THESE DE SCIENCES GSK3β : clé de voûte des mécanismes de

THESE DE SCIENCES

UNIVERSITE DES SCIENCES PAUL SABATIER -TOULOUSE III

UFR SVT - Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies

Présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur de l’Université Paul Sabatier

Spécialité Cancérologie

GSK3β : clé de voûte des mécanismes de résistance au stress contrôlés par les intégrines dans les

leucémies aiguës myéloïdes

par Fabienne DE TONI

Soutenue le 14 novembre 2007 devant le jury composé de : Pr. Catherine Muller IPBS/CNRS (Toulouse) Présidente Dr. Corinne Albigès-Rizo INSERM U823 (Grenoble) Rapporteur Dr. Fawzia Louache INSERM U362 (Villejuif) Rapporteur Dr. Jean-Antoine Girault INSERM U536 (Paris) Examinateur Dr. Claire Racaud-Sultan INSERM U563 (Toulouse) Directrice de thèse

INSERM U563 - CPTP - Equipe B. Payrastre « Phosphoinositides et signalisation dans les cellules hématopoïétiques », CHU Purpan, Toulouse, FRANCE

A Olivier, mon compagnon et futur mari,

A mes parents,

A mon parrain regretté,

A mes amis,

A mes grands-parents.

A tous ceux qui liront ou feuillèteront cette thèse,

qu’elle leur soit agréable à lire

tout comme j’ai eu plaisir à l’écrire.

Remerciements

Tout d’abord, je tiens à remercier les membres du jury qui m’ont fait l’honneur de lire et de

juger ce travail ainsi que pour tout le temps qu’ils y ont consacré :

Madame le Professeur Catherine Muller qui m’a fait l’honneur de présider ce jury de thèse

et qui m’a encadré lors de mes premiers pas dans la recherche, en stage de maîtrise. Je la

remercie également de m’avoir donné le goût de la recherche.

Madame le Docteur Corinne Albigès-Rizo pour avoir accepté le lourd travail de rapporteur

et pour les pistes intéressantes qu’elle nous a conseillé pour l’article sur les mécanismes

d’activation de GSK3β en aval des intégrines α4β1 et α5β1.

Madame le Docteur Fawzia Louache pour avoir accepté d’évaluer ce travail de thèse en

qualité de rapporteur et pour ses questions pertinentes. Je la remercie encore d’avoir lu et jugé

ces 1,2 kilos de thèse !!

Monsieur le Docteur Jean-Antoine Girault qui a accepté d’évaluer ce travail de thèse et ce

avec beaucoup de gentillesse. Je le remercie également pour ses remarques pertinentes et ses

corrections sur la partie neuroscience de GSK3β.

Madame le Docteur Claire Racaud-Sultan pour son encadrement scientifique et ses conseils

tout au long de ces trois ans de thèse. Je tiens également à la remercier pour son enthousiasme

et sa passion communicante pour la recherche. Je me souviendrai toujours de notre premier

entretien où j’ai senti que ce sujet de thèse serait passionnant (je ne me suis pas trompée !!) et

qu’elle était une chercheuse passionnée au plus haut point. Merci donc pour tout, pour nos

discussions qui m’ont permis de me remettre toujours en question scientifiquement, d’élargir

ma réflexion sur mon sujet et de m’ouvrir sur de nombreux horizons scientifiques. Je vous

souhaite beaucoup de bonheur scientifique, de nombreux articles, des résultats palpitants et

des hypothèses de plus en plus passionnantes !!

Je tiens également à remercier toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à ce

travail de thèse, pour leur confiance et leur soutien tout au long de ces trois années.

Ainsi, je remercie vivement tous les membres de l’équipe du docteur Bernard Payrastre.

Bernard pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et pour m’avoir fait confiance dès le

début. Merci également pour votre disponibilité et pour votre esprit critique qui m’a permis de

m’améliorer et de réaliser ce travail.

Je tiens également à remercier tous les autres statutaires de l’équipe : Stéphane (pour ses

conseils de manip à mon arrivée au labo et à ceux pour l’oral de ma thèse), Marie-Pierre

(pour sa bonne humeur), Monique (pour ses coups de gueule pro-féministes, merci pour nous

toutes), Hélène (pour m’avoir fait découvrir les « vivaspin » et la biotinylation des anticorps,

et pour nos discussions scientifiques ou non), et Fred (merci pour tes corrections pour mon

projet de thèse en septembre 2004, alors que tu ne me connaissais pas, et pour ton esprit

critique tout au long de ma thèse ; je sais que c’était pour mon bien.)

Mathieu pour ces deux années de fous rires et pour nos discussions scientifiques. Merci

d’avoir choisi le sujet sur FAK pour ton DEA. Je me souviendrai longtemps de nos manips à

quatre mains, et notamment celles commençant dans l’animalerie le matin et se finissant le

soir au FACS. Bref de longues journées à travailler ensemble mais aussi à se marrer pendant

les pauses.

Sonia et Audrey pour m’avoir tracé la voie de la fin de thèse, merci pour tous vos conseils et

votre expérience qui m’ont aidé et rassuré dans les moments d’écriture. A très bientôt pour un

week-end in England pour faire la fête !! Gros bisous à toutes les deux.

Sophie pour toutes nos pauses clopes et sans clopes (depuis que j’ai arrêté), avec Sonia et

Audrey, qui me permettaient de repartir de plus belle. Je te souhaite une très très belle année

2008, avec une thèse réussie et un mariage magnifique. Plein de calins.

Anne V pour avoir été à mes côtés dans le bureau pendant ces trois années. Je te souhaite bon

courage pour la fin de ta thèse, je sais que tu vas y parvenir et ce de façon brillante.

Loïc pour m’avoir appris les rudiments de la CAM-DR et m’avoir soutenu et aidé pour mon

projet de thèse en septembre 2004. Merci.

Je voudrais remercier tous ceux du bureau des étudiants : Jessica (qui reprend le flambeau

GSK3β, je te souhaite bon courage mais aussi du plaisir et de bons résultats. Je pense que

GSK3β a bien d’autres surprises à nous réserver !!), Cédric (plus qu’une année et toi aussi tu

auras fini ta thèse, bon courage pour la dernière ligne droite), Nathalie (même si tu n’es

arrivée qu’à la fin de ma thèse, je voudrais te remercier pour tes conseils pour l’oral de thèse),

Anne M. (pour tes coups de gueule dans le labo et tes conseils de manip ; félicitations pour

ton poste à Paris), Kelly (merci pour tes mini cours d’anglais !!) et Gaëtan (je te souhaite un

bon rétablissement).

Je n’oublie pas les autres étudiants : Damien (je te souhaite une bonne fin de thèse et une

bonne année 2008 avec un beau mariage) et Junior (bon courage, je sais que tu vas faire une

jolie thèse) du bureau phosphoinositides, Valérie et Marie-Cécile des plaquettes (merci pour

votre calme et votre bonne humeur ; bon courage pour vos thèses).

Je tiens également à remercier tous les membres des autres équipes de l’étage, JJF, GL et

GD. Merci pour votre disponibilité (notamment pour les répétitions de l’oral de thèse) et votre

aide lorsque j’étais en manque de certains produits ou que j’avais besoin de conseils sur des

techniques ou des concepts. Je ne vous cite pas tous car cela serait trop long, mais vous avez

tous ma gratitude. Je voudrais également dire un grand merci à Sophie Allart pour m’avoir

appris le fonctionnement du microscope confocal, à Fatima pour ces explications lors de mes

manips de FACS et à Joël pour sa gentillesse et sa disponibilité (tu as sauvé beaucoup de mes

western blots en me dépannant de marqueur de taille !!).

Enfin, je tiens à remercier toute ma famille et mes amis, qui même s’ils n’ont pas contribué

directement à ce travail de thèse, m’ont permis de mener à bien cette thèse grâce à leur

patience et à leur amour. Tout d’abord, merci à toi, Olivier, pour m’avoir soutenu tout au long

de ma thèse, mais également pendant mon DEA. Je sais que l’écriture de ma thèse n’a pas été

un moment très plaisant pour toi et je tiens donc à te remercier pour toute ta patience, pour ta

présence réconfortante et ton amour.

Je remercie mes parents, Catherine et Michel, qui m’ont suivi pendant toutes mes études et

qui ont vécu avec moi mes succès et mes échecs, merci d’avoir toujours cru en moi, de

m’avoir redonné confiance dans les moments les plus difficiles et d’avoir été toujours là.

Merci et encore merci à vous deux !!

Je voudrais remercier également la famille d’Olivier, sa mère Nicole, ses grands-parents, Paul

et Honorine, sa soeur Nathalie et son compagnon Nicolas pour leur soutien et leur

gentillesse.

A mes amis qui ont su me soutenir et me réconforter (Roxane, Sophie, Caroll, Christel et

Isa) et qui ont su me laisser « hiberner dans ma tanière » lors de l’écriture de cette thèse

(Caroll, Jo), merci pour votre patience. Un grand merci aussi pour les soirées qui m’ont

permis de décompresser et rire (pas de liste, mais un gros merci et de gros bisous à tous)!!

Une petite dédicace spéciale pour Sophie et Roxane qui vont bientôt passer leur thèse, la

première en Math, et la seconde en bio. Bon courage et plein de bonheur à vous deux !!

Résumé

Un des problèmes majeurs rencontré actuellement dans le traitement des leucémies aiguës

myéloïdes (LAM) est la récurrence de cette pathologie suite à la chimiothérapie, entraînant la rechute

de 50 à 70 % des patients atteints de LAM post-chimiothérapie. Cette grave complication est due à un

foyer de cellules leucémiques résistantes à la thérapie, qui sont localisées dans la moelle osseuse des

os plats, où des éléments du microenvironnement tels que les ligands des intégrines et les

morphogènes Wnt, régulent étroitement leurs fonctions de survie, de prolifération et de

différenciation. Or, la sérine/thréonine kinase GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) est un carrefour

majeur des voies de signalisation contrôlant ces fonctions cellulaires. Nous avons recherché quel

pourrait être l’impact d’une modulation de son activité dans la résistance au stress des cellules

leucémiques, et quels étaient les mécanismes impliqués dans cette régulation.

Après avoir montré que l’adhésion sur fibronectine, via l’engagement des intégrines α4β1 et

α5β1, et le blocage de la voie Wnt entraînaient la résistance des cellules de LAM à l’apoptose induite

par la daunorubicine, différents inhibiteurs pharmacologiques et une stratégie de siRNA ont permis de

mettre en évidence que cette voie de survie nécessitait l’activation de la GSK3β. De plus, dans notre

modèle, GSK3β permet l’activation de NF-κB (nuclear factor κB), indépendamment de la voie de

régulation classique par IκB. La recherche des événements proximaux responsables de l’activation de

GSK3β, en aval de l’engagement des intégrines α4β1 et α5β1, a permis de démontrer une régulation

différentielle de cette kinase par les deux intégrines. En effet, alors que l’intégrine α4β1 régule une

forme tyrosine phosphorylée active de GSK3β intranucléaire et associée à la tyrosine kinase Pyk2,

l’intégrine α5β1 induit la translocation d’un complexe PP2A/GSK3β vers le compartiment

cytoplasme/membrane et la déphosphorylation activatrice sur la sérine 9 de GSK3β. Enfin, nous avons

révélé une régulation croisée entre les intégrines et la voie Wnt par le biais d’une sécrétion de

l’antagoniste de Wnt, sFRP-1 (secreted Frizzled Related Protein-1), après adhésion des blastes

leucémiques sur les ostéoblastes de la niche médullaire.

En conclusion, nos travaux ont permis de mettre à jour un mécanisme original de

chimiorésistance des LAM, impliquant deux acteurs majeurs du microenvironnement médullaire, les

molécules d’adhésion et les morphogènes Wnt. Ce processus de résistance au stress repose sur

l’activation de la kinase GSK3β, dont nous révélons pour la première fois le rôle essentiel dans une

voie de survie contrôlée par les intégrines. En perspectives, il reste à démontrer que GSK3β puisse

représenter une cible thérapeutique différentielle permettant d’épargner les cellules souches

hématopoïétiques normales, dans le traitement des LAM. Désormais, un grand champ d’investigations

s’ouvre pour comprendre le rôle de l’activation de GSK3β, en tant qu’élément pro-oncogénique dans

différents cancers.

1

Abstract

Relapse after chemotherapy is the major problem found in acute myeloid leukemia (AML) and

hits 50 to 70 % of AML patients. This serious complication is due to a pool of resistant leukemic cells.

These tumoral cells are localized in bone marrow of flat bones, where some microenvironmental

elements, such as integrin ligands and Wnt morphogens, tightly control their functions of survival,

proliferation and differentiation. Now, the serine/threonine kinase GSK3β (glycogen synthase kinase

3β) is a crucial crossroad of signaling pathways that control these cellular functions. We sought the

impact of a GSK3β activity modulation in stress resistance of leukemic cells, and mechanisms

involved in this regulation.

After showing that adhesion on fibronectin, via α4β1 and α5β1 integrins engagement, and that

blockade of the Wnt pathway promoted AML cell resistance against apoptosis mediated by

daunorubicin, different pharmacological inhibitors and a siRNA strategy allowed us to reveal that this

pathway required GSK3β activation. Following thus, we showed that GSK3β leads activation of a

transcriptional factor, NF-κB (nuclear factor κB), independent of the classical regulatory pathway by

IκB. By researching th signalling events downstream α4β1 and α5β1 integrin engagement responsible

for GSK3β activation, we demonstrated a differential regulation of this kinase by these two integrins.

In fact, while that α4β1 integrin regulates GSK3β by tyrosine phosphorylation and its co-localization

with the tyrosine kinase Pyk2 in nucleus, α5β1 integrin leads to translocation of the PP2A/GSK3β

complex out of the nucleus and the dephosphorylation of GSK3β on serine 9. Finally, we have shown

a cross-talk between integrins and the Wnt pathway by the way of secretion of a Wnt antagonist,

sFRP-1 (secreted Frizzled Related Protein-1), after adhesion of leukemic blasts on osteoblasts of the

medullar niche.

In conclusion, our work has allowed us to reveal a novel mechanism of AML chemoresistance,

involving two major players in the medullar microenvironment, adhesive molecules and Wnt

morphogens. This process of stress resistance depends on the GSK3β kinase activation, which we

demonstrate for the first time has a crucial role in a survival pathway controlled by integrins. In

perspective of my thesis work, it is important to determine if GSK3β might represent a novel

therapetic target, specific to leukemic stem cells, allowing preservation normal hematopoietic stem

cells, in AML treatment. Furthermore, a huge field of investigation opens henceforth to understand the

role of GSK3β activation in AML physiopathology, and as a pro-oncogenic element in different

cancers.

2

Sommaire

Sommaire RESUME......................................................................................................................... 1 ABSTRACT.................................................................................................................... 2 SOMMAIRE.................................................................................................................. 3 ABREVIATIONS......................................................................................................... 7 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE.............................................................................. 11

Chapitre I : L’hématopoïèse physiologique vs l’hématopoïèse leucémique.... 12

A. L’hématopoïèse normale ou physiologique................................................. 12 1. Le concept de cellules souches....................................................................... 12 2. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH).............................................. 13

2.1. La quiescence et la résistance au stress des CSH.................................... 15 a). La quiescence des CSH....................................................................... 15 b). La résistance au stress des CSH..........................................................17

2.2. L’autorenouvellement des CSH...............................................................20 a). La voie morphogène Wnt.................................................................... 24 b). Les antagonistes de la voie Wnt.......................................................... 28

2.3. La division asymétrique et la différenciation des CSH........................... 29 2.4. Des souris et des hommes........................................................................ 33

B. Le rôle du microenvironnement médullaire............................................... 34 1. La niche hématopoïétique.............................................................................. 35

1.1. La niche ostéoblastique ou endostéale.................................................... 35 a). Les ostéoblastes................................................................................... 35 b). Les composants de la matrice extracellulaire..................................... 38 c). Le calcium extracellulaire................................................................... 39

1.2. La niche vasculaire.................................................................................. 39 2. Les autres interactions entre le microenvironnement médullaire et les CSH ....................................................................................................... 41

2.1. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM)..................................... 41 2.2. Les cellules immunitaires........................................................................ 42 2.3. Les adipocytes......................................................................................... 43

3. Les autres mécanismes de régulation de l’hématopoïèse............................ 44 3.1. L’hypoxie et le stress oxydant................................................................. 44 3.2. Le système adrénergique......................................................................... 46

C. L’hématopoïèse leucémique........................................................................... 48 1. La leucémie aiguë myéloïde (LAM).............................................................. 48 2. Les cellules souches leucémiques (CSL)....................................................... 51

2.1. Les CSH et les progéniteurs : cibles de la transformation....................... 52 2.2. Les anomalies de survie, d’autorenouvellement et de différenciation dans la leucémogenèse............................................................................ 54

3. Initiation et progression de la LAM : modèle d’étude chez la souris........ 55

3

Sommaire

4. Les changements dans le microenvironnement médullaire leucémique... 57 5. Les traitements actuels et leurs conséquences............................................. 58

D. Conclusions et hypothèses préliminaires sur les éventuelles similitudes et différences des CSH et des CSL dans la réponse au stress.................................................................................................................... 60

Chapitre II : Les intégrines........................................................................................... 62 A. Les structures et les fonctions des intégrines.............................................. 62

1. Généralités sur les intégrines......................................................................... 62 2. Les intégrines et le contrôle de la survie cellulaire...................................... 67 3. Les intégrines et le stress oxydant................................................................. 76

B. Les intégrines exprimées par les cellules hématopoïétiques et leur implication dans l’hématopoïèse physiologique et leucémique.............. 77

1. Le rôle général des intégrines dans l’hématopoïèse.................................... 77 2. Le rôle critique des intégrines de type β1 dans l’hématopoïèse................. 78

2.1. La distribution des intégrines β1 et de leurs ligands dans le système hématopoïétique...................................................................................... 79 2.2. La modulation de l’activité des intégrines β1 dans les CSH................... 79

a). Les signalisations « inside-out» et «outside-in» des intégrines.......... 80 b). Les facteurs de croissance hématopoïétiques..................................... 80 c). Les chémokines................................................................................... 81 d). Les autres récepteurs d’adhérence..................................................... 81 e). Les cations métalliques divalents........................................................ 84

3. Les grandes voies de signalisation en aval des intégrines β1...................... 85 3.1. La famille des Focal Adhesion Kinases : le rôle particulier de Pyk2...... 85

a). Son expression tissulaire..................................................................... 87 b). Son activation...................................................................................... 88 c). Son rôle en oncogenèse....................................................................... 89 d). Son rôle dans la survie cellulaire........................................................ 90

3.2. Les phosphatases PP2A........................................................................... 91 a). Leurs structures et leurs régulations................................................... 91 b). Leurs multiples implications dans les fonctions cellulaires................ 92 c). Leur lien avec les intégrines β1.......................................................... 94

4. Les intégrines α4β1 et α5β1 dans l’hématopoïèse leucémique............... 95 4.1. L’intégrine α4β1..................................................................................... 95

a). Ses fonctions dans les blastes leucémiques......................................... 95 b). Son ciblage thérapeutique................................................................... 95

4.2. L’intégrine α5β1..................................................................................... 96 a). Ses fonctions dans les blastes leucémiques......................................... 96 b). Son ciblage thérapeutique................................................................... 97

4.3. La coopération entre les intégrines α4β1 et α5β1.................................. 97

C. Conclusions et hypothèses préliminaires sur le rôle des intégrines α4β1 et α5β1 dans les CSH et les CSL......................................................... 98

Chapitre III : La glycogène synthase kinase 3β (GSK3β)................................... 100

A. Les glycogène synthase kinases 3.................................................................. 100 1. Les différentes isoformes de GSK3............................................................... 100

4

Sommaire

2. Les knock-out de GSK3................................................................................. 101

B. La régulation de GSK3β.................................................................................. 102 1. Par sa phosphorylation.................................................................................. 102

1.1. L’autophosphorylation de GSK3β.......................................................... 102 1.2. La phosphorylation de GSK3β par des kinases et phosphatases............. 105 1.3. L’état de phosphorylation des substrats de GSK3β.................................108

2. Par sa localisation intracellulaire et celle de ses partenaires spécifiques.. 110 2.1. Dans le cytosol........................................................................................ 110

a). La voie insulinique.............................................................................. 111 b). Les voies morphogènes Wnt et Shh..................................................... 111 c). Le cytosquelette................................................................................... 114

2.2. Dans le noyau.......................................................................................... 116 2.3. Dans la mitochondrie............................................................................... 118

C. Le rôle de GSK3β dans les processus physiologiques et pathologiques..................................................................................................... 119

1. GSK3β et ses fonctions cellulaires................................................................. 119 1.1. L’inhibition pharmacologique de GSK3β............................................... 119 1.2. Dans le métabolisme énergétique............................................................ 119 1.3. Dans la survie cellulaire.......................................................................... 122 1.4. Dans l’architecture et la migration cellulaires......................................... 128 1.5. Dans la prolifération................................................................................ 130 1.6. Dans la sénescence.................................................................................. 130

2. GSK3β et le microenvironnement médullaire............................................. 131 2.1. L’inflammation et l’immunité................................................................. 131 2.2. L’hypoxie................................................................................................ 131

3. GSK3β et les cancers...................................................................................... 133 3.1. Dans les hémopathies.............................................................................. 133 3.2. Dans les autres cancers............................................................................ 134

D. Conclusions et hypothèses préliminaires sur le rôle de GSK3β dans les CSH et les CSL........................................................................................ 135

OBJECTIF DES TRAVAUX................................................................................... 136 RESULTATS EXPERIMENTAUX....................................................................... 137

Partie I. Le rôle des intégrines et de la voie Wnt dans la chimiorésistance des LAM : Mise en évidence du rôle clef de GSK3β...................... 138

1. Introduction....................................................................................................... 138 2. Résultats............................................................................................................. 139 3. Conclusion et discussion.................................................................................... 140

5

Sommaire

Partie II. Les voies adhésives contrôlant l’activation de GSK3β dans les LAM.................................................................................................. 143

1. Introduction....................................................................................................... 144 2. Matériels et méthodes........................................................................................ 146

3. Résultats............................................................................................................. 150 3.1. Résultats expérimentaux.......................................................................... 150 3.2. Figures..................................................................................................... 156

3.3. Légendes des figures............................................................................... 167 4. Conclusion et discussion................................................................................... 169

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES...................................... 175 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................. 180 ANNEXES

6

Abréviations

Abréviations AES : amino-terminal enhancer of split AGM : aorta-gonad-mesonephros ALDH : aldéhyde déshydrogénase Ang-1 : angiopoïétine-1 APC : adematous polyposis coli ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated BMP : bone morphogenic proteins BMPR : bone morphogenic protein receptor BMPRIA : bone morphogenic protein receptor type IA CADTK : calcium-dependent tyrosine kinase CAK-β : cell adhesion kinase β CAM-DR : cell adhesion mediated-drug resitance CaR : calcium-sensing receptor cdk : cyclin-dependent kinase CFU-GM : colony forming unit-granulocyte macrophage CFU-S : colony forming unit-spleen Ci : cubitus interruptus CK : caséine kinase Cos : costal2 CREB : Cyclic AMP response element binding protein CSE : cellule souche embryonnaire CSH : cellule souche hématopoïétique CSH-LT : CSH à long terme CSH-CT : CSH à court terme CSM : cellule souche mésenchymateuse DISC : death-inducing signaling complex Dkk : Dickkopf Dsh : dishevelled E-cadhérine : cadhérine épithéliale EGF : Epidermal growth factor ERK : extracellular signal-regulated kinase FAB : French-American-British FADD : Fas-associated-death-domain protein FAK : focal adhesion kinase FAT : focal adhesion targeting FERM : protein 4.1, ezrin, radixin and moesin homology Fg : fibrinogène Fn : fibronectine Flt-3L : Flt-3 ligand FOXO ou FoxO : Forkhead box subgroup O Frat : Frequently arranged in T cell lymphomas FRNK : FAK-related non-kinase Fus : fused FX : facteur X Fzl-R : récepteur Frizzled G-SCF : granulocyte colony-forming stimulating factor GEF : guanine nucleotide-exchange factor

7

Abréviations

GM-CSF : granulocyte macrophage-colony-stimulating factor GRB2 : growth-factor-receptor-bound-2 GSK3 : Glycogen Synthase kinase 3 HDAC : histone deacetylase Hh : Hedgehog HoxB4 : Homeo box B4 ICAM : intercellular cell adhesion molecule IGF1/2 : insuline-like growth factor 1/2 IL : interleukine ILK : integrin-linked kinase IRS : insulin receptor substrate JNK : Jun amino-terminal kinase KL : kit ligand L-IC : leukemia-initiating cells LAL : leucémie aiguë lymphoblastique Lam : laminine LAM : leucémie aiguë myéloïde LDL : low-density lipoprotein LEF/TCF : Lymphocyte enhancer factor/T cell factor LFA-1 : lymphocyte function-associated antigen-1 LIF : leukemia inhibitory factor LLC : leucémie lymphoïde chronique LMC : leucémie myéloïde chronique LMCT : leucine carboxyl methyltransferase LPA : lysophosphatidic acid LRP5-LRP6 : lipoprotein related-receptor proteins 5 and 6 LSK : Lin- Sca1+ c-Kit+

LTC-IC : long-term culture initiating capabilities M-CSF : monocyte colony-forming stimulating factor MAD1 : Myc-antagonist MadCAM-1 : mucosal adressin cell adhesion molecule-1 MAPK : Mitogen activated protein kinase MGF : mast cell growth factor MEC : matrice extracellulaire MICA/B : MHC class-I-related chain A and B MMP : matrix metalloproteinase MnSOD : manganese superoxide dismutase MO : moelle osseuse MRD : minimal residual disease MRM : maladie résiduelle minimale NAC : N-acétyl-L-cystéine NADP : nicotamide adenine dinucleotide phosphate NADP(H) : nicotamide adenine dinucleotide phosphate sous forme réduite Nck2 : non-catalytic (region of) tyrosine kinase adaptor protein 2 NES : nuclear export sequence NFκB : nuclear factor κ B NICD : Notch intracellular domain NK : natural killer NLS : nuclear localization sequence NOD-SCID : Nonobese diabetic - Severe combined immunodeficiency

8

Abréviations

NOX : NAD(P)H oxidase Nrf2 : NF-E2-related factor 2 NRTK : non-receptor tyrosine kinase Opn : ostéopontine PDK : 3’-phosphoinositide-dependent kinase PEM : progéniteur érythro-myéloïde PEr : progéniteur érythroïde PGM : progéniteur granulo-myéloïde PI-3K : phosphatidylinositol-3 kinase PINCH : particularly interesting new cysteine-histidine rich protein PKB : protein kinase B = Akt PLC : progéniteur lymphoïde commun PMc : progéniteur mégaryocytaire PMC : progéniteur myéloïde commun PME-1 : phosphatase methylesterase 1 pO2 : pression en oxygène PP2A : protein phosphatases 2A Pro-NK : pro-natural killer PPR : PTH/PTHrP receptor PRNK : Pyk2-related non-kinase PSGL-1 : P-selectin glycoprotein-1 Ptc : patched PTEN : phosphatase and tensin homologue PTH : parathyroid hormone PTHrP : PTH-related protein PTP : protéines tyrosine phosphatases Pyk2 : proline-rich tyrosine kinase 2 RAFTK : related adhesion focal tyrosine kinase RE : réticulum endoplasmique RI : récepteur à l’insuline RIP : receptor-interacting protein ROS : reactive oxygen species RTK : récepteur à activité tyrosine kinase SAPK : stress-activated protein kinase SCF : Stem cell factor SDF-1 : stromal-cell-derived factor 1 ser : sérine SFK : Src-family kinases sFRP : secreted frizzled related protein SH2 : Src-homology-2 Shh : Sonic hedgehog siRNA : small interfering RNA Smo : smoothened SNO : spindle shape N-cadherin+ osteoblast SOD : superoxide dismutase SOS : son-of-sevenless SP : side population TCF/LEF : T cell factor / lymphocyte-enhancer-binding factor TGFβ : transforming growth factor-β TGFR : transforming growth factor receptor

9

Abréviations

TLR : Toll-like receptor Tn-C : ténacine-C TNF : tumor necrosis factor tyr : tyrosine VCAM : vascular cell adhesion molecule VDAC : voltage dependent anion channel VE-cadhérine : cadhérine endothéliale vasculaire VEGF : vascular endothelial growth factor VIH : virus de l’immunodéficience humaine VLA : very late antigen Vn : vitronectine VWF : facteur von Willebrandt Wnt : wingless

10

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

11

Revue bibliographie Chapitre I Les hématopoïèses normale et leucémique

Chapitre I : L’hématopoïèse physiologique versus

l’hématopoïèse leucémique

A. L’hématopoïèse normale ou physiologique

La production permanente de cellules sanguines par la moelle osseuse (MO) est

essentielle au transport de l’oxygène par les hématies, à l’hémostase par les plaquettes et aux

réponses immunes, ainsi qu’aux fonctions réparatrices tissulaires probablement. Cette

pérénité de l’hématopoïèse, tout au long de la vie d’un organisme, est assurée par des cellules

souches.

1. Le concept de cellules souches

Les cellules souches sont définies comme des cellules qui ont la capacité de se

perpétuer elles-mêmes via le processus d’autorenouvellement et de générer des cellules

matures d’un tissu particulier via la différenciation. Dans la plupart des tissus, les cellules

souches sont rares. A cause de cela, elles doivent être identifiées et soigneusement purifiées

afin d’étudier leurs propriétés. Chaque tissu de l’organisme adulte possèderait donc des

cellules souches spécifiques, mais leur identification n’a été réalisée que dans peu de cas. A

l’heure actuelle, elles ont été mises en évidence dans le système hématopoïétique, le cerveau,

la peau, l’intestin (Weissman I.L. et al., 2001), le sein, la prostate et identifiées

potentiellement dans le pancréas et le foie (Burke Z.D. et al., 2007). Les cellules souches de

la MO (les cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses), de l’intestin et du sein

présentent des marqueurs spécifiques, mais les études de transcriptome et de protéome

montrent que certaines familles de gènes/protéines sont exprimées dans toutes ces cellules

souches. Or, ces gènes et ces protéines sont notamment en relation avec l’adhésion, l’hypoxie

et le métabolisme, et régulent donc un contexte microenvironnemental nécessaire pour la

pérénité des cellules souches (Unwin R.D. et al., 2006), bien que les niches tissulaires

correspondantes soient différentes. Les cellules souches (notamment mésenchymateuses) ont

le potentiel d’être utilisées en thérapie cellulaire dans le futur, mais seules les cellules souches

12


hématopoïétiques (CSH) - cellules souches les mieux caractérisées (Kondo M. et al., 2003) -

ont déjà été largement utilisées dans le cadre de greffe de MO.

2. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Les CSH ont été originellement identifiées fonctionnellement par Till et McCulloch,

par leur transplantation dans une souris irradiée permettant ainsi d’obtenir des colonies dans

la rate, appelées CFU-S (Colony forming unit-spleen), constituées de plusieurs lignées

cellulaires et correspondant chacune à une cellule souche injectée au départ (Becker A.J. et

al., 1963). Les CSH représentent 0,01 à 0,05 % des cellules de la MO. C’est une petite

population cellulaire responsable de la production de toutes les lignées sanguines et donc du

maintien de l’homéostasie au cours de la vie d’un individu, grâce à diverses propriétés

spécifiques : la quiescence à long terme, une forte résistance au stress,

l’autorenouvellement, la multipotence et la division asymétrique.

La balance entre la quiescence et la prolifération des CSH est vraisemblablement critique pour

l’hématopoïèse à long terme, pendant toute la durée de vie d’un adulte, et dépend des besoins

de l’organisme au niveau du système sanguin ou immunitaire (Glimm H. et al., 2000 ;

Passegue E. et al., 2005). La prolifération des CSH entraîne soit un autorenouvellement

simple permettant de maintenir leur nombre et leur multipotence, soit une division

asymétrique qui engendre à la fois une CSH identique à la CSH mère (par le processus

d’autorenouvellement), et une cellule plus mature qui sort de la niche permettant ainsi son

expansion et sa perte de multipotence. Face à un stress hématologique, tel qu’une hémorragie,

une infection ou une exposition à des agents cytotoxiques, les CSH doivent reconstituter tout

le système sanguin de l’organisme, ce qui provoque leur sortie de quiescence, suivie de leur

expansion et leur différenciation en tous les lignages du sang par ce processus de division

asymétrique. Or, pour proliférer et donc entrer dans le cycle cellulaire, les CSH doivent sortir

de la niche et donc perdre leur capacité de se greffer à la niche. En effet, lors de la division

asymétrique, une polarité s’installe dans la niche au niveau des contacts adhésifs et semble

essentielle pour cette maturation des CSH. De plus, il a été récemment prouvé que ce

mécanisme de division asymétrique est caractérisé par une répartition génique différente de

celle constatée pour la CSH quiescente, grâce à une puce à ADN du transcriptome humain

(Wagner W. et al., 2004).

13


Le compartiment des CSH peut être divisé en trois populations différentes : (i) les

CSH à l’autorenouvellement à long terme (CSH à long terme ou CSH-LT), seules capables de

péréniser l’hématopoïèse durant toute la vie d’un organisme, (ii) les CSH à

l’autorenouvellement à court terme (les CSH à court terme ou CSH-CT), qui sont un peu plus

différenciées que les précédentes et donc ne peuvent reconstituer l’hématopoïèse que pendant

une durée limitée (quelques semaines), et (iii) les progéniteurs multipotents sans potentiel

d’autorenouvellement détectable (Morrison S.J. & Weissman I.L., 1994 ; Morrison S.J. et al.,

1997). Ces populations constituent un lignage dans lequel les CSH à long terme donnent

naissance aux CSH à court terme, qui donnent lieu à leur tour aux progéniteurs multipotents

(Morrison S.J. et al., 1997) (figure 1).

Figure 1 : Les cellules souches hématopoïétiques. Le compartiment des CSH se compose de trois populations cellulaires : les CSH à long terme avec un fort pouvoir d’autorenouvellement (flèche rouge pleine), les CSH à court terme avec un plus faible pouvoir d’autorenouvellement (flèche rouge en pointillés) et les progéniteurs multipotents sans ce potentiel d’autorenouvellement mais plus actifs mitotiquement. Ce sont les CSH-LT qui permettent de reconstituer une hématopoïèse à long terme, lors d’une greffe de MO dans une souris NOD-SCID (Nonobese diabetic - Severe combined immunodeficiency) au préalable irradiée, alors que les CSH-CT et les progéniteurs multipotents reconstituent l’hématopoïèse de souris irradiées pour moins de huit semaines. (D’après Reya T. et al., 2001).

Actuellement, il existe plusieurs méthodes pour isoler et purifier des CSH humaines ou

murines (Bonnet D., 2005). A partir de la MO de souris, on peut réaliser un tri cellulaire se

composant de plusieurs étapes. D’abord, par l’utilisation de nanoparticules ferro-magnétiques,

une sélection négative sur le lignage suivie d’une sélection positive sur le marqueur de surface

Sca1 est effectuée, puis grâce à un trieur cellulaire (FACS), les cellules positives pour le

récepteur c-Kit sont isolées. Cette technique permet donc d’obtenir des cellules LSK (Lin-

Sca1+ c-Kit+), considérées comme les CSH murines (voir la partie suivante Des souris et des

14


hommes). En ce qui concerne les CSH humaines, une sélection positive sur le marqueur de

surface CD34 puis une négative sur le CD38, par l’utilisation également de nanoparticules

ferro-magnétiques, permet d’isoler des cellules hématopoïétiques immatures CD34+ CD38-.

Pour enrichir cette population en CSH, d’autres tris complémentaires peuvent être réalisés sur

d’autres marqueurs de surface, considérés comme spécifiques de la souchitude (CD90,

CD123, CD133, ..). Une autre procédure, pour purifier des CSH à partir de la MO humaine,

est basée sur la capacité de ces cellules à effluer un composé coloré fluorescent, le Hoechst

33342. Les cellules faiblement colorées par le Hoechst 33342, ainsi isolées, sont appelées la

«side population» (SP) et ont été montrées comme ayant le même phénotype que des cellules

Lin- Sca1+ CD34-, indépendamment identifiées dans le compartiment des CSH adultes

murines (Pearce D.J. et al., 2004). Enfin, une autre méthode a été développée à partir de

l’utilisation de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH), une enzyme cytosolique qui est

responsable de l’oxydation des aldéhydes intracellulaires. Des taux élevés d’ALDH ont été

constatés dans les cellules progénitrices murines et humaines, comparés aux autres cellules

hématopoïétiques (Hess D.A. et al., 2004).

2.1. La quiescence et la résistance au stress des CSH

a). La quiescence des CSH

Les CSH adultes existent dans un état quiescent, dans la niche médullaire (Morrison S.

J. & Weissman I. L., 1994 ; Bradford G.B. et al., 1997 ; Cheshier S.H. et al., 1999). Le

maintien de la quiescence des CSH implique à la fois des mécanismes extrinsèques et

intrinsèques. Ainsi, un nombre de gènes qui codent pour des régulateurs du cycle cellulaire

tels que p21cip1/waf1, p27Kip1, β-caténine/axine, cycline D1, PTEN (Phosphatase and tensin

homolog), c-Myc et MEF/ELF4 (Cheng T. et al., 2000a ; Cheng T. et al., 2000b ; Wilson A.

et al., 2004 ; Walkley C.R., 2005 ; Zhang J. et al., 2006 ; Lacorazza H.D. et al., 2006), ont été

montrés comme régulant les programmes intrinsèques de quiescence des CSH. Par exemple,

chez des souris déficientes en p21cip1/waf1 (p21-/-), régulateur du point de contrôle (checkpoint)

G1 et inhibiteur de cdk (cyclin-dependent kinase), la prolifération et le nombre absolu de CSH

augmentent dans des conditions homéostasiques normales (Cheng T. et al., 2000a). Au

contraire des souris p21-/-, le nombre des CSH est normal dans les souris déplétées pour le

gène de la protéine p27Kip1 (p27-/-), alors que ces souris ont une augmentation du nombre de

cellules progénitrices hématopoïétiques (Cheng T. et al., 2000b). Ainsi, les deux inhibiteurs

de cdk, p21 et p27 gouvernent plus spécifiquement la quiescence des cellules souches et des

progéniteurs hématopoïétiques, respectivement.

15


De plus, les interactions entre les CSH et leur microenvironnement médullaire dans

des zones anatomiquement et fonctionnellement spécifiques, appelées « niches » (un

paragraphe sera consacré à celle de la MO ultérieurement), ont permis de faire avancer les

connaissances dans le maintien de la quiescence des CSH (Li L. & Xie T., 2005). En effet,

comme les CSH ont besoin de se détacher de la niche où elles sont maintenues dans un état

quiescent pour entrer en division asymétrique et en expansion, il semble donc que

l’interaction des CSH avec le microenvironnement médullaire et le maintien de l’état de

quiescence soient étroitement interconnectés. Ainsi, on peut suggérer que les signaux

extrinsèques de la niche hématopoïétique, tels que les BMP (bone morphogenic proteins), le

calcium (Ca2+), les ligands Notch, et l’angiopoïétine-1 (Ang-1) (Calvi L.M. et al., 2003 ;

Zhang J. et al., 2003 ; Arai F. et al., 2004 ; Adams G.B. et al., 2006), et les interactions

adhésives entre la matrice extracellulaire (MEC) médullaire et les CSH (Jiang Y. et al., 2000)

pourraient réguler de façon harmonieuse l’état quiescent des CSH. Malgré tout, les

mécanismes coordonnant la régulation du cycle cellulaire des CSH restent obscurs.

De façon intéressante, les interactions entre les CSH et leur microenvironnement

reposent sur une polarisation et une organisation du cytosquelette, qui peuvent influencer

l’entrée cellulaire en mitose et son déroulement. L’équipe de Zheng s’est intéressée à Cdc42,

un membre de la famille des GTPase Rho, exprimée de façon ubiquitaire et impliquée dans la

régulation de multiples fonctions cellulaires, comme la polymérisation de l’actine, l’adhésion

cellule-cellule ou cellule-MEC, et la transcription génique (Etienne-Manneville S. & Hall A.,

2003). Lors d’expériences préliminaires, ils ont montré, dans un modèle murin de gain

d’activité de Cdc42, que l’augmentation constitutive des formes de Cdc42-GTP entraînait une

apoptose accrue des progéniteurs hématopoïétiques, la désorganisation de la structure de

l’actine et un défaut dans la prise de la greffe sans affecter le statut du cycle cellulaire (Wang

L. et al., 2006). Grâce à un modèle murin d’invalidation conditionnelle du gène Cdc42 dans

les cellules hématopoïétiques, cette équipe a également mis en évidence le rôle de Cdc42 dans

le maintien de la quiescence des CSH et dans leur localisation au sein de la niche médullaire.

Il est aussi montré que Cdc42 régule l’expression d’un grand nombre de régulateurs clés du

cycle cellulaire (incluant c-Myc et p21Cip1), de molécules d’adhésion cellulaires (telles que

l’intégrine β1 et la N-cadhérine) et la structure de l’actine (Yang L. et al., 2007 ; Yang L. &

Zheng Y., 2007). Par contre, leurs résultats prouvent que Cdc42 n’est pas nécessaire à la

survie des CSH. Quant à Rac1 et Rac2, deux autres membres de la famille des GTPases Rho,

elles sont importantes pour la rétention des CSH dans la niche hématopoïétique et pour leur

16


survie et leur progression dans le cycle cellulaire, mais elles ne sont pas impliquées dans ce

maintien de l’état de quiescence des CSH (Cancelas J.A. et al., 2005).

b). La résistance au stress des CSH

C’est grâce à leur état quiescent et à leur capacité à métaboliser les radicaux oxygénés,

que les CSH peuvent résister à différents stress microenvironnementaux de la niche

hématopoïétique et ainsi assurer le processus de l’hématopoïèse, tout au long de la vie des

individus. Or, dans la CSH-LT quiescente, le suppresseur de tumeur PTEN est actif et réprime

la signalisation PI-3K (phosphatidylinositol-3 kinase)/Akt (appelée aussi PKB) conduisant à

l’inhibition ou à l’activation des composés distaux, tels que mTOR et FoxO (Forkhead box

subgroup O), respectivement (figure 2).

Figure 2 : Régulation de la quiescence des CSH par PTEN, FoxO et ATM. Le suppresseur de tumeur PTEN (Phosphatase and tensin homolog) contrôle les facteurs de transcription FoxO (Forkhead box subgroup O) et ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Même s’il n’existe encore aucun lien expérimental entre ces deux protéines, FoxO et ATM sont, l’une comme l’autre, capables de promouvoir la détoxification des ROS (reactive oxygen species), et d’inhiber le cycle cellulaire des CSH. Tous ces mécanismes permettent donc de maintenir les CSH en quiescence. (D’après Coffer P.J. & Burgering B.M.T., 2007).

17


Or, les facteurs de transcription FoxO actifs programment les CSH à rester quiescentes par

une répression du cycle cellulaire et une induction de la quiescence, mais aussi permettent

leur survie face à un stress oxydant, en les orientant vers la néoglucogenèse et un métabolisme

des acides gras, avec élimination des reactive oxygen species (ROS). Bien qu’aucun lien entre

FoxO et ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) n’ait encore été découvert expérimentalement,

ATM a été aussi impliquée dans la fonctionnalité des CSH, en ce qui concerne leur entrée

dans le cycle cellulaire et la concentration intracellulaire en ROS (figure 2).

PTEN a été démontrée comme régulant le maintien des CSH, à travers une restriction

de leur prolifération (Yilmaz O.H. et al., 2006 ; Zhang J. et al., 2006). En effet, ces deux

équipes ont montré que, dans des souris invalidées pour PTEN, la prolifération des CSH était

augmentée et le compartiment souche se réduisait progressivement et de façon très

importante. L’ablation de PTEN provoque, en outre, la phosphorylation et l’inhibition des

isoformes de FoxO, grâce à l’activation accrue d’Akt/PKB, permettant ainsi au stress oxydant

de s’installer de manière permanente. Ces données sont très intéressantes, car PTEN est située

en amont des facteurs de transcription FoxO et ATM.

En absence de stimulation par des facteurs de croissance (notamment par la voie

insuline/PI-3K/Akt), ou dans des conditions de stress, les facteurs de transcription de la

famille FOXO se trouvent dans le noyau et entraînent l’expression de gènes impliqués dans

l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose et la résistance au stress (Tothova Z. & Mercher T.,

2007). A l’heure actuelle, il a été démontré par plusieurs équipes que selon le type de stress,

déprivation en nutriments et/ou blocage de la voie insulinique, le type de FOXO activé est

différent, ainsi que les gènes des superoxide dismutase (SOD), cibles de FOXO impliquées

dans la détoxification des ROS (Kops G.J. et al., 2002 ; Essers M.A. et al., 2005). Les FOXO

(pour les gènes humains ou FoxO pour les formes murines) représentent une sous-famille des

facteurs de transcription Forkhead et sont remarquablement conservés de la levure à

l’homme. Cette famille comporte quatre membres principaux chez les mammifères, identifiés

comme des orthologues de la protéine DAF-16 (Dauer formation defective) de

Caenorhabditis elegans : FOXO1 (FKHR), FOXO3a (FKHRL1), FOXO4 (AFX), FOXO6.

Seuls FOXO1, FOXO3a et FOXO4 sont exprimés de façon ubiquitaire, ont des rôles

partiellement redondants, et ont été étudiés dans le système hématopoïétique (Anderson M.J.

et al., 1998 ; Furuyama T. et al., 2000 ; Biggs W.H. et al., 2001). Ainsi, pour s’affranchir de

cette redondance partielle, Tothova et al. ont réalisé récemment l’invalidation conditionnelle

simultanée des gènes FoxO1, FoxO3a et FoxO4 (Tothova Z. et al., 2007), dans le système

hématopoïétique de souris adultes. Les souris déficientes en FoxO (FoxO1/3/4- /-) montrent

18


notamment une expansion du lignage myéloïde et une diminution marquée du compartiment

LSK (lignage négatif Lin-, Sca1+ , c-Kit+), qui contient les populations de CSH-CT et CSH-

LT. La MO déficiente en FoxO a un défaut dans l’activité de repopulation à long terme

(expériences de greffe de MO), ce qui corrèle avec un épuisement des capacités

d’autorenouvellement des CSH, suite à d’intenses cycles de divisions cellulaires, et de leur

apoptose massive due à une accumulation intracellulaire de ROS. De plus, un traitement in

vivo avec un agent anti-oxydant, la N-acétyl-L-cystéine (NAC), résulte en une réversion du

phénotype des CSH déficientes en FoxO, s’accompagnant d’une inactivation de la Mitogen

activated protein kinase (MAPK) p38. Les protéines FoxO, et notamment FoxO3a (Yamazaki

S. et al., 2006), jouent donc un rôle majeur dans la réponse au stress oxydatif physiologique et

par conséquent participent de manière active dans le maintien de la quiescence et la résistance

au stress du compartiment des CSH, une fonction nécessaire pour leur potentiel de

régénération à long terme.

Nous avons vu précédemment que les facteurs de transcription FOXO exercent des

effets sur le devenir des CSH, qui semblent liés à une augmentation du stress oxydatif (c’est-

à-dire des ROS) dans les CSH, résultant d’un défaut d’expression des gènes normalement

impliqués dans leur détoxification. De plus, dans cette étude, ils ont observé que l’expression

d’ATM et d’une de ses cibles, p16INK4a, est modifiée dans les souris déficientes en FoxO

(souris FoxO1/3/4-/-), suggérant que le facteur ATM pourrait être une cible de FoxO (Tothova

Z. et al., 2007), bien qu’aucun lien direct entre les deux n’ait été décrit à ce jour. Or, l’équipe

d’Ito a montré précédemment que l’inhibition du stress oxydant par ATM est nécessaire à

l’autorenouvellement des CSH. En effet, dans cette étude, les auteurs nous révèlent qu’ATM a

un rôle essentiel dans la capacité de reconstitution des CSH, mais n’est pas importante pour la

prolifération ou la différenciation des progéniteurs (Ito K. et al., 2004). En outre, des souris

déficientes pour ATM (souris ATM-/-) âgées de 24 semaines montrent une défaillance de la

MO résultant d’un défaut dans la fonction des CSH qui est associé à une concentration élevée

de ROS et à une activation de p38. Or, dans ces études, un traitement avec des agents anti-

oxydants, tels que la NAC et la catalase, ou avec un inhibiteur de la MAPK p38, restaure la

capacité de reconstitution d’une hématopoïèse des CSH ATM-/-, en empêchant la défaillance

de la MO, indiquant que l’inactivation de p38 protège les CSH contre la perte de leur capacité

d’autorenouvellement induite par les ROS (Ito K. et al., 2004 ; Ito K. et al., 2006). Grâce à

ces résultats, on peut en conclure que la capacité d’autorenouvellement des CSH dépend de

l’inhibition du stress oxydant par le biais d’ATM. De plus, tous ces travaux sur FoxO et ATM

montrent que ces protéines sont majeures pour maintenir des faibles taux intracellulaires

19


d’oxydants dans les CSH et suggèrent donc qu’elles joueraient un rôle essentiel dans la

prévention du vieillissement prématuré.

Au vu de ces résultats, prouvant que PTEN, FoxO et ATM sont nécessaires à la quiescence

des CSH, au maintien de leur pool et à leur résistance au stress, et notamment au stress

oxydant par des mécanismes d’élimination des ROS, nous avons résumé, dans la figure 3, les

effets des invalidations géniques de ces trois protéines sur le devenir des CSH murines.

Figure 3 : Rôles de PTEN, FoxO et ATM sur la quiescence/résistance au stress des CSH murines, démontrés par des invalidations de ces gènes chez la souris.

2.2. L’autorenouvellement des CSH

A l’opposé de l’état de quiescence/résistance au stress des CSH, l’autorenouvellement

les fait basculer dans un état dynamique de prolifération, impliquant des acteurs de

signalisation spécifiques. Ce processus est une division cellulaire permettant d’aboutir à la

formation d’au moins une cellule fille, identique à la CSH mère, c’est-à-dire ayant conservé

intactes ses capacités d’autorenouvellement et de multipotence.

Bien que les propriétés phénotypiques et fonctionnelles des CSH aient été largement abordées

(Weissman, I. L., 2000), la question cruciale de savoir comment l’autorenouvellement est

régulé reste sans réponse précise. Dans la plupart des cas, les combinaisons de facteurs de

20


croissance qui peuvent induire une prolifération efficace ne peuvent empêcher la

différenciation des CSH en culture à long terme. Bien que des progrès aient été réalisés dans

l’identification des conditions de culture qui maintiennent l’activité des CSH (référencées, par

exemple, dans les papiers de Miller C. L. & Eaves C. J., 1997 ; Ema H. et al., 2000 ;

Sauvageau G. et al., 2004), des difficultés ont été constatées pour identifier les combinaisons

de facteurs de croissance qui provoquent une expansion significative des CSH ayant conservé

leur activité de régénération hématopoïétique après une greffe. Ainsi, toutes ces expériences

ont permis de déterminer que le granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-

CSF) joue un rôle majeur - tout comme l’interleukine-3 (IL-3) - dans la survie, la prolifération

et la différenciation des CSH multipotentes en cellule souches plus matures et restreintes en

terme de lignages (Olofsson T.B., 1991). Quant à l’insuline-like growth factor (IGF), ce

facteur de croissance permet d’inhiber l’apoptose programmée des progéniteurs

hématopoïétiques, de façon dépendante de la PI-3K, et l’expression de son récepteur est

nécessaire pour la survie et la prolifération de ces cellules. Donc, IGF-1 joue à la fois un rôle

de facteur de croissance et de survie pour enrichir les populations de progéniteurs

hématopoïétiques primaires (Kelley K.W. et al., 1998). Cependant, l’équipe de Weissman a

montré que les acteurs du cycle cellulaire responsables de l’autorenouvellement des CSH sont

différents de ceux qui régulent la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques (Passegue

E. et al., 2005).

Des voies impliquées dans l’embryogenèse, les voies morphogènes Wnt, Sonic

hedgehog (Shh) et Notch, se sont révélées comme essentielles dans le contrôle de la balance

quiescence/autorenouvellement des CSH (figure 4). Grâce à des carrefours de signalisation

communs (voir plus loin le chapitre sur la glycogène synthase kinase 3β), ces voies vont

dialoguer et influencer les CSH vers un phénotype quiescent (via la voie Notch) ou

d’autorenouvellement (via les voies Wnt et Shh).

Des études contradictoires ont examiné le rôle de Notch dans l’autorenouvellement des CSH.

Ainsi, l’activation de Notch dans les CSH en culture via le ligand Jagged-1 augmente la

quantité des progéniteurs primitifs qui peut être observée in vitro et in vivo, suggérant que

l’activation de la voie Notch promeut l’autorenouvellement des CSH, ou au moins la

maintenance de leur multipotentialité (Varnum-Finney B. et al., 2000 ; Karanu F. N. et al.,

2000). A l’inverse de ces résultats, une autre équipe a analysé l’effet fonctionnel de la voie de

signalisation Notch sur des cellules progénitrices hématopoïétiques humaines, par

l’expression ectopique de Notch 1 constitutivement actif conduisant à un arrêt du cycle

cellulaire et à l’apoptose des cellules CD34+ (Chadwick N. et al., 2007).

21


Figure 4 : Les trois grandes voies morphogènes régulant l’autorenouvellement des CSH. La voie Wnt (à gauche) est activée lorsqu’un ligand Wnt s’associe au récepteur Frizzled (Fzd) couplé aux récepteurs LRP5/6, inhibant ainsi GSK3β qui ne peut plus exercer son rôle négatif sur le facteur de co-transcription, la β-caténine (β-cat), permettant alors à cette dernière d’induire la transcription, avec LEF/TCF (Lymphocyte enhancer factor/T cell factor), de gènes impliqués dans l’autorenouvellement des CSH, tels que la cycline D1. Pour la voie Sonic Hedgehog (Shh) (au milieu), la liaison du ligand Hedgehog sur le récepteur Patched (Ptc) lève l’inhibition que ce dernier exerçait sur le récepteur Smoothened (Smo) et permet ainsi au facteur de transcription Gli d’aller dans le noyau et d’induire la transcription de plusieurs gènes dont, entre autres, celui de Ptc. Pour activer la voie Notch (à droite), le récepteur Notch interagit avec son ligand (Delta 1,2 et 4 et Jagged 1 et 2), ce qui entraîne le clivage et la libération du domaine intracellulaire Notch 1 (NICD pour Notch intracellular domain) dans le noyau, qui en se liant au facteur de transcription CBF-1, permet la transcription de gènes comme celui de la protéine Hes-1. (D’après Reya T. et al., 2001).

Les auteurs expliquent cette contradiction des résultats par le fait que des taux élevés de

Notch actif (comme ce qui est observé lors de leur transfection rétrovirale) résulteraient en

une apoptose, alors que des taux faibles entraîneraient l’autorenouvellement des CSH.

Quant à la voie Shh (cette voie sera plus détaillée, en terme de signalisation, dans le chapitre

« La glycogène synthase kinase 3β »), elle a aussi été impliquée dans la régulation de

l’autorenouvellement par la constatation expérimentale que les populations hautement

enrichies en CSH humaines (Lin- CD34+ CD38-) arboraient un autorenouvellement accru en

réponse à la stimulation de la voie Shh in vitro (bien qu’en combinaison avec d’autres

facteurs de croissance), et ce via la régulation des BMP (Bhardwaj G. et al., 2001).

Comme nous l’avons abordé précédemment, les interactions adhésives, les facteurs de

croissance et les trois voies morphogènes jouent un rôle critique dans le contrôle de la balance

entre quiescence et autorenouvellement des CSH. Une de leurs cibles communes est le facteur

22


de transcription c-Myc (Satoh Y. et al., 2004). Ainsi, Wilson et al. proposent un modèle de

régulation de l’hématopoïèse par c-Myc (figure 5 ; Wilson A. et al., 2004).

Figure 5 : Modèle hypothétique de régulation de l’hématopoïèse par c-Myc. (a) Le système hématopoïétique physiologique (sauvage). (b) La déficience en c-Myc dans les CSH-LT. (c) La surexpression de c-Myc dans les CSH-LT. (D’après Wilson A. et al., 2004).

Au cours de l’hématopoïèse, une sous-population des CSH-LT expriment c-Myc, entraînant

ainsi une différenciation en CSH-CT puis, après la perte de la capacité de

l’autorenouvellement, en cellules plus différenciées. Au début de la différenciation terminale,

l’activité de la protéine c-Myc diminue pour permettre la sortie du cycle cellulaire et la

progression vers la différenciation terminale. Dans des cas de déficience en c-Myc, les CSH-

LT ne cessent de s’autorenouveler et ne peuvent plus se différencier, ce qui provoque leur

accumulation dans la niche endostéale. De plus, les progéniteurs en amplification transitoire

stoppent leur expansion. Par contre, quand c-Myc est surexprimée, les CSH-LT se

23


différencient au détriment de l’autorenouvellement, créant ainsi un épuisement en cellules

souches et donc à terme la perte de toutes les cellules hématopoïétiques.

De façon intéressante, les modulations d’expression de c-Myc dans les CSH ont un impact

totalement différent, selon que les cellules soient traitées in vitro ou in vivo. Cela signifie

donc que c-Myc entretient un dialogue important avec le microenvironnement des CSH. Son

impact, notamment sur la régulation de l’expression des molécules d’adhésion, sera détaillée

dans la partie Le rôle du microenvironnement médullaire.

Enfin, la régulation épigénétique, qui est réalisée via des facteurs modulant la structure

de la chromatine, joue un rôle clef dans le contrôle de l’autorenouvellement. Ainsi, une

protéine Polycomb-like, Bmi-1, s’est révélée comme nécessaire pour le maintien de

l’autorenouvellement des cellules souches et notamment des CSH (Park I.K. et al., 2003). Or,

le proto-oncogène Bmi-1, un des composants clés du complexe répresseur Polycomb 1

(PRC1) - impliqué dans le maintien stable de gènes répresseurs -, est exprimé dans les CSH

murines et humaines et est nécesssaire à la répression des gènes codant pour des inhibiteurs

des cdk, comme p16Ink4a (responsable sinon du blocage du cycle cellulaire et donc de l’arrêt

de prolifération). En effet, dans des souris déficientes pour Bmi-1, aucun autorenouvellement

des CSH adultes n’est détecté et l’expression de cet inhibiteur du cycle cellulaire, p16Ink4a,

dans des CSH normales, provoque un arrêt de leur prolifération (Park I.K. et al., 2003).

a). La voie morphogène Wnt

Les régulations croisées entre les voies morphogènes et les voies adhésives jouent très

probablement un rôle clef dans le contrôle de la balance quiescence/autorenouvellement des

CSH. Ce dialogue perpétuel a été partiellement étudié, dans différents modèles, entre la voie

de signalisation Wnt et les voies d’adhésion en aval des intégrines ou des cadhérines. Voilà

pourquoi, il nous semble nécessaire de détailler ici plus longuement la voie Wnt, ainsi que ses

antagonistes.

Les protéines Wnt sont des molécules hydrophobes de signalisation intercellulaire

(Nusse R. & Varmus H.E., 1992) qui contrôlent le développement de plusieurs organismes

(Cadigan K. M. & Nusse R., 1997). La voie morphogène Wnt a aussi été montrée comme

régulant à la fois l’autorenouvellement et l’oncogenèse, dans différents organes, et notamment

dans le système hématopoïétique (Taipale J. & Beachy P.A., 2001 ; Reya T. et al., 2003). Les

protéines solubles Wnt peuvent être produites par les CSH elles-mêmes, aussi bien que par le

microenvironnement. Des études réalisées sur la MO humaine suggèrent que Wnt 2B, Wnt

5A, et Wnt 10B sont exprimées dans les cellules de la MO, alors que seule Wnt 5A est

24


exprimée dans les cellules CD34+ Lin- (population enrichie donc en progéniteurs et en CSH)

(Van Den Berg D. J. et al., 1998). Plusieurs travaux démontrent la capacité des ligands Wnt à

stimuler la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques de foie fœtal murin ou de MO

humaine (Austin T.W. et al., 1997 ; Van Den Berg D.J. et al., 1998) et l’autorenouvellement

des CSH (Willert K. et al., 2003). De plus, un traitement avec du milieu conditionné en Wnt

5A, chez des souris NOD-SCID (Nonobese diabetic - Severe combined immunodeficiency), a

permis d’augmenter la population des CSH de ces souris (Murdoch B. et al., 2003). Ce papier

démontre donc le rôle in vivo de Wnt sur la régulation du développement et de la fonction des

CSH, et ces résultats pourraient avoir un intérêt direct pour améliorer l’efficacité des greffes

chez les patients.

La voie Wnt/β-caténine régule la prolifération, l’adhésion, la morphologie, la

migration et les remodelages structuraux cellulaires. Cette voie se constitue des voies

canoniques, dites classiques, et non-canoniques, appelées alternes (figure 6). Les voies de

signalisation canoniques Wnt sont celles qui, en aval de la liaison d’un ligand Wnt sur son

récepteur Frizzled, jouent sur le devenir de la protéine β-caténine. Par contre, les voies Wnt,

qui n’incluent pas ce facteur de co-transcription, sont les voies Wnt appelées « alternes » ou

« non canoniques » (Kühl M. et al., 2001). Les composés majeurs des voies Wnt sont les

glycoprotéines Wnt, qui peuvent être codées par 19 gènes dans les génomes de Mammifères.

Elles sont sécrétées, subissent des modifications lipidiques et se lient aux récepteurs Frizzled

à la surface membranaire. Ces récepteurs sont couplés à d’autres récepteurs moléculaires, que

sont les lipoprotein related-receptor proteins 5/6 (LRP5/6).

En absence de ligand Wnt, la β-caténine est associée, dans le cytoplasme, au complexe

axine/APC (adematous polyposis coli)/GSK3β (Glycogen Synthase kinase 3β), où elle est

phosphorylée par GSK3β et la casein kinase I (CKI), ce qui entraîne ainsi son ubiquitination

par la β-transducin repeat-containing protein (βTrCP) et sa dégradation par le protéasome

26S (figure 6 ; Polakis P., 2002). L’activation de la voie Wnt/β-caténine canonique, par la

liaison d’un agoniste Wnt, tel que Wnt 1, Wnt 3A et Wnt 8 (appelés également Wnt

canoniques), permet de stimuler Dishevelled (Dsh) et Frequently arranged in T cell

lymphomas (FRAT), provoquant la libération de la β-caténine du complexe inhibiteur et

empêchant donc sa dégradation.

25


Figure 6 : Les voies Wnt canonique et alternes. La voie Wnt/β-caténine est la voie canonique, c’est-à-dire classique, tandis que les autres voies schématisées ici, telles que la voie du Ca2+ et la voie induisant la polarité planaire cellulaire, sont les voies Wnt alternes. La voie Wnt/β-caténine est activée par des agonistes, comme le ligand Wnt 3A. D’autres ligands, comme Wnt 5A et Wnt 11, peuvent dans certaines conditions entraîner l’activation de voies alternes, comme la voie du Ca2+ et la voie de polarité planaire cellulaire.

La β-caténine peut alors s’accumuler dans le cytoplasme de la cellule. Elle s’associe, au

niveau intracellulaire, à la membrane plasmique avec les cadhérines pour promouvoir

l’adhésion cellulaire et avec les microfilaments d’actine du cytosquelette, via l’α-caténine,

pour contrôler la forme cellulaire (Jamora C. & Fuchs E., 2002). La β-caténine peut aussi

entrer dans le noyau où elle active la transcription, avec les facteurs de co-transcription

LEF/TCF, de gènes impliqués dans la prolifération et l’autorenouvellement des CSH, comme

la cycline D1 (figure 6 ; Cadigan K.M. & Nusse R., 1997). La répartition entres ses

localisations membranaires et nucléaires n’est pas encore tout à fait bien comprise, mais

26


semble faire intervenir sa concentration cytoplasmique, son état de phosphorylation et ses

partenaires spécifiques.

Il existe de nombreuses voies Wnt alternes, et vraisemblablement d’autres sont encore

inconnues. Parmi ces voies non canoniques, nous pouvons citer et décrire la voie de la

polarité planaire cellulaire et celle du Ca2+. Ainsi, certains ligands Wnt, comme Wnt 5A,

peuvent inhiber la voie canonique, mais activer celle du Ca2+, via la protéine G

hétérotrimérique du récepteur Frizzled. Cela va permettre de stimuler la phospholipase C

(PLC) et donc d’augmenter la concentration en calcium, ce qui conduit à

l’autophosphorylation de la kinase II dépendante de la calmoduline (CAMKII), et finalement

à des processus cruciaux pour la cellule, comme l’adhésion dépendante du calcium. Quant à la

voie de la polarité planaire cellulaire, la liaison d’un Wnt non canonique, comme Wnt 5A ou

Wnt 11, active Dsh ce qui provoque l’activation de RhoA qui, par deux kinases différentes -

la Jun amino-terminal kinase (JNK) ou la Rho-kinase - , peut jouer sur les microfilaments

d’actine du cytosquelette et réguler par conséquent la polarité cellulaire.

En utilisant des CSH de MO, l’équipe de Weissman a montré que la surexpression de

la β-caténine activée (acteur central de la voie de signalisation Wnt) accroît le pool de CSH

transplantables caractérisées à la fois par le phénotype (Thy1.1low Lin-/low Sca1+ c-kit+) et la

fonction (la capacité de reconstituer le système hématopoïétique in vivo) (Reya T. et al.,

2003). De plus, l’expression ectopique de l’axine, un inhibiteur de la β-caténine, conduit à

l’inhibition de la prolifération des CSH, à une augmentation de la mort des CSH in vitro, et à

une réduction de la reconstitution hématopoïétique in vivo. Enfin, le fait que certains acteurs

de la voie Notch soient sous la « houlette » de la β-caténine (Reya T. et al., 2003 ; Duncan

AW & Reya T., observation non publiée) indique qu’il pourrait exister une hiérarchie

moléculaire du contrôle de l’autorenouvellement des CSH.

Une équipe allemande, quant à elle, a montré qu’un inhibiteur des déacétylases des

histones, l’acide valproïque, permettait d’augmenter la prolifération et l’autorenouvellement

des CSH (Bug G. et al., 2005). Cet inhibiteur accélère la progression des CSH dans le cycle

cellulaire, qui s’accompagne d’une inhibition de p21cip-1/waf-1. De plus, il inhibe GSK3β par

phosphorylation sur sa sérine 9 (ser 9), ce qui induit une activation de la voie Wnt, ainsi

qu’une suractivation de HoxB4, un gène cible de la voie β-caténine et un facteur clé dans la

régulation de l’autorenouvellement et de la prolifération des CSH.

Ainsi, les ligands Wnt contribuent à l’autorenouvellement des CSH, mais aussi à celui

de cellules souches d’autres tissus (pour revue Reya T. & Clevers H., 2005). Or, leur action

27


est étroitement contrebalancée par l’existence d’antagonistes des voies canoniques et alternes

Wnt.

b). Les antagonistes de la voie Wnt

Outre les ligands Wnt, potentiellement antagonistes de la voie canonique de

signalisation Wnt, comme Wnt 4, Wnt 5A et Wnt 11 - qui activent les voies Wnt alternes et

sont nommés les Wnt non canoniques -, il existe des antagonistes extracellulaires de ces voies

(Kawano Y. & Kypta R., 2003). Ils peuvent être divisés en deux grandes classes de molécules

qui empêchent les interactions récepteur/ligand : (i) la première classe inclut la famille

secreted frizzled related protein (sFRP), le Wnt inhibitory factor 1 (WIF-1) et Cerberus, qui se

lient principalement aux protéines Wnt, altérant ainsi leur capacité de s’associer aux

récepteurs Frizzled/LRP5/6, et (ii) la seconde classe comprend certains membres de la famille

Dickkopf (Dkk), qui eux se lient aux co-récepteurs de Frizzled, que sont les LRP5/6. Donc, en

théorie, les antagonistes de la classe sFRP peuvent inhiber à la fois les voies Wnt canoniques

et alternes, tandis que ceux de la classe Dkk inhibent spécifiquement la voie classique.

Les sFRP, au nombre de huit, sont des antagonistes qui se lient directement aux

glycoprotéines Wnt. Une nomenclature existe seulement pour cinq d’entre eux, de sFRP1 à

sFRP5. Sur la base des homologies de séquence, sFRP1, 2 et 5 forment un sous-groupe, tout

comme sFRP3 et 4. Bien que les sFRP soient sécrétés, notamment par les cellules

leucémiques et les ostéoblastes (composés structurels et fonctionnels majeurs de la niche

médullaire), il a été rapporté que des sFRP synthétisés par des cultures cellulaires étaient

retrouvés dans la membrane plasmique et/ou dans la MEC. Des expériences ont permis de

montrer que durant le développement, les sFRPs pourraient ne pas fonctionner tout le temps

comme des antagonistes de la voie Wnt. De plus, ils sont très importants pour réguler la

croissance cellulaire, notamment en cas de cancers, où cette dernière fonction devient accrue

et non contrôlée pour les cellules tumorales.

La famille Dkk comprend quatre membres, de Dkk-1 à Dkk-4, et une protéine

apparentée à Dkk-3, appelée Soggy (Sgy) ou Dkk-11. Le membre de cette famille le plus

étudié est Dkk-1. Il pourrait être un important médiateur de l’apoptose induite par des stimuli

variés. En outre, en inhibant la voie Wnt canonique, après une inactivation suivie d’une

internalisation des LRP5/6, Dkk empêche la formation du complexe LRP5/6-Wnt-Frizzled.

Ceci entraîne la phosphorylation et la dégradation de la β-caténine, et donc l’inhibition de la

voie Wnt classique, alors que le complexe Wnt-Frizzled peut activer les autres voies alternes,

comme celle induisant la polarité planaire cellulaire.

28


2.3. La division asymétrique et la différenciation des CSH

Les CSH ont soit (i) la particularité de se reproduire à l’identique, c’est-à-dire de se

diviser en deux cellules filles tout à fait semblables à la cellule mère, c’est la division

symétrique, soit (ii) de donner une cellule fille identique à elles-mêmes (une autre CSH) et

une cellule fille qui est déjà plus différenciée et qui devient un précurseur avec une

prolifération plus rapide, par le processus de division asymétrique. En effet, les CSH doivent

subir la division asymétrique pour générer en même temps les cellules capables de supporter

l’hématopoïèse à long terme, et les cellules progénitrices des différents lignages sanguins

(figure 7 ; Ho A.D., 2005).

Figure 7 : Divisions symétrique et asymétrique des CSH dans le temps (t). Les CSH sont notées « S » sur cette figure. (a) Les CSH se divisent de façon symétrique pour se reproduire à l’identique, permettant ainsi un repeuplement du pool de cellules souches : c’est la capacité d’autorenouvellement. (b) Certaines CSH vont ensuite se diviser de façon asymétrique, c’est-à-dire qu’une des cellules filles est l’identique de la CSH (même fonction de cellule souche), alors que l’autre cellule fille est une cellule différenciée qui devient un précurseur avec une prolifération plus rapide. (c) La fonction de cellule souche est perdue quand toutes les cellules filles se différencient en précurseurs avec des divisions rapides. (D’après Ho A.D. & Wagner W., 2007).

Plusieurs facteurs sont nécessaires et conditionnent le devenir d’une cellule, à savoir si

elle va s’autorenouveller ou se diviser asymétriquement. Ainsi, l’exposition à des signaux du

microrenvironnement, avant la mitose, peut contrôler cette division asymétrique de la cellule.

Un facteur externe, comme le contact avec le microenvironnement, peut aussi induire la

polarisation cellulaire et l’orientation du fuseau mitotique. Pour les CSH, les mécanismes

29


précis, par lesquels le microenvironnement contrôle la balance entre l’autorenouvellement et

la maturation, n’ont pas encore été définis. Il a été montré que les CSH primaires migrent

activement vers les cellules stromales de soutien et y adhèrent par leurs uropodes au niveau

du « trailing edge », qui correspond à l’arrière de la cellule (Wagner W. et al., 2007). Punzel

et al. ont démontré aussi que seul le contact direct cellule-cellule de cellules primitives CD34+

CD38-, avec une cellule souche de soutien du microenvironnement médullaire, augmentait le

nombre de divisions asymétriques à la fois des progéniteurs très immatures et de ceux

engagés dans un lignage (Punzel M. et al., 2003). Enfin, Wagner et al. ont déterminé par des

profils d’expression génique globale des CSH que le contact avec des cellules stromales

entraînait l’accroissement de l’expression de gènes qui régulent l’adhésion et les

réarrangements du cytosquelette, c’est-à-dire des protéines essentielles à l’ancrage des CSH

aux cellules du microenvironnement (comme les intégrines β1) et à une bonne orientation du

fuseau mitotique, respectivement (Wagner W. et al., 2005).

Les preuves expérimentales de cette division asymétrique par les CSH ont été

fournies, récemment, par l’équipe de Giebel, grâce à l’identification de quatre protéines qui

ségrègent différentiellement dans environ 20 % des cellules primitives hématopoïétiques

humaines, se divisant dans des cultures sans stroma (Beckmann J. et al., 2007). De plus, des

expériences fonctionnelles, basées sur des essais de clonogénicité et de différenciation, ont

permis de démontrer qu’environ 20 % des progéniteurs hématopoïétiques se sont divisés de

façon asymétrique, mettant à jour des voies de différenciation différentes pour les deux

cellules filles générées (Leary A.G. et al., 1984).

Un autre groupe a examiné la réplication des CSH humaines, en utilisant un système

de caméra en temps réel, et démontré que les divisions asymétriques des cellules CD34+ ont

vraiment lieu et ceci dans 30 % de ces cellules dites souches (Huang S. et al., 1999). Une des

cellules filles reste quiescente ou en division très lente, alors que l’autre se multiplie de façon

exponentielle pour donner naissance à des progéniteurs engagés et des colonies spécifiques

des différents lignages. Les divisions asymétriques ont significativement été trouvées plus

fréquemment parmi les cellules CD34+ CD38- (CSH) que dans les cellules CD34+ CD38+

(plus matures) (Huang S. et al., 1999). Ainsi, le potentiel de division asymétrique des CSH

serait sous contrôle intrinsèque, alors que la différenciation des cellules filles vers tel ou tel

lignage se ferait de façon stochastique.

La différenciation hématopoïétique (figure 8) est un processus qui est régulé par des

cytokines et des cellules du microenvironnement spécifiques.

30


Figure 8 : La différenciation hématopoïétique. Les CSH donnent naissance au progéniteur multipotent qui se divise en deux précurseurs, le progéniteur lymphoïde commun (PLC), qui donne naissance aux cellules Pro-B, Pro-T et Pro-NK, conduisant respectivement aux lymphocytes B, lymphocytes T et les cellules natural killer (NK), et le progéniteur myéloïde commun (PMC), qui donne naissance à deux autres précurseurs plus différenciés, le progéniteur granulo-myéloïde (PGM) et le progéniteur érythro-myéloïde (PEM), conduisant respectivement aux autres cellules de l’immunité (granulocytes et macrophages) et du sang (plaquettes, via le PMc pour progéniteur mégaryocytaire, et hématies, via le PEr pour progéniteur érythroïde). Quant aux cellules dendritiques, elles proviennent à la fois du PLC et du PGM. (D’après Reya T. et al., 2001).

Par exemple, Mayani et ses collaborateurs ont utilisé des cocktails de cytokines différents,

dans le milieu de culture, pour favoriser soit l’érythropoïèse [mast cell growth factor (MGF) +

interleukine-6 (IL-6) + IL-3 + érythropoïétine] soit la myélopoïèse [MGF + IL-6 + protéine de

fusion d’IL-3 et de GM-CSF + monocyte colony-forming stimulating factor (M-CSF) +

granulocyte colony-forming stimulating factor (G-CSF)] (Mayani H. et al., 1993). Ainsi,

31


après différentes études et expériences, il a été établi que les facteurs de croissance

spécifiques et indispensables au déroulement de la différenciation hématopoïétique sont l’IL-

3, le GM-CSF, le G-CSF, le stem cell factor (SCF) et l’érythropoïétine (EPO). Cependant,

d’autres études indiquent que ce ne sont probablement pas les molécules régulatrices solubles

qui influencent les cellules à s’engager dans la différenciation par rapport à

l’autorenouvellement (Huang S. et al., 1999).

Comme nous l’avons vu précédemment, l’expression du facteur de transcription c-

Myc est absente dans les CSH quiescentes, mais lorsqu’une sous-population des CSH-LT

l’exprime, cela entraîne leur différenciation. Or, c-Myc est capable de réprimer l’expression

de molécules adhésives, telles que les intégrines α2β1 et α5β1 et la N-cadhérine. Ainsi,

Wilson et al. ont proposé un modèle de régulation du devenir des CSH par l’adhésion à la

niche médullaire contrôlée par c-Myc (Wilson A. et al., 2004). Ce modèle propose que

lorsque c-Myc est fortement exprimé, les CSH, en réponse à un signal mitogène, génèrent

deux progéniteurs engagés qui sortent de la niche puisque leurs contacts adhésifs avec la N-

cadhérine et les intégrines α2β1 et α5β1 sont considérablement réprimés ; il y a donc

différenciation. Au contraire, quand c-Myc est inactif, suite à un signal mitogène, ces

molécules d’adhésion restent fortement exprimées ce qui retient les cellules filles dans la

niche conduisant ainsi à l’expansion des CSH ; c’est l’autorenouvellement. Par ailleurs, la

composition de la niche médullaire peut varier en terme de présence ou non de cellules

stromales, comme les adipocytes, les cellules endothéliales et les neutrophiles, ce qui peut

influencer la détermination du lignage hématopoïétique, lors de la différenciation d’une CSH.

De manière surprenante, des travaux récents ont permis de mettre en évidence que la

MO et les CSH pouvaient générer des tissus non hématopoïétiques. Par exemple, l’équipe de

Goff a identifié des marqueurs originaires de la MO dans des cellules hépatiques, suite à une

régénération hépatique, indiquant que des cellules souches de la MO avaient des capacités de

lignage cellulaire épithélial (Petersen B.E. et al., 1999). D’autres études ont révélé la

génération d’un phénotype neuronal (expression de protéines neuronales), suite à la

transplantation de MO dans un cerveau adulte, démontrant une plasticité remarquable des

tissus adultes avec une potentielle application en clinique (Brazelton T.R. et al., 2000 ; Mezey

E. et al., 2000). Cela suggère donc que les cellules hématopoïétiques pourraient avoir un

potentiel de différenciation plus important que celui qui était présumé auparavant. Ainsi,

plusieurs équipes ont émis comme hypothèse que les CSH étaient capables de se différencier

en un autre lignage que le lignage hématopoïétique pour lequel elles étaient programmées,

c’est la transdifférenciation. Mais, ce nouveau concept est à l’heure actuelle assez

32


controversé, car aucune étude ou technique actuelle ne permet véritablement de valider ce

mécanisme avec certitude. Certains scientifiques préfèrent donc parler de

transdétermination, terme plus approprié pour qualifier le passage d’un type cellulaire à un

autre, par rapport à celui de transdifférenciation.

2.4. Des souris et des hommes

Les CSH ont été isolées à partir de MO murine et humaine (Spangrude G. J. et al., 1988

; Morrison S. J. & Weissman I. L., 1994 ; Baum C. M. et al., 1992 ; Osawa M. et al., 1996).

Le domaine de la biologie des CSH a grandement avancé par l’identification de marqueurs de

surface et de régulateurs intrinsèques des CSH, grâce aux études génétiques sur les modèles

murins. Nos connaissances actuelles sur les régulateurs extrinsèques des CSH dérivent des

études limitées aux modèles murins (Calvi L.M. et al., 2003 ; Zhang J. et al., 2003).

L’estimation du nombre total de CSH chez la souris et chez l’homme sont de 1,1 à 2,2.104

cellules, soit 0,01 à 0,1 %, et de 2 à 5.104 cellules, soit 0,01 à 0,05 % des cellules de la MO,

respectivement.

Il existe donc plusieurs marqueurs de surface pour purifier spécifiquement les CSH et

obtenir ainsi une population très immature et pouvant être considérée comme assez pure. Ces

marqueurs sont différents suivant l’espèce (figure 9) : Lin- CD34+ CD38- CD90+ CD123+

CD133+ pour les CSH-LT humaines, et Lin- Sca1+ c-Kit+ (appelé compartiment LSK)

Thy1.1low Flk2- CD34- Slamf1+ pour les CSH-LT murines (Spangrude G. J. et al., 1988 ;

Osawa M. et al., 1996 ; Christensen J.L. & Weissman I.L., 2001 ; Kiel M.J. et al., 2005).

Cependant, il est à noter que bien que les différentes sous-populations de CSH ont été

fonctionnellement mises en évidence à un degré significatif chez la souris, ceci n’est pas le

cas dans le système humain. Ceci laisse donc à penser que les cellules définies comme les

CSH humaines par les marqueurs de surface cellulaire Lin- CD34+ CD38- CD90+ CD123+

CD133+ incluent probablement une ou plusieurs populations de progéniteurs multipotents.

Bien que le compartiment LSK soit enrichi en terme d’activité de « souchitude »

comparé à la MO entière (environ 1000 fois plus), la plus grande majorité des cellules LSK

sont des progéniteurs multipotents et seulement 1/30 des cellules LSK sont réellement des

CSH capables de repopulation multi-lignage à long terme (Bryder D. et al., résultats non

publiés). A cause de cela, des précautions doivent être prises quand des résultats sur l’activité

des CSH sont basés uniquement sur ce compartiment LSK (qui est le plus répandu dans la

littérature).

33


Figure 9 : Les marqueurs de surface des CSH humaines et murines. Suivant le stade des CSH, certains marqueurs de surface diffèrent dans leur taux d’expression, et ce notamment pour les CSH murines. (D’après Bryder D. et al., 2006).

Pour étudier le devenir des CSH humaines et les mécanismes impliqués, elles ont été

transplantées dans des souris réservoirs, les NOD-SCID, pour savoir le rôle précis du

microenvironnement médullaire, c’est-à-dire des molécules et des composants de la niche

hématopoïétique. Cependant, ces modèles murins humanisés ne sont pas assez puissants,

puisqu’ils sont constitués d’une niche spécifique des CSH murines, différente sur certains

aspects - qui seront abordés et discutés dans la prochaine partie - par rapport à celle de

l’homme.

B. Le rôle du microenvironnement médullaire

Il apparaît évident que les spécificités fonctionnelles des cellules souches et leur

pérénité indispensable requièrent un environnement particulier. Le premier exemple de niche

comme environnement spécialisé a été démontré pour les cellules souches des gonades de

Drosophila melanogaster (Xie T. & Spradling A.C., 2000) et de Caenorhabditis elegans. En

1978, Schofield émet l’hypothèse de l’existence de cellules à proximité des CSH, qui ont la

capacité d'exercer une influence - non négligeable - sur le fonctionnement des CSH (Schofield

34


R., 1978). Mais, ce n’est que très récemment que des travaux ont permis de mieux

comprendre les interactions entre les CSH et leur microenvironnement.

1. La niche hématopoïétique

Le mot « niche » signifie littéralement la maison du chien, cependant cette niche n’est

pas seulement un endroit, mais elle a une dimension fonctionnelle majeure.

1.1. La niche ostéoblastique ou endostéale

La niche des CSH se situe à un endroit très précis dans la MO, dans la région

endostéale de l’os trabéculaire, zone dynamique, à l’interface de la MO et de l’os (Nilsson

S.K. et al., 2001), zone où l’os subit continuellement des remodelages. Chez l’homme, les

sites susceptibles de fournir une niche pour les CSH se trouvent dans les os plats, tels que les

os formant la hanche (l’iléon, l’ischion et l’os du sacrum) ou l’os du sternum, et dans les

épiphyses des os longs rattachés au squelette axial (le fémur). Chez la souris, l’hématopoïèse

a lieu également dans les os longs (fémur, tibia). Chez Drosophila melanogaster, il existe

deux sortes d’hématopoïèse. La première, appelée hématopoïèse embryonnaire, se déroule

dans le mésoderme de la tête des embryons précoces et donne naissance à un nombre limité

de lignages et d’hémocytes. La seconde, ou hématopoïèse larvaire, a lieu dans un organe

spécialisé et dédié uniquement à cet effet, appelé la glande lymphatique (Crozatier M. &

Meister M., 2007). Ainsi, par l’exemple de ces trois espèces, nous constatons que des

invertébrés aux vertébrés une niche hématopoïétique, endroit unique et spécialisé, est

indispensable à la formation des cellules hématopoïétiques durant toute la vie d’un organisme.

a). Les ostéoblastes, cellules clés de l’hématopoïèse

Les ostéoblastes, issus d’une différenciation des cellules souches mésenchymateuses

(CSM), sont des cellules spécialisées dans la mise en place de la nature protéique osseuse,

secondairement calcifiée. Au cours de leur différenciation, le stade des pré-ostéoblastes

(ostéoblastes immatures CD45- N-cadhérine+ en forme de fuseau) s’est révélé récemment

comme un composant majeur de la niche hématopoïétique.

D’abord, Zhang et al. se sont intéressés au rôle des BMP dans le développement des

CSH adultes, en utilisant des souris invalidées de manière conditionnelle pour le récepteur des

BMP de type IA (BMPRIA pour bone morphogenic protein receptor type IA). Cette délétion

35


est responsable d’un accroissement du nombre des ostéoblastes immatures CD45- N-

cadhérine+ en forme de fuseau (notés SNO pour spindle shape N-cadherin+ osteoblast), situés

au niveau de l’os trabéculaire, et corrèle avec une augmentation du nombre des CSH. Ils

complètent leur démonstration en montrant que les CSH adhèrent à ces cellules

ostéoblastiques particulières, les SNO, via des jonctions d’adhérence impliquant la N-

cadhérine et la β-caténine (Zhang J. et al., 2003). Donc, les ostéoblastes SNO, à l’interface de

la MO et de l’os, jouent le rôle de composés clés de la niche pour supporter l’hématopoïèse, et

la voie de signalisation BMPRIA/BMP contrôle le nombre de CSH en régulant la taille de

cette niche.

Il est également intéressant de noter que les ostéoblastes produisent des facteurs de

croissance et sont activés par l’hormone parathyroïde (PTH pour parathyroid hormone) ou

par la protéine PTHrP (PTH-related protein) produite localement, via le récepteur

PTH/PTHrP (PPR pour PTH/PTHrP receptor). Calvi et ses collaborateurs ont montré que les

ostéoblastes stimulés par PPR prolifèrent, génèrent des niveaux élevés du ligand Notch,

Jagged 1, et supportent l’augmentation du nombre de CSH, grâce à l’activation de la voie

Notch in vivo (Calvi L.M. et al., 2003).

Un peu plus tard, Arai et ses collaborateurs ont, quant à eux, démontré qu’il existe une

interaction entre les CSH et les ostéoblastes, via le récepteur Tie-2 des CSH et le ligand

angiopoïétine-1 produit par les ostéoblastes. Cette interaction est cruciale pour le maintien de

la quiescence des CSH (Arai F. et al., 2004). Un autre type d’interaction entre les CSH et les

ostéoblastes a été étudiée, in vitro, par l’équipe de Taichman. Ils ont mis en évidence que la

survie des progéniteurs hématopoïétiques sur les ostéoblastes dépend de l’engagement des

intégrines α4β1 et α5β1, en utilisant des anticorps bloquants (Jung Y. et al., 2005). Cette

étude et des résultats antérieurs de la même équipe montrent que des signaux solubles sécrétés

(pas encore déterminés) par les CSH, en contact avec les ostéoblastes, établissent une boucle

paracrine avec les ostéoblastes qui supportent la survie des CSH et suggèrent que les CSH

modulent directement la formation de leur microenvironnement. Ainsi, les ostéoblastes jouent

un rôle central dans la régulation des CSH, en terme de survie, prolifération et de quiescence,

dans la création de la niche des CSH, et dans la synthèse des molécules induisant leurs

interactions avec les CSH (pour revue Taichman R.S., 2005). Enfin, la co-transplantation des

ostéoblastes avec des CSH peut améliorer la prise de la greffe (El-Badri N.S. et al., 1998),

alors que des souris, exhibant une mort métabolique induite des ostéoblastes, subissent une

altération sévère de leur hématopoïèse (Visnjic D. et al., 2004).

36


Ces quelques exemples révèlent le rôle majeur des ostéoblastes dans la régulation des

CSH, soit par la sécrétion de ligands, soit par des contacts adhésifs directs. Le schéma

proposé par Adams et Scadden résume l’ensemble des interactions connues entre les

ostéoblastes et les CSH (figure 10 ; Adams G.B. & Scadden D.T., 2006).

Figure 10 : Interactions dans la niche endostéale impliquées dans la quiescence et l’autorenouvellement des CSH. Les CSH engagent les composants moléculaires des ostéoblastes dans des interactions qui modulent leurs fonctions, soit pour promouvoir leur quiescence soit pour induire leur autorenouvellement. CaR : calcium-sensing receptor, Dkk1 : Dickkopf 1, G-CSF : granulocyte colony-forming stimulating factor, G-CSFR : granulocyte colony-forming stimulating factor receptor, GM-CSF : granulocyte macrophage-colony-forming stimulating factor, GM-CSFR : granulocyte macrophage-colony-forming stimulating factor receptor, Hh : Hedgehog, KL : kit ligand, LRP5-LRP6 : lipoprotein related-receptor proteins 5 and 6, TGF-BMP : transforming growth factor-β family and bone morphogenic protein family, TGFR-BMPR : transforming growth factor receptor and bone morphogenic protein receptor, VLA : very late antigen, Wnt : wingless.

Il faut également rappeler, ici, le rôle particulier de c-Myc dans la régulation de

l’expression de molécules adhésives d’ancrage des CSH sur les ostéoblastes. Le modèle

proposé par Wilson et al. indique qu’une forte activation de c-Myc dans les CSH induit une

diminution d’expression des N-cadhérines et intégrines β1, entraînant une sortie de niche des

CSH (Wilson A. et al., 2004). De façon intéressante, ce rôle de c-Myc comme régulateur du

37


maintien ou de la sortie de niche des CSH est retrouvé dans d’autres niches de cellules

souches (Frye M. et al., 2003 ; Murphy M.J. et al., 2005).

b). Les composants de la matrice extracellulaire

Les molécules adhésives (ostéopontine, fibronectine, laminine, acide hyaluronique)

ont des récepteurs cellulaires, les intégrines, permettant la liaison des CSH au stroma

médullaire. Ces protéines matricielles vont influencer spécifiquement les états de quiescence

ou d’autorenouvellement des CSH.

L’ostéopontine est une sialoprotéine interagissant avec des récepteurs à la surface des

CSH, tels que le CD44, les intégrines α4β1 et α5β1 (figure 10) (Denhardt D.T. et al., 2001).

La production d’ostéopontine varie suivant l’activation des ostéoblastes et l’ostéopontine sert

à limiter le nombre de cellules souches. En effet, Nilsson et al. démontrent que l’ostéopontine

est très exprimée dans la région endostéale, à l’interface os/MO, et qu’elle est impliquée dans

la migration et la localisation dans la MO des CSH. De plus, c’est un régulateur important du

maintien en quiescence des CSH (Nilsson S.K. et al., 2005).

La fibronectine (du latin fibro et nectere, c’est-à-dire la « fibre qui relie ») est une

glycoprotéine de 450 à 500 kDa, découverte en 1948, qui interagit avec les intégrines α4β1 et

α5β1 et le CD44, comme l’ostéopontine (figure 10). Depuis une décennie, elle est considérée

par beaucoup d’auteurs comme la protéine majeure de l’adhérence cellulaire (Dufour S. et al.,

1986). Molécule ubiquitaire d’adhérence, elle participe à la régulation de l’ensemble des

fonctions cellulaires (survie, prolifération, différenciation et motilité).

Présente dans la niche ostéoblastique, la fibronectine régule les progéniteurs

hématopoïétiques, ayant des capacités d’initier des cultures à long terme (LTC-IC pour long-

term culture initiating capabilities), qui adhèrent préférentiellement à travers des interactions

fibronectine/intégrine α4β1 (Verfaillie C.M. et al., 1991 ; Verfaillie C.M., 1998). Une étude

récente a démontré clairement que la culture de CSH murines ex vivo en présence de

fibronectine provoquait leur expansion et l’amélioration de la prise de greffe (Sagar B.M. et

al., 2006).

Dans la MO, les isoformes de la laminine 8 et 10 sont présentes au niveau des sites de

développement et de trafic des cellules hématopoïétiques et promeuvent in vitro l’adhésion et

la migration des progéniteurs hématopoïétiques humains via l’interaction avec l’intégrine

α6β1 (Gu Y.C. et al., 2003). De plus, il a été démontré que la laminine pouvait augmenter le

nombre de CSH murines et améliorer leur greffe dans la niche (Sagar B.M. et al., 2006).

38


Quant à l’acide hyaluronique, c’est une molécule qui se lie au récepteur CD44,

puisque c’est son ligand majeur (figure 10). Considéré longtemps comme un simple acteur

dans la mise en place et le maintien de l’interaction entre les ostéoblastes et les CSH, des

études ont montré qu’il pouvait influencer les fonctions cellulaires des CSH. Ainsi, après un

traitement avec des anticorps dirigés contre le site de liaison de l’acide hyaluronique sur le

CD44, le nombre de cellules myéloïdes et lymphoïdes matures, produites par des cultures à

long terme de MO murine, décroît ainsi que celui du nombre de LTC-IC dans des cultures de

cellules CD34+CD38low/- dépendantes du stroma médullaire (Ghaffari S. et al., 1999).

c). Le calcium extracellulaire

La surface endostéale de l’os est une zone de remodelage active où sont co-localisés

les ostéoblastes et les ostéoclastes. Or, la concentration en calcium élevée près des

ostéoclastes actifs influence les fonctions des CSH. Ces cellules sont sensibles au calcium

extracellulaire grâce au récepteur à sept segments transmembranaires sensible au calcium, le

CaR (calcium-sensing receptor ; figure 10). Ce récepteur couplé à une protéine G

hétérotrimérique est exprimé dans une population de cellules hématopoïétiques enrichies en

cellules souches (Adams G.B. & Scadden D.T., 2006). Dans des souris déficientes en ce

récepteur, les CSH se forment normalement dans le foie fœtal, mais ne migrent pas au cours

du développement dans la MO. De plus, les interactions adhésives sont étroitement régulées

par la présence de calcium extracellulaire. Ainsi, la capacité des CSH à percevoir et à

répondre à une augmentation de la concentration en calcium dans la niche médullaire

participe à la création d’interactions uniques entre la niche et les CSH qui rendent possibles

l’hématopoïèse. Cependant, les voies de signalisation des CSH contrôlées par la présence de

calcium extracellulaire restent jusqu’à présent inconnues.

1.2. La niche vasculaire

En utilisant une nouvelle technique pour visualiser les CSH, consistant à suivre les

cellules CD150+ CD48- CD41- (qu’ils ont montré comme reconstituant à long terme

l’hématopoïèse après transplantation chez des souris irradiées), Kiel et ses collaborateurs ont

mis en évidence une autre localisation des CSH, que la niche endostéale. Ils ont ainsi révélé

que les 2/3 des CSH dans la MO sont près des sinusoïdes (Kiel M.J. et al., 2005). Les

sinusoïdes sont des vaisseaux spécifiques qui permettent aux cellules hématopoïétiques de

passer dans la circulation veineuse, ou inversement en cas de homing (figure 11).

39


Figure 11 : La niche vasculaire. Cette niche est constituée par les sinusoïdes qui sont des vaisseaux permettant aux CSH de passer des tissus hématopoïétiques, ici la niche endostéale de la MO constituée d’ostéoblastes, aux veines. La plupart des CSH se situent près de cellules réticulaires, qui sécrètent la chémokine CXCL12. Quelques CSH de la MO sont localisées, aussi, au niveau de l’endostéum ou d’autres endroits. (D’après Sugiyama T. et al., 2006).

Le rôle de l’endostéum dans la régulation de la fonction des CSH, couplé avec la localisation

de la plupart des CSH près des sinusoïdes soulèvent plusieurs questions, sur l’existence de

populations spécifiques de CSH et sur les rôles respectifs des niches endostéale et vasculaire

dans le maintien des CSH et leurs fonctions d’autorenouvellement et de différenciation.

Sugiyama et al. fournissent un mécanisme pour le maintien des CSH dans les niches

vasculaires, ainsi qu’un lien fonctionnel entre les niches vasculaires et endostéales (Sugiyama

T. et al., 2006). Ils démontrent que les sinusoïdes sont entourés de cellules réticulaires qui

sécrètent inhabituellement des quantités importantes de CXCL12 [aussi connu sous le nom de

stromal-cell-derived factor 1 (SDF-1)], une chémokine qui est nécessaire au maintien des

CSH (figure 11), et qui est aussi sécrétée par les ostéoblastes. Les CSH qui sont localisées

autour des sinusoïdes sont normalement en contact avec ces cellules réticulaires. Le principal

récepteur de CXCL12 est CXCR4, qui est exprimé par les CSH (Peled A. et al., 1999). La

voie de signalisation CXCL12- CXCR4 est nécessaire à la colonisation de la MO par les CSH

40


durant le développement et régule la prise de greffe des CSH après transplantation (Peled A.

et al., 1999). CXCL12 a été précédemment impliquée dans la régulation des CSH à la fois

dans les niches vasculaire et ostéoblastique (Kollet. O. et al., 2006).

D’après tous ces résultats, on peut penser que cette niche vasculaire serait plutôt une zone de

transit des CSH, alors que la niche ostéoblastique représenterait le vrai réservoir des CSH les

plus immatures, capable de maintenir leur quiescence grâce aux nombreuses interactions entre

les ostéoblastes et les CSH.

Finalement, nous constatons que la niche hématopoïétique est très dynamique et qu’il

est vraisemblable que beaucoup de cellules contribuent au maintien des CSH, potentiellement

des cellules telles que les cellules endothéliales, les progéniteurs mésenchymateux, les

mégacaryocytes, les plaquettes, les cellules immunes, les adipocytes, en plus des cellules

réticulaires exprimant CXCL12 (Sugiyama T. et al., 2006), les ostéoblastes (Calvi L.M. et al.,

2003 ; Zhang J. et al., 2003), et les ostéoclastes (Kollet O. et al., 2006). Ainsi, dans la

prochaine partie, nous allons aborder la description d’interactions entre les CSH et ces

« autres » cellules, dans la MO.

2. Les autres interactions entre le microenvironnement médullaire et

les CSH

2.1. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM)

Les CSM constituent une population de cellules rares non hématopoïétiques de la MO

adulte, qui peuvent être définies par leurs capacités d’autorenouvellement et de différenciation

en tissus d’origine mésodermique. Ce sont des cellules qui vont donc donner naissance à

différents types cellulaires que sont les ostéoblastes, les adipocytes, les chondrocytes (cellules

du cartilage osseux), les fibroblastes, les cellules endothéliales, et les myoblastes, comme

démontré in vitro et in vivo (Wang X. et al., 2006 ; Muguruma Y. et al., 2006). En plus de

leur fonction génératrice de cellules différenciées, elles régulent par leurs sécrétions et leurs

interactions adhésives l’état des CSH (différenciation, autorenouvellement,...).

Les CSM responsables de la formation du stroma médullaire jouent ainsi un rôle

majeur pour soutenir l’hématopoïèse, en générant les ostéoblastes (Calvi L.M. et al., 2003 ;

Zhang J. et al., 2003) et en fournissant aux progéniteurs hématopoïétiques les cytokines

nécessaires à leur autorenouvellement et leur différenciation (Dazzi F. et al., 2005). Les CSM

41


sécrètent des facteurs solubles favorisant la survie et l’autorenouvellement des CSH [SCF,

LIF, SDF, TGFβ (transforming growth factor β), Flt3, BMP4 et Wnt 2B, 3, 5A et 10B] ou

pro-différenciant (IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14 ; IL-15, G-CSF et GM-CSF).

Il a été démontré également que les CSM exhibent une activité immunosuppressive efficace,

qui cible pratiquement tous les types de cellules immunes, à la fois des lignages myéloïde et

lymphoïde. Pour toutes ces propriétés, les CSM ont été testées dans des applications

thérapeutiques dans le domaine de la transplantation des CSH. Ainsi, des essais suggèrent que

les CSM améliorent la prise de greffe des CSH (Koc O.N. et al., 2000) et suppriment la

maladie du greffon contre l’hôte après une transplantation allogénique de CSH (Le Blanc K.

et al., 2004).

De plus, un dysfonctionnement du microenvironnement médullaire limite la prise de

greffe de CSH transplantées. Or, ceci est corrélé avec le raccourcissement progressif des

télomères dans les cellules stromales de la MO. Ce dysfonctionnement des télomères (obtenu

en utilisant des souris avec une invalidation des télomérases, soit Ter-/-) diminue la fonction

des cellules progénitrices mésenchymateuses, réduit la capacité des cellules stromales de la

MO de maintenir des CSH fonctionnelles, et augmente l’expression d’une multitude de

cytokines, incluant le G-SCF, dans le plasma de souris âgées (Ju Z. et al., 2007).

2.2. Les cellules immunitaires

Diverses cellules du système immunitaire sont situées dans la niche médullaire,

incluant une majorité de macrophages, de lymphocytes T et de neutrophiles. Ces cellules

immunitaires sont capables de réguler plusieurs fonctions des CSH.

Ainsi, il a été démontré que les NK invariants, appartenant à la classe des cellules T,

émergent comme la première sous-population de cellules T régulatrices nécessaires à une

hématopoièse efficace, à la fois dans des conditions de repos et d’activation immune

(Kotsianidis I. et al., 2006). De plus, il est à noter que les progéniteurs hématopoïétiques

expriment à leur surface des Toll-like receptor (TLR), comme les cellules de l’immunité innée

(Nagai Y. et al., 2006). Ces récepteurs sont responsables de la reconnaissance de produits

bactériens et viraux et par conséquent impliqués dans la survie cellulaire. Or, en présence

d’un ligand des TLR, sans facteur de croissance, les progéniteurs myéloïdes vont se

différencier en macrophages et/ou monocytes, et les progéniteurs lymphoïdes en cellules

dendritiques, indiquant donc que l’activation des TLR est suffisante pour engendrer la

différenciation hématopoïétique, afin de renforcer les défenses immunes de l’organisme

(Nagai Y. et al., 2006). Il est également intéressant de révéler que GSK3, qui est à la fois un

42


des acteurs clés de la voie Wnt et une protéine impliquée dans les processus inflammatoires,

régule différentiellement la production de cytokines pro- et anti-inflammatoires induite en

aval de l’activation des TLR (Martin M. et al., 2005).

D’autre part, les cellules immunitaires peuvent entraîner la migration des CSH. Ainsi,

quand les CSM sécrètent du G-CSF, les neutrophiles en réponse libèrent des enzymes

protéolytiques, telles que l’élastase, la cathepsine G, les MMP-2 et 9 (pour matrix

metalloproteinase-2 et 9), ce qui provoque l’inactivation de SDF-1 et donc par conséquent la

mobilisation des CSH (McQuibban G.A. et al., 2001). De plus, la MMP-9 produite dans la

MO entraîne la libération du ligand Kit, permettant la prolifération et le recrutement des CSH

(Heissig B. et al., 2002).

Enfin, certaines cellules immunes sont capables de provoquer la maturation de

certaines cellules hématopoïétiques. Ainsi, les macrophages interagissent avec les

érythroblastes et ces interactions, spécifiques de ces deux types cellulaires, sont nécessaires à

la formation des ilôts érythroblastiques, lieux de l’érythopoïèse (Chasis J.A., 2006).

2.3. Les adipocytes

Les adipocytes proviennent de la différenciation des CSM. Bien que peu étudiés à

l’heure actuelle, ils pourraient jouer un rôle clef dans les fonctions et le devenir des CSH.

L’adipocyte est le type cellulaire le plus abondant des cellules stromales trouvées dans

la MO (Gimble J.M. et al., 1996). Les adipocytes matures sont présents dans les cultures de

MO à long terme (Allen T.D. & Dexter T.M., 1984) et sont capables de supporter à la fois la

lymphopoïèse (Gimble J.M. et al., 1990) et la granulopoïèse (Gimble J.M. et al., 1992). De

plus, récemment, une équipe française a démontré que les adipocytes issus de MO humaines

supportent la complète différenciation de progéniteurs hématopoïétiques en cellules

myéloïdes et lymphoïdes B et T. Cependant, ces cellules sont incapables de maintenir la

survie et l’autorenouvellement des CSH (Corre J. et al., 2006).

Les adipocytes sont connus également pour sécréter un grand nombre de protéines ou

d’adipokines, qui jouent un rôle dans l’hématopoïèse, comme les interleukines 6 et 8 (IL-6 et

IL-8) (Bruserud O. et al., 2003) qui influencent la survie, la prolifération et la différenciation

des cellules hématopoïétiques, la prostaglandine E2 (PGE2), qui induit l’apoptose des CSH, ou

la leptine qui est nécessaire à la lymphopoïèse normale et capable de stimuler la prolifération

des progéniteurs myéloïdes. Récemment, l’équipe de DiMascio et al. a trouvé que

l’adiponectine, une autre adipokine, augmentait la prolifération in vitro des CSH et que les

cellules ayant proliféré de cette manière sont plus efficaces pour reconstituer des hôtes

43


létalement irradiés (DiMascio L. et al., 2007). Dans cette même étude, ils prouvent que

l’adiponectine est un facteur de croissance des CSH en activant la MAPK p38 et que la voie

de signalisation induite par le récepteur à l’adiponectine (AdipoR1) joue un rôle

physiologique dans la reconstitution de l’hématopoïèse in vivo.

3. Les autres mécanismes de régulation de l’hématopoïèse

Nous avons eu un aperçu des mécanismes intrinsèques et extrinsèques locaux qui

gouvernent les interactions entre les CSH et leur microenvironnement. Or, il existe d’autres

signaux, d’influence plus large, qui jouent également des rôles essentiels pour le

fonctionnement des CSH. Nous allons nous focaliser sur les aspects d’hypoxie et de stress

oxydant et sur le système adrénergique.

3.1. L’hypoxie et le stress oxydant

Un modèle mathématique de la distribution de la pression en oxygène (pO2) dans la

MO, tenant compte de la complexité structurale de la moelle et de ses vaisseaux, a suggéré

que les CSH sont localisées dans une région quasiment anoxique (Chow D.C. et al., 2001). De

plus, une étude récente in vivo, basée sur des tests de perfusion suivis d’isolement et de

caractérisation des différentes populations de cellules hématopoïétiques, indique que les CSH

et les cellules stromales de la niche sont en majorité situées à l’extrémité la plus faible d’un

gradient d’oxygène dans la MO (Parmar K. et al., 2007). Or, les changements dans les

protéines contrôlant le métabolisme et la protection anti-oxydante, qui sont liés à l’hypoxie,

sont observés seulement dans des cellules hématopoïétiques murines LSK+ (ayant des

capacités de reconstitution à long terme), par rapport à des cellules LSK- (sans ces capacités

de reconstitution à long terme), indiquant donc que les cellules LSK+ sont adaptées à un

environnement de glycolyse anaérobique (Unwin R.D. et al., 2006).

Quant à Piccoli et al., ils ont voulu caractériser les réactions de consommation

d’oxygène mitochondriales et extra-mitochondriales dans des cellules CD34+. Ils ont révélé

que ces cellules possèdent de faibles quantités en complexes des chaînes respiratoires de la

mitochondrie. De plus, la moitié de la consommation endogène d’oxygène est extra-

mitochondriale et peut être inhibée par des enzymes anti-oxydantes [catalase et SOD

(superoxyde dismutase)] et un inhibiteur de la NOX (NAD(P)H oxidase) (Piccoli C. et al.,

2005). La NOX oxyde le NAD(P)H, qui est partiellement réduit en anion superoxyde (O2-.),

44


c’est-à-dire en ROS (Piccoli C. et al., 2005). Ainsi, cette équipe a proposé un modèle

suggérant que les NOX2 et 4 sont des senseurs d’oxygène et/ou de ROS servant de messagers

redox dans l’activation des voies de signalisation intracellulaires contribuant aux processus

mitochondriaux, à la survie cellulaire et à la différenciation des CSH (figure 12).

Figure 12 : Modèle schématique illustrant la possible fonction des NAD(P)H oxidases NOX2 et 4 dans la croissance et la différenciation des CSH CD34+ dans la niche hématopoïétique. FC : facteur de croissance ; NOX : NAD(P)H oxidase ; ROS : reactive oxygen species. (D’après Piccoli C. et al., 2005).

Ainsi, cela implique un fonctionnement métabolique quasiment anaérobique des CSH,

dont la faible efficacité s’adapte bien au peu d’énergie demandée par ces cellules arrêtées en

G0-G1. De plus, l’environnement hypoxique pourrait limiter la production de ROS, préservant

ainsi les CSH des dommages oxydatifs dépendants de l’âge.

45


La localisation des CSH dans une niche hypoxique les protègerait donc d’un stress

oxydant qui limite leur durée de vie. Le taux basal de ROS dans les progéniteurs myéloïdes

est beaucoup plus élevé que dans les CSH. Or, les progéniteurs myéloïdes se différencient

naturellement en neutrophiles et monocytes dont le rôle physiologique, dans la réponse

immunitaire de défense contre les infections, est de produire de grandes quantités de ROS. Le

taux basal élevé de ROS dans les progéniteurs myéloïdes pourrait donc résulter d’un équilibre

précaire entre la production de ROS à des fins utilitaires et l’effet toxique des ROS sur la

survie cellulaire. Cela pourrait expliquer pourquoi les cellules myéloïdes en général ont la

durée de vie la plus courte parmi les cellules hématopoïétiques (Gougerot-Pocidalo M.A. et

al., 2007). Cet équilibre pourrait être rompu avec l’âge en faveur de l’expression de certains

gènes impliqués dans l’inflammation et la réponse au stress. Ainsi, des analyses moléculaires

ont permis de comparer l’expression génique entre des CSH jeunes et des CSH âgées et ont

révélé la présence d’un microenvironnement inflammatoire dans la MO âgée (surexpression

de la P-sélectine et du facteur de transcription nuclear factor κ B, NF-κB) et d’une

dérégulation épigénétique dans les CSH âgées (Chambers S.M. et al., 2007).

3.2. Le système adrénergique

En dehors des mécanismes de régulation loco-régionaux des CSH que nous venons

d’évoquer, l’hématopoïèse est sous le contrôle des systèmes généraux de l’organisme, tels que

le système adrénergique et la parathyroid hormone (PTH).

Premièrement, les cellules hématopoïétiques primitives possèdent des récepteurs

adrénergiques (Muthu K., 2007). D’autre part, l’implication de la signalisation adrénergique a

été identifiée dans l’altération de la fonction des ostéoblastes, réduisant la production de

CXCL12 et conduisant ainsi à la libération des cellules souches dans la circulation (figure 13 ;

Katayama Y. et al., 2006). De façon intéressante, plusieurs travaux antérieurs avaient

démontré le rôle critique du G-CSF dans l’inhibition des fonctions ostéoblastiques et la

mobilisation des CSH. Le travail de Katayama et al. montre, de façon élégante, que l’action

du G-CSF pourrait intervenir en amont de la régulation des neurones noradrénergiques

(Katayama Y. et al., 2006).

46


Figure 13 : Les signaux du système nerveux sympathique modulent les CSH de la niche endostéale. L’activation des neurones noradrénergiques périphériques libèrent les catécholamines induisant la mobilisation des CSH. La perte du pouvoir de rétention de la niche ostéoblastique, via la diminution de sécrétion de CXCL12, peut faire intervenir l’action du G-CSF, soit en amont au niveau neuronal, soit directement sur les ostéoblastes, soit encore via l’activation de la sécrétion de protéases par les neutrophiles. (D’après Larsson J. & Scadden D., 2006).

La PTH est une hormone dont les récepteurs sont présents aussi bien sur les CSH, que

sur les ostéoblastes. Des études ont montré que la PTH stimulait l’hématopoïèse, car

l’injection d’un analogue de la PTH augmente la taille du pool de CSH, chez la souris

(Whitfield J.F., 2005). Or, les PTH ostéogéniques pourraient accroître la taille du pool de

CSH, par au moins quatre mécanismes (pour revue Whitfield J.F., 2005). Premièrement, elles

stimulent fortement la croissance de l’os trabéculaire, ce qui pourrait agrandir l’espace de la

niche des CSH. Deuxièmement, elles pourraient promouvoir l’attachement des CSH à la

niche, en favorisant l’expression de la N-cadhérine par les cellules ostéoblastiques, peut-être

par un processus épigénétique. Troisièmement, elles seraient susceptibles de stimuler

directement les CFU-S. Enfin, Calvi et al. ont montré, en utilisant un analogue de PTH ou un

47


récepteur de PTH constitutivement actif, que les PTH augmentent le pool de CSH murines en

causant la sécrétion de grandes quantités de Jagged 1 par les ostéoblastes, ce qui active les

récepteurs Notch sur les CSH (Calvi L.M. et al., 2003).

En conclusion, la niche hématopoïétique est, à la fois, sous le contrôle de facteurs

loco-régionaux et généraux de l’organisme, lui permettant de répondre rapidement aux

besoins homéostasiques (oxygénation, immunité, hémostase), en induisant la différenciation

des progéniteurs et la régénération tissulaire en favorisant la mobilisation des CSH.

C. L’hématopoïèse leucémique

Il existe quatre catégories de leucémies : la leucémie aiguë myéloïde (LAM) - qui est

le type de leucémie auquel je me suis intéressée tout le long de ma thèse -, la leucémie

myéloïde chronique (LMC), la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) et la leucémie

lymphoïde chronique (LLC).

Seule la LMC a été associée à une anomalie chromosomique persistante - le

chromosome de Philadelphie (Ph) -, une translocation équilibrée et réciproque impliquant les

bras longs des chromosomes 9 et 22 t(9;22) et aboutissant à la génération d’une oncoprotéine

de fusion bcr-abl. Après une phase chronique, durant laquelle les granulocytes matures sont

encore produits, mais où un nombre augmenté de cellules progénitrices myéloïdes est observé

dans le sang périphérique, les patients peuvent entrer dans une phase accélérée ou la crise

blastique de LAM. La LMC est également une maladie des CSH, d’où l’intérêt des nombreux

travaux réalisés sur cette pathologie et le rôle des interactions entre les CSH et leur

microenvironnement, dans ce contexte. De plus, le processus d’acutisation de la LMC peut

aider à mieux comprendre les mécanismes spécifiques de signalisation mis en jeu dans les

LAM.

1. La leucémie aiguë myéloïde (LAM)

La LAM est une affection sanguine caractérisée par l’envahissement de la moelle

osseuse par une population myéloïde immature et monoclonale. Cette population myéloïde

dérive de la transformation maligne d’une cellules souche ou d’un progéniteur multipotent.

Les cellules de LAM sont caractérisées par une prolifération anarchique et un blocage de

48


différenciation. Ainsi, les cellules souches ou les progéniteurs devenus malins vont donner

naissance à une population myéloïde bloquée à un stade précoce de la différenciation

cellulaire et donc incapable de maturation terminale. Cette transformation maligne de cellules

normales peut être induite par différents mécanismes, confèrant à ces dernières un avantage

de survie et la perte du potentiel de maturation cellulaire terminal. Actuellement, les

événements génétiques (mutations perte de fonction et translocations chromosomiques

engendrant des protéines de fusion) et les modifications du microenvironnement médullaire

(diminution de l’oxygénation ou des apports nutritifs, défaut d’ancrage au stroma médullaire,

stress oxydant, inflammation, sénescence) sont impliqués.

Puis, cette population cellulaire clonale va envahir la MO, diminuant l’espace occupé par les

progéniteurs hématopoïétiques normaux, et diminuer leur différenciation. Une insuffisance

médullaire est alors observée. Ceci se traduit au niveau sanguin par une diminution du

nombre de cellules matures normales (érythrocytes, lymphocytes et globules blancs matures)

ainsi que par l’apparition de cellules immatures (blastes) provenant de la population myéloïde

immature de la MO.

L’âge médian de la survenue de la LAM est approximativement de 65 ans. Le

pronostic des patients adultes atteints de LAM est généralement mauvais : seulement 15 à 25

% d’entre eux sont vivants cinq ans après le diagnostic, et la survie médiane parmi les patients

qui ont rechuté après chimiothérapie est de trois à douze mois (Keating M.J. et al., 1989). La

situation des patients plus âgés (au-delà de 60 ans) est plus dramatique, puisque le

pourcentage de survivants après cinq ans est seulement de 5 à 10 %.

Actuellement, il existe seulement trois types de thérapies pour traiter les LAM : (i) une

chimiothérapie intensive, (ii) une transplantation de cellules souches autologues, ou (iii) la

transplantation de cellules souches allogéniques. La chimiothérapie de première intention est

caractérisée par un fort taux de rechutes (50 à 70 %). Cette résistance aux thérapies est

soutenue par l’existence de cellules souches, capables de régénérer l’hématopoïèse

leucémique, et qui sont insensibles à la chimiothérapie. Ainsi, l’étude des LAM est

particulièrement intéressante pour appréhender les mécanismes spécifiques de survie des

cellules souches cancéreuses, dans le système hématopoïétique, et plus largement en général.

La classification Fab (French-American-British) est basée sur des caractéristiques

morphologiques et cytochimiques de différenciation (McKenna R.W., 2000). Pour certaines

des catégories, un phénotypage immunologique est nécessaire. Cette classification divise donc

49


les cas de LAM en huit groupes principaux de M0 à M7, chacun correspondant à un stade de

blocage de différenciation des cellules leucémiques (tableau 1).

Tableau 1 : Classification FAB des LAM.

Ces phénotypes Fab sont associés parfois à des anomalies chromosomiques spécifiques

(tableau 1) et ont une incidence variable dans la population.

La classification OMS (Organisation mondiale de la santé ; tableau 2) combine les

caractéristiques de lignage et de cytogénétique, à visée pronostique (McKenna R.W., 2000).

50


Tableau 2 : Classification OMS des LAM.

Ainsi, les cliniciens utilisent la classification OMS pour diagnostiquer la LAM d’un patient et

pour envisager les indications thérapeutiques, car elle est plus complète et prend en compte

plus de critères, notamment les facteurs de bon ou mauvais pronostique.

2. Les cellules souches leucémiques (CSL)

Grâce au modèle murin NOD/SCID transplantable, les cellules souches leucémiques

(CSL) et, plus largement, les cellules initiant la leucémie ou L-IC (pour leukemia-initiating

cells) ont été plus facilement identifiées (Lapidot T. et al., 1994 ; Bonnet D. & Dick, J. E.,

1997). De façon intéressante, les capacités de transplantation dans les souris NOD/SCID sont

corrélées au pronostic des patients (Pearce D.J. et al., 2006), ce qui reflète l’existence de

différents types de cellules leucémiques immatures.

Dans les sous-types de LAM M0, M1, M2, M3, M4, et M5, les CSL sont définies

phénotypiquement par : CD34+ CD38- CD71- CD90- HLA-DR- CD117- CD123+ (Bonnet D.

& Dick J. E., 1997 ; Jordan C.T. et al., 2000). Même si la plupart de ces caractéristiques

51


antigéniques sont partagées avec les CSH (CD34+ CD38- CD71- HLA-DR- CD123+), d’autres

marqueurs sont trouvés comme étant uniques aux CSL, tels que CD117-, et plus récemment,

CD96+ (Hosen N. et al., 2007) et l’antigène CLL-1+ (van Rhenen A. et al., 2007).

Dans cette partie, nous allons aborder (i) l’origine de la formation des CSL et (ii) leurs

caractéristiques fonctionnelles.

2.1. Les CSH et les progéniteurs : cibles de la transformation

Ces dernières années, une accumulation de preuves a permis d’identifier les CSH

comme cibles de la transformation tumorale aboutissant aux LAM. En premier lieu, seules les

cellules de LAM humaines CD34+ CD38-, c’est-à-dire immatures, sont capables d’initier la

LAM dans des souris NOD/SCID (Bonnet D. & Dick J.E., 1997). Par contre, les cellules

leucémiques CD34+ CD38+ ne peuvent pas transférer la maladie, malgré le fait qu’elles

exhibent un phénotype de blastes leucémiques. Cela suggère que les CSH normales, plutôt

que les progéniteurs engagés en différenciation, sont les cibles de la transformation

leucémique, suite à des mutations génétiques et des altérations dans le microenvironnement

de la niche hématopoïétique (figure 14). De plus, même si les LAM sont caractérisées par

différents niveaux de blocage dans la maturation des lignages, les premières étapes de

différenciation sont conservées et similaires à l’hématopoïèse normale, suggérant l’origine

souche de la transformation.

Les CSH, nous l’avons vu auparavant, sont en majorité quiescentes et contrôlées par la

niche hématopoïétique, ce qui doit normalement les préserver de la survenue d’anomalies

épigénétiques ou génétiques. Cependant, en cas de stress itératifs (inflammation, agents

toxiques, sénescence,...), une mauvaise défense vis-à-vis du stress oxydant et/ou des

altérations microenvironnementales peuvent aboutir à une augmentation de leur rythme de

prolifération et à une délocalisation de la niche. Ces CSH, anormalement suractivées,

pourraient alors accumuler des désordres génétiques et y être anormalement tolérantes, à

cause de défauts dans l’induction des mécanismes de protection pro-apoptotique et anti-

oxydante.

Les anomalies génétiques retrouvées dans les LAM sont de deux ordres : (i) les premières

impliquent des gènes régulateurs de la prolifération cellulaire et (ii) les secondes, des gènes

régulateurs de la différenciation cellulaire.

52


Figure 14 : L’origine des cellules souches leucémiques (CSL). Suite à des mutations chromosomiques et des altérations du microenvironnement médullaire, les CSL apparaissent après transformation des CSH elles-mêmes ou après transformation des progéniteurs plus restreints qui ont acquis des capacités de cellules souches. (D’après Passegue E. et al., 2003).

La plus fréquente des anormalités chromosomiques dans les LAM est la translocation

8;21, qui entraîne l’expression d’un transcrit chimérique AML1-ETO responsable d’une

prolifération anarchique. Dans une étude sur des CSH humaines provenant de patients en

rémission, les transcrits AML1-ETO y sont retrouvés (Miyamoto T. et al., 2000). Ces CSH

isolées et leurs progéniteurs ne sont pas leucémiques, et pourraient se différencier en cellules

myélo-érythroïdes normales in vitro. Cela indique que la translocation se produit

originellement dans les CSH normales et que les mutations additionnelles dans une sous-

population de ces CSH, ou de leurs progéniteurs multipotents, conduisent à la leucémie

(Miyamoto T. et al., 2000). L’idée que les CSH sont une cible commune des événements pré-

leucémiques et de la transformation leucémique est aussi supportée par des travaux sur la

LMC, où les réarrangements chromosomiques associés à la leucémie clonogène ont été

trouvés dans les cellules CD34+ CD38- , une population enrichie en CSH (Mauro M. J. &

Druker B. J., 2001).

Bien que les cellules souches soient souvent la cible d’événements génétiques qui sont

nécessaires ou suffisants à la transformation maligne, dans d’autres cas les progéniteurs plus

restreints pourraient être la cible de la transformation (figure 14). En ciblant l’expression de

53


transgènes dans les progéniteurs myéloïdes restreints par l’utilisation d’un promoteur

spécifique, il est possible de créer un modèle murin dans lequel la leucémie myéloïde survient

à partir de progéniteurs restreints. Les transgènes induisant l’activation de Bcl2 (par un

transgène constitutivement actif de Bcl2 ou par une délétion de Fas) entraînent la survenue de

leucémies ressemblant aux leucémies humaines à de nombreux égards (Traver D. et al.,

1998). Dans ces modèles murins transgéniques pour les leucémies myéloïdes, l’expression

forcée du gène anti-apoptotique Bcl-2 dans le lignage myéloïde conduit à la maladie qui est

similaire à la LMC humaine.

2.2. Les anomalies de survie, d’autorenouvellement et de différenciation

dans la leucémogenèse

La LAM est une hémopathie caractérisée par une prolifération anarchique et un blocage

de différenciation des cellules leucémiques. Ainsi comprendre quels sont les mécanismes de

dérégulation de l’autorenouvellemnt des CSL et du blocage de différenciation des

progéniteurs est fondamental pour mieux cibler ces cellules en thérapeutique. De plus, il est

très important de ne pas oublier la notion de tolérance vis-à-vis de ces celules transformées :

au lieu de mourir, ces cellules anormales vont développer des mécanismes de résistance qui

leur permettent de survivre dans un milieu hostile.

Plusieurs équipes se sont penchées sur l’étude et la compréhension des mécanismes

responsables des anomalies de l’autorenouvellement des CSL. Ainsi, les protéines de fusion

codées par des translocations communément trouvées dans les LAM (AML1-ETO, PML-

RARα, PLZF-RARα) entraînent une augmentation de la β et de la γ-caténines et des gènes

cibles de TCF/LEF, suggérant l’implication de la voie Wnt dans la dérégulation de

l’autorenouvellement des LAM (Muller-Tidow C. et al., 2004 ; Zheng X. et al., 2004). Or, la

voie Wnt a déjà été largement montrée comme nécessaire à l’autorenouvellement des CSH, et

sa dérégulation dans les LAM permettrait d’expliquer la prolifération anarchique des CSL

(pour revue Mikesch J.H. et al., 2007). De plus, il a été rapporté une activation de la β-

caténine dans les progéniteurs granulocytes/macrophages de LMC, qui apparait comme

augmentant l’activité d’autorenouvellement et le potentiel leucémique des ces cellules

(Jamieson C.H.M. et al., 2004). Cependant, la seule suractivation de la voie Wnt/β-caténine

ne semble pas capable de provoquer une leucémie, et entraîne surtout une exhaustion du pool

de CSH par leur entrée dérégulée en prolifération et différenciation (Kirstetter P. et al., 2006 ;

Scheller M. et al., 2006).

54


Quant au blocage de différenciation, certaines anomalies génétiques sont proposées comme

étant reponsables de ce mécanisme leucémogène. En effet, les aberrations génétiques

identifiées dans les LAM incluent des mutations « perte de fonction » des facteurs de

transcription qui sont nécessaires au développement hématopoïétique normal. Tel est le cas du

facteur de transcription PU.1, qui joue un rôle essentiel dans l’hématopoïèse normale, et

notamment la différenciation myéloïde, et dont des mutations sont identifiées chez certains

patients souffrant de LAM (Durual S. et al., 2007). HOXA9 est aussi impliquée dans la

leucémogenèse et corrèle avec un mauvais pronostic. En effet, des mutations sur cette

protéine vont entraîner sa persistance, ce qui induit un blocage de différenciation.

D’autres anomalies génétiques, sont quant à elles, responsables de la résistance au stress

acrrue de ces cellules leucémiques, ainsi les facteurs anti-apoptotiques, comme Bcl-2, Bcl-XL,

Mcl-1, sont de manière aberrante très exprimés dans les cellules de patients atteints de LAM

(Kaufmann S.H. et al., 1998 ; Konopleva M. et al., 2002). De plus, le facteur de survie NF-κB

est constitutivement actif dans les LAM (Guzman M.L. et al., 2001).

Cependant, ces mutations ne sont pas suffisantes, seules, pour causer une leucémie,

comme nous l’indique les modèles murins transformés génétiquement sur une seule cible.

Ainsi, deux « hits » sont indispensables au développement leucémique chez un individu : (i)

un consistant en une mutation sur un facteur permettant d’accroître le potentiel de survie et de

prolifération et (ii) un autre représentant une anomalie génétique qui provoque le blocage de

différenciation.

3. Initiation et progression de la LAM : modèle d’étude chez la souris

Ces modèles murins illustrent, d’une part, le fait que les CSH ou les progéniteurs

multipotents peuvent être le lieu d’initiation du processus leucémogène et, d’autre part, la

nécessité de l’association de plusieurs anomalies conjuguées pour l’apparition de cette

pathologie.

Récemment, Neering et al. ont développé un modèle murin de la crise blastique

survenant lors de l’acutisation de la LMC, en modifiant des cellules hématopoïétiques

primitives avec deux produits de translocations chromosomiques (Neering S.J. et al., 2007).

Ces deux transgènes représentent les deux « hits » nécessaires à la transformation leucémique,

c’est-à-dire la combinaison d’un fort signal mitogène, tel que l’activation constitutive d’une

kinase (ici BCR/ABL), suivi de mutations inhibant la différenciation, comme celles sur des

55


facteurs de transcription (ici Nup98/HoxA9). Ainsi, grâce à ce modèle intéressant, ils ont mis

en évidence que les CSL sont rares et ont conservé les propriétés dites « souches » des CSH.

Ils confirment que ce modèle est efficace pour tester une thérapie anti-cancéreuse sur les CSL

in vivo, et le proposent comme utile pour déterminer les propriétés des cellules souches

normales versus leucémiques (Neering S.J. et al., 2007).

Un autre modèle murin transgénique pour les leucémies myéloïdes a été réalisé en

induisant une suractivation de la résistance au stress des CSL, c’est-à-dire l’expression du

gène anti-apoptotique Bcl-2 dans le lignage myéloïde. Ces souris modifiées génétiquement

développent une hémopathie maligne, similaire à la LMC humaine (Traver D. et al., 1998).

Un autre type de modèle d’étude chez la souris a permis de mettre en exergue le rôle majeur

du microenvironnement médullaire dans la transformation leucémique, en le modifiant

génétiquement, par l’inactivation d’un régulateur central du cycle cellulaire, comme la

protéine retinoblastoma (Rb), ou d’un régulateur négatif de la voie de signalisation Jak/STAT

(Bourdeau A. et al., 2007 ; Wakley C.R. et al., 2007).

Enfin, plusieurs équipes ont mis au point différents modèles murins leucémiques, par

transgenèse d’invalidation ou de protéine de fusion, pour mieux appréhender les acteurs

responsables de cette leucémogenèse. Quelques travaux sont résumés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Différents modèles transgéniques murins d’initiation de leucémies. Rb : Retinoblastoma .

56


4. Les changements dans le microenvironnement médullaire

leucémique

Nous venons de voir, grâce aux modèles expérimentaux murins, qu’une dérégulation

du microenvironnement des CSH peut être à l’origine de la transformation leucémique.

Lorsque la pathologie s’installe, le dialogue permanent entre les cellules hématopoïétiques et

les cellules stromales s’amplifie, se modifie et va être crucial pour le blocage ou la promotion

de l’évolution leucémique.

Il n’y a pratiquement aucune information sur l’état des cellules stromales dans les

LAM, même si dans d’autres hémopathies malignes, telles que les myélomes et la LMC, la

lyse osseuses et des anomalies dans les cellules mésenchymateuses participent à la

pathogenèse (Bhatia R. et al., 1995 ; Corre J. et al., 2007). Cependant, un premier travail de

Lisovsky et Savchenko a pu montrer que le stroma médullaire de patients atteints de LAM est

incapable de supporter la culture de progéniteurs hématopoïétiques normaux in vitro

(Lisovsky M.Y. & Savchenko V.G, 1995). Surtout, l’article récent de Blau et al. démontre

l’existence d’anomalies génétiques non clonales dans les cellules mésenchymateuses du

stroma, de patients atteints de LAM, et différentes en plus des aberrations génétiques

retrouvées dans les cellules hématopoïétiques leucémiques (Blau O. et al., 2007).

Finalement, les perturbations fonctionnelles des blastes leucémiques et de leur niche,

ainsi que la grande production de cytokines qui en résulte, vont aboutir à l’existence d’un

foyer inflammatoire. Comme tout site inflammatoire, une concentration élevée de cellules de

l’immunité et de protéines matricielles sera retouvée. Or, des anomalies des cellules de

l’immunité innée, démontrées par l’équipe d’Olive, pourraient expliquer en partie la tolérance

immunitaire vis-à-vis des blastes leucémiques (Costello R.T. et al., 2002 ; Fauriat C. et al.,

2005). Cette équipe montre également que les cellules dendritiques de patients atteints de

LAM produisent une grande quantité de fibronectine (Vialle-Castellano A. et al., 2004).

Comme nous l’avons indiqué prédemment (dans la partie Les composants de la matrice

extracellulaire), une surabondance de fibronectine dans le microenvironnement des CSH

peut être la cause de leur amplification dérégulée. De façon intéressante, une isoforme

particulière de fibronectine, la fibronectine EDA+ est fréquemment retrouvée associée aux

processus inflammatoires, tumoraux et d’angiogenèse (Manabe R. et al., 1997). Il serait donc

important d’explorer la présence de cette isoforme dans la MO leucémique et de déterminer

son impact sur les CSL, car la fibonectine EDA+ est particulièrement bien liée par l’intégrine

57


α5β1, présente à la surface des CSL (et ce, de manière plus importante qu’à la surface des

CSH), et favoriserait les mécanismes de migration et de prolifération cellulaire.

L’angiogenèse, qui est le processus de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à

partir des pré-existants, est nécessaire à la croissance des hémopathies et notamment de la

LAM. Plusieurs groupes ont démontré que la néovascularisation est augmentée dans la MO

des patients atteints de LAM (Hussong J.W. et al., 2000 ; Padro T. et al., 2000). Ceci corrèle

avec le fait que l’expression du vascular endothelial growth factor (VEGF) est

significativement augmentée dans la MO de patients de LAM (Bellamy W.T. et al., 1999) et

représente un facteur de mauvais pronostic dans les LAM. Or, des travaux ont démontré que

l’expression du récepteur au VEGF1 (vascular endothelial growth factor receptor 1 ou

VEGFR1) sur des progéniteurs hématopoïétiques était nécessaire pour initier une niche pré-

métastatique (Kaplan R.N. et al., 2005). Dans la même optique, d’autres équipes ont étudié

les angiopoïétines (Ang), qui sont d’autres médiateurs angiogéniques plus récents. Les Ang-1

et 2 entraînent des réponses opposés, intégrité et déstabilisation des vaisseaux sanguins

respectivement, quand ils se lient à leur récepteur Tie2. Ainsi, il a été découvert que la LAM

est associée à une augmentation de l’expression d’Ang-2 et de Tie2, mais pas d’Ang-1, dans

la MO (Schliemann C. et al., 2006). Cette dérégulation dans la balance des Ang jouerait donc

un rôle important dans le processus angiogénique et l’amplification du pool des CSH qui se

mettent en place pendant la transformation leucémique.

5. Les traitements actuels et leurs conséquences

Avant 60 ans, les patients ont trois options thérapeutiques qui s’offrent à eux : (i) une

chimiothérapie intensive, (ii) une transplantation de cellules souches autologues, ou (iii) la

transplantation de cellules souches allogéniques. Par contre, après 60 ans, les cliniciens vont

éviter tout traitement trop cytotoxique, comme une chimiothérapie très intensive ou une

allogreffe. Cependant, quelque soit la thérapie choisie, le microenvironnement médullaire

représente un acteur clef de l’efficacité thérapeutique, que ce soit en terme de

chimiosensibilité ou de prise de greffe. Le choix de la thérapie est basée sur plusieurs

facteurs, que sont l’âge, le caryotype, la cytogénétique (étude des translocations

chromosomiques et des facteurs de bon ou mauvais pronostic) et donc la classification de la

LAM.

58


Les cellules de LAM sont généralement chimiosensibles (chimiosensibilité basée sur

un traitement avec la daunorubicine et l’étoposide, inhibiteurs de la topoisomérase de type II,

les anti-mitotiques ou cytostatiques, comme la vinculine, et les agents alkylants, qui créent

des dommages dans la molécule d’ADN). 70 à 80 % de patients atteints de LAM présentent

une rémission complète apparente de la maladie, due à la chimiothérapie de première

intention (Ohno R. et al., 1993 ; Hann I.M. et al., 1997). Malheureusement, à long terme, la

survie sans reprise de la maladie reste très faible, de l’ordre de 30 à 50 % (Ohno R. et al.,

1993 ; Hann I.M. et al., 1997 ; Lowenberg B. et al., 1999), principalement à cause des

rechutes après chimiothérapie. L’amélioration de la survie nécessite de nouvelles stratégies

pour empêcher les rechutes. Pour cela, il est nécessaire d’éliminer spécifiquement le pool de

CSL qui sont résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Ces cellules sont capables de

résister aux agents chimiothérapeutiques quand elles sont en adhésion, il s’agit du processus

appelé CAM-DR pour cell adhesion mediated-drug resistance (une partie y sera consacrée

dans le chapitre II). En effet, l’adhésion au support médullaire contribue également au

maintien de la quiescence des CSL, qui est un facteur important de chimiorésitance. Par

ailleurs, les CSL (tout comme les CSH également) possèdent des systèmes d’efflux efficaces

(la P-glycoprotéine ou P-gp), qui permettent l’efflux des agents thérapeutiques. De façon

intéressante, il semble que les CSH et les CSL puissent être différenciées par leurs voies

spécifiques de survie. Il semblerait qu’inhiber NF-κB ou activer les gènes régulés par p53

induise seulement l’apoptose des CSL (Guzman M.L. et al., 2002). Un nouveau mécanisme

de chimiorésistance a été, également, mis en évidence dans les LAL. Les cellules

mésenchymateuses de MO leucémique produisent de grandes quantités d’asparagine

synthétase qui protège les blastes leucémiques, à proximité de ces cellules stromales, des

effets néfastes d’un traitement à l’asparagine (Williams D.A., 2007).

De plus, ces traitements chimiothérapeutiques peuvent avoir des conséquences secondaires

importantes, puisque des cancers secondaires peuvent apparaître et que le

microenvironnement médullaire peut être perturbé suite à une exposition à ces agents

chimiothérapeutiques (Li J. et al., 2004). Cela peut donc désavatanger l’hématopoïèse

normale et gêner les greffes ultérieures.

Les stratégies de thérapie envisagées à court terme reposent sur les mécanismes

impliqués dans la transformation leucémique, par la découverte de nouvelles molécules

inhibitrices visant essentiellement les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), les acteurs

de signalisation du cycle et de la survie cellulaires, et les aberrations chromosomiques

spécifiques (figure 15).

59


Figure 15 : Cibles moléculaires pour le traitement des LAM. RTK : récepteur à activité tyrosine kinase ; NRTK : non-receptor tyrosine kinase. (D’après Ikeda A. et al., 2006).

Pourtant, étant donné l’origine « souche » des LAM, les options thérapeutiques d’avenir

concernent essentiellement (i) le blocage de l’autorenouvellement des CSL, (ii) la réversion

de leur blocage de différenciation, mais aussi (iii) l’induction d’une apoptose spécifique des

CSL par rapport aux CSH.

Enfin, la prise en compte du microenvironnement est essentielle et peut représenter

une nouvelle cible thérapeutique intéressante. A la suite du travail de l’équipe de Dick

démontrant qu’en inhibant les liaisons entre les CSL et le stroma, par un anticorps activant le

CD44, on provoquait l’éradication des CSL dans un modèle murin, un essai clinique va être

démarré (Jin L. et al., 2006). Cette étude donne bon espoir que des stratégies thérapeutiques

visant les interactions entre la niche médullaire et les CSL pourront être développées avec

d’autres molécules d’adhésion, ou d’autres cibles du microenvironnement médullaire.

D. Conclusions et hypothèses préliminaires sur les similitudes et

différences des CSH et des CSL dans la réponse au stress

Dans ce chapitre, nous avons pu constater plusieurs similitudes mais aussi des

divergences entre les CSH et les CSL.

60


Tout d’abord, les CSL et les CSH sont des cellules quiescentes, arrêtées en G0/G1, qui

possèdent des glycoprotéines entraînant l’efflux de molécules. Ces caractéristiques leur

permettent donc, à toutes les deux, de résister à des stress génotoxiques, comme les

traitements chimiothérapeutiques qui ciblent plutôt des cellules cyclantes ou qui sont excluent

de ces cellules par des P-gp ou d’autres types de transporteurs. De plus, ces deux types de

cellules souches, normales et leucémiques, semblent partager les mêmes grandes voies de

signalisation pour les mécanismes d’autorenouvellement et de résistance au stress. Pour

éradiquer le clone souche leucémique, il faudrait donc cibler spécifiquement les CSL sans

supprimer les CSH ou perturber leurs fonctions, pour que l’hématopoïèse physiologique à

long terme perdure.

Or, nous avons établi également que certains marqueurs de surface pourraient être

assez spécifiques des CSL, et pas des CSH, suggérant qu’ils pourraient servir au ciblage des

L-IC. En plus, certaines voies dans les CSL sont plus activées que dans les CSH, du fait des

translocations chromosomiques et des dérégulations du microenvironnement leucémique. En

effet, les réarrangements chromosomiques par la production de protéines de fusion entraînent

une prolifération anarchique, un blocage de différenciation et la perte d’apoptose permettant

ainsi aux cellules leucémiques de s’accroître de façon anormale. A cause de cela, des

thérapies sont mises au point à partir de petites molécules ciblant ces protéines de fusion ou

les voies suractivées dans les LAM. Cependant, ces nouvelles thérapies ne sont pas tout à fait

efficaces, car même si elles ne touchent que les CSL, elles sont à l’origine de résistance et

donc de rechutes.

Le microenvironnement médullaire ne réagit pas de la même façon face aux CSL et

certaines de ces composantes sont modifiées dans un contexte leucémique. Ceci est valable

notamment pour les récepteurs d’adhérence que sont les intégrines. En effet, certaines de ces

intégrines seraient impliquées dans les phénomènes de survie et pourraient être donc des

cibles de choix, ainsi que les protéines participant aux voies de survie activées en aval, pour

éradiquer les CSL sans affecter les CSH. Cette remarque se confirme puisque, à l’heure

actuelle, deux essais cliniques (un en phase I et l’autre en phase II) sont en cours pour tester

des molécules qui inhibent spécifiquement les intégrines αVβ3 et/ou αVβ5 dans les leucémies

et les LAM, et un essai clinique est en cours de demande pour le récepteur CD44 pour cibler

spécifiquement les CSL dans les LAM et LMC.

61

Revue bibliographique Chapitre II Les intégrines

Chapitre II : Les intégrines

Nous avons établi dans le premier chapitre que les éléments du microenvironnement

médullaire sont essentiels pour réguler la fonction et le devenir des CSH et des CSL,

notamment les molécules adhésives dont font partie les intégrines.

Les intégrines sont des molécules de surface qui permettent le déroulement de nombreuses

voies de signalisation en aval, ce qui les implique donc dans de nombreuses fonctions

cellulaires, telles que la survie, la prolifération et la différenciation, que ce soit dans un

contexte physiologique ou pathologique. En effet, dans différents types de cellules tumorales,

la fonction et la régulation de ces molécules sont en partie perturbées, et ainsi pourraient

contribuer au phénotype malin et à la pré-existence ou l’acquisition de la résistance aux

différents agents ou traitements chimiothérapeutiques. Les intégrines sont des molécules

majeures en thérapie anti-cancéreuse, puisqu’elles permettent de cibler la survie

tumorale.

A. Les structures et les fonctions des intégrines

Chaque tissu exprime un répertoire particulier de molécules d’adhérence, spécifique

de chaque stade de développement. Grâce à une distribution ordonnée et spécifique d’un

grand nombre de molécules d’adhérence, chaque type cellulaire va pouvoir s’exprimer,

persister et coopérer avec les autres cellules de l’organe. Les intégrines représentent une des

super-familles de molécules d’adhérence qui contrôlent les interactions cellulaires.

1. Généralités sur les intégrines

Les intégrines sont des molécules hétérodimériques de la surface cellulaire, d’un poids

moléculaire avoisinant les 150 kDa, qui sont composées d’une sous-unité α et d’une sous-

unité β associées de manière non covalente (figure 16). 17 sous-unités α et huit sous-unités β

ont été identifiées chez l’homme pour former 24 hétérodimères αβ connus selon le type et la

fonction cellulaires (Hynes R.O., 2002 ; Schwartz M.A. & Ginsberg M.H. 2002 ; Watt F.M.

2002). L’appariement spécifique d’une chaîne α avec une chaîne β constitue une intégrine

62


particulière avec un répertoire unique de ligands, de fonctions et de distribution cellulaires.

Chaque sous-unité d’intégrine a un grand domaine extracellulaire, un court domaine

transmembranaire et un petit domaine intracellulaire.

Figure 16 : Schéma de la structure typique d’une intégrine avec ses sous-unités α et β.

Les intégrines sont classées en fonction de leur sous-unité β (Figure 17). Puis, suivant

la sous-unité α associée, l’intégrine sera spécifique soit d’un ou de plusieurs composés

matriciels comme la fibronectine, l’ostéopontine, la laminine, la vitronectine, les différents

collagènes, soit d’une molécule d’adhésion exprimée à la surface cellulaire, telle que ICAM

(intercellular cell adhesion molecule) et VCAM (vascular cell adhesion molecule).

63


Figure 17 : Appariement des sous-unités α et β des intégrines exprimées dans le système hématopoïétique. Col, collagènes ; Fg, fibrinogène ; Fn, fibronectine ; FX, facteur X ; ICAM-1, intercellular cell adhesion molecule-1 ; Lam, laminines ; MadCAM-1, mucosal adressin cell adhesion molecule-1 ; Opn, ostéopontine ; Tn-C, ténacine-C ; VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1 ; Vn, vitronectine ; vWF, facteur von Willebrandt. (D’après Levesque J.P. et al., 2001).

Les intégrines sont des molécules de la surface cellulaire qui relient, d’un côté le

cytosquelette d’actine à la membrane cellulaire, et d’un autre côté la surface cellulaire au

support matriciel environnant, dans des zones spécifiques appelées contacts focaux ou zones

focales d’adhésion (figure 18). Ces contacts focaux sont formés au niveau des jonctions

intégrine-matrice extracellulaire (MEC) qui permettent le recrutement des protéines du

cytosquelette et de la signalisation durant les processus d’adhésion, d’étalement et de

migration cellulaires. Ces regroupements protéiques induisent la transmission de signaux

externes à l’intérieur de la cellule et peuvent relayer des signaux intracellulaires pour générer

un état activé des intégrines à la surface membranaire (Caldenwood D.A. & Ginsberg M.H.,

2003). La protéine focal adhesion kinase (FAK) a été associée, dans de nombreuses études, à

la formation des zones focales d’adhésion, et notamment par le fait que sa phosphorylation

sur tyrosine serait un événement rapide, associé à la formation de ces contacts.

64


Figure 18 : Architecture moléculaire des contacts focaux d’adhésion. La matrice extracellulaire (MEC), les sous-unités α et β des intégrines et le cytosquelette de la cellule interagissent dans des sites appelés contacts focaux. Ces zones sont des groupes dynamiques de protéines de structure et de protéines régulatrices qui transmettent des signaux externes à l’intérieur de la cellule et peuvent aussi relayer des signaux intracellulaires pour générer un état activé des intégrines à la surface cellulaire. Les protéines de liaison aux intégrines, que sont la paxilline et la taline, recrutent FAK et la vinculine dans les contacts focaux. L’α-actinine est une protéine du cytosquelette qui est phosphorylée par FAK, se lie à la vinculine et aux fibres de stress d’actine, et les attachent au niveau des zones focales d’adhésion. (D’après Mitra S.K.et al., 2005).

Dans les cellules hématopoïétiques, l’interaction des intégrines avec la MEC ou les

composants cellulaires de la moelle osseuse (MO) entraînent la formation des zones focales

d’adhésion, dont les fonctions structurales et de signalisation vont influencer leurs capacités

prolifératives, de différenciation et de localisation, appropriées aux besoins de

l’hématopoïèse. Parmi les grands carrefours de signalisation en aval de l’engagement des

intégrines, dans les cellules hématopoïétiques, on peut citer la famille des FAK et l’ILK

(Integrin-linked kinase). Grâce à ces molécules, la signalisation des intégrines interagit de

65


façon étroite et coopérative avec la signalisation déclenchée par d’autres récepteurs

membranaires, notamment les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) pour réguler les

fonctions cellulaires (figure 19 ; Dedhar S. & Hannigan G.E, 1996).

Figure 19 : Signalisation « autonome » des intégrines et coopération entre intégrines et RTK, en aval de FAK et d’ILK. Les intégrines signalent de façon prédominante à travers le recrutement et l’activation des kinases de la famille Src (SFK) (à gauche). Les intégrines recrutent la kinase FAK ou ILK, via leur sous-unité β. En coopérant avec les RTK, FAK peut alors activer la voie PI3-K/Akt ou recruter et phosphoryler Src dans les zones focales d’adhésion. FAK peut aussi activer la voie extracellular signal-regulated kinase (ERK)/MAPK. Les voies de signalisation que les intégrines activent via les SFK (Src-family kinases) sont suffisantes pour induire la migration cellulaire et conférer une protection aux cellules face à l’apoptose. Cette collaboration entre FAK et la signalisation RTK, en réponse à des facteurs de croissance (FC), est nécessaire à la prolifération, à la survie optimale et à la migration/invasion cellulaire. Grâce à PINCH (particularly interesting new cysteine-histidine rich protein) et Nck2 (non-catalytic (region of) tyrosine kinase adaptor protein 2), ILK relie les intégrines et la signalisation des RTK et via la parvine, la MEC au cytosquelette. ILK peut activer Akt et inhiber GSK3β. La coopération entre ILK et la signalisation en aval des facteurs de croissance permet de stimuler des fonctions cellulaires, comme la différenciation, la prolifération, la survie et l’apoptose. (D’après Guo W. & Giancotti F.G., 2004 et Hehlgans S. et al., 2006).

66


Sur cette figure 19, nous pouvons constater que les intégrines activent des voies spécifiques

via deux molécules essentielles FAK (Schaller M.D., 2001) et ILK (Hannigan G.E. et al.,

1996), et que ces deux kinases peuvent coopérer avec la signalisation des RTK pour

promouvoir les fonctions cellulaires.

Dans notre travail, nous nous sommes intéressés particulièrement au contrôle de la

survie cellulaire en aval de l’engagement des intégrines, dans les cellules hématopoïétiques

leucémiques. Nous allons donc rappeler les principales notions de la survie cellulaire régulées

par les intégrines.

2. Les intégrines et le contrôle de la survie cellulaire

L’adhésion cellulaire a un rôle majeur dans la survie et l’apoptose cellulaires, et

notamment dans le processus d’anoïkis. C’est une apoptose spécifique qui est causée par le

détachement de la cellule de son support matriciel. Des travaux préliminaires ont suggéré

qu’une modulation de la voie Jun amino-terminal kinase (JNK)/ stress-activated protein

kinase (SAPK) était importante pour l’induction de l’anoïkis. Cependant, des études plus

poussées ont mis en évidence le rôle plus frappant d’autres molécules de signalisation, telles

que FAK, ILK, PI-3K et la cascade Ras/MAPK dans la régulation de l’anoïkis (Alahari S.K.

et al., 2002). Récemment, le rôle de chacune a été déterminé dans la survie de cellules

normales, dépendante de l’adhésion.

D’abord, la kinase FAK joue un rôle central dans les signaux transmis par l’adhésion

et dans la régulation de la survie dépendante de l’adhésion. Dans les cellules normales, une

fois que les intégrines sont activées par la liaison d’un ligand suivie de leur regroupement,

FAK est recrutée par la sous-unité β de l’intégrine et activée à son tour. FAK peut alors

favoriser la survie cellulaire par la voie PI-3K/Akt ou en recrutant une kinase Src, dans les

zones focales. Dans ce dernier cas, Src phosphoryle p130Cas et la paxilline, qui recrute à son

tour le complexe Crk-DOCK180, et par la suite entraîne l’activation de Rac. L’activation de

Rac peut être obtenue par la voie dépendante de Src ou la voie dépendante de la PI-3K et

entraîne l’activation de JNK (Almeida E.A. et al., 2000) et de NF-κB (Parsons J.T. & Parsons

S.J., 1997 ; Cary L.A. et al., 1999) (figure 19) pour induire la survie cellulaire. De manière

intéressante, l’anoïkis peut être empêchée par l’expression de mutants FAK constitutivement

actifs. Par contre, la perturbation de la signalisation de FAK dans les cellules cancéreuses, par

67


diverses techniques, provoque la mort cellulaire après détachement des cellules de leur

substrat.

De récentes investigations ont révélé l’existence de relations étroites entre FAK et les

signalisations de survie. Ainsi, FAK a été trouvée comme interagissant directement avec RIP

(receptor-interacting protein), une sérine/thréonine kinase contenant un domaine de mort,

qui, grâce à ce dernier, permet l’interaction avec d’autres protéines à domaine de mort et

contrôle la balance survie/apoptose, via la régulation de NF-κB. Selon que FAK soit localisée

dans ou hors des contacts focaux, sa liaison à RIP pourrait entraîner, respectivement, soit sa

dégradation et l’apoptose cellulaire, soit l’inhibition de RIP et de l’apoptose induite par les

récepteurs de mort (Kurenova E. et al., 2004).

Une autre protéine des zones focales d’adhésion, la vinculine, a été aussi récemment

impliquée dans la régulation de la survie cellulaire, via la modulation de la signalisation FAK.

La vinculine est un lien important de la connexion entre les intégrines et le cytosquelette

d’actine (figure 18). Or, la délétion du gène de la vinculine, dans des cellules embryonnaires

de carcinomes, confère une résistance à plusieurs stimuli apoptotiques, incluant la déprivation

sérique et la culture en suspension. L’absence de vinculine renforce la voie de survie

FAK/paxilline conduisant à l’activation de ERK, alors que la surexpression de la vinculine

interrompt ce signal (Coll J.L. et al., 1995).

Toutes ces études montrent que des interactions différentielles entre FAK et ces protéines sont

importantes dans la régulation de la voie de signalisation de FAK conduisant à la survie

cellulaire.

Quant à la kinase ILK, régulée par les RTK et les intégrines en coopération avec la PI-

3K, son activité est importante dans la survie. Une diminution de l’expression d’ILK bloque

la phosphorylation d’Akt sur la ser 473 et une élévation du taux d’apoptose. Ainsi, ILK joue

un rôle non négligeable dans la phosphorylation d’Akt sur ser 473, probablement par un

mécanisme direct, et la survie cellulaire (Nho R.S. et al., 2005).

ILK interagit avec PINCH (figure 19), qui semble aussi avoir un rôle majeur dans la survie

cellulaire. Sa déplétion, par une stratégie de siRNA (small interfering RNA), favorise

l’inhibition de l’étalement et l’induction de l’apoptose cellulaire. Cette apoptose accrue

corrèle positivement avec l’inhibition de la phosphorylation d’Akt sur Thr 308 et ser 473.

Cependant, la kinase Akt active pourrait ne pas bloquer l’apoptose induite par la suppression

de PINCH-1 ou d’ILK-1. Donc, PINCH-1 et ILK-1 pourraient avoir des fonctions en aval ou

en parallèle de l’activation d’Akt qui sont cruciales pour la survie cellulaire.

68


En amont d’Akt se trouve la PI-3K. Cette dernière génère des phosphoinositides

phosphorylés en 3’ qui stimulent le recrutement d’Akt à la membrane, via son domaine PH

(Pleckstrin homology), où les PDK (3’-phosphoinositide-dependent kinase) phosphorylent

Akt sur sa Thr 308 et sa ser 473, pour induire son activation. Akt, une fois activée, va

promouvoir la survie cellulaire en phosphorylant plusieurs substrats, tels que Bad et la pro-

caspase 9, et en les inhibant. La PI-3K et l’activation d’Akt, qui en résulte, jouent un rôle

central dans la régulation des signaux de survie dépendants de l’adhésion (Alahari S.K. et al.,

2002 ; Nicholson K.M. & Anderson N.G., 2002). La kinase Akt est donc une cible commune

de la PI-3K, de FAK et d’ILK, comme nous l’avons vu précédemment.

Le tryptophane 775 de la queue cytoplasmique de l’intégrine β1 a été trouvé comme essentiel

à la stimulation d’Akt, puisque sa substitution avec une alanine inhibe spécifiquement

l’activité d’Akt, conduisant à une diminution de la survie de ces cellules exprimant ce mutant

(Pankov R. et al., 2003). De plus, cette intégrine β1 peut recruter, de manière sélective, une

isoforme de protein phosphatase 2A (PP2A). Or, cette phosphatase déphosphoryle Akt et, par

conséquent, réduit la survie cellulaire induite par les intégrines. La présence de PP2A associée

à l’intégrine β1 pourrait donc permettre la rapide suppression de l’activité d’Akt, en réponse à

des changements dans le statut adhésif (Pankov R. et al., 2003).

Une autre connexion, dans la toile des interactions de la PI-3K régulant l’anoïkis, est la death

associated protein-3 (DAP-3), qui est une protéine pro-apoptotique localisée, à la fois, au

niveau mitochondrial et cytoplasmique. Elle régule la mort cellulaire induite par les ligands

des récepteurs de mort, comme le TNFα (tumor necrosis factor α). La suppression de

l’expression de DAP-3, dans des cellules HEK293, inhibe l’anoïkis. Le détachement cellulaire

stimule l’association de DAP-3 avec Fas-associated-death-domain protein (FADD) et

augmente l’activité de la caspase 8, tandis que l’expression d’Akt active inhibe cette

association, l’activation de la caspase 8 et l’anoïkis de cellules en suspension. De plus, Akt

phosphoryle directement DAP-3, ce qui stimule la survie cellulaire de cellules en suspension.

Donc, DAP-3 apparaît comme une cible importante d’Akt, dans la voie de survie dépendante

de l’adhésion (Miyazaki T. et al., 2004).

Bien qu’elle soit majeure dans le processus de survie cellulaire induit par les intégrines, la

voie PI-3K/Akt peut être contournée. En effet, dans un panel de lignées cellulaires de cancer

du sein, l’activation d’Akt n’est pas fortement corrélée avec la survie cellulaire. En outre, une

inhibition pharmacologique de la PI-3K n’entraîne pas une sensibilité à l’anoïkis des cellules

avec de forts taux de phosphorylation d’Akt/PKB (Eckert L.B. et al., 2004). Cette étude

69


suggère donc qu’il existe une voie indépendante de PI-3K/Akt, permettant de promouvoir la

survie cellulaire dépendante de l’adhésion.

Hormis les protéines de signalisation en aval des intégrines, les molécules régulatrices

apoptotiques jouent un rôle majeur dans la survie cellulaire, dépendante de l’adhésion. Les

protéines pro-apoptotiques Bad, Bim, Bmf, Bid, Noxa et Puma appartiennent à la famille des

protéines à un seul domaine BH3, sont des senseurs du stress cellulaire et ne possèdent pas de

capacité intrinsèque à induire la mort cellulaire de leur propre chef. Bim et Bmf sont des

senseurs importants des changements du cytosquelette d’actine. Les isoformes BimEL et BimL

se lient à DLC1 (cytoplasmic dynein light chain ou LC8), un composé du complexe moteur

dynéine associé aux microtubules. Ces protéines sont séquestrées dans le complexe dynéine,

jusqu’à ce qu’un stimulus apoptotique induise leur libération (Puthalakath H. et al., 1999).

Une étude a montré que la régulation négative de l’expression de Bim par l’adhésion et la

signalisation en aval du récepteur à l’EGF (epidermal growth factor) sont, toutes deux,

impliquées dans la suppression de l’anoïkis de lignées cellulaires épithéliales de sein

(Reginato M.J. et al., 2003). Par contre, d’autres études ont démontré que l’anoïkis pouvait se

produire indépendamment de Bim. Quant à Bmf, elle se lie à la chaîne légère de la dynéine 2.

Or, le traitement des cellules avec de la cytochalasine D ou l’induction de l’anoïkis initie la

libération de Bmf du cytosquelette (Puthalakath H. et al., 2001). Une fois libérées de leur

contrainte cytosquelettique, Bim et Bmf vont neutraliser les protéines pro-survie de la famille

Bcl-2, par liaison avec leur domaine BH3. Il s’ensuit un déséquilibre entre protéines

régulatrices pro- et anti-apoptotiques, responsable de l’apoptose. Ainsi, la protéine pro-

apoptotique Bax contribue à l’induction de l’apoptose par sa translocation vers la membrane

externe de la mitochondrie, induisant ensuite sa perméabilisation, permettant la libération de

facteurs apoptotiques, comme le cytochrome C, et l’activation subséquente des caspases

(Green D.R. & Kroemer G., 2004). La perte des signaux de survie contrôlés par FAK entraîne

la translocation vers la mitochondrie de différents facteurs pro-apoptotiques, tels que Bax et

Bid (Valentijn A.J. et al., 2003 ; Valentijn A.J. & Gilmore A.P., 2004). A l’inverse, la

signalisation des intégrines promeut l’expression de Bcl-2, qui est une protéine anti-

apoptotique, et supprime l’expression de la protéine pro-apoptotique Bim, (Reginato M.J. et

al., 2003).

Cependant, dans le journal scientifique Cell, Ruoslahti et ses collaborateurs montrent

que les intégrines pourraient réguler l’apoptose à travers des mécanismes indépendants des

caspases (Jan Y. et al., 2004). Précisément, ils démontrent que la perte d’adhésion par

l’intégrine α5β1 provoque la libération d’une protéine de la mitochondrie, Bit1, dans le

70


cytoplasme, où il forme un complexe avec le co-régulateur transcriptionnel AES (amino-

terminal enhancer of split) et induit l’apoptose (figure 20). De plus, il est connu que le

complexe AES, qui est un membre de la famille des facteurs de transcription Groucho, se lie à

un grand nombre de protéines, incluant le récepteur aux androgènes, les facteurs de

transcription Tcf et la sous-unité p65 de NF-κB (ou RelA).

Figure 20 : Régulation de Bit1 par les intégrines. Bit1 est une hydrolase ARNt qui est localisée dans la membrane externe mitochondriale. La translocation de Bit1 dans le cytosol en réponse à des stimuli apoptotiques provoque l’association de bit1 avec le complexe AES, qui promeut l’apoptose. Les mécanismes impliqués ne sont pas encore décortiqués, mais AES (amino-terminal enhancer of split) est connu pour favoriser ou réprimer l’activité de plusieurs facteurs de transcription (tels que TCF et NF-κB, respectivement), et Bit1 pourrait aussi conserver son activité hydrolase ARNt dans le cytosol. Mais, lorsque α5β1 est activée et liée à la fibronectine, cette translocation cytoplasmique de Bit1 est inhibée et donc empêche la mort de la cellule adhérente. (D’après Stupack D.G. & Cheresh D.A., 2004).

Nous avons vu que l’engagement des intégrines régule la survie cellulaire, via une modulation

des voies de signalisation proximales des récepteurs membranaires, et via une régulation du

cytosquelette et des fonctions mitochondriales. Enfin, les intégrines régulent également des

facteurs de transcription clés de la survie cellulaire, tels que NF-κB, p53, AP-1 et TCF. NF-

κB est activé lors de l’adhésion cellulaire et est capable d’inhiber l’anoïkis, en régulant

71


notamment l’expression de Bcl-2 (Toruner M. et al., 2006). Plusieurs études ont montré que

l’anoïkis est dépendante de l’activation de p53 (Grossmann J., 2002). La protéine p53 régule à

de nombreux niveaux les voies de survie que ce soit l’activation de la voie Fas, la régulation

de PTEN (phosphatase and tensin homologue) ou l’expression des protéines de la famille

Bcl-2. Le facteur de transcription AP-1, cible des voies MAPK, est également un facteur

important de régulation de l’anoïkis (Zeng Q. et al., 2002) et est régulé par les intégrines,

notamment par un mécanisme original de translocation de la membrane vers le noyau du co-

facteur de transcription JAB1 (Bianchi E. et al., 2000). Enfin, la voie β-caténine/LEF activée

protège de l’anoïkis et est régulée par les intégrines (Novak A. et al., 1998).

Les conditions environnementales des cellules sont aussi des paramètres à prendre en

compte et qui peuvent jouer un rôle essentiel dans l’initiation de la survie dépendante de

l’adhésion. Il a été rapporté que l’expression de l’intégrine α5β1, mais pas de α2β1, dans des

cellules épithéliales normales d’intestin de rat, permet la survie préférentielle des cellules en

condition de déprivation sérique via l’activation différentielle de la voie PI-3K/Akt, mais pas

d’ERK1/2 (Lee J.W. & Juliano R.L., 2000). En plus, l’activation de cette voie de survie par

l’intégrine α5β1 permet également d’augmenter la signalisation de l’EGF, en induisant le

regroupement entre l’intégrine, le récepteur à l’EGF, et d’autres protéines (Lee J.W. & Juliano

R.L., 2002). Dans le même genre, une équipe a montré que l’activation d’Akt, dans les

cellules adhérentes aux laminines 10 et 11, peut sauver les cellules de l’apoptose induite par la

déprivation sérique, alors que l’adhésion sur la fibronectine les protège de cette apoptose par

une voie dépendante d’ERK (Gu J. et al., 2002). Cette étude démontre donc que différents

composés de la MEC conduisent à des signaux de survie, se distinguant par les voies de

signalisation activées en aval des intégrines.

Les résultats de Janes et Watt suggèrent que la régulation négative de l’intégrine αvβ5

par la régulation positive de l’intégrine αvβ6 pourrait protéger les cellules de carcinomes

basocellulaires de l’anoïkis, par l’activation de la voie de survie Akt (Janes S.M. & Watt

F.M., 2004). On peut également noter que l’architecture en 3D contribue à la viabilité des

cellules face à des stimuli apoptotiques. Ainsi, la formation d’hémidesmosomes (polarité

cellulaire), suite à l’activation de l’intégrine α6β4, et le maintien de l’activité de NF-κB se

sont révélés comme des processus essentiels à la résistance apoptotique des cellules d’acini

mammaires (Weaver V.M. et al., 2002).

Au contraire des cellules normales, les cellules transformées de manière oncogénique,

sont relativement résistantes au processus d’anoïkis (Frisch S.M. & Ruoslahti E., 1997). La

72


suractivation des signaux vus précédemment ou une modification des interactions adhésives

en 3D permet cette résistance. Cette suractivation des signaux de survie peut être contrôlée

par des facteurs extracellulaires comme l’insuline-like growth factor 1/2 (IGF1/2) ou l’IL-3

(Lotem J. & Sachs L., 1996 ; Butt A.J. et al., 1999), des signaux intracellulaires à partir de

mutant Ras ou Src (Khwaja A. et al., 1997), ou encore par la délétion du suppresseur de

tumeur PTEN (Tamura M. et al., 1999). Toutes ces voies contribuent à la résistance à

l’anoïkis des cellules cancéreuses, via l’activation de la voie de signalisation PI-3K/Akt.

Ainsi, une cible importante en aval de la voie PI-3K/Akt, pour la survie cellulaire, pourrait

être la survivine qui n’est pas présente dans la majorité des tissus sains, mais très exprimée

dans de nombreux cancers humains et corrélée à un mauvais pronostic de survie (Altieri D.C.,

2001). Or, l’adhésion de cellules tumorales de prostate à la fibronectine, dépendante de

l’engagement de l’intégrine α5β1, augmente l’expression de la survivine et la résistance à

l’apoptose induite par le TNFα (Fornaro M. et al., 2003). Cependant, dans certaines cellules

cancéreuses, la forte activité PI-3K/Akt ne corrèle pas avec leurs capacités de survie (Eckert

L.B. et al., 2004). De plus, les mutations de p53, fréquentes dans les tumeurs, confèrent un

avantage sélectif en permettant aux cellules cancéreuses de se soustraire à l’apoptose due à

l’anoïkis (Fridman J.S. & Lowe S.W., 2003).

Enfin, la signalisation associée aux intégrines peut rendre les cellules plus résistantes

ou plus sensibles aux agents anti-cancéreux génotoxiques comme les radiations ionisantes et

la chimiothérapie. Ces processus sont appelés cell adhesion-mediated radioresistance/drug

resistance (CAM-RR, CAM-DR) ou cell adhesion-mediated drug sensitization (CAM-DS).

La CAM-DS est un processus dépendant de la tyrosine kinase c-Abl. Ainsi, en absence de

p53, dans certaines lignées tumorales, l’activation de c-Abl lors de l’adhésion cellulaire

entraîne la stabilisation de l’homologue de p53, p73, permettant l’induction de l’apoptose en

réponse à la chimiorésistance (Truong T. et al., 2003). La CAM-RR et la CAM-DR sont

définies par le fait que les intégrines et l’adhésion des cellules à la MEC confèrent une plus

grande résistance aux radiations ionisantes et aux agents cytotoxiques, et ce que les cellules

soient normales ou transformées (Damiano J.S. et al., 1999 ; Hazlehurst L.A. et al., 2000;

Cordes N. et al., 2006). Pour résister aux stress du microenvironnement, l’adhésion des

cellules sur un support matriciel, par l’engagement des intégrines, entraîne différentes voies

de signalisation permettant le blocage des récepteurs de mort, l’arrêt du cycle cellulaire,

l’inhibition de protéines mitochondriales pro-apoptotiques, et l’induction de la voie JNK

induite par le stress, du facteur de transcription NF-κB, de molécules anti-apoptotiques

73


mitochondriales et de protéines de signalisation impliquées dans la survie (figure 21). Tout

cela permet donc la mise en place de la CAM-DR.

Figure 21 : Voies de signalisation induisant la CAM-DR en réponse à un stress génotoxique. A la suite d’un traitement chimiothérapique ou de radiations ionisantes, FAK, en interagissant avec les intégrines, permet d’activer différentes voies : la voie PI-3K/Akt, qui favorise la survie par la survivine ou par les protéines anti-apoptotiques cIAP-2 (cellular inhibitor of apoptosis 2), XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) et Bcl-XL, et la voie JNK (Jun amino-terminal kinase). FAK inhibe aussi la voie de signalisation en aval des récepteurs de mort, comme TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), ce qui empêche l’apoptose par les caspases 3 et 8. En aval de la liaison des intégrines avec un ligand de la MEC, plusieurs processus de résistance sont déclenchés : l’activation du facteur anti-apoptotique NF-κB (nuclear factor κ B) et des voies MAPK (Mitogen activated protein kinase) p42/p44 et p38, l’induction des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 et inhibitrices du cycle cellulaire comme p27, et l’inhibition des protéines anti-apoptotiques, Bax et Bim.

L’exposition chronique à un agent cytotoxique peut s’accompagner de modifications

de l’expression ou de la fonction de certaines intégrines, incluant les intégrines β1, β3, α5 et

74


αv, par des mécanismes moléculaires encore inconnus (Dong L. et al., 1999 ; Cordes N. et al.,

2003). Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer ces changements. Par exemple,

des cellules exprimant un profil d’intégrines particulier, leur permettant de mieux survivre du

fait des interactions avec la MEC, pourraient être sélectionnées suite à une exposition à un

agent chimiothérapeutique. De même, la réorganisation globale des réseaux épigénétiques et

métaboliques, conséquence d’une adaptation à l’agent anticancéreux, pourrait conduire à la

perturbation des voies de synthèse, de maturation, de trafic des intégrines vers la surface

cellulaire.

Nous avons vu que les cellules cancéreuses pouvaient résister à des traitements

cytotoxiques par les processus de CAM-DR et de CAM-RR. Or, si les cellules tumorales en

dormance sont réfractaires à la chimiothérapie, il semble que ce soit en grande partie à cause

de leur état de quiescence (arrêt G0/G1), l’état dans lequel sont les CSH et les CSL. Des

travaux de l’équipe d’Ossowski suggèrent que l’interaction entre les récepteurs de surface

(intégrines, Urokinase-type plasminogen activator receptor pour uPAR), les voies de

signalisation mitogène (ERK) et celle activée par le stress (p38) pourraient déterminer le

passage des cellules tumorales de la prolifération à l’arrêt du cycle cellulaire en G0/G1 et à leur

dormance (Aguirre-Ghiso J.A. et al., 2001). La revue de Ranganathan et ses collaborateurs

met donc en évidence que le ratio ERK/p38 est un déterminant de la dormance tumorale de

cellules de carcinomes épidermoïques, régulé par des molécules de surface cellulaire

(Ranganathan A.C. et al., 2006). Quand l’Urokinase-type plasminogen activator (uPA) se lie

à son récepteur, ce dernier interagit avec l’intégrine α5β1, favorisant ainsi l’assemblage

efficace des fibrilles de fibronectine. De plus, cette interaction provoque la formation d’un

complexe fonctionnel impliquant FAK et EGFR, permettant une forte activation de la voie de

signalisation mitogène Ras/ERK et une inhibition de la voie de p38, via l’inactivation de

Cdc42. Cette balance déséquilibrée en faveur d’ERK favorise donc la prolifération et promeut

la tumorigénicité. Par contre la diminution de l’expression d’uPAR, le blocage de la fonction

de l’intégrine α5β1 ou l’inhibition de FAK entraînent un désassemblage de ce complexe et

réduit l’activation d’ERK. Par conséquent, cela conduit à l’activation de Cdc42 et à celle de

p38 par la suite. Le ratio ERK/p38 étant devenu faible, un arrêt de croissance survient et les

cellules tumorales sont forcées à rentrer dans un état de dormance (Aguirre-Ghiso J.A., 2002).

Ces résultats nous permettent de conclure que la signalisation en aval des intégrines et

l’expression d’une kinase associée aux intégrines, comme FAK, influencent la décision entre

la tumorigénicité et la dormance, in vivo, en régulant la balance des voies de signalisation

75


ERK/SAPK p38 (Aguirre-Ghiso J.A. et al., 2003). Dans ce contexte, il est important de

souligner que l’adhésion sur fibronectine augmente l’expression de p27, inhibiteur des cdk et

du cycle cellulaire, et contribue ainsi à la CAM-DR (Hazlehurst L.A. et al., 2000).

3. Les intégrines et le stress oxydant

Le microenvironnement tumoral est particulièrement stressant sur le plan oxydant, à

cause de la grande quantité de ROS produits par les cellules inflammatoires. Or, ce contexte

inflammatoire peut influencer fortement les mécanismes de survie cellulaire. D’autre part, les

intégrines peuvent induire la production d’espèces réactives oxygénées intracellulaires, par le

biais de l’activation de la GTPase Rac. La source de ROS stimulée par Rac provient soit de la

chaîne respiratoire mitochondriale, par une voie dépendante de l’intégrine α5β1 (Werner E. &

Werb Z., 2002), soit de l’activation de la NADPH oxydase membranaire, par une voie

dépendante de l’intégrine α4β1 (Poon B.Y. et al., 2001). Ces ROS contribuent à l’efficacité

des signaux dépendants des intégrines, via la régulation des tyrosine phosphatases et à

l’induction de NF-κB (Chiarugi P. et al., 2003). Ainsi, les intégrines supportent le rôle

paradoxal de devoir aider les cellules à résister vis-à-vis du stress oxydant extracellulaire, tout

en favorisant la production et la métabolisation de radicaux oxygénés intracellulaires

indispensables à la survie cellulaire.

En réponse au stress oxydant extracellulaire, l’expression/activation des intégrines β1 et

αv, à la surface cellulaire, est augmentée (Lamari F. et al., 2007), comme d’autres récepteurs

d’adhésion, tels que CXCR4 (Zhang Y. et al., 2007). De plus, les voies d’oxydo-réduction

intracellulaires régulent l’expression de certaines intégrines, comme αLβ2 (LFA-1 ;

Hashizume K. et al., 2002). De façon intéressante, il a été montré qu’il existe un site redox

dans la partie extracellulaire riche en cystéines de la sous-unité β des intégrines, qui contrôle

l’interconversion entre leur état de repos et leur état activé, indiquant que les intégrines sont

les cibles directes de la modulation redox et qu’il existe un lien sous-estimé entre l’adhésion

cellulaire et la biologie redox (Yan B. & Smith J.W., 2000).

Enfin, il est à noter le rôle joué par les partenaires de signalisation des intégrines, tels

que FAK et Pyk2 qui, respectivement, régulent l’expression d’enzymes anti-oxydantes

intracellulaires (Sonoda Y. et al., 2004) et l’activation de la NADPH-oxydase (Zhao T. &

Bokoch G.M., 2005), participant également à un contrôle précis du métabolisme

d’oxydoréduction intracellulaire.

76


B. Les intégrines exprimées par les cellules hématopoïétiques et

leur implication dans l’hématopoïèse physiologique et

leucémique

Les intégrines ont une importance cruciale dans l’homéostasie de l’hématopoïèse,

mais aussi dans le développement leucémique, en terme de prolifération, d’invasion, et de

réponse thérapeutique.

1. Le rôle général des intégrines dans l’hématopoïèse

Au cours du développement embryonnaire, les CSH primitives vont changer

successivement de localisation et donc de microenvironnement, pour leur expansion et leur

maturation jusqu’au phénotype de CSH adultes. Ainsi, les CSH vont du sac vitellin à la région

AGM (aorta-gonad-mesonephros) - territoire qui englobe les rudiments de l’aorte, des

gonades et du rein -, puis en passant par l’aorte dorsale, se retrouvent dans le foie et

finalement migrent dans la MO de manière définitive (Medvindsky A. & Dzierzak E., 1996 ;

Gekas C. et al., 2005). Cela suppose des capacités migratoires et d’interactions adhésives

variées, qui sont en grande partie assurées par les intégrines.

Les intégrines exprimées dans le système hématopoïétique appartiennent aux familles

β1, β2, β3 et β7. Chez la souris, comme chez l’homme, les progéniteurs restreints au lignage

myéloïde voient apparaître à leur surface des intégrines β2 telles que LFA-1 (lymphocyte

function-associated antigen-1 ; Torensma R. et al., 1996), alors que les précurseurs

mégacaryocytaires acquièrent le récepteur du fibrinogène αIIbβ3. Il est à noter que

l’expression de l’intégrine β3 est spécifique de la mégacaryocytopoïèse. Bien que capables de

former des colonies myéloïdes in vitro, les cellules CD34+ LFA-1+ humaines ou murines sont

incapables de reconstituer une hématopoïèse à long terme après leur transplantation.

Réciproquement, seules les cellules CD34+ LFA-1- ont le pouvoir de reconstituer une

hématopoïèse à long terme suivant leur transplantation, une caractéristique essentielle qui

distingue les cellules souches (Torensma R. et al., 1996 ; Orschell-Traycoff C.M. et al.,

2000).

La délétion concomitante des intégrines β1 et β7 n’entraîne pas d’anomalie majeure de

l’hématopoïèse adulte (Bungartz G., 2006). Il semble pourtant que les intégrines β1 soient

77


importantes pour les processus de migration et de colonisation du foie, de la rate et de la

moelle chez l’embryon (Potocnik A.J., 2000).

Or, la sous-unité α4 peut s’associer avec les sous-unités β1 et β7. De plus, il apparaît

que l’intégrine α4 est essentielle pour le maintien d’une hématopoïèse normale, dans les

contextes microenvironnementaux du foie, de la rate et de la moelle, en période fœtale et

périnatale, en régulant la balance prolifération/différenciation des progéniteurs

hématopoïétiques (Arroyo A.G. et al., 1999 ; Gribi R. et al., 2006). Dans des modèles de

délétion conditionnelle ou d’utilisation d’anticorps bloquants ciblant α4, le rôle de cette

intégrine dans les processus de « homing », c’est-à-dire de localisation des CSH dans la niche

hématopoïétique, nécessaires à une hématopoïèse à long terme après greffe, est clairement

établi (Scott L.M. et al., 2003). De façon intéressante, il semble que le rôle principal de

l’intégrine α4 soit de permettre une hématopoïèse régénératrice en réponse au stress (Scoot

L.M. et al., 2003 ; Priestley G.V. et al., 2006).

Les interactions adhésives indispensables au bon déroulement de l’hématopoïèse ne

reposent pas uniquement sur les intégrines. D’autres récepteurs d’adhésion, tels que CD44 et

CXCR4, jouent un rôle essentiel dans les capacités de rétention dans la niche hématopoïétique

et dans la balance prolifération/différenciation des progéniteurs, en régulant des voies

redondantes ou complémentaires de celles contrôlées par les intégrines.

2. Le rôle critique des intégrines de type β1 dans l’hématopoïèse

Les intégrines β1 sont les seules intégrines présentes à la surface des CSH capables de

reconstituer l’hématopoïèse à long terme. Les CSH expriment quatre intégrines appartenant

toutes à la famille β1 (CD29) : 1) α2β1 (CD49b/CD29) ou VLA-2 (very late antigen-2),

récepteur pour les collagènes, 2) α4β1 (CD49d/CD29) ou VLA-4, récepteur pour la

fibronectine et pour VCAM-1 (CD106), 3) α5β1 (CD49e/CD29) ou VLA-5, récepteur pour la

fibronectine et 4) α6β1 (CD49f/CD29) ou VLA-6, récepteurs pour les laminines (Levesque

J.P. et al., 1995 ; Simmons P.J. et al., 1997).

78


2.1. La distribution des intégrines β1 et de leurs ligands dans le système

hématopoïétique

Chez l’humain adulte, les précurseurs hématopoïétiques médullaires, incluant les

cellules souches ont un phénotype CD34+ CD38- ou CD34+ Thy-1+ et expriment de façon

prédominante α4β1 et α5β1, par rapport aux intégrines α2β1 et α6β1. L’adhésion des

cellules CD34+ à la fibronectine requiert une activation préalable des intégrines α4β1 et α5β1

(signalisation « inside-out », qui sera développée dans une partie ultérieure ; Kerts J .M. et

al., 1993).

Au cours de la maturation myéloïde, une forte diminution de l’expression de

l’intégrine α5β1 est observée (Kerts J .M. et al., 1993). Tandis qu’au cours de la maturation

érythroïde, c’est l’expression à la fois de VLA-4 et VLA-5 qui diminue et, ensuite, elles ne

sont plus exprimées à la surface des hématies permettant ainsi leur mise en circulation dans le

sang (Vuillet-Gaugler M.H. et al., 1990).

La distribution des ligands des intégrines β1 dans l’os et la MO de souris (Nilsson S.K.

et al. 1998) est résumée dans le tableau 4. Les niches endostéale et vasculaire ont une

composition matricielle remarquablement différente, suggérant un engagement différentiel

des intégrines, exprimées en surface des CSH, selon leur localisation.

Tableau 4 : Localisation des ligands pour les intégrines dans l’os et la moelle osseuse murins. (Levesque J.P. et al., 2001).

2.2. La modulation de l’activité des intégrines β1 dans les CSH

Les intégrines β1 des CSH sont assujetties à une régulation par les ions bivalents du

microenvironnement, les peptides matriciels, et les interactions entre les facteurs de

croissance, les chémokines, et les récepteurs d’adhérence. La mise en activation des intégrines

79


pour qu’elles puissent reconnaître leur ligand est appelée signalisation « inside-out », alors

que la régulation des signaux qu’elles contrôlent, après liaison de leur ligand, est appelée

signalisation « outside-in ». Ces deux processus impliquent des signalisations cellulaires

spécifiques.

a). Les signalisations « inside-out » et « outside-in » des intégrines

Les intégrines β1 en surface des cellules hématopoïétiques sont exprimées sous forme

inactive et requièrent une activation préliminaire pour être capables de lier leurs ligands et

d’assurer leurs fonctions adhésives (Kerts J .M. et al., 1993) : c’est la signalisation « inside-

out ». Chez les progéniteurs hématopoïétiques, cette signalisation « inside-out » fait intervenir

les kinases PI-3K (Levesque J.P. & Simmons P.J., 1999) et les GTPases de la famille Rho

telles que Rac2 (Jansen M. et al., 2005). Cette activation des intégrines résulte d’un

changement de leur conformation tridimensionnelle (Schwartz M.A. et al., 1995), via très

probablement une modification des propriétés physico-chimiques des adaptateurs, telles que

la taline, qui joignent le domaine cytoplasmique des intégrines au cytosquelette (Martel V. et

al., 2001 ; Tanentzapf G. & Brown N.H. , 2006).

Suite à cette activation primaire des intégrines qui augmente leur affinité pour leurs

ligands, la signalisation « outside-in » peut avoir lieu. En permettant la formation des points

de contact focaux, cette signalisation induit le regroupement des intégrines (appelé aussi

« clustering ») à la surface des cellules entraînant une stabilisation des complexes récepteur-

ligand (avidité), le recrutement, l’exclusion ou l’activation de protéines effectrices ou

structurales au sein de microdomaines membranaires, appelés « rafts ». Il est intéressant de

noter que le « clustering » des rafts est un élément crucial de l’activation des CSH, puisque le

regroupement de ces microdomaines induit par les cytokines est essentiel à l’entrée des CSH

dans le cycle cellulaire et que l’inhibition de leur « clustering » conduit à une accumulation

nucléaire de FOXO et provoque, ex vivo, la dormance des CSH (Yamazaki S. et al., 2006).

Les rafts lipidiques sont donc le lieu privilégié d’interactions entre les récepteurs aux facteurs

de croissance (tels que IGF-1) ou aux chémokines et les intégrines (Shamri R. et al., 2002 ;

Tai Y.T. et al., 2003) et de la régulation croisée de leurs signalisations.

b). Les facteurs de croissance hématopoïétiques

Les facteurs de croissance hématopoïétiques tels que les IL- 3 et 6, le G-CSF et le

GM-CSF, la thrombopoïétine, l’IGF-1, les ligands de c-Kit (SCF) et de Flt-3 (Flt-3L) activent

80


de façon transitoire les intégrines α4β1 et α5β1, qui participent ainsi aux signalisations pro-

prolifératives et pro-migratoires dans les cellules hématopoïétiques (Levesque J.P. et al.,

1996 ; Kapur R. et al., 2001).

Dans les cellules CD34+, l’équipe de Verfaillie a montré que le blocage en transition

G1/S induit par les intégrines peut être levé par l’addition d’IL3 et de GM-CSF, ou de SCF et

de Flt-3L (Jiang Y. et al., 2000). Cette balance en faveur de la prolifération par rapport à la

quiescence peut également être une conséquence de l’activation du récepteur de l’IGF-1. La

protéine adaptatrice RACK1, qui peut interagir avec la PKC, les intégrines β1 et le récepteur

de l’IGF-1, apparaît comme un carrefour important de la balance prolifération/quiescence

cellulaires (Hermanto U. et al., 2002). En effet, sa surexpression entraîne une inhibition de la

croissance cellulaire dépendante d’IGF-1 et favorise la formation des zones focales

d’adhésion et de l’étalement cellulaire (Hermanto U. et al., 2002).

c). Les chémokines

Les chémokines telles que le facteur chimiotactique stromal SDF-1 (qui a été évoqué

précédemment dans le chapitre I) peuvent aussi moduler l’activité des intégrines (figure 22).

En effet, ce facteur produit par les ostéoblastes, le stroma et l’endothélium médullaires

(Ponomaryov T. et al., 2000) est capable d’activer la migration des précurseurs

hématopoïétiques et myéloïdes par l’intermédiaire de α4β1, α5β1 et α2β1 (Peled A. et al.,

1999). Le dialogue entre les chémokines et les intégrines a donc un impact majeur sur la

localisation médullaire des progéniteurs hématopoïétiques, leur rétention et leur mobilisation

dans la circulation sanguine.

d). Les autres récepteurs d’adhérence

Il existe à la surface des CSH et des progéniteurs hématopoïétiques d’autres types de

récepteurs d’adhésion que les intégrines (tableau 5). En effet, les sélectines, les sialomucines

(figure 22), le récepteur CD44, la superfamille des immunoglobulines et les cadhérines

constituent les autres super-familles de molécules d’adhérence, qui peuvent modifier

l’hématopoïèse en interagissant ou non avec les intégrines.

81


Figure 22 : Modèle d'interconnexion des réseaux de cytokines et de molécules d'adhérence cellulaire dans les contrôles de la localisation, prolifération et différenciation des CSH. (D’après Levesque J.P. et al., 2001).

Les sélectines sont des protéines transmembranaires avec un domaine extracellulaire

constitué d’un domaine homologue aux lectines, un domaine homologue à l’EGF et un

domaine homologue aux protéines du complément. La L-sélectine est exprimée par les CSH

et les progéniteurs lymphoïdes et myéloïdes. Or, il a été montré qu’un des récepteurs de la L-

sélectine exprimé par les CSH humaines est une isoforme jusqu’à présente non décrite du

CD44 (Dimitroff C.J. et al., 2000). Quant à la E- et la P-sélectine, elles permettent de

maintenir, in vitro et in vivo dans la MO, les CSH dans un état peu prolifératif sans affecter la

prolifération des progéniteurs plus tardifs chargés d’assurer le renouvellement des cellules

sanguines (Bradford G.B. et al., 1997).

82


Tableau 5 : Les super-familles de molécules d’adhérence (hormis les intégrines) dans le système hématopoïétique. (D’après Levesque J.P. et al., 2001).

Les sélectines ont aussi un rôle dans la transduction du signal car lorsqu’elles interagissent

avec leur ligand, elles peuvent modifier les niveaux d’expression, l’état d’activation et/ou la

fonction de molécules d’adhérence telles que les intégrines β1 (Chan J.Y. & Watt S.M.,

2001). Tous ces résultats indiquent que les sélectines sont donc essentielles au maintien de

l’homéostasie du système hématopoïétique.

Les CSH expriment aussi des sialomucines, qui présentent un niveau élevé de N- et O-

glycosylations riches en acide sialiques. Cette famille comprend notamment le marqueur des

progéniteurs hématopoïétiques et CSH, le CD34, le CD43 ou leucosialine/sialophorine, le

CD164 et le PSGL-1 (P-selectin glycoprotein-1), qui est le récepteur de la P-sélectine. Toutes

les sialomucines dont la fonction a été étudiée (CD34, CD43, CD164 et PSGL-1) ont un rôle

inhibiteur sur l’hématopoïèse (figure 22), et le CD43 a la capacité d’augmenter l’affinité des

intégrines qui se lient à la fibronectine, dans les progéniteurs hématopoïétiques (Anzai N. et

al., 1999).

83


Le récepteur CD44 a un rôle majeur dans l’adhésion des progéniteurs

hématopoïétiques aux cellules stromales notamment aux ostéoblastes, via son interaction avec

l’acide hyaluronique, la fibronectine et l’ostéopontine. Le CD44 coopère également avec les

intégrines β1, dans la régulation de la prolifération des cellules hématopoïétiques (Lundell

B.I. et al., 1997). De plus, des altérations fonctionnelles du CD44 ont été rapportées dans le

développement leucémique (Ghaffari S. et al., 1999).

Les cadhérines E, N et P sont exprimées dans les progéniteurs hématopoïétiques, alors

que les VE-cadhérines signent une population de CSH très immatures, proches des

hémangioblastes (Shinoda G. et al., 2007). Nous avons abordé précédemment que les N-

cadhérines joueraient, elles, un rôle primordial dans l’ancrage des CSH aux ostéoblastes. Les

E et N-cadhérines sont exprimées à la fois sur les cellules stromales et sur une sous-

population de cellules CD34+. Plusieurs études ont démontré l’existence d’une interaction

entre les intégrines β1 et les cadhérines, notamment les N-cadhérines (Monier-Gavelle F. &

Duband J.L., 1997), essentielle pour la migration cellulaire (Huttenlocher A. et al., 1998). Or,

la tyrosine kinase FER semble être un élément important de régulation de l’interaction entre

les N-cadhérines et les intégrines β1, notamment via le contrôle de l’association de la β-

caténine aux cadhérines (Arregui C. et al., 2000 ; Piedra J. et al., 2003). Il reste à déterminer

quelle est la nature exacte des relations croisées entre les cadhérines et les intégrines dans les

CSH.

D’autres antigènes transmembranaires, tels que le récepteur d’adhérence PECAM-

1/CD31, sont capables d’accroître l’activité adhésive de l’intégrine α4β1 (Leavesley D.I. et

al., 1994).

e). Les cations métalliques divalents

Les cations métalliques divalents Mg2+, Ca2+ et Mn2+ permettent aussi de moduler

l’activité de certaines intégrines. Ainsi, de fortes concentrations en calcium inhibent l’affinité

des intégrines β1 sur la fibronectine dans les cellules hématopoïétiques, alors que le Mn2+ est

un très fort activateur (Takamatsu Y. et al., 1998). Dans l’endostéum, à l’interface os-moelle,

la concentration de Ca2+ peut atteindre 40 mM (Silver I.A. et al., 1988), et il en est de même

pour le Mn2+ (Takamatsu Y. et al., 1998). Ces ions sont extrêmement majeurs pour la

régulation de l’affinité des récepteurs d’adhésion, tels que les intégrines et les cadhérines

(Takamatsu Y. et al., 1998). Indirectement, le Ca2+ extracellulaire peut influencer le taux de

PTH et donc fortement moduler les fonctions des ostéoblastes et des CSH. De façon

84


intéressante, la PTH régule l’expression des intégrines sur les ostéoblastes, in vivo (Kaiser E.

et al., 2001).

Enfin, les ions extracellulaires peuvent influencer fortement les voies de signalisation

intracellulaires des CSH, notamment reliées à l’adhésion cellulaire, comme nous allons le

découvrir dans le paragraphe suivant.

3. Les grandes voies de signalisation en aval des intégrines β1

Les intégrines β1 sont capables de se lier à de nombreuses molécules structurales ou

de signalisation pour induire la migration, la survie ou la prolifération cellulaires. Ainsi, elles

peuvent interagir au niveau de leur domaine cytoplasmique avec des protéines du

cytosquelette, telles que la paxilline, la vinculine, la taline et la tensine pour établir des

contacts focaux nécessaires à la mise en place d’un cytosquelette organisé et à l’interaction

des acteurs de la signalisation. Ces acteurs sont des GTPases des familles Ras et Rho, ainsi

que des kinases (Takahashi K., 2001 ; Suzuki K. & Takahashi K., 2003 a,b) telles que ILK

(Hannigan G.E. et al., 1996), PKC, Src, CaMKII (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase

II ; Suzuki K. & Takahashi K., 2003 b) et les protéines de la famille FAK, et des phosphatases

comme PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B), SHIP (src homology inositol phosphatase)

et PP2A (Hannigan G.E. et al., 1996 ; Mulrooney J. et al., 2000 ; Suzuki K. & Takahashi K.,

2003 a).

Ces plateformes proximales, qui se constituent au niveau de la queue cytoplasmique des

intégrines, vont activer les grandes cascades de signalisation telles que les voies PI-3K/Akt,

JNK/SAPK, MAPK, aboutissant à la régulation de la transcription génique.

Notre étude bibliographique se focalisera sur deux familles de protéines directement en

rapport avec notre sujet de recherche, la famille des kinases FAK et la famille des

phosphatases PP2A.

3.1. La famille des Focal Adhesion Kinases : le rôle particulier de Pyk2

FAK est la protéine la plus souvent recrutée par les intégrines. Or cette protéine est le

chef de file de la famille des « Focal adhesion kinases », qui est constituée de quatre

membres : FAK, la « proline-rich tyrosine kinase 2 » ou Pyk2, la FAK-related non-kinase ou

FRNK et la Pyk2-related non-kinase ou PRNK. Nous allons particulièrement nous intéresser

à FAK et à Pyk2, car le système hématopoïétique offre la particularité de ne pas exprimer la

85


kinase FAK dans les progéniteurs immatures (elle n’apparaît qu’à la fin de la maturation

hématopoïétique), alors que la protéine Pyk2 est exprimée de façon ubiquitaire dans

l’ensemble des cellules hématopoïétiques (Avraham H. et al., 2000). Dans le contexte de la

niche hématopoïétique, le fait que les CSH expriment spécifiquement Pyk2 est

particulièrement intéressant, dans la mesure où cette voie est un senseur du Ca2+ et du stress

oxydant (Dougherty C.J. et al., 2004).

La proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), tyrosine kinase non réceptrice de 110kDa, a

d’abord été mise en évidence pour son rôle dans l’adhésion cellulaire et donc, dans un premier

temps, elle a été nommée la CAK-β, pour cell adhesion kinase β (Sasaki H. et al., 1995), ou

RAFTK, pour related adhesion focal tyrosine kinase (Avraham H. et al., 1995). Comme la

protéine Pyk2 est aussi une tyrosine kinase dépendante du calcium, elle est aussi connue sous

le nom de calcium-dependent tyrosine kinase (CADTK ; Yu H. et al., 1996). Elle appartient à

la famille FAKs, puisqu’elle partage un arrangement des domaines similaires à la protéine

FAK, ainsi qu’une identité de séquence de 60% dans le domaine kinase central (figure 23), ce

qui lui a valu également le nom de focal adhesion kinase 2 (FAK2).

Pyk2 est majoritairement exprimée dans les systèmes nerveux central et

hématopoïétique, alors que l’expression de FAK est ubiquitaire. De plus, au contraire de

FAK, qui est localisée principalement aux sites des zones focales d’adhésion dans les cellules

adhérentes, Pyk2 est surtout diffusée dans tout le cytoplasme et concentrée dans la région

périnucléaire de la cellule (Andreev J. et al., 1999).

La kinase Pyk2 présente un arrangement des domaines FERM (protein 4.1, ezrin, radixin and

moesin homology) en position N-terminale, kinase et FAT (focal adhesion targeting) en

position C-terminale, similaire à la protéine FAK, avec une identité de séquence de 60% dans

le domaine kinase central et de 40 % dans le domaine FERM, une conservation des régions

riches en proline (proline-rich regions pour PRR), et des positions identiques pour les quatre

sites de phosphorylations sur tyrosines (tyr). Les tyrosines de Pyk2 402, 579, 580 et 881

correspondent aux tyrosines 397, 576, 577 et 925 de FAK, respectivement (figure 23). Des

différences structurales permettent toutefois une redondance limitée des fonctions de ces

tyrosines kinases dans les cellules, même si elles sont toutes deux capables de se lier aux

kinases de la famille Src et d’activer des voies de signalisation communes. La protéine FAK

est ainsi un important médiateur de la prolifération cellulaire, de la survie et de la migration

cellulaires. Quant à Pyk2, c’est une kinase qui est activée en réponse à une augmentation des

taux de calcium dans la cellule ou à des signaux de stress et qui, contrairement à FAK, peut

induire un arrêt de prolifération et l’apoptose.

86


Figure 23 : Séquences des protéines FAK et Pyk2. La phosphorylation de Pyk2 sur Tyr402 et Tyr881 crée des sites de liaison Src-homology-2 (SH2) pour Src et GRB2, respectivement. Les domaines FERM (protein 4.1, ezrin, radixin and moesin homology) et FAT (focal adhesion targeting) permettent, respectivement, d’une part une régulation négative par un repliement intramoléculaire et l’association au cytosquelette et aux intégrines et, d’autre part, la liaison à la paxilline, et donc à la localisation de Pyk2 dans les zones focales d’adhésion. PRR : proline-rich regions. (D’après Mitra S.K.et al., 2005).

a). Son expression tissulaire

Pyk2 est particulièrement exprimée dans le système nerveux central et dans les

cellules hématopoïétiques, deux tissus où le Ca2+ extracellulaire joue un rôle essentiel dans la

régulation de la signalisation cellulaire. De plus, il est intéressant de constater que la

duplication génique conduisant à l’expression de Pyk2, en plus de FAK dans les tissus,

n’apparaît que chez les vertébrés (Corsi J.M. et al., 2006).

Il est à noter que mis à part ses multiples rôles dans le système nerveux central, tels

que la croissance du neurite, la plasticité, et la différenciation cellulaires (Girault J.A. et al.,

1999), Pyk2 a été récemment impliquée dans la survie en réponse à un stress de polarisation

membranaire des neurones cérébelleux (Strappazzon F. et al., 2007).

Deux isoformes d’épissage de Pyk2 ont été décrites. Ainsi, Dikic et ses collaborateurs

ont mis en évidence une isoforme de Pyk2, Pyk2-H, exprimée principalement dans les

cellules hématopoïétiques, incluant les CSH ou les progéniteurs hématopoïétiques CD34+

(Salesse S. et al., 2004), les cellules B, T et NK (Dikic I. et al., 1998). Pyk2-H est un variant

d’épissage de la forme pleine taille de Pyk2 (qui est la forme prédominante dans le cerveau),

87


puisqu’il est caractérisé par l’absence de l’exon 23 codant pour 42 acides aminés dans la

région C-terminale.

b). Son activation

Pyk2 est activée par une multitude de stimuli extracellulaires (figure 24), notamment les

intégrines et les signaux de stress (TNFα, rayons UV, radicaux oxygénés, modifications

membranaires de polarisation ou d’osmolarité) (Tokiwa G. et al., 1996 ; Yu H. et al., 1996 ;

Derkinderen P. et al., 1998 ; Chauhan D. et al., 1999 ; Avraham H. et al., 2000 ; Zhao T. &

Bokoch G.M., 2005). A la suite de ces stimuli, des modifications du taux intracellulaire de

Ca2+, du cytosquelette ou de l’activité de différentes kinases telles que PKCδ et CAMKII, ou

de phospholipases, comme la PLD2, vont aboutir à l’activation de Pyk2 (Ginnan R. & Singer

H.A., 2002 ; Frank G.D. et al., 2003 ; Banno Y. et al., 2005 ; Wu S.S. et al., 2006).

L’activation de Pyk2 repose sur une trans-autophosphorylation sur la tyrosine 402, ce qui

induit son activation (Dikic I. et al., 1996). Ensuite, Pyk2 recrute et active les kinases de la

famille Src qui en retour phosphorylent Pyk2 sur trois autres résidus tyrosine (tyr 579, 580 et

881), ce qui permet l’interaction avec des protéines adaptatrices importantes de la

signalisation, telles que GRB2 (Avraham H. et al., 2000). Or, cette phosphorylation sur les

tyrosines 579 et 580 est nécessaire pour la complète activation de Pyk2 (Dikic I. et al., 1996 ;

Avraham H. et al., 2000). De plus, un clivage limité de Pyk2 par les calpaïnes semblent

participer à la stimulation de la migration cellulaire (Calle Y. et al., 2006).

L’équipe de Verfaillie a démontré que, suite à l’engagement des intégrines β1 sur les cellules

CD34+, l’activation de la PI-3K entraîne la phosphorylation de Pyk2, ce qui est nécessaire au

recrutement du complexe PI-3K/Pyk2 au niveau de l’intégrine β1 (Melikova S. et al., 2004).

Puis, cette même équipe a montré que Pyk2 inhibait la maturation myéloïde et induisait ainsi

le maintien du pool de CSH (Dylla S.J. et al., 2004). D’après ces résultats, Pyk2 semble jouer

un rôle majeur dans le maintien du pool des CSH, mais les mécanismes impliqués sont pour

l’instant inconnus.

Pyk2 joue donc le rôle de kinase activatrice proximale dans plusieurs cascades de

signalisation intracellulaire, comme les voies MAPK-ERK p42/p44 et SAPK (figure 24).

De plus, Pyk2 contrôle des protéines régulatrices du cytosquelette, telles que Cbl, Rho-GAP,

la paxilline et la β-caténine (Ostergaard H.L. et al., 1998 ; Ren X.R. et al., 2001 ; Haglund K.

et al., 2004 ; Van Buul J.D. et al., 2005).

88


Figure 24 : Voies de signalisation potentielles induites par Pyk2/RAFTK/CAK-β/CADTK. La tyrosine phosphorylation de Pyk2 est stimulée par les hormones, les neurotransmetteurs, les facteurs de croissance, les intégrines, les cytokines, les récepteurs couplés à des protéines G (RCPG), les cytokines inflammatoires et les signaux de stress. 7TMRs : receptors with seven-helix transmembrane regions ; ERK-1 : p44 MAP kinase ; ERK-2 : p42 MAP kinase ; MAPK : mitogen-activated protein kinase ; MEKK1 : MAPKKK protein ; MKK4 : MAP kinase kinase 4 ; PI(3)K : phosphatidylinositol-3 kinase ; PKC : protein kinase C ; PLC : phospholipase C ; PTK : protein tyrosine kinase ; RTK : receptor tyrosine kinase ; SAP : stress-activated protein ; SAPK : stress-activated protein kinase. (D’après Avraham H. et al., 2000).

c). Son rôle en oncogenèse

Dans différents types de tumeurs (cancer du sein, de la prostate, gliomes) Pyk2 a été

impliquée dans leurs capacités invasives (Zrihan-Licht S. et al., 2000 ; De Amicis F. et al.,

2006). De plus, Pyk2 est un acteur de l’angiogenèse (Tang H. et al., 2002) et un facteur de

89


mauvais pronostic corrélé à une progression tumorale agressive (Sun C.K. et al., 2007).

Une étude s’est intéressée à la signalisation en aval des intégrines β1, impliquée dans la

maintenance et la balance prolifération/différenciation des CSH, mais anormale dans les

LMC. Ainsi, ils se sont penchées sur l’épissage de Pyk2, une kinase majeure en aval de ces

intégrines dans les cellules hématopoïétiques CD34+. Or, dans des cellules de LMC, un

épissage alternatif de Pyk2 est observé et provoque l’augmentation de Pyk2 pleine taille. Ceci

est réversé par un inhibiteur de BCR/ABL (breakpoint cluster region/ Abelson kinase). Donc,

l’activité kinase de BCR/ABL en favorisant un épissage alternatif de Pyk2 pleine taille

pourrait contribuer à la pathogenèse des LMC, ainsi que la forme pleine taille de Pyk2

(Salesse S. et al., 2004)

Tous ces résultats mettent en lumière le rôle majeur de Pyk2 dans l’oncogenèse, rôle accru par

son impact également sur la survie cellulaire.

d). Son rôle dans la survie cellulaire

Pyk2 a été montrée comme promoteur de la survie cellulaire en réponse au stress

(Banno Y. et al., 2005 ; Strappazzon F. et al., 2007), à des cytokines (Benbernou N. et al.,

2000), à l’endothéline-1 (Ogata Y. et al., 2003), et dans un cas de résistance à l’anoïkis de

cellules tumorales du poumon (Wei L. et al., 2004). Selon les conditions de stimulation, les

voies de survie en aval de Pyk2 sont la voie PI-3K/Akt (Banno Y. et al., 2005), la voie JNK

(Dougherty C.J. et al., 2004), ou la surexpression de Bcl-xl (Ogata Y. et al., 2003).

A contrario, Pyk2 peut avoir une fonction pro-apoptotique. Sa surexpression dans les

fibroblastes de souris et de rat conduit à la mort cellulaire par apoptose (Xiong W. & Parsons

J.T., 1997). Par la suite, plusieurs travaux ont démontré le rôle pro-apoptotique de Pyk2 en

réponse à des glucocorticoïdes, dans des cellules normales et tumorales (Chauhan D. et al.,

1999 ; Plotkin L.I. et al., 2007), au TNFα (Avdi N.J. et al., 2001), et en réponse à une

suractivation chronique de Pyk2 dans le contexte d’un remodelage cardiaque (Melendez J. et

al., 2004). Ces processus pro-apoptotiques dépendants de Pyk2 requièrent une activation de

JNK (Avdi N.J. et al., 2001 ; Plotkin L.I. et al., 2007), ou des voies p38 et caspase 3

(Melendez J. et al., 2004). De plus, l’inhibition des calpaïnes, protéases qui clivent Pyk2,

bloque l’apoptose induite par les glucocorticoïdes (Squier M.K. & Cohen J.J., 1997). Enfin, il

est intéressant de signaler l’existence d’un inhibiteur physiologique de Pyk2, le FIP200, qui

bloque l’apoptose induite par Pyk2 (Ueda H. et al., 2000).

90


3.2. Les phosphatases PP2A

Les PP2A constituent une famille de sérine/thréonine phosphatases qui régulent la

prolifération, la survie et la différenciation cellulaires (Janssens V. & Goris J., 2001 ; Wang et

al., 2004). Leur perte de fonction a été associée avec la transformation cellulaire (Janssens V.

et al., 2005). PP2A est impliquée dans la régulation de complexes adhésifs comprenant les

cadhérines (Takahashi K. & Suzuki K., 2006) ou les intégrines (Mulrooney J. et al., 2000).

a). Leurs structures et leurs régulations

Plusieurs complexes d’holoenzymes de PP2A ont été isolés à partir d’une variété de

tissus et ont été largement caractérisés. L’enzyme principale (« core ») est un dimère

(PP2AD), comprenant une sous-unité catalytique de 36 kDa (PP2AC) et une sous-unité

régulatrice de 65 kDa, appelée PR65 ou la sous-unité A. Une troisième sous-unité régulatrice

B peut être associée avec cette structure principale. Pour le moment, quatre familles

différentes de sous-unités B ont été identifiées et nommées les familles B, B’, B’’ et B’’’

(figure 25).

Figure 25 : Structure des différentes sous-unités de PP2A. C est la sous-unité catalytique, A est la première sous-unité régulatrice ou structurale, et B/B’/B’’/B’’’ constituent le second type de sous-unités régulatrices. Chez les Mammifères, les sous-unités A et C sont codées par deux gènes (α et β), la sous-unité B/PR55 est codée par quatre gènes voisins (α, β, γ et δ) et la famille B’/PR61 est codée par cinq gènes voisins (α, β, γ, δ et ε). (D’après Janssens V. & Goris J., 2001).

91


Comme chaque sous-unité existe sous plusieurs isoformes, il y a environ 75 compositions

d’holoenzymes de PP2A différentes. Une spécificité d’expression dans les tissus

hématopoïétiques n’a pas encore été décrite.

La sous-unité catalytique nommée PR65 ou A, très conservée, possède une activité

très hautement régulée par des méthylations réversibles qui régulent les interactions entre les

sous-unités (figure 26).

Figure 26 : Régulation de PP2A. PP2A est régulée par la liaison des trois sous-unités régulatrices variables (PR55/B, PR61/B’, et PR72/B’’) au complexe PR65/A/PP2Ac et par des modifications post-traductionnelles. PME-1 : phosphatase methylesterase 1 ; LMCT : leucine carboxyl methyltransferase ; PTPA : PP2A activator. (D’après Janssens V. et al., 2005).

La localisation cellulaire de PP2A est très variée (noyau, membrane plasmique et micro-

domaines membranaires, cytosquelette, mitochondrie) et reliée à ses fonctions régulatrices de

la prolifération, de l’apoptose, de l’adhésion et de la transcription génique.

b). Leurs multiples implications dans les fonctions cellulaires

Les sérine/thréonine phosphatases PP2A sont des phosphatases majeures qui régulent

une multitude de processus cellulaires, comme la prolifération, la survie et la différenciation

92


cellulaires et la suppression tumorale (Wang S.S. et al., 1998 ; Janssens V. & Goris J., 2001 ;

Janssens V. et al., 2005).

Ainsi, PP2A peut moduler la voie de signalisation Wnt/β-caténine (Janssens V. & Goris

J., 2001). En absence de signal Wnt, la β-caténine est localisée au niveau de la membrane

plasmatique, où PP2ACα stabilise le complexe β-caténine/E-cadhérine, qui lui-même induit

les interactions avec le cytosquelette d’actine. La β-caténine est également localisée dans un

autre complexe, au niveau du cytoplasme, avec l’APC, l’axine et GSK3β. En présence de

ligand Wnt, l’activité de GSK3β dans ce dernier complexe est bloquée par Dishevelled, ce qui

induit une accumulation d’axine, d’APC et de β-caténine non phosphorylées. Or, PP2A, et

notamment PP2Ac, pourrait contribuer à cet état en déphosphorylant directement l’APC,

l’axine et peut-être β-caténine. La β-caténine peut alors s’accumuler dans le cytosol, puis être

transloquée au noyau où elle permet la transcription de ses gènes cibles impliqués dans

l’autorenouvellement des CSH (voir chapitre I). PP2Ac pourrait donc être impliquée dans la

régulation de la voie Wnt, en contrôlant l’équilibre entre la β-caténine accrochée aux

cadhérines et la β-caténine cytosolique libre, et/ou en régulant la translocation nucléaire de la

β-caténine et son activité transcriptionnelle via LEF/TCF.

PP2A a également un rôle dans l’apoptose. Ce rôle a été suggéré par son interaction

avec la caspase 3 et Bcl-2 (Santoro M. F. et al., 1998 ; Deng X. et al., 1998). Par exemple,

dans des cellules Jurkat apoptotiques, la caspase 3 est activée et clive PR65/A, ce qui entraîne

l’augmentation de l’activité de PP2Ac, mesurée par la diminution de la phosphorylation des

MAPK (Santoro M. F. et al., 1998). De plus, Bcl-2, une protéine anti-apoptotique puissante,

est régulée par phosphorylation sur sérine. Cette phosphorylation est nécessaire pour sa

capacité à supprimer l’apoptose et peut être réversée par une des formes de PP2A (Deng X. et

al., 1998). Inversement, PP2A peut être un facteur pro-survie aussi bien chez la drosophile

que dans des cellules de mammifères normales ou tumorales (Li X. et al., 2002 ; Kong M. et

al., 2004 ; Yi K.D. et al., 2005). Il est à noter également que, dans les cellules

hématopoïétiques, PP2A régule positivement la voie ERK/MAPK anti-apoptotique, en aval de

l’engagement de l’intégrine α2β1 (Chetoui N. et al., 2006), et son inhibition entraîne une

activation des voies classiques apoptotiques (caspase 3, 8 et 9 ; Boudreau R.T. et al., 2007).

De façon intéressante, dans les LAM, SET (Suvar 3-9, enhancer of zeste, trithorax),

qui est un inhibiteur spécifique et efficace de PP2A, peut fusionner avec CAN (nucleoporin

Nup214), apparemment suite à une translocation chromosomique. Cette protéine de fusion

SET-CAN pourrait compromettre la régulation normale de PP2A et contribuer à la

93


leucémogenèse (Neviani P. et al., 2005). Une autre publication d’intérêt, étant donné le rôle

de c-myc dans les leucémies, a mis en évidence l’existence d’un inhibiteur spécifique de

l’action inhibitrice de PP2A sur c-Myc, CIP2A, qui est surexprimé dans divers cancers

humains (Junttila M.R. et al., 2007).

c). Leur lien avec les intégrines β1

La protéine PP2A peut déphosphoryler l’intégrine β1 phosphorylée, favorisant ainsi sa

liaison aux filaments d’actine (F-actine). Cependant, si PP2A participe à la régulation de

l’assemblage des F-actine auxquels l’intégrine β1 est ancrée, cela reste encore un mécanisme

obscur. Ainsi, l’équipe de Takahashi a montré que l’enzyme PP2A de type AC (PP2A-AC),

constituée de la sous-unité régulatrice A (PP2A-A) et de la sous-unité catalytique C (PP2A-

C), forme un complexe avec l’intégrine β1, une petite GTPase Rac et son effecteur IQGAP1

dans des cellules mammaires humaines non malignes (Suzuki K. et al., 2005). Dans cette

étude, ils proposent que PP2A, particulièrement PP2A-A, permet de maintenir l’assemblage

des F-actine auxquels l’intégrine β1 est ancrée, en recrutant IQGAP1 au niveau du complexe

intégrine β1/Rac. De façon intéressante, ce mécanisme n’est pas retrouvé avec certaines

isoformes de sous-unité d’intégrines β1.

Des données supplémentaires indiquent un rôle positif des PP2A dans la signalisation

dépendante des intégrines. Ainsi, l’inhibition de l’activité de PP2A induit une perte sélective

des intégrines β1 au niveau des zones focales d’adhésion (Mulrooney J.K. et al., 2000) et

inhibe l’adhésion cellulaire (Coppolino M.G. & Dedhar S., 2000). PP2A colocalise avec les

intégrines β1 dans les sites d’adhésion et son activation semble dépendre d’un résidu

spécifique Trp775 de la queue cytoplasmique de l’intégrine β1 (Pankov R . et al., 2003). Cette

interaction spécifique avec l’intégrine β1 est responsable de la déphosphorylation d’Akt (ce

qui la rend inactive) et est corrélée avec celle de GSK3β (ce qui la rend active) (Ivaska J. et

al., 2002). De plus, PP2A peut influencer la conversion de HEF1 (human enhancer of

filamentation 1), un membre de la famille des Cas, qui participe à la signalisation des

intégrines et des facteurs de croissance impliquée dans des fonctions cellulaires, comme la

croissance, la motilité et l’apoptose. En effet, une étude a pu montrer que l’organisation du

cytosquelette d’actine dépendante de l’adhésion régule le turnover de HEF1, via l’activité de

PP2A (Zheng M. & McKeown-Longo P.J., 2006).

Ainsi, les interactions entre les intégrines β1 et PP2A contrôlent plusieurs acteurs

importants de la survie cellulaire.

94


4. Les intégrines α4β1 et α5β1 dans l’hématopoïèse physiologique et

leucémique

Ce chapitre est consacré aux quelques rares données de la littérature concernant les

rôles des intégrines α4β1 et α5β1 dans la leucémogenèse et la chimiorésistance des LAM.

4.1. L’intégrine α4β1

a). Ses fonctions dans les blastes leucémiques

L’intégrine α4β1 est exprimée à la surface des blastes leucémiques (Reuss-Borst M.A.

et al., 1995 ; Vila L. et al., 1995) et a été impliquée principalement dans la migration (Burger

J.A. et al., 2003) et leur adhésion au stroma médullaire (Liesveld J.L. et al., 1993).

De plus, l’expression de l’intégrine α4β1 sur les blastes leucémiques a été associée à

des paramètres de mauvais pronostic, comme l’hyperleucocytose (Vila L. et al., 1995) et de

CAM-DR (Matsunaga T. et al., 2003). Ainsi, Matsunaga et ses collaborateurs ont montré que

les cellules leucémiques exprimant l’intégrine α4β1 acquièrent une résistance à l’anoïkis et à

l’apoptose induite par un agent chimiothérapeutique, via la voie de signalisation PI-

3K/Akt/Bcl-2 activée par l’interaction entre l’intégrine α4β1 et la fibronectine. Ensuite, à

l’aide d’un modèle murin de maladie minimale résiduelle, ils ont mis en évidence que la

combinaison d’un anticorps dirigé contre cette intégrine et d’une anthracyline permettait

d’obtenir un pourcentage de survie de 100 % (Matsunaga T. et al., 2003). Cependant, ils n’ont

jamais pris en compte dans leur étude que les blastes leucémiques exprimaient très fortement

l’intégrine α5β1 et que cette dernière pourrait être responsable ultérieurement de rechutes en

induisant un processus de CAM-DR, rendant ainsi les CSL encore plus résistantes à une

nouvelle chimiothérapie.

b). Son ciblage thérapeutique

Etant donné que l’intégrine α4β1 est exprimée à la surface des blastes leucémiques et

des cellules impliquées dans les processus inflammatoires, les cellules immunitaires, son

ciblage thérapeutique revêt une grande importance dans la thérapie des LAM, tant au niveau

de l’éradication de la maladie résiduelle (CAM-DR), que de l’amélioration de l’efficacité des

greffes par son action de « homing » ou son implication dans l’immunité.

Ainsi, plusieurs essais cliniques ou études sur l’animal sont en cours, dans différentes

pathologies - cancers ou maladies inflammatoires -, sur des anticorps ou des petites molécules

95


(peptidomimétiques) qui bloquent le site de liaison du ligand pour inhiber la fonction de

l’intégrine α4β1. Bien que ces approches thérapeutiques soient efficaces, elles peuvent

engendrer des effets secondaires sérieux, tels que des défauts dans le développement

cardiaque, dans certains lignages hématopoïétiques, des réponses immunes, des effets

inattendus d’agonistes (stimulation des cellules T) et des risques infectieux. Cependant, à

cause de ces désagréments, de récentes investigations ont suggéré que la signalisation en aval

de l’intégrine α4 pourrait représenter une cible prometteuse pour le traitement de maladies

auto-immunes. Cela permettrait, par exemple, de bloquer la voie en aval de l’intégrine α4

impliquée dans la migration cellulaire, sans interférer sur celle induisant les contacts

cellulaires (pour revue Kummer C. & Ginsberg M.H., 2006).

4.2. L’intégrine α5β1

a). Ses fonctions dans les blastes leucémiques

L’intégrine α5β1 est exprimée à la surface des blastes leucémiques et sa surexpression a

été constatée par rapport aux cellules CD34+ normales (De Waele M. et al., 1999).

De façon intéressante, cette intégrine induit l’augmentation de l’adhésion sur fibronectine,

après stimulation des cellules leucémiques par le SCF, et supporte son action anti-

apoptotique, a contrario des cellules CD34+ normales (Bendall L.J. et al., 1998). En outre, la

fibronectine EDA+ est fréquemment retrouvée associée aux processus inflammatoires,

tumoraux et d’angiogenèse (Manabe R.. et al., 1997) - mécanismes présents dans la MO

leucémique - et est particulièrement bien liée par l’intégrine α5β1, présente à la surface des

CSL. Ainsi, on peut supposer que la liaison de cette fibronectine particulière avec l’intégrine

α5β1, dans un contexte leucémogène, favoriserait les mécanismes de migration et de

prolifération cellulaire.

Matsunaga et al. ont réalisé une étude sur la CAM-DR de cellules de patients de LAM

et ont conclu seulement à l’implication de l’intégrine α4β1, et pas de α5β1, dans ce processus

de résistance face à un stress génotoxique (Matsunaga T. et al., 2003). Or, cette conclusion

peut sembler un peu hâtive, car les auteurs ne tiennent pas compte du fait que les blastes

leucémiques des patients, ainsi que les lignées leucémiques utilisées, possèdent ces deux types

d’intégrines et que l’intégrine α5β1, très fortement exprimée à la surface de ces cellules

leucémiques, participe aussi aux interactions entre les CSL et la niche leucémique. En effet,

Damiano et ses collaborateurs ont démontré, eux, que la CAM-DR de blastes leucémiques

96


était induite par l’intégrine α5β1 (Damiano J.S. et al., 2001). Cependant, ces divergences de

résultats peuvent peut-être s’expliquer par des protocoles et des conditions expérimentales

différents.

b). Son ciblage thérapeutique

A l’heure actuelle, deux antagonistes de l’intégrine α5β1 sont en cours d’essai clinique

en tant qu’agents anti-tumoraux : l’ATN-161 et le Volociximab. Ils ont pour action de bloquer

l’angiogenèse.

Cependant, d’après la littérature et les résultats de travaux expérimentaux sur des cellules de

patients atteints de LAM, des antagonistes de cette intégrine pourraient être très prometteurs

puisqu’ils pourraient agir à plusieurs niveaux : (i) sur le décrochage des CSL de la niche, en

empêchant leurs interactions avec les ostéoblastes et la MEC leucémique, (ii) sur l’inhibition

du processus de CAM-DR, en contrecarrant l’effet protecteur procuré par l’adhésion, et (iii)

sur l’inhibition de la prolifération.

4.3. La coopération entre les intégrines α4β1 et α5β1

Selon les conditions d’activation cellulaire, les intégrines α4β1 et α5β1 peuvent avoir

des actions synergiques ou antagonistes. Alors que les intégrines α4β1 et α5β1 activent une

voie commune pour promouvoir la motilité de fibroblastes par le biais de connections

proximales différentes, c’est-à-dire par Src ou par les complexes FAK-Src, respectivement

(Hsia D.A. et al., 2005), d’autres résultats ont permis de mettre en évidence que l’intégrine

α4β1 fournit un signal antagoniste à l’intégrine α5β1 en interférant avec la voie de

signalisation RhoA et que ceci entraîne la migration de cellules de mélanome (Moyano J.V. et

al., 2003). De plus, Kapur et al. ont démontré, dans des cellules hématopoïétiques

progénitrices, que ces deux intégrines avaient des effets opposés sur le survie et la

prolifération cellulaires, négatif dans le cas de l’intégrine α4β1 et positif pour α5β1 (Kapur

R. et al., 2001).

Or, les domaines de liaison à la fibronectine de ces deux intégrines sont différents

(figure 27), pouvant sommairement expliquer l’opposition de leurs actions sur les fonctions

cellulaires.

Il est également intéressant de noter qu’il existe un peptide chimérique, appelé la

RetronectinTM (Takara), qui possède, à la fois, le domaine CS-1 (site de liaison de l’intégrine

α4β1) et le domaine CBD (site de liaison de l’intégrine α5β1) de la fibronectine, qui sont

97


Figure 27 : Structure de la fibronectine. Cette molécule est constituée de domaines répétés de type I, II et III et d’un domaine IIICS (carboxyl terminus) en position C-terminale. Les sites classiques de liaison des intégrines α4β1 et α5β1 sont les domaines CS-1 (carboxyl terminus-1) et cell binding domain (CBD), respectivement. Hep : heparin binding domain. (D’après Chan J.Y. & Watt S.M., 2001).

capables d’augmenter l’efficacité de l’infection rétrovirale. Cela permettrait donc de cibler les

cellules exprimant fortement ces deux intégrines, comme les blastes leucémiques, et

d’augmenter l’action cytotoxique d’un agent chimiothérapeutique en épargnant les cellules

saines.

C. Conclusions et hypothèses préliminaires sur le rôle des

intégrines α4β1 et α5β1 dans les CSH et CSL

A la fin de ce chapitre II sur les intégrines, nous avons mis en exergue le rôle majeur

de deux types d’intégrines β1, α4β1 et α5β1, ainsi que de deux protéines activées en aval des

intégrines β1, Pyk2 et PP2A, dans la résistance au stress de cellules normales ou cancéreuses.

Le fait qu’il existe des différences d’expression de ces intégrines dans les blastes leucémiques

et de leur ligand dans la niche hématopoïétique leucémique, par rapport à un contexte

physiologique, suggère que la coordination des voies de réponse au stress dans les CSH

puisse être différente dans les CSL, ce qui aurait un impact majeur en thérapeutique.

98


De plus, l’équilibre potentiel entre les intégrines α4β1 et α5β1 dans le contrôle de la

prolifération des progéniteurs hématopoïétiques pourrait être rompu de façon à promouvoir

l’accélération de l’entrée dans le cycle (par l’intégrine α5β1), au détriment du frein que peut

représenter l’engagement de l’intégrine α4β1.

Quelles que soient les voies envisagées de survie, ou de prolifération, un partenaire de

signalisation de la kinase Pyk2 et de la phosphatase PP2A pourrait figurer un carrefour

incontournable du contrôle cellulaire, et notamment de la résistance au stress des cellules

tumorales. De plus, cibler une de ces protéines en aval de ces intégrines serait plus judicieux

et efficace, car comme nous l’avons vu précédemment inhiber directement une intégrine peut

être très toxique.

99

Revue bibliographique Chapitre III La glycogène synthase kinase 3β

Chapitre III : La glycogène synthase kinase 3β

A. Les glycogène synthase kinases 3

1. Les différentes isoformes de GSK3

La glycogen synthase kinase 3 (GSK3) est une sérine/thréonine kinase, conservée tout

au long de l’évolution, et existant sous deux isoformes distinctes chez les mammifères :

GSK3α (51 kDa) et GSK3β (47 kDa) (figure 28), codées par des gènes distincts (Woodgett

J.R., 1990). Bien que leurs domaines kinases aient une forte homologie (98%), les isoformes

de GSK3 ne sont pas fonctionnellement identiques.

Figure 28 : Représentation schématique des isoformes GSK3α et GSK3β, chez les Mammifères. Les sites principaux de phosphorylation sur sérine et tyrosine sont indiqués. Le domaine riche en glycines en position N-terminale est unique à GSK3α et les deux isoformes ont une très forte homologie dans le domaine kinase. (D’après Doble B.W. & Woodgett J.R., 2003).

GSK3β, la plus petite des deux isoformes, a été à l’origine isolée à partir du muscle

squelettique, mais cette enzyme est largement exprimée dans tous les tissus, avec des taux

particulièrement élevés dans le cerveau (Woodgett J.R., 1990). Un variant d’épissage de

GSK3β a été récemment identifié dans le système nerveux central (Mukai F. et al., 2002).

Cette isoforme, nommée GSK3β2, est un variant d’épissage mineur de GSK3β (environ 15 %

100


de la GSK3β totale) qui contient une insertion de treize résidus dans le domaine kinase. Des

analyses in vitro sur son activité kinase révèlent une activité réduite envers la protéine Tau

associée aux microtubules, comparée à celle de GSK3β non épissé. De plus, un anticorps

spécifique pour cette insertion du nouveau variant met en évidence que GSK3β2 est

principalement localisé dans les corps cellulaires des neurones, alors que la GSK3β totale est

aussi trouvée dans les extensions neuronales (Mukai F. et al., 2002).

Comme nous pouvons le constater sur la figure 28, bien que les isoformes α et β aient

un fort taux d’homologie dans leur domaine kinase et exposent des similarités dans leurs

propriétés biochimiques et de substrats, ils existent entre les deux des différences structurales

dans les régions N- et C-terminales, et de nombreux rapports suggèrent que les fonctions de

ces deux GSK3 ne sont pas toujours identiques. Ainsi, GSK3α peut se substituer à beaucoup -

mais pas à toutes - des fonctions de GSK3β, surtout en terme de voie de signalisation Wnt

(Doble B.W. et al., 2007). Dans cette étude, les auteurs se sont intéressés à la voie de

signalisation canonique Wnt et ont démontré que GSK3α et GSK3β sont capables, tout autant

l’un que l’autre, de maintenir des taux faibles de β-caténine. Cette incapacité de GSK3α de se

substituer à toutes les fonctions de GSK3β est confirmée par la génération de souris

invalidées pour le gène codant pour GSK3β, c’est-à-dire de souris knock-down pour GSK3β.

2. Les knock-down de GSK3

Bien que plusieurs mutants murins aient été générés pour aborder les rôles de GSK3β,

il n’existe encore aucune confirmation claire sur le rôle de cette molécule in vivo à cause de la

possibilité de compensation par l’autre isoforme de GSK3, GSK3α. Des souris invalidées

pour GSK3β présentent une létalité soit vers le stade embryonnaire 13 (E-13), principalement

à cause d’une apoptose hépatique, soit au premier jour post-natal (P1) à cause de difficultés

respiratoires et d’un déficit énergétique (Hoeflich K.P. et al., 2000 ; Stankunas K. et al.,

2003). Cependant, avant le stade E-13, les embryons GSK3β-/- ne montrent pas d’anormalités

morphologiques, et les cellules provenant des souris invalidées pour GSK3β n’ont pas de

défaut dans la voie de signalisation Wnt (Hoeflich K.P. et al., 2000). Ces résultats suggèrent

donc que les isoformes de GSK3 pourraient se compenser l’une et l’autre dans certaines

situations, et dans d’autres jouer des rôles distincts.

101


Ainsi, l’incapacité de GSK3α à sauver les souris invalidées pour GSK3β indique que

le phénotype de dégénération hépatique se produit spécifiquement à cause de la perte de

l’isoforme β (Hoeflich K.P. et al., 2000). Il est à noter que ce phénotype est remarquablement

similaire à celui des animaux délétés pour Rel A (ou sous-unité p65 de NF-κB ; Beg A.A. et

al., 1995) ou de la kinase I-κB2 (Li Q. et al., 1999), composés de la voie de signalisation

classique de NF-κB (Rothwarf D.M. & Karin M., 1999 ; Ghosh S. & Karin M., 2002). La

régulation de l’import nucléaire de NF-κB n’est pas perturbée dans les fibroblastes

embryonnaires isolés de souris invalidées pour GSK3β, ce qui indique que GSK3β affecte les

autres niveaux de régulation de NF-κB.

Quant au phénotype des souris invalidées pour le gène GSK3α, il n’a pas encore été rapporté.

Mais, Liang et Chuang, en utilisant des siRNA (small interfering RNA) spécifiques des deux

isoformes, ont suggéré que GKS3α est plus fort que GSK3β pour inhiber la régulation

transcriptionnelle de CREB (Cyclic AMP response element binding protein) (Liang M. &

Chuang D., 2006).

De plus, un nombre de rapports suggèrent que les régulations de ces deux isoformes de

GSK3 ne sont pas toujours identiques. Par exemple, certaines isoformes de PKC régulent

GSK3α, mais pas GSK3β (Goode N. et al., 1992).

Nous allons aborder plus en détail la régulation de GSK3β, qui est l’isoforme qui nous

intéresse particulièrement ici, et qui doit être finement régulée pour être efficace.

B. La régulation de GSK3β

Quatre mécanismes clés ont été identifiés comme contribuant à réguler les actions de

GSK3 : sa régulation par phosphorylation (autophosphorylation, phosphorylation sur sérine et

tyrosine), sa localisation cellulaire, sa capacité à participer à la formation de complexes

protéiques, et l’état de phosphorylation de ses substrats (figure 29).

1. Par sa phosphorylation

1.1. L’autophosphorylation de GSK3β

L’activité de GSK3β peut être facilitée par la phosphorylation sur sa tyrosine 216 (tyr

216) pour GSK3β (tyrosine 279 pour GSK3α).

102


Figure 29 : Mécanismes de régulation des actions de GSK3. Quatre mécanismes jouent en concert pour réguler la phosphorylation des substrats par GSK3. (D’après Beurel E. & Jope R.S., 2006).

Cela se produirait par autophosphorylation ou par d’autres tyrosines kinases (ces dernières

seront développées dans le prochain chapitre, « La phosphorylation de GSK3β par des

kinases et phosphatases »), mais peu de choses sont encore réellement connues sur la

régulation du processus qui module la phosphorylation sur tyrosine de GSK3β, et notamment

pour quelles fonctions cette phosphorylation est nécessaire (Frame S. & Cohen P., 2001 ;

Grimes C.A. & Jope R.S., 2001). Cependant, après détermination de la structure en

cristallographie de GSK3β (Bax B. et al., 2001 ; Dajani R. et al., 2001), la phosphorylation

sur cette tyr 216, dans la boucle d’activation (« T-loop »), est requise pour ouvrir le site

catalytique permettant ainsi l’accès aux substrats, préférentiellement pré-phosphorylés (Dajani

R. et al., 2001). Ils ont également montré que cette phosphorylation sur tyr 216 de la boucle

d’activation de GSK3β pourrait faciliter la phosphorylation des substrats, mais n’est pas

strictement nécessaire à son activité kinase (Dajani R. et al., 2001).

De plus, ces travaux sur la structure de GSK3β ont permis d’expliquer le rôle

inhibiteur de la phosphorylation sur sérine 9 (ser 9). Dans les cellules au repos, GSK3β est

103


constitutivement active. Des substrats pré-phosphorylés (ce processus sera détaillé

ultérieurement) ou non par une kinase de pré-phosphorylation (« priming kinase ») sont

capables d’être phosphorylés par GSK3β active. Les phospho-résidus de pré-phosphorylation

(en position N +4) se lient à une poche de charge positive sur GSK3β (composée de deux

résidus arginine, R, et d’une lysine, K). Cela permet de diriger correctement le domaine N-

terminal du substrat dans le site catalytique de GSK3β, pour être phosphorylé sur sérine ou

thréonine (figure 30). Quand GSK3β est phosphorylée sur ser 9 par une kinase comme Akt

(« inactivating kinase »), le domaine N-terminal de GSK3β devient un « pseudo-substrat

phosphorylé » qui va occuper la poche positive de liaison et le site catalytique (« catalytic

site ») de l’enzyme GSK3β, jouant ainsi le rôle d’un inhibiteur compétitif par rapport aux

vrais substrats (figure 30). Cela empêche donc la phosphorylation d’autres substrats de

GSK3β (Frame S. et al., 2001).

Figure 30 : Régulation de l’activité de GSK3β par la phosphorylation sur sérine 9. Cette régulation intervient dans des cellules stimulées en présence de protéines inhibitrices de GSK3β, notées IK, telles que Akt. C.S. : catalytic site ; IK : inactivating kinase ; PK : priming kinase. (D’après Doble B.W. & Woodgett J.R., 2003).

104


Enfin, ces études de cristallographie ont mis en évidence l’existence de dimères de GSK3β,

ressemblant à des interactions tête-bêche (Dajani R. et al., 2001 ; Fraser E. et al., 2002). Bien

que cela n’ait pas été déterminé in situ, cette dimérisation pourrait peut-être jouer un rôle dans

la localisation nucléaire de GSK3β.

1.2. La phosphorylation de GSK3β par des kinases et phosphatases

GSK3β a été décrite comme constitutivement active dans les cellules au repos et

soumise à une régulation négative en réponse à des stimuli externes. Par exemple, en réponse

à l’insuline et à la stimulation de facteurs de croissance, GSK3β est négativement régulée par

la phosphorylation sur sa ser 9 via l’activation de plusieurs kinases, comme Akt (ou PKB ;

Cross D.A., 1995) , PKC (protein kinase C ; Goode N. et al., 1992), PKA (cAMP-dependent

protein kinase A ; Fang X. et al., 2000) et d’autres, telles que p70 S6 kinase et p90Rsk (Eldar-

Finkelman H. et al., 1995). Cette sérine inhibitrice se trouve dans la partie N-terminale de la

protéine ; il s’agit de la ser 9 pour GSK3β et de la ser 21 pour GSK3α (figure 31).

Figure 31 : Principales voies de régulation inhibitrice de GSK3β. Suite à la stimulation d’un RCPG (récepteur couplé aux protéines G), la PKC est activée et phosphoryle, sur ser 9, GSK3β (à gauche). De la même façon, les ligands, se liant aux RCPG qui activent l’adénylyl cyclase (AC) pour produire de l’AMP cyclique, conduisent à l’activation de la PKA, qui peut aussi phosphoryler GSK3β sur sa ser 9 (à droite). L’activation des RTK, comme le récepteur à l’insuline (IR = insulin receptor ; IRS = insulin-receptor substrat), peut entraîner la phosphorylation de GSK3β sur cette sérine, via une activation séquentielle de la PI-3K, de la 3’-phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1), et la protéine kinase, Akt, qui phosphoryle GKS3β sur ser 9. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

105


Après ces diverses voies de signalisation conduisant à une inactivation de GSK3β, la

réactivation de GSK3β est assurée par des protéines phosphatases spécifiques (Ptase). Ainsi,

l’activation de GSK3β, par privation du support trophique (Jin N . et al., 2005), exposition à

la protéine Tat du virus VIH (virus de l’immunodéficience humaine) de type-1 (Maggirwar

S.B., 1999), au peptide β-amyloïde (Aβ ; Takashima A. et al., 1996) ou aux toxines

mitochondriales (Grimes C.A. & Jope R.S., 2001), est souvent associée avec la

déphosphorylation de cette sérine 9, réalisée par la phosphatase PP2A (Sutherland C. et al.,

1993).

D’autre part, l’activité de GSK3β peut être augmentée par phosphorylation sur son

résidu tyr 216, localisé dans le domaine kinase. Dans les cellules de mammifères, les

tyrosines kinases Fyn, Pyk2 et Csk ont été impliquées dans cette phosphorylation sur tyr 216,

mais ce mécanisme reste pour l’instant assez méconnu. Dans une étude, il a été montré, que

dans des cellules de lignée de neuroblastomes humains (Sh-SY5Y), Fyn, un membre de la

famille des tyrosines kinases Src, était capable de phosphoryler GSK3β sur cette tyr 216

(Lesort M. et al., 1999). Cette phosphorylation sur tyrosine est également augmentée par un

accroissement transitoire, des concentrations intracellulaires de calcium (Hartigan J.A. &

Johnson G.V.W., 1999). C’est cette même équipe qui a décrit, pour la première fois, que

GSK3β pouvait être un substrat de Pyk2. Dans des cellules CHO co-transfectées avec Pyk2 et

GSK3β, ils ont montré que Pyk2 phosphoryle GSK3β sur sa tyr 216, à la fois in situ et in

vitro, et ceci via une interaction directe entre ces deux acteurs (Hartigan J.A. et al., 2001).

Cependant, ces travaux n’avaient pas mis en lumière un rôle physiologique ou pathologique

de cette activation de GSK3β par la kinase Pyk2, ni impliqué ces deux protéines dans une

voie de signalisation. Mais, plus récemment, dans les cellules neuronales, il a été démontré

que GSK3β est phosphorylée sur cette tyrosine par Pyk2 et activée pendant la rétraction du

neurite induite par le LPA (lysophosphatidic acid ; Sayas C.L. et al., 2006). Ces travaux

révèlent donc, pour la première fois, un rôle du couple GKS3β/Pyk2 dans une voie de

signalisation nécessaire à un processus neuronal physiologique (figure 32).

106


Figure 32 : Régulation activatrice de GSK3β par Pyk2 lors de la rétraction du neurite. (D’après Sayas C.L. et al., 2006).

Ainsi, toutes ces données bibliographiques nous indiquent que la signature d’une

activation de GSK3β, in cellulo, peut se traduire par une diminution de son état de

phosphorylation sur ser 9, associée ou non avec une augmentation de sa phosphorylation sur

tyr 216 (figure 33).

107


Figure 33 : Régulations activatrices et inhibitrices de GSK3β par différentes kinases et phosphatases. (D’après Grimes C.A. & Jope R.S., 2001).

1.3. L’état de phosphorylation des substrats de GSK3

Plus d’une quarantaine de protéines ont été décrites comme pouvant être

phosphorylées par GSK3β, en incluant une douzaine de facteurs de transcription (Tableau 6).

Bien que la plupart de ces protéines ne répondent pas encore à tous les critères exposés par

Frame et Cohen (Frame S. & Cohen P., 2001) nécessaires pour prouver qu’une protéine est un

substrat de GSK3 in vivo, ce grand nombre de substrats potentiels illustre bien le potentiel de

GSK3β à affecter les diverses fonctions cellulaires. Cela suggère que l'activité de GSK3β doit

être soigneusement régulée par des mécanismes indépendants et adaptés pour chaque substrat

pour éviter que GSK3β ne phosphoryle « aveuglément » ses divers substrats.

108


Tableau 6 : Substrats potentiels de GSK3. Ces substrats peuvent être classés en trois catégories : les protéines métaboliques et de signalisation, les protéines de structure et les facteurs de transcription. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

Les actions de GSK3 sont régulées par l’état de phosphorylation de ses substrats. Ceci

est dû au fait que la plupart des substrats de GSK3 doivent être pré-phosphorylés, c’est-à-dire

« amorcés », pour être ensuite phosphorylés par GSK3 (figure 34).

Figure 34 : Pré-phosphorylation ou « priming » des substrats de GSK3β. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

109


Cette pré-phosphorylation, réalisée par une « kinase d’amorçage » (le plus souvent par la

caséine kinase II) pour former un motif -S-X-X-X-S(P)-, est nécessaire à la reconnaissance de

ce substrat par GSK3β (Roach P.J., 1990). Cependant, tous les substrats ne nécessitent pas

cette pré-phosphorylation pour la reconnaissance par GSK3β, comme les facteurs de

transcription de la famille myc. Cette catégorie de molécules semblerait contenir de multiples

résidus acides qui favoriseraient la reconnaissance par GSK3β (Fiol C.J. et al., 1988).

Ainsi, deux séries de systèmes de signalisation basés sur la phosphorylation sont

intégrés dans la régulation des actions de GSK3β. En amont de GSK3, les systèmes de

signalisation transmettent une information régulatrice à GSK3 via des kinases qui

phosphorylent directement GSK3β pour contrôler son activité (figure 33), et en aval de

GSK3β, d’autres kinases transmettent une information régulatrice en pré-phosphorylant les

substrats de GSK3 (figure 34).

Pour que la réponse cellulaire soit spécifique, chaque kinase ne doit affecter probablement

qu’un seul pool de GSK3β mis à disposition, selon sa localisation cellulaire.

2. Par sa localisation intracellulaire et celle de ses partenaires

spécifiques

En plus d’une régulation par phosphorylation, il existe dans la cellule des mécanismes

qui régulent la localisation intracellulaire de GSK3β pour contrôler son accès à ses substrats.

Bien que GSK3β soit traditionnellement considérée comme une protéine cytosolique (où elle

est localisée de façon prédominante), elle est aussi présente dans le noyau et la mitochondrie,

où elle est fortement activée par rapport à la forme cytosolique (Bijur G.N. & Jope R.S.,

2003a). Dans chacun des compartiments cellulaires, GSK3β présente des partenaires

spécifiques au sein de complexes protéiques.

2.1. Dans le cytosol

GSK3β a été auparavant considérée surtout comme une protéine cytosolique, car elle y

est présente de façon prédominante, et relativement inactive comparée aux pools existants

dans le noyau et la mitochondrie. Dans ce compartiment cellulaire, elle est un composé clé de

différents complexes protéiques.

110


a). La voie insulinique

La GSK3β a été nommée, glycogène synthase kinase 3β, à cause de sa capacité à

phosphoryler, et par conséquent à inactiver la glycogène synthase (GS) (figure 35). Ce

processus clé permet donc de réguler la synthèse du glycogène. En réponse à l’insuline, la

voie PI-3K/Akt est responsable de la phosphorylation sur ser 9 de GSK3β, et donc de son

inactivation (Cross D.A. et al., 1995 ; Cohen P. et al., 1997). En conclusion, en réponse à

l’insuline, l’inhibition de GSK3β promeut l’activation de la GS, en favorisant sa

déphosphorylation (par une des glycogen-associated forms of protein phosphatase-1), ce qui

contribue à la stimulation de la synthèse de glycogène (figure 35).

Figure 35 : La voie insulinique. L’insuline initie une cascade de signalisation qui provoque la phosphorylation de GKS3β sur la ser 9 par Akt, et donc son inactivation. IRS : insulin receptor substrate ; ILK : integrin-linked kinase ; PDK : phosphoinositide-dependent kinase ; PIP2 : phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate ; PIP3 : phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate.

b). Les voies morphogènes Wnt et Shh

En absence de stimulus, l’axine se lie à GSK3β, la caséine kinase I (CKI), et à la β-

caténine, via l’APC. L’axine représente donc une protéine structurale essentielle qui permet la

111


construction du complexe régulateur de la β-caténine. En effet, la CKI peut ainsi phosphoryler

la β-caténine sur la sérine 45 (ser 45), créant ainsi un site de « pré-amorçage » pour que

GSK3β phosphoryle la β-caténine sur sa thréonine 41 (thr 41), et par la suite sur ses sérines

37 (ser 37) et 33 (ser 33). Ces modifications provoquent l’ubiquitination de la β-caténine et sa

dégradation par le protéasome (figure 36).

Figure 36 : La voie canonique Wnt. En absence de ligand Wnt, GSK3β phosphoryle la β-caténine ce qui va entraîner sa dégradation par le protéasome. Par contre, en présence de ligand Wnt, GSK3β est inhibée par Dvl et FRAT, permettant ainsi à la β-caténine d’aller dans le noyau pour jouer son rôle de co-activateur de la transcription de gènes cibles. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

Par contre, la stimulation par Wnt des deux récepteurs associés, que sont le récepteur Frizzled

(Fzl-R) et le récepteur LRP5/6 (LDL (low-density lipoprotein)-related protein 5/6), entraîne

l’activation de disheveled (dvl), qui en concert avec la protéine liant GSK3β, Frat (Frequently

arranged in T cell lymphomas), facilite la perturbation du complexe fondé par l’axine et

GSK3β. Cela provoque une diminution de la phosphorylation propice à la dégradation de la

β-caténine, ce qui aboutit à son accumulation et à son activation. Ensuite, la β-caténine va

112


dans le noyau où elle joue son rôle de co-activateur de transcription des facteurs de

transcription TCF/LEF (T cell factor / lymphocyte-enhancer-binding factor).

Des complexes multiprotéiques, tels que ceux utilisés dans le système Wnt, sont

utilisés pour réguler la spécificité des actions de GSK3β dans d’autres voies de signalisation

(Manoukian A.S. & Woodgett J.R., 2002). C’est le cas de la voie de signalisation Sonic

Hedgehog (Shh) (figure 37).

Figure 37 : La voie de signalisation hedgehog. En absence de ligand Hh, le facteur de transcription Ci forme un complexe avec Cos et Fus au niveau des microtubules. Dans ce complexe, Ci est phosphorylé par PKA, CKI et GSK3β, ce qui entraîne une protéolyse de Ci en Ci75, un répresseur transcriptionnel. La stimulation du récepteur Ptc (patched) par Hh active le récepteur Smo (smoothened), ce qui provoque la dissociation du complexe Cos-Fu-Ci des microtubules et diminue la phosphorylation de Ci. Ainsi, il s’accumule dans le noyau où il peut jouer son rôle d’activateur de la transcription. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

113


En absence de ligand Hh, le récepteur patched (Ptc), inhibe l’activité du récepteur smoothened

(Smo). Cela permet à un facteur de transcription aux doigts de zinc, Ci (cubitus interruptus),

de former un complexe avec costal2 (Cos) et fused (Fus) lié aux microtubules. Dans ce

complexe, Ci est phosphorylé par PKA, CKI et GSK3β, ce qui entraîne une protéolyse de Ci

en Ci75, un répresseur transcriptionnel (Price M.A. & Kalderon D., 2002 ; Jia J. et al., 2002).

Après stimulation de Ptc par Hh, Smo est activé ce qui cause la dissociation du complexe

Cos-Fus-Ci des microtubules, et diminue la phosphorylation - par GSK3β notamment - de Ci,

augmentant ainsi sa stabilité et permettant son accumulation dans le noyau où il joue le rôle

d’activateur transcriptionnel (figure 37).

c). Le cytosquelette

Les microtubules sont des filaments du cytosquelette essentiels pour maintenir

l’organisation, la structure et la motilité de la cellule. Or, GSK3β phosphoryle les protéines

associées aux microtubules ou MAPs (microtubule-associated proteins), comme Tau et MAP-

1B, ce qui à pour effet de réguler leur interaction avec les microtubules et donc de moduler la

dynamique des microtubules. La phosphorylation de Tau par GSK3β diminue son affinité

pour les microtubules, alors que celle de MAP-1B augmente son association avec les

microtubules. GSK3 phosphoryle aussi les chaînes légères de la kinésine, une protéine

motrice qui déplace les protéines vers les extrémités positives des microtubules, ce qui

provoque la libération, le relargage de cargos (c’est-à-dire des protéines, des vésicules et des

organelles). Ceci est une fonction essentielle car il est important que les cargos soient délivrés

à des endroits appropriés (Morfini G. et al., 2002). De plus, il est à noter que les protéines

motrices de la famille des kinésines régulent aussi les événements microtubulaires pendant la

mitose, et l’inhibition de GSK3 entraîne des défauts dans le fuseau mitotique et une mauvaise

orientation des chromosomes, potentiellement en raison de ses effets régulateurs sur la

kinésine (Wakefield J.G. et al., 2003). L’APC est aussi associée aux microtubules via KAP3

(kinesin-associated protein 3) qui interagit avec la kinésine. Lorsque GSK3β phosphoryle

l’APC, cela diminue l’association entre l’APC et les microtubules. Or, le positionnement

d’APC sur les extrémités positives des microtubules est essentiel pour maintenir une direction

convenable de la migration cellulaire.

GSK3β est aussi associée au développement de maladies neurodégénératives, telles

que la maladie d’Alzheimer, qui sont la conséquence de modifications importantes du

cytosquelette dans les neurones et de formations de plaques amyloïdes entre les cellules

114


neuronales. De nombreux liens ont été identifiés entre cette kinase et les caractéristiques de la

maladie d’Alzheimer (figure 38). Ainsi, GSK3β est le candidat principal induisant

l’hyperphosphorylation de Tau, associée à cette neuropathie. Il est à noter que cette

hyperphosphorylation peut s’accompagner, dans des sites mineurs, de la phosphorylation de

Tau par Cdk5. Or, la phosphorylation de Tau par GSK3β entraîne une diminution de la liaison

aux microtubules, et peut-être une augmentation de la formation des filaments hélicoïdaux

(PHF, paired helical filament), un prélude possible à l’installation d’enchevêtrements

neurofibrillaires (NFT, neurofibrillary tangle) (figure 38 ; Johnson G.V.W. & Bailey C.D.C.,

2002). GSK3β pourrait aussi contribuer aux dépôts de Tau hyperphosphorylée, retrouvés dans

d’autres maladies neurodégénératives (Ferrer I. et al., 2002). De plus, dans des modèles de

souris transgéniques où l’expression de GSK3β est augmentée, la phosphorylation de Tau est

accrue et des déficits dans l’apprentissage spatial sont constatés (Hernandez F. et al., 2002).

GSK3 est également impliquée dans le processus de formation des plaques amyloïdes, qui

sont constituées du peptide β-amyloïde (noté Aβ ; Phiel C.J. et al., 2003). Cette molécule est

produite par la protéolyse de la protéine précurseur d’amyloïde (APP) par la β-sécrétase et la

γ-sécrétase. Or, GSK3 phosphoryle APP et facilite la production de β-amyloïde. En effet, la

réduction de la production de β-amyloïde s’accompagne de l’inhibition de GSK3 (Phiel C.J.

et al., 2003). Ainsi, GSK3 contribue à la neurotoxicité et à la production des plaques

amyloïdes. La préséniline-1 (PS1), qui est essentielle au processus protéolytique de l’APP, se

lie directement à GSK3β. Cette association est altérée par des mutations de la PS1, qui sont

retrouvées dans des cas familiaux de la maladie d’Alzheimer, mutations qui perturbent

également l’interaction de GSK3β avec la kinésine, entraînant une diminution du transport

axonal (Pigino G. et al., 2003). Des preuves considérables montrent que les stress du

réticulum endoplasmique (RE) et l’accumulation de protéines mal conformées contribuent à

la neurotoxicité de la maladie d’Alzheimer, et que les stress du RE induisent une activation de

GSK3β (Song L. et al., 2002).

115


Figure 38 : GSK3β est impliquée dans la neuropathologie de la maladie d’Alzheimer. La phosphorylation de Tau par GSK3β entraîne une diminution de la liaison aux microtubules, conduisant peut-être à une augmentation de la formation des filaments hélicoïdaux (PHF, paired helical filament), et par la suite à celle d’enchevêtrements neurofibrillaires (NFT). GSK3β facilite la production de β-amyloïde (Aβ), et donc la formation de plaques amyloïdes. GSK3β phosphoryle aussi le précurseur de l’amyloïde (APP, amyloid precursor protein) et peut se lier directement à la préséniline-1 (PS1). Une forme active de GSK3 a été identifiée dans les neurones développant des dégénérescences granulo-vacuolaires (GVD, granulovacuolar degeneration), dans des cas de maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait représenter une façon de séquestrer la GSK3 active. β : β-secretase ; γ : γ-secretase ; RE : réticulum endoplasmique. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

2.2. Dans le noyau

Récemment, une équipe a percé à jour la présence d’une séquence de localisation

nucléaire, appelée nuclear localization sequence (NLS), dans le site catalytique de GSK3β. Ils

ont d’une part révélé que les complexes protéiques cytoplasmiques sont capables de bloquer

la fonction de la NLS en séquestrant GSK3β dans le cytosol, et d’autre part que la NLS est

masquée par une boucle d’activation contenant la tyr 216 non phosphorylée (Meares G.P. &

116


Jope R.S., 2007). Ainsi, il a été montré que l’expression de l’axine 2 séquestrait GSK3β dans

le cytoplasme, et donc empêchait son accès à son substrat nucléaire Snail, qui est un

répresseur transcriptionnel de la E-cadhérine (Yook J.I. et al., 2006). Par contre, GSK3β ne

possède pas de séquence d’export nucléaire, ou nuclear export sequence (NES).

La GSK3β nucléaire est particulièrement intéressante car elle régule de nombreux

facteurs de transcription (tableau 6), soit par phosphorylation soit par modification

épigénétique. En effet, GSK3β va pouvoir influencer plusieurs voies de signalisation qui

convergent vers ces facteurs de transcription, et par conséquent réguler l’expression d’un

grand nombre de gènes. Le taux nucléaire de GSK3β n’est pas statique, mais il varie de

manière dynamique en réponse aux signaux intracellulaires. De plus, les taux de GSK3β dans

le noyau fluctuent pendant le cycle cellulaire, avec un pic en phase S, ce qui facilite la

phosphorylation de la cycline D1 nucléaire par GSK3β, entraînant donc la dégradation de la

cycline D1 (Diehl J.A. et al., 1998) et un arrêt du cycle cellulaire. Les taux de GSK3β dans le

noyau peuvent rapidement augmenter dans les étapes précoces du processus d’apoptose

(Bijmur G.N. & Jope R.S., 2001). Ainsi, Bhat et al. ont rapporté que des stimuli pro-

apoptotiques augmentaient la quantité de GSK3β nucléaire phosphorylée sur tyr 216,

conséquence soit d’une translocation de GSK3β soit d’une augmentation de la

phosphorylation sur tyrosine de GSK3β déjà présente dans le noyau (Bhat R.V. et al., 2000).

Or, la mutation de cette tyr 216 par une phénylalanine entraîne une moindre accumulation de

GSK3β dans le noyau (Salas T.R. et al., 2004), suggérant que GSK3β phosphorylée sur cette

tyr 216 est la conformation idéale pour l’accumulation nucléaire.

La régulation de la localisation nucléaire de GSK3 n’étant qu’aux balbutiements de

son exploration, il se pourrait que d’autres conditions puissent aussi moduler son taux et son

activité dans le noyau. Ainsi, des dimères de GKS3β ont été mis en évidence, par des études

de cristallographie, avec une très forte phosphorylation sur tyr 216 ; cependant, leur existence

nucléaire in vivo est à l’heure actuelle une hypothèse.

Quant à la liaison de Frat-1 à GSK3β, elle facilite son export nucléaire (Franca-Koh J.

et al., 2002). La présence d’autres protéines de la voie de signalisation Wnt dans le noyau,

telles que l’axine, la protéine adenomatous polyposis coli (APC), et disheveled, suggère que

ces protéines pourraient réguler la GSK3β nucléaire, bien que cela reste à être étudié. D’autre

part, il est connu que le suppresseur de tumeur p53 se lie directement à la GSK3β nucléaire.

Cette association active GSK3β qui stimule alors les actions transcriptionnelles et

apoptotiques de p53, bien que le mécanisme impliqué n’ait pas été encore élucidé

117


(Watcharasit P. et al., 2002). Dans les tumeurs de sarcome de Kaposi associées au virus de

l’herpès, l’antigène nucléaire latent (LANA), une protéine oncogénique virale nucléaire

exprimée dans ces tumeurs, peut aussi se lier à GSK3β et la séquestrer dans le noyau,

permettant ainsi l’accumulation et l’activation de la β-caténine (Fujimuro M. et al., 2003). En

outre, LANA peut se lier à p53 et inhiber ses actions, qui sont sans cela favorisées par

GSK3β.

2.3. Dans la mitochondrie

La GSK3β est également présente dans le compartiment mitochondrial (Hoshi M. et

al., 1996), mais encore moins de choses sont connues sur cette localisation. Cependant,

l’équipe de Jope a démontré que dans les neurones primaires corticaux les pools nucléaires et

mitochondriaux de GSK3β, au contraire de la GSK3β cytosolique, sont hautement activés en

réponse à des stimuli apoptotiques induits par des dommages à l’ADN ou par des éléments de

réponse au stress (Bijur G.N. & Jope R.S., 2003a). De plus, il a été montré que, contrairement

au taux nucléaire de GSK3β, qui diminue quand Akt est activée (Bijur G.N. & Jope R.S.,

2001), la protéine Akt activée importée dans la mitochondrie est responsable de la

phosphorylation de GSK3β sur sa ser 9 pour inhiber son activité, sans modification de son

taux (Bijur G.N. & Jope R.S., 2003b).

De plus, les taux de p53 augmentent durant certaines formes d’apoptose, et p53 se lie à

GSK3β dans l’organelle mitochondrial. Le résultat fonctionnel de cette interaction

mitochondriale n’est pas connu, mais il pourrait faciliter l’apoptose car l’inhibition de GSK3β

atténue à la fois la libération de cytochrome c induite par p53 et l’activation des caspases

(Watcharasit P. et al., 2003).

En conclusion, des études supplémentaires identifieront indubitablement de nouvelles

protéines se liant à GSK3β dans le noyau, la mitochondrie et le cytosol, et éclairciront

comment les mécanismes régulateurs sont intégrés pour réussir la régulation spécifique de

l’activité de GSK3β. Il est à noter que, de façon intéressante, les trois pools de GSK3β, c’est-

à-dire cytoplasmique, nucléaire et mitochondrial, sont tous régulés par le lithium, un

inhibiteur de GSK3β utilisé pour traiter les désordres mentaux (Bijur G.N. & Jope R.S.,

2003a). Les quelques exemples de partenariat que nous avons évoqués montrent combien

GSK3β est impliquée dans la régulation de fonctions cellulaires clés, telles que le

métabolisme énergétique, les voies morphogènes et la régulation de l’organisation du

cytosquelette.

118


C. Le rôle de GSK3β dans les processus physiologiques et

pathologiques

La protéine GSK3β est maintenant reconnue comme un élément clé d’un nombre

surprenant de processus cellulaires et de pathologies. Il apparaît que son inhibition ou son

activation trop prolongée peuvent être la source de dysfonctionnement important de la cellule,

aboutissant à des pathologies majeures, comme les diabètes, les maladies neurodégénératives

ou les cancers.

1. GSK3β et ses fonctions cellulaires

1.1. L’inhibition pharmacologique de GSK3β

Le lithium a été le premier inhibiteur de GSK3β, et il est toujours utilisé dans les

traitements de désordres mentaux, tels que la psychose maniaco-dépressive. A l’heure

actuelle, il existe différentes classes pharmacologiques d’inhibiteurs de GSK3 (tableau 7). La

plupart de ces molécules inhibent l’action de GSK3β en réalisant une compétition de liaison

avec l’ATP. Cependant, d’autres sont des compétiteurs de liaison du magnésium ou du

substrat lui-même, mais certains ont un mécanisme d’action inconnu.

1.2. Dans le métabolisme énergétique

A l’origine, GSK3β a été identifiée pour son rôle de régulateur négatif de la synthèse

de glycogène (pour revue Roach P.J., 2002). En absence d’insuline, l’enzyme métabolique GS

est d’abord phosphorylée par la caséine kinase II (CKII) sur la ser 657. Cette pré-

phosphorylation de la GS est nécessaire à sa phosphorylation séquentielle sur ser 653, ser 649,

ser 645 et ser 641, par l’une des deux isoformes de GSK3 (α ou β), ce qui entraîne l’inhibition

de l’activité de la GS (Ali A. et al., 2001). Des augmentations du taux de glucose sanguin

conduisent à la libération d’insuline, laquelle en retour initie une cascade de signalisation

impliquant le récepteur à l’insuline (IR), l’IRS et l’activation de la PI-3K et d’Akt (figure 36).

Puis, la PKB ou Akt active peut inhiber les deux isoformes GSK3, en phosphorylant sur ser

21 et ser 9 GSK3α et GSK3β, respectivement (Cross D.A. et al., 1995). L’inhibition de GSK3

provoque l’accumulation de GS active, ce qui résulte en un assemblage de plusieurs glucose-

UDP en glycogène.

119


Tableau 7 : Les différents inhibiteurs de GSK3β. (D’après Forde J.E. & Dale T.C., 2007).

120


L’étude de McManus et al. a démontré récemment que l’inhibition de l’activité de GSK3 est

nécessaire à l’activation de la GS, alors que l’activité de la GS est dramatiquement faible dans

des souris invalidées à la fois pour les deux isoformes de GSK3 (S21A GSK3α/S9A GSK3β

double knock-in ; McManus E.J. et al., 2005). De façon surprenante, l’inhibition de GSK3β

seule a été déterminée comme étant le mécanisme principal par lequel l’insuline activait GS.

Cependant, ces souris GSK3β-/- dans cette étude ne sont pas diabétiques, et les taux de réserve

musculaire en glycogène sont comparables à ceux des souris sauvages, indiquant que d’autres

voies coopèrent dans la régulation des réserves en glycogène. Ces résultats tendent à suggérer

que le rôle clé de GSK3β dans les fonctions cellulaires est dû moins au fait que ce soit un

acteur indispensable de la voie de signalisation impliquée, qu’au fait que ce soit un

« senseur » de l’état cellulaire et un « carrefour » des voies de signalisation permettant une

réaction coordonnée et efficace face à une situation microenvironnementale.

Etant donné son rôle dans la synthèse du glycogène, GSK3β a été impliquée dans les

pathologies diabétiques (Henriksen E.J. & Dokken B.B., 2006) et proposée comme cible

thérapeutique (Eldar-Finkelman H., 2002). La régulation diminuée de la production d’insuline

et de l’utilisation de glucose est associée avec l’insulino-résistance et les diabètes, incluant les

diabètes de type 1 insulino-dépendant et de type 2 insulino-indépendant. Or, peu d’études ont

été menées in vivo sur l’état de phosphorylation de GSK3β dans les tissus périphériques, dans

des modèles animaux insulino-résistants, et celles-ci ont rapporté des résultats variables.

Toutefois, il existe des preuves qu’une GSK3β déphosphorylée et hyperactive est associée

avec l’insuffisance insulinique (Nikoulina S.E. et al., 2000 ; Henriksen E.J. et al., 2003).

L’administration d’un peptide inhibiteur de GSK3, compétiteur de substrat, augmente la

tolérance au glucose dans des souris diabétiques (Plotkin B. et al., 2003). Dans plusieurs

modèles de diabètes, deux inhibiteurs de GSK3, des dérivés amino-pyrimidine, abaissent les

taux plasmatiques de glucose de façon dose-dépendante, de plus de 50 % (Ring D.B. et al.,

2003). L’ensemble des données démontre que l’inhibition de GSK3 améliore la régulation du

glucose dans des animaux diabétiques. En accord avec cela, la surexpression de GSK3β dans

le muscle squelettique est suffisante pour causer une intolérance au glucose (Pearce N.J. et al.,

2004). Donc, dans l’ensemble, il apparaît que GSK3β pourrait être hyperactive dans la plupart

des tissus périphériques lors de la pathologie diabétique, et que l’inhibition de GSK3β

pourrait être capable de contribuer au contrôle des taux glucidiques, chez les sujets

diabétiques.

121


1.3. Dans la survie cellulaire

La kinase GSK3β contribue à la fois à la mort et à la survie cellulaires, et ce suivant

les conditions et le type cellulaires. En 1998, Pap et Cooper ont montré que la surexpression

de GSK3β permettait l’induction de l’apoptose (Pap M. & Cooper G.M., 1998). Depuis,

l’activation de GSK3β a été décrite comme promouvant l’apoptose dans de nombreuses

conditions, telles que la déprivation en facteur trophique, l’inhibition de la voie PI-3K/Akt, le

stress oxydant, et la toxicité induite par le peptide β-amyloïde (Aβ) de la maladie d’Alzheimer

ou par la protéine Tat de type 1 du VIH (passées en revue dans Grimes C.A. & Jope R.S.,

2001). Récemment, GSK3β a été liée à l’apoptose induite par p53 suite à des dommages à

l’ADN (Watcharasit P. et al., 2002), par l’hypoxie (Loberg R.D. et al., 2002), par la toxicité

du prion (Perez M. et al., 2003), par le stress du réticulum endoplasmique (RE ; Song L. et

al., 2002), et par la toxicité de la polyglutamine associée à la maladie de Huntington’s

(Carmichael J. et al., 2002).

La découverte du rôle de GSK3β dans beaucoup de conditions apoptotiques coïncide

avec l’intérêt croissant porté à la protection neuronale offerte par le lithium, qui inhibe

GSK3β (Klein P.S. & Melton D.A., 1996). Bien que le lithium ait plusieurs effets sur les

cellules, il a été montré qu’il fournissait une protection vis-à-vis de l’apoptose causée par une

GSK3β hyperactive (Bijur G.N. et al., 2000) suggérant que la capacité protectrice du lithium

est, en partie, due à l’inhibition de GSK3β (Bijur G.N. et al., 2000 ; Li X. et al., 2002).

Maintenant, il existe une reconnaissance croissante pour cette relation car de nombreuses

conditions, qui entraînent l’apoptose en association avec l’activation de GSK3β, sont aussi

contrecarrées par le lithium, et de nouveaux inhibiteurs de GSK3β ont un effet protecteur

similaire au lithium (Cross D.A. et al., 2001).

Le rôle de GKS3β dans la régulation de l’apoptose cellulaire a été largement étudié et

documenté et ceci dans de nombreux modèles cellulaires (neurones, hépatocytes…). Le rôle

pro-apoptotique de GSK3β se situe à différents niveaux selon ses principales localisations

cellulaires, cytosolique, nucléaire ou mitochondriale. L’inhibition de la synthèse protéique

suite à la phosphorylation du facteur d’initiation eucaryotique 2B (eIF2B) par GSK3β a été

trouvée comme un mécanisme important pour faciliter l’apoptose (Pap M. & Cooper G.M.,

2002). En outre, GSK3β facilite l’activation de la voie de signalisation impliquant la kinase c-

Jun, en activant la mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEKK1), ce qui contribue

souvent à une signalisation apoptotique (Kim J.W. et al., 2003 ; Hongisto V. et al., 2003).

Dans le noyau, GSK3β promeut l’apoptose en régulant les facteurs de transcription, c’est-à-

122


dire à la fois en inhibant les facteurs de transcription qui favorisent la survie, tels que CREB

et le facteur heat shock-1 (Grimes C.A. & Jope R.S., 2001), et en facilitant l’action des

facteurs de transcription pro-apoptotiques, comme p53 (Watcharasit P. et al., 2002). De plus,

GSK3β est capable de favoriser l’apoptose, en induisant la translocation nucléaire des facteurs

de transcription pro-apoptotiques (figure 39).

Au niveau mitochondrial, GSK3β favorise la voie apoptotique intrinsèque en réponse

aux dommages à l’ADN, au stress oxydant, au stress du RE, ou à d’autres types d’injures qui

causent des dommages cellulaires. Ces conditions qui activent cette voie apoptotique

intrinsèque entraînent une perturbation de la mitochondrie, conduisant à la destruction

cellulaire, processus qui sont favorisés par GSK3β. Les événements majeurs provoquant la

perturbation de la mitochondrie et conduisant à l’activation des caspases (dont la caspase-3)

sont clairement facilités par GSK3β, notamment par la régulation de la libération des

protéines à domaine BH3, à partir des microtubules (figure 39). Or, il faut rappeler que

GSK3β est un déstabilisateur des microtubules. Il est à noter que GSK3β activée (via

l’inhibition d’Akt) peut phosphoryler le canal ionique VDAC (voltage dependent anion

channel), protéine abondamment présente dans la membrane externe mitochondriale. Or, cette

phosphorylation de VDAC par GSK3β empêche l’hexokinase II (HXKII) de se lier à VDAC.

Dans les cellules transformées, ceci induit une dissociation des mécanismes de glycolyse et de

survie cellulaire, conduisant à leur apoptose (Pastorino J.G. et al., 2005).

La GSK3β activée facilite aussi la mort par anoïkis, qui est le résultat de l’interruption

des interactions cellule-MEC (Kim H.S. et al., 2002 ; voir aussi le chapitre II sur les

intégrines). De plus, il a été démontré que la surexpression d’un mutant GSK3β qui est

déficient pour la phosphorylation sur ser 9 (GSK3β S9A) est suffisante pour induire

l’apoptose cellulaire (Sanchez J.F. et al., 2003). De façon intéressante, une étude sur la

localisation cellulaire de GSK3β, lors d’une stimulation pro-apoptotique, met en évidence sa

relocalisation dans les rafts lipidiques (Sui Z. et al., 2006).

A l’opposé, GSK3β peut induire la survie cellulaire, en inhibant la

phosphotidylinositol D3-phosphatase PTEN, suppresseur de tumeur qui contrecarre les effets

de la voie PI-3K/Akt et qui régule négativement la croissance et la survie cellulaires. En effet,

Al-Khouri et ses collaborateurs ont démontré que la caséine kinase 2 (CKII) n’est pas la seule

kinase à pouvoir phosphoryler PTEN, et que GSK3β participe aussi à sa phosphorylation et

donc à son inhibition, empêchant PTEN d’accéder à ses substrats au niveau de la face

cytoplasmique de la membrane plasmique (Al-Khouri A.M. et al., 2005). Ainsi, la

123


participation de GSK3β dans la phosphorylation de PTEN in vivo suggère une possible

régulation de PTEN par une boucle de rétrocontrôle négatif.

Figure 39 : GSK3β promeut la signalisation apoptotique intrinsèque. GSK3β active la voie de signalisation apoptotique intrinsèque en régulant les facteurs de transcription contrôlant l’expression des protéines pro-apoptotiques, en favorisant les changements de structure cellulaire et la dégradation des microtubules, et en induisant la perturbation mitochondriale. TF : facteur de transcription ; APAF-1 : apoptotic protease activating factor-1. (D’après Beurel E. & Jope R.S., 2006).

124


De plus, un rôle anti-apoptotique de GSK3β a été mis en évidence, notamment après

l’observation d’une apoptose hépatique massive, lors de l’invalidation du gène de GSK3β

(Hoeflich K.P. et al., 2000). Si le rôle pro-apoptotique de GSK3β concerne les voies de

réponse à un stimulus intrinsèque, il semble que son rôle anti-apoptotique se réalise en

réponse à un stimulus extrinsèque, comme le TNF (figure 40).

Figure 40 : GSK3β inhibe la signalisation apoptotique extrinsèque. GSK3β inhibe cette voie apoptotique en diminuant la transduction du signal permettant l’activation de la caspase-8, induite par les récepteurs de mort. Dans l’encart en haut à gauche, sont représentés les différents récepteurs de mort qui appartiennent à la famille des récepteurs au TNF. (D’après Beurel E. & Jope R.S., 2006).

125


Les récepteurs de mort sont essentiels à l’initiation de la signalisation apoptotique extrinsèque

(Ashkenazi A. & Dixit V.M., 1998) et une fois stimulés par leur ligand, ils se trimérisent.

Puis, ces récepteurs trimériques se lient aux protéines cytoplasmiques FADD et la pro-

caspase-8 (ou la 10) pour former un complexe connu sous le nom de DISC (death-inducing

signaling complex). Cette formation du DISC permet d’activer la caspase-8, qui conduit

ensuite à l’activation des caspases effectrices (caspases-3, 6 et 7). Dans la majorité des

cellules, l’activation de la caspase-8 induite par le DISC est insuffisante pour éradiquer les

cellules sans recruter le programme apoptotique mitochondrial via le clivage et l’activation de

Bid (figure 40 ; Scaffidi C. et al., 1998).

Bien que l’effet anti-apoptotique de GSK3β dans l’apoptose stimulée par les

récepteurs de mort ait bien été établi, les bases mécanistiques de cette action restent à être

identifiées. Beaucoup d’études, travaillant sur la compréhension et la caractérisation de ce

mécanisme, se sont portées sur le facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κ B), qui est

fréquemment impliqué dans ces processus de type inflammatoire et est une cible de GSK3β.

Les souris invalidées pour GSK3β se développent normalement jusqu’à la moitié de la

gestation, mais meurent vers le quatorzième jour suite à une apoptose hépatique massive

induite par le TNFα (Hoeflich K.P. et al., 2000). Cette observation représente une des

premières indications sur les fonctions de GSK3 spécifiques de l’isoforme β, car GSK3α est

incapable de compenser la perte de GSK3β (Hoeflich K.P. et al., 2000). Or, cette même

équipe a démontré que l’activation de NF-κB neutralise la signalisation apoptotique induite

par le TNFα , et ce via une régulation induite par GSK3β, au niveau du complexe

transcriptionnel (Hoeflich K.P. et al., 2000).

A l’heure actuelle, trois modes de régulation de NF-κB par GSK3β ont été mis en

évidence (figure 41 ; Ougolkov A.V. et al., 2007). Premièrement, GSK3β peut phosphoryler

le domaine C-terminal (résidus 354-551) de p65 in vitro (Schwabe R.F. & Brenner D.A.,

2002), mais des études plus approfondies sont nécessaires pour vérifier si p65 est un substrat

physiologique de GSK3β et évaluer l’effet de cette modification. D’autres kinases peuvent

aussi phosphoryler la sous-unité p65 de NF-κB, augmentant ainsi sa transactivation (Wang D.

et al., 2000 ; Jang M.K. et al., 2001). Deuxièmement, deux articles d’une même équipe ont

démontré que des taux élevés de β-caténine peuvent antagoniser l’activité de NF-κB (Deng J.

et al., 2002 ; Deng J. et al., 2004), suggérant que l’inhibition de GSK3 (à la fois α et β)

pourrait affecter l’activité de NF-κB via la stabilisation des complexes β-caténine/p65

nucléaires qui sont transcriptionnellement inactifs. Enfin, GSK3β a été récemment montrée

126


comme supportant l’activité transcriptionelle de NF-κB de manière promoteur-spécifique

(figure 41), démontrant que GSK3β supporte sélectivement l’expression d’un sous-groupe de

gènes activés par NF-κB (Steinbrecher K.A. et al., 2005). Parmi les gènes sous la dépendance

de cette voie GSK3β/NF-κB, nous pouvons citer ceux de l’IL-6 et de XIAP (X-linked

inhibitor of apoptosis protein) et Bcl-2, deux protéines anti-apoptotiques (Ougolkov A.V. et

al., 2007).

Figure 41 : Les diverses actions de GSK3β sur l’activité de NF-κB dans le noyau. GSK3β régule l’activité nucléaire de NF-κB, indépendamment de la dégradation d’IκB et de la translocation nucléaire de NF-κB (p65/p50). (D’après Ougolkov A.V. & Billadeau D.D., 2006).

Cependant, il faut préciser que GSK3β peut aussi influencer l’activité de NF-κB, en

amont de p65. Le facteur de transcription NF-κB est composé de deux sous-unités, parmi cinq

existantes. Dans le système hématopoïétique, et notamment dans les cellules leucémiques, la

forme de NF-κB la plus représentée est celle constituée des sous-unités p65 et p50. Or, p50 a

127


pour précurseur la sous-unité p105, qui forme un complexe in vivo avec GSK3β et qui est

phosphorylée in vitro par cette même kinase. De plus, la même équipe a montré que GSK3β

stabilise p105 dans des cellules au repos, mais amorce sa dégradation en réponse à un

traitement au TNFα (Demarchi F. et al., 2003). GSK3β a aussi été impliquée dans la

régulation de la kinase IKKβ responsable de la phosphorylation et de la dégradation d’IκB,

qui séquestre p65 dans le cytosol (figure 41 ; Takada Y. et al., 2004).

1.4. Dans l’architecture et la migration cellulaires

Le rôle de GSK3β dans la régulation de l’architecture et de la migration cellulaires a

surtout été étudié dans le système nerveux. La rétraction et l’extension du neurite, qui sont des

processus cruciaux dans le développement et le remodelage du système nerveux, sont

régulées par GSK3β. Pour une bonne croissance axonale, les événements d’extension et de

rétraction doivent être temporellement et spatialement coordonnés. GSK3β au début du

processus de rallongement des cônes de croissance, c’est-à-dire au front de migration

(« leading edge »), est maintenue sous sa forme inactive, suggérant que sa forme active

inhiberait l’extension des cônes de croissance (Etienne-Manneville S. & Hall A., 2003 ;

Eickholt B.J. et al., 2002). En accord avec cela, l’inactivation expérimentale de GSK3β dans

les neurones granuleux cérébelleux provoque l’expansion du cône de croissance, l’étalement

axonal et l’augmentation des bifurcations (Lucas F.R. et al., 1998 ; Hall A.C. et al., 2002).

Tous ces effets de GSK3β sur l’architecture et la motilité cellulaires proviennent de sa

capacité à réguler et à réorganiser les microtubules. Ainsi, pour éviter l’inhibition de

l’oraganisation des microtubules dépendante de l’APC, l’activité de GSK3β est inhibée dans

les cônes de croissance durant la migration cellulaire par phosphorylation sur sérine. Cela est

réalisé par l’activation de la petite GTPase Cdc42 qui transloque le complexe Par6-PKCζ-

GSK3β au front de migration de la cellule. PKCζ phosphoryle et inactive GSK3β, ce qui

réduit la phosphorylation inhibitrice sur APC (figure 42 ; Etienne-Manneville S. & Hall A.,

2001). Cela permet donc d’accroître la liaison d’APC aux extrémités positives des

microtubules, qui apparaît comme cruciale pour maintenir l’orientation correcte des

protrusions astrocytaires.

Inversement, la sémaphorine 3A (Eickholt B.J. et al., 2002) et l’acide

lysophosphatidique (Sayas C.L. et al., 2002) activent GSK3, et ceci est responsable de la

rétraction du cône de croissance et du neurite. Ces études démontrent bien que l’inactivation

128


et l’activation de GSK3β provoquent respectivement la croissance et la rétraction des neurites,

des processus clés qui régulent la dynamique du remodelage du système nerveux.

Figure 42 : Rôle de GSK3β sur l’interaction des microtubules avec leurs partenaires spécifiques. (D’après Jope R.S. & Johnson G.V.W., 2004).

GSK3β influence aussi le remodelage du système nerveux, via la kinase Pyk2 qui

peut, entre autre, être activée en aval des intégrines de type β1, ainsi que suite à la liaison du

LPA sur son récepteur. Ainsi, il a été démontré que GSK3β est phosphorylée sur tyr 216 par

Pyk2 en réponse à un traitement au LPA, conduisant à la rétraction du neurite (Sayas C.L. et

al., 2006). Une autre kinase, FAK, activée en aval des intégrines β1, joue un rôle important

dans la régulation des interactions protéines-protéines au niveau des sites d’attachement

cellulaire. FAK phosphoryle les protéines associées à l’adhésion, comme la paxilline, pour

défaire les adhésions et promouvoir la migration (Schlaepfer D.D. et al., 2004). Par un jeu de

phosphorylations réciproques inhibitrices, FAK et GSK3β vont subir des périodes

d’activation et d’inhibition itératives, nécessaires à la migration cellulaire (Huang D., 2002 ;

Bianchi M. et al., 2005). GSK3 est également capable de promouvoir l’étalement cellulaire

via la phosphorylation de la paxilline (Cai X. et al., 2006).

129


1.5. Dans la prolifération

Nous avons vu précédemment, dans la partie ci-dessus, que GSK3β pouvait réguler la

dynamique des microtubules. Or, les microtubules du fuseau mitotique sont essentiels au bon

déroulement de la mitose et donc à la prolifération cellulaire. De plus, une équipe a démontré

récemment que la phosphorylation de p27, un inhibiteur majeur des Cdk pour la régulation du

cycle cellulaire est dépendante de GSK3 et augmente sa stabilité (Surjit M. & Lal S.K., 2007).

Ainsi, en absence de facteur de croissance, p27 n’est pas dégradé à cause de la

phosphorylation de GSK3, ce qui bloque la progression des cellules dans le cycle. De plus,

une autre étude antérieure a montré que l’inhibition de GSK3, par le lithium, induit un arrêt

mitotique retardé et cible la différenciation des cellules de neuroblastomes (Garcia-Perez J. et

al., 1999), suggérant que cette kinase une fois activée permet la prolifération de ces cellules

tumorales.

1.6. Dans la sénéscence Le stress oxydant est un processus majeur lors du vieillissement cellulaire. Les

modifications du microenvironnement vieillissant font que les cellules se retrouvent en

présence de plus grandes quantités de ROS. Or, leurs mécanismes de détoxification des ROS

sont de moins en moins performants, ce qui conduit à une importante accumulation de ROS

dans les cellules, et donc à leur transformation maligne, leur sénéscence ou leur apoptose.

Ainsi, chez C. elegans, un facteur de transcription, SKN1, impliqué dans cette détoxification,

est nécessaire à la résistance au stress oxydant et donc à la longévité. Une équipe a démontré

que GSK3 empêche, par phosphorylation, que SKN1 s’accumule dans le noyau et exerce son

rôle d’activateur de la transcription de gènes impliqués dans la détoxification des ROS et dans

la résistance au stress (An J.H. et al., 2005). D’autres travaux ont permis de montrer que

GSK3β, via la tyrosine kinase Fyn, contrôle l’export nucléaire de l’homologue de SKN1 chez

les mammifères, NF-E2-related factor 2 (Nrf2). Ainsi, suite à un stress oxydant, GSK3β est

phosphorylée sur sa tyr 216 et favorise l’export de Nrf2 du noyau, son ubiquitination et sa

dégradation (Jain A.K. & Jaiswal A.K., 2007).

GSK3 est donc un régulateur des mécanismes de détoxification des ROS, ce qui en fait

une cible de choix pour combattre la mort cellulaire, due au vieillissement.

130


2. GSK3β et le microenvironnement médullaire

Nous avons précisé précédemment qu’une des caractéristiques de GSK3β est de

présenter des actions opposées en fonction de l’état du microenvironnement. Ainsi, les

conditions inflammatoires et énergétiques de la niche hématopoïétique vont jouer un rôle clé

dans le mode de réponse cellulaire via GSK3β.

2.1. L’inflammation et l’immunité

Nous savons que la niche hématopoïétique peut prendre un caractère inflammatoire en

raison de perturbations dues au vieillissement ou à une transformation tumorale. Or, GSK3β

est un régulateur majeur des réponses inflammatoires et favorise la production de plusieurs

cytokines pro-inflammatoires, comme l’IL-6, l’IL-1β et le TNF, secondaire à la stimulation de

plusieurs types de récepteurs Toll-like (TLR, Toll-like receptor) dans les monocytes et les

cellules mononucléaires du sang périphérique. Inversement, GSK3β réduit la production de la

cytokine anti-inflammatoire IL-10. Les inhibiteurs de GSK3β sont donc envisagés en

thérapeutique dans de nombreuses pathologies inflammatoires (figure 43 ; Jope R.S. et al.,

2007).

GSK3β a aussi un impact sur l’exposition des MHC class I–related chain A and B

(MICA/B) sur les cellules cancéreuses, puisque son activité est essentielle à l’expression de

ces cibles moléculaires potentielles des cellules NK. Le fait d’activer GSK3β, par des

inhibiteurs des histone deacetylase (HDAC), induit donc l’expression des ligands MICA et

MICB sur les cellules cancéreuses, qui sont ainsi reconnues par les cellules NK (Skov S. et

al., 2005).

2.2. L’hypoxie

Comme nous l’avons évoqué précédemment (dans le chapitre I), la niche

hématopoïétique offre des conditions de type hypoxique, et même anoxique. GSK3β a été liée

à l’apoptose induite par l’hypoxie (Loberg R.D. et al., 2002). En effet, dans cette étude, ils

montrent que le fait d’accroître l’activité de GSK3β conduit à l’apoptose, induite par des

conditions hypoxiques, de cellules vasculaires de muscles lisses. Or, ils démontrent également

que cela peut être empêché par le transport et le métabolisme glucidiques. Une étude récente

sur des cellules de glioblastomes a mis en évidence qu’une voie RhoB/Akt, induite par les

ROS, en conditions hypoxiques, entraînait une inactivation de GSK3β, ce qui favorisait la

131


stabilisation d’HIF1α (hypoxia-inducible factor 1α ; Skuli N. et al., 2006). Au contraire, une

autre étude a montré que l’hypoxie prolongée activait GSK3β et diminuait la protéine HIF1α

(Mottet D. et al., 2003).

Figure 43 : Implication de GSK3β dans diverses pathologies inflammatoires. (D’après Jope R.S. et al., 2007).

De même, dans le cerveau murin, il a été observé sous hypoxie, une rapide déphosphorylation

sur ser de GSK3α et GSK3β, dans le cortex, l’hippocampe et le striatum (Roh M.S. et al.,

2005). Ainsi, ces études suggèrent que GSK3β est un régulateur important de la réponse

cellulaire à l’hypoxie, notamment via le contrôle de la dégradation d’HIF1α. Or, selon le

degré de stress hypoxique et d’apport énergétique du microenvironnement, on peut remarquer

une inhibition ou une activation de GSK3β, démontrant, dans ce cas, aussi, l’étroite régulation

à laquelle est soumise cette enzyme majeure.

Dans un modèle murin, il a été montré que l’inhibition de GSK3, par des inhibiteurs

sélectifs (compétitifs pour le site de liaison à l’ATP), augmentait in vivo la prolifération et

132


l’expansion des CSH humaines et murines pour stimuler l’activité de repopulation

(Trowbridge J.J. et al., 2006). Ainsi, ces résultats suggèrent que GSK3 est un élément majeur

des relations entre les CSH et leur microenvironnement.

3. GSK3β et les cancers

GSK3β se présente comme un acteur potentiel de la transformation néoplastique.

Longtemps considérée en oncogenèse uniquement pour son inactivation dans les voies

canonique Wnt et PI-3K/Akt, plusieurs équipes ont depuis démontré que la GSK3β active

permettait aux cellules de différentes tumeurs de survivre à un stress apoptotique. Ainsi, il

apparaît de plus en plus clairement que son activation permet aux cellules transformées de

résister aux agents pro-apoptotiques et aux conditions de stress microenvironnementales.

3.1. Dans les hémopathies

Une étude réalisée sur des cellules de myélome a pu mettre en évidence le rôle de

GSK3β dans la croissance et la survie de ces cellules. L’inhibition de l’activité de GSK3β, par

la voie PI-3K/Akt, est suffisante pour supprimer la croissance tumorale et induire l’apoptose,

annulant ainsi les effets « oncogéniques » de l’IL-6 (G-Amlak M. et al., 2002). Or, GSK3β

n’est pas seulement activée en aval de l’IL-6, mais il semble qu’il existe une boucle de

rétrocontrôle positif puisque GSK3β favorise la transcription de cette interleukine, via NF-κB

(Steinbrecher K.A. et al., 2005).

En outre, le travail récent de l’équipe de Billadeau a pu mettre en lumière que GSK3β,

en favorisant la transcription de gènes anti-apoptotiques cibles de NF-κB, comme XIAP et

Bcl-2, permet la survie des cellules B de LLC. Dans cette étude, une accumulation aberrante

de GSK3β dans les cellules B de LLC est constatée et une inhibition pharmacologique de

GSK3β (par des compétiteurs ou non de l’ATP) entraîne une déplétion du pool nucléaire, la

suppression de l’activité transcriptionnelle de NF-κB et, de l’expression des protéines anti-

apoptotiques XIAP et Bcl-2 et, l’apoptose des cellules B de LLC. De surcroît, pour la

première fois, ils ont démontré que GSK3β régule la transcription génique par une

modification des histones des gènes cibles de NF-κB (Ougolkov A.V. et al., 2007).

133


3.2. Dans les autres cancers

Le cancer colorectal est l’exemple type d’une dérégulation de la voie Wnt en

cancérologie. Les causes en sont multiples : mutations des acteurs du complexe de

dégradation de la β-caténine (comme l’APC, qui doit son nom aux tumeurs rencontrées dans

ce cancer), déficit en inhibiteurs extracellulaires de la voie Wnt (tels que sFRP1). Ainsi, on

pourrait s’attendre à ce que l’inhibition de GSK3β amplifie les effets de cette dérégulation, et

contribue à cette oncogenèse. Cependant, plusieurs travaux ont révélé que l’inhibition

pharmacologique de GSK3β, par des dérivés maléimides, induisait une importante apoptose

dépendante de p53, dans les cellules cancéreuses colorectales (Ghosh J.C. & Altieri D.C.,

2005 ; Shakoori A. et al., 2005 ; Tan J. et al., 2005). L’équipe de Billadeau a pu donc

démontrer que les taux d’expression de GSK3β sous sa forme active sont plus élevés dans les

cellules tumorales de patients atteints de cancer colorectal, que dans leurs contreparties saines.

Des études indiquant les mêmes propriétés de GSK3β vis-à-vis de la survie des cellules

tumorales ont également été publiées, concernant le cancer de la prostate en réponse au TNF

(tumor necrosis factor ; Liao X. et al., 2003) et le cancer pancréatique. L’équipe de Billadeau

a aussi mis en évidence que GSK3β influence la transcription génique de NF-κB, de façon

indépendante du complexe IKK, dans le cancer du pancréas (Ougolkov A.V. et al, 2005). De

plus, une accumulation nucléaire de la GSK3β active, corrélée significativement avec une

dédifférenciation tumorale a été montrée. De façon intéressante, l’inhibition de l’activité

kinase de GSK3β entraînerait sa dégradation par le protéasome nucléaire. Enfin, l’inhibition

de GSK3β arrête la croissance tumorale pancréatique in vivo (Ougolkov A.V. et al, 2006).

Ces études de l’équipe de Billadeau permettent ainsi de proposer GSK3β comme une nouvelle

cible thérapeutique dans les cancers pancréatiques.

Tous ces travaux démontrent donc que la GSK3β sous forme active - principalement

localisée au niveau nucléaire - contrôle la survie cellulaire des cellules cancéreuses de

tumeurs solides, mais aussi d’hémopathies, et est impliquée dans la résistance à l’apoptose

induite par le stress du microenvironnement tumoral. Il reste à comprendre si GSK3β pourrait

être impliquée dans la pathogenèse de ces tumeurs.

134


D. Conclusions et hypothèses préliminaires sur le rôle de GSK3β

dans les CSH et les CSL

Nous avons vu que GSK3β peut être à la fois une enzyme qui promeut un

microenvironnement inflammatoire et la protection des cellules tumorales vis à vis de ce type

de stress. Or, l’inhibition de GSK3β est bénéfique au pool des CSH normales, d’après

l’équipe de Bhatia (Trowbridge J.J. et al., 2006). Ainsi, on peut suggérer que l’inhibition de

GSK3β puisse amplifier le pool de CSH normales, et par contre réduire le pool de CSL. Ces

deux types cellulaires contrôlent leur quiescence et leur résistance au stress par des voies

différentes. Il reste à déterminer quels pourraient être les partenaires spécifiques de

signalisation de GSK3β dans les CSH et les CSL, en cas de validité de notre hypothèse.

135

Objectifs des travaux

Au vu de cette revue bibliographique, plusieurs aspects de la physiopathologie des

leucémies aiguës myéloïdes restent obscurs, et notamment la chimiorésistance et les rechutes

après chimiothérapie qui sont un grave problème en clinique.

Le microenvironnement médullaire leucémique peut favoriser des stress oxydatif et

hypoxique. Or, deux importants facteurs de la niche hématopoïétique, les molécules

adhésives, telles que les intégrines, et les ligands de la voie morphogène Wnt sont capables

d’influencer la réponse des blastes leucémiques. De plus, l’étude bibliographique nous

indique que ces deux grandes voies partagent certains acteurs de signalisation qui représentent

de véritables carrefours du contrôle des fonctions cellulaire, tels que la glycogène synthase

kinase 3β (GSK3β).

Nous avons donc voulu déterminer :

1. si les intégrines et les ligands Wnt supportent la chimiorésistance des cellules

leucémiques, et

2. quelles étaient les voies de signalisation impliquées dans ce processus.

136

RESULTATS EXPERIMENTAUX

137

Résultats expérimentaux Partie I

Partie I. Le rôle des intégrines et de la voie Wnt dans la

chimiorésistance des LAM

1. Introduction

Les données cliniques indiquent que les rechutes après chimiothérapie sont un

problème majeur pour la survie des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM). 50 à

70 % des patients y sont confrontés et ces récidives se présentent souvent sous une forme

agressive. Plusieurs mécanismes de chimiorésistance ont été mis à jour. En résumé (figure

44), il s’agit pour les cellules leucémiques d’avoir les capacités d’effluer l’agent

chimiothérapeutique, de se protéger des stress extracellulaires - comme le TNFα qui active les

voies des récepteurs de mort -, et d’acquérir un phénotype propice à diminuer ou à surmonter

les dommages à l’ADN (modification des cibles des agents anti-cancéreux, meilleure

réparation et survie améliorée).

Figure 44 : Les principaux mécanismes de chimiorésistance des cellules tumorales. CAM-DR : Cell adhesion mediated drug-resistance ; DISC : death-inducing signaling complex ; P-gp : P-glycoprotéine.

138


Au moment où l’équipe a démarré son étude, plusieurs données bibliographiques

démontraient le rôle de l’adhésion cellulaire en tant que modulateur de la réponse à la

chimiothérapie. Notamment, le rôle protecteur de l’adhésion semblait se situer principalement

au niveau de ses différentes actions anti-apoptotiques dans la mesure où les dommages à

l’ADN n’étaient pas modifiés (Rintoul R.C. & Sethi T., 2002).

A cette même période, le concept de cellules souches leucémiques (CSL) était de plus en plus

accepté et documenté. Ainsi, l’histoire clinique et la physiopathologie ont fortement suggéré

que les cellules leucémiques résistantes aux traitements chimiothérapeutiques et responsables

des rechutes étaient ces CSL. En effet, ces cellules immatures possèdent de grandes capacités

d’efflux des agents anti-cancéreux (conduisant au phénotype de multidrug resistance ou

MDR) et seraient mieux protégées vis-à-vis des dommages à l’ADN (Senent L. et al., 1998).

Il est admis que le microenvironnement des cellules souches est important pour leur

fonctionnalité (cycle cellulaire, survie, protection vis-à-vis du stress).

Nous avons posé la question du rôle de l’adhésion cellulaire et des voies morphogènes,

deux facteurs majeurs du microenvironnement médullaire essentiels à la prolifération et la

survie des cellules hématopoïétiques, dans le contexte de la chimiorésistance des LAM.

N’ayant à l’époque pas de possibilité de traiter des cellules réellement souches leucémiques,

nous avons travaillé sur des cellules du « bulk » leucémique de patients atteints de LAM,

c’est-à-dire sur l’ensemble des cellules médullaires dérivées du clone leucémique de

différents patients. Parallèlement, nous avons réalisé nos expériences sur des lignées

cellulaires leucémiques, et il s’est avéré que la lignée humaine leucémique U937 a présenté

les réponses les plus proches de celles observées chez les cellules de patients. Enfin, nous

avons choisi de travailler in vitro avec un support matriciel de fibronectine, un composé

majeur de la matrice extracellulaire médullaire, et notamment retrouvée dans la MO

leucémique (Vialle-Castellano A. et al., 2004), et des ligands de la voie Wnt, pour deux

raisons : la première est que la voie morphogène Wnt présente des interactions croisées avec

les voies de signalisation de l’adhésion cellulaire dépendante des intégrines (Schambony A. et

al., 2004 ; Bienz M., 2005) et la seconde est qu’une donnée récente de la littérature a suggéré

que ces ligands Wnt pouvaient participer à la chimiorésistance des cellules tumorales (Roth

W. et al., 2000 ; Lee J.L. et al., 2004).

2. Résultats

139

Dickkopf) could modulate adhesion/migration or chemo-sensitivity of several cancer cells (Roth et al., 2000; Shouet al., 2002; Hoang et al., 2004; Lee et al., 2004).Depending on the model, the inhibition of Wnt signalingpathway might induce positive or negative effects onchemosensitivity and adhesive functions. Adhesion andWnt-dependent signals use several common signalingpathways. The oncogenic protein b-catenin is differen-tially localized and regulated upon engagement ofreceptors of cell/cell junctions (cadherins), integrins orWnt receptors (Frizzled) (Yoganathan et al., 2002;Nelson and Nusse, 2004). b-Catenin has been involvedin the regulation of leukemic cell adhesion, proliferation,and survival (Chung et al., 2002; Hwang et al., 2002).Among other targets shared by integrins and Wntpathway is the transcriptional regulator, NF-kB, whichplays a key role in cell survival (Scatena et al., 1998;Bournat et al., 2000). A constitutive activation of NF-kB in AML has been described (Guzman et al., 2001)and its inhibition contributes specifically to apoptosisinduction in leukemic stem cells (Guzman et al., 2002).Upstream of b-catenin and NF-kB, the glycogensynthase kinase 3b (GSK3b) has been shown to controlb-catenin (Yoganathan et al., 2002) and NF-kB(Hoeflich et al., 2000) activities, and can be regulatedby integrins and the Wnt pathway.The purpose of this study was to evaluate the

influence of integrin and Wnt-dependent signalingpathways on the chemosensitivity of AML. The mecha-nism of the integrin/Frizzled cross-talk in the context ofdrug response is presently unknown. Using AML freshblasts and cell lines, we demonstrate here that bothadhesion and Wnt pathways modulate the chemo-sentivity of AML to anthracyclins through a GSK3b/NF-kB-dependent pathway. Moreover, adhesion ofleukemic cells on osteoblasts enhances their drugresistance and triggers Wnt antagonist secretion.

Results

CAM-DR of AML cells occurs in the absenceof serum and is mediated through a4b1 and a5b1integrins engagementWe have first delineated experimental conditions allow-ing CAM-DR studies with the U937 leukemic cell lineand fresh blasts. Serum withdrawal (1 h) was required toobtain cell adhesion onto fibronectin (80%) and death inresponse to daunorubicin (DNR) (40–60%). Cell adhe-sion onto fibronectin (1 h) was followed by 1 h ofDNR treatment in the absence of serum and subsequentincubation of cells with serum for 24 h. Under theseconditions, CAM-DR could be measured in U937 andblasts from patients (Figure 1a). Among the 35 AMLpatients tested, 50% displayed CAM-DR (cell survivalafter DNR treatment in adhesion compared to suspen-sion: þ 25%, n¼ 17, Figure 1a). No significant correla-tion with biological or clinical features (age, WBC, FABsubtype, cytogenetic, FLT3-ITD, CD34 or CD117expression, complete remission, relapse) was observed.

U937 displayed CAM-DR similarly to fresh blasts (cellsurvival after DNR treatment in adhesion compared tosuspension: þ 22%, n¼ 19). Therefore, the followingexperiments were performed with blasts from patients orU937 cells. Cell cycle analysis of PI-labeled U937 byFACS revealed no difference in cell cycle repartition incontrols in adhesion or in suspension. After DNRtreatment, a smaller sub-G1 fraction in DNR-treatedU937 in adhesion (31%) versus suspension (56%) wasmeasured, indicating that cell death due to apoptosiswas decreased in adherent cells (not shown). More-over, adhesion of U937 before DNR treatment pre-vented the cleavage of caspase 3 and its substrate PARP(Figure 1b). Since reduced cell death in adherent DNR-treated U937 was confirmed by different techniques,without evidence of changes in the cell proliferationstatus, we used the MTT assay to measure cell survivalvariations in further experiments.

b

Caspase 3

actin

PARP

U937S

+DNRA

+DNR

0

800

1000

1200

1400

DO

U937

10510.50.10µg/ml Integrin antibody

α5 α4

0

20

40

60

80

100

120%

U937Patients

FnFn α4 Ab α5 Abcoating:

suspensionadhesion

Surv

ival

(%

of

cont

rol)

a

mIgG3

Figure 1 Adhesion protects AML from genotoxic stress. (a) Freshblasts from AML patients and U937 cells were serum starved for1 h and then plated on fibronectin (Fn) or plastic coated withantibodies directed to a4 or a5 integrin subunits. DNR (0.5mM) wasadded for 1 h and after washing, cells were incubated with serumfor 24 h. Surviving cells were estimated by a MTT test. Data frompatients (n¼ 17) or from U937 (n¼ 19) are expressed as percent ofsurvival compared to the controls without DNR (suspension oradhesion). Two independent experiments have been performedwith each anti-integrin antibody and an isotype control with mouseIgG3 is shown. In the insert, a dose–response curve to a4 or a5antibodies in a competitive cell adhesion assay demonstrate theinvolvement of both a4b1 and a5b1 integrins in the adhesion ofU937 on fibronectin. (b) U937 were allowed to adhere onfibronectin (A) or maintained in suspension (S) and treated byDNR. Western-blotting of caspase 3 and its substrate (PARP) havebeen performed onto lysates obtained in the different conditions.

Adhesion and Wnt pathways in chemoresistance of AMLF De Toni et al

3114

Oncogene

In our experimental conditions, U937 adhesion ontofibronectin was mediated by both a4b1 and a5b1 integrinsas indicated by the use of specific blocking antibodiesagainst a4 or a5 subunits (Figure 1a, insert). As shown inFigure 1a, coated antibodies directed to a4 or a5supported CAM-DR to the same extent as fibronectin.Coating with irrelevant antibodies (mouse IgG3) was notable to support CAM-DR (Figure 1a).Downstream of integrin engagement, signaling path-

ways regulated by FAK and phosphoinositide 3-kinase(PI 3-kinase) play a major role in cell survival. Ourprevious data (Recher et al., 2004) have shown thatFAK-negative blasts adherent on fibronectin displayedCAM-DR. Moreover, U937 did not express FAK in ourculture conditions even after 12 h of cell adhesion ontofibronectin (Recher et al., 2004 and not shown). Theuse of PI 3-kinase inhibitors (wortmannin, 100 nM;LY294002, 10 mM) increased chemosensitivity of U937,both in suspension and in adhesion, but CAM-DR wasmaintained (þ 21% in LY294002 assays versus þ 27%in controls, n¼ 8, not shown).Altogether, these results show that CAM-DR in AML

could occur independently of serum factors, impliesdifferent types of integrins and differs from the classicalFAK and PI 3-kinase-dependent pathways.

Modulation of the Wnt pathway regulateschemosensitivity of AMLSince Wnt antagonists (sFRP) have been shown to induceresistance to apoptotic signals in several cancer cells, weexamined this question for AML. Addition of sFRP-1 toblasts or U937 cells induced resistance to DNR (þ 16 andþ 20% increase of survival, respectively) as shown inFigure 2a. Conversely, incubation with the Wnt agonist,Wnt3a, increased chemosensitivity of U937 and blasts(Figure 2a). Notably, addition of sFRP-1 or Wnt3a didnot change adhesion properties (not shown) nor drug-sensitivity of adherent cells (Figure 2a).

b-Catenin being a common target of both Wnt andcell adhesion pathways, its variations were measuredusing Western blotting in our conditions. The b-cateninexpression level in U937 was strongly decreased orincreased upon sFRP-1 or Wnt3a treatment, respec-tively (Figure 2b), but was not changed upon adhesiononto fibronectin (not shown). Moreover, siRNA direc-ted to b-catenin did not significantly modify U937survival (not shown) despite a strong decrease of theprotein level (>80%).These data show that inhibition of the Wnt pathway in

leukemic cells triggers chemoresistance as efficiently ascell adhesion. The mechanisms involved in cell resistanceare not correlated with the level of b-catenin but mightinvolve other targets shared by both pathways.

GSK3b regulates AML survival and is a common effectorof both integrins and Wnt pathwaysGSK3b, a proximal target of both integrins and Wntreceptors, was inhibited by pharmacological inhibitorsor by siRNA. Since proteasomal degradation ofb-catenin is decreased by GSK3b inhibition, we checked

the efficiency of GSK3b inhibitors using Westernblottting of b-catenin (Figure 3a, right panel). Dataobtained in U937 and blasts with different pharmaco-logical inhibitors, or siRNA, demonstrate that GSK3bactivity is required for chemoresistance induced by celladhesion (Figure 3a, left and right panels). The survivalof DNR-treated AML cells in suspension was notsignificantly modified by GSK3b inhibition (Figure 3a,right panel), suggesting that the GSK3b-dependentpathway could have controlled specifically CAM-DR.It should be noted that GSK3b inhibitors did not impaircell adhesion onto fibronectin (not shown).Western blot analysis using an antibody specific for

inactive GSK3b (GSK3 phosphorylated at serine 9)showed that GSK3b was not phosphorylated inadherent U937 by contrast with cells in suspension,suggesting that GSK3b activity is triggered by celladhesion (Figure 3b).As shown in Figure 4, GSK3b inhibition by LiCl

(10mM) abrogated drug resistance induced by differentantagonists of the canonical Wnt/b-catenin pathway(sFRP-1, Dkk-1, Wnt5a).These data demonstrate that GSK3b plays a key role

in the chemoresistance mediated by cell adhesion or Wntinhibition.

a

b

0

20

40

60

80

100

120%

AS

U937 Patients

AS

*

*

**

Surv

ival

(%

of

cont

rol)

*

sFRP-1:Wnt3a:

-- +- +

- + -- - +-

-- +- +

- + -- - +-

β catenin

Control sFRP-1 Wnt3a

U937

actin

Figure 2 Modulation of the Wnt pathway regulates chemosensi-tivity of AML. (a) Fresh blasts from AML patients or U937 cellswere processed for CAM-DR as described in Figure 1. Asindicated, sFRP-1 (10mg/ml) or Wnt3a (20 ng/ml) were incubatedwith leukemic cells before and during DNR addition. Followingincubation with serum for 24 h, survival was estimated by a MTTtest. Data are expressed as percent of survival compared to thecontrols without DNR (suspension, S, or adhesion, A). U937 andPatients’ data are from 3 to 9 experiments: *Po0.05; **Po0.01(comparison with control without sFRP-1 or Wnt3a). (b) b-Cateninlevel was measured by Western blotting in the different experi-mental conditions described above to check the efficiency of Wntmodulators.


3115

Oncogene

NF-kB is required for drug resistance and is regulated byGSK3b in AMLSince NF-kB is a potential target of GSK3b-dependentcell survival pathway and has been shown to be involvedin cell survival of AML, we checked its involvement inadhesion- or sFRP-1-mediated drug resistance. UsingsiRNA directed to the NF-kB family member p65 (Rel A/p65), we show that NF-kB is required for drug resistancemediated by both cell adhesion and the Wnt antagonistsFRP-1 (Figure 5a). Cell survival of DNR-treated U937in suspension (Figure 5a) and cell adhesion on fibronectin(not shown) were not modified by p65 decrease.Measurement of NF-kB activity in U937 cells by gel

electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed asignificant basal activity (Figure 5b) reflecting constitu-tive activity in AML. However, an increased activitywas measured upon adhesion whereas pretreatment withLiCl restored basal activity (Figure 5b), indicating that

GSK3b could regulate NF-kB activity. Notably, varia-tions of NF-kB activity in adherent U937, or after LiCltreatment, were not correlated with significant decreaseor increase in IkB level, respectively (Figure 5c), suggest-ing that: (i) adhesion could increase NF-kB activity by amechanism different from the IkB degradation by theproteasome; (ii) LiCl did not modify NF-kB activitythrough a regulation of the proteasome activity.Altogether, these results show that NF-kB activity

plays major roles in drug resistance of leukemic cells. Inthese conditions, the regulation of NF-kB by GSK3bcould involve an IkB-independent pathway.

Adhesion of U937 on osteoblasts supports drug resistanceand triggers sFRP-1 secretionOsteoblasts play a key role in the maintenance of thehematopoietic niche and we asked for their potentialrole in drug resistance of AML. U937 cells were allowed

αβ GSK3

P(Ser9)GSK3βSA

U937b

a U937

Surv

ival

(%

of

cont

rol)

100

80

60

40

20

00 105 2015

%

**

* *

*

concentration

ADHESION

* LiCl (mM)

3-(3-Carboxy-4-chloroanilino)-4-(3-nitrophenyl)maleimide (µM)

TDZD-8 (µM)SB 216763 (µM)

TDZD-8:0

20

40

60

80

100

120%

siGSK3β:

**

+ -- +

**

Surv

ival

(%

of

cont

rol)

PatientsU937

+-- + -

- +

suspensionadhesion

-- -

**

+-

siScramble:--

-- - +-- ---

+

Figure 3 Effects of GSK3b inhibition on chemoresistance induced by adhesion. (a) Left panel: U937 cells were incubated with GSK3binhibitors (3-(3-Carboxy-4-chloroanilino)-4-(3-nitrophenyl)maleimide, LiCl, SB-216763 or TDZD-8) and processed for CAM-DRassays. Data are expressed as percent of survival compared to controls (cells in Adhesion with DNR), and are representative from twoindependent experiments. Right panel: U937 (n¼ 3–8) and blasts from patients (n¼ 8) were processed for CAM-DR assays. U937 cellsor blasts from patients were preincubated or not with TDZD-8 (10mM). As controls of GSK3b inhibition or of loading, b-catenin andactin levels were checked, respectively. SiRNA GSK3b was performed by electroporation of a ‘smart pool’ of siRNAs as indicated inMaterials and methods section and cells were used 48 h after for CAM-DR assays. Survival was estimated by a MTT test. Data areexpressed as percent of survival compared to the respective controls in Suspension or in Adhesion without DNR. **Po0.01(comparison with control without GSK3b inhibition). (b) Phosphorylation state of GSK3b in U937 adherent (A) or in suspension (S)was evaluated with a specific antibody directed to the inactive form of GSK3b (GSK3 serine phosphorylated at position 9). Data arerepresentative of two independent experiments.


3116

Oncogene

to adhere onto human osteoblasts and apoptosisinduced by DNR was measured by flow cytometry(Figure 6a). In agreement with our previous results(Figure 1), 60% U937 in suspension died in response toDNR. Similarly to adhesion on fibronectin, adhesion ofU937 onto osteoblasts decreased DNR-induced apop-tosis (�11 and �26%, from two independent experi-ments, Figure 6a and not shown). LiCl pretreatment ofU937 partially restored drug sensitivity, suggesting thatGSK3b activity is required for drug resistance in bothadhesion on fibronectin and on osteoblasts.When U937, in suspension, were preincubated with

the culture medium conditioned by U937 adherent onosteoblasts, they became more resistant (þ 23%) toDNR treatment (Figure 6b, bar No. 2, Po0.05). Bycontrast, the supernatant of osteoblasts alone (barNo. 1) did not modify chemosensitivity of leukemiccells. Significant amount of sFRP-1 (but not Dkk-1, notshown) was detected by Western blotting in the super-natant of osteoblasts with adherent U937 but not ofosteoblasts alone (Figure 6b, right panel). It should benoted that sFRP-1 was not detectable when U937 wereincubated with osteoblasts in the absence of adhesivecontacts (chamber with poreous membrane) or whenU937 were allowed to adhere onto fibronectin (notshown). Importantly, immunodepletion of sFRP-1 fromthe supernatant restored basal sensitivity of U937 toDNR (Figure 6b, bar No. 3).These results suggest that more relevant complex

adhesion modes of leukemic cells could support drugresistance through the involvement of GSK3b regulation.Importantly, adhesion of leukemic cells on osteoblaststriggers secretion of Wnt antagonists able to modulatedrug response of non-adherent leukemic cells.

Discussion

Microenvironmental factors are now considered to playa very important role in tumorigenesis and resistance totherapy (Hazlehurst et al., 2003; Kenny and Bissell,2003; Prindull and Zipori, 2004). In AML, cellproliferation and differentiation are controlled by theadhesion through engagement of integrin receptors(Bendall et al., 1998), and morphogen pathways suchas Wnt (Simon et al., 2005). Therefore, we focused ourinterest on the role of both mechanisms in resistance totherapy. We confirm here that adhesion through integrinengagement triggers chemoresistance of AML blasts aspreviously shown by Matsunaga et al. (2003). Moreover,we demonstrate that the blockade of the Wnt pathwayby Wnt antagonists supports drug resistance of AML.These two mechanisms of resistance involve the activa-tion of a cell survival pathway controlled by GSK3b/NF-kB. As suggested by the fact that adhesion ofleukemic cells on osteoblasts induces secretion of Wntantagonists, a crosstalk between these two pathways ofresistance could occur in vivo.The interaction between a4b1 (VLA-4) and stromal

fibronectin was shown to support drug resistance ofAML through PI 3-kinase activation, in vitro, andcombination of a4b1-specific antibodies with chemother-apy strongly increased survival rate in vivo (Matsunagaet al., 2003). Our data demonstrate that CAM-DRoccurs for AML after adhesion onto fibronectin as wellas onto osteoblasts. In our experimental conditions,both a4b1 and a5b1-mediated adhesion induced resis-tance, and inhibition of PI 3-kinase did not abolishCAM-DR. a5b1 has already been shown to mediateantiapoptotic and proliferative signals in AML (Bendallet al., 1998). The discrepancy between our results andthose of Matsunaga (Matsunaga et al., 2003) on theinvolvement of a5b1 in CAM-DR of U937 leukemic cellscould be explained by differences in experimentalprocedures, particularly the absence of serum in ourCAM-DR assays, or by the origin of U937 cell line. Itshould be noted that, in Matsunaga’s study, CAM-DRof AML blasts from patients was correlated with theexpression of both a4b1 and a5b1 integrins. Dependingon the context in vivo, either one integrin or the other, orboth, could be involved in CAM-DR.We found that different Wnt antagonists (sFRP-1,

Dkk-1, Wnt5a) induced drug resistance at the same levelas adhesion did. No sFRP-1 was detected in adherentU937 onto fibronectin, but adhesion of U937 onosteoblasts triggered sFRP-1 secretion. sFRP-1 hasbeen shown to induce antiapoptotic effects in glioma(Roth et al., 2000) and leiomyoma (Fukuhara et al.,2002). It protects fibroblasts from ceramide-inducedapoptosis through the regulation of a p53/BCL-2pathway (Han and Amar, 2004). Because U937 arep53 negative and since we did not detect BCL-2variations in our experiments (not shown), this mechan-ism is unlikely to be active in our system. Our datasuggest that adhesion and Wnt antagonist treatment ofleukemic blasts could modulate a common signalingpathway critical for cell survival in response to

100

%

LiCl: - + - + - -+

U937

*** ******

*** **

sFRP-1:

Dkk-1:

Wnt5a:

Surv

ival

(% o

f co

ntro

l)

***

+

SUSPENSION

+ +- - ---- -- - -++

- -- - ++--

--

Figure 4 Effects of GSK3b inhibition on chemoresistance inducedby Wnt antagonists. U937 cells in suspension were preincubatedwith the GSK3b inhibitor LiCl (10mM) for 1 h before the additionof antagonists of the Wnt pathway (sFRP-1 10 mg/ml, Dkk-10.15mg/ml, Wnt5a 10 ng/ml). Then survival to DNR treatment wasmeasured by a MTT test. Data are expressed as percent of survivalcompared to the controls with DNR and are from threeindependent experiments. **Po0.01; ***Po0.001 (comparisonwith controls without Wnt antagonist or LiCl treatment).


3117

Oncogene

genotoxic stress. Moreover, secretion of sFRP-1 afterleukemic cell adhesion onto osteoblasts indicates thatadhesion could also influence the resistance of non-adherent neighboring leukemic cells.Proteolysis of b-catenin has been associated with

proapoptotic effects in leukemic cells (Chung et al.,2002; Hwang et al., 2002). However, in our experiments,b-catenin level was strongly decreased in resistant blaststreated with Wnt antagonists, and modulation ofb-catenin level by siRNA did not significantly modifycell survival. Altogether, these results demonstrate thatb-catenin is not responsible for drug resistance ofleukemic blasts in adhesion or upon Wnt antagonisttreatment. Upstream of b-catenin, GSK3b is a point ofcrosstalking between integrin- and Wnt-dependentsignaling pathways. Our data demonstrate that GSK3bmight be a critical therapeutic target in resistant blastsof AML. Indeed, pharmacological or genetic inhibitionof GSK3b abolished drug resistance induced by adhe-sion or Wnt antagonist treatment. Moreover, we showedthat GSK3b activity was triggered by adhesion ontofibronectin since dephosphorylation of the Ser(9) posi-tion required for GSK3b activation was detected in

adherent blasts before DNR treatment. The involve-ment of active GSK3b in cell survival is poorlydescribed. However, in some solid tumors, GSK3inhibitors are thought to represent interesting futuretherapeutic tools since active GSK3b controls cellsurvival (Ghosh and Altieri, 2005; Ougolkov et al.,2005) or resistance to apoptosis induced by differentstress (Liao et al., 2003). GSK3b activation downstreamof a2b1 engagement has been described previously in athree-dimensional cell adhesion model (Ivaska et al.,2002). Interestingly, in these experiments, dephosphor-ylation of the Ser(9) position of GSK3b is concomitantof Akt inhibition by the protein phosphatase PP2A. Wecurrently check whether this pathway is relevant in ourconditions.We demonstrate that a GSK3b/NF-kB pathway plays

key role in chemoresistance induced by adhesion ontofibronectin or Wnt antagonist treatment. The fact thatan incomplete downregulation of GSK3b or NF-kB p65subunit by siRNA is sufficient to restore chemosensi-tivity suggests that very active pools of GSK3b or p65are involved in the adhesion/Wnt antagonists-dependentresistance. In agreement with the work of Landowski on

actinp 65 65

scramble p65

siRNA

IκB

actin

S AA

+ LiCl

NF-κB EMSA

lamin B

S AA

+ LiCl

S A A+ LiCl

AAb

to p65

free probe

coldprobe

U937

100

Surv

ival

(% o

f co

ntro

l)

*

sFRP-1:

**

sip65: +

-+ +

suspensionadhesion

- - - + +

- - -siScramble: + + +

- - +

- - -- - -- - -

a

b

c

Figure 5 NF-kB activity is required for drug resistance and is regulated by GSK3b. (a) U937 cells were transduced with siRNAdirected to p65. Western-blotting was performed on cell extracts obtained 48 h after p65 siRNA transduction (right panel). Cells werethen processed for CAM-DR. In other assays, U937 in suspension were preincubated with sFRP-1 (10 mg/ml) before DNR treatment.Data are percent of survival compared to the controls without DNR from three independent experiments. *Po0.05; **Po0.01(comparison with control without siRNA p65). (b) NF-kB activity was measured by EMSA (gel electrophoretic mobility shift assays)as described in the Materials and methods section. Nuclear extracts were obtained from U937 in adhesion (A) or in suspension (S) andincubated or not with 10mM LiCl. Controls with cold probe and p65 Ab are shown (right panel). Western blotting of Lamin B wasused as control loading of nuclear extracts (left panel). Data are representative of three experiments. (c) Cytosolic fractions from theabove experiment (S: suspension; A: adhesion) were submitted to Western blotting with IkB antibody. Actin was immunoblotted ascontrol loading.


3118

Oncogene

CAM-DR of myeloma (Landowski et al., 2003), wemeasured an activation of NF-kB in adherent U937compared to cells in suspension. NF-kB is a majortarget in GSK3b-regulated cell survival (Hoeflich et al.,2000) and has been shown to be constitutively active inAML (Guzman et al., 2001). We propose that activeGSK3b could represent a new pathway responsible forNF-kB activation in AML. Different ways of NF-kBregulation by GSK3b, direct or indirect, have beenproposed (Hoeflich et al., 2000; Demarchi et al., 2003;

Deng et al., 2004; Takada et al., 2004). Our data suggestthat the regulation of NF-kB by GSK3b does not occurat the IkB level in our model.One major question raised by our results is the origin

of sFRP-1 detected in the supernatant of osteoblasts andleukemic cells in co-culture, and the potential role ofGSK3b in this secretion. Indeed both cell types havebeen described to secrete sFRP-1 and GSK3b mightcontrol cell survival through the regulation of sFRP-1production. We have performed preliminary experiments

U937

Eve

nts

SUSPENSION

59%

a

Apoptotic cells

Eve

nts

640

10 10 10 10 10PC5

ADHESIONON OSTEOBLASTS

48%Apoptotic cells

- DNR+ DNR

b

100

%

Control

*

Surv

ival

(%

of

cont

rol)

1 2 3

1 2 3Rec.

sFRP-1

sFRP-1

Osteoblast-conditioned media

Eve

nts

640

10 10 10 10 10PC5

ADHESION ON OSTEOBLASTS+ GSK3β INHIBITION (LiCl 10mM)

56%

Fluorescence intensity

Fluorescence intensityFluorescence intensity

Apoptotic cells

Rel

ativ

e ce

ll n

umbe

r

Rel

ativ

e ce

ll n

umbe

r

Rel

ativ

e ce

ll n

umbe

r

Figure 6 Adhesion on osteoblasts protects AML from genotoxic stress. (a) Serum-starved U937 treated or not with LiCl (10mM)were allowed to adhere on osteoblasts and were then treated with DNR as described in Materials and methods section. After 24 h ofincubation in serum supplemented medium, U937 were permeabilized and labeled with Apo2.7-PC5 to check apoptosis by flowcytometric analysis. Proportion of apoptotic cells in each condition is indicated in the histograms. Data are representative of twoindependent experiments. (b) Serum-starved U937 were preincubated with supernatants from flasks containing osteoblasts alone (barNo. 1) or osteoblasts plus adherent U937 (bars No. 2 and 3) before DNR treatment as indicated in Materials and methods section.After 24 h in serum containing medium, effects on survival were quantified by a MTT test. In some experiments, the osteoblastsupernatant was immunodepleted of sFRP-1 (bar No. 3) before incubation with U937. Western blotting with anti-sFRP-1 antibody ofunconcentrated supernatants (50mg of total proteins) is shown. Recombinant sFRP-1 (Rec.sFRP-1) was used as control. Survivalmeasurement is expressed as percent of control (DNR-treated U937) and was obtained from three independent experiments: *Po0.05.


3119

Oncogene

by preincubation of osteoblasts or U937 with LiClbefore starting co-culture. We have not measuredsignificant variations of sFRP-1 amounts in super-natants obtained in control and LiCl assays (notshown). This result and the fact that adherent U937on fibronectin did not secrete significant amount ofsFRP-1 suggest that (i) osteoblasts could be the sourceof sFRP-1 (ii) the sFRP-1 secretion is not controlledby GSK3b.In conclusion, our data demonstrate for the first time

the involvement of GSK3b, under its active form, inchemoresistance induced by adhesion. Moreover, thispathway is also relevant to Wnt antagonist-inducedsurvival, a new way of AML drug resistance that wehave shown. Importantly, our results suggest also thatthe adhesion-dependent secretion of Wnt antagonists byosteoblasts could strongly reinforce resistance to chemo-therapy in the hematopoietic stem cell niche by inducinga double resistance mechanism (i.e. adhesion and anti-Wnt production). Thus, novel antileukemic approachesshould include targeting of the GSK3b/NF-kB pathwaybeside conventional chemotherapeutic agents or specificantioncogenic drugs. It could allow to target specificallyresistant adherent leukemic cells but also their neighborsconditioned by Wnt antagonists.

Materials and methods

Antibodies, Wnt products and GSK3b inhibitorsMonoclonal antibodies against b-catenin, GSK3a/b or integrinsubunits (a5, P1D6; a4, P4G9) were from Cell SignalingTechnology (Beverly, MA, USA), Biosource International(Camarillo, CA, USA) and Dako (Carpinteria, CA, USA),respectively. Mouse IgG3 isotype control was from BDBiosciences, Pharmingen. Monoclonal anti-PARP (poly(ADP-ribose) polymerase) and antiactin were purchased from BDTransduction Laboratories and Sigma, respectively. Polyclo-nal antibodies directed to NF-kB (p65), IkB, lamin B, FRP-1were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).Polyclonal antibody against caspase 3 came from CellSignaling Technology. Horseradish-peroxydase-conjugatedsecondary antibodies against mouse, rabbit or goat immuno-globulins were from Cell Signalling Technology and SantaCruz Biotechnology, respectively. sFRP-1 was a generous giftfrom Dr JS Rubin (Laboratory of Cellular and MolecularBiology, NIH, Bethesda, MD, USA) and Wnt3a, Wnt5aand Dkk-1 were purchased from RD Systems (Lille, France).GSK3b inhibitors: LiCl and SB-216763 were from Sigma,and 3-(3-Carboxy-4-chloroanilino)-4-(3-nitrophenyl)maleimideand TDZD-8 were obtained from Calbiochem (Darmstadt,Germany).

CellsFresh AML cells were obtained from bone marrow of 35patients upon informed consent, using Ficoll-Hypaquedensity-gradient centrifugation. Blasts were immediately cryo-preserved in Iscove’s modified Dulbecco’s medium withdimethyl sulfoxide and fetal calf serum (FCS). All patients werediagnosed according to WHO classification at the HematologyDepartment of Toulouse University Hospital (France). Leu-kemias were characterized in terms of morphology (FrenchAmerican British classification), karyotype, immunophenotyp-ing, and FLT3 gene mutation (internal tandem duplication;

FLT3/ITD) mutation. Bone marrow samples contained morethan 80% leukemic blasts after processing. For in vitroexperiments, blasts were immediately resuspended in RPMI-1640 with 10% FCS after thawing. Cells were then washedtwice in RPMI containing HEPES (10mM) and 0.2% BSA.Only samples with more than 80% of cell survival estimated byTrypan blue were processed. The human leukemic cell lineU937 was purchased from American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD, USA).Fresh human osteoblasts were prepared by the explant

technique (Siggelkow et al., 1999) from normal vertebralfragments obtained at the Pediatric Surgery Department ofToulouse University Hospital (France).

Cell cultureU937 cells and human osteoblasts were grown at 371C in 5%CO2 in RPMI-1640 or DMEM medium, respectively, contain-ing 10% FCS, 50mg/ml penicillin, and 50mg/ml streptomycin.Osteoblasts were used at passages 1–5 and characterized byN-cadherin and phosphatase alkaline expression.

Western blottingFor Western blot, 0.5–3� 106 cells resuspended in cell culturemedium without serum were reduced in Laemmli samplebuffer. After boiling for 10min, proteins were resolved onpolyacrylamide SDS gel (SDS–PAGE) and then transferred tonitrocellulose (membrane Hybond-C super, Amersham Phar-macia Biotech) using a liquid transfer apparatus (AmershamPharmacia Biotech). The membrane was blocked 1 h at roomtemperature in Tris-buffered saline (TBS) containing 1% fat-free milk and 1% bovine serum albumin (BSA). The proteinswere detected by blotting overnight at 41C with the appro-priate monoclonal or polyclonal antibodies in TBS, 0.1%Tween, 1% fat-free milk and 1% BSA, followed by incuba-tion with either anti-mouse or anti-rabbit IgG antibodycoupled to horseradish peroxidase. Detection was achievedusing a chemoluminescent probe (ECL, Amersham PharmaciaBiotech).

Transfection of siRNAU937 cells were transfected using the Amaxa nucleofectiontechnologyt (Amaxa, Koeln, Germany). Briefly, cells wereresuspended in Amaxa solution kit Vt, following the Amaxaguidelines for cell line transfection that we have optimized forU937 cells. 6� 106 U937 cells in 100 ml solution kit V weremixed or not with 200 nM siRNA GSK3b, 200 nM siRNA p65or with 200 nM siRNA scramble (Dharmacon Inc., Lafayette,CO, USA), and immediately nucleofected with an AmaxaNucleofector apparatus (Amaxa, program V01). Cells werethen immediately transferred into wells containing 371Cprewarmed culture medium in six-well plates. After transfec-tion, cells were cultured from 24 to 48 h before analysing byWestern blotting. Decrease of GSK3b and p65 was observed at24 h but was maximal at 48 h. Therefore, tests of drugsensitivity were performed at 48 h postnucleofection.

Drug cytotoxicity studies and induction of CAM-DRIn all, 96 wells microtiter plates (MaxiSorp Immuno Plate,Nunc, Denmark) were coated overnight at 41C with 40 mg/mlof human fibronectin (Roche Molecular Biochemicals, Man-nheim, Germany) in a final volume of 50ml in PBS andsubsequently blocked with 1% fatty acid-free BSA in PBS, 1 hat room temperature. AML cells were diluted at 300 000/mlovernight and then were serum starved for 1 h, incubated ornot with Wnt modulators (sFRP-1, 10 mg/ml; Wnt3a, 20 ng/ml;Dkk-1, 0.15mg/ml; Wnt5a, 10 ng/ml) or GSK3b inhibitors.


3120

Oncogene

Then, cells were allowed to adhere on fibronectin-coatedmicrotiter plate 96 wells (105 cells/well) for 1 h at 371C ormaintained in suspension. In some experiments, adhesionassays were performed on wells coated with a4b1 (1 mg/ml) ora5b1 (0.1 mg/ml) antibodies. Cells in suspension or adherentwere treated with 0.5 mM DNR (Laboratoire Roger Bellon,Neuilly-sur-Seine, France) for 1 h at 371C. At the end of theincubation period, cells were washed and incubated in serum-containing medium for 24 h at 371C. Cell viability was thenquantified by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay(Sigma). Experiments were performed in triplicate.

Preparation of cell extractsU937 cells (5� 106) were serum starved and untreated ortreated with LiCl (10mM) for 1 h and subsequently plated onfibronectin (1 h) or maintained in suspension. In someexperiments, DNR treatment was then performed (1 h). Thencells were washed with ice-cold phosphate-buffered saline,harvested, and resuspended in 0.4ml of buffer A (10mMHEPES, pH 7.9, 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA,1mM dithiothreitol, 0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride). At10min after, 23ml of 10% Nonidet P-40 was added and mixedfor 2 s. Nuclei were separated from cytosol by centrifugation at13 000 g for 10 s and were resuspended in 50ml of buffer B(20mM HEPES, pH 7.9, 0.4M NaCl, 1mM EDTA, 1mMEGTA, 0.1mM phenylmethylsulfonylfluoride). After 30min at41C, lysates were separated by centrifugation (13 000 g, 30 s).Supernatant containing nuclear proteins and cytosol extractswere processed for measurement of protein concentration.Samples were stored at �201C.

Gel EMSAThe gel mobility shift assays were performed with a syntheticdouble-stranded 31-mer oligonucleotide (50-ACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGG-30) containing the NF-kB-binding site from sequences of the human immunodefi-ciency virus long terminal repeat, 5-end-labeled with [g32P]ATPusing the T4 polynucleotide kinase. Of the nuclear extract, 5 mgwas incubated in 20ml of binding buffer (20mM HEPES, pH7.9, 100mM KCl, 20% glycerol, 0.3mg/ml sonicated double-stranded salmon sperm DNA, protease inhibitor mixture(Sigma)) for 20min in ice. Then 32P-labeled oligonucleotideprobe (approximately 30 000–50 000 cpm) was added, and thereaction mixture was incubated for 20min at room tempera-ture. For reactions involving competitor oligonucleotides, theunlabeled competitor and the labeled probes were premixedbefore addition to the reaction mixture. To prove theinvolvement of the NF-kB p65 subunit in DNA binding, p65Ab was added in some assays inducing a shift of the DNA–NF-kB complex. The samples were analysed on 6% acryla-mide gels, which were made in 50mM Tris borateEDTA buffer and electrophoresis was carried out at 100V/cm for 1.30 h. Gel contents were transferred to Whatman

DE-81 paper, dried, and exposed overnight at �801C with anintensifying screen.

Competitive cell adhesion assayAdhesion assays were performed in 96-well plates coated withfibronectin as described in the experimental section of drug-cytotoxicity studies. During serum starvation (1 h), U937 insuspension were incubated with blocking integrin antibodies(anti-a4, P4G9 or anti-a5, P1D6) at concentrations indicated,and cells (0.1� 106) were then allowed to adhere on fibronectinfor 1 h. After two gentle washes with PBS, cells were fixed for30min with a Karnovsky solution (2% paraformaldehyde-0.1% glutaraldehyde in PBS, pH 7.4) and then stained for5min with a 0.1% crystal violet solution. Cells were rinsedfour times under running water, and the stain retained by cellswas solubilized in 0.1ml of 2% sodium deoxycholate, and A595was measured to determine cell adhesion.

Adhesion of AML cells on osteoblastsSerum-starved U937 (1 h; 1� 106) were plated on osteoblastsat nearly confluence (0.4� 106) for 1 h in RPMI. In all,50�60% adhesion was quantified in these conditions. Remain-ing suspended U937 were discarded and DNR (0.5 mM) wasapplied for 1 h. At the end of incubation, cells were culturedin RPMI 10% SVF for 24 h and then analysed for apoptosisby flow cytometric analysis using APO2.7-PC5 labeling(Immunotech, Marseille, France). In some experiments,osteoblasts were cultured at confluence for 48 h in DMEMwith 1% SVF. Then serum-starved U937 were allowed toadhere on osteoblasts for 1 h and incubation of remainingadherent U937 was further continued in DMEM 1% SVF for24 h. At the end of the incubation, supernatants of flasks withosteoblasts alone or osteoblasts plus U937 were centrifugedand incubated with serum-starved U937 for 1 h before DNRtreatment as described in drug cytotoxicity studies sectionabove. U937 survival was estimated at 24 h by a MTT test.When indicated supernatants were processed for immuno-detection of sFRP-1 or Dkk-1 by Western blotting or forimmunoprecipitation of sFRP-1 (5 mg antibody/720 mg totalprotein) and further drug cytotoxicity assays.

Statistical analysisStudent’s t test was used for in vitro experiments analysis.

Acknowledgements

We acknowledge Dr Jeff Rubin for sFRP-1 purchase andscientific advices, Pr Guy Laurent for supporting CAM-DRstudies and Dr Fatima L’Faqihi for technical assistance inFACS experiments. This work was financially supported byAssociation pour la Recherche contre le Cancer (Grant No.3638); Association Laurette Fugain, France.

References

Bendall LJ, Makrynikola V, Hutchinson A, Bianchi AC,Bradstock KF, Gottlieb DJ. (1998). Leukemia 12: 1375–1382.

Bournat JC, Brown AM, Soler AP. (2000). J Neurosci Res 61:21–32.

Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, Weber JM, Olson DP,Knight MC et al. (2003). Nature 425: 841–846.

Chung EJ, Hwang SG, Nguyen P, Lee S, Kim JS, Kim JWet al. (2002). Blood 100: 982–990.

Czyz J, Wobus A. (2001). Differentiation 68: 167–174.Dean M, Fojo T, Bates S. (2005). Nat Rev Cancer 5: 275–284.

Demarchi F, Bertoli C, Sandy P, Schneider C. (2003). J BiolChem 278: 39583–39590.

Deng J, Xia W, Miller SA, Wen Y, Wang HY, Hung MC.(2004). Mol Carcinog 39: 139–146.

Fukuhara K, Kariya M, Kita M, Shime H, Kanamori T,Kosaka C et al. (2002). J Clin Endocrinol Metab 87:1729–1736.

Ghosh JC, Altieri DC. (2005). Clin Cancer Res 11: 4580–4588.Gradl D, Kuhl M, Wedlich D. (1999). Mol Cell Biol 19:5576–5587.


3121

Oncogene

Guzman ML, Neering SJ, Upchurch D, Grimes B, HowardDS, Rizzieri DA et al. (2001). Blood 98: 2301–2307.

Guzman ML, Swiderski CF, Howard DS, Grimes BA, RossiRM, Szilvassy SJ et al. (2002). Proc Natl Acad Sci USA 99:16220–16225.

Han X, Amar S. (2004). J Biol Chem 279: 2832–2840.Hazlehurst LA, Landowski TH, Dalton WS. (2003). Oncogene22: 7396–7402.

Hoang BH, Kubo T, Healey JH, Yang R, Nathan SS, KolbEA et al. (2004). Cancer Res 64: 2734–2739.

Hoeflich KP, Luo J, Rubie EA, Tsao MS, Jin O, Woodgett JR.(2000). Nature 406: 86–90.

Hwang SG, Lee HC, Trepel JB, Jeon BH. (2002). Leuk Res 26:863–871.

Ivaska J, Nissinen L, Immonen N, Eriksson JE, Kahari VM,Heino J. (2002). Mol Cell Biol 22: 1352–1359.

Jamieson CH, Ailles LE, Dylla SJ, Muijtjens M, Jones C,Zehnder JL et al. (2004). N Engl J Med 351: 657–667.

Kenny PA, Bissell MJ. (2003). Int J Cancer 107: 688–695.Landowski TH, Olashaw NE, Agrawal D, Dalton WS. (2003).

Oncogene 22: 2417–2421.Lee JL, Lin CT, Chueh LL, Chang CJ. (2004). J Biol Chem279: 14602–14609.

Liao X, Zhang L, Thrasher JB, Du J, Li B. (2003).Mol CancerTher 2: 1215–1222.

Matsunaga T, Takemoto N, Sato T, Takimoto R, Tanaka I,Fujimi A et al. (2003). Nat Med 9: 1158–1165.

Muller-Tidow C, Steffen B, Cauvet T, Tickenbrock L, Ji P,Diederichs S et al. (2004). Mol Cell Biol 24: 2890–2904.

Nelson WJ, Nusse R. (2004). Science 303: 1483–1487.Ougolkov AV, Fernandez-Zapico ME, Savoy DN, UrrutiaRA, Billadeau DD. (2005). Cancer Res 65: 2076–2081.

Prindull G, Zipori D. (2004). Blood 103: 2892–2899.Recher C, Ysebaert L, Beyne-Rauzy O, Mansat-De Mas V,Ruidavets JB, Cariven P et al. (2004). Cancer Res 64:3191–3197.

Reya T, Duncan AW, Ailles L, Domen J, Scherer DC, WillertK et al. (2003). Nature 423: 409–414.

Roth W, Wild-Bode C, Platten M, Grimmel C, MelkonyanHS, Dichgans J et al. (2000). Oncogene 19: 4210–4220.

Scatena M, Almeida M, Chaisson ML, Fausto N, Nicosia RF,Giachelli CM. (1998). J Cell Biol 141: 1083–1093.

Shou J, Ali-Osman F, Multani AS, Pathak S, Fedi P,Srivenugopal KS. (2002). Oncogene 21: 878–889.

Siggelkow H, Rebenstorff K, Kurre W, Niedhart C, Engel I,Schulz H et al. (1999). J Cell Biochem 75: 22–35.

Simon M, Grandage VL, Linch DC, Khwaja A. (2005).Oncogene 24: 2410–2420.

Takada Y, Fang X, Jamaluddin MS, Boyd DD, Aggarwal BB.(2004). J Biol Chem 279: 39541–39554.

Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM. (2004). Gene 341:19–39.

Yoganathan N, Yee A, Zhang Z, Leung D, Yan J, Fazli Let al. (2002). Pharmacol Ther 93: 233–242.


3122

Oncogene


3. Conclusion et discussion

Nous avons montré que l’adhésion des blastes leucémiques sur fibronectine, via

l’engagement des intégrines α4β1 et α5β1, et l’addition des antagonistes de la voie Wnt

induisent, indépendamment, la chimiorésistance des cellules de LAM. Cette survie cellulaire

est soutenue par l’activation d’une voie GSK3β/NF-κB spécifique, puisque indépendante

d’IκB (figure 45).

Figure 45 : Une nouvelle voie de survie des LAM dépendante de GSK3β/NF-κB suite à l’adhésion cellulaire ou à l’inhibition de la voie Wnt.

Nos résultats représentent la première démonstration du rôle des antagonistes Wnt

dans la survie des LAM et, d’autre part, impliquent pour la première fois l’activation de

GSK3β, comme voie de survie des LAM. De plus, le rôle de l’adhésion dépendante des

intégrines dans cette voie de chimiorésistance des LAM est en accord avec la revue

d’Hazlehurst et al., qui met l’accent sur l’implication des processus adhésifs dans la

chimiorésistance de cellules cancéreuses hématopoïétiques (Hazlehurst L.A. et al., 2003).

Concernant l’activation de GSK3β, cette voie de survie semble être conditionnée par des

conditions microenvironnementales très particulières, telles que la déprivation sérique ou

glucidique, et le stress oxydatif ou inflammatoire. Nous avons reproduit ces conditions de

140


stress in vitro (privation sérique) pour aboutir à nos conditions de CAM-DR. L’activation de

GSK3β a été corrélée à un état de réponse au stress extracellulaire avec un état de non

prolifération, mimant l’état de quiescence, et de résistance aux voies pro-apoptotiques

d’origine extracellulaire (Beurel E. & Jope R.S., 2006). A l’opposé, dans des conditions de

prolifération ou d’apport glucidique normal, il semble que la voie de résistance soit supportée

par une activité PI-3K (Matsunaga T. et al., 2003). C’est ce que démontre Matsunaga et al.,

dans des cellules leucémiques (lignées cellulaires U937 et HL60 et cellules de patients atteints

de LAM) en adhésion sur fibronectine, pour qui l’engagement de l’intégrine α4β1 est

responsable de la CAM-DR, via l’activation de la PI-3K dans des conditions de culture où les

blastes de LAM sont mis en présence de sérum (Matsunaga T. et al., 2003). Dans ces

conditions, l’activité de GSK3β est inhibée après phosphorylation par la kinase Akt, elle-

même stimulée par la PI-3K. Dans notre modèle de CAM-DR, ce sont à la fois les intégrines

α4β1 et α5β1 qui semblent pouvoir induire la chimiorésistance des cellules de LAM. La

question est de savoir si l’engagement de l’intégrine α5β1 est, dans notre cas, crucial pour

l’activation de GSK3β. Cette problématique sera développée, ci-après, dans la partie II des

résultats expérimentaux.

Une autre question posée par nos résultats est le mécanisme impliqué dans la régulation

spécifique de NF-κB par GSK3β. Cette régulation, d’après la littérature, semble avoir lieu

spécifiquement dans le noyau et conduire à l’expression de gènes, tels que ceux de l’IL-6 ou

de facteurs chémotactiques (Steinbrecher K.A. et al., 2005). Ce type de cytokines joue un rôle

extrêmement important dans la survie des cellules hématopoïétiques et leur localisation. De

plus, la régulation de NF-κB par GSK3β dans le noyau pourrait influencer les interactions

entre la β-caténine et NF-κB, et donc contrôler l’équilibre entre autorenouvellement et survie

cellulaire (Deng J. et al., 2002 ; Deng J. et al., 2004).

Enfin, notre démonstration du rôle de sFRP1, sécrété lors de l’interaction entre les

cellules leucémiques et les ostéoblastes, et capable d’induire la chimiorésistance de cellules

leucémiques non adhérentes, par les mêmes signaux intracellulaires que ceux déclenchés par

les intégrines, suggère également un lien étroit entre la balance

autorenouvellement/prolifération cellulaire et les capacités de survie et de résistance au stress.

Tout se passe comme si le blaste leucémique, pour résister à un stress du

microenvironnement, a besoin de bloquer sa prolifération soit par l’adhésion dépendante des

intégrines soit par l’inhibition de la voie Wnt via des antagonistes Wnt, ce qui permettrait

d’engendrer un état de quiescence et de résistance. Or, à l’heure actuelle, aucune donnée n’a

141


été avancée sur l’action des antagonistes de la voie Wnt dans la modulation de la

chimiosensibilité des LAM. Par contre, nous savons que les ligands ou les antagonistes de

cette voie Wnt peuvent être sécrétés par les ostéoblastes (cellules qui sont, comme nous

l’avons révélé précédemment, majeures pour le bon fonctionnement de l’hématopoïèse tant au

niveau de leurs interactions avec les CSH qu’au niveau des régulateurs qu’ils sécrètent) ou par

les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques. Pour l’instant, des résultats

préliminaires, que nous avons obtenus au laboratoire, semblent indiquer que ce sont les

ostéoblastes qui sécrètent sFRP-1, et ce indépendamment de GSK3β, lors de nos expériences

de co-culture entre les cellules leucémiques et les ostéoblastes.

Il serait également intéressant de déterminer le rôle clé d’une modulation des fonctions de la

β-caténine, dans le noyau, par GSK3β, comme nous en discuterons plus tard dans la partie

Conclusion générale et perspectives.

L’ensemble de nos résultats et ceux de la littérature nous incite à penser que cette voie

de survie dépendante de l’activation de GSK3β, des intégrines α4β1 et α5β1, d’interactions

avec la niche hématopoïétique, et de conditions stressantes pourrait représenter un mode de

résistance spécifique des CSL. Cependant, cette voie de survie adaptée à des cellules

quiescentes, et devant survivre aux attaques de leur environnement, pourrait tout aussi bien

concerner les CSH. Il s’agit donc de savoir si, dans les CSL et les CSH, la régulation de

GSK3β est la même et si elle est dépendante de l’adhésion cellulaire. Or, des anomalies des

molécules d’adhésion sont observées dans les LAM, comme le fait que la fibronectine soit

synthétisée en plus grande quantité par les CSL que par les CSH (Vialle-Castellano A. et al.,

2004), et que l’intégrine α5β1, un de ses récepteurs, est aussi plus exprimée dans les CSL que

dans leur contrepartie normale (De Waele M. et al., 1999). De plus, la niche médullaire

leucémique présente des modifications de type inflammatoire par rapport aux cellules de la

niche hématopoïétique normale. Toutes ces constatations suggèrent que cette régulation de

GSK3β soit différente dans ces deux types de cellules souches.

142

Résultats expérimentaux Partie II

Partie II. Les voies adhésives contrôlant l’activation de GSK3β

La synergie originale de α4β1 et α5β1 active GSK3β et favorise la

survie des leucémies aiguës myéloïdes

A new synergy between α4β1 and α5β1 activates GSK3β and

promotes survival of acute myeloid leukemia

Fabienne De Toni, Mathieu Despeaux, Ezzedine Bourrega, Jessica Bertrand, Loïc

Ysebaert, Bernard Payrastre, and Claire Racaud-Sultan

Département d’Oncogenèse et Signalisation Cellulaire dans les Cellules Hématopoïétiques,

Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Unité 563, Centre Hospitalier

Universitaire Purpan, Toulouse, France.

Mots clés : GSK-3β, Pyk2, PP2A, intégrine, survie cellulaire, leucémie.

143


1. Introduction

Chez les Mammifères, la glycogène synthase kinase 3 ou GSK3, sérine/thréonine

kinase mutifonctionnelle, existe sous deux isoformes codées par deux gènes distincts, GSK3α

(51 kDa) et GSK3β (47 kDa) (Woodgett J.R., 1990). La GSK3β est nécessaire à de nombreux

processus cellulaires, tels que le métabolisme du glycogène, la prolifération, la migration et la

survie cellulaires. Des dérégulations de son activité ont été impliquées dans plusieurs

pathologies humaines, comme les diabètes et la maladie d’Alzheimer, et certaines tumeurs

solides (Ougolkov A.V. et al., 2005 ; Shakoori A. et al., 2005). Or, l’activité de GSK3β peut

être régulée par différentes voies de signalisation, incluant la voie PI-3K/Akt, la voie des

morphogènes Wnt et les voies en aval des intégrines.

Suite à l’engagement des intégrines, GSK3β peut être inhibée ou activée suivant les

protéines impliquées. En aval des intégrines, GSK3β est inhibée (par phosphorylation sur sa

sérine 9) par la voie ILK/Akt ou par le complexe Cdc42/PKCζ, pour promouvoir soit la

prolifération cellulaire (Delcommenne M. et al., 1998 ; D’Amico M. et al., 2000), soit la

migration cellulaire (Etienne-Manneville S. & Hall A., 2003), respectivement. Au contraire,

dans un modèle d’adhésion cellulaire en trois dimensions, l’engagement de l’intégrine α2β1

permet d’activer la phosphatase PP2A (protein phosphatase 2A) qui, en déphosphorylant

GSK3β sur sa sérine 9, va conduire à son activation (Ivaska J. et al., 2002). Mais, le rôle de

GSK3β en aval de l’intégrine α2β1 n’a pas été clairement défini, dans cette étude. De plus,

l’activation de GSK3β peut être augmentée par phosphorylation sur sa tyrosine 216 (Grimes

C.A. & Jope R.S., 2001). Pyk2 (Proline-rich tyrosine kinase 2 ; également connue sous le

nom de calcium-dependent tyrosine kinase ou CADTK) est une kinase, partenaire des

intégrines, capable de phosphoryler cette tyrosine activatrice de GSK3β (Hartigan J.A. et al.,

2001), dans un modèle de rétraction du neurite induite par le LPA (lysophosphatidic acid ;

Sayas C.L. et al., 2006). Ces travaux révèlent donc un rôle du couple Pyk2/GKS3β active

dans une voie de signalisation nécessaire à un processus neuronal physiologique. Cependant,

pour l’instant aucun lien n’existe entre cette activation de GSK3β (soit par phosphorylation de

la tyrosine 216 soit par la déphosphorylation de la sérine 9) en aval des intégrines et la survie

cellulaire.

Nous avons précédemment démontré que l’activation de GSK3β était nécessaire à la

chimiorésistance des cellules leucémiques, dans un contexte d’adhésion sur une matrice de

fibronectine (De Toni F. et al., 2006). Dans ce modèle, l’adhésion des cellules leucémiques

144


est induite par l’engagement des intégrines α4β1 et α5β1 et conduit à l’activation de GSK3β,

révélée par sa déphosphorylation sur sérine 9. De plus, cette activation aboutit à l’activation

du facteur de transcription, NF-κB, indépendamment de la régulation classique d’IκB (De

Toni F. et al., 2006). Or, dans la littérature, il a été montré que la régulation dépendante de

GSK3β par phosphorylation de NF-κB dans le noyau ou par régulation épigénétique des

promoteurs cibles, est impliquée dans la survie cellulaire (Ougolkov A.V. & Billadeau D.D.,

2006). GSK3β est aussi particulièrement engagée dans la résistance au stress pro-apoptotique,

induit par la stimulation des récepteurs de mort par le TNF (Beurel E. & Jope R.S., 2006). De

surcroît, des souris invalidées pour cette kinase meurent durant le développement

embryonnaire à cause d’une apoptose hépatique massive (Hoeflich K.P. et al., 2000).

Récemment, plusieurs équipes ont démontré que la GSK3β active permettait aux cellules de

différentes tumeurs solides de survivre ou de résister à un stress apoptotique (Ghosh J.C. et al,

2005 ; Ougolkov A.V. et al, 2005 ; Ougolkov A.V. et al, 2006 ; Liao X. et al, 2003).

Toutefois, bien que des interactions étroites entre la kinase GSK3β et la mitochondrie, le

cytosquelette et plusieurs facteurs de transcription aient été décrites, les mécanismes de

signalisation dépendants de GSK3β aboutissant à la survie cellulaire restent méconnus.

Les processus d’adhésion cellule/cellule ou cellule/matrice sont impliqués dans la

chimiorésistance (CAM-DR) et ce phénotype résistant est retrouvé aussi bien dans des

tumeurs solides qu’hématologiques (Hazlehurst L.A. et al., 2003). Les intégrines α4β1 et

α5β1 participent notamment à ce processus de CAM-DR , par leur capacité à lier la

fibronectine ou des ligands cellulaires (VCAM). Ces deux intégrines reconnaissent toutes

deux la fibronectine, mais par des domaines de liaison différents et spécifiques, pouvant

conduire, comme cela l’a été montré dans les cellules hématopoïétiques, à des effets opposés

sur la prolifération et la survie cellulaires (Kapur R. et al., 2001). Particulièrement, l’intégrine

α4β1 peut présenter des fonctions pro- ou anti-apoptotiques, selon les conditions de culture

cellulaire. Le but de notre étude était donc de déterminer par quelles voies de signalisation, les

intégrines α4β1 et α5β1 pourraient conditionner l’activation de GSK3β dans les cellules

leucémiques, lors de l’induction d’un stress sérique.

Nos résultats montrent pour la première fois que l’engagement des intégrines α4β1 et

α5β1 sur fibronectine aboutit à l’activation de GSK3β et à la survie des cellules de LAM, par

deux voies de signalisation différentes dépendantes de Pyk2 et de PP2A, respectivement. De

plus, il apparaît que ces deux voies pourraient exercer un effet synergique sur la survie des

cellules leucémiques.

145


2. Matériels et méthodes

Anticorps et inhibiteurs pharmacologiques :

Les anticorps primaires monoclonaux murins dirigés contre Pyk2 et GSK3β

proviennent de chez BD Transduction Laboratories, tandis que ceux dirigés contre les

protéines phospho-tyrosines 279/216 GSK3α/β et GSK3α/β sont de chez Upstate et

Biosource International (Camarillo, CA, USA), respectivement. Les anticorps primaires

monoclonaux murins dirigés contre l’actine et les sous-unités d’intégrines (α4, P4G9 ; α5,

P1D6 ; anticorps utilisés pour les expériences de FACS et d’immunofluoresence) ont, quant à

eux, été achetés chez Sigma et Dako (Carpinteria, CA, USA), respectivement. Les anticorps

primaires polyclonaux de lapin dirigés contre Pyk2, PP2A-A, et celui de chèvre dirigé contre

la lamine B sont de chez Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Etats-Unis). Quant à

ceux dirigés contre la phospho-tyrosine 402 de Pyk2 et PP2A-B’, ils ont été fournis par

Biosource International et Cell Signaling Technology, respectivement. Les anticorps

primaires polyclonaux de lapin dirigés contre les sous-unités d’intégrines α4 et α5 (anticorps

utilisés pour les immunoempreintes) ont été achetés chez Chemicon International. L’anticorps

primaire polyclonal de lapin dirigé contre les phospho-sérines 21/9 GSK3α/β provient de

chez Cell Signaling Technology (Beverly, MA, Etats-Unis). Les anticorps secondaires

couplés à la péroxydase de Raifort et dirigés contre les immunoglobulines de souris, de lapin

ou de chèvre sont fournis par Cell Signaling Technology et Santa Cruz Biotechnology,

respectivement, et utilisés pour les immunoempreintes. Pour les expériences de FACS ou

d’immunofluorescence, les anticorps secondaires, couplés à des fluorochromes excitables à

488, 594 ou 633 nm, et dirigés contre les immunoglobulines de souris ou de lapin proviennent

de chez Invitrogen Molecular Probes (pour les Alexa faits chez la souris et le lapin, 488 et 594

nm) et Zymed Laboratories (San Francisco, CA, Etats-Unis ; pour Cy-5, lapin, 633 nm).

Le LiCl, inhibiteur de GSK3β, et l’acide okadaïque, inhibiteur de la phosphatase

PP2A, proviennent de chez Sigma.

Cellules et culture cellulaire :

La lignée cellulaire humaine leucémique U937 a été achetée à la société « American

Type Culture Collection » (ATCC ; Rockville, MD, Etats-Unis). Les cellules U937 se

cultivent, à 37°C, dans une atmosphère à 5 % CO2, dans un milieu de culture RPMI-1640,

complémenté avec 10 % de sérum, 50 µg/ml de pénicilline et 50 µg/ml de streptomycine.

146


Tous les deux ou trois jours, le milieu est changé et les cellules sont comptées afin de les

remettre à 300 000 cellules/ml, dans de nouvelles flasques, pour permettre une prolifération

intensive.

Immunoempreinte :

Pour les expériences d’immunoempreinte, 0.5-1.106 cellules, après lavage au PBS

(Phosphate Buffer Saline), sont re-suspendues dans du tampon Laemmli. Après les avoir

soniquées pendant 10 sec et bouillies pendant 10 min, les protéines sont migrées dans un gel

dénaturant de polyacrylamide (SDS-PAGE), et transférées sur une membrane de

nitrocellulose (membrane Hybond-C, Millipore). Puis, les sites non spécifiques de la

membrane sont saturés, pendant 1 h à température ambiante, avec une solution de TBS-T

(Tris-buffered saline avec 0.1 % de Tween 20 de chez Sigma) contenant 5 % de lait sans

acides gras. Les protéines sont ensuite détectées par incubation avec les anticorps

monoclonaux ou polyclonaux appropriés (dilués dans une solution de TBS-T contenant le

plus souvent 3 % lait et 3% BSA (Bovine Serum Albumin de chez Euromedex), toute la nuit à

4°C, suivie d’une incubation avec l’anticorps secondaire couplé à la péroxydase de Raifort et

dirigé contre les immunoglobulines de souris ou de lapin, pendant 1 h à température ambiante.

La détection est achevée par l’utilisation d’une sonde chémoluminescente (SuperSignal,

Amersham Pharmacia Biotech).

Transfection cellulaire des siRNA :

Les cellules U937 sont transfectées en utilisant la technologie de nucléofection

d’Amaxa (Amaxa, Koeln, Allemagne), comme indiqué dans l’article De Toni F. et al., 2006.

6.106 cellules U937 sont reprises avec 100 µl de solution du kit V et 200 nM de siRNA

GSK3β, 100 nM de siRNA PP2A-B’ ou 100 nM de siRNA contrôle provenant de chez

Dharmacon Inc. (Lafayette, CO, Etats-Unis), ou avec 30 nM de siRNA α4 ou α5 intégrines,

achetés chez Ambion. Elles sont immédiatement nucléofectées avec l’appareil de

nucléofection d’Amaxa (programme V01), puis transférées dans un milieu de culture adéquat

(RPMI 10 % sérum) à 37°C. Après transfection, les cellules sont cultivées de 24 à 96h pour

être analysées soit par immunoempreinte soit par FACS. Les diminutions de GSK3β, de Pyk2

et de l’intégrine α4 sont maximales à 48h, celle de PP2A-B’ à 72h et celle de l’intégrine α5 à

96h. Les tests de survie seront donc réalisés pour chacune de ces protéines à 48, 72 et 96h

après nucléofection, respectivement.

147


Analyse par cytométrie en flux de l’expression membranaire des intégrines :

Pour chaque expression protéique (ici celle des intégrines α4 et α5), 0.5.106 cellules

sont incubées 1h à température ambiante avec l’anticorps primaire choisi, puis avec un

anticorps secondaire approprié couplé à un fluorochrome, pendant 30 min à 4°C et à l’abri de

la lumière. Les cellules ainsi marquées sont ensuite suspendues dans une solution de PBS,

puis passées au cytomètre en flux (FACS). Après analyse, on détermine le niveau

d’expression de la protéine d’intérêt dans la majorité des cellules.

Analyse apoptotique par marquage annexine V/Iodure de Propidium :

1.106 cellules de cellules transfectées par siRNA contrôle ou siRNA α5, 96 h après

nucléofection, sont déprivées une heure en sérum et mises une heure en adhésion sur

fibronectine. Après récupération, les cellules sont lavées puis incubées 15 minutes, à

température ambiante et à l’abri de la lumière, avec une solution d’annexine V/iodure de

propidium (IP), volume à volume. Après reprise des cellules dans du PBS, les cellules sont

passées au cytomètre en flux (FACS). Après analyse, on détermine le pourcentage de cellules

vivantes, de cellules en apoptose et de cellules en nécrose sur 10 000 cellules.

Test MTT :

La moitié des puits d’une plaque 96 puits (MaxiSorp Immuno Plate, Nunc, Danemark)

est recouverte, toute la nuit à 4°C, avec 40 µg/ml de fibronectine humaine (Roche Molecular

Biochemicals, Mannheim, Allemagne) dans un volume final de 50 µl de PBS et saturée le

lendemain, 1h à température ambiante, avec une solution de PBS contenant 1 % de BSA sans

acides gras. Les cellules U937 sont diluées, la veille, à une concentration de 300 000/ml et le

lendemain déprivées en sérum pendant 1 h à 37°C, incubées ou non avec le LiCl (100 nM) ou

l’acide okadaïque (100 nM) dans un milieu très pauvre en glucose (DMEM 1 g/L de glucose,

Gibco). En effet, des expériences ont permis de démontrer que les cellules leucémiques

résistaient mieux à un stress génotoxique en adhésion, quand elles étaient incubées avec un

milieu très pauvre en glucose par rapport à un apport glucidique normal (DMEM 4.5 g/L de

glucose) (résultat non montré). Puis, les cellules sont mises en adhésion sur les puits

recouverts de fibronectine (0.8.105 cellules/puits) pendant 1h à 37°C ou maintenues en

suspension. A la fin de cette dernière incubation, les cellules sont lavées puis incubées dans

du milieu contenant 10 % de sérum, pendant toute la nuit, à 37°C. La survie cellulaire est

ensuite quantifiée avec un test au methyl thiazolyl tetrazolium (MTT, Sigma). Les expériences

sont réalisées en triplicat.

148


Immunofluorescence:

Les puits de lames (Cel-Line, Portsmouth, NH, Etats-Unis) sont recouverts, toute la

nuit à 4°C, avec 40 µg/ml de fibronectine humaine (FN) pour les cellules en adhésion. Pour

les cellules en suspension, les puits sont recouverts avec de la poly-l-lysine (PLL, Sigma),

pendant une nuit à température ambiante, pour permettre une adhésion non spécifique. Les

cellules leucémiques U937 sont déprivées 1h en sérum, puis mises en adhésion ou non sur les

puits recouverts de fibronectine, pendant 1h à 37°C. Après une incubation de 15 min dans une

solution de méthanol/acétone (vol 1 :1) à 4°C, les lames notées FN sont séchées et les cellules

en suspension, fixées par une solution de méthanol/acétone, sont déposées sur les lames

recouvertes en PLL, pendant 15 min. Les puits sont ensuite recouverts avec des solutions

composées d’un ou de deux anticorps primaires, pendant une heure à température ambiante,

puis incubés avec une solution contenant le ou les anticorps secondaires appropriés et l’iodure

de propidium à 0.2 µg/ml (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, Oregon, Etats-Unis),

pendant 30 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. Toutes les solutions sont

réalisées avec du PBS contenant 0.3 % de BSA (Euromedex) pour permettre une saturation

des sites non spécifiques. Pour finir, les lames sont montées grâce à du mowiol. Après leur

séchage toute la nuit à température ambiante, les lames sont observées à l’aide d’un

microscope confocal (Zeiss LSM 510). Les images sont ensuite analysées avec le logiciel

« LSM Image Browser ».

Fractionnement cellulaire :

30.106 de cellules leucémiques U937 sont déprivées 1h en sérum, à 37°C, puis mises

en adhésion sur des boîtes de culture recouverte de 40 µg/ml de fibronectine humaine,

pendant 1 h, à 37°C, ou maintenues en suspension. Après un lavage avec du milieu de culture,

les cellules sont reprises dans un tampon hypotonique, pendant 30 min à 4°C, puis la lyse

cellulaire est complétée par l’action physique d’un « dounce ». Après centrifugation, la

fraction nucléaire, constituant le culot, est récupérée dans un tampon de lyse, puis soniquée.

Le surnageant, composé des membranes et du cytosol, est centrifugé à 12 000 tr/min pendant

45 min à 4°C. Le culot de cette centrifugation représente la partie membranaire, est repris

dans un tampon de lyse, et soniqué également. Le surnageant de cette dernière centrifugation

représente le cytoplasme. Les trois fractions cellulaires (nucléaire, cytosolique et

membranaire) sont ensuite dosées, diluées dans du tampon Laemmli et déposées sur gel

d’acrylamide pour détection protéique. La détection avec l’anticorps dirigé contre la lamine B

149


sert de vérification au bon déroulement du fractionnement, car elle ne doit être retrouvée que

dans les fractions nucléaires.

Analyses statistiques :

Les tests « student » sont utilisées dans les analyses de toutes les expériences in vitro.

3. Résultats

3.1. Résultats expérimentaux

GSK3β, les intégrines α4β1 et α5β1 sont impliquées dans la survie des cellules leucémiques

adhérentes sur fibronectine

Nos précédents travaux avaient démontré que les intégrines α4β1 et α5β1, et la kinase

GSK3β, étaient impliquées dans la chimiorésistance des cellules de LAM adhérentes sur

fibronectine (De Toni F. et al., 2006). Afin de déterminer si les intégrines α4β1 et α5β1 et

GSK3β jouent un rôle dans la survie de ces cellules, en absence d’agent chimiothérapeutique,

nous avons déterminé des conditions expérimentales de culture cellulaire qui permettraient la

mise en place des voies protectrices adhésives, en réponse au stress. Ce fut le cas après

déprivation sérique et diminution du glucose dans le milieu de culture (voir Matériel et

Méthodes). Dans ces conditions, les cellules leucémiques U937 présentent une survie

augmentée de 30 %, par rapport aux cellules maintenues en suspension (résultat obtenu par

marquage annexine V/Iodure de Propidium et test MTT, non montré). Nous avons ensuite

réalisé des expériences avec des siRNA spécifiques de nos protéines d’intérêt. L’analyse par

cytométrie en flux (FACS) montre une diminution de 47 % et de 33 % des intégrines α4 et

α5, respectivement (figure 1.A.). Par immunoempreinte, on constate également une nette

diminution du taux de GSK3β avec un siRNA spécifique de cette kinase (figure 1.A.). Ainsi,

dans nos conditions expérimentales, l’efficacité maximale, que nous avons observé avec

chacun de ces siRNA, est à 48h pour l’intégrine α4 et GSK3β, et à 96h, pour l’intégrine α5.

Dans ces conditions d’efficacité des siRNA, la figure 1.B. montre une diminution de 28

% et de 30 % des cellules leucémiques vivantes en adhésion, révélée par un test MTT, quand

l’expression de l’intégrine α5 ou de GSK3β est inhibée, respectivement. Par contre, le siRNA

dirigé contre l’intégrine α4 entraîne une diminution de la quantité de cellules vivantes en

adhésion beaucoup plus modeste (-12 %). En suspension, le siRNA dirigé contre l’intégrine

150


α5 entraîne une baisse du nombre de cellules deux fois moins importante qu’en adhésion. Il

est important de préciser qu’aucun de ces trois siRNA n’a induit de modifications des

capacités d’adhésion sur fibronectine des cellules leucémiques, dans nos conditions

expérimentales (résultat non montré).

Etant donné que le test MTT permet de révéler des variations de quantité de cellules

vivantes dues à des différences de prolifération ou de survie, nous avons réalisé un marquage

Annexine V/ Iodure de propidium de nos cellules, pour déterminer si les variations observées

dans la figure 1.B. sont réellement la conséquence d’un mécanisme de survie. On constate que

les cellules transfectées avec un siRNA dirigé contre l’intégrine α5, dans nos conditions

expérimentales de déprivation sérique suivie de l’adhésion sur fibronectine, présentent une

augmentation du pourcentage d’apoptose (20,60 % versus 8,54 % pour le siRNA contrôle), et

dans une moindre mesure également de nécrose (8,64 % versus 4,52 % pour le siRNA

contrôle), par rapport aux cellules transfectées avec un siRNA contrôle (figure 1.C.). Cela

nous indique que l’inhibition de l’intégrine α5 entraîne une apoptose de nos cellules

leucémiques en adhésion et donc que l’intégrine α5 est nécessaire à la survie des cellules

leucémiques adhrentes, en réponse à un stress. Cependant, il est à noter que nos études

précédentes avaient mis en évidence l’absence de différence dans la répartition du cycle

cellulaire des cellules en suspension et de celles en adhésion, dans nos conditions

expérimentales (De Toni F. et al., 2006).

Nos résultats confirment donc la nécessité de l’engagement des intégrines α4β1 et

α5β1 pour la survie des cellules leucémiques adhérentes sur fibronectine. En effet, les sous-

unités α4 et α5 sont très majoritairement associées à la sous-unité β1 dans les cellules de

LAM. De plus, la diminution de survie, constatée lors du traitement avec les siRNA α5 ou

GSK3β est équivalente quantitativement (de -28 % et de -30 %, respectivement), et est

comparable au pourcentage de survie observé pour les cellules adhérentes par rapport aux

cellules en suspension, dans nos précédentes expériences de CAM-DR (De Toni F. et al.,

2006). Ceci suggère que, dès leur adhésion sur une matrice de fibronectine, les cellules

leucémiques pourraient mettre en place une voie spécifique de survie dépendante des

intégrines β1 et de GSK3β, dans nos conditions expérimentales, c’est-à-dire en absence de

sérum. Nous avons donc recherché quelles étaient les voies de régulation de GSK3β, en aval

des intégrines α4β1 et α5β1.

151


L’expression et l’état de phosphorylation de GSK3β sont différentiellement régulés par les

intégrines α4β1 et α5β1 dans les cellules leucémiques

Afin d’aborder les voies régulatrices de GSK3β par les intégrines α4β1 et α5β1, nous

avons dans un premier temps recherché l’impact des siRNA dirigés contre ces deux intégrines

sur l’expression de GSK3β. Après nucléofection avec ces siRNA, dans les conditions

normales de culture, c’est-à-dire en présence de 10 % de sérum, le siRNA α4 induit une forte

diminution du taux de GSK3β, qui n’est pas constatée avec le siRNA de l’intégrine α5 (figure

2.A.). Ce résultat suggère donc que l’intégrine α4 serait capable de réguler le niveau

d’expression de GSK3β.

Par la suite, en nous plaçant dans nos conditions d’adhésion en déprivation sérique,

nous avons étudié l’impact de ces mêmes siRNA sur l’état de phosphorylation de GSK3β.

Deux phosphorylations spécifiques ont été suivies, la phosphorylation sur sérine 9, qui reflète

un état inhibé de l’activité de GSK3β, et la phosphorylation sur tyrosine 216, qui au contraire

entraîne une activation de l’enzyme. Tout d’abord, dans les conditions « contrôle » (si

contrôle, en suspension), on observe une forte phosphorylation à la fois sur sérine 9 et sur

tyrosine 216 de la kinase (figure 2.B.). En suspension, seule l’intégrine α4 induit une nette

variation de l’état de phosphorylation de GSK3β, puisqu’une nette diminution de la

phosphorylation sur tyrosine 216 est observée. La mise en adhésion des cellules contrôles (Si

contrôle) sur fibronectine entraîne une diminution de phosphorylation sur sérine 9 et sur

tyrosine 216 (figure 2.B.). Il ressort également de cette même figure que les siRNA intégrines

modifient différemment l’état de phosphorylation de GSK3β en adhésion, puisque le siRNA

α4 entraîne une diminution de la phosphorylation sur tyrosine 216 (comme en suspension) et

le siRNA α5 provoque au contraire une augmentation de la phosphorylation sur sérine 9 de

GSK3β. Il est à noter que les efficacités des siRNA intégrines α4 et α5 sont comparables en

suspension et en adhésion (figures 2.A. et 2.B. panel).

En conclusion, l’intégrine α4β1 régule l’expression de GSK3β et sa phosphorylation

activatrice (sur tyrosine 216), dans les cellules leucémiques en suspension et en adhésion sur

une matrice de fibronectine. Par contre, l’intégrine α5β1 contrôle spécifiquement l’état de

phosphorylation sur sérine 9 de GSK3β en adhésion, en favorisant cette déphosphorylation et

donc l’activation de GSK3β. Nous avons donc recherché quels partenaires spécifiques de

chacune de ces intégrines pouvaient expliquer ces différents niveaux de régulation de GSK3β.

152


L’intégrine α5 et PP2A ont des effets similaires sur la survie cellulaire, la phosphorylation

de GSK3β et sont co-localisées dans les cellules leucémiques

La phosphatase PP2A est un partenaire des intégrines β1, impliqué dans le contrôle de

la survie cellulaire (Janssens V. et al., 2005), et un régulateur de la phosphorylation sur sérine

9 de GSK3β (Ivaska J. et al., 2002). Pour déterminer si cette protéine était impliquée dans la

survie des cellules leucémiques adhérentes, dans nos conditions expérimentales, nous avons

réalisé une inhibition de PP2A par deux approches, l’une pharmacologique (avec 100 nM

d’acide okadaïque) et l’autre par siRNA (siRNA spécifique de la sous-unité régulatrice de

PP2A, PP2A-B’). Le choix de cibler la sous-unité régulatrice B’ de PP2A (B56 ou PP2A-B’)

nous a paru le plus judicieux, étant donné son implication dans la régulation des fonctions

adhésives (Viquez N.M. et al., 2006) et de son rôle de modulateur d’Akt (Van Kanegan M.J.

et al., 2005). L’inhibition par l’acide okadaïque entraîne une diminution de la survie des

cellules leucémiques adhérentes de 25,4 %, comparable à celle obtenue avec l’inhibition de

l’intégrine α5 (figure 3.A.). Il est à noter qu’en suspension, l’inhibition de PP2A par l’acide

okadaïque ou de l’intégrine α5 par siRNA engendre une diminution plus modérée de la survie

des cellules leucémiques, par rapport aux cellules adhérentes. Le siRNA PP2A-B’ s’est révélé

peu efficace (figure 3.A. panel). Son action sur la survie cellulaire est elle aussi modérée,

puisque la diminution de la survie en adhésion n’est que de 13,3 %, et absente sur des cellules

leucémiques en suspension (figure 3.A.). Néanmoins, ces résultats sont en faveur de

l’implication de PP2A dans la survie des cellules leucémiques adhérentes sur fibronectine.

Afin de vérifier le rôle potentiel de PP2A dans la déphosphorylation de GSK3β, dans

notre modèle, nous avons examiné l’impact des siRNA contre PP2A-B’ et contre l’intégrine

α5. La figure 3.B. montre que ces deux siRNA entraînent une augmentation de la

phosphorylation sur sérine 9 de GSK3β, en conditions basales de culture. Ainsi, dans les

cellules leucémiques, l’intégrine α5 et PP2A contrôlent l’état de phosphorylation inhibitrice

de GSK3β. Nous avons ensuite recherché la co-localisation de l’intégrine α5β1 et de la sous-

unité catalytique de PP2A par immunofluorescence, dans nos conditions de déprivation

sérique, en suspension ou en adhésion. Dans ces conditions, l’intégrine α5 et PP2A co-

localisent à hauteur d’environ 50 % dans les cellules U937, au niveau de la périphérie

cellulaire (cytoplasme/membrane) (figure 4), que ce soit en suspension ou en adhésion.

Ainsi, nos résultats démontrent que l’intégrine α5 et PP2A régulent positivement

l’activité de GSK3β, dans des cellules leucémiques U937, et sont co-localisées au niveau

membranaire. Cette régulation pourrait avoir un impact majeur dans nos tests de résistance au

153


stress, puisque nous montrons que PP2A, comme l’intégrine α5, régule la survie des cellules

leucémiques, et ce particulièrement en adhésion.

PP2A et GSK3β co-localisent différemment en suspension et en adhésion dans les cellules

leucémiques

Etant donné que nos résultats montrent un co-localisation identique de l’intégrine α5

et de PP2A, quand les cellules leucémiques sont en suspension ou en adhésion, une

explication potentielle de leur rôle spécifique dans la survie cellulaire en adhésion pourrait

être une différence de localisation de leur cible, GSK3β, entre nos deux conditions

expérimentales (S-SVF et A-SVF).

La figure 5.A. montre, par immunofluorescence, qu’en suspension, GSK3β et la sous-

unité catalytique de PP2A sont majoritairement présentes dans le noyau cellulaire (figure 5.A.

panel de gauche ; 67 % et 72 %, respectivement). En revanche, en adhésion, ces deux

protéines sont en quantités beaucoup plus faibles dans le noyau (figure 5.A. panel de gauche ;

18 % et 21 %, respectivement). Il est à noter que ces deux protéines sont fortement co-

localisées aussi bien en suspension qu’en adhésion (figure 5.A. panel de droite). De plus, une

immunoempreinte de GSK3β (figure 5.B.) montre sa déphosphorylation globale sur sérine 9,

dans des fractions membranaires et cytoplasmiques de cellules leucémiques en adhésion (A-

SVF), par rapport à celles en suspension (S-SVF).

Tous ces résultats suggèrent que la relocalisation de GSK3β du noyau vers le

compartiment cytosol/membrane est une étape clef de son activation, lorsque les cellules

leucémiques U937 sont en adhésion sur une matrice de fibronectine. De façon intéressante, la

phosphatase PP2A, potentiellement responsable de l’activation de GSK3β dans ce modèle, est

fortement co-localisée avec GSK3β et subit la même relocalisation que la kinase sous le

contrôle de l’adhésion.

Pyk2 est activée dans les cellules leucémiques adhérentes, contrôle la survie cellulaire et est

régulée par l’intégrine α4

Nous avons vu précédemment (figure 2.B.) que l’intégrine α4 contrôle de façon

spécifique la phosphorylation sur tyrosine 216 de GSK3β, quand les cellules U937 sont en

suspension ou en adhésion, selon nos conditions expérimentales. Il était donc essentiel de

vérifier si Pyk2, une tyrosine kinase partenaire des intégrines β1 et potentiellement capable de

phosphoryler GSK3β, était activée dans nos conditions d’étude.

154


La figure 6.A. montre que la phosphorylation du résidu tyrosine 402 de Pyk2, reflétant

son activation, est induite par la privation sérique des cellules leucémiques (S-SVF), et encore

plus nettement par leur adhésion sur fibronectine (A-SVF). De façon intéressante, un siRNA

dirigé contre Pyk2 entraîne une diminution significative de la survie des cellules leucémiques,

spécifiquement dans des conditions adhésives (- 30 % ; figure 6.B.). Sur la figure 7.A., on

observe que la phosphorylation sur tyrosine 402 de Pyk2 est sous le contrôle de l’engagement

de l’intégrine α4, sur fibronectine, puisque la réalisation d’un siRNA dirigé contre cette

intégrine l’inhibe fortement.

Au vu de ces résultats, il nous a paru intéressant ensuite de déterminer la localisation

cellulaire de ces deux protéines dans les cellules leucémiques. Par immunofluorescence, une

co-localisation entre l’intégrine α4 et Pyk2 est constatée dans des cellules leucémiques en

suspension et en adhésion, dans nos conditions expérimentales, mais de façon plus importante

en adhésion (figure 7.B.).

En conclusion, la kinase Pyk2 est activée lors de l’adhésion des cellules leucémiques

U937 sur matrice de fibronectine et est impliquée dans leur survie. De plus, son activation est

spécifiquement régulée par l’intégrine α4β1.

Pyk2 régule et co-localise GSK3 phosphorylée sur tyrosine dans les cellules leucémiques en

adhésion

Ainsi, nos résultats montrent que l’intégrine α4 contrôle à la fois l’état de

phosphorylation sur tyrosine 402 et donc l’activation de Pyk2, et celle de GSK3β, spécifique

de sa phosphorylation sur tyrosine 216, dans les cellules leucémiques adhérentes (figures 2.B.

et 7.A.). Nous avons vu, dans la littérature, que Pyk2 peut phosphoryler sur tyrosine 216

GSK3β. Pour vérifier cela dans notre modèle, nous avons réalisé un siRNA dirigé contre

Pyk2. La diminution de l’expression de Pyk2 entraîne une baisse de cet état de

phosphorylation de GSK3β, dans les cellules leucémiques en conditions basales de culture

(figure 8). De plus, l’étude par immunofluorescence montre que Pyk2 et phospho tyrosine

GSK3 co-localisent de façon plus importante quand les cellules leucémiques sont en adhésion

(50 % de co-localisation), par rapport à celles maintenues en suspension (18 %) (figure 9 et

panel de droite).

De façon intéressante, on constate un enrichissement majeur de la protéine phospho

tyrosine GSK3 dans le noyau des cellules leucémiques adhérentes (environ + 30 % de

localisation nucléaire, par rapport à la condition en suspension), ainsi qu’un fort pourcentage

155


de Pyk2 nucléaire, dans ces mêmes conditions adhésives (44 % ; figure 9 et panel de gauche).

Il est à noter que, par fractionnement cellulaire, nos résultats indiquent que la forme

phosphorylée sur tyr 216 de GSK3β est plus abondante, dans le noyau des cellules U937

adhérentes, que la forme phosphorylée sur ser 9 (résultat non montré).

3.2. Figures

156


Figure 1 (De Toni F. et al.)

157



158



159



160



161



162



163



164



165



166


3.3. Légendes des figures

Figure 1: Implication de GSK3β et des intégrines α4 et α5 dans la survie des cellules

leucémiques adhérentes. A. Cytométrie en flux. Après nucléofection avec des siRNA dirigés

contre les intégrines, les cellules U937 transfectées, à 48 h pour l’intégrine α4 et à 96 h pour

l’intégrine α5, sont analysées par cytométrie en flux, après un marquage avec les anticorps

dirigés contre α4 et α5. Les résultats sont comparés aux cellules U937 transfectées avec le

siRNA contrôle et sont représentatifs de deux expériences indépendantes. Le pourcentage de

baisse d’intensité de fluorescence est indiqué. Immunoempreinte. 48 h après nucléofection, les

cellules U937 transfectées avec le siRNA GSK3β sont analysées par immunoempreinte. Les

résultats sont comparés aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle et ils sont

représentatifs de trois expériences indépendantes. L’actine est montrée en tant que témoin de

dépôt. B. Les cellules U937, transfectées avec les siRNA, sont privées en sérum pendant une

heure, 48 h après nucléofection pour le siGSK3β et le siα4 et 96 h pour le siα5, et mises en

adhésion pendant une heure sur fibronectine. Après une nuit d’incubation en présence de 10

% de sérum, le nombre de cellules vivantes est quantifié par un test MTT. Les résultats sont

exprimés en pourcentage comparé aux contrôles respectifs en Suspension ou en Adhésion

(siRNA contrôle) et sont représentatifs de six expériences indépendantes. **P<0.001,

*P<0.05. C. Les cellules U937 transfectées avec le siRNA α5, 96 h après nucléofection, sont

déprivées une heure en sérum et mises une heure en adhésion sur fibronectine. Après un

marquage annexine V/iodure de propidium (IP), les cellules sont passées au cytomètre en

flux, puis analysées en terme de pourcentage de cellules en apoptose et de cellules en nécrose.

Les résultats sont comparées aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle et ayant

subi le même traitement.

Figure 2: Régulation différentielle de GSK3β par les intégrines α4 et α5 dans les cellules

leucémiques. A. Les cellules U937 transfectées avec le siRNA intégrine α4 ou α5 sont

analysées par immunoempreinte, 48 h ou 96 h après nucléofection, respectivement. Des

immunoempreintes sont réalisées vis-à-vis des intégrines α4 et α5, et de GSK3β. Les résultats

sont comparés aux cellules U937 transfectées avec le siRNA contrôle. L’actine est représentée

en tant que contrôle des dépôts. B. Les cellules U937 transfectées avec les siRNA des

intégrines α4 et α5 sont prélevées à 48 h et 96 h, respectivement, déprivées 1 h en sérum, et

sont mises en adhésion sur fibronectine 1 h, à 37°C (A-SVF), ou maintenues en suspension

167


(S-SVF). Après la réalisation de lysats cellulaires, des immunoempreintes sont effectuées vis-

à-vis de GSK3β, phospho (S9) GSK3β, phospho (Y216) GSK3β et les intégrines α4 et α5

(voir le panel, où GSK3β est le témoin de dépôt).

Figure 3: Implication de l’intégrine α5 et de PP2A dans la régulation de GSK3β et dans

la survie des cellules leucémiques. A. Les cellules U937 transfectées avec un siRNA α5 ou

PP2A (dirigé contre la sous-unité régulatrice de PP2A, PP2A-B’) sont recueillies à 96 h et 72

h, respectivement, et déprivées 1 h en sérum. Elles sont ensuite mises en adhésion sur

fibronectine 1 h à 37°C, ou maintenues en suspension, puis toutes les cellules (en adhésion et

en suspension) sont incubées toute la nuit avec 10 % de sérum. Des cellules U937 non

transfectées sont traitées de façon identique, après incubation avec l’acide okadaïque (100

nM) pendant l’heure de déprivation sérique. A 24 h, les cellules vivantes sont estimées par un

test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie par rapport au contrôle en

suspension et sont représentatifs de trois expériences indépendantes, pour les cellules siRNA

PP2A et traitées avec l’acide okadaïque, et de six pour les cellules siRNA α5. **P<0.001.

Panel : 72 h après nucléofection, le taux de PP2A-B’ est évalué par immunoempreinte pour

tester l’efficacité du siRNA. B. 72 h ou 96 h après nucléofection, les cellules U937

transfectées avec le siRNA PP2A-B’ ou intégrine α5, respectivement, sont reprises dans du

tampon Laemmli et analysées par immunoempreinte, pour l’intégrine α5, PP2A-B’, GSK3β,

et sa forme phosphorylée sur sérine 9. Les résultats sont comparés aux cellules transfectées

avec le siRNA contrôle. Le taux d’actine témoigne de l’homogénéité des dépôts.

