avoir un comportement très proche d’un réacteur parfaitement agité. En
effet, l’allure des courbes est similaire au cas idéal. De plus, les temps de séjours moyens
expérimentaux sont proches des théoriques.
Par contre, les tests menés avec le second panier dit « petites mailles » donnent des
DTS différents de ceux obtenus avec l’autre. De plus, les temps de séjour moyens théoriques
sont plus importants. Le panier a donc un impact important sur l’hydrodynamique du milieu.
Les pertes de charges induites par les petites mailles empêchent l’agitation à l’extérieur du
panier. Le volume à l’intérieur du panier (de l’ordre de 80 ml) représente près d’un tiers du
volume total (d’environ 250 ml). La majorité du milieu n’est donc pas homogénéisée. Le
transfert de matière de l’intérieur vers l’extérieur est essentiellement assuré par la diffusion,
ce qui augmente donc les temps de séjours.
Annexe 4
- 204 -
• Extrapolation des résultats pour les essais sous pression
Les valeurs de DTS expérimentales ont été mesurées dans des conditions différentes
de celles de nos essais. En effet, cette détermination a été effectuée avec de l’eau à une
pression de 1 bar et à une température de 25°C. Les essais seront eux réalisés avec un
mélange CO2-éthanol pour un domaine de P= 250 bar et T= 27-45°C. De plus, le réacteur sera
chargé initialement de matière première sous forme de poudre et ensuite, lors de l’extraction
le solvant contiendra des lipides.
Déterminons, le régime hydrodynamique du milieu en fonction des conditions
opératoires. Pour cela, nous calculons le nombre de reynolds, Re. Il correspond au rapport
entre la force d’inertie et la force visqueuse. Celui-ci détermine le régime du fluide : le fluide
est en régime laminaire stable et stationnaire quand la valeur de Re est faible (Re=1 à 10) et
est turbulent instable et chaotique, quand sa valeur est plus élevée (Re>104).
Dans le cas d’un réacteur agité, il se calcule par la formule suivante (TI j4010) :
fE = 7�z²μ
� n : vitesse d’agitation en tours/s
� D=2,5 cm
� Pour l’eau, ρ= 1000 kg.m-3 et µ=0,001
Pa.s
Le régime ne dépend, dans le cas de l’eau et à température constante, que de la vitesse
d’agitation.
Annexe 4
- 205 -
Vitesse d’agitation
(tr/min)
100 200 500
Re 1042 2083 5208
Tableau XII-3 : Reynolds d’agitation de l’étude des DTS en fonction de la vitesse d’agitation
Pour une vitesse d’agitation comprise entre 100 et 500 tours/min, le régime est
intermédiaire.
Le mélange CO2-éthanol va modifier les valeurs de masse volumique et de viscosité.
D’une manière générale, dans nos conditions de pression et de température, la masse
volumique est de l’ordre de 900 kg/m3 et la viscosité sera de l’ordre de 1-2 x 10-4 Pa.s. (250
bar et T = 27-45°C). On fait l’hypothèse que la présence de la matière première modifie peu la
viscosité.
Pour une masse volumique de 900 kg/m3 et une viscosité de 2 x 10-4 Pa.s, on obtient
les valeurs de Reynolds suivantes :
Vitesse d’agitation
(tr/min)
100 200 500
Re 4688 9375 23438
Tableau XII-4 : Reynolds d’agitation des essais d’extraction en CO2-éthanol en fonction de la vitesse d’agitation
Pour 100 et 200 tours/min, le régime est transitoire et est turbulent à 500 tr/min.
L’homogénéisation du milieu est équivalente ou meilleure dans ces conditions que lors de la
détermination des DTS avec l’eau.
L’utilisation du panier possédant des mailles de 1 µm et dans ces conditions de
pression et de température (P = 250 bar et T = 27 ou 45°C) permet d’avoir un comportement
de type parfaitement agité pour le réacteur.
Annexe 5
- 206 -
XIIIAnnexe 5 : Comparaison des profils
de concentration des grands réacteurs
Annexe 5
- 207 -
Pour les deux types de réacteur, on peut estimer les concentrations en phospholipides
dans le flux CO2-éthanol de sortie (mg de PL / g de solvant), à partir des masses collectées
dans chaque fraction, en supposant que l’intégrale de la fraction peut être représentée par une
concentration moyenne selon :
5BHHEPQ = |�PQ'����}�U�~'DF
Il vient :
5BHHEPQ = �PQ�����'����}�U�~'∆F
Ce qui conduit à la concentration :
�PQ����� = 5BHHEPQ����}�U�~'∆F
Les deux réacteurs donnent des profils de concentration de sortie différents (Figure
XIII-1), le réacteur tubulaire donnant une concentration plus importante pendant les 80
premières minutes (jusqu’à F4).
Figure XIII-1 : Comparaison des concentrations moyennes de PL obtenues pour les
réacteurs agité et tubulaire
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Ma
sse
de
PL
(mg
) /
g d
e
solv
an
t (C
O2-é
tha
no
l)
réacteur piston de 500ml (30 g)
réacteur agité de 250 ml (30 g)