THESE E - ceraas.orgceraas.org/IMG/pdf/Issa faye THESE-DEFINITIVE.pdf · Kandioura NOBA, Professeur Titulaire, ... Mohamed Faye mes frères et sœurs et mes amis ... Dr Ndiaga Cissé

UNIVERSITÉ CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR (U.C.A.D.)

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE VEGETALE

TTHHEESSEE Présentée en vue de l’obtention du titre de

DDOOCCTTEEUURR DDEE 33èèmmee CCYYCCLLEE

Spécialité : Génétique et Amélioration des Plantes

Par

M. Issa FAYE

Sur le sujet :

Soutenue le 22 Mai 2010 devant la commission d’examen :

Kandioura NOBA, Professeur Titulaire, UCAD Président Tahir A. DIOP, Professeur Titulaire, UCAD Membre

Ousmane NDOYE, Maître de Recherche, ISRA/CERAAS Membre

Mbacké SEMBENE, Maître de Conférences, UCAD Membre Abdou NDIAYE, Maitre de Recherche, ISRA/CRZ Membre

Contrôle génétique de la dormance des graines fraîches chez des variétés d’arachide (Arachis hypogaea L.) de type Spanish et recherche de marqueurs microsatellites liés au caractère

Je rends grâce à Dieu et je prie sur le Prophète Mohamed (PSL)

Je dédie ce travail à

à mes parents,

mon épouse, Aminata Tine

notre fils, Mohamed Faye

mes frères et sœurs

et mes amis

en guise de reconnaissance pour leur patience, leurs soutien et encouragements.

Remerciements

Ce travail a été réalisé grâce à la collaboration entre trois institutions que sont l’UCAD,

l’ISRA et le CIRAD. A travers cette collaboration, nous avons eu le privilège de bénéficier de

l’appui de plusieurs personnes dont les conseils éclairés ont permis de réaliser ce travail.

Au Dr Ndoye, je voudrais saisir cette occasion qui m’est offerte pour lui dire toute ma

gratitude pour avoir assuré ma supervision au sein de l’ISRA. Par ailleurs, je lui serais

reconnaissant à jamais pour avoir coordonné les activités de cette thèse et avoir été disponible de

nous fournir les conseils pratiques et pertinents, puisés d’une solide expérience qu’il a de cette

belle culture, l’arachide. En outre, grâce à ses bonnes relations au niveau international, il m’a

permis de bénéficier de beaucoup de formations à l’étranger, pour renforcer mes capacités dans le

domaine de la sélection et de la génétique moléculaire. Ces différentes formations ont été

supportées par plusieurs programme notamment le programme « Collaborative Research Support

Program » financé par l’Agence Américaine pour le Développement Internationale (USAID), le

programme « Generation Challenge Program » fnancé par la Fondation Bill Gates. Au cours de

ces différentes formations, il m’a été donné l’occasion de faire connaissance avec des chercheurs

chevronnés avec qui j’entretiens des échanges scientifiques très enrichissants. Que les bailleurs

de ces programmes soient vivement remerciés ici.

Au Professeur Tahir A. Diop, j’exprime ma sincère gratitude pour avoir cru à ce projet de

recherche depuis que nous le lui avons présenté. Il a été toujours disponible à chaque fois que

besoin en était. Il m’a ouvert sa porte grandement. Par ailleurs, il m’a toujours encouragé à

persévérer dans l’excellence.

Mes sincères remerciements vont également aux autres membres du Jury qui ont accepté

de donner de leur temps et de leur savoir pour évaluer et améliorer ce travail. Par ailleurs, je leur

suis redevable pour avoir reçu leurs enseignements à la Faculté des Sciences et Techniques de

l’UCAD. En fait, je me rappelle toujours de mes cours de l’AEA avec Professeur Noba et de mes

séances de travaux pratiques en licence avec Dr Sembène. Je remercie Dr Abdou Ndiaye,

sélectionneur à l’ISRA pour la documentation qu’il a mise à ma disposition dès que je venais

d’entamer ce travail et pour l’honneur qu’il m’a fait en accepter d’être membre du Jury.