Figure 4: Co-localisation de l’intégrine α5 et de la phosphatase PP2A dans les cellules

leucémiques. Les cellules U937 sont déprivées 1 h en sérum, puis mises en adhésion (A-

SVF) ou non (S-SVF) sur une matrice de fibronectine pendant 1 h. Elles sont ensuite

marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre l’intégrine α5 et la sous-

unité catalytique de la phosphatase PP2A. Ces images sont représentatives de deux

expériences indépendantes et correspondent au phénotype observé dans plus de 90 % des

cellules de la lame.

Figure 5: Localisations différentielles de PP2A et de GSK3β et régulation de GSK3β

dans des cellules leucémiques en suspension ou en adhésion. A. Les cellules U937 sont

traitées dans des conditions adhésives (A-SVF) ou de suspension (S-SVF), fixées puis

168


marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre PP2A et GSK3β. Panel

de gauche. Le graphique représente le pourcentage moyen de chaque protéine présente dans le

noyau, en adhésion et en suspension, dans plus de 80% des cellules de la lame. Panel de

droite. Le graphique représente le pourcentage moyen de co-localisation des deux protéines

dans la cellule, en adhésion et en suspension, dans plus de 80% des cellules de la lame. B.

Après la déprivation sérique, suivie (A-SVF) ou non (S-SVF) de l’adhésion sur matrice de

fibronectine, les cellules U937 subissent un fractionnement pour obtenir les protéines des

compartiments cytosolique (C) et membranaire (Mb). Les immunoempreintes sont réalisées

vis-à-vis de GSK3β et de sa forme phosphorylée sur sérine 9, ainsi que pour l’intégrine α5.

L’actine est montrée en tant que témoin de dépôt.

Figure 6: Activation de Pyk2 lors de l’adhésion des cellules leucémiques sur fibronectine

et contrôle de leur survie par Pyk2. A. Les cellules U937 sont déprivées en sérum et soit

mises en adhésion (A-SVF), soit laissées en suspension (S-SVF). D’autres cellules sont

cultivées dans des conditions basales en sérum (S+SVF). Des immunoempreintes sont

réalisées avec des anticorps dirigés contre Pyk2, et sa forme phosphorylée sur tyrosine 402, à

partir des lysats obtenus pour chaque essai. L’actine représente le témoin de dépôt. B. Les

cellules U937 transfectées avec un siRNA contre Pyk2 sont recueillies 48 h après

nucléofection, puis traitées dans les conditions adhésives (A-SVF) ou de suspension (S-SVF),

toujours après 1 h de déprivation sérique. Ensuite, toutes les cellules (en adhésion et en

suspension) sont incubées toute la nuit avec 10 % de sérum. Les cellules vivantes sont

estimées par un test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de survie par rapport au

contrôle en suspension et sont représentatifs de cinq expériences indépendantes. **P<0.001.

Panel. 48 h après nucléofection, le taux de Pyk2 est recherché par immunoempreinte pour

tester l’efficacité du siRNA Pyk2, qui a été réalisé par électroporation avec un siRNA « smart

pool » comme indiqué dans le Matériels et Méthodes.

Figure 7: Régulation de Pyk2 par l’intégrine α4 dans les cellules leucémiques. A. 48 h

après nucléofection, les cellules U937 transfectées avec un siRNA dirigé contre l’intégrine α4

sont privées pendant 1 heure de sérum, puis mises en adhésion sur fibronectine, pendant 1

heure. L’évaluation de l’expression de l’intégrine α4 et de la phosphorylation sur tyrosine 402

de Pyk2 est réalisée par immunoempreinte et comparée avec les cellules U93 transfectées

avec un siRNA contrôle, après le même traitement. Le taux d’actine sert de contrôle pour

169


l’homogénéité des dépôts. B. Les cellules U937 sont traitées dans des conditions adhésives

(A-SVF) ou de suspension (S-SVF), puis marquées par immunofluorescence avec les

anticorps dirigés contre Pyk2 et l’intégrine α4. Ces images sont représentatives de deux

expériences indépendantes et correspondent au phénotype de plus de 90 % des cellules de la

lame.

Figure 8: Régulation de la phosphorylation de la tyrosine 216 de GSK3β par Pyk2 dans

les cellules leucémiques. 48 h après nucléofection, les cellules U937 transfectées avec le

siRNA Pyk2 sont recueillies pour obtenir des lysats cellulaires. Par immunoempreinte, le taux

de phosphorylation sur tyrosine 216 de la kinase GSK3β et celui de GSK3β sont révélés. Les

résultats sont comparés aux cellules transfectées avec le siRNA contrôle. Le taux d’actine

représente le témoin de dépôt.

Figure 9: Co-localisation de Pyk2 et de Ptyr GSK3 dans les cellules leucémiques

adhérentes. Les cellules U937 sont traitées dans des conditions adhésives (A-SVF) ou de

suspension (S-SVF), puis marquées par immunofluorescence avec les anticorps dirigés contre

Pyk2 et phospho-tyrosine (Y279/216) GSK3α/β (GSK3 tyr). Panel de gauche. Le graphique

représente le pourcentage moyen de chaque protéine présente dans le noyau, en adhésion et en

suspension, dans plus de 80 % des cellules. Panel de droite. Le graphique représente le

pourcentage moyen de co-localisation des deux protéines dans la cellule, lors des deux

conditions expérimentales, dans plus de 80 % des cellules de la lame.

4. Conclusion et discussion

Dans un modèle de survie au stress de déprivation sérique, nous démontrons que les

cellules leucémiques U937 mettent en place une voie de signalisation spécifique, après

adhésion sur une matrice de fibronectine. Cette voie implique essentiellement l’activation de

la kinase GSK3β par sa déphosphorylation sur sérine 9, induite par la phosphatase PP2A

après engagement de l’intégrine α5β1. Cependant, l’autre intégrine récepteur de la

fibronectine, α4β1, semble jouer un rôle complémentaire majeur qui est de maintenir un

niveau basal d’expression de GSK3β, et de favoriser la localisation nucléaire de sa forme

activée tyrosine phosphorylée, en coopération avec la tyrosine kinase Pyk2.

170


Les résultats obtenus démontrent que, lorsque les cellules U937 sont en suspension, la

phosphatase PP2A co-localise avec l’intégrine α5 et GSK3β, respectivement à la membrane

et dans le noyau. En conditions adhésives, une relocalisation vers le compartiment

cytosol/membrane de la PP2A et de la GSK3β nucléaires est corrélée avec une diminution de

la phophorylation de GSK3β sur sa sérine 9, permettant ainsi son activation. Une approche de

siRNA et d’inhibiteurs pharmacologiques a permis de montrer que l’intégrine α5, PP2A et

GSK3β contrôlaient environ 30 % de la survie des cellules leucémiques en adhésion. Il est

intéressant de noter que ce pourcentage de survie est identique à celui que nous avons observé

lors de nos expériences de résistance à la daunorubicine liée à l’adhésion cellulaire (CAM-

DR), impliquant l’intégrine α5β1 et GSK3β (De Toni F. et al., 2006). Ces données suggèrent

fortement que l’action pro-survie de GSK3β a lieu dans un compartiment

cytoplasme/membrane, structuré par l’intégrine α5. Dans ce compartiment, GSK3β pourrait

être impliquée dans l’inhibition des voies apoptotiques extrinsèque (induite par les récepteurs

de mort) ou intrinsèque (induite par les acteurs mitochondriaux) (Beurel E. & Jope R.S.,

2006).

La voie de signalisation en aval de l’intégrine α5 reste à approfondir, notamment via

la réalisation de co-immunoprécipitations, afin de déterminer si GSK3β interagit dans un

complexe comprenant PP2A et l’intégrine α5. La partie C-terminale de la sous-unité β1 des

intégrines joue un rôle crucial dans la survie cellulaire liée à la phosphatase PP2A (Pankov R.

et al., 2005) et dans l’inhibition de prolifération (Meredith J.E. Jr et al., 1999). Or, la voie

PP2A/ERK a aussi été impliquée, en aval de l’intégrine α2β1, dans la résistance à l’apoptose

induite par Fas (Chetoui N. et al., 2006). De même, la voie ERK est responsable de la

résistance à l’apoptose induite par la privation sérique de cellules adhérentes sur fibronectine

(Gu J. et al., 2002), et GSK3β est décrite comme régulateur de cette voie (Kim J.W. et al.,

2003). Cependant, dans nos expériences, l’inhibition de la kinase ERK ne module pas la

survie des cellules leucémiques U937 en adhésion, après stress sérique (Ysebaert L. et al.,

résultat non publié). En fait, il se pourrait que le rôle de PP2A soit de prévenir l’activation

pro-apoptotique de p38, en réponse aux cytokines (Prickett T.D. et Brautigan D.L., 2007).

Mais, il reste à déterminer si GSK3β pourrait être impliquée dans cette régulation. Enfin,

l’action inhibitrice de GSK3β sur les facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux pourrait

passer par une régulation du VDAC (voltage dependent anion channel), puisqu’il a été

déterminé que GSK3β phosphoryle VDAC sous certaines conditions (Pastorino J.G. et al.,

2005).

171


L’intégrine α4 contrôle le niveau d’expression de GSK3β dans les cellules U937. De

plus, elle favorise la phosphorylation activatrice de l’enzyme sur la tyrosine 216, lorsque les

cellules sont en suspension ou en adhésion. Cependant, une approche par siRNA nous a

permis de montrer que cette intégrine est beaucoup moins essentielle pour réponse au stress

immédiate des cellules leucémiques adhérentes, que l’intégrine α5β1. Cependant, nos

expériences montrent une corrélation entre l’enrichissement nucléaire de la forme

phosphorylée sur tyrosine 216 de GSK3β et des conditions propices à la survie des cellules

leucémiques, c’est-à-dire en adhésion. Dans ces conditions, une forte co-localisation entre la

tyrosine kinase Pyk2 et GSK3 phosphorylée sur tyrosine a été constatée au niveau nucléaire.

Or, Pyk2 est localisée de façon prépondérante dans le noyau des cellules U937 aussi bien en

suspension qu’en adhésion, dans nos conditions expérimentales. En accord avec les résultats

obtenus par Faure et al., dans un autre modèle cellulaire (Faure C. et al., 2007), nous

montrons une dissociation entre la forte phosphorylation sur la tyrosine 402 de Pyk2 observée

dans les cellules U937 adhérentes sur fibronectine, signe de son activation et dépendante de

l’intégrine α4β1, et cette localisation nucléaire. Par contre, Pyk2 sous forme active régule la

phosphorylation activatrice sur tyrosine 216 de GSK3β, dans les conditions basales de culture

des cellules U937. Ainsi, dans notre modèle, l’engagement de l’intégrine α4β1 pourrait

contrôler la tyrosine phosphorylation de GSK3β par le biais d’une régulation de Pyk2 dan sles

cellules leucémiques en suspension ou en adhésion. La spécificité de l’adhésion résulterait

donc de la forte activation de Pyk2 et de sa forte co-localisation avec GSK3β dans le noyau. Il

reste à savoir si la tyrosine phosphorylation de GSK3β survient dans le cytosol ou après sa

translocation nucléaire. La tyrosine phosphorylation de GSK3β pourrait tout aussi bien

réguler à proximité la NLS de GSK3β (Meares G.P. & Jope R.S., 2007), ou la dégradation de

l’enzyme par le protéasome nucléaire (Ougolkov A.V. et al., 2006). Dans ce contexte, il est

intéressant de souligner le rôle de RhoB dans l’accumulation nucléaire de GSK3β (Huang M.

et al., 2006).

Pyk2 a déjà été impliquée en aval de src, dans un modèle de résistance à l’anoïkis,

indépendamment des voies PI-3K/Akt ou ERK (Wei L. et al., 2004). Le rôle de Pyk2 dans la

survie cellulaire peut impliquer des voies de signalisation spécifique, mais aussi une

régulation du cytosquelette via les microtubules (Gil-Henn H. et al., 2007), ou encore une

régulation des centres promoteurs (Schindler E.M. et al., 2007). Il serait donc intéressant de

rechercher les partenaires de Pyk2 et de GSK3β, dans le noyau des cellules U937 résistantes.

Un candidat potentiel, dont nous avons démontré la relevance antérieurement, est le facteur de

172


transcription NF-κB (De Toni F. et al., 2006). Ainsi, la transcription de gènes anti-

apoptotiques, soit par régulation épigénétique, soit par la régulation des co-facteurs des

facteurs de transcription, pourrait, sous le contrôle de Pyk2 et de GSK3β, permettre une survie

des cellules leucémiques stressées sur le long terme. Actuellement, notre équipe explore ces

possibilités.

Nos résultats et les données bibliographiques nous laissent à penser qu’il existeraient

deux « pools » distincts de GSK3β dans les cellules de LAM adhérentes, impliqués tous

deux dans la survie de ces cellules et sous deux formes actives différentes:

• une forme phosphorylée sur tyrosine 216, dans le noyau, qui activerait directement

NF-κB, et donc entraînerait la transcription de gènes anti-apoptotiques et de résistance,

• une forme déphosphorylée sur sérine 9, au niveau du compartiment

cytoplasme/membrane, qui pourrait jouer un rôle dans l’inhibition des voies apoptotiques

extrinsèque et intrinsèque.

Chacune de ces voies de survie serait respectivement sous le contrôle des intégrines

α4β1 et α5β1, mais une prédominance fonctionnelle pro-survie serait attribuable à α5β1, au

moins sur le court terme. Ceci est en accord avec l’importance attribuée à la forme

cytosolique de GSK3β dans les fonctions de survie cellulaire (Meares G.P. & Jope R.S.,

2007). Nos données suggèrent une action synergique des deux intégrines dans le contrôle de

la survie cellulaire des cellules leucémiques (figure 46). On peut également penser que cette

coopération entre intégrines puisse influencer la transformation tumorale, en réponse à un

microenvironnement stressant.

L’activation de GSK3β représente donc une nouvelle voie de survie en aval de

l’engagement des intégrines. Nous montrons de plus que les intégrines peuvent réguler

différentiellement cette enzyme. Cette voie de signalisation, retrouvée active dans certains

cancers, pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique, d’où l’importance de bien

caractériser ses partenaires de signalisation. Enfin, il reste à déterminer si cette voie de survie

est spécifique des cellules tumorales en situation de stress, ou si elle peut être présente dans

les cellules normales. Ceci permettrait de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques

capables d’éliminer les cellules leucémiques chimiorésistantes, tout en épargnant les CSH

normales.

173


Figure 46 : Schéma hypothétique des régulations différentielles de GSK3β par les intégrines α4β1 et α5β1 dans les cellules leucémiques en réponse à un stress microenvironnemental.

174

CONCLUSION GENERALE ET

PERSPECTIVES

175

Conclusion générale et perspectives


Pour finaliser et valoriser nos travaux, il est nécessaire de déterminer si cette voie de

survie dépendante de GSK3β n’est retrouvée qu’après transformation leucémique des CSH, et

pas à l’état normal des CSH. Or, quelques données suggèrent que cette voie n’est pas

essentielle à la résistance de progéniteurs hématopoïétiques normaux. Ainsi, des résultats de

l’équipe indiquent qu’un traitement avec des extraits de plantes à fort pouvoir anti-oxydant et

anti-inflammatoire entraînent une diminution de l’activité de GSK3β et tuent dramatiquement

les cellules de patients atteints de LAM et des lignées leucémiques humaines, alors qu’aucun

effet en terme de mort cellulaire n’est observé dans les cellules humaines normales CD34+

(Bouregaa E. et al., en préparation). De plus, un article de l’équipe de Bhatia montre, dans un

modèle murin, que l’inhibition de GSK3 augmente in vivo les capacités de repopulation des

CSH humaines et murines (Trowbridge J.J. et al., 2006). Ces résultats laissent à penser que

l’inhibition de GSK3β permettrait de favoriser le maintien du pool de CSH au détriment des

CSL, chez les patients atteints de LAM. Ainsi, un essai clinique avec un inhibiteur de GSK3,

à visée anti-leucémique, est en cours aux Etats-Unis. Notre équipe compte également vérifier

l’intérêt de cette approche d’inhibition de GSK3β sur un modèle de LAM humaine

transplantée chez des souris NOD/SCID, à partir d’échantillons cellulaires de patients atteints

de LAM.

A l’heure actuelle, peu de cibles thérapeutiques ont été proposées pour éradiquer

spécifiquement les CSL. Seule la suractivation de NF-κB dans les cellules immatures

leucémiques (Guzman M.L. et al., 2001) permet de suggérer l’utilisation d’un analogue du

parthénolide, le DMAPT, induisant une mort rapide des CSL de leucémies myéloïdes et

lymphoïdes, tout en épargnant les cellules hématopoïétiques normales (Guzman M.L. et al.,

2007). L’activité du DAMPT favorise des réponses de stress oxydant, l’activation de p53 et

l’inhibition du facteur de transcription NF-κB.

Dans notre étude, nous avons montré que la voie de résistance au stress dépendante de

l’activation de GSK3β impliquait plusieurs partenaires de signalisation, des intégrines

jusqu’au facteur de transcription NF-κB. Dans le rôle majeur que joue GSK3β vis-à-vis de la

résistance aux voies de mort d’origine extracellulaire (TNFα et récepteurs de mort), le travail

de Chen et al. est tout à fait intéressant à noter. En effet, une simple modulation de la matrice

extracellulaire, par la liaison de la protéine matricielle CNN1 aux intégrines αVβ5 et α6β1,

176


permet la génération de ROS, l’activation de JNK, et restaure la sensibilité à l’action pro-

apoptotique du TNFα (Chen C.C. et al., 2007). De plus, les nombreux travaux de l’équipe de

Bissell démontrent que le ciblage des intégrines β1 est une stratégie tout à fait intéressante en

cancérologie. Ainsi, l’inhibition de l’intégrine β1 entraîne une polarité différentielle des

cellules cancéreuses de sein par rapport aux cellules normales en structure 3D, permettant la

résistance des cellules normales mais l’induction de l’apoptose des cellules malignes (Park

C.C. et al., 2006). Egalement, un traitement ciblant le récepteur d’adhésion CD44 pourrait

représenter une stratégie intéressante. En effet, l’activation du CD44 par un anticorps

spécifique permet, dans un modèle murin, de délocaliser les CSL de la niche médullaire

protectrice, d’induire leur différenciation, et donc leur éradication (Jin L. et al., 2006). Une

autre approche consisterait à cibler les CSL qui surexpriment les intégrines α4β1 et α5β1, via

l’utilisation du peptide chimérique, RetronectinTM (Takara), qui couplé avec un inhibiteur de

la voie GSK3β, pourrait spécifiquement éradiquer les CSL.

Concernant les partenaires directs de signalisation des intégrines, l’inhibition de la

phosphatase PP2A permettrait de bloquer d’une part la survie dépendante de GSK3β, mais

également d’inhiber la voie Wnt, qui est suractivée dans les LAM. En effet, PP2A semble

impliquée dans la translocation nucléaire de la β-caténine ou dans la régulation de l’activité

transcriptionnelle de LEF/TCF par la β-caténine (Janssens V. and Goris J., 2001). Si la

tryrosine kinase Pyk2 n’a pas encore été ciblée, à notre connaissance, par des inhibiteurs

pharmacologiques éventuellement utilisables en clinique, une autre kinase en aval des

intégrines, ILK, a déjà été proposée comme cible thérapeutique. Son inhibition entraîne des

modifications tant au niveau des cellules leucémiques que de leur support stromal permettant

in fine d’induire l’apoptose des cellules leucémiques (Tabe Y. et al., 2007). Cependant, nos

résultats et ceux de Cordes (Hess F. et al., 2007) montrent que ce type de voie capable

d’activer la voie PI-3K/Akt n’est pas la voie de résistance des cellules leucémiques dans

certaines conditions environnementales de stress.

Au niveau transcriptionnel, les résultats publiés de l’équipe et ceux qui sont en cours

d’obtention indiquent que GSK3β est un régulateur clé des facteurs de transcription NF-κB et

FoxO3a. La littérature nous renseigne sur l’importance de la β-caténine en tant que co-

répresseur ou -activateur de ces deux facteurs NF-κB et FoxO3a, respectivement (Deng J. et

al., 2002 ; Deng J. et al., 2004 ; Essers M.A. et al., 2005). Ainsi, il apparaît crucial, dans notre

modèle d’étude, de vérifier à l’avenir si la régulation dépendante de GSK3β de ces facteurs

passe par une modulation de leur interaction avec le proto-oncogène β-caténine. De plus, des

177


travaux récents de l’équipe de Billadeau démontrent que GSK3β peut modifier la structure de

la chromatine, et par conséquent faciliter l’accessibilité des facteurs de transcription, tels que

NF-κB, au niveau des régions promotrices des gènes cibles (Ougolkov A.V. et al., 2007).

Grâce à des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), cette hypothèse

pourrait être vérifiée dans les cellules de LAM. En effet, les phénomènes épigénétiques sont

très présents dans les hémopathies malignes, puisque de nombreux facteurs de transcription

impliqués dans la transformation leucémique sont étroitement régulés par ce mécanisme.

Cette hypothèse serait donc très intéressante à « creuser » et pourrait permettre une avancée

majeure dans la compréhension de la physiopathologie des LAM.

Ces données pourraient nous conduire, à plus long terme, à envisager de transplanter des CSH

murines ou humaines chez la souris, après modification génétique de GSK3β, et à en étudier

l’impact sur l’hématopoïèse in vivo.

Notre réflexion repose sur le rôle majeur que pourrait avoir l’activation de GSK3β

dans la résistance au stress dans le contexte environnemental perturbé de la niche médullaire

leucémique. La réaction du système immunitaire dans ce site très inflammatoire se heurte au

fait que les blastes leucémiques, dans leur grande majorité, subissent une perte d’expression

des ligands d’activation de l’immunité innée, comme ceux permettant leur reconnaissance par

les cellules NK. Cependant, il a été montré récemment que l’activité de GSK3β est essentielle

à l’expression des MHC class I–related chain A and B (MICA/B), cibles des cellules NK, sur

la surface membranaire des cellules cancéreuses (Skov S. et al., 2005). Ainsi, on peut

supposer que, dans notre modèle de stress, l’activation de GSK3β puisse favoriser

l’expression des ligands MICA et MICB sur les cellules leucémiques, favorisant donc leur

élimination. Inversement, une étude en cours dans l’équipe tente de comprendre quel impact

peuvent avoir les cellules de l’immunité sur l’activation de GSK3β dans les CSH. De plus, les

ligands anti-Wnt, tels que sFRP1 et DKK1, sécrétés dans différents types de tumeurs

(Joesting M.S. et al., 2005) peuvent contrer l’apoptose des cellules leucémiques, comme nous

l’avons montré dans notre étude (De Toni F. et al., 2006). Ainsi, ces antagonistes Wnt

pourraient représenter une cible thérapeutique dans les LAM. Or, récemment, un anticorps

dirigé contre DDK1 supprime la destruction osseuse induite par le myélome multiple et la

croissance tumorale in vivo (Yaccoby S. et al., 2007).

Dans les conditions de stress du microenvironnement leucémique, le contrôle

métabolique pourrait jouer un rôle clef. Les CSL ont été décrites comme quiescentes, ce qui

favoriserait leur résistance. De façon intéressante, il pourrait y avoir un lien entre cette

178


quiescence et un état d’insulinorésistance contrôlé par l’adhésion cellulaire. En effet, la

régulation de la protéine adaptatrice RACK1 permet un changement (ou « switch ») d’un état

de prolifération dépendant de l’IGF-1 vers un état de quiescence dépendant des intégrines

(Hermanto U. et al., 2002). A terme, lorsque le contrôle exercé par les intégrines et GSK3β

est dépassé par une trop grande production de ROS, une sortie de quiescence et une

émigration de la niche hématopoïétique, accompagnées d’une suractivation de la voie mTOR,

pourraient aboutir à l’amplification du clone leucémique (Jang Y.Y. & Sharkis S.J., 2007 ;

Hosokawa K. et al., 2007). Dans ce contexte, une étude de la localisation de nos cibles dans

les rafts lipidiques prendrait tout son relief, étant donné le rôle de l’organisation de ces

microdomaines membranaires dans l’activation des CSH (Yamazaki S. et al., 2006).

Ainsi, toutes les expériences envisagées sont indispensables pour essayer de valider

GSK3β en tant que cible thérapeutique dans les LAM, et pour permettre une meilleure

compréhension de leur physiopathologie. De surcroît, cette voie pourrait être aussi très active

dans d’autres types de tumeurs, et notamment celles dépendantes de la transformation de

cellules souches.

179

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

180

Références bibliographiques


A. Adams, G.B., Chabner, K.T., Alley, I.R., Olson, D.P., Szczepiorkowski, Z.M., Poznansky,

M.C., Kos, C.H., Pollak, M.R., Brown, E.M. and Scadden, D.T. (2006) Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature, 439, 599-603.

Adams, G.B. and Scadden, D.T. (2006) The hematopoietic stem cell in its place. Nat Immunol, 7, 333-337.

Aguirre-Ghiso, J.A., Estrada, Y., Liu, D. and Ossowski, L. (2003) ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res, 63, 1684-1695.

Aguirre Ghiso, J.A. (2002) Inhibition of FAK signaling activated by urokinase receptor induces dormancy in human carcinoma cells in vivo. Oncogene, 21, 2513-2524.

Aguirre-Ghiso, J.A., Liu, D., Mignatti, A., Kovalski, K. and Ossowski, L. (2001) Urokinase receptor and fibronectin regulate the ERK(MAPK) to p38(MAPK) activity ratios that determine carcinoma cell proliferation or dormancy in vivo. Mol Biol Cell, 12, 863-879.

Al-Khouri, A.M., Ma, Y., Togo, S.H., Williams, S. and Mustelin, T. (2005) Cooperative phosphorylation of the tumor suppressor phosphatase and tensin homologue (PTEN) by casein kinases and glycogen synthase kinase 3beta. J Biol Chem, 280, 35195-35202.

Alahari, S.K., Reddig, P.J. and Juliano, R.L. (2002) Biological aspects of signal transduction by cell adhesion receptors. Int Rev Cytol, 220, 145-184.

Ali, A., Hoeflich, K.P. and Woodgett, J.R. (2001) Glycogen synthase kinase-3: properties, functions, and regulation. Chem Rev, 101, 2527-2540.

Allen, T.D. and Dexter, T.M. (1984) The essential cells of the hemopoietic microenvironment. Exp Hematol, 12, 517-521.

Almeida, E.A., Ilic, D., Han, Q., Hauck, C.R., Jin, F., Kawakatsu, H., Schlaepfer, D.D. and Damsky, C.H. (2000) Matrix survival signaling: from fibronectin via focal adhesion kinase to c-Jun NH(2)-terminal kinase. J Cell Biol, 149, 741-754.

Altieri, D.C. (2001) The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy. Trends Mol Med, 7, 542-547.

An, J.H., Vranas, K., Lucke, M., Inoue, H., Hisamoto, N., Matsumoto, K. and Blackwell, T.K. (2005) Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 16275-16280.

Anderson, M.J., Viars, C.S., Czekay, S., Cavenee, W.K. and Arden, K.C. (1998) Cloning and characterization of three human forkhead genes that comprise an FKHR-like gene subfamily. Genomics, 47, 187-199.

Andreev, J., Simon, J.P., Sabatini, D.D., Kam, J., Plowman, G., Randazzo, P.A. and Schlessinger, J. (1999) Identification of a new Pyk2 target protein with Arf-GAP activity. Mol Cell Biol, 19, 2338-2350.

Anzai, N., Gotoh, A., Shibayama, H. and Broxmeyer, H.E. (1999) Modulation of integrin function in hematopoietic progenitor cells by CD43 engagement: possible involvement of protein tyrosine kinase and phospholipase C-gamma. Blood, 93, 3317-3326.

181


Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K., Koh, G.Y. and Suda, T. (2004) Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell, 118, 149-161.

Arregui, C., Pathre, P., Lilien, J. and Balsamo, J. (2000) The nonreceptor tyrosine kinase fer mediates cross-talk between N-cadherin and beta1-integrins. J Cell Biol, 149, 1263-1274.

Arroyo, A.G., Yang, J.T., Rayburn, H. and Hynes, R.O. (1999) Alpha4 integrins regulate the proliferation/differentiation balance of multilineage hematopoietic progenitors in vivo. Immunity, 11, 555-566.

Ashkenazi, A. and Dixit, V.M. (1998) Death receptors: signaling and modulation. Science, 281, 1305-1308.

Austin, T.W., Solar, G.P., Ziegler, F.C., Liem, L. and Matthews, W. (1997) A role for the Wnt gene family in hematopoiesis: expansion of multilineage progenitor cells. Blood, 89, 3624-3635.

Avdi, N.J., Nick, J.A., Whitlock, B.B., Billstrom, M.A., Henson, P.M., Johnson, G.L. and Worthen, G.S. (2001) Tumor necrosis factor-alpha activation of the c-Jun N-terminal kinase pathway in human neutrophils. Integrin involvement in a pathway leading from cytoplasmic tyrosine kinases apoptosis. J Biol Chem, 276, 2189-2199.

Avraham, H., Park, S.Y., Schinkmann, K. and Avraham, S. (2000) RAFTK/Pyk2-mediated cellular signalling. Cell Signal, 12, 123-133.

Avraham, S., London, R., Fu, Y., Ota, S., Hiregowdara, D., Li, J., Jiang, S., Pasztor, L.M., White, R.A., Groopman, J.E. and et al. (1995) Identification and characterization of a novel related adhesion focal tyrosine kinase (RAFTK) from megakaryocytes and brain. J Biol Chem, 270, 27742-27751.

B. Banno, Y., Ohguchi, K., Matsumoto, N., Koda, M., Ueda, M., Hara, A., Dikic, I. and Nozawa,

Y. (2005) Implication of phospholipase D2 in oxidant-induced phosphoinositide 3-kinase signaling via Pyk2 activation in PC12 cells. J Biol Chem, 280, 16319-16324.

Baum, C.M., Weissman, I.L., Tsukamoto, A.S., Buckle, A.M. and Peault, B. (1992) Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 2804-2808.

Becker, A.J., Mc, C.E. and Till, J.E. (1963) Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature, 197, 452-454.

Beckmann, J., Scheitza, S., Wernet, P., Fischer, J.C. and Giebel, B. (2007) Asymmetric cell division within the human hematopoietic stem and progenitor cell compartment: identification of asymmetrically segregating proteins. Blood, 109, 5494-5501.

Beg, A.A., Sha, W.C., Bronson, R.T., Ghosh, S. and Baltimore, D. (1995) Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kappa B. Nature, 376, 167-170.

Bellamy, W.T., Richter, L., Frutiger, Y. and Grogan, T.M. (1999) Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in hematopoietic malignancies. Cancer Res, 59, 728-733.

Benbernou, N., Muegge, K. and Durum, S.K. (2000) Interleukin (IL)-7 induces rapid activation of Pyk2, which is bound to Janus kinase 1 and IL-7Ralpha. J Biol Chem, 275, 7060-7065.

Bendall, L.J., Makrynikola, V., Hutchinson, A., Bianchi, A.C., Bradstock, K.F. and Gottlieb, D.J. (1998) Stem cell factor enhances the adhesion of AML cells to fibronectin and augments fibronectin-mediated anti-apoptotic and proliferative signals. Leukemia, 12, 1375-1382.

182


Beurel, E. and Jope, R.S. (2006) The paradoxical pro- and anti-apoptotic actions of GSK3 in the intrinsic and extrinsic apoptosis signaling pathways. Prog Neurobiol, 79, 173-189.

Bhardwaj, G., Murdoch, B., Wu, D., Baker, D.P., Williams, K.P., Chadwick, K., Ling, L.E., Karanu, F.N. and Bhatia, M. (2001) Sonic hedgehog induces the proliferation of primitive human hematopoietic cells via BMP regulation. Nat Immunol, 2, 172-180.

Bhat, R.V., Shanley, J., Correll, M.P., Fieles, W.E., Keith, R.A., Scott, C.W. and Lee, C.M. (2000) Regulation and localization of tyrosine216 phosphorylation of glycogen synthase kinase-3beta in cellular and animal models of neuronal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 11074-11079.

Bhatia, R., McGlave, P.B., Dewald, G.W., Blazar, B.R. and Verfaillie, C.M. (1995) Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: role of malignant stromal macrophages. Blood, 85, 3636-3645.

Bianchi, E., Denti, S., Granata, A., Bossi, G., Geginat, J., Villa, A., Rogge, L. and Pardi, R. (2000) Integrin LFA-1 interacts with the transcriptional co-activator JAB1 to modulate AP-1 activity. Nature, 404, 617-621.

Bianchi, M., De Lucchini, S., Marin, O., Turner, D.L., Hanks, S.K. and Villa-Moruzzi, E. (2005) Regulation of FAK Ser-722 phosphorylation and kinase activity by GSK3 and PP1 during cell spreading and migration. Biochem J, 391, 359-370.

Bienz, M. (2005) beta-Catenin: a pivot between cell adhesion and Wnt signalling. Curr Biol, 15, R64-67.

Biggs, W.H., 3rd, Cavenee, W.K. and Arden, K.C. (2001) Identification and characterization of members of the FKHR (FOX O) subclass of winged-helix transcription factors in the mouse. Mamm Genome, 12, 416-425.

Bijur, G.N., De Sarno, P. and Jope, R.S. (2000) Glycogen synthase kinase-3beta facilitates staurosporine- and heat shock-induced apoptosis. Protection by lithium. J Biol Chem, 275, 7583-7590.

Bijur, G.N. and Jope, R.S. (2001) Proapoptotic stimuli induce nuclear accumulation of glycogen synthase kinase-3 beta. J Biol Chem, 276, 37436-37442.

Bijur, G.N. and Jope, R.S. (2003a) Glycogen synthase kinase-3 beta is highly activated in nuclei and mitochondria. Neuroreport, 14, 2415-2419.

Bijur, G.N. and Jope, R.S. (2003b) Rapid accumulation of Akt in mitochondria following phosphatidylinositol 3-kinase activation. J Neurochem, 87, 1427-1435.

Blau, O., Hofmann, W.K., Baldus, C.D., Thiel, G., Serbent, V., Schumann, E., Thiel, E. and Blau, I.W. (2007) Chromosomal aberrations in bone marrow mesenchymal stroma cells from patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloblastic leukemia. Exp Hematol, 35, 221-229.

Bonnet, D. (2005) Normal and leukaemic stem cells. Br J Haematol, 130, 469-479. Bonnet, D. and Dick, J.E. (1997) Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy

that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med, 3, 730-737. Boudreau, R.T., Conrad, D.M. and Hoskin, D.W. (2007) Apoptosis induced by protein

phosphatase 2A (PP2A) inhibition in T leukemia cells is negatively regulated by PP2A-associated p38 mitogen-activated protein kinase. Cell Signal, 19, 139-151.

Bourdeau, A., Dube, N., Heinonen, K.M., Theberge, J.F., Doody, K.M. and Tremblay, M.L. (2007) TC-PTP-deficient bone marrow stromal cells fail to support normal B lymphopoiesis due to abnormal secretion of interferon-{gamma}. Blood, 109, 4220-4228.

Bradford, G.B., Williams, B., Rossi, R. and Bertoncello, I. (1997) Quiescence, cycling, and turnover in the primitive hematopoietic stem cell compartment. Exp Hematol, 25, 445-453.

183


Brazelton, T.R., Rossi, F.M., Keshet, G.I. and Blau, H.M. (2000) From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science, 290, 1775-1779.

Bruserud, O., Glenjen, N. and Ryningen, A. (2003) Effects of angiogenic regulators on in vitro proliferation and cytokine secretion by native human acute myelogenous leukemia blasts. Eur J Haematol, 71, 9-17.

Bryder, D., Rossi, D.J. and Weissman, I.L. (2006) Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol, 169, 338-346.

Bug, G., Gul, H., Schwarz, K., Pfeifer, H., Kampfmann, M., Zheng, X., Beissert, T., Boehrer, S., Hoelzer, D., Ottmann, O.G. and Ruthardt, M. (2005) Valproic acid stimulates proliferation and self-renewal of hematopoietic stem cells. Cancer Res, 65, 2537-2541.

Bungartz, G., Stiller, S., Bauer, M., Muller, W., Schippers, A., Wagner, N., Fassler, R. and Brakebusch, C. (2006) Adult murine hematopoiesis can proceed without beta1 and beta7 integrins. Blood, 108, 1857-1864.

Burger, J.A., Spoo, A., Dwenger, A., Burger, M. and Behringer, D. (2003) CXCR4 chemokine receptors (CD184) and alpha4beta1 integrins mediate spontaneous migration of human CD34+ progenitors and acute myeloid leukaemia cells beneath marrow stromal cells (pseudoemperipolesis). Br J Haematol, 122, 579-589.

Burke, Z.D., Thowfeequ, S., Peran, M. and Tosh, D. (2007) Stem cells in the adult pancreas and liver. Biochem J, 404, 169-178.

Butt, A.J., Firth, S.M. and Baxter, R.C. (1999) The IGF axis and programmed cell death. Immunol Cell Biol, 77, 256-262.

C. Cadigan, K.M. and Nusse, R. (1997) Wnt signaling: a common theme in animal development.

Genes Dev, 11, 3286-3305. Cai, X., Li, M., Vrana, J. and Schaller, M.D. (2006) Glycogen synthase kinase 3- and

extracellular signal-regulated kinase-dependent phosphorylation of paxillin regulates cytoskeletal rearrangement. Mol Cell Biol, 26, 2857-2868.

Calderwood, D.A. and Ginsberg, M.H. (2003) Talin forges the links between integrins and actin. Nat Cell Biol, 5, 694-697.

Calle, Y., Carragher, N.O., Thrasher, A.J. and Jones, G.E. (2006) Inhibition of calpain stabilises podosomes and impairs dendritic cell motility. J Cell Sci, 119, 2375-2385.

Calvi, L.M., Adams, G.B., Weibrecht, K.W., Weber, J.M., Olson, D.P., Knight, M.C., Martin, R.P., Schipani, E., Divieti, P., Bringhurst, F.R., Milner, L.A., Kronenberg, H.M. and Scadden, D.T. (2003) Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature, 425, 841-846.

Cancelas, J.A., Lee, A.W., Prabhakar, R., Stringer, K.F., Zheng, Y. and Williams, D.A. (2005) Rac GTPases differentially integrate signals regulating hematopoietic stem cell localization. Nat Med, 11, 886-891.

Carella, C., Bonten, J., Rehg, J. and Grosveld, G.C. (2006) MN1-TEL, the product of the t(12;22) in human myeloid leukemia, immortalizes murine myeloid cells and causes myeloid malignancy in mice. Leukemia, 20, 1582-1592.

Carmichael, J., Sugars, K.L., Bao, Y.P. and Rubinsztein, D.C. (2002) Glycogen synthase kinase-3beta inhibitors prevent cellular polyglutamine toxicity caused by the Huntington's disease mutation. J Biol Chem, 277, 33791-33798.

Cary, L.A., Han, D.C. and Guan, J.L. (1999) Integrin-mediated signal transduction pathways. Histol Histopathol, 14, 1001-1009.

184


Chadwick, N., Nostro, M.C., Baron, M., Mottram, R., Brady, G. and Buckle, A.M. (2007) Notch signaling induces apoptosis in primary human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Stem Cells, 25, 203-210.

Chambers, S.M., Shaw, C.A., Gatza, C., Fisk, C.J., Donehower, L.A. and Goodell, M.A. (2007) Aging hematopoietic stem cells decline in function and exhibit epigenetic dysregulation. PLoS Biol, 5, e201.

Chan, J.Y. and Watt, S.M. (2001) Adhesion receptors on haematopoietic progenitor cells. Br J Haematol, 112, 541-557.

Chasis, J.A. (2006) Erythroblastic islands: specialized microenvironmental niches for erythropoiesis. Curr Opin Hematol, 13, 137-141.

Chauhan, D., Hideshima, T., Pandey, P., Treon, S., Teoh, G., Raje, N., Rosen, S., Krett, N., Husson, H., Avraham, S., Kharbanda, S. and Anderson, K.C. (1999) RAFTK/PYK2-dependent and -independent apoptosis in multiple myeloma cells. Oncogene, 18, 6733-6740.

Chen, C.C., Young, J.L., Monzon, R.I., Chen, N., Todorovic, V. and Lau, L.F. (2007) Cytotoxicity of TNFalpha is regulated by integrin-mediated matrix signaling. Embo J, 26, 1257-1267.

Cheng, T., Rodrigues, N., Dombkowski, D., Stier, S. and Scadden, D.T. (2000a) Stem cell repopulation efficiency but not pool size is governed by p27(kip1). Nat Med, 6, 1235-1240.

Cheng, T., Rodrigues, N., Shen, H., Yang, Y., Dombkowski, D., Sykes, M. and Scadden, D.T. (2000b) Hematopoietic stem cell quiescence maintained by p21cip1/waf1. Science, 287, 1804-1808.

Cheshier, S.H., Morrison, S.J., Liao, X. and Weissman, I.L. (1999) In vivo proliferation and cell cycle kinetics of long-term self-renewing hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 3120-3125.

Chetoui, N., Gendron, S., Chamoux, E. and Aoudjit, F. (2006) Collagen type I-mediated activation of ERK/MAP Kinase is dependent on Ras, Raf-1 and protein phosphatase 2A in Jurkat T cells. Mol Immunol, 43, 1687-1693.

Chiarugi, P., Pani, G., Giannoni, E., Taddei, L., Colavitti, R., Raugei, G., Symons, M., Borrello, S., Galeotti, T. and Ramponi, G. (2003) Reactive oxygen species as essential mediators of cell adhesion: the oxidative inhibition of a FAK tyrosine phosphatase is required for cell adhesion. J Cell Biol, 161, 933-944.

Chow, D.C., Wenning, L.A., Miller, W.M. and Papoutsakis, E.T. (2001) Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. II. Modified Kroghian models. Biophys J, 81, 685-696.

Christensen, J.L. and Weissman, I.L. (2001) Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: a simple method to isolate long-term stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 14541-14546.

Coffer, P.J. and Burgering, B.M. (2007) Stressed marrow: FoxOs stem tumour growth. Nat Cell Biol, 9, 251-253.

Cohen, P., Alessi, D.R. and Cross, D.A. (1997) PDK1, one of the missing links in insulin signal transduction? FEBS Lett, 410, 3-10.

Coll, J.L., Ben-Ze'ev, A., Ezzell, R.M., Rodriguez Fernandez, J.L., Baribault, H., Oshima, R.G. and Adamson, E.D. (1995) Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 9161-9165.

Coppolino, M.G. and Dedhar, S. (2000) Bi-directional signal transduction by integrin receptors. Int J Biochem Cell Biol, 32, 171-188.

185


Cordes, N., Hansmeier, B., Beinke, C., Meineke, V. and van Beuningen, D. (2003) Irradiation differentially affects substratum-dependent survival, adhesion, and invasion of glioblastoma cell lines. Br J Cancer, 89, 2122-2132.

Cordes, N., Seidler, J., Durzok, R., Geinitz, H. and Brakebusch, C. (2006) beta1-integrin-mediated signaling essentially contributes to cell survival after radiation-induced genotoxic injury. Oncogene, 25, 1378-1390.

Corre, J., Barreau, C., Cousin, B., Chavoin, J.P., Caton, D., Fournial, G., Penicaud, L., Casteilla, L. and Laharrague, P. (2006) Human subcutaneous adipose cells support complete differentiation but not self-renewal of hematopoietic progenitors. J Cell Physiol, 208, 282-288.

Corre, J., Mahtouk, K., Attal, M., Gadelorge, M., Huynh, A., Fleury-Cappellesso, S., Danho, C., Laharrague, P., Klein, B., Reme, T. and Bourin, P. (2007) Bone marrow mesenchymal stem cells are abnormal in multiple myeloma. Leukemia, 21, 1079-1088.

Corsi, J.M., Rouer, E., Girault, J.A. and Enslen, H. (2006) Organization and post-transcriptional processing of focal adhesion kinase gene. BMC Genomics, 7, 198.

Costello, R.T., Sivori, S., Marcenaro, E., Lafage-Pochitaloff, M., Mozziconacci, M.J., Reviron, D., Gastaut, J.A., Pende, D., Olive, D. and Moretta, A. (2002) Defective expression and function of natural killer cell-triggering receptors in patients with acute myeloid leukemia. Blood, 99, 3661-3667.

Cross, D.A., Alessi, D.R., Cohen, P., Andjelkovich, M. and Hemmings, B.A. (1995) Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. Nature, 378, 785-789.

Cross, D.A., Culbert, A.A., Chalmers, K.A., Facci, L., Skaper, S.D. and Reith, A.D. (2001) Selective small-molecule inhibitors of glycogen synthase kinase-3 activity protect primary neurones from death. J Neurochem, 77, 94-102.

Crozatier, M. and Meister, M. (2007) Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol, 9, 1117-1126.

D. D'Amico, M., Hulit, J., Amanatullah, D.F., Zafonte, B.T., Albanese, C., Bouzahzah, B., Fu,

M., Augenlicht, L.H., Donehower, L.A., Takemaru, K., Moon, R.T., Davis, R., Lisanti, M.P., Shtutman, M., Zhurinsky, J., Ben-Ze'ev, A., Troussard, A.A., Dedhar, S. and Pestell, R.G. (2000) The integrin-linked kinase regulates the cyclin D1 gene through glycogen synthase kinase 3beta and cAMP-responsive element-binding protein-dependent pathways. J Biol Chem, 275, 32649-32657.

Dajani, R., Fraser, E., Roe, S.M., Young, N., Good, V., Dale, T.C. and Pearl, L.H. (2001) Crystal structure of glycogen synthase kinase 3 beta: structural basis for phosphate-primed substrate specificity and autoinhibition. Cell, 105, 721-732.

Damiano, J.S., Cress, A.E., Hazlehurst, L.A., Shtil, A.A. and Dalton, W.S. (1999) Cell adhesion mediated drug resistance (CAM-DR): role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell lines. Blood, 93, 1658-1667.

Damiano, J.S., Hazlehurst, L.A. and Dalton, W.S. (2001) Cell adhesion-mediated drug resistance (CAM-DR) protects the K562 chronic myelogenous leukemia cell line from apoptosis induced by BCR/ABL inhibition, cytotoxic drugs, and gamma-irradiation. Leukemia, 15, 1232-1239.

Dazzi, F., Ramasamy, R., Glennie, S., Jones, S.P. and Roberts, I. (2006) The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev, 20, 161-171.

de Amicis, F., Lanzino, M., Kisslinger, A., Cali, G., Chieffi, P., Ando, S., Mancini, F.P. and Tramontano, D. (2006) Loss of proline-rich tyrosine kinase 2 function induces spreading and motility of epithelial prostate cells. J Cell Physiol, 209, 74-80.

186


De Toni, F., Racaud-Sultan, C., Chicanne, G., Mas, V.M., Cariven, C., Mesange, F., Salles, J.P., Demur, C., Allouche, M., Payrastre, B., Manenti, S. and Ysebaert, L. (2006) A crosstalk between the Wnt and the adhesion-dependent signaling pathways governs the chemosensitivity of acute myeloid leukemia. Oncogene, 25, 3113-3122.

De Waele, M., Renmans, W., Jochmans, K., Schots, R., Lacor, P., Trullemans, F., Otten, J., Balduck, N., Vander Gucht, K., Van Camp, B. and Van Riet, I. (1999) Different expression of adhesion molecules on CD34+ cells in AML and B-lineage ALL and their normal bone marrow counterparts. Eur J Haematol, 63, 192-201.

Dedhar, S. and Hannigan, G.E. (1996) Integrin cytoplasmic interactions and bidirectional transmembrane signalling. Curr Opin Cell Biol, 8, 657-669.

Delcommenne, M., Tan, C., Gray, V., Rue, L., Woodgett, J. and Dedhar, S. (1998) Phosphoinositide-3-OH kinase-dependent regulation of glycogen synthase kinase 3 and protein kinase B/AKT by the integrin-linked kinase. Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 11211-11216.

Demarchi, F., Bertoli, C., Sandy, P. and Schneider, C. (2003) Glycogen synthase kinase-3 beta regulates NF-kappa B1/p105 stability. J Biol Chem, 278, 39583-39590.

Deng, J., Miller, S.A., Wang, H.Y., Xia, W., Wen, Y., Zhou, B.P., Li, Y., Lin, S.Y. and Hung, M.C. (2002) beta-catenin interacts with and inhibits NF-kappa B in human colon and breast cancer. Cancer Cell, 2, 323-334.

Deng, J., Xia, W., Miller, S.A., Wen, Y., Wang, H.Y. and Hung, M.C. (2004) Crossregulation of NF-kappaB by the APC/GSK-3beta/beta-catenin pathway. Mol Carcinog, 39, 139-146.

Deng, X., Ito, T., Carr, B., Mumby, M. and May, W.S., Jr. (1998) Reversible phosphorylation of Bcl2 following interleukin 3 or bryostatin 1 is mediated by direct interaction with protein phosphatase 2A. J Biol Chem, 273, 34157-34163.

Denhardt, D.T., Noda, M., O'Regan, A.W., Pavlin, D. and Berman, J.S. (2001) Osteopontin as a means to cope with environmental insults: regulation of inflammation, tissue remodeling, and cell survival. J Clin Invest, 107, 1055-1061.

Derkinderen, P., Siciliano, J., Toutant, M. and Girault, J.A. (1998) Differential regulation of FAK+ and PYK2/Cakbeta, two related tyrosine kinases, in rat hippocampal slices: effects of LPA, carbachol, depolarization and hyperosmolarity. Eur J Neurosci, 10, 1667-1675.

Deshpande, A.J., Cusan, M., Rawat, V.P., Reuter, H., Krause, A., Pott, C., Quintanilla-Martinez, L., Kakadia, P., Kuchenbauer, F., Ahmed, F., Delabesse, E., Hahn, M., Lichter, P., Kneba, M., Hiddemann, W., Macintyre, E., Mecucci, C., Ludwig, W.D., Humphries, R.K., Bohlander, S.K., Feuring-Buske, M. and Buske, C. (2006) Acute myeloid leukemia is propagated by a leukemic stem cell with lymphoid characteristics in a mouse model of CALM/AF10-positive leukemia. Cancer Cell, 10, 363-374.

Diehl, J.A., Cheng, M., Roussel, M.F. and Sherr, C.J. (1998) Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin D1 proteolysis and subcellular localization. Genes Dev, 12, 3499-3511.

Dikic, I., Dikic, I. and Schlessinger, J. (1998) Identification of a new Pyk2 isoform implicated in chemokine and antigen receptor signaling. J Biol Chem, 273, 14301-14308.

DiMascio, L., Voermans, C., Uqoezwa, M., Duncan, A., Lu, D., Wu, J., Sankar, U. and Reya, T. (2007) Identification of adiponectin as a novel hemopoietic stem cell growth factor. J Immunol, 178, 3511-3520.

Dimitroff, C.J., Lee, J.Y., Fuhlbrigge, R.C. and Sackstein, R. (2000) A distinct glycoform of CD44 is an L-selectin ligand on human hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 13841-13846.

187


Doble, B.W., Patel, S., Wood, G.A., Kockeritz, L.K. and Woodgett, J.R. (2007) Functional redundancy of GSK-3alpha and GSK-3beta in Wnt/beta-catenin signaling shown by using an allelic series of embryonic stem cell lines. Dev Cell, 12, 957-971.

Doble, B.W. and Woodgett, J.R. (2003) GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. J Cell Sci, 116, 1175-1186.

Dougherty, C.J., Kubasiak, L.A., Frazier, D.P., Li, H., Xiong, W.C., Bishopric, N.H. and Webster, K.A. (2004) Mitochondrial signals initiate the activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) by hypoxia-reoxygenation. Faseb J, 18, 1060-1070.

Dufour, S., Duband, J.L. and Thiery, J.P. (1986) Role of a major cell-substratum adhesion system in cell behavior and morphogenesis. Biol Cell, 58, 1-13.

Durual, S., Rideau, A., Ruault-Jungblut, S., Cossali, D., Beris, P., Piguet, V. and Matthes, T. (2007) Lentiviral PU.1 overexpression restores differentiation in myeloid leukemic blasts. Leukemia, 21, 1050-1059.

Dylla, S.J., Deyle, D.R., Theunissen, K., Padurean, A.M. and Verfaillie, C.M. (2004) Integrin engagement-induced inhibition of human myelopoiesis is mediated by proline-rich tyrosine kinase 2 gene products. Exp Hematol, 32, 365-374.

E. Eckert, L.B., Repasky, G.A., Ulku, A.S., McFall, A., Zhou, H., Sartor, C.I. and Der, C.J.

(2004) Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis. Cancer Res, 64, 4585-4592.

Eickholt, B.J., Walsh, F.S. and Doherty, P. (2002) An inactive pool of GSK-3 at the leading edge of growth cones is implicated in Semaphorin 3A signaling. J Cell Biol, 157, 211-217.

El-Badri, N.S., Wang, B.Y., Cherry and Good, R.A. (1998) Osteoblasts promote engraftment of allogeneic hematopoietic stem cells. Exp Hematol, 26, 110-116.

Eldar-Finkelman, H. (2002) Glycogen synthase kinase 3: an emerging therapeutic target. Trends Mol Med, 8, 126-132.

Eldar-Finkelman, H., Seger, R., Vandenheede, J.R. and Krebs, E.G. (1995) Inactivation of glycogen synthase kinase-3 by epidermal growth factor is mediated by mitogen-activated protein kinase/p90 ribosomal protein S6 kinase signaling pathway in NIH/3T3 cells. J Biol Chem, 270, 987-990.

Ema, H., Takano, H., Sudo, K. and Nakauchi, H. (2000) In vitro self-renewal division of hematopoietic stem cells. J Exp Med, 192, 1281-1288.

Essers, M.A., de Vries-Smits, L.M., Barker, N., Polderman, P.E., Burgering, B.M. and Korswagen, H.C. (2005) Functional interaction between beta-catenin and FOXO in oxidative stress signaling. Science, 308, 1181-1184.

Etienne-Manneville, S. and Hall, A. (2001) Integrin-mediated activation of Cdc42 controls cell polarity in migrating astrocytes through PKCzeta. Cell, 106, 489-498.

Etienne-Manneville, S. and Hall, A. (2003) Cdc42 regulates GSK-3beta and adenomatous polyposis coli to control cell polarity. Nature, 421, 753-756.

F. Fang, X., Yu, S.X., Lu, Y., Bast, R.C., Jr., Woodgett, J.R. and Mills, G.B. (2000)

Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by protein kinase A. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 11960-11965.

Faure, C., Corvol, J.C., Toutant, M., Valjent, E., Hvalby, O., Jensen, V., El Messari, S., Corsi, J.M., Kadare, G. and Girault, J.A. (2007) Calcineurin is essential for depolarization-

188


induced nuclear translocation and tyrosine phosphorylation of PYK2 in neurons. J Cell Sci, 120, 3034-3044.

Fauriat, C., Moretta, A., Olive, D. and Costello, R.T. (2005) Defective killing of dendritic cells by autologous natural killer cells from acute myeloid leukemia patients. Blood, 106, 2186-2188.

Ferrer, I., Barrachina, M. and Puig, B. (2002) Glycogen synthase kinase-3 is associated with neuronal and glial hyperphosphorylated tau deposits in Alzheimer's disease, Pick's disease, progressive supranuclear palsy and corticobasal degeneration. Acta Neuropathol (Berl), 104, 583-591.

Fiol, C.J., Haseman, J.H., Wang, Y.H., Roach, P.J., Roeske, R.W., Kowalczuk, M. and DePaoli-Roach, A.A. (1988) Phosphoserine as a recognition determinant for glycogen synthase kinase-3: phosphorylation of a synthetic peptide based on the G-component of protein phosphatase-1. Arch Biochem Biophys, 267, 797-802.

Forde, J.E. and Dale, T.C. (2007) Glycogen synthase kinase 3: a key regulator of cellular fate. Cell Mol Life Sci, 64, 1930-1944.

Fornaro, M., Plescia, J., Chheang, S., Tallini, G., Zhu, Y.M., King, M., Altieri, D.C. and Languino, L.R. (2003) Fibronectin protects prostate cancer cells from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis via the AKT/survivin pathway. J Biol Chem, 278, 50402-50411.

Frame, S. and Cohen, P. (2001) GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery. Biochem J, 359, 1-16.

Frame, S., Cohen, P. and Biondi, R.M. (2001) A common phosphate binding site explains the unique substrate specificity of GSK3 and its inactivation by phosphorylation. Mol Cell, 7, 1321-1327.

Franca-Koh, J., Yeo, M., Fraser, E., Young, N. and Dale, T.C. (2002) The regulation of glycogen synthase kinase-3 nuclear export by Frat/GBP. J Biol Chem, 277, 43844-43848.

Frank, G.D., Mifune, M., Inagami, T., Ohba, M., Sasaki, T., Higashiyama, S., Dempsey, P.J. and Eguchi, S. (2003) Distinct mechanisms of receptor and nonreceptor tyrosine kinase activation by reactive oxygen species in vascular smooth muscle cells: role of metalloprotease and protein kinase C-delta. Mol Cell Biol, 23, 1581-1589.

Fraser, E., Young, N., Dajani, R., Franca-Koh, J., Ryves, J., Williams, R.S., Yeo, M., Webster, M.T., Richardson, C., Smalley, M.J., Pearl, L.H., Harwood, A. and Dale, T.C. (2002) Identification of the Axin and Frat binding region of glycogen synthase kinase-3. J Biol Chem, 277, 2176-2185.

Fridman, J.S. and Lowe, S.W. (2003) Control of apoptosis by p53. Oncogene, 22, 9030-9040. Frisch, S.M. and Ruoslahti, E. (1997) Integrins and anoikis. Curr Opin Cell Biol, 9, 701-706. Frye, M., Gardner, C., Li, E.R., Arnold, I. and Watt, F.M. (2003) Evidence that Myc

activation depletes the epidermal stem cell compartment by modulating adhesive interactions with the local microenvironment. Development, 130, 2793-2808.

Fujimuro, M., Wu, F.Y., ApRhys, C., Kajumbula, H., Young, D.B., Hayward, G.S. and Hayward, S.D. (2003) A novel viral mechanism for dysregulation of beta-catenin in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latency. Nat Med, 9, 300-306.

Furuyama, T., Nakazawa, T., Nakano, I. and Mori, N. (2000) Identification of the differential distribution patterns of mRNAs and consensus binding sequences for mouse DAF-16 homologues. Biochem J, 349, 629-634.

189


G. G-Amlak, M.., Uddin, S., Mahmud, D., Damacela, I., Lavelle, D., Ahmed, M., van Besien, K.

and Wickrema, A. (2002) Regulation of myeloma cell growth through Akt/Gsk3/forkhead signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun, 297, 760-764.

Garcia-Perez, J., Avila, J. and Diaz-Nido, J. (1999) Lithium induces morphological differentiation of mouse neuroblastoma cells. J Neurosci Res, 57, 261-270.

Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S.H. and Mikkola, H.K. (2005) The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell, 8, 365-375.

Ghaffari, S., Smadja-Joffe, F., Oostendorp, R., Levesque, J.P., Dougherty, G., Eaves, A. and Eaves, C. (1999) CD44 isoforms in normal and leukemic hematopoiesis. Exp Hematol, 27, 978-993.

Ghosh, J.C. and Altieri, D.C. (2005) Activation of p53-dependent apoptosis by acute ablation of glycogen synthase kinase-3beta in colorectal cancer cells. Clin Cancer Res, 11, 4580-4588.

Ghosh, S. and Karin, M. (2002) Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell, 109 Suppl, S81-96.

Gil-Henn, H., Destaing, O., Sims, N.A., Aoki, K., Alles, N., Neff, L., Sanjay, A., Bruzzaniti, A., De Camilli, P., Baron, R. and Schlessinger, J. (2007) Defective microtubule-dependent podosome organization in osteoclasts leads to increased bone density in Pyk2(-/-) mice. J Cell Biol, 178, 1053-1064.

Gimble, J.M., Dorheim, M.A., Cheng, Q., Medina, K., Wang, C.S., Jones, R., Koren, E., Pietrangeli, C. and Kincade, P.W. (1990) Adipogenesis in a murine bone marrow stromal cell line capable of supporting B lineage lymphocyte growth and proliferation: biochemical and molecular characterization. Eur J Immunol, 20, 379-387.

Gimble, J.M., Robinson, C.E., Wu, X. and Kelly, K.A. (1996) The function of adipocytes in the bone marrow stroma: an update. Bone, 19, 421-428.

Gimble, J.M., Youkhana, K., Hua, X., Bass, H., Medina, K., Sullivan, M., Greenberger, J. and Wang, C.S. (1992) Adipogenesis in a myeloid supporting bone marrow stromal cell line. J Cell Biochem, 50, 73-82.

Ginnan, R. and Singer, H.A. (2002) CaM kinase II-dependent activation of tyrosine kinases and ERK1/2 in vascular smooth muscle. Am J Physiol Cell Physiol, 282, C754-761.

Girault, J.A., Costa, A., Derkinderen, P., Studler, J.M. and Toutant, M. (1999) FAK and PYK2/CAKbeta in the nervous system: a link between neuronal activity, plasticity and survival? Trends Neurosci, 22, 257-263.

Glimm, H., Oh, I.H. and Eaves, C.J. (2000) Human hematopoietic stem cells stimulated to proliferate in vitro lose engraftment potential during their S/G(2)/M transit and do not reenter G(0). Blood, 96, 4185-4193.

Goode, N., Hughes, K., Woodgett, J.R. and Parker, P.J. (1992) Differential regulation of glycogen synthase kinase-3 beta by protein kinase C isotypes. J Biol Chem, 267, 16878-16882.

Gougerot-Pocidalo, M.A., El Benna, J., My-Chan Dang, P. and Elbim, C. (2007) [Pathogens trapped in neutrophils nets]. Med Sci (Paris), 23, 464-465.

Green, D.R. and Kroemer, G. (2004) The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science, 305, 626-629.

Gribi, R., Hook, L., Ure, J. and Medvinsky, A. (2006) The differentiation program of embryonic definitive hematopoietic stem cells is largely alpha4 integrin independent. Blood, 108, 501-509.

Grimes, C.A. and Jope, R.S. (2001) The multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular signaling. Prog Neurobiol, 65, 391-426.

190


Grossmann, J. (2002) Molecular mechanisms of "detachment-induced apoptosis--Anoikis". Apoptosis, 7, 247-260.

Gu, J., Fujibayashi, A., Yamada, K.M. and Sekiguchi, K. (2002) Laminin-10/11 and fibronectin differentially prevent apoptosis induced by serum removal via phosphatidylinositol 3-kinase/Akt- and MEK1/ERK-dependent pathways. J Biol Chem, 277, 19922-19928.

Gu, Y.C., Kortesmaa, J., Tryggvason, K., Persson, J., Ekblom, P., Jacobsen, S.E. and Ekblom, M. (2003) Laminin isoform-specific promotion of adhesion and migration of human bone marrow progenitor cells. Blood, 101, 877-885.

Guo, W. and Giancotti, F.G. (2004) Integrin signalling during tumour progression. Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 816-826.

Guzman, M.L., Neering, S.J., Upchurch, D., Grimes, B., Howard, D.S., Rizzieri, D.A., Luger, S.M. and Jordan, C.T. (2001) Nuclear factor-kappaB is constitutively activated in primitive human acute myelogenous leukemia cells. Blood, 98, 2301-2307.

Guzman, M.L., Swiderski, C.F., Howard, D.S., Grimes, B.A., Rossi, R.M., Szilvassy, S.J. and Jordan, C.T. (2002) Preferential induction of apoptosis for primary human leukemic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 16220-16225.

Guzman, M.L., Rossi, R.M., Neelakantan, S., Li, X., Corbett, C.A., Hassane, D.C., Becker, M.W., Bennett, J.M., Sullivan, E., Lachowicz, J.L., Vaughan, A., Sweeney, C.J., Matthews, W., Carroll, M., Liesveld, J.L., Crooks, P.A. and Jordan, C.T. (2007) An orally bioavailable parthenolide analog selectively eradicates acute myelogenous leukemia stem and progenitor cells. Blood.

H. Haglund, K., Ivankovic-Dikic, I., Shimokawa, N., Kruh, G.D. and Dikic, I. (2004)

Recruitment of Pyk2 and Cbl to lipid rafts mediates signals important for actin reorganization in growing neurites. J Cell Sci, 117, 2557-2568.

Hall, A.C., Brennan, A., Goold, R.G., Cleverley, K., Lucas, F.R., Gordon-Weeks, P.R. and Salinas, P.C. (2002) Valproate regulates GSK-3-mediated axonal remodeling and synapsin I clustering in developing neurons. Mol Cell Neurosci, 20, 257-270.

Hann, I.M., Stevens, R.F., Goldstone, A.H., Rees, J.K., Wheatley, K., Gray, R.G. and Burnett, A.K. (1997) Randomized comparison of DAT versus ADE as induction chemotherapy in children and younger adults with acute myeloid leukemia. Results of the Medical Research Council's 10th AML trial (MRC AML10). Adult and Childhood Leukaemia Working Parties of the Medical Research Council. Blood, 89, 2311-2318.

Hannigan, G.E., Leung-Hagesteijn, C., Fitz-Gibbon, L., Coppolino, M.G., Radeva, G., Filmus, J., Bell, J.C. and Dedhar, S. (1996) Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta 1-integrin-linked protein kinase. Nature, 379, 91-96.

Hartigan, J.A. and Johnson, G.V. (1999) Transient increases in intracellular calcium result in prolonged site-selective increases in Tau phosphorylation through a glycogen synthase kinase 3beta-dependent pathway. J Biol Chem, 274, 21395-21401.

Hartigan, J.A., Xiong, W.C. and Johnson, G.V. (2001) Glycogen synthase kinase 3beta is tyrosine phosphorylated by PYK2. Biochem Biophys Res Commun, 284, 485-489.

Hashizume, K., Hatanaka, Y., Fukuda, I., Sano, T., Yamaguchi, Y., Tani, Y., Danno, G., Suzuki, K. and Ashida, H. (2002) N-acetyl-L-cysteine suppresses constitutive expression of CD11a/LFA-1alpha protein in myeloid lineage. Leuk Res, 26, 939-944.

Hazlehurst, L.A., Damiano, J.S., Buyuksal, I., Pledger, W.J. and Dalton, W.S. (2000) Adhesion to fibronectin via beta1 integrins regulates p27kip1 levels and contributes to cell adhesion mediated drug resistance (CAM-DR). Oncogene, 19, 4319-4327.

191


Hazlehurst, L.A., Landowski, T.H. and Dalton, W.S. (2003) Role of the tumor microenvironment in mediating de novo resistance to drugs and physiological mediators of cell death. Oncogene, 22, 7396-7402.

Hehlgans, S., Haase, M. and Cordes, N. (2007) Signalling via integrins: implications for cell survival and anticancer strategies. Biochim Biophys Acta, 1775, 163-180.

Heissig, B., Hattori, K., Dias, S., Friedrich, M., Ferris, B., Hackett, N.R., Crystal, R.G., Besmer, P., Lyden, D., Moore, M.A., Werb, Z. and Rafii, S. (2002) Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP-9 mediated release of kit-ligand. Cell, 109, 625-637.

Henriksen, E.J. and Dokken, B.B. (2006) Role of glycogen synthase kinase-3 in insulin resistance and type 2 diabetes. Curr Drug Targets, 7, 1435-1441.

Henriksen, E.J., Kinnick, T.R., Teachey, M.K., O'Keefe, M.P., Ring, D., Johnson, K.W. and Harrison, S.D. (2003) Modulation of muscle insulin resistance by selective inhibition of GSK-3 in Zucker diabetic fatty rats. Am J Physiol Endocrinol Metab, 284, E892-900.

Hermanto, U., Zong, C.S., Li, W. and Wang, L.H. (2002) RACK1, an insulin-like growth factor I (IGF-I) receptor-interacting protein, modulates IGF-I-dependent integrin signaling and promotes cell spreading and contact with extracellular matrix. Mol Cell Biol, 22, 2345-2365.

Hernandez, F., Borrell, J., Guaza, C., Avila, J. and Lucas, J.J. (2002) Spatial learning deficit in transgenic mice that conditionally over-express GSK-3beta in the brain but do not form tau filaments. J Neurochem, 83, 1529-1533.

Hess, D.A., Meyerrose, T.E., Wirthlin, L., Craft, T.P., Herrbrich, P.E., Creer, M.H. and Nolta, J.A. (2004) Functional characterization of highly purified human hematopoietic repopulating cells isolated according to aldehyde dehydrogenase activity. Blood, 104, 1648-1655.

Hess, F., Estrugo, D., Fischer, A., Belka, C. and Cordes, N. (2007) Integrin-linked kinase interacts with caspase-9 and -8 in an adhesion-dependent manner for promoting radiation-induced apoptosis in human leukemia cells. Oncogene, 26, 1372-1384.

Ho, A.D. (2005) Kinetics and symmetry of divisions of hematopoietic stem cells. Exp Hematol, 33, 1-8.

Ho, A.D. and Wagner, W. (2007) The beauty of asymmetry: asymmetric divisions and self-renewal in the haematopoietic system. Curr Opin Hematol, 14, 330-336.

Hoeflich, K.P., Luo, J., Rubie, E.A., Tsao, M.S., Jin, O. and Woodgett, J.R. (2000) Requirement for glycogen synthase kinase-3beta in cell survival and NF-kappaB activation. Nature, 406, 86-90.

Hongisto, V., Smeds, N., Brecht, S., Herdegen, T., Courtney, M.J. and Coffey, E.T. (2003) Lithium blocks the c-Jun stress response and protects neurons via its action on glycogen synthase kinase 3. Mol Cell Biol, 23, 6027-6036.

Hosen, N., Park, C.Y., Tatsumi, N., Oji, Y., Sugiyama, H., Gramatzki, M., Krensky, A.M. and Weissman, I.L. (2007) CD96 is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 11008-11013.

Hoshi, M., Takashima, A., Noguchi, K., Murayama, M., Sato, M., Kondo, S., Saitoh, Y., Ishiguro, K., Hoshino, T. and Imahori, K. (1996) Regulation of mitochondrial pyruvate dehydrogenase activity by tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3beta in brain. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 2719-2723.

Hosokawa, K., Arai, F., Yoshihara, H., Nakamura, Y., Gomei, Y., Iwasaki, H., Miyamoto, K., Shima, H., Ito, K. and Suda, T. (2007) Function of oxidative stress in the regulation of hematopoietic stem cell-niche interaction. Biochem Biophys Res Commun.

192


Hsia, D.A., Lim, S.T., Bernard-Trifilo, J.A., Mitra, S.K., Tanaka, S., den Hertog, J., Streblow, D.N., Ilic, D., Ginsberg, M.H. and Schlaepfer, D.D. (2005) Integrin alpha4beta1 promotes focal adhesion kinase-independent cell motility via alpha4 cytoplasmic domain-specific activation of c-Src. Mol Cell Biol, 25, 9700-9712.

Hu, N., Gulley, M.L., Kung, J.T. and Lee, E.Y. (1997) Retinoblastoma gene deficiency has mitogenic but not tumorigenic effects on erythropoiesis. Cancer Res, 57, 4123-4129.

Huang, D., Cheung, A.T., Parsons, J.T. and Bryer-Ash, M. (2002) Focal adhesion kinase (FAK) regulates insulin-stimulated glycogen synthesis in hepatocytes. J Biol Chem, 277, 18151-18160.

Huang, M., Kamasani, U. and Prendergast, G.C. (2006) RhoB facilitates c-Myc turnover by supporting efficient nuclear accumulation of GSK-3. Oncogene, 25, 1281-1289.

Huang, S., Law, P., Francis, K., Palsson, B.O. and Ho, A.D. (1999) Symmetry of initial cell divisions among primitive hematopoietic progenitors is independent of ontogenic age and regulatory molecules. Blood, 94, 2595-2604.

Hussong, J.W., Rodgers, G.M. and Shami, P.J. (2000) Evidence of increased angiogenesis in patients with acute myeloid leukemia. Blood, 95, 309-313.

Huttenlocher, A., Lakonishok, M., Kinder, M., Wu, S., Truong, T., Knudsen, K.A. and Horwitz, A.F. (1998) Integrin and cadherin synergy regulates contact inhibition of migration and motile activity. J Cell Biol, 141, 515-526.

Hynes, R.O. (2002) Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell, 110, 673-687. I. Ikeda, A., Shankar, D.B., Watanabe, M., Tamanoi, F., Moore, T.B. and Sakamoto, K.M.

(2006) Molecular targets and the treatment of myeloid leukemia. Mol Genet Metab, 88, 216-224.

Ito, K., Hirao, A., Arai, F., Matsuoka, S., Takubo, K., Hamaguchi, I., Nomiyama, K., Hosokawa, K., Sakurada, K., Nakagata, N., Ikeda, Y., Mak, T.W. and Suda, T. (2004) Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature, 431, 997-1002.

Ito, K., Hirao, A., Arai, F., Takubo, K., Matsuoka, S., Miyamoto, K., Ohmura, M., Naka, K., Hosokawa, K., Ikeda, Y. and Suda, T. (2006) Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nat Med, 12, 446-451.

Ivaska, J., Nissinen, L., Immonen, N., Eriksson, J.E., Kahari, V.M. and Heino, J. (2002) Integrin alpha 2 beta 1 promotes activation of protein phosphatase 2A and dephosphorylation of Akt and glycogen synthase kinase 3 beta. Mol Cell Biol, 22, 1352-1359.

J. Jain, A.K. and Jaiswal, A.K. (2007) GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of

nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem, 282, 16502-16510.

Jamieson, C.H., Ailles, L.E., Dylla, S.J., Muijtjens, M., Jones, C., Zehnder, J.L., Gotlib, J., Li, K., Manz, M.G., Keating, A., Sawyers, C.L. and Weissman, I.L. (2004) Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast-crisis CML. N Engl J Med, 351, 657-667.

Jamora, C. and Fuchs, E. (2002) Intercellular adhesion, signalling and the cytoskeleton. Nat Cell Biol, 4, E101-108.

193


Jan, Y., Matter, M., Pai, J.T., Chen, Y.L., Pilch, J., Komatsu, M., Ong, E., Fukuda, M. and Ruoslahti, E. (2004) A mitochondrial protein, Bit1, mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressors. Cell, 116, 751-762.

Janes, S.M. and Watt, F.M. (2004) Switch from alphavbeta5 to alphavbeta6 integrin expression protects squamous cell carcinomas from anoikis. J Cell Biol, 166, 419-431.

Jang, M.K., Goo, Y.H., Sohn, Y.C., Kim, Y.S., Lee, S.K., Kang, H., Cheong, J. and Lee, J.W. (2001) Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV stimulates nuclear factor-kappa B transactivation via phosphorylation of the p65 subunit. J Biol Chem, 276, 20005-20010.

Jang, Y.Y. and Sharkis, S.J. (2007) A low level of reactive oxygen species selects for primitive hematopoietic stem cells that may reside in the low-oxygenic niche. Blood, 110, 3056-3063.

Jansen, M., Yang, F.C., Cancelas, J.A., Bailey, J.R. and Williams, D.A. (2005) Rac2-deficient hematopoietic stem cells show defective interaction with the hematopoietic microenvironment and long-term engraftment failure. Stem Cells, 23, 335-346.

Janssens, V. and Goris, J. (2001) Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J, 353, 417-439.

Janssens, V., Goris, J. and Van Hoof, C. (2005) PP2A: the expected tumor suppressor. Curr Opin Genet Dev, 15, 34-41.

Jia, J., Amanai, K., Wang, G., Tang, J., Wang, B. and Jiang, J. (2002) Shaggy/GSK3 antagonizes Hedgehog signalling by regulating Cubitus interruptus. Nature, 416, 548-552.

Jiang, Y., Prosper, F. and Verfaillie, C.M. (2000) Opposing effects of engagement of integrins and stimulation of cytokine receptors on cell cycle progression of normal human hematopoietic progenitors. Blood, 95, 846-854.

Jin, L., Hope, K.J., Zhai, Q., Smadja-Joffe, F. and Dick, J.E. (2006) Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med, 12, 1167-1174.

Jin, N., Kovacs, A.D., Sui, Z., Dewhurst, S. and Maggirwar, S.B. (2005) Opposite effects of lithium and valproic acid on trophic factor deprivation-induced glycogen synthase kinase-3 activation, c-Jun expression and neuronal cell death. Neuropharmacology, 48, 576-583.

Joesting, M.S., Perrin, S., Elenbaas, B., Fawell, S.E., Rubin, J.S., Franco, O.E., Hayward, S.W., Cunha, G.R. and Marker, P.C. (2005) Identification of SFRP1 as a candidate mediator of stromal-to-epithelial signaling in prostate cancer. Cancer Res, 65, 10423-10430.

Johnson, G.V. and Bailey, C.D. (2002) Tau, where are we now? J Alzheimers Dis, 4, 375-398. Jope, R.S. and Johnson, G.V. (2004) The glamour and gloom of glycogen synthase kinase-3.

Trends Biochem Sci, 29, 95-102. Jope, R.S., Yuskaitis, C.J. and Beurel, E. (2007) Glycogen synthase kinase-3 (GSK3):

inflammation, diseases, and therapeutics. Neurochem Res, 32, 577-595. Jordan, C.T., Upchurch, D., Szilvassy, S.J., Guzman, M.L., Howard, D.S., Pettigrew, A.L.,

Meyerrose, T., Rossi, R., Grimes, B., Rizzieri, D.A., Luger, S.M. and Phillips, G.L. (2000) The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia, 14, 1777-1784.

Ju, Z., Jiang, H., Jaworski, M., Rathinam, C., Gompf, A., Klein, C., Trumpp, A. and Rudolph, K.L. (2007) Telomere dysfunction induces environmental alterations limiting hematopoietic stem cell function and engraftment. Nat Med, 13, 742-747.

194


Jung, Y., Wang, J., Havens, A., Sun, Y., Wang, J., Jin, T. and Taichman, R.S. (2005) Cell-to-cell contact is critical for the survival of hematopoietic progenitor cells on osteoblasts. Cytokine, 32, 155-162.

Junttila, M.R., Puustinen, P., Niemela, M., Ahola, R., Arnold, H., Bottzauw, T., Ala-aho, R., Nielsen, C., Ivaska, J., Taya, Y., Lu, S.L., Lin, S., Chan, E.K., Wang, X.J., Grenman, R., Kast, J., Kallunki, T., Sears, R., Kahari, V.M. and Westermarck, J. (2007) CIP2A inhibits PP2A in human malignancies. Cell, 130, 51-62.

K. Kaiser, E., Sato, M., Onyia, J.E. and Chandrasekhar, S. (2001) Parathyroid hormone (1-34)

regulates integrin expression in vivo in rat osteoblasts. J Cell Biochem, 83, 617-630. Kaplan, R.N., Riba, R.D., Zacharoulis, S., Bramley, A.H., Vincent, L., Costa, C., MacDonald,

D.D., Jin, D.K., Shido, K., Kerns, S.A., Zhu, Z., Hicklin, D., Wu, Y., Port, J.L., Altorki, N., Port, E.R., Ruggero, D., Shmelkov, S.V., Jensen, K.K., Rafii, S. and Lyden, D. (2005) VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature, 438, 820-827.

Kapur, R., Cooper, R., Zhang, L. and Williams, D.A. (2001) Cross-talk between alpha(4)beta(1)/alpha(5)beta(1) and c-Kit results in opposing effect on growth and survival of hematopoietic cells via the activation of focal adhesion kinase, mitogen-activated protein kinase, and Akt signaling pathways. Blood, 97, 1975-1981.

Karanu, F.N., Murdoch, B., Gallacher, L., Wu, D.M., Koremoto, M., Sakano, S. and Bhatia, M. (2000) The notch ligand jagged-1 represents a novel growth factor of human hematopoietic stem cells. J Exp Med, 192, 1365-1372.

Katayama, Y., Battista, M., Kao, W.M., Hidalgo, A., Peired, A.J., Thomas, S.A. and Frenette, P.S. (2006) Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell, 124, 407-421.

Kaufmann, S.H., Karp, J.E., Svingen, P.A., Krajewski, S., Burke, P.J., Gore, S.D. and Reed, J.C. (1998) Elevated expression of the apoptotic regulator Mcl-1 at the time of leukemic relapse. Blood, 91, 991-1000.

Kawano, Y. and Kypta, R. (2003) Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway. J Cell Sci, 116, 2627-2634.

Keating, M.J., Kantarjian, H., Smith, T.L., Estey, E., Walters, R., Andersson, B., Beran, M., McCredie, K.B. and Freireich, E.J. (1989) Response to salvage therapy and survival after relapse in acute myelogenous leukemia. J Clin Oncol, 7, 1071-1080.

Kelley, K.W., Meier, W.A., Minshall, C., Schacher, D.H., Liu, Q., VanHoy, R., Burgess, W. and Dantzer, R. (1998) Insulin growth factor-I inhibits apoptosis in hematopoietic progenitor cells. Implications in thymic aging. Ann N Y Acad Sci, 840, 518-524.

Kerst, J.M., Sanders, J.B., Slaper-Cortenbach, I.C., Doorakkers, M.C., Hooibrink, B., van Oers, R.H., von dem Borne, A.E. and van der Schoot, C.E. (1993) Alpha 4 beta 1 and alpha 5 beta 1 are differentially expressed during myelopoiesis and mediate the adherence of human CD34+ cells to fibronectin in an activation-dependent way. Blood, 81, 344-351.

Khwaja, A., Rodriguez-Viciana, P., Wennstrom, S., Warne, P.H. and Downward, J. (1997) Matrix adhesion and Ras transformation both activate a phosphoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Akt cellular survival pathway. Embo J, 16, 2783-2793.

Kiel, M.J., Yilmaz, O.H., Iwashita, T., Yilmaz, O.H., Terhorst, C. and Morrison, S.J. (2005) SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell, 121, 1109-1121.

195


Kim, H.S., Skurk, C., Thomas, S.R., Bialik, A., Suhara, T., Kureishi, Y., Birnbaum, M., Keaney, J.F., Jr. and Walsh, K. (2002) Regulation of angiogenesis by glycogen synthase kinase-3beta. J Biol Chem, 277, 41888-41896.

Kim, J.W., Lee, J.E., Kim, M.J., Cho, E.G., Cho, S.G. and Choi, E.J. (2003) Glycogen synthase kinase 3 beta is a natural activator of mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 1 (MEKK1). J Biol Chem, 278, 13995-14001.

Kirstetter, P., Anderson, K., Porse, B.T., Jacobsen, S.E. and Nerlov, C. (2006) Activation of the canonical Wnt pathway leads to loss of hematopoietic stem cell repopulation and multilineage differentiation block. Nat Immunol, 7, 1048-1056.

Klein, P.S. and Melton, D.A. (1996) A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 8455-8459.

Koc, O.N., Gerson, S.L., Cooper, B.W., Dyhouse, S.M., Haynesworth, S.E., Caplan, A.I. and Lazarus, H.M. (2000) Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy. J Clin Oncol, 18, 307-316.

Kollet, O., Dar, A., Shivtiel, S., Kalinkovich, A., Lapid, K., Sztainberg, Y., Tesio, M., Samstein, R.M., Goichberg, P., Spiegel, A., Elson, A. and Lapidot, T. (2006) Osteoclasts degrade endosteal components and promote mobilization of hematopoietic progenitor cells. Nat Med, 12, 657-664.

Kondo, M., Wagers, A.J., Manz, M.G., Prohaska, S.S., Scherer, D.C., Beilhack, G.F., Shizuru, J.A. and Weissman, I.L. (2003) Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol, 21, 759-806.

Kong, M., Fox, C.J., Mu, J., Solt, L., Xu, A., Cinalli, R.M., Birnbaum, M.J., Lindsten, T. and Thompson, C.B. (2004) The PP2A-associated protein alpha4 is an essential inhibitor of apoptosis. Science, 306, 695-698.

Konopleva, M., Zhao, S., Hu, W., Jiang, S., Snell, V., Weidner, D., Jackson, C.E., Zhang, X., Champlin, R., Estey, E., Reed, J.C. and Andreeff, M. (2002) The anti-apoptotic genes Bcl-X(L) and Bcl-2 are over-expressed and contribute to chemoresistance of non-proliferating leukaemic CD34+ cells. Br J Haematol, 118, 521-534.

Kops, G.J., Dansen, T.B., Polderman, P.E., Saarloos, I., Wirtz, K.W., Coffer, P.J., Huang, T.T., Bos, J.L., Medema, R.H. and Burgering, B.M. (2002) Forkhead transcription factor FOXO3a protects quiescent cells from oxidative stress. Nature, 419, 316-321.

Kotsianidis, I., Silk, J.D., Spanoudakis, E., Patterson, S., Almeida, A., Schmidt, R.R., Tsatalas, C., Bourikas, G., Cerundolo, V., Roberts, I.A. and Karadimitris, A. (2006) Regulation of hematopoiesis in vitro and in vivo by invariant NKT cells. Blood, 107, 3138-3144.

Krivtsov, A.V., Twomey, D., Feng, Z., Stubbs, M.C., Wang, Y., Faber, J., Levine, J.E., Wang, J., Hahn, W.C., Gilliland, D.G., Golub, T.R. and Armstrong, S.A. (2006) Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature, 442, 818-822.

Kuhl, M., Geis, K., Sheldahl, L.C., Pukrop, T., Moon, R.T. and Wedlich, D. (2001) Antagonistic regulation of convergent extension movements in Xenopus by Wnt/beta-catenin and Wnt/Ca2+ signaling. Mech Dev, 106, 61-76.

Kummer, C. and Ginsberg, M.H. (2006) New approaches to blockade of alpha4-integrins, proven therapeutic targets in chronic inflammation. Biochem Pharmacol, 72, 1460-1468.

Kurenova, E., Xu, L.H., Yang, X., Baldwin, A.S., Jr., Craven, R.J., Hanks, S.K., Liu, Z.G. and Cance, W.G. (2004) Focal adhesion kinase suppresses apoptosis by binding to the death domain of receptor-interacting protein. Mol Cell Biol, 24, 4361-4371.

196


L. Lacorazza, H.D., Yamada, T., Liu, Y., Miyata, Y., Sivina, M., Nunes, J. and Nimer, S.D.

(2006) The transcription factor MEF/ELF4 regulates the quiescence of primitive hematopoietic cells. Cancer Cell, 9, 175-187.

Lamari, F., Braut-Boucher, F., Pongnimitprasert, N., Bernard, M., Foglietti, M.J., Derappe, C. and Aubery, M. (2007) Cell adhesion and integrin expression are modulated by oxidative stress in EA.hy 926 cells. Free Radic Res, 41, 812-822.

Lapidot, T., Sirard, C., Vormoor, J., Murdoch, B., Hoang, T., Caceres-Cortes, J., Minden, M., Paterson, B., Caligiuri, M.A. and Dick, J.E. (1994) A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature, 367, 645-648.

Larsson, J. and Scadden, D. (2006) Nervous activity in a stem cell niche. Cell, 124, 253-255. Le Blanc, K., Rasmusson, I., Sundberg, B., Gotherstrom, C., Hassan, M., Uzunel, M. and

Ringden, O. (2004) Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet, 363, 1439-1441.

Leary, A.G., Ogawa, M., Strauss, L.C. and Civin, C.I. (1984) Single cell origin of multilineage colonies in culture. Evidence that differentiation of multipotent progenitors and restriction of proliferative potential of monopotent progenitors are stochastic processes. J Clin Invest, 74, 2193-2197.

Leavesley, D.I., Oliver, J.M., Swart, B.W., Berndt, M.C., Haylock, D.N. and Simmons, P.J. (1994) Signals from platelet/endothelial cell adhesion molecule enhance the adhesive activity of the very late antigen-4 integrin of human CD34+ hemopoietic progenitor cells. J Immunol, 153, 4673-4683.

Lee, A.Y., He, B., You, L., Xu, Z., Mazieres, J., Reguart, N., Mikami, I., Batra, S. and Jablons, D.M. (2004) Dickkopf-1 antagonizes Wnt signaling independent of beta-catenin in human mesothelioma. Biochem Biophys Res Commun, 323, 1246-1250.

Lee, J.W. and Juliano, R.L. (2000) alpha5beta1 integrin protects intestinal epithelial cells from apoptosis through a phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B-dependent pathway. Mol Biol Cell, 11, 1973-1987.

Lee, J.W. and Juliano, R.L. (2002) The alpha5beta1 integrin selectively enhances epidermal growth factor signaling to the phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway in intestinal epithelial cells. Biochim Biophys Acta, 1542, 23-31.

Lesort, M., Jope, R.S. and Johnson, G.V. (1999) Insulin transiently increases tau phosphorylation: involvement of glycogen synthase kinase-3beta and Fyn tyrosine kinase. J Neurochem, 72, 576-584.

Levesque, J.P., Haylock, D.N. and Simmons, P.J. (1996) Cytokine regulation of proliferation and cell adhesion are correlated events in human CD34+ hemopoietic progenitors. Blood, 88, 1168-1176.

Levesque, J.P. and Simmons, P.J. (1999) Cytoskeleton and integrin-mediated adhesion signaling in human CD34+ hemopoietic progenitor cells. Exp Hematol, 27, 579-586.

Levesque, J.P., Takamatsu, Y., Nilsson, S.K., Hayloc, D.N., Simmons, P.J. and MacCallum, P. (2001) Rôle des intégrines et sélectines dans le développement et les régulations du système hématopoïétique. Med/Sci, 7, 99-109.

Li, J., Law, H.K., Lau, Y.L. and Chan, G.C. (2004) Differential damage and recovery of human mesenchymal stem cells after exposure to chemotherapeutic agents. Br J Haematol, 127, 326-334.

Li, L. and Xie, T. (2005) Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol, 21, 605-631.

Li, Q., Van Antwerp, D., Mercurio, F., Lee, K.F. and Verma, I.M. (1999) Severe liver degeneration in mice lacking the IkappaB kinase 2 gene. Science, 284, 321-325.

197


Li, X., Bijur, G.N. and Jope, R.S. (2002a) Glycogen synthase kinase-3beta, mood stabilizers, and neuroprotection. Bipolar Disord, 4, 137-144.

Li, X., Scuderi, A., Letsou, A. and Virshup, D.M. (2002b) B56-associated protein phosphatase 2A is required for survival and protects from apoptosis in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol, 22, 3674-3684.

Liang, M.H. and Chuang, D.M. (2006) Differential roles of glycogen synthase kinase-3 isoforms in the regulation of transcriptional activation. J Biol Chem, 281, 30479-30484.

Liao, X., Zhang, L., Thrasher, J.B., Du, J. and Li, B. (2003) Glycogen synthase kinase-3beta suppression eliminates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand resistance in prostate cancer. Mol Cancer Ther, 2, 1215-1222.

Liesveld, J.L., Winslow, J.M., Frediani, K.E., Ryan, D.H. and Abboud, C.N. (1993) Expression of integrins and examination of their adhesive function in normal and leukemic hematopoietic cells. Blood, 81, 112-121.

Lisovsky, M. and Savchenko, V.G. (1995) Defect of stromal microenvironment in long term bone marrow cultures of patients with acute and chronic myelogenous leukemias. Leuk Lymphoma, 19, 145-152.

Loberg, R.D., Vesely, E. and Brosius, F.C., 3rd. (2002) Enhanced glycogen synthase kinase-3beta activity mediates hypoxia-induced apoptosis of vascular smooth muscle cells and is prevented by glucose transport and metabolism. J Biol Chem, 277, 41667-41673.

Lotem, J. and Sachs, L. (1996) Control of apoptosis in hematopoiesis and leukemia by cytokines, tumor suppressor and oncogenes. Leukemia, 10, 925-931.

Lowenberg, B., Downing, J.R. and Burnett, A. (1999) Acute myeloid leukemia. N Engl J Med, 341, 1051-1062.

Lucas, F.R., Goold, R.G., Gordon-Weeks, P.R. and Salinas, P.C. (1998) Inhibition of GSK-3beta leading to the loss of phosphorylated MAP-1B is an early event in axonal remodelling induced by WNT-7a or lithium. J Cell Sci, 111 (Pt 10), 1351-1361.

Lundell, B.I., McCarthy, J.B., Kovach, N.L. and Verfaillie, C.M. (1997) Activation of beta1 integrins on CML progenitors reveals cooperation between beta1 integrins and CD44 in the regulation of adhesion and proliferation. Leukemia, 11, 822-829.

M. Maggirwar, S.B., Tong, N., Ramirez, S., Gelbard, H.A. and Dewhurst, S. (1999) HIV-1 Tat-

mediated activation of glycogen synthase kinase-3beta contributes to Tat-mediated neurotoxicity. J Neurochem, 73, 578-586.

Manabe, R., Ohe, N., Maeda, T., Fukuda, T. and Sekiguchi, K. (1997) Modulation of cell-adhesive activity of fibronectin by the alternatively spliced EDA segment. J Cell Biol, 139, 295-307.

Manoukian, A.S. and Woodgett, J.R. (2002) Role of glycogen synthase kinase-3 in cancer: regulation by Wnts and other signaling pathways. Adv Cancer Res, 84, 203-229.

Martel, V., Racaud-Sultan, C., Dupe, S., Marie, C., Paulhe, F., Galmiche, A., Block, M.R. and Albiges-Rizo, C. (2001) Conformation, localization, and integrin binding of talin depend on its interaction with phosphoinositides. J Biol Chem, 276, 21217-21227.

Martin, M., Rehani, K., Jope, R.S. and Michalek, S.M. (2005) Toll-like receptor-mediated cytokine production is differentially regulated by glycogen synthase kinase 3. Nat Immunol, 6, 777-784.

Matsunaga, T., Takemoto, N., Sato, T., Takimoto, R., Tanaka, I., Fujimi, A., Akiyama, T., Kuroda, H., Kawano, Y., Kobune, M., Kato, J., Hirayama, Y., Sakamaki, S., Kohda, K., Miyake, K. and Niitsu, Y. (2003) Interaction between leukemic-cell VLA-4 and

198


stromal fibronectin is a decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia. Nat Med, 9, 1158-1165.

Mauro, M.J. and Druker, B.J. (2001) Chronic myelogenous leukemia. Curr Opin Oncol, 13, 3-7.

Mayani, H., Dragowska, W. and Lansdorp, P.M. (1993) Lineage commitment in human hemopoiesis involves asymmetric cell division of multipotent progenitors and does not appear to be influenced by cytokines. J Cell Physiol, 157, 579-586.

McKenna, R.W. (2000) Multifaceted approach to the diagnosis and classification of acute leukemias. Clin Chem, 46, 1252-1259.

McManus, E.J., Sakamoto, K., Armit, L.J., Ronaldson, L., Shpiro, N., Marquez, R. and Alessi, D.R. (2005) Role that phosphorylation of GSK3 plays in insulin and Wnt signalling defined by knockin analysis. Embo J, 24, 1571-1583.

McQuibban, G.A., Butler, G.S., Gong, J.H., Bendall, L., Power, C., Clark-Lewis, I. and Overall, C.M. (2001) Matrix metalloproteinase activity inactivates the CXC chemokine stromal cell-derived factor-1. J Biol Chem, 276, 43503-43508.

Meares, G.P. and Jope, R.S. (2007) Resolution of the nuclear localization mechanism of glycogen synthase kinase-3: functional effects in apoptosis. J Biol Chem, 282, 16989-17001.

Medvinsky, A. and Dzierzak, E. (1996) Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell, 86, 897-906.

Melendez, J., Turner, C., Avraham, H., Steinberg, S.F., Schaefer, E. and Sussman, M.A. (2004) Cardiomyocyte apoptosis triggered by RAFTK/pyk2 via Src kinase is antagonized by paxillin. J Biol Chem, 279, 53516-53523.

Melikova, S., Dylla, S.J. and Verfaillie, C.M. (2004) Phosphatidylinositol-3-kinase activation mediates proline-rich tyrosine kinase 2 phosphorylation and recruitment to beta1-integrins in human CD34+ cells. Exp Hematol, 32, 1051-1056.

Meredith, J.E., Jr., Kiosses, W.B., Takada, Y. and Schwartz, M.A. (1999) Mutational analysis of cell cycle inhibition by integrin beta1C. J Biol Chem, 274, 8111-8116.

Mezey, E., Chandross, K.J., Harta, G., Maki, R.A. and McKercher, S.R. (2000) Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science, 290, 1779-1782.

Mikesch, J.H., Steffen, B., Berdel, W.E., Serve, H. and Muller-Tidow, C. (2007) The emerging role of Wnt signaling in the pathogenesis of acute myeloid leukemia. Leukemia, 21, 1638-1647.

Miller, C.L. and Eaves, C.J. (1997) Expansion in vitro of adult murine hematopoietic stem cells with transplantable lympho-myeloid reconstituting ability. Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 13648-13653.

Mitra, S.K., Hanson, D.A. and Schlaepfer, D.D. (2005) Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat Rev Mol Cell Biol, 6, 56-68.

Miyamoto, T., Weissman, I.L. and Akashi, K. (2000) AML1/ETO-expressing nonleukemic stem cells in acute myelogenous leukemia with 8;21 chromosomal translocation. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 7521-7526.

Miyazaki, T., Shen, M., Fujikura, D., Tosa, N., Kim, H.R., Kon, S., Uede, T. and Reed, J.C. (2004) Functional role of death-associated protein 3 (DAP3) in anoikis. J Biol Chem, 279, 44667-44672.

Monier-Gavelle, F. and Duband, J.L. (1997) Cross talk between adhesion molecules: control of N-cadherin activity by intracellular signals elicited by beta1 and beta3 integrins in migrating neural crest cells. J Cell Biol, 137, 1663-1681.

199


Morfini, G., Szebenyi, G., Elluru, R., Ratner, N. and Brady, S.T. (2002) Glycogen synthase kinase 3 phosphorylates kinesin light chains and negatively regulates kinesin-based motility. Embo J, 21, 281-293.

Morrison, S.J., Wandycz, A.M., Hemmati, H.D., Wright, D.E. and Weissman, I.L. (1997) Identification of a lineage of multipotent hematopoietic progenitors. Development, 124, 1929-1939.

Morrison, S.J. and Weissman, I.L. (1994) The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity, 1, 661-673.

Mottet, D., Dumont, V., Deccache, Y., Demazy, C., Ninane, N., Raes, M. and Michiels, C. (2003) Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta pathway in HepG2 cells. J Biol Chem, 278, 31277-31285.

Moyano, J.V., Maqueda, A., Casanova, B. and Garcia-Pardo, A. (2003) Alpha4beta1 integrin/ligand interaction inhibits alpha5beta1-induced stress fibers and focal adhesions via down-regulation of RhoA and induces melanoma cell migration. Mol Biol Cell, 14, 3699-3715.

Muguruma, Y., Yahata, T., Miyatake, H., Sato, T., Uno, T., Itoh, J., Kato, S., Ito, M., Hotta, T. and Ando, K. (2006) Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment. Blood, 107, 1878-1887.

Mukai, F., Ishiguro, K., Sano, Y. and Fujita, S.C. (2002) Alternative splicing isoform of tau protein kinase I/glycogen synthase kinase 3beta. J Neurochem, 81, 1073-1083.

Muller-Tidow, C., Steffen, B., Cauvet, T., Tickenbrock, L., Ji, P., Diederichs, S., Sargin, B., Kohler, G., Stelljes, M., Puccetti, E., Ruthardt, M., deVos, S., Hiebert, S.W., Koeffler, H.P., Berdel, W.E. and Serve, H. (2004) Translocation products in acute myeloid leukemia activate the Wnt signaling pathway in hematopoietic cells. Mol Cell Biol, 24, 2890-2904.

Mulrooney, J., Foley, K., Vineberg, S., Barreuther, M. and Grabel, L. (2000) Phosphorylation of the beta1 integrin cytoplasmic domain: toward an understanding of function and mechanism. Exp Cell Res, 258, 332-341.

Murdoch, B., Chadwick, K., Martin, M., Shojaei, F., Shah, K.V., Gallacher, L., Moon, R.T. and Bhatia, M. (2003) Wnt-5A augments repopulating capacity and primitive hematopoietic development of human blood stem cells in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 3422-3427.

Murphy, M.J., Wilson, A. and Trumpp, A. (2005) More than just proliferation: Myc function in stem cells. Trends Cell Biol, 15, 128-137.

Muthu, K., Iyer, S., He, L.K., Szilagyi, A., Gamelli, R.L., Shankar, R. and Jones, S.B. (2007) Murine hematopoietic stem cells and progenitors express adrenergic receptors. J Neuroimmunol, 186, 27-36.

N. Nagai, Y., Garrett, K.P., Ohta, S., Bahrun, U., Kouro, T., Akira, S., Takatsu, K. and Kincade,

P.W. (2006) Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity, 24, 801-812.

Neering, S.J., Bushnell, T., Sozer, S., Ashton, J., Rossi, R.M., Wang, P.Y., Bell, D.R., Heinrich, D., Bottaro, A. and Jordan, C.T. (2007) Leukemia stem cells in a genetically defined murine model of blast-crisis CML. Blood, 110, 2578-2585.

Neviani, P., Santhanam, R., Trotta, R., Notari, M., Blaser, B.W., Liu, S., Mao, H., Chang, J.S., Galietta, A., Uttam, A., Roy, D.C., Valtieri, M., Bruner-Klisovic, R., Caligiuri, M.A., Bloomfield, C.D., Marcucci, G. and Perrotti, D. (2005) The tumor suppressor

200


PP2A is functionally inactivated in blast crisis CML through the inhibitory activity of the BCR/ABL-regulated SET protein. Cancer Cell, 8, 355-368.

Nho, R.S., Xia, H., Kahm, J., Kleidon, J., Diebold, D. and Henke, C.A. (2005) Role of integrin-linked kinase in regulating phosphorylation of Akt and fibroblast survival in type I collagen matrices through a beta1 integrin viability signaling pathway. J Biol Chem, 280, 26630-26639.

Nicholson, K.M. and Anderson, N.G. (2002) The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy. Cell Signal, 14, 381-395.

Nikoulina, S.E., Ciaraldi, T.P., Mudaliar, S., Mohideen, P., Carter, L. and Henry, R.R. (2000) Potential role of glycogen synthase kinase-3 in skeletal muscle insulin resistance of type 2 diabetes. Diabetes, 49, 263-271.

Nilsson, S.K., Debatis, M.E., Dooner, M.S., Madri, J.A., Quesenberry, P.J. and Becker, P.S. (1998) Immunofluorescence characterization of key extracellular matrix proteins in murine bone marrow in situ. J Histochem Cytochem, 46, 371-377.

Nilsson, S.K., Johnston, H.M. and Coverdale, J.A. (2001) Spatial localization of transplanted hemopoietic stem cells: inferences for the localization of stem cell niches. Blood, 97, 2293-2299.

Nilsson, S.K., Johnston, H.M., Whitty, G.A., Williams, B., Webb, R.J., Denhardt, D.T., Bertoncello, I., Bendall, L.J., Simmons, P.J. and Haylock, D.N. (2005) Osteopontin, a key component of the hematopoietic stem cell niche and regulator of primitive hematopoietic progenitor cells. Blood, 106, 1232-1239.

Novak, A., Hsu, S.C., Leung-Hagesteijn, C., Radeva, G., Papkoff, J., Montesano, R., Roskelley, C., Grosschedl, R. and Dedhar, S. (1998) Cell adhesion and the integrin-linked kinase regulate the LEF-1 and beta-catenin signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 4374-4379.

Nusse, R. and Varmus, H.E. (1992) Wnt genes. Cell, 69, 1073-1087. O. Ogata, Y., Takahashi, M., Ueno, S., Takeuchi, K., Okada, T., Mano, H., Ookawara, S.,

Ozawa, K., Berk, B.C., Ikeda, U., Shimada, K. and Kobayashi, E. (2003) Antiapoptotic effect of endothelin-1 in rat cardiomyocytes in vitro. Hypertension, 41, 1156-1163.

Ohno, R., Kobayashi, T., Tanimoto, M., Hiraoka, A., Imai, K., Asou, N., Tomonaga, M., Tsubaki, K., Takahashi, I., Kodera, Y. and et al. (1993) Randomized study of individualized induction therapy with or without vincristine, and of maintenance-intensification therapy between 4 or 12 courses in adult acute myeloid leukemia. AML-87 Study of the Japan Adult Leukemia Study Group. Cancer, 71, 3888-3895.

Olofsson, T.B. (1991) Growth regulation of hematopoietic cells. An overview. Acta Oncol, 30, 889-902.

Orschell-Traycoff, C.M., Hiatt, K., Dagher, R.N., Rice, S., Yoder, M.C. and Srour, E.F. (2000) Homing and engraftment potential of Sca-1(+)lin(-) cells fractionated on the basis of adhesion molecule expression and position in cell cycle. Blood, 96, 1380-1387.

Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. and Nakauchi, H. (1996) Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science, 273, 242-245.

Ostergaard, H.L., Lou, O., Arendt, C.W. and Berg, N.N. (1998) Paxillin phosphorylation and association with Lck and Pyk2 in anti-CD3- or anti-CD45-stimulated T cells. J Biol Chem, 273, 5692-5696.

201


Ougolkov, A.V. and Billadeau, D.D. (2006) Targeting GSK-3: a promising approach for cancer therapy? Future Oncol, 2, 91-100.

Ougolkov, A.V., Bone, N.D., Fernandez-Zapico, M.E., Kay, N.E. and Billadeau, D.D. (2007) Inhibition of glycogen synthase kinase-3 activity leads to epigenetic silencing of nuclear factor kappaB target genes and induction of apoptosis in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood, 110, 735-742.

Ougolkov, A.V., Fernandez-Zapico, M.E., Bilim, V.N., Smyrk, T.C., Chari, S.T. and Billadeau, D.D. (2006) Aberrant nuclear accumulation of glycogen synthase kinase-3beta in human pancreatic cancer: association with kinase activity and tumor dedifferentiation. Clin Cancer Res, 12, 5074-5081.

Ougolkov, A.V., Fernandez-Zapico, M.E., Savoy, D.N., Urrutia, R.A. and Billadeau, D.D. (2005) Glycogen synthase kinase-3beta participates in nuclear factor kappaB-mediated gene transcription and cell survival in pancreatic cancer cells. Cancer Res, 65, 2076-2081.

P. Padro, T., Ruiz, S., Bieker, R., Burger, H., Steins, M., Kienast, J., Buchner, T., Berdel, W.E.

and Mesters, R.M. (2000) Increased angiogenesis in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia. Blood, 95, 2637-2644.

Pankov, R., Cukierman, E., Clark, K., Matsumoto, K., Hahn, C., Poulin, B. and Yamada, K.M. (2003) Specific beta1 integrin site selectively regulates Akt/protein kinase B signaling via local activation of protein phosphatase 2A. J Biol Chem, 278, 18671-18681.

Pap, M. and Cooper, G.M. (1998) Role of glycogen synthase kinase-3 in the phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt cell survival pathway. J Biol Chem, 273, 19929-19932.

Pap, M. and Cooper, G.M. (2002) Role of translation initiation factor 2B in control of cell survival by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta signaling pathway. Mol Cell Biol, 22, 578-586.

Park, C.C., Zhang, H., Pallavicini, M., Gray, J.W., Baehner, F., Park, C.J. and Bissell, M.J. (2006) Beta1 integrin inhibitory antibody induces apoptosis of breast cancer cells, inhibits growth, and distinguishes malignant from normal phenotype in three dimensional cultures and in vivo. Cancer Res, 66, 1526-1535.

Park, I.K., Qian, D., Kiel, M., Becker, M.W., Pihalja, M., Weissman, I.L., Morrison, S.J. and Clarke, M.F. (2003) Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature, 423, 302-305.

Parmar, K., Mauch, P., Vergilio, J.A., Sackstein, R. and Down, J.D. (2007) Distribution of hematopoietic stem cells in the bone marrow according to regional hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 5431-5436.

Parsons, J.T. and Parsons, S.J. (1997) Src family protein tyrosine kinases: cooperating with growth factor and adhesion signaling pathways. Curr Opin Cell Biol, 9, 187-192.

Passegue, E., Jamieson, C.H., Ailles, L.E. and Weissman, I.L. (2003) Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci U S A, 100 Suppl 1, 11842-11849.

Passegue, E., Wagers, A.J., Giuriato, S., Anderson, W.C. and Weissman, I.L. (2005) Global analysis of proliferation and cell cycle gene expression in the regulation of hematopoietic stem and progenitor cell fates. J Exp Med, 202, 1599-1611.

Pastorino, J.G., Hoek, J.B. and Shulga, N. (2005) Activation of glycogen synthase kinase 3beta disrupts the binding of hexokinase II to mitochondria by phosphorylating

202


voltage-dependent anion channel and potentiates chemotherapy-induced cytotoxicity. Cancer Res, 65, 10545-10554.

Pearce, D.J., Ridler, C.M., Simpson, C. and Bonnet, D. (2004a) Multiparameter analysis of murine bone marrow side population cells. Blood, 103, 2541-2546.

Pearce, N.J., Arch, J.R., Clapham, J.C., Coghlan, M.P., Corcoran, S.L., Lister, C.A., Llano, A., Moore, G.B., Murphy, G.J., Smith, S.A., Taylor, C.M., Yates, J.W., Morrison, A.D., Harper, A.J., Roxbee-Cox, L., Abuin, A., Wargent, E. and Holder, J.C. (2004b) Development of glucose intolerance in male transgenic mice overexpressing human glycogen synthase kinase-3beta on a muscle-specific promoter. Metabolism, 53, 1322-1330.

Pearce, D.J., Taussig, D., Zibara, K., Smith, L.L., Ridler, C.M., Preudhomme, C., Young, B.D., Rohatiner, A.Z., Lister, T.A. and Bonnet, D. (2006) AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood, 107, 1166-1173.

Peled, A., Grabovsky, V., Habler, L., Sandbank, J., Arenzana-Seisdedos, F., Petit, I., Ben-Hur, H., Lapidot, T. and Alon, R. (1999a) The chemokine SDF-1 stimulates integrin-mediated arrest of CD34(+) cells on vascular endothelium under shear flow. J Clin Invest, 104, 1199-1211.

Peled, A., Petit, I., Kollet, O., Magid, M., Ponomaryov, T., Byk, T., Nagler, A., Ben-Hur, H., Many, A., Shultz, L., Lider, O., Alon, R., Zipori, D. and Lapidot, T. (1999b) Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science, 283, 845-848.

Perez, M., Rojo, A.I., Wandosell, F., Diaz-Nido, J. and Avila, J. (2003) Prion peptide induces neuronal cell death through a pathway involving glycogen synthase kinase 3. Biochem J, 372, 129-136.

Petersen, B.E., Bowen, W.C., Patrene, K.D., Mars, W.M., Sullivan, A.K., Murase, N., Boggs, S.S., Greenberger, J.S. and Goff, J.P. (1999) Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science, 284, 1168-1170.

Phiel, C.J., Wilson, C.A., Lee, V.M. and Klein, P.S. (2003) GSK-3alpha regulates production of Alzheimer's disease amyloid-beta peptides. Nature, 423, 435-439.

Piccoli, C., Ria, R., Scrima, R., Cela, O., D'Aprile, A., Boffoli, D., Falzetti, F., Tabilio, A. and Capitanio, N. (2005) Characterization of mitochondrial and extra-mitochondrial oxygen consuming reactions in human hematopoietic stem cells. Novel evidence of the occurrence of NAD(P)H oxidase activity. J Biol Chem, 280, 26467-26476.

Piedra, J., Miravet, S., Castano, J., Palmer, H.G., Heisterkamp, N., Garcia de Herreros, A. and Dunach, M. (2003) p120 Catenin-associated Fer and Fyn tyrosine kinases regulate beta-catenin Tyr-142 phosphorylation and beta-catenin-alpha-catenin Interaction. Mol Cell Biol, 23, 2287-2297.

Pigino, G., Morfini, G., Pelsman, A., Mattson, M.P., Brady, S.T. and Busciglio, J. (2003) Alzheimer's presenilin 1 mutations impair kinesin-based axonal transport. J Neurosci, 23, 4499-4508.

Plotkin, B., Kaidanovich, O., Talior, I. and Eldar-Finkelman, H. (2003) Insulin mimetic action of synthetic phosphorylated peptide inhibitors of glycogen synthase kinase-3. J Pharmacol Exp Ther, 305, 974-980.

Plotkin, L.I., Manolagas, S.C. and Bellido, T. (2007) Glucocorticoids induce osteocyte apoptosis by blocking focal adhesion kinase-mediated survival. Evidence for inside-out signaling leading to anoikis. J Biol Chem, 282, 24120-24130.

Polakis, P. (2002) Casein kinase 1: a Wnt'er of disconnect. Curr Biol, 12, R499-R501. Ponomaryov, T., Peled, A., Petit, I., Taichman, R.S., Habler, L., Sandbank, J., Arenzana-

Seisdedos, F., Magerus, A., Caruz, A., Fujii, N., Nagler, A., Lahav, M., Szyper-

203


Kravitz, M., Zipori, D. and Lapidot, T. (2000) Induction of the chemokine stromal-derived factor-1 following DNA damage improves human stem cell function. J Clin Invest, 106, 1331-1339.

Poon, B.Y., Ward, C.A., Cooper, C.B., Giles, W.R., Burns, A.R. and Kubes, P. (2001) alpha(4)-integrin mediates neutrophil-induced free radical injury to cardiac myocytes. J Cell Biol, 152, 857-866.

Potocnik, A.J., Brakebusch, C. and Fassler, R. (2000) Fetal and adult hematopoietic stem cells require beta1 integrin function for colonizing fetal liver, spleen, and bone marrow. Immunity, 12, 653-663.

Price, M.A. and Kalderon, D. (2002) Proteolysis of the Hedgehog signaling effector Cubitus interruptus requires phosphorylation by Glycogen Synthase Kinase 3 and Casein Kinase 1. Cell, 108, 823-835.

Prickett, T.D. and Brautigan, D.L. (2007) Cytokine activation of p38 mitogen-activated protein kinase and apoptosis is opposed by alpha-4 targeting of protein phosphatase 2A for site-specific dephosphorylation of MEK3. Mol Cell Biol, 27, 4217-4227.

Priestley, G.V., Scott, L.M., Ulyanova, T. and Papayannopoulou, T. (2006) Lack of alpha4 integrin expression in stem cells restricts competitive function and self-renewal activity. Blood, 107, 2959-2967.

Punzel, M., Liu, D., Zhang, T., Eckstein, V., Miesala, K. and Ho, A.D. (2003) The symmetry of initial divisions of human hematopoietic progenitors is altered only by the cellular microenvironment. Exp Hematol, 31, 339-347.

Puthalakath, H., Huang, D.C., O'Reilly, L.A., King, S.M. and Strasser, A. (1999) The proapoptotic activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex. Mol Cell, 3, 287-296.

Puthalakath, H., Villunger, A., O'Reilly, L.A., Beaumont, J.G., Coultas, L., Cheney, R.E., Huang, D.C. and Strasser, A. (2001) Bmf: a proapoptotic BH3-only protein regulated by interaction with the myosin V actin motor complex, activated by anoikis. Science, 293, 1829-1832.

R. Ranganathan, A.C., Adam, A.P. and Aguirre-Ghiso, J.A. (2006) Opposing roles of mitogenic

and stress signaling pathways in the induction of cancer dormancy. Cell Cycle, 5, 1799-1807.

Reginato, M.J., Mills, K.R., Paulus, J.K., Lynch, D.K., Sgroi, D.C., Debnath, J., Muthuswamy, S.K. and Brugge, J.S. (2003) Integrins and EGFR coordinately regulate the pro-apoptotic protein Bim to prevent anoikis. Nat Cell Biol, 5, 733-740.

Ren, X.R., Du, Q.S., Huang, Y.Z., Ao, S.Z., Mei, L. and Xiong, W.C. (2001) Regulation of CDC42 GTPase by proline-rich tyrosine kinase 2 interacting with PSGAP, a novel pleckstrin homology and Src homology 3 domain containing rhoGAP protein. J Cell Biol, 152, 971-984.

Reuss-Borst, M.A., Klein, G., Waller, H.D. and Muller, C.A. (1995) Differential expression of adhesion molecules in acute leukemia. Leukemia, 9, 869-874.

Reya, T., Morrison, S.J., Clarke, M.F. and Weissman, I.L. (2001) Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 414, 105-111.

Reya, T., Duncan, A.W., Ailles, L., Domen, J., Scherer, D.C., Willert, K., Hintz, L., Nusse, R. and Weissman, I.L. (2003) A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature, 423, 409-414.

Reya, T. and Clevers, H. (2005) Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature, 434, 843-850.

204


Ring, D.B., Johnson, K.W., Henriksen, E.J., Nuss, J.M., Goff, D., Kinnick, T.R., Ma, S.T., Reeder, J.W., Samuels, I., Slabiak, T., Wagman, A.S., Hammond, M.E. and Harrison, S.D. (2003) Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes, 52, 588-595.

Rintoul, R.C. and Sethi, T. (2002) Extracellular matrix regulation of drug resistance in small-cell lung cancer. Clin Sci (Lond), 102, 417-424.

Roach, P.J. (1990) Control of glycogen synthase by hierarchal protein phosphorylation. Faseb J, 4, 2961-2968.

Roach, P.J. (2002) Glycogen and its metabolism. Curr Mol Med, 2, 101-120. Roh, M.S., Eom, T.Y., Zmijewska, A.A., De Sarno, P., Roth, K.A. and Jope, R.S. (2005)

Hypoxia activates glycogen synthase kinase-3 in mouse brain in vivo: protection by mood stabilizers and imipramine. Biol Psychiatry, 57, 278-286.

Roth, W., Wild-Bode, C., Platten, M., Grimmel, C., Melkonyan, H.S., Dichgans, J. and Weller, M. (2000) Secreted Frizzled-related proteins inhibit motility and promote growth of human malignant glioma cells. Oncogene, 19, 4210-4220.

Rothwarf, D.M. and Karin, M. (1999) The NF-kappa B activation pathway: a paradigm in information transfer from membrane to nucleus. Sci STKE, 1999, RE1.

S. Sagar, B.M., Rentala, S., Gopal, P.N., Sharma, S. and Mukhopadhyay, A. (2006) Fibronectin

and laminin enhance engraftibility of cultured hematopoietic stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 350, 1000-1005.

Salas, T.R., Kim, J., Vakar-Lopez, F., Sabichi, A.L., Troncoso, P., Jenster, G., Kikuchi, A., Chen, S.Y., Shemshedini, L., Suraokar, M., Logothetis, C.J., DiGiovanni, J., Lippman, S.M. and Menter, D.G. (2004) Glycogen synthase kinase-3 beta is involved in the phosphorylation and suppression of androgen receptor activity. J Biol Chem, 279, 19191-19200.

Salesse, S., Dylla, S.J. and Verfaillie, C.M. (2004) p210BCR/ABL-induced alteration of pre-mRNA splicing in primary human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Leukemia, 18, 727-733.

Sanchez, J.F., Sniderhan, L.F., Williamson, A.L., Fan, S., Chakraborty-Sett, S. and Maggirwar, S.B. (2003) Glycogen synthase kinase 3beta-mediated apoptosis of primary cortical astrocytes involves inhibition of nuclear factor kappaB signaling. Mol Cell Biol, 23, 4649-4662.

Santoro, M.F., Annand, R.R., Robertson, M.M., Peng, Y.W., Brady, M.J., Mankovich, J.A., Hackett, M.C., Ghayur, T., Walter, G., Wong, W.W. and Giegel, D.A. (1998) Regulation of protein phosphatase 2A activity by caspase-3 during apoptosis. J Biol Chem, 273, 13119-13128.

Sasaki, H., Nagura, K., Ishino, M., Tobioka, H., Kotani, K. and Sasaki, T. (1995) Cloning and characterization of cell adhesion kinase beta, a novel protein-tyrosine kinase of the focal adhesion kinase subfamily. J Biol Chem, 270, 21206-21219.

Satoh, Y., Matsumura, I., Tanaka, H., Ezoe, S., Sugahara, H., Mizuki, M., Shibayama, H., Ishiko, E., Ishiko, J., Nakajima, K. and Kanakura, Y. (2004) Roles for c-Myc in self-renewal of hematopoietic stem cells. J Biol Chem, 279, 24986-24993.

Sauvageau, G., Iscove, N.N. and Humphries, R.K. (2004) In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells. Oncogene, 23, 7223-7232.

Sayas, C.L., Ariaens, A., Ponsioen, B. and Moolenaar, W.H. (2006) GSK-3 is activated by the tyrosine kinase Pyk2 during LPA1-mediated neurite retraction. Mol Biol Cell, 17, 1834-1844.

205


Sayas, C.L., Avila, J. and Wandosell, F. (2002) Regulation of neuronal cytoskeleton by lysophosphatidic acid: role of GSK-3. Biochim Biophys Acta, 1582, 144-153.

Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., Friesen, C., Li, F., Tomaselli, K.J., Debatin, K.M., Krammer, P.H. and Peter, M.E. (1998) Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. Embo J, 17, 1675-1687.

Schaller, M.D. (2001) Biochemical signals and biological responses elicited by the focal adhesion kinase. Biochim Biophys Acta, 1540, 1-21.

Schambony, A., Kunz, M. and Gradl, D. (2004) Cross-regulation of Wnt signaling and cell adhesion. Differentiation, 72, 307-318.

Scheller, M., Huelsken, J., Rosenbauer, F., Taketo, M.M., Birchmeier, W., Tenen, D.G. and Leutz, A. (2006) Hematopoietic stem cell and multilineage defects generated by constitutive beta-catenin activation. Nat Immunol, 7, 1037-1047.

Schindler, E.M., Baumgartner, M., Gribben, E.M., Li, L. and Efimova, T. (2007) The role of proline-rich protein tyrosine kinase 2 in differentiation-dependent signaling in human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol, 127, 1094-1106.

Schlaepfer, D.D., Mitra, S.K. and Ilic, D. (2004) Control of motile and invasive cell phenotypes by focal adhesion kinase. Biochim Biophys Acta, 1692, 77-102.

Schliemann, C., Bieker, R., Padro, T., Kessler, T., Hintelmann, H., Buchner, T., Berdel, W.E. and Mesters, R.M. (2006) Expression of angiopoietins and their receptor Tie2 in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia. Haematologica, 91, 1203-1211.

Schofield, R. (1978) The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells, 4, 7-25.

Schwabe, R.F. and Brenner, D.A. (2002) Role of glycogen synthase kinase-3 in TNF-alpha-induced NF-kappaB activation and apoptosis in hepatocytes. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 283, G204-211.

Schwartz, M.A. and Ginsberg, M.H. (2002) Networks and crosstalk: integrin signalling spreads. Nat Cell Biol, 4, E65-68.

Schwartz, M.A., Schaller, M.D. and Ginsberg, M.H. (1995) Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annu Rev Cell Dev Biol, 11, 549-599.

Scott, L.M., Priestley, G.V. and Papayannopoulou, T. (2003) Deletion of alpha4 integrins from adult hematopoietic cells reveals roles in homeostasis, regeneration, and homing. Mol Cell Biol, 23, 9349-9360.

Senent, L., Jarque, I., Martin, G., Sempere, A., Gonzalez-Garcia, Y., Gomis, F., Perez-Sirvent, M., De La Rubia, J. and Sanz, M.A. (1998) P-glycoprotein expression and prognostic value in acute myeloid leukemia. Haematologica, 83, 783-787.

Shakoori, A., Ougolkov, A., Yu, Z.W., Zhang, B., Modarressi, M.H., Billadeau, D.D., Mai, M., Takahashi, Y. and Minamoto, T. (2005) Deregulated GSK3beta activity in colorectal cancer: its association with tumor cell survival and proliferation. Biochem Biophys Res Commun, 334, 1365-1373.

Shamri, R., Grabovsky, V., Feigelson, S.W., Dwir, O., Van Kooyk, Y. and Alon, R. (2002) Chemokine stimulation of lymphocyte alpha 4 integrin avidity but not of leukocyte function-associated antigen-1 avidity to endothelial ligands under shear flow requires cholesterol membrane rafts. J Biol Chem, 277, 40027-40035.

Shinoda, G., Umeda, K., Heike, T., Arai, M., Niwa, A., Ma, F., Suemori, H., Luo, H.Y., Chui, D.H., Torii, R., Shibuya, M., Nakatsuji, N. and Nakahata, T. (2007) alpha4-Integrin(+) endothelium derived from primate embryonic stem cells generates primitive and definitive hematopoietic cells. Blood, 109, 2406-2415.

206


Silver, I.A., Murrills, R.J. and Etherington, D.J. (1988) Microelectrode studies on the acid microenvironment beneath adherent macrophages and osteoclasts. Exp Cell Res, 175, 266-276.

Simmons, P.J., Levesque, J.P. and Zannettino, A.C. (1997) Adhesion molecules in haemopoiesis. Baillieres Clin Haematol, 10, 485-505.

Skov, S., Pedersen, M.T., Andresen, L., Straten, P.T., Woetmann, A. and Odum, N. (2005) Cancer cells become susceptible to natural killer cell killing after exposure to histone deacetylase inhibitors due to glycogen synthase kinase-3-dependent expression of MHC class I-related chain A and B. Cancer Res, 65, 11136-11145.

Skuli, N., Monferran, S., Delmas, C., Lajoie-Mazenc, I., Favre, G., Toulas, C. and Cohen-Jonathan-Moyal, E. (2006) Activation of RhoB by hypoxia controls hypoxia-inducible factor-1alpha stabilization through glycogen synthase kinase-3 in U87 glioblastoma cells. Cancer Res, 66, 482-489.

Song, L., De Sarno, P. and Jope, R.S. (2002) Central role of glycogen synthase kinase-3beta in endoplasmic reticulum stress-induced caspase-3 activation. J Biol Chem, 277, 44701-44708.

Sonoda, Y., Aiba, N., Utsubo, R., Koguchi, E., Hasegawa, M. and Kasahara, T. (2004) Induction of antioxidant enzymes by FAK in a human leukemic cell line, HL-60. Biochim Biophys Acta, 1683, 22-32.

Spangrude, G.J., Heimfeld, S. and Weissman, I.L. (1988) Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science, 241, 58-62.

Squier, M.K. and Cohen, J.J. (1997) Calpain, an upstream regulator of thymocyte apoptosis. J Immunol, 158, 3690-3697.

Stankunas, K., Bayle, J.H., Gestwicki, J.E., Lin, Y.M., Wandless, T.J. and Crabtree, G.R. (2003) Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell, 12, 1615-1624.

Steinbrecher, K.A., Wilson, W., 3rd, Cogswell, P.C. and Baldwin, A.S. (2005) Glycogen synthase kinase 3beta functions to specify gene-specific, NF-kappaB-dependent transcription. Mol Cell Biol, 25, 8444-8455.

Strappazzon, F., Torch, S., Trioulier, Y., Blot, B., Sadoul, R. and Verna, J.M. (2007) Survival response-linked Pyk2 activation during potassium depletion-induced apoptosis of cerebellar granule neurons. Mol Cell Neurosci, 34, 355-365.

Stupack, D.G. and Cheresh, D.A. (2004) A Bit-role for integrins in apoptosis. Nat Cell Biol, 6, 388-389.

Sugiyama, T., Kohara, H., Noda, M. and Nagasawa, T. (2006) Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity, 25, 977-988.

Sui, Z., Kovacs, A.D. and Maggirwar, S.B. (2006) Recruitment of active glycogen synthase kinase-3 into neuronal lipid rafts. Biochem Biophys Res Commun, 345, 1643-1648.

Sun, C.K., Ng, K.T., Sun, B.S., Ho, J.W., Lee, T.K., Ng, I., Poon, R.T., Lo, C.M., Liu, C.L., Man, K. and Fan, S.T. (2007) The significance of proline-rich tyrosine kinase2 (Pyk2) on hepatocellular carcinoma progression and recurrence. Br J Cancer, 97, 50-57.

Surjit, M. and Lal, S.K. (2007) Glycogen synthase kinase-3 phosphorylates and regulates the stability of p27kip1 protein. Cell Cycle, 6, 580-588.

Sutherland, C., Leighton, I.A. and Cohen, P. (1993) Inactivation of glycogen synthase kinase-3 beta by phosphorylation: new kinase connections in insulin and growth-factor signalling. Biochem J, 296 (Pt 1), 15-19.

Suzuki, K., Chikamatsu, Y. and Takahashi, K. (2005) Requirement of protein phosphatase 2A for recruitment of IQGAP1 to Rac-bound beta1 integrin. J Cell Physiol, 203, 487-492.

207


Suzuki, K. and Takahashi, K. (2003a) Reduced expression of the regulatory A subunit of serine/threonine protein phosphatase 2A in human breast cancer MCF-7 cells. Int J Oncol, 23, 1263-1268.

Suzuki, K. and Takahashi, K. (2003b) Reduced cell adhesion during mitosis by threonine phosphorylation of beta1 integrin. J Cell Physiol, 197, 297-305.

T. Tabe, Y., Jin, L., Tsutsumi-Ishii, Y., Xu, Y., McQueen, T., Priebe, W., Mills, G.B., Ohsaka,

A., Nagaoka, I., Andreeff, M. and Konopleva, M. (2007) Activation of integrin-linked kinase is a critical prosurvival pathway induced in leukemic cells by bone marrow-derived stromal cells. Cancer Res, 67, 684-694.

Tai, Y.T., Podar, K., Catley, L., Tseng, Y.H., Akiyama, M., Shringarpure, R., Burger, R., Hideshima, T., Chauhan, D., Mitsiades, N., Richardson, P., Munshi, N.C., Kahn, C.R., Mitsiades, C. and Anderson, K.C. (2003) Insulin-like growth factor-1 induces adhesion and migration in human multiple myeloma cells via activation of beta1-integrin and phosphatidylinositol 3'-kinase/AKT signaling. Cancer Res, 63, 5850-5858.

Taichman, R.S. (2005) Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell niche. Blood, 105, 2631-2639.

Taipale, J. and Beachy, P.A. (2001) The Hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer. Nature, 411, 349-354.

Takada, Y., Khuri, F.R. and Aggarwal, B.B. (2004) Protein farnesyltransferase inhibitor (SCH 66336) abolishes NF-kappaB activation induced by various carcinogens and inflammatory stimuli leading to suppression of NF-kappaB-regulated gene expression and up-regulation of apoptosis. J Biol Chem, 279, 26287-26299.

Takahashi, K. (2001) The linkage between beta1 integrin and the actin cytoskeleton is differentially regulated by tyrosine and serine/threonine phosphorylation of beta1 integrin in normal and cancerous human breast cells. BMC Cell Biol, 2, 23.

Takahashi, K. and Suzuki, K. (2006) Regulation of protein phosphatase 2A-mediated recruitment of IQGAP1 to beta1 integrin by EGF through activation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Cell Physiol, 208, 213-219.

Takamatsu, Y., Simmons, P.J. and Levesque, J.P. (1998) Dual control by divalent cations and mitogenic cytokines of alpha 4 beta 1 and alpha 5 beta 1 integrin avidity expressed by human hemopoietic cells. Cell Adhes Commun, 5, 349-366.

Takashima, A., Noguchi, K., Michel, G., Mercken, M., Hoshi, M., Ishiguro, K. and Imahori, K. (1996) Exposure of rat hippocampal neurons to amyloid beta peptide (25-35) induces the inactivation of phosphatidyl inositol-3 kinase and the activation of tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3 beta. Neurosci Lett, 203, 33-36.

Tamura, M., Gu, J., Danen, E.H., Takino, T., Miyamoto, S. and Yamada, K.M. (1999) PTEN interactions with focal adhesion kinase and suppression of the extracellular matrix-dependent phosphatidylinositol 3-kinase/Akt cell survival pathway. J Biol Chem, 274, 20693-20703.

Tan, J., Zhuang, L., Leong, H.S., Iyer, N.G., Liu, E.T. and Yu, Q. (2005) Pharmacologic modulation of glycogen synthase kinase-3beta promotes p53-dependent apoptosis through a direct Bax-mediated mitochondrial pathway in colorectal cancer cells. Cancer Res, 65, 9012-9020.

Tanentzapf, G. and Brown, N.H. (2006) An interaction between integrin and the talin FERM domain mediates integrin activation but not linkage to the cytoskeleton. Nat Cell Biol, 8, 601-606.

208


Tang, H., Hao, Q., Fitzgerald, T., Sasaki, T., Landon, E.J. and Inagami, T. (2002) Pyk2/CAKbeta tyrosine kinase activity-mediated angiogenesis of pulmonary vascular endothelial cells. J Biol Chem, 277, 5441-5447.

Tokiwa, G., Dikic, I., Lev, S. and Schlessinger, J. (1996) Activation of Pyk2 by stress signals and coupling with JNK signaling pathway. Science, 273, 792-794.

Torensma, R., Raymakers, R.A., van Kooyk, Y. and Figdor, C.G. (1996) Induction of LFA-1 on pluripotent CD34+ bone marrow cells does not affect lineage commitment. Blood, 87, 4120-4128.

Toruner, M., Fernandez-Zapico, M., Sha, J.J., Pham, L., Urrutia, R. and Egan, L.J. (2006) Antianoikis effect of nuclear factor-kappaB through up-regulated expression of osteoprotegerin, BCL-2, and IAP-1. J Biol Chem, 281, 8686-8696.

Tothova, Z., Kollipara, R., Huntly, B.J., Lee, B.H., Castrillon, D.H., Cullen, D.E., McDowell, E.P., Lazo-Kallanian, S., Williams, I.R., Sears, C., Armstrong, S.A., Passegue, E., DePinho, R.A. and Gilliland, D.G. (2007) FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell, 128, 325-339.

Tothova, Z. and Mercher, T. (2007) [FoxO: stress or eternal life]. Med Sci (Paris), 23, 466-467.

Traver, D., Akashi, K., Weissman, I.L. and Lagasse, E. (1998) Mice defective in two apoptosis pathways in the myeloid lineage develop acute myeloblastic leukemia. Immunity, 9, 47-57.

Trowbridge, J.J., Xenocostas, A., Moon, R.T. and Bhatia, M. (2006) Glycogen synthase kinase-3 is an in vivo regulator of hematopoietic stem cell repopulation. Nat Med, 12, 89-98.

Truong, T., Sun, G., Doorly, M., Wang, J.Y. and Schwartz, M.A. (2003) Modulation of DNA damage-induced apoptosis by cell adhesion is independently mediated by p53 and c-Abl. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 10281-10286.

U. Ueda, H., Abbi, S., Zheng, C. and Guan, J.L. (2000) Suppression of Pyk2 kinase and cellular

activities by FIP200. J Cell Biol, 149, 423-430. Unwin, R.D., Smith, D.L., Blinco, D., Wilson, C.L., Miller, C.J., Evans, C.A., Jaworska, E.,

Baldwin, S.A., Barnes, K., Pierce, A., Spooncer, E. and Whetton, A.D. (2006) Quantitative proteomics reveals posttranslational control as a regulatory factor in primary hematopoietic stem cells. Blood, 107, 4687-4694.

V. Valentijn, A.J. and Gilmore, A.P. (2004) Translocation of full-length Bid to mitochondria

during anoikis. J Biol Chem, 279, 32848-32857. Valentijn, A.J., Metcalfe, A.D., Kott, J., Streuli, C.H. and Gilmore, A.P. (2003) Spatial and

temporal changes in Bax subcellular localization during anoikis. J Cell Biol, 162, 599-612.

van Buul, J.D., Anthony, E.C., Fernandez-Borja, M., Burridge, K. and Hordijk, P.L. (2005) Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) mediates vascular endothelial-cadherin-based cell-cell adhesion by regulating beta-catenin tyrosine phosphorylation. J Biol Chem, 280, 21129-21136.

Van Den Berg, D.J., Sharma, A.K., Bruno, E. and Hoffman, R. (1998) Role of members of the Wnt gene family in human hematopoiesis. Blood, 92, 3189-3202.

209


Van Kanegan, M.J., Adams, D.G., Wadzinski, B.E. and Strack, S. (2005) Distinct protein phosphatase 2A heterotrimers modulate growth factor signaling to extracellular signal-regulated kinases and Akt. J Biol Chem, 380, 36029-36.

van Rhenen, A., van Dongen, G.A., Kelder, A., Rombouts, E.J., Feller, N., Moshaver, B., Walsum, M.S., Zweegman, S., Ossenkoppele, G.J. and Jan Schuurhuis, G. (2007) The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood, 110, 2659-2666.

Varnum-Finney, B., Xu, L., Brashem-Stein, C., Nourigat, C., Flowers, D., Bakkour, S., Pear, W.S. and Bernstein, I.D. (2000) Pluripotent, cytokine-dependent, hematopoietic stem cells are immortalized by constitutive Notch1 signaling. Nat Med, 6, 1278-1281.

Verfaillie, C.M. (1998) Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process. Blood, 92, 2609-2612.

Vialle-Castellano, A., Gaugler, B., Mohty, M., Isnardon, D., van Baren, N. and Olive, D. (2004) Abundant expression of fibronectin is a major feature of leukemic dendritic cells differentiated from patients with acute myeloid leukemia. Leukemia, 18, 426-433.

Vila, L., Thomas, X., Campos, L., Sabido, O. and Archimbaud, E. (1995) Expression of VLA molecules on acute leukemia cells: relationship with disease characteristics. Exp Hematol, 23, 514-518.

Viquez, N.M., Li, C.R., Wairkar, Y.P. and DiAntonio, A. (2006) The B’ protein phosphatase 2A regulatory subunit well-rounded regulates synaptic growth and cytoskeletal stability at the Drosophila neuromuscular junction. J Neurosci, 26, 9293-303.

Visnjic, D., Kalajzic, Z., Rowe, D.W., Katavic, V., Lorenzo, J. and Aguila, H.L. (2004) Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency. Blood, 103, 3258-3264.

Vuillet-Gaugler, M.H., Breton-Gorius, J., Vainchenker, W., Guichard, J., Leroy, C., Tchernia, G. and Coulombel, L. (1990) Loss of attachment to fibronectin with terminal human erythroid differentiation. Blood, 75, 865-873.

W. Wagner, W., Ansorge, A., Wirkner, U., Eckstein, V., Schwager, C., Blake, J., Miesala, K.,

Selig, J., Saffrich, R., Ansorge, W. and Ho, A.D. (2004) Molecular evidence for stem cell function of the slow-dividing fraction among human hematopoietic progenitor cells by genome-wide analysis. Blood, 104, 675-686.

Wagner, W., Saffrich, R., Wirkner, U., Eckstein, V., Blake, J., Ansorge, A., Schwager, C., Wein, F., Miesala, K., Ansorge, W. and Ho, A.D. (2005) Hematopoietic progenitor cells and cellular microenvironment: behavioral and molecular changes upon interaction. Stem Cells, 23, 1180-1191.

Wagner, W., Wein, F., Roderburg, C., Saffrich, R., Faber, A., Krause, U., Schubert, M., Benes, V., Eckstein, V., Maul, H. and Ho, A.D. (2007) Adhesion of hematopoietic progenitor cells to human mesenchymal stem cells as a model for cell-cell interaction. Exp Hematol, 35, 314-325.

Wakefield, J.G., Stephens, D.J. and Tavare, J.M. (2003) A role for glycogen synthase kinase-3 in mitotic spindle dynamics and chromosome alignment. J Cell Sci, 116, 637-646.

Walkley, C.R., Fero, M.L., Chien, W.M., Purton, L.E. and McArthur, G.A. (2005) Negative cell-cycle regulators cooperatively control self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol, 7, 172-178.

Walkley, C.R., Shea, J.M., Sims, N.A., Purton, L.E. and Orkin, S.H. (2007) Rb regulates interactions between hematopoietic stem cells and their bone marrow microenvironment. Cell, 129, 1081-1095.

210


Wang, D., Westerheide, S.D., Hanson, J.L. and Baldwin, A.S., Jr. (2000) Tumor necrosis factor alpha-induced phosphorylation of RelA/p65 on Ser529 is controlled by casein kinase II. J Biol Chem, 275, 32592-32597.

Wang, L., Fortney, J.E. and Gibson, L.F. (2004) Stromal cell protection of B-lineage acute lymphoblastic leukemic cells during chemotherapy requires active Akt. Leuk Res, 28, 733-742.

Wang, L., Yang, L., Filippi, M.D., Williams, D.A. and Zheng, Y. (2006) Genetic deletion of Cdc42GAP reveals a role of Cdc42 in erythropoiesis and hematopoietic stem/progenitor cell survival, adhesion, and engraftment. Blood, 107, 98-105.

Wang, S.S., Esplin, E.D., Li, J.L., Huang, L., Gazdar, A., Minna, J. and Evans, G.A. (1998) Alterations of the PPP2R1B gene in human lung and colon cancer. Science, 282, 284-287.

Wang, X., Hisha, H., Taketani, S., Adachi, Y., Li, Q., Cui, W., Cui, Y., Wang, J., Song, C., Mizokami, T., Okazaki, S., Li, Q., Fan, T., Fan, H., Lian, Z., Gershwin, M.E. and Ikehara, S. (2006) Characterization of mesenchymal stem cells isolated from mouse fetal bone marrow. Stem Cells, 24, 482-493.

Watcharasit, P., Bijur, G.N., Song, L., Zhu, J., Chen, X. and Jope, R.S. (2003) Glycogen synthase kinase-3beta (GSK3beta) binds to and promotes the actions of p53. J Biol Chem, 278, 48872-48879.

Watcharasit, P., Bijur, G.N., Zmijewski, J.W., Song, L., Zmijewska, A., Chen, X., Johnson, G.V. and Jope, R.S. (2002) Direct, activating interaction between glycogen synthase kinase-3beta and p53 after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 7951-7955.

Watt, F.M. (2002) Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation. Embo J, 21, 3919-3926.

Weaver, V.M., Lelievre, S., Lakins, J.N., Chrenek, M.A., Jones, J.C., Giancotti, F., Werb, Z. and Bissell, M.J. (2002) beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell, 2, 205-216.

Wei, L., Yang, Y., Zhang, X. and Yu, Q. (2004) Altered regulation of Src upon cell detachment protects human lung adenocarcinoma cells from anoikis. Oncogene, 23, 9052-9061.

Weissman, I.L. (2000) Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science, 287, 1442-1446.

Weissman, I.L., Anderson, D.J. and Gage, F. (2001) Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annu Rev Cell Dev Biol, 17, 387-403.

Werner, E. and Werb, Z. (2002) Integrins engage mitochondrial function for signal transduction by a mechanism dependent on Rho GTPases. J Cell Biol, 158, 357-368.

Whitfield, J.F. (2005) Parathyroid hormone (PTH) and hematopoiesis: new support for some old observations. J Cell Biochem, 96, 278-284.

Willert, K., Brown, J.D., Danenberg, E., Duncan, A.W., Weissman, I.L., Reya, T., Yates, J.R., 3rd and Nusse, R. (2003) Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature, 423, 448-452.

Williams, D.A. (2007) A new mechanism of leukemia drug resistance? N Engl J Med, 357, 77-78.

Wilson, A., Murphy, M.J., Oskarsson, T., Kaloulis, K., Bettess, M.D., Oser, G.M., Pasche, A.C., Knabenhans, C., Macdonald, H.R. and Trumpp, A. (2004) c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Genes Dev, 18, 2747-2763.

211


Woodgett, J.R. (1990) Molecular cloning and expression of glycogen synthase kinase-3/factor A. Embo J, 9, 2431-2438.

Wu, S.S., Jacamo, R.O., Vong, S.K. and Rozengurt, E. (2006) Differential regulation of Pyk2 phosphorylation at Tyr-402 and Tyr-580 in intestinal epithelial cells: roles of calcium, Src, Rho kinase, and the cytoskeleton. Cell Signal, 18, 1932-1940.

X. Xie, T. and Spradling, A.C. (2000) A niche maintaining germ line stem cells in the

Drosophila ovary. Science, 290, 328-330. Xiong, W. and Parsons, J.T. (1997) Induction of apoptosis after expression of PYK2, a

tyrosine kinase structurally related to focal adhesion kinase. J Cell Biol, 139, 529-539. Y. Yaccoby, S., Ling, W., Zhan, F., Walker, R., Barlogie, B. and Shaughnessy, J.D., Jr. (2007)

Antibody-based inhibition of DKK1 suppresses tumor-induced bone resorption and multiple myeloma growth in vivo. Blood, 109, 2106-2111.

Yamazaki, S., Iwama, A., Takayanagi, S., Morita, Y., Eto, K., Ema, H. and Nakauchi, H. (2006) Cytokine signals modulated via lipid rafts mimic niche signals and induce hibernation in hematopoietic stem cells. Embo J, 25, 3515-3523.

Yan, B. and Smith, J.W. (2000) A redox site involved in integrin activation. J Biol Chem, 275, 39964-39972.

Yang, L., Wang, L., Geiger, H., Cancelas, J.A., Mo, J. and Zheng, Y. (2007) Rho GTPase Cdc42 coordinates hematopoietic stem cell quiescence and niche interaction in the bone marrow. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 5091-5096.

Yang, L. and Zheng, Y. (2007) Cdc42: a signal coordinator in hematopoietic stem cell maintenance. Cell Cycle, 6, 1445-1450.

Yi, K.D., Chung, J., Pang, P. and Simpkins, J.W. (2005) Role of protein phosphatases in estrogen-mediated neuroprotection. J Neurosci, 25, 7191-7198.

Yilmaz, O.H., Valdez, R., Theisen, B.K., Guo, W., Ferguson, D.O., Wu, H. and Morrison, S.J. (2006) Pten dependence distinguishes haematopoietic stem cells from leukaemia-initiating cells. Nature, 441, 475-482.

Yook, J.I., Li, X.Y., Ota, I., Hu, C., Kim, H.S., Kim, N.H., Cha, S.Y., Ryu, J.K., Choi, Y.J., Kim, J., Fearon, E.R. and Weiss, S.J. (2006) A Wnt-Axin2-GSK3beta cascade regulates Snail1 activity in breast cancer cells. Nat Cell Biol, 8, 1398-1406.

Yu, H., Li, X., Marchetto, G.S., Dy, R., Hunter, D., Calvo, B., Dawson, T.L., Wilm, M., Anderegg, R.J., Graves, L.M. and Earp, H.S. (1996) Activation of a novel calcium-dependent protein-tyrosine kinase. Correlation with c-Jun N-terminal kinase but not mitogen-activated protein kinase activation. J Biol Chem, 271, 29993-29998.

Z. Zeng, Q., McCauley, L.K. and Wang, C.Y. (2002) Hepatocyte growth factor inhibits anoikis

by induction of activator protein 1-dependent cyclooxygenase-2. Implication in head and neck squamous cell carcinoma progression. J Biol Chem, 277, 50137-50142.

Zhang, J., Grindley, J.C., Yin, T., Jayasinghe, S., He, X.C., Ross, J.T., Haug, J.S., Rupp, D., Porter-Westpfahl, K.S., Wiedemann, L.M., Wu, H. and Li, L. (2006) PTEN maintains haematopoietic stem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention. Nature, 441, 518-522.

Zhang, J., Niu, C., Ye, L., Huang, H., He, X., Tong, W.G., Ross, J., Haug, J., Johnson, T., Feng, J.Q., Harris, S., Wiedemann, L.M., Mishina, Y. and Li, L. (2003) Identification

212


of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature, 425, 836-841.

Zhang, Y., Wittner, M., Bouamar, H., Jarrier, P., Vainchenker, W. and Louache, F. (2007) Identification of CXCR4 as a new nitric oxide-regulated gene in human CD34+ cells. Stem Cells, 25, 211-219.

Zhao, T. and Bokoch, G.M. (2005) Critical role of proline-rich tyrosine kinase 2 in reversion of the adhesion-mediated suppression of reactive oxygen species generation by human neutrophils. J Immunol, 174, 8049-8055.

Zheng, M. and McKeown-Longo, P.J. (2006) Cell adhesion regulates Ser/Thr phosphorylation and proteasomal degradation of HEF1. J Cell Sci, 119, 96-103.

Zheng, X., Beissert, T., Kukoc-Zivojnov, N., Puccetti, E., Altschmied, J., Strolz, C., Boehrer, S., Gul, H., Schneider, O., Ottmann, O.G., Hoelzer, D., Henschler, R. and Ruthardt, M. (2004) Gamma-catenin contributes to leukemogenesis induced by AML-associated translocation products by increasing the self-renewal of very primitive progenitor cells. Blood, 103, 3535-3543.

Zrihan-Licht, S., Fu, Y., Settleman, J., Schinkmann, K., Shaw, L., Keydar, I., Avraham, S. and Avraham, H. (2000) RAFTK/Pyk2 tyrosine kinase mediates the association of p190 RhoGAP with RasGAP and is involved in breast cancer cell invasion. Oncogene, 19, 1318-1328.

213

ANNEXES

Cell Adhesion Regulates CDC25A Expression and Proliferation

in Acute Myeloid Leukemia

Anne Fernandez-Vidal,1Loıc Ysebaert,

1Christine Didier,

3Remy Betous,

1Fabienne De Toni,

1

Naıs Prade-Houdellier,2Cecile Demur,

2Marie-Odile Contour-Galcera,

4Gregoire P. Prevost,

4

Bernard Ducommun,3Bernard Payrastre,

1Claire Racaud-Sultan,

1and Stephane Manenti

1

1Centre de Physiopathologie Toulouse-Purpan, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale U563-IFR30, Departement‘‘Oncogenese et Signalisation dans les cellules hematopoıetiques,’’ and 2Service d’Hematologie Biologique, CHU Purpan;3Laboratoire de Biologie cellulaire et Moleculaire du Controle de la Proliferation, Centre National de laRecherche Scientifique UMR 5088-IFR109, Universite Paul Sabatier, Toulouse, France; and 4IPSEN,Institut Henri Beaufour, Les Ulis, France

Abstract

The effects of cell adhesion on leukemia cell proliferationremain poorly documented and somehow controversial. Inthis work, we investigated the effect of adhesion to fibronectinon the proliferation of acute myeloid leukemia (AML) celllines (U937 and KG1a) and CD34+ normal or leukemic primarycells. We observed an increased rate of proliferation of AMLcells when adhered to fibronectin, concomitant with acceler-ated S-phase entry and accumulation of CDC25A. Conversely,normal CD34+ cell proliferation was decreased by adhesion tofibronectin with a concomitant drop in CDC25A expression.Importantly, we showed that both small interfering RNA(siRNA)–mediated CDC25A down-regulation and a recentlydeveloped CDC25 pharmacologic inhibitor impaired thisadhesion-dependent proliferation, establishing a functionallink between CDC25A accumulation and adhesion-dependentproliferation in leukemic cells. CDC25A accumulation wasfound only slightly dependent on transcriptional regulationand essentially due to modifications of the proteasomaldegradation of the protein as shown using proteasomeinhibitors and reverse transcription-PCR. Interestingly, CDC25Aregulation was Chk1 dependent in these cells as suggestedby siRNA-mediated down-regulation of this protein. Finally,we identified activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway as an adhesion-dependent regulation mechanismof CDC25A protein expression. Altogether, our data show thatin leukemic cells adhesion to fibronectin increases CDC25Aexpression through proteasome- and Chk1-dependent mech-anisms, resulting in enhanced proliferation. They also suggestthat these adhesion-dependent proliferation properties ofhematopoietic cells may be modified during leukemogenesis.(Cancer Res 2006; 66(14): 7128-35)

Introduction

Eukaryotic cells need interactions with their microenvironmentto regulate their proliferation. Adhesion to the extracellular matrix(ECM) has been extensively described as a key positive regulator ofcell proliferation in various cell types (1), although in some cases

interaction with the ECM may inhibit cell proliferation (2, 3).Various cell signaling pathways have been involved in thisregulation (4). In response to these signal transduction pathways,cyclin D1, p21Cip1, and p27Kip1 appear as the main G1 cell cycleregulators downstream of cell adhesion and can be considered asmolecular sensors of extracellular stimuli (5, 6). Both transcrip-tional and post-translational regulations of these proteins havebeen described in this context.The microenvironment of hematopoietic stem cells and progen-

itors plays a crucial role in the normal and leukemic hematopoiesisin the bone marrow. Stimulation by various cytokines and directinteraction with the ECM and with neighbor cells determinedifferentiation and proliferation cues at the progenitor cells levels(7). For instance, a4 integrins regulate the proliferation/differenti-ation balance of hematopoietic progenitors (8). However, thefunctional and molecular effect of integrin-dependent cell adhesionto ECM on proliferation has not been extensively investigated inthese cells. In normal human immature CD34+ cells, adhesion tofibronectin, a major component of the ECM in the bone marrow,inhibits cell proliferation (9, 10). Up-regulation of the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor p27Kip1 was correlated with thisinhibition. By contrast, this is apparently not the case in moremature (CD34�) cells adhered to fibronectin (11). In acute myeloidleukemia (AML) cells, the role of the adhesion to the ECM on cellproliferation remains unclear, although in one study the adhesion tofibronectin of AML cells from some patients was found to act insynergy with stem cell factor (SCF) to induce proliferation (12).CDC25A is a dual-specificity phosphatase mostly involved in the

G1-S transition of the cell cycle, although its implication in mitosishas also been recently described (13). Dephosphorylation of Thr14

and Tyr15 residues on CDK2 by CDC25A leads to the activation ofthe CDK2/cyclin E complex and participates to the G1-S-phasetransition. To this respect, CDC25A can be considered as a keyregulator of the G1 phase and as a potential sensor for extracellularstimuli. Still, major regulatory factors of this protein in response tomitogenic extracellular stimuli have not been extensively docu-mented. E2F-dependent transcriptional regulation of CDC25A wasreported and found necessary for efficient E2F-dependent S-phaseentry (14). In an other study, this transcriptional regulation by E2Fwas described as a serum-dependent mechanism (15). Transcrip-tional regulation of CDC25A by c-myc was also reported, althoughthe physiologic context of this process remains unclear (16, 17).In addition to transcriptional mechanisms, the CDC25A proteincan be subjected to proteolytic processing by the proteasome.Double-strand breaks induced on DNA by genotoxic compounds orby radiations lead to the checkpoint kinase Chk1 activation and

Requests for reprints: Stephane Manenti, Centre de Physiopathologie Toulouse-Purpan, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale U563-IFR30,Departement ‘‘Oncogenese et Signalisation dans les cellules hematopoıetiques,’’ CHUPurpan, BP3028, 31024 Toulouse Cedex 3, France. Phone: 33-562-74-45-24; Fax: 33-562-74-45-58; E-mail: [email protected].