Je suis spécialement redevable à l’Institut Sénégalais de Recherche Agricole (ISRA) qui

m’a accueilli pour ce travail. L’appui de l’ISRA m’a permis d’une part de recevoir une allocation

mensuelle de la Direction Générale de l’ISRA pendant toute la durée de cette thèse et d’autre part

pour m’avoir donné l’appui technique nécessaire à l’atteinte des objectifs que nous nous étions

assignés. Je voudrais par la même occasion exprimer vivement ma reconnaissance à tout le

personnel du CNRA à travers la personne de son Chef de Centre, Dr Ndiaga Cissé qui m’a

beaucoup encouragé quand je venais d’entamer ce travail. Que l’équipe de l’arachide au CNRA

de Bambey, soit particulièrement remerciée pour son dévouement et sa grande contribution à ce

travail depuis son début. Je remercie Ameth Sy, technicien au CNRA, pour m’avoir appris à faire

des croisements chez l’arachide. Remerciements vont à l’égard de Dr Bassirou Sine et de

Cheikhou Dramé tous deux au CERAAS respectivement pour avoir relu le document et m’avoir

assisté pour sa finalisation.

Mes sincères remerciements vont également à l’endroit de Dr Jean-François Rami du

CIRAD pour m’avoir initié à l’analyse de données de cartographie génétique et pour les

discussions intéressantes que j’ai eues avec lui. Je remercie également Danièl Foncéka, à côté de

Dr J-F Rami, qui a accepté d’être mon tuteur en biologie moléculaire quand je suis arrivé au

CIRAD. Que tout le personnel du Département Amélioration des Plantes de cette institution

(DAP-CIRAD) notamment Ronan Rivallan, Hélène Vignes, Jean-Baptiste Bassène, soit remercié

ici pour avoir donné un coup de main au séquenceur et pour les belles invitations qui ont rendu

agréable mon séjour à Montpellier. Du côté de l’ICRISAT, je suis redevable à Papaiah pour sa

disponibilité et son appui technique. Je m’en voudrais si j’avais terminé cet avant-propos sans

dire merci à Dr Omar Diouf et à Dr Modou Sène qui m’ont encadré pour l’obtention du DEA au

CERAAS et qui ont recommandé ma candidature auprès de Dr Ousmane Ndoye pour ce poste

d’allocataire de recherche à l’ISRA.

J’exprime toute ma gratitude à mon épouse, Aminata Tine, qui a vite compris la charge de

travail qui pesait sur mes épaules et qui a fait preuve de patience et de compréhension pendant

toute la durée de cette thèse, ponctuée par des absences répétées et d’innombrables week-end

passés au bureau ou au laboratoire.

Je remercie très sincèrement mes parents qui ont continué à m’encourager et à me soutenir

durant tout ce temps alors que je venais juste de finir ma formation à l’Ecole Normale Supérieure.

En fin, je ne saurais trop remercier Dr Mark Burow de l’Université A&M du Texas (USA)

pour son soutien de tous les instants.

LISTE DES ABREVIATIONS ET SIGLES Termes scientifiques

ADN: Acide désoxyribonucléique

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

BSA: Bulk Segragation Analysis ou analyse de mélanges en ségrégation

cM: Centimorgan

d: effet d’additivité

Gs: Gain génétique escompté

H2: Héritabilité au sens large

h2 : Héritabilité au sens strict

h: effet de dominance

i: effet d’interaction digénique du type « additif x additif »

j: effet d’interaction digénique du type « additif x dominance »

JAS: Jours après semis

bp /Kb: base-pair (paire de bases) /Kilobase ou Kilo-paire de bases

l: effet d’interaction digénique du type « dominance x dominance »

MATAB: Mixed Alkyl Trimethyl Ammonium Bromide

Nm: nombre minimum de gènes

PCR: Polymerase Chain Reaction (Réaction de polymérisation en chaîne)

QTL: Quantitative trait loci

RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

SAM: Sélection assistée par marqueurs

SSR: Simple Sequence Repeat

Taq: Thermus aquaticus

Institutions CERAAS: Centre d’Etudes Régional pour l’Amélioration de l’Adaptation à la Sécheresse (Thiès,

Sénégal) CIRAD: Centre de Coopération International en Recherche Agronomique pour le Développement

(Montpellier, France) CNRA : Centre National de Recherches Agronomiques (ISRA, Bambey-Sénégal) CRSP: Collaborative Research Support Program (USAID, USA) Embrapa: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria (Brésil) GCP: Generation Challenge Program (CIMMYT, Mexique) ICRISAT: International Crops Research Institute for Semi-Arid Tropics (Patancheru, Inde) ISRA: Institut Sénégalais de Recherches Agricole (DG: Route des Hydrocarbures-Bel-air, Dakar) UCAD: Université Cheikh Anta Diop (Dakar, Sénégal)

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Durée de cycle estimé (en jours) satisfait pour les variétés d’arachide du Bassin Arachidier au Sénégal en rapport avec la longueur des hivernages (Khalfaoui, 1991a). .................................................... 3 Figure