I2006 American Association for Cancer Research.doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-2552

Cancer Res 2006; 66: (14). July 15, 2006 7128 www.aacrjournals.org

Research Article

subsequent CDC25A phosphorylation, triggering its degradationby the proteasome through a SCFh-TrCP-dependent mechanism( for a review, see ref. 18). Although this process was essentiallydescribed in response to genotoxic stress, recent studies suggestthat this ubiquitin-proteasome system could also be involved instress-independent CDC25A regulation during normal cell cycle(19). The question of how CDC25A levels are regulated seems ofoutstanding interest in cancer because overexpression of theprotein has been described in various cancer cell types. In thesestudies, post-translational mechanisms of regulation have beenfound involved in the stabilization of the protein (20).In this work, we investigated how cell adhesion to fibronectin

influences the proliferation of AML cells, and we established theimportance of CDC25A regulation in this context. In these malig-nant cells, adhesion to fibronectin up-regulates CDC25A expres-sion through regulation of its degradation, leading to increasedproliferation.

Materials and Methods

Cytokines, antibodies, and pharmacologic inhibitors. The phospha-tidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors LY294002 and wortmannin and the

mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor rapamycin were

purchased from Sigma (St. Louis, MO). The p38 mitogen-activated proteinkinase (MAPK) inhibitor SB203580 and the proteasome inhibitors MG132

and lactacystin were purchased from Calbiochem (La Jolla, CA). UCN-01 was

provided by the National Cancer Institute (Rockville, MD). SCF, interleukin

(IL)-3, Flt3 ligand (FL), and granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor (GM-CSF) were from R&D Systems (Minneapolis, MN). Antibodies

used were monoclonal anti-CDC25A, monoclonal anti–cyclin A, monoclonal

anti-Chk1, polyclonal anti-CDK2, and polyclonal anti-Akt1/Akt2 (SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Polyclonal anti-phospho-Ser473-Akt,

anti-phospho-p38, and anti-phospho-CDC2 were from Cell Signaling

(Beverly, MA). Actin monoclonal antibody (1:10,000) was from Sigma.

Cell lines and culture conditions. Leukemic immature KG1a and moremature U937 and HL-60 cell lines were purchased from the German

Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Germany)

and grown in Iscove’smodified Dulbecco’smedium (IMDM) plus 20%FCS and

RPMI plus 10% FCS, respectively, in the presence of 100 units/mL penicillin/100 Ag/mL streptomycin at 37jC and 5% CO2. Jurkat cells were purchased

from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures and grown

in RPMI plus 10% FCS. Normal bonemarrow CD34+ hematopoietic cells wereharvested from healthy volunteers upon informed consent after positive

selection of CD34-expressing cells by the means of immunomagnetic

separation column (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). The

purity of CD34+ cells reached 85% to 98% according to flow cytometryanalysis. Leukemic blasts from patients with newly diagnosed AML and

referred to the Toulouse Purpan University Hospital were obtained upon

informed consent from bone marrow aspirates by Ficoll-Hypaque density

gradient centrifugation. Frozen cells were thawed in EGM2 medium (ref. 21;Cambrex, Walkersville, MD) supplemented with SCF (100 ng/mL), IL-3

(5 ng/mL), FL (100 ng/mL), and GM-CSF (10 ng/mL). Cells were left at

1� 106/mL for 24 hours in these conditions during whichmoderate cell deathoccurred (10-40% of the cells depending of the patient). At that time, cells

were processed for the proliferation experiments described in Results.

Apoptotic cells were detected with the Annexin V-FITC detection kit from BD

PharMingen (San Diego, CA) used as recommended by the manufacturer.Fibronectin matrix preparation and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-

2,5-diphenyltetrazolium bromide proliferation assay. Six-well culturedishes were coated overnight at 4jC with 40 Ag/mL human fibronectin

(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) in a final volume of1 mL in PBS. Each well was rinsed twice with PBS before seeding the cells at

relevant concentration (usually 0.5 � 106/mL for proliferation conditions).

Quantification of living cells was quantified by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-

2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay (Sigma).

Differentiation of CD34+ normal progenitors in vitro . CD34+ cellswere cultured and differentiated in 12-well plates in IMDM plus 10% FCS

supplemented with SCF (100 ng/mL), IL-3 (5 ng/mL), FL (100 ng/mL), and

GM-CSF (10 ng/mL) for myelomonocytic differentiation. Cells were initially

seeded at 400,000/mL and diluted with fresh medium and cytokines every2 days. Expression of the differentiation markers (CD34, CD38, CD33, and

CD11b) was assessed by flow cytometry (200,000 cells used). For each time

point, 300,000 cells were used for Western blot analysis.

Transfection of small interfering RNA. Transfection experiments were

done using the Amaxa nucleofection technology protocols (Amaxa, Cologne,

Germany). U937 cells were grown until subconfluence (1 � 106/mL) and

6 � 106 cells were resuspended in 100 AL Amaxa solution V. Eight picomoles

of Chk1 small interfering RNA (siRNA; Qiagen, Valencia, CA), CDC25A

SMARTpool, Akt1 siRNA, or scramble siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO)

were added and cells were immediately transfected using the Amaxa

nucleofector device (program V-01 for U937 and C-16 for Jurkat cells).

For Akt, a second transfection was done in the same conditions 24 hours

after the first one to improve the siRNA efficiency. Cells were subsequently

resuspended in normal medium culture at 106/mL and processed after

8 (U937) or 24 ( Jurkat) hours for relevant experiments. Adhesion

experiments were usually done at 0.5 � 106 cells/mL in the presence of

1% FCS.Western blot analysis and immunoprecipitation. Cells (2 � 106) were

usually reduced in 75 AL Laemmli sample buffer, sonicated for 6 seconds,

and boiled for 3 minutes. Proteins were then resolved on SDS-PAGE and

transferred to nitrocellulose membrane (Hybond-C Super, AmershamPharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Saturation of the membrane was done

for 1 hour in TBS with Tween 0.05% (TBS-T) containing 5% nonfat milk.

Membranes were blotted with proper antibodies overnight at 4jC or for 1

hour at room temperature, washed thrice with TBS-T, and incubated for30 minutes with horseradish peroxidase–coupled secondary antibody (Cell

Signaling). After three additional washes, detection was achieved with

Pierce Supersignal chemiluminescent substrate (Pierce, Rockford, IL).Antibodies were used at the following dilutions: anti-CDC25A (1:200),

anti–cyclin A (1:1,000), anti-Chk1 (1:1,000), anti-Akt1/Akt2 (1:1,000), anti-

CDK2 (1:500), anti-phospho-Ser473-Akt (1:1,000), anti-phospho-Cdc2 (1:500),

anti-phospho-p38 (1:500), and anti-actin (1:10,000). Western blot quantifi-cations were done with the Gene Tools software from SynGene (Cambridge,

United Kingdom). For CDK2 immunoprecipitation experiments, 5 � 106

cells were lysed in 1 mL immunoprecipitation buffer [50 mmol/L Tris

(pH 8), 150 mmol/L NaCl, 3 mmol/L EGTA, 1% NP40, 50 mmol/L NaF,1 mmol/L sodium orthovanadate, 10 mmol/L h-glycerophosphate, proteaseinhibitors] and kept for 20 minutes on ice. After centrifugation at 14,000

rpm for 10 minutes at 4jC, the supernatant was incubated with 5 Ag ofthe anti-CDK2 antibody and 40 AL protein A-Sepharose overnight at 4jC.Following two washes with the immunoprecipitation buffer, the immuno-

precipitated material was resuspended in 60 AL Laemmli sample buffer,

boiled for 3 minutes, and analyzed by Western blot with the anti-Tyr15

phosphorylated CDC2 antibody (1:1,000), which also recognizes the Tyr15

phosphorylated form of CDK2.

Real-time PCR. Total RNA was extracted by guanidine isothiocyanate-

phenol-chloroform extraction ready-to-use TRIzol reagent (Invitrogen,Carlsbad, CA) according to the manufacturer. Extraction was done from

1 � 107 cells in 1 mL TRIzol solution. cDNA was generated from 5 Ag RNA,with the SuperScript reverse transcriptase from the SuperScript III First-

Strand Synthesis System for Reverse Transcription-PCR (RT-PCR; Invitro-gen) following the manufacturer’s suggestions. The PCR mixture containing

5 AL cDNA reactant and 0.5 Amol/L of each primer in a final volume of

25 AL prepared using the quantitative PCR Mastermix Plus SYBR Green I(Eurogentec, Seraing, Belgium). In negative controls, the reverse transcrip-

tase was replaced by H2O. The primer sequences were as follows: CDC25A

5¶-ACCGTCACTATGGACCAGC-3¶ (sense; 0.5 Amol/L) and 5¶-TTCA-GAGCTGGACTACATCC-3¶ (antisense; 0.5 Amol/L) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 5¶-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3¶(sense) and 5¶-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3¶ (antisense; 0.3 Amol/L).

To confirm product purity, melting curves were checked and in some cases

complemented by 1% agarose gel electrophoresis.

Cell Adhesion–Dependent Regulation of CDC25A

www.aacrjournals.org 7129 Cancer Res 2006; 66: (14). July 15, 2006

Bromodeoxyuridine incorporation assay. The S phase of the cell cyclewas assayed by measuring the incorporation of bromodeoxyuridine

(BrdUrd). Cells were pulse labeled with 10 Amol/L BrdUrd for 30 minutes,

washed with PBS, and fixed in cold 70% ethanol for 20 minutes. BrdUrd

detection was done by use of the BrdUrd staining kit from BD PharMingen(FITC-conjugated BrdUrd antibody set). The cells were then analyzed by

flow cytometry with a FACScan cytometer (Becton Dickinson, San Diego,

CA), and the percentage of cells synthesizing DNA was determined.

Results

Adhesion to fibronectin increases AML cell proliferation. Toestablish the effect of integrin-dependent adhesion on AML cellproliferation, U937 and KG1a cell lines were grown in suboptimal(1% FCS) conditions and maintained in suspension or adhered ona fibronectin matrix. Cells were counted daily by using a MTTcolorimetric method. The results of these experiments show thatafter 3 days cell adhesion to fibronectin significantly increased the

proliferation rate of both U937 and KG1a leukemic cells (Fig. 1A).Annexin V-FITC apoptosis detection experiments were done as acontrol, indicating no significant difference of apoptosis betweenadherent and nonadherent cells (data not shown). BrdUrd incor-poration experiments indicated an increase of 21.4 F 2% (twoexperiments) and 16.5 F 1.8% (three experiments) in S-phase entryof U937 and KG1a cells, respectively, on adhesion to fibronectin. Toconfirm this higher proliferation rate at the molecular level, wechecked the expression of cyclin A, which is considered as abiochemical marker of the S-phase entry during the cell cycle. Ascan be seen in Fig. 1A (insets), cyclin A expression was significantlyincreased (1.9- and 2.7-fold in U937 and KG1a, respectively) whencells were adhered to fibronectin for 14 hours, consistent with thepositive effect of cell adhesion on proliferation.To confirm these data, we did similar experiments with AML

blasts from patients. Four patients with an immature phenotype(CD34+, M1) were used for this experiment (see results in Fig. 2 forjustification). Cells were thawed in EGM2 medium in the presenceof SCF, GM-CSF, IL-3, and FL, placed on a fibronectin matrix or leftin suspension, and counted every 48 hours. As can be seen in Fig.1B , AML blasts from three of these patients showed increasedproliferation when adhered to fibronectin, confirming the dataobtained with the established cell lines. Altogether, these datashow that cell adhesion to fibronectin increases the proliferationof AML cells.Adhesion to fibronectin differently affects the proliferation

of normal hematopoietic cells depending on their maturationstate. To establish whether the above-mentioned adhesion-dependent proliferation increase was specific of AML cells, wechecked the effect of cell adhesion on the proliferation of normalhematopoietic progenitors from healthy donors. For this purpose,CD34+ normal hematopoietic cells were grown for 2 weeks incytokine-supplemented medium conditions, allowing their differ-entiation along with the myelomonocytic pathway. This matura-tion process was conducted either in suspension or in adhesionconditions on fibronectin. The proliferation rate and the differen-tiation state were monitored every 2 days by direct countingof the living cells and by fluorescence-activated cell sorting (FACS)analysis, respectively. The results of these experiments indicatethat proliferation of immature CD34+ cells is inhibited on bindingto the fibronectin matrix (Fig. 2, top). By contrast, adhesion tofibronectin of more mature CD34� cells stimulated their prolifera-tion (Fig. 2, bottom). These data suggest that the effect ofintegrin-dependent adhesion on cell proliferation depends on thedifferentiation stage of normal hematopoietic cells. They also pointto an opposite behavior of normal and leukemic (see results withKG1a cell line and blasts from patients in Fig. 1) immature CD34+

cells in terms of adhesion-dependent cell proliferation.Adhesion to fibronectin up-regulates CDC25A protein level

in AML cells. Cyclin D1, p27Kip1, and p21Cip1 are key cell cycleregulators involved in extracellular signals integration during theG1 phase of the cell cycle. To investigate the mechanisms of thisanchorage-dependent proliferation increase, we checked theexpression of these proteins by Western blot. In the experimentalconditions used for proliferation studies, we did not observe anysignificant modification of the cellular expression levels for theseproteins (data not shown). By contrast, we observed a dramaticincrease of the dual-specificity phosphatase CDC25A, an otherimportant player of the G1-S transition (Fig. 3A). This process wasobserved in the two previously described AML cell lines U937 andKG1a but also in the myeloblastic CD34� HL-60 cell line. These

Figure 1. Adhesion to fibronectin increases the proliferation rate of AML cells.A, U937 and KG1a cell lines were grown in the presence of 1% and 10%FCS, respectively, in normal suspension conditions (Sp ; gray columns ) or inthe presence of a fibronectin matrix (Adh ; white columns ). Viable cells werecounted daily by the MTT method. The day 3/day 0 ratio was calculated from thecorresponding absorbance values. Columns, mean of four independentexperiments done in triplicate; bars, SD. **, P < 0.01; ***, P < 0.001, comparedwith suspension conditions. U937 and KG1a cells were left in suspension oradherent for 14 hours, and cyclin A expression was analyzed by Western blotafter that time. Densitometric quantification of the Western blot signal was done,and the ratio between the CDC25A and the corresponding actin value wasindicated for each fraction. B, AML blasts from patients were processed asdescribed in Materials and Methods and used for proliferation experiment. Thenumber of cells was counted each 48 hours, and the proliferation rate wascalculated as in (A) and compared in the suspension (gray columns ) andadhesion (white columns ) culture conditions. Except for patient 1, in which cellsunderwent proliferation at day 1, proliferation between days 3 and 5 is shownfor the other three patients.

Cancer Research


results suggest for the first time the existence of an adhesion-dependent regulation of CDC25A expression.We then tested the effect of cell adhesion onCDC25A expression in

blasts frompatientswith immature CD34+ andM1 phenotype. As canbe seen in Fig. 3B , blasts from patients 2 and 3 showed increasedCDC25A expressionwhen adhered to fibronectin, in good correlationwith the proliferation experiments (see Fig. 1). Blasts from a thirdpatient (patient 5), not tested for proliferation, also showed CDC25Aexpression increase in adhesive conditions. CDC25A level wasfound unchanged in patients 1 and 4 (data not shown). These dataobtained with blasts from patients confirm that CDC25A protein isup-regulated in AML cells following adhesion to fibronectin.We then examined this regulation process in normal hemato-

poietic cells. As shown in Fig. 3C , CDC25A expression was high inCD34+ immature cells and dramatically reduced on adhesion tofibronectin. By contrast, the expression level of this protein waslower in more differentiated CD34� cells and significantlyincreased by the adhesion to fibronectin. These data suggest that(a) CDC25A protein level is regulated along the hematopoieticdifferentiation process and that cell interaction with the ECM maydifferently affect this expression and (b) up-regulation of CDC25Aon adhesion is not maturation restricted in AML as opposed totheir normal counterparts.We finally tested the adhesion-dependent regulation of CDC25A

in other hematologic malignancies. Jurkat cells, the Karpas largecell anaplastic lymphoma cell line, the ES mantle lymphoma cellline, and the follicular lymphoma RL and Karpas 422 cell lines weretested to this respect. As shown in Fig. 3D , the effect of cell

adhesion on CDC25A protein level is clearly different from onecell type to the other. On adhesion to fibronectin, CDC25Aincreased in Jurkat and RL cells, decreased in Karpas 422 cells, andremained low and apparently unchanged in Karpas and ES cells.These data indicate that adhesion-dependent regulation ofCDC25A is not restricted to AML cells and they confirm that thisregulation may lead to opposite effects on CDC25A level.CDC25A accumulation is involved in adhesion-dependent

proliferation. We then addressed the question of the functionalrelationship between adhesion-dependent CDC25A expression andincreased cell proliferation. To this purpose, we down-regulatedCDC25A expression in U937 cells by a siRNA strategy and checkedthe adhesion-dependent cyclin A expression by Western blot. Asobserved in Fig. 4A , a moderate siRNA-induced down-regulationof CDC25A significantly decreased the cyclin A protein level inadherent cells. These data suggest that modifications of CDC25A

Figure 2. Adhesion to fibronectin inhibits or stimulates the proliferation ofnormal hematopoietic cells depending on their maturation state. Adherent(white columns ) or suspension (gray columns ) normal hematopoietic CD34+

cells were differentiated in vitro as described in Materials and Methods. Theproliferation was compared at two different stages (CD34+ and CD34�) of thedifferentiation process. Results from two independent donors (donors 1 and 2).The cell number 3 days after seeding was compared for the adhesion andsuspension conditions. Results are expressed in cell number/mL. For donor 1,the proliferation experiments were done between days 3 and 5 and days 10 and12 for CD34+ and CD34� cells, respectively. For donor 2, proliferations weredone between days 1 and 3 and days 8 and 10, respectively. This correspondedto similar stages of differentiation for the two donors as judged by FACSanalysis of cell surface markers (data not shown).

Figure 3. CDC25A phosphatase expression is regulated by cell adhesion tofibronectin. A, AML cell lines were either adhered to fibronectin for 14 hours orleft in suspension for the same time. CDC25A level was then visualized byWestern blot. Membranes were then stripped and blotted again with an antibodyagainst actin. B, blasts from patients were cultured on fibronectin or left insuspension for 14 hours and then processed for Western blotting analysis. In allcases, densitometric quantification of the Western blot signal was done, andthe ratio between the CDC25A and the corresponding actin value was indicatedfor each fraction. C, normal hematopoietic CD34+ cells were subjected to adifferentiation process in vitro as described before. At day 0 (CD34+ status) andday 7 (CD34� status), cells were collected and adhered to fibronectin matrixor left in suspension for 14 hours. CDC25A expression was then detected byWestern blot analysis on the corresponding cellular extracts. These resultswere reproduced in at least three independent experiments for each cell lineand twice for the primary cells. D, five cell lines, from various hematologicmalignancies, were tested by Western blotting for CDC25A expression insuspension and adhesion conditions. Representative of two independentexperiments. ALL, acute lymphoblastic leukemia; ML, mantle lymphoma;FL, follicular lymphoma; Ana.L, anaplastic lymphoma.



expression drive the augmentation of proliferation triggered by celladhesion to fibronectin.To reinforce these observations, we made use of BN82685, a

recently described CDC25 pharmacologic inhibitor (22). Becausewe address a question concerning the G1-S transition, we reasonedthat in our experimental conditions the effect of this inhibitorshould essentially concern the CDC25A phosphatase and notCDC25B or CDC25C, although these two isoforms are also inhibitedin these conditions. When U937 cells were adhered to fibronectin inthe presence of this inhibitor, we observed that cyclin Aaccumulation was impaired, in good correlation with the siRNAexperiments (Fig. 4B). Altogether, these data show that CDC25Aup-regulation is involved in the adhesion-dependent proliferationincrease of AML cells. To confirm the effect of BN82685 on CDK2activity, we did an immunoprecipitation of CDK2 from control andBN82685-treated cells and detected the inactive form of the kinaseby Western blot with an antibody recognizing Tyr15-phosphorylatedCDK2. As shown in Fig. 4C , BN82685 indeed increased theinhibitory phosphorylation state of CDK2 in these experiments.Cell type–dependent variations of CDC25A mRNA on

adhesion to fibronectin. To establish if transcriptional activationcould control the CDC25A protein accumulation, we comparedCDC25A mRNA levels in adherent and nonadherent AML cells.Quantitative RT-PCR was done for this purpose. GAPDH mRNAlevels were used to normalize the measured values, and the results

were expressed in fold increase between adhesion and suspensionconditions (Fig. 5). The results of these experiments indicatealmost no variation of CDC25A mRNA in U937 and HL-60 cell lines(1.6 and 1.4, respectively) and a moderate increase in KG1aadherent cells (4.5). These data suggest that transcriptionalincrease and/or mRNA stabilization are probably not involved inCDC25A protein accumulation in U937 and HL-60 cell lines,although they possibly participate to this regulation in KG1a cells.In consequence, they also suggest some cell type–dependentvariations of this regulation.Involvement of Chk1 and proteasomal degradation in

CDC25A turnover. We then investigated whether the previouslydescribed post-translational regulation of CDC25A was involved inthe accumulation of this protein on adhesion. We focused ourattention on proteasomal degradation of the protein and on thepotential role of the checkpoint kinase Chk1 in this process. WhenAML cell lines were incubated with the proteasome inhibitorMG132 for 5 hours in growing culture conditions, an accumulationof CDC25A protein was observed in each cell line (Fig. 6A). WhenU937 cells were transfected with Chk1 siRNA, leading to majordown-regulation of this protein, a significant increase of CDC25Aexpression was also observed (Fig. 6B). Altogether, these datasuggest that phosphorylation by Chk1 and subsequent proteasomaldegradation are key regulators of CDC25A protein in the absence ofgenotoxic stress in these cells. To confirm a role for Chk1 in theadhesion-dependent regulation of CDC25A, adherent U937 andKG1a cells were removed from the fibronectin matrix with EDTA inthe presence of the Chk1 inhibitor UCN-01. First, removing the cellsfrom the fibronectin matrix with EDTA induced rapid down-regulation of the CDC25A protein, indicating that the adhesion-dependent accumulation process was quickly reversible. As can beseen in Fig. 6C , the presence of UCN-01 impaired this CDC25Adown-regulation, suggesting that Chk1 is actually involved in theadhesion-dependent regulation of the phosphatase. We thenquestioned the involvement of proteasome regulation in adhe-sion-dependent CDC25A increase. To this aim, the same experi-ment as in Fig. 6C was conducted in the presence of proteasomeinhibitors instead of UCN-01. The results of these experiments arepresented in Fig. 6D . The presence of proteasome inhibitorscompletely or partially inhibited this down-regulation dependingon the cell type and on the pharmacologic inhibitor used.Altogether, these data suggest that Chk1 and the proteasomemachinery are actually involved in the anchorage-dependentCDC25A regulation.

Figure 4. CDC25A regulates adhesion-dependent proliferation of AML cells.A, U937 cells were transfected by scramble (control; scr) or CDC25A siRNAusing the Amaxa nucleofection device. After 8 hours, cells were either adhered tofibronectin or left in suspension for 14 additional hours. CDC25A and cyclin Aproteins levels were then detected by Western blot in the corresponding cellularextracts. Representative of three independent experiments. B, U937 cellswere adhered or left in suspension for 14 hours in the presence (+) or absence(�) of the CDC25 inhibitor BN82685 (100 nmol/L). Western blot analysis of thecyclin A protein was then done. These experiments were done twice. In all cases,densitometric quantification of the Western blot signal was done, and the ratiobetween the CDC25A and the corresponding actin value was indicated for eachfraction. C, cells were treated with BN82685 (300 nmol/L) for 4 hours andthen processed for immunoprecipitation of CDK2 as described in Materials andMethods. The inactive form of CDK2 was then detected by Western blot withan anti-phospho-Tyr15 antibody, and total immunoprecipitated CDK2 wasdetected with the antibody used for the immunoprecipitation.

Figure 5. RT-PCR analysis of CDC25A expression in adhesion andsuspension conditions. Total mRNA was prepared from adherent (14 hours) andnonadherent cells and quantitative RT-PCR was done to quantify CDC25AmRNA as described in Materials and Methods. The ratio for adherent versussuspension cells from the three cell lines was then deduced and plotted.Columns, mean of three independent experiments done in triplicate; bars, SD.

Cancer Research


PI3K/mTOR pathway is involved in adhesion-dependentCDC25A regulation. Because the p38 MAPK pathway was recentlyinvolved in CDC25A protein expression in T lymphocytes, weinvestigated p38 involvement in U937 and KG1a cell proliferationin suspension and adhesion conditions. The p38 inhibitor SB203580did not affect CDC25A levels in any of the conditions or cell linestested, suggesting that p38 MAPK is not a major regulator ofCDC25A expression in AML (data not shown).A few reports from the literature suggest that the PI3K/mTOR

pathway can regulate CDC25A level in certain conditions (23, 24).Therefore, we tested the effect of PI3K and mTOR inhibitors onanchorage-dependent CDC25A accumulation. First, we checked theeffect of cell adhesion on the activity of the PI3K pathway. For thispurpose, U937 were adhered to fibronectin for different times, andthe phosphorylation state of protein kinase B (PKB)/Akt wasdetected by Western blot. As shown in Fig. 7A , rapid and sustainedactivation of this pathway was observed on adhesion of U937 cellsto fibronectin. Interestingly, this adhesion-dependent activation ofPKB/Akt was also observed in AML primary cells from patients(Fig. 7B). As shown in Fig. 7C and D , the PI3K inhibitors LY294002and wortmannin and the mTOR-specific inhibitor rapamycin

strongly impaired the adhesion-dependent CDC25A up-regulation,suggesting the participation of this pathway in this process. Tofurther show the involvement of the PI3K pathway in CDC25Aregulation, we aimed to perform siRNA-dependent Akt down-regulation. Due to technical difficulties to use the U937 cells for thispurpose, we used the Jurkat cell line found previously (see Fig. 3) toregulate CDC25A level through an adhesion-dependent mecha-nism. BrdUrd incorporation experiments done with this cell lineshowed increased DNA synthesis (17.7 F 2.5%) on cell adhesion tofibronectin. We then verified that the PI3K inhibitors LY294002and wortmannin impaired the CDC25A protein level in this celltype (Fig. 8A ). In good agreement, siRNA-mediated down-regulation of the Akt protein led to reduced expression of CDC25Ain adherent cells (Fig. 8B) despite incomplete (50%) down-regulation of Akt protein in the conditions used. Altogether, thesedata suggest that interaction with fibronectin activates the PI3K/Akt/mTOR pathway, which participates to CDC25A up-regulationin these conditions.

Discussion

In this work, we show that adhesion to fibronectin stimulates theproliferation of AML cell lines. This question had not beenextensively addressed until now, although the proliferation stateof leukemic cells in the bone marrow may be of outstanding

Figure 7. PI3K pathway regulates adhesion-dependent CDC25A proteinaccumulation. A, U937 cells were adhered to fibronectin for different times or leftin suspension, and CDC25A expression and Akt/PKB Ser473 phosphorylationstate (P-Akt ) were probed by Western blot. B, blasts from AML patients were leftin suspension or adhered to fibronectin for 14 hours, and Akt/PKB Ser473

phosphorylation and Akt protein level were then probed by Western blot analysis.C, U937 cells were adhered to fibronectin for 14 hours in the absence (C ) orpresence of the PI3K inhibitors LY294002 at 10 (LY10 ) or 20 (LY20 ) Amol/L orwortmannin at 50 (W50 ) or 100 (W100 ) nmol/L. CDC25A expression and Akt/PKB Ser473 phosphorylation state were then probed by Western blot.Representative of four independent experiments. D, U937 cells were left insuspension conditions or adhered to fibronectin in the absence or presence ofthe mTOR inhibitor rapamycin (Rap ; 10 nmol/L). Western blot analysis ofCDC25A expression was then done. Representative of two independentexperiments.

Figure 6. Proteasome- and Chk1-dependent regulation of CDC25A in AMLcells. A, U937, HL-60, and KG1a cells were incubated with the proteasomeinhibitor MG132 (MG ; 5 Amol/L) for 5 hours. CDC25A level was then detectedby Western blot. B, U937 cells were transfected with scramble or Chk1 siRNAwith the Amaxa nucleofection system. After 24 hours, cell extracts were preparedand Chk1 and CDC25A expression was detected by Western blot. C, U937and KG1a cells were adhered to fibronectin for 14 hours, removed from thefibronectin matrix with EDTA (ReSp ), and left in suspension conditions in thepresence of UCN-01 (UCN ; 100 nmol/L) or with DMSO. D, as in (C ), U937,HL-60, and KG1a cells were adhered to fibronectin for 14 hours, removed fromthe fibronectin matrix with EDTA, and left in suspension conditions in thepresence of the proteasome inhibitors MG132 (5 Amol/L) and lactacystin (Lac ;5 Amol/L) or with DMSO (C ). Western blot analysis of the corresponding cellularfractions was then done to follow CDC25A expression. Representative data ofat least two independent experiments done from each cell line. In all cases,densitometric quantification of the Western blot signal was done, and the ratiobetween the CDC25A and the corresponding actin value was indicated foreach fraction.



importance for their response to therapeutic drugs and/or relapseof the disease. A synergistic effect of cell adhesion on SCF-mediatedAML cell proliferation has been already reported in some cases ofleukemic blasts from patients (12). Our experiments done onestablished cell lines and blasts from patients further reinforcethese data and suggest that blast adhesion to fibronectin in thebone marrow may be a key variable amplifying the abnormalexpansion of the leukemic clone. Of special interest are the resultsobtained with normal immature (CD34+) cells. Adhesion onto afibronectin matrix inhibits their proliferation as already reportedby others (9, 10). One of the important observations is that thisphenotype apparently disappears along with the myeloid differen-tiation process and mirrors the kinetics of CD34 antigenexpression. Indeed, a more mature phenotype corresponding toCD34� committed precursors showed accelerated proliferation onadhesion to fibronectin. Conversely, the maturation state, asassessed by French-American-British classification, does not seemanymore as a critical factor for the adhesion-dependent prolifer-ation of leukemic cells, because both immature (CD34+) AML cells(KG1a cell line and blasts from patients) and U937, a more maturemyelomonocytic (CD34�) cell line, showed increased anchorage-dependent proliferation. The opposite effects on proliferationtriggered by adhesion observed between normal and leukemicCD34+ cells suggest that modifications of the proliferative responseto cell adhesion could be a critical step occurring during theleukemogenic process. Experiments are presently being done in ourlaboratory to answer this question.An other important observation is that CDC25A expression was

dramatically dependent on the adhesive status of the cells. To ourknowledge, this is the first report of an integrin-dependentregulation of CDC25A. As a general matter, there are not manyreports of extracellular signal-dependent variations of CDC25Aprotein level in the literature. Serum- and E2F-dependent increase

of CDC25A mRNA has been described, but the status of the proteinwas poorly documented in these studies (14, 15). Furthermore, ourquantitative RT-PCR analysis of CDC25A mRNA does not argue fora major transcriptional regulation of the protein in our system.Our data are more in favor of post-translational regulation(s) ofthe protein by the proteasome as suggested by the experimentsdone with pharmacologic inhibitors of this machinery. However,the 4.5-fold increase of CDC25A mRNA in KG1a cells on adhesionmay suggest that transcriptional or mRNA stability regulationsare active in certain cell types. Further experiments are needed toconfirm these hypotheses. One of the important questions ensuingfrom our data is the cell specificity of this adhesion-dependentCDC25A regulation. The experiments done with other hematologicmalignancies suggest that this regulation is not specific of AMLcells. Although we did not perform proliferation experimentswith these different cell lines, one may notice that increasedproliferation of Jurkat cells has been described in response tocell adhesion (see ref. 25), in good agreement with the CDC25Aaccumulation observed in these cells (see Fig. 3) and with theincreased BrdUrd incorporation that we observed on cell adhesion.Finally, although preliminary experiments from our laboratoryindicate that nonhematopoietic cell lines (HeLa and HEK293) donot significantly change their CDC25A expression on cellanchorage removal, we cannot rule out the existence of thisregulation in such cell types.Our data also suggest the involvement of the PI3K pathway and

of the Chk1 kinase in the adhesion-dependent regulation ofCDC25A. We did not detect any adhesion-regulated modulation ofChk1 activity by Western blot with an anti-phospho-Ser345 antibody(data not shown). This does not rule out the existence of someother type(s) of regulation not detectable by this approach.Interestingly, recent publications describe the phosphorylation ofChk1 by Akt and the subsequent inactivation of the kinase bycytoplasmic sequestration following monoubiquitination (26, 27).This hypothesis would nicely fit with our observations. Indeed, cellanchorage triggers Akt activation in our system and PI3K inhibitionimpairs the adhesion-dependent CDC25A up-regulation. Interest-ingly, a few data from the literature already ascribed a role for thePTEN/PI3K (23) and/or mTOR (24) pathways in CDC25A proteinaccumulation. Furthermore, the PI3K/Akt/mTOR pathway iscurrently deregulated in AML cells from patients (28), and werecently described the mTOR kinase as an interesting therapeutictarget in these pathologies (29). Whether an integrin/PI3K/Akt/Chk1 pathway regulates CDC25A expression in AML cells iscurrently under study in our laboratory.As indicated in Results, a recent work (30) described a major role

for CDC25A in the proliferation of lymphocytes. Theses authorsdescribed a direct phosphorylation of CDC25A by the p38 MAPKpathway in cytokine-starved lymphocytes and the subsequentdown-regulation of the phosphatase. Although we observed someregulation of the p38 MAPK activity on cell adhesion in KG1a cells,this pathway is apparently not involved in the adhesion-dependentCDC25A regulation. This discrepancy argues for different mecha-nisms of CDC25A regulation downstream of various mitogenicsignals (growth factors, cell adhesion, etc.) and/or a cell type–dependent regulation of the phosphatase.Our data argue for the involvement of CDC25A in the adhesion-

dependent proliferation increase of AML cells. Whether cell adhe-sion to the ECM participates to the leukemogenic proliferationin vivo remains to be established, but if this was the case this wouldmake of CDC25A an interesting therapeutic target for these

Figure 8. PKB/Akt down-regulation affects CDC25A level in Jurkat cells.A, Jurkat cells were left in suspension or adhered to fibronectin for 14 hours inthe absence (Cont ) or the presence of LY294002 (LY ; 20 Amol/L) or wortmannin(Wort. ; 100 nmol/L). CDC25A expression, Akt protein level, and Akt/PKBSer473 phosphorylation state were then probed by Western blot. Representativeof three experiments. B, Jurkat cells were transfected with scramble (Scr ) orAkt siRNA as described in Materials and Methods and then adhered tofibronectin for 14 hours. Akt and CDC25A expression was then probed byWestern blot analysis. Representative of two independent experiments.

Cancer Research


pathologies. Of outstanding interest is the fact that the expressionof this protein seems regulated during the normal hematopoieticprocess and permanently under the positive (mature progenitors)or negative (immature progenitors) control of integrin functions.

Acknowledgments

Received 7/20/2005; revised 4/19/2006; accepted 5/19/2006.

Grant support: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale,Association Laurette Fugain grant R05027BB, and Association pour la Recherche sur leCancer grant 3638.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of pagecharges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordancewith 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

We thank Pierre Cavailles and Marie-Michele Duplantier for helpful expertise anddiscussions on real-time quantitative PCR, Martin Carroll for helpful discussionsabout the culture of blasts from patients, Christine Bezombes for providing us withlymphoblastic cell lines, and the Division of Cancer Treatment and Diagnosis, NationalCancer Institute, for providing us with UCN-01.

References1. Danen E, Yamada K. Fibronectin, integrins and growthcontrol. J Cell Physiol 2001;189:1–13.2. Meredith J, Takada Y, Fornaro M, Languino LR, SchwartzMA. Inhibition of cell cycle progression by the alterna-tively spliced integrin h1C. Science 1995;269:1570–2.3. Fornaro M, Steger CA, Bennett AM, Wu JJ, Languino L.Differential role of h1C and h1A integrin cytoplasmicvariants in modulating focal adhesion kinase, proteinkinase B/AKT, and Ras/mitogen-activated proteinkinase pathways. Mol Biol Cell 2000;11:2235–49.4. Lee JW, Juliano R. Mitogenic signal transduction byintegrin and growth factor receptor-mediated pathways.Mol Cells 2004;17:188–202.5. Assoian R. Anchorage-dependent cell cycle progres-sion. J Cell Biol 1997;136:1–4.6. Assoian RK, Schwartz MA. Coordinate signaling by inte-grins and receptor tyrosine kinases in the regulation ofG1 phase cell-cycle progression. Genes Dev 2001;11:48–53.7. Verfaillie C. Adhesion receptors as regulator ofhematopoietic process. Blood 1998;92:2609–12.8. Arroyo AG, Yang JT, Rayburn H, Hynes RO. a4 Integrinsregulate the proliferation/differentiation balance ofmultilineage hematopoietic progenitors in vivo . Immu-nity 1999;11:555–66.9. Hurley RW, McCarthy JB, Verfaillie CN. Directadhesion to bone marrow stroma via fibronectinreceptors inhibits hematopoietic progenitor prolifera-tion. J Clin Invest 1995;96:511–9.10. Jiang Y, Prosper F, Verfaillie CM. Opposing effects ofengagement of integrins and stimulation of cytokinereceptors on cell cycle progression of normal humanhematopoietic progenitors. Blood 2000;95:846–54.11. Dylla SJ, Deyle DM, Theunissen K, Padurean AM,Verfaillie CM. Integrin engagement-induced inhibition

of human myelopoiesis is mediated by proline-richtyrosine kinase 2 gene products. Exp Hematol 2004;32:365–74.12. Bendall LJ, Makrynikola V, Hutchinson A, Bianchi AC,Bradstock KF, Gottlieb DJ. Stem cell factor enhances theadhesion of AML cells to fibronectin and augmentsfibronectin-mediated anti-apoptotic and proliferativesignals. Leukemia 1998;12:1375–82.13. Mailand N, Podtelejnikov AV, Groth A, Mann M,Bartek J, Lukas J. Regulation of G2-M events by CDC25Athrough phosphorylation-dependent modulation of itsstability. EMBO J 2002;21:5911–20.14. Vigo E, Muller H, Prosperini E, et al. CDC25A phos-phatase is a target of E2F and is required for efficientE2F-induced S phase. Mol Cell Biol 1999;19:6379–95.15. Chen X, Prywes R. Serum-induced expression of theCDC25A gene by relief of E2F-mediated repression. MolCell Biol 1999;19:4695–702.16. Galaktionov K, Chen X, Beach D. CDC25A cell-cyclephosphatase as a target of c-myc. Nature 1996;382:511–7.17. Barre B, Vigneron A, Coqueret O. The STAT3transcription factor is a target for the Myc andretinoblastoma proteins on the CDC25A promoter.J Biol Chem 2005;280:15673–81.18. Busino L, Chiesa M, Draetta GF, Donzelli M. CDC25Aphosphatase: combinatorial phosphorylation, ubiquity-lation and proteolysis. Oncogene 2004;23:2050–6.19. Sorensen CS, Syljuasen RG, Bartek J, Lukas J. ATR,Claspin and the Rad9-1-Hus1 complex regulate Chk1and CDC25A in the absence of DNA damage. Cell Cycle2004;3:e35–9.20. Loffler H, Syljuasen RG, Bartkova J, Worm J, Bartek J,Lukas J. Distinct mode of deregulation of the proto-oncogenic CDC25A phosphatase in human breastcancer cell lines. Oncogene 2003;22:8063–71.

21. Xu Q, Thompson JE, Carroll M. mTOR regulates cellsurvival after etoposide treatment in primary AML cells.Blood 2005;106:4261–8.22. Brezak MC, Quaranta M, Contour-Galcera MO, et al.Inhibition of human tumor cell growth in vivo by anorally bioavailable inhibitor of CDC25 phosphatases.Mol Cancer Ther 2005;4:1378–87.23. Seminario MC, Precht P, Wersto RP, et al. PTENexpression in PTEN-null leukaemic T cell lines leads toreduced proliferation via slowed cell cycle progression.Oncogene 2003;22:8195–204.24. Gao N, Flynn DN, Zhang Z, et al. G1 cell cycleprogression and the expression of G1 cyclins areregulated by PI3K/Akt/mTOR/p70S6K1 signaling inhuman ovarian cancer cells. Am J Physiol Cell Physiol2004;287:C281–91.25. Iwata S, Ohashi Y, Kamiguchi K, Morimoto C. h1-Integrin-mediated cell signaling in T lymphocytes.J Dermatol Sci 2000;23:75–86.26. Puc J, Keniry M, Li HS, et al. Lack of PTEN sequestersChk1 and initiates genetic instability. Cancer Cell 2005;7:193–204.27. Puc J, Parsons R. PTEN loss inhibits CHK1 to causedouble stranded-DNA breaks in cells. Cell Cycle 2005;4:e71–3.28. Min YH, Eom JI, Cheong JW, et al. Constitutivephosphorylation of Akt/PKB protein in acute myeloidleukemia: its significance as a prognostic variable.Leukemia 2003;17:995–7.29. Recher C, Beyne-Rauzy O, Demur C, et al. Antileu-kemic activity of rapamycin in acute myeloid leukemia.Blood 2005;105:2527–34.30. Khaled A, Bulavin D, Kittipatarin C, et al. Cytokine-driven cell cycling is mediated through CDC25A. J CellBiol 2005;169:755–63.



ORIGINAL ARTICLE

Expression of b-catenin by acute myeloid leukemia cells predicts enhanced clonogeniccapacities and poor prognosis

L Ysebaert1,2, G Chicanne1, C Demur1,3, F De Toni1, N Prade-Houdellier1, J-B Ruidavets4, V Mansat-De Mas1,3, F Rigal-Huguet2,G Laurent1,2, B Payrastre1, S Manenti1 and C Racaud-Sultan1

1INSERM U563, Centre de Physiopathologie Toulouse Purpan (CPTP), Departement Oncogenese et Signalisation dans les cellulesHematopoıetiques, CHU Purpan, Toulouse Cedex, France; 2Service d’Hematologie clinique, CHU Purpan, Toulouse, France;3Service d’Hematologie biologique, CHU Purpan, Toulouse, France and 4INSERM U558, Faculte de Medecine de Toulouse,Toulouse, France

Activation of the Wnt/b-catenin pathway has recently beenshown to be crucial to the establishment of leukemic stem cellsin chronic myeloid leukemia. We sought to determine whetherb-catenin was correlated to clonogenic capacity also in theacute myeloid leukemia (AML) setting. Eighty-two patients wereretrospectively evaluated for b-catenin expression by Westernblot. b-Catenin was expressed (although at various proteinlevels) in 61% of patients, and was undetectable in theremaining cases. In our cohort, b-catenin expression wascorrelated with the clonogenic proliferation of AML-colonyforming cells (AML-CFC or CFU-L) in methylcellulose in thepresence of 5637-conditioned medium, and more strikingly withself-renewing of leukemic cells, as assessed in vitro by a re-plating assay. In survival analyses, b-catenin appeared as a newindependent prognostic factor predicting poor event-freesurvival and shortened overall survival (both with Po0.05).Furthermore, variations in b-catenin protein levels were depen-dent on post-transcriptional mechanisms involving the Wnt/b-catenin pathway only in leukemic cells. Indeed, b-cateninnegative leukemic cells were found to increase b-catenin inresponse to Wnt3a agonist in contrast to normal counterparts.Altogether, our data pave the way to the evaluation of Wnt path-way inhibition as a new rationale for eradicating the clonogenicpool of AML cells.Leukemia (2006) 20, 1211–1216. doi:10.1038/sj.leu.2404239;published online 11 May 2006Keywords: Wnt; b-catenin; acute myeloid leukemia; prognosis;clonogenicity; CFU-L

Introduction

Wnt/b-catenin signaling is a morphogenic pathway that governsearly embryo patterning and organogenesis in embryo develop-ment. Its implication in the self-renewal of normal adult stemcells raised major interest in the fields of regenerative medicineand cancer.1–3 As b-catenin, the main effector of the canonicalWnt pathway, was linked to clonogenic growth of variousmalignancies,4–5 we asked whether it could also influenceleukemic colony forming cells (CFU-L). These rare progenitorssupport self-renewal (in the minority) or limited differentiation(in the bulk of the disease) of acute myeloid leukemia (AML)blasts. The frequency of relapse in AML is thought to be due tothe lack of eradication of the self-renewing part of AML cells, theso-called leukemic stem cells pool. In vitro assessment of

different growth patterns in AML cells have emerged from somepioneer studies,6,7 but the ability to form colonies in methyl-cellulose allowed to gain more insight into the definition of trueCFU-L. Later, these preliminary findings were confirmed byclassifying CFU-L based on autonomous growth or dependancyupon addition of exogenous growth factors.8

Wnt pathway controls self-renewal of hematopoietic stemcells (HSC) through regulation of b-catenin.9–11 In HSC,b-catenin also modulates survival and growth factor responseboth in vitro and in vivo, while inhibiting differentiation.11–14 Theimportance of b-catenin in the maintenance of the HSC poolechoes in many hematological malignancies of lymphoid ormyeloid origin.15–21 As clonogenic test of AML cells at diagnosisare routinely performed in our lab for newly diagnosed patients,we tried to identify b-catenin expression in unsorted bulk cells toknow whether it could correlate with enhanced clonogenicproperties. We also studied the influence of Wnt stimulation inthe accumulation of b-catenin in normal CD34þ or leukemiccells and along myelomonocytic maturation induced in vitro.

We confirm that Wnt signaling is deregulated in AML asassessed by b-catenin expression (which is rapidly lost uponinduction of differentiation in normal precursors), and iscorrelated to enhanced clonogenic proliferation of CFU-L.Moreover, b-catenin expression appears as a new prognosticfactor independently correlated with relapse and shortersurvival. Finally, the Wnt pathway could be regulated in AML,thus suggesting a different responsiveness to Wnt agonists ofAML comparatively to normal counterparts.

Materials and methods

Primary cells and cell linesLeukemic blasts from randomly selected 82 patients with newlydiagnosed AML, were obtained upon informed consent frombone marrow aspirates by Ficoll-Hypaque density gradientcentrifugation. This technique ensures high blastic cells percen-tages (median 92% of leukemic cells in the samples). Cells wereeither immediately processed or cryopreserved in Iscove’smodified Dulbecco medium (IMDM) with 10% dimethylsulfox-yde and 50% fetal calf serum (FCS) for further handling. Allpatients received induction therapy (anthracycline days 1–5 andcytosine arabinoside continuously infused days 1–7), furtherconsolidation therapy being given accordingly to Frenchcooperative trials protocols, stratified by age. Normal bonemarrow CD34þ were sorted by the means of immunomagneticseparation column (Miltenyi Biotech, Germany). The purity ofCD34þ cells reached 85–98% according to flow cytometry.

Received 3 September 2005; revised 17 March 2006; accepted 23March 2006; published online 11 May 2006

Correspondence: Dr L Ysebaert, Service d’Hematologie clinique, CHUPurpan, 1 place du Dr Baylac, 31059 Toulouse Cedex 9, France.E-mail: [email protected]

Leukemia (2006) 20, 1211–1216& 2006 Nature Publishing Group All rights reserved 0887-6924/06 $30.00

www.nature.com/leu

Leukemic immature (KG1) and myelomonocytic (U937) celllines were purchased from DSMZ (Germany), and grown inIMDMþ 10% FCS and RPMIþ 10% FCS, respectively, withpenicillin/streptomycin at 371C and 5% CO2.

Differentiation of CD34þ normal progenitors in vitroCD34þ cells were maintained in liquid culture and differ-entiated in six-well plates in IMDMþ 10% FCS, supplementedwith stem cell factor (SCF, 100 ng/ml), Interleukin 3 (IL-3, 10 ng/ml), Flt3 ligand (FL, 50 ng/ml) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF, 50 ng/ml) for myelomono-cytic differentiation (for 14 days) (all cytokines purchased fromR&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Input plating was4� 105/ml, and cells were counted and diluted with freshmedium with cytokines (þ /� Wnt ligands) every 2 days. Whenindicated, cells were cultured under the same conditions withrecombinant Wnt3a (20 ng/ml) or Wnt5a (0.3 mg/ml) from R&DSystems. Choice of Wnt dosage was guided by manufacturer’sguidelines and by publication by Willert et al.,12 who usedpurified Wnt3a and demonstrated that accumulation ofb-catenin is comparable between 20 and 1000 ng/ml. Expres-sion of differentiation markers (CD34, CD38, CD33, CD11b andCD14) was assessed at day 3, 5, 7, 10 and 14 by flow cytometry.At each time point, 2� 105 cells were also lysed for furtherblotting.

Reverse transcriptase-polymerase chain reactionanalysisTotal RNAs were extracted using Qiagen RNAeasy kit, accord-ing to manufacturer’s instructions, and were reverse-transcribedusing the Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA). Of a 20 ml cDNA reaction 5ml was usedas template for amplification with the following specific primers.For human Wnt5a forward: 50-CAAGGTGGGTGATGCCCTGAAGGAG-30, and reverse 50-CGTCTGCACGGTCTTGAACTGGTCGTA-30, for human b-catenin forward: 50-AATCAGCTGGCCTGGTTTGA-3’, and reverse 50-GGCCAATCACAATGCAAGTTC-30, for human GAPDH forward: 50-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3’, and reverse 5’-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-30.

Western blottingCells (0.5–1� 106) were reduced in Laemmli sample buffer andthen boiled for 10 min at 1001C. Proteins were resolved onsodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) and then transferred to nitrocellulose membrane(Hybond-C Super, Amersham Pharmacia Biotech, Little Chafont,UK). Membranes were blocked in Tris buffer saline TBS-Tween0.05% with 5% nonfat milk for 1 h, and then incubated withproper antibodies. We purchased monoclonal anti-b-cateninfrom BD Transduction Laboratories, anti-actin from Sigma (StLouis, MO, USA). All antibodies were diluted 1/1000 in TBS-Tween 0.05%, except anti-actin that was used 1/10 000.Membranes were blotted overnight at 41C, washed three times,and blotted with appropriate anti-mouse IgG antibody coupledto horseradish peroxydase. Detection was achieved using PierceSupersignal chemiluminescent substrate.

Clonogenic assaysLeukemic blast primary colony assay was performed aspreviously described.22–23 Briefly, 3� 105 cells were resus-pended in methyl-cellulose semi-solid medium with (PE1þ ,

Plating Efficiency at 1 week) or without (PE1-) 10% humanbladder carcinoma cell line 5637 conditioned medium (5637CM). A total of 1� 105 cells was then plated in 35 mm Petridishes in triplicate (1 ml mixture/dish), and incubated at 371Cand 5% CO2 humidified atmosphere. At day 7, the leukemiccolonies (420 cells) and clusters (45 cells) were scored underan inverted microscope. As the growth of clusters or coloniesdepends on intrinsic blastic characters, clusters and colonieswere referred as CFU-L. Cells were washed, counted andre-seeded at 1� 105/ml in the same solid medium with 5637CM for assessment of replating capacity (plating efficiencyat 2 weeks (PE2)) at day 15.

Statistical analysisInfluence of b-catenin expression was evaluated on patientsclinical and biological characteristics using the w2 test andFisher’s exact test for categorical variables. Survival curves wereplotted using the product-limit method of Kaplan–Meier andcompared with the log-rank test. Mann–Whitney test wascarried out for comparison of medians from nonparametricdata. Cox regression model was used for the identification ofprognostic factors, those linked with RFS and OS with Po0.1 inunivariate analysis were subsequently assessed in multivariateanalysis (level for significance: Po0.05)

Results

Expression of b-catenin in AML cells and leukemiccell linesb-Catenin was found to be expressed in 61% of our 82 AMLsamples, as well as in nearly all tested leukemic cell lines(Figure 1), although at various expression levels. As expectedwith regards to its post-translational regulation by the Wntpathway, b-catenin protein levels differed from mRNA levels asassessed by RT-PCR (Figure 1). Indeed, mRNA was constantlyfound by RT-PCR analysis, irrespective of protein levels,indicating that b-catenin is mainly regulated through transla-tional and/or post-translational mechanisms in AML cells.Leukemic cells expressing b-catenin were uniformly classifiedas b-cateninþ for further correlation analyses, irrespective of thelevel of accumulation of the protein. On the other hand, primarysamples lacking b-catenin expression were classified asb-catenin�.

β-catenin

Actin

AML PATIENTS

A B C D E F G H I

β-catenin

GAPDH

KG

1a

K56

2

HL

60

U93

7

UT

7-E

PO

Jurk

at

β-catenin

Actin

Figure 1 Expression profiles of b-catenin in leukemic myeloid cells.b-Catenin is expressed at various protein levels among leukemic celllines and primary samples obtained from patients, but mRNA is readilyexpressed suggesting a post-transcriptional regulation. Patients A, Fand G are b-catenin�, whereas remaining patients are uniformlyclassified as b-cateninþ irrespective of protein levels.

b-Catenin and clonogenic capacity in acute myeloid leukemiaL Ysebaert et al

1212

Leukemia

Correlations between b-catenin expression and usualclinico-biologic features in patientsMain characteristics of the population are summarized inTable 1. b-catenin expression was not found to be correlatedwith CD34 expression in 53 patients (median CD34þ cells61% in b-cateninþ (n¼ 31) versus 15.5% in b-catenin� (n¼ 22)blasts, P¼ 0.12). However, in immature M0–M2 subtypes(usually CD34þ ), median CD34 expression was 10% (n¼ 13)versus 90% (n¼ 13) in b-catenin� and b-cateninþ , respectively(P¼ 0.024). This correlation was lost in M4–M5 leukemias(usually CD34 low), since median CD34 expression was 23 and29.5%, respectively (P¼ 0.86). As b-catenin was also preferen-tially expressed in monocytic rather than immature leukemias(M4–M5 versus M0–M2, P¼ 0.02, Table 1), this result indicatesthat b-catenin accumulation is not strictly dependent uponCD34 expression.

b-Catenin expression correlates with clonogenicproperties of blastsResults of available clonogenic assays are summarized inTable 2. PE1� (i.e. autonomous growth of blasts) was notinfluenced by b-catenin expression (median PE1� colonies 275versus 500 in b-catenin� and b-cateninþ subjects, respectively,

P¼ ns), but rather PE1þ did (median number of colonies 10 550versus 2080, Po0.05). These results confirm a proliferativeadvantage under growth factor stimulation for b-cateninþ

blasts. Of note, the expression of the CD34 antigen was notcorrelated with clonogenic properties of blasts: Median PE1�colonies were 90 versus 50 and PE1þ were 9395 versus 4650(both P¼ ns) according to CD34 expression (chosen cutoff forstatistical tests: 20% of CD34 expression). Uppermost, b-cateninis the only variable statistically associated with re-platingcapacity (median PE2 was 405 colonies in 16 b-catenin� versus4100 in 33 b-cateninþ patients, Po0.02, n¼ 49). Again,according to CD34 expression median PE2 colony numberswere 6775 versus 2380 (P¼ 0.45, n¼ 28). Altogether theseresults indicate that b-catenin expression is a much morereliable predictor of clonogenic potential than the percentage ofCD34þ cells in the bulk population of blasts.

Clinical outcome is influenced by b-catenin expressionin AML blastsb-Catenin expression did not influence CR (data not shown).Expression of b-catenin is associated with both shortenedrelapse-free survival (RFS, log-rank P¼ 0.012, n¼ 49) andoverall survival (OS, log-rank Po0.01, n¼ 82) (Figure 2). In

Table 1 Initial clinical characteristics of 82 patients with acute myeloid leukemia according to b-catenin expression levels

b-Catenin (n¼31) b-Catenin+ (n¼51) P-value

Age (median) 57 61 NS

Gender (%) NSMale 61 49Female 39 51

Prior MDS (%) 19 21 NS%CD34(med./mean:ranges) 15.5/33.6:16–51.2 61/50.5:35.6–65.4 NS

Karyotype (%) 28/31 patients: 45/51 patients: NSFavorable 14.3 11Intermediate 60.7 53Unfavorable 25 36

FAB subtype (%)M0 3

#4

#41

M1 35.5 64.5 22M2 26 15 0.02M4 29

i35.5 35

i59

M5 6.5 24

FLT3-ITD mutation (%) 37 38 NSLeukocytosis (median) 81 200 50 000 NS

Fisher exact test (percentages) or Mann–Whitney (medians) were used to compare variables, and P–values are indicated.Flt3-ITD: Flt3 internal tandem duplication, FAB: French-American-British classification, MDS: myelodysplastic syndrome, med.: median values.Karyotypes were classified as favorable (t(8;21) and inv16), intermediate (normal, -Y), and unfavorable (all others, including complex karyotypes).

Table 2 Clonogenic properties of blasts are influenced by b-catenin expression

b-Catenin�

(n patients)b-Catenin+

(n patients)P-value

PE1�: autonomous growth (median number of colonies) 275 (n¼30) 500 (n¼ 44) NSPE1+: clonogenic growth after stimulation with 5637 CM (median number of colonies) 2080 (n¼30) 10550 (n¼ 44) 0.048PE2: replating capacity (median number of colonies) 405 (n¼16) 4100 (n¼ 33) 0.018

Plating efficiences (PE) were estimated as described in the Material and methods section, and median number of colonies after 1 (PE1) or 2 (PE2)weeks according to b-catenin status are listed.P-values indicate statistically relevant correlations.


1213

Leukemia

our cohort, b-catenin is the only factor influencing RFS inKaplan–Meier analysis. Other variables linked to OS (in Kaplan–Meier and log-rank tests) are age 460 years (Po0.05), absenceof CR (Po0.001), high median plating efficiencies (PE1�, PE1þand PE2, all with Po0.05), a complex karyotype (Po0.05). Inmultivariate analysis, b-catenin is an independent variableassociated with shortened OS (Po0.05). This correlationbetween b-catenin and OS is even stronger if we consider theyounger (i.e. under the median 62.5 years of age of our cohort)category of patients, with log-rank P¼ 0.004. Altogether, these

data suggest that b-catenin is crucial to the pathogenesis ofleukemia and the prognosis of patients.

Regulation of b-catenin levels in leukemic myeloid cellsdiffers from normal cellsIn normal CD34þ progenitors b-catenin is strongly expressedbut is rapidly lost upon differentiation in cytokines supplemen-ted liquid culture (after 3–5 days), even if recombinant Wnt3a orWnt5a were added to culture (our unpublished data and Simonet al.26). The downregulation of b-catenin is phenotypicallyachieved in CD34þ /low38þ33þ immature progenitors (data notshown), and is also specific to myelomonocytic differentiation.Indeed, under erythroid differentiation conditions, re-expressionof high levels of b-catenin in proerythroblasts occurs withoutany maturation hiatus (our unpublished data). The finding of aloss of b-catenin expression, at a post-transcriptional level,despite Wnt stimulation in normal differentiating progenitors ledus to check whether such an antagonistic regulating mechanismcould be lost in AML. Wnts are ligands for a co-receptor madeby Frizzled and LRP5/6, respectively specifically inhibited byFRP-1 and Dkk-1. Some Wnts are pro- (e.g. Wnt3a) and othersanti- (e.g. Wnt5a) b-catenin through various couples of co-receptors. b-catenin in leukemic blasts and cell lines was readilystimulated by Wnt3a but not Wnt5a (Figure 3a, representative of6/6 patients with low/undetectable b-catenin levels), or down-regulated by recombinant frizzled related peptide-1 (FRP-1) (intwo of three patients) or Dickkopf-1 (Dkk-1) (in one of twopatients) (Figure 3b, and data not shown). We next used RT-PCRto check whether differences in b-catenin levels might be linkedto the loss of the hematopoietic tumor suppressor Wnt5a (anti-b-catenin ligand) expression in blasts.24 We noticed greatvariations in Wnt5a transcripts levels in six out of 11consecutive subjects (Figure 3c), that did not strictly correlatewith b-catenin protein expression. Altogether, these results showthat the Wnt/b-catenin pathway could be regulated in AML, asopposed to normal myelomonocytic differentiating precursors.

Discussion

We aimed to study b-catenin expression in a large cohort ofpatients to determinate whether it could influence blast behavior

Figure 2 Kaplan–Meier relapse-free (RFS) and overall survival (OS)curves in 49 and 82 patients, respectively, according to b-cateninstatus of leukemic cells. Comparison of survival curves using the log-rank test identifies b-catenin as an adverse prognostic factor.

β-catenin

Actin

U937 KG1

0 5 10 20 0 5 10 20

- + - Wnt3a-

---

+-+

-+

--

+-

-+ Wnt5a

1 (+

)

2 (+

)

3 (-

)

4 (+

)

5 (-

)

6 (-

)

7 (+

)

8 (-

)

9 (-

)

10 (

+)

11 (

-)

# patients (β-catenin protein level)

Wnt5a

β-catenin

GAPDH

- + - + FRP-1

β-catenin

Actin

Patient 4 Patient 5NormalCD34+

Patient 1 Patient 2 Patient 3Wnt3a(ng/ml) Wnt3a(µg/ml)

a

b c

Figure 3 b-catenin response profile of leukemic cells upon Wnt ligand stimulation. (a) Leukemic cell lines and patients cells are responsive toWnt3a (20 ng/ml), but not Wnt 5a (0.3mg/ml) in terms of b-catenin upregulation, after incubation for 4 h. (b) In b-cateninþ patients, recombinantFRP-1 (0.1mg/ml) inhibits b-catenin in the same culture conditions, suggesting that in leukemic cells b-catenin accumulation depends on Wntstimulatory/inhibitory loops. (c) Expression of Wnt5a mRNAs by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) in normal and leukemiccells. At the mRNA level, Wnt5a is found in normal CD34þ progenitors. Yet, six out of 11 patients have lost Wnt5a mRNA expression (anti-canonical Wnt), indicating that at least in some AML cells unleashing of canonical Wnt agonists may participate to the accumulation of b-catenin.


1214

Leukemia

in vivo. As already reported by previous publications,25–27 wewere able to find b-catenin in the majority of patients (nearly thetwo-thirds), although at very various levels. For analyticalpurposes, we chose a simple plus/minus stadification system,which appeared to us as the best way to avoid bias in theclassification of patients, avoiding also the choice of a cell typewith a reference level of b-catenin (a normal or malignant cell?At which maturation state?).

We established a correlation between b-catenin expressionand clonogenic growth. Previous reports using clonogenicassays noted the inverse relationship between autonomousgrowth and the magnitude of response to growth factors, in thatcells with low baseline proliferation kinetics are more readilystimulated.28 This is also the case in our work, becauseb-catenin is correlated with proliferation under stimulation, notat baseline. Moreover, in our series, absence of prior myelo-dysplastic syndrome is correlated to autonomous growth (notshown), as previously demonstrated.29 Leukemic cell growth invitro has been correlated to poor OS in our study and in previouspublications, and although b-catenin level and clonogenicproperties (PE1þ and PE2) are correlated, they are bothindependent prognostic factors for survival. It might be objectedthat b-catenin does not correlate with autonomous growth,which has been associated with poor prognosis in AML.30–31 Itshould be noticed that translocation products of t(8;21) andt(15;17), that enhance Wnt signaling in leukemic cells, have notbeen linked to increased autonomous growth and that amongAML, those with t(15;17) have been found to have enhancedPE1þ rather than PE1�.32 The major interest rather comes fromthe finding of a correlation between b-catenin expression andre-plating efficiency, which indicates a putative role of b-cateninin leukemic stem cells (LSCs). Moreover, since b-catenin wasthe only variable linked to relapse in our cohort, it could meanthat a probably small pool of b-catenin-positive immature cellscould drive the re-occurrence of the disease, although b-cateninwas not correlated with chemoresistance in the bulk AML cellsat diagnosis.

To understand how Wnt signaling could be deregulated inAML, we sought to determine b-catenin expression in normalhematopoiesis. We confirm that b-catenin expression is rapidlylost upon myelomonocytic differentiation.26,33 Interestingly, ourpreliminary results show that, depending on the way ofmaturation, erythroid for example, b-catenin could be re-expressed in CD34� cells (data not shown, and33). We foundthat in M0–M2 AML patients (no M6 AML was tested), b-cateninexpression was correlated with the median percentage ofCD34þ blasts, although this was not the case for M4–M5AML. In unsorted bulk cells, b-catenin expression reflects theprevalence of CFU-L more accurately that CD34 expression (ourdata and8,26,34). The loss of b-catenin in normal precursorscoincides with the narrowing of their differentiating capacities(and the loss of CD34 antigen). Thus, the abnormal accumula-tion of b-catenin in leukemic cells (irrespective of theirmaturation and CD34 status) may confer clonogenic propertiesnormally restricted to immature precursors.

To elucidate the mechanism(s) at stake in maintainingb-catenin in the majority of blasts, we further demonstrated arapid modulation of b-catenin upon Wnt3a or FRP-1 ligation,indicating that AML blasts are fully responsive to bothregulations of b-catenin levels, as opposed to differentiatingnormal myelomonocytic cells. These data imply that activation/inactivation of b-catenin by the Wnt pathway is readilyachievable in AML cells,35 suggesting that (i) receptors arepresent, and (ii) downstream Wnt pathways are functional. Inthe hematopoietic tissue, Wnt5a is a tumor suppressor

antagonizing Wnt signaling through b-catenin.24 In our cohort,we could also find a differential expression of Wnt5a ligands insome patients (in a way indicating that Wnt signature could beshifted towards oncogenic Wnts at the expense of Wnt5a), butthat does not strictly infirm other mechanism(s) to be responsiblefor b-catenin accumulation in other cases. Whether misexpres-sion of Wnt receptors and/or secreted inhibitors of the pathwaycould be responsible for variations of b-catenin levels in patientsremains to be elucidated. Our data pave the way to developingnew therapeutic strategies aimed at inhibiting the Wnt pathwayin clonogenic leukemic cells, like micro-environment manip-ulations (bone marrow stromal cells secrete Wnt ligands tosupport normal hematopoiesis36), or Wnt-Tcf interactions forexample (small molecules inhibitors have been developed37).

Acknowledgements

Research grants and financial support: LY is supported by a grantfrom the Fondation de France-Federation Nationale des Centresde Lutte Contre le Cancer. This work was supported by a grantfrom the Association de Recherche contre le Cancer (contract3638).

References

1 Pardal R, Clarke MF, Morrison SJ. Applying the priciples of stemcells biology to cancer. Nat Rev Cancer 2003; 3: 895–902.

2 Reya T, Morrison S, Clarke M, Weissman I. Stem cells, cancer, andcancer stem cells. Nature 2001; 414: 105–111.

3 Polakis P. Wnt signalling and cancer. Genes Dev 2000; 14:1837–1851.

4 Giles RH, van Es JH, Clevers H. Caught up in a Wnt storm: Wntsignaling in cancer. Biochim Biophys Acta 2003; 1653: 1–24.

5 van Es JH, Barker N, Clevers H. You Wnt some, you lose some:oncogenes in the Wnt signaling pathway. Curr Opin Genet Dev2003; 13: 28–33.

6 Moore MAS, Spitzer G, Williams G, Metcalf D, Buckley J. Agarculture studies in 127 cases of untreated acute leukemia: theprognostic value of reclassification of leukemia according to invitro growth characteristics. Blood 1994; 44: 1–18.

7 Vincent PC, Sutherland R, Bradley M, Lind D, Gunz FW. Marrowculture studies in acute leukemia at presentation and duringremission. Blood 1977; 49: 903–912.

8 Del Canizo M, Brufau A, Almeida J, Galende J, Garcia Marcos MA,Mota A et al. In vitro growth in acute myeloblastic leukemia:relationship with other clinico-biological characteristics of thedisease. Br J Haematol 1998; 103: 137–142.

9 Van den Berg D, Sharma A, Bruno E, Hoffman R. Role of membersof the Wnt gene family in human hematopoiesis. Blood 1998; 92:3189–3202.

10 Austin T, Solar G, Ziegler F, Liem L, Matthews W. A role for theWnt gene family in hematopoiesis: expansion of multilineageprogenitor cells. Blood 1997; 89: 3624–3635.

11 Reya T, Duncan AW, Ailles L, Domen J, Scherer D, Willert K et al.A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stemcells. Nature 2003; 23: 409–414.

12 Willert K, Brown JD, Danenberg E, Duncan A, Weissman IL, ReyaT et al. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cellgrowth factors. Nature 2003; 423: 448–452.

13 Staal FJ, Clevers HC. WNT signalling and haematopoiesis: a WNT-WNT situation. Nat Rev Immunol 2005; 1): 21–30.

14 Brandon C, Eisenberg LM, Eisenberg CA. Wnt signaling modulatesthe diversification of hematopoietic cells. Blood 2000; 96:4132–4141.

15 Lu D, Zhao Y, Tawatao R, Cottam H, Sen M, Leoni LM et al.Activation of the Wnt signaling pathway in chronic lymphocyticleukemia. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 3118–3123.

16 Qiang YW, Endo Y, Rubin JS, Rudikoff S. Wnt signaling in B-cellneoplasia. Oncogene 2003; 22: 1536–1545.


1215

Leukemia

17 Derksen P, Tijn E, Meijer H, Klok MD, MacGillavry MH, van OersMH et al. Illegitimate Wnt signaling promotes proliferation ofmultiple myeloma cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:6122–6127.

18 Jamieson C, Ailles L, Dylla S, Muijtjens M, Johnes C, Zehnder JLet al. Granulocyte-macrophage pogenitors as candidateleukemic stem cells in blast-crisis CML. N Engl J Med 2004; 351:657–667.

19 Muller-Tidow C, Steffen B, Cauvet T, Tickenbrock L, Ji P,Diederichs S et al. Translocation products in acute myeloidleukemia activate the Wnt signaling pathway in hematopoieticcells. Mol Cell Biol 2004; 24: 2890–2904.

20 Zheng X, Beissert T, Kukoc-Zivojnov N, Puccetti E, Altschmied J,Strolz C et al. catenin contributes to leukemogenesis inducedby AML-associated translocation products by increasing theself-renewal of very primitive progenitor cells. Blood 2004; 103:3535–3543.

21 Mc Whirter JR, Neuteboom ST, Wancewicz EV, Monia BP,Downing JR, Murre C. Oncogenic homeodomain transcriptionfactor E2A-Pbx1 activates a novel WNT gene in pre-B acutelymphoblastoid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:11464–11469.

22 Demur C, Muller C, Cassar G, Bousquet C, Laroche M, Laurent G.Acute myeloid leukemia cells with low p-glycoprotein expressionand high Rhodamine 123 efflux capacity display high clonogeni-city. Leukemia 1998; 12: 192–199.

23 Laredo J, Demur C, Muller C, Saivin S, Cassar G, Bousquet C et al.Effects of H-7 and staurosporine on proliferation and self-renewalof acute myeloid leukemia progenitors. Leukemia 1993; 7:813–820.

24 Liang H, Chen Q, Coles AH, Anderson SJ, Pihan G, Bradley A et al.Wnt5a inhibits B cell proliferation and functions as a tumorsuppressor in hematopoietic tissue. Cancer Cell 2003; 4: 349–360.

25 Chung EJ, Hwang SG, Nguyen PM, Lee S, Kim JS, Kim JW et al.Regulation of leukemic cell adhesion, proliferation, and survivalby b-catenin. Blood 2002; 100: 982–990.

26 Simon M, Grandage V, Linch D, Khwaja A. Constitutive activationof the Wnt/b-catenin pathway in acute myeloid leukemia.Oncogene 2005; 24: 2410–2420.

27 Tickenbrock L, Schwable J, Wiedehage M, Steffen B, Sargin B,Choudhary C et al. Flt3 tandem duplication mutations cooperatewith Wnt signaling in leukemic signal transduction. Blood 2005;105: 3699–3706.

28 Norgaard JM, Langkjer S, Palshof T, Clausen N, Pedersen b,Hokland P. Relation of blast cell survival and proliferationto chemotherapy resistance in AML. Br J Haematol 1996; 93:888–897.

29 Richert-Boe KE, Bagby GC. In vitro hematopoiesis in myelodys-plasia: liquid and soft-gel culture studies. Hematol Oncol ClinNorth Am 1992; 6: 543–556.

30 Hunter A, Rogers S, Roberts I, Barrett AJ, Russel N. Autonomousgrowth of blast cells is associated with reduced survival in acutemyeloblastic leukemia. Blood 1993; 82: 899–903.

31 Lowenberg B, Van Putten W, Touw I, Delwel R, Santini V.Autonomous proliferation of leukemic cells in vitro as adeterminant of prognosis in adult acute myeloid leukemia. N EnglJ Med 1993; 328: 614–619.

32 Ohler L, Berer A, Aletaha D, Kabrna E, Heinze G, Streubel B et al.Cytogenetic risk groups in acute myeloblastic leukemia differgreatly in their semi-solid colony growth. Br J Haematol 2001;113: 120–125.

33 Serinsoz E, Neusch M, Busche G, Wasielewski R, Kreipe H, BockO. Aberrant expression of beta-catenin discriminates acutemyeloid leukaemia from acute lymphoblastic leukaemia. Br JHaematol 2004; 126: 313–319.

34 Tepstra W, Prins A, Ploemacher RE, Wogum BW, Wagemaker G,Lowenberg B et al. Long-term leukemic-initiating capacity of aCD34- subpopulation of acute myeloid leukemia. Blood 1996; 87:2187–2193.

35 Bafico A, Liu G, Goldin L, Harris V, Aaronson SA. An autocrinemechanism for constitutive Wnt pathway activation in humancancer cells. Cancer cell 2004; 6: 497–506.

36 Yamane T, Kunisada T, Tsukamoto H, Yamazaki H, Niwa H,Takada S et al. signaling regulates hemopoiesis through stromalcells. J Immunol 2001; 167: 765–772.

37 Lepourcelet M, Chen YN, France DS, Wang H, Crews P, Petersen Fet al. antagonists of the oncogenic Tcf/beta-catenin proteincomplex. Cancer Cell 2004; 5: 91–102.


1216

Leukemia

AUTEUR : Fabienne DE TONI TITRE : « GSK3β : clé de voûte des mécanismes de résistance au stress contrôlés par les intégrines dans les leucémies aiguës myéloïdes » DIRECTRICE DE THESE : Dr. Claire RACAUD-SULTAN

Un des problèmes majeurs rencontré actuellement dans le traitement des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) est la récurrence de cette pathologie suite à la chimiothérapie, entraînant la rechute de 50 à 70 % des patients atteints de LAM post-chimiothérapie. Cette grave complication est due à un foyer de cellules leucémiques résistantes à la thérapie, qui sont localisées dans la moelle osseuse des os plats, où des éléments du microenvironnement tels que les ligands des intégrines et les morphogènes Wnt, régulent étroitement leurs fonctions de survie, de prolifération et de différenciation. Or, la sérine/thréonine kinase GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) est un carrefour majeur des voies de signalisation contrôlant ces fonctions cellulaires. Nous avons recherché quel pourrait être l’impact d’une modulation de son activité dans la résistance au stress des cellules leucémiques, et quels étaient les mécanismes impliqués dans cette régulation.

Après avoir montré que l’adhésion sur fibronectine, via l’engagement des intégrines α4β1 et α5β1, et le blocage de la voie Wnt entraînaient la résistance des cellules de LAM à l’apoptose induite par la daunorubicine, différents inhibiteurs pharmacologiques et une stratégie de siRNA ont permis de mettre en évidence que cette voie de survie nécessitait l’activation de la GSK3β. De plus, dans notre modèle, GSK3β permet l’activation de NF-κB (nuclear factor κB), indépendamment de la voie de régulation classique par IκB. La recherche des événements proximaux responsables de l’activation de GSK3β, en aval de l’engagement des intégrines α4β1 et α5β1, a permis de démontrer une régulation différentielle de cette kinase par les deux intégrines. En effet, alors que l’intégrine α4β1 régule une forme tyrosine phosphorylée active de GSK3β intranucléaire et associée à la tyrosine kinase Pyk2, l’intégrine α5β1 induit la translocation d’un complexe PP2A/GSK3β vers le compartiment cytoplasme/membrane et la déphosphorylation activatrice sur la sérine 9 de GSK3β. Enfin, nous avons révélé une régulation croisée entre les intégrines et la voie Wnt par le biais d’une sécrétion de l’antagoniste de Wnt, sFRP-1 (secreted Frizzled Related Protein-1), après adhésion des blastes leucémiques sur les ostéoblastes de la niche médullaire.

En conclusion, nos travaux ont permis de mettre à jour un mécanisme original de chimiorésistance des LAM, impliquant deux acteurs majeurs du microenvironnement médullaire, les molécules d’adhésion et les morphogènes Wnt. Ce processus de résistance au stress repose sur l’activation de la kinase GSK3β, dont nous révélons pour la première fois le rôle essentiel dans une voie de survie contrôlée par les intégrines. En perspectives, il reste à démontrer que GSK3β puisse représenter une cible thérapeutique différentielle permettant d’épargner les cellules souches hématopoïétiques normales, dans le traitement des LAM. Désormais, un grand champ d’investigations s’ouvre pour comprendre le rôle de l’activation de GSK3β, en tant qu’élément pro-oncogénique dans différents cancers. MOTS-CLES : GSK3β, intégrine, Wnt, microenvironnement, survie cellulaire, leucémie aiguë myéloïde SPECIALITE : Cancérologie LABORATOIRE : INSERM U563 - CPTP - Equipe B. Payrastre « Phosphoinositides et signalisation dans les cellules hématopoïétiques », CHU Purpan, Toulouse, FRANCE

Documents

THESE DE SCIENCES GSK3β : clé de voûte des mécanismes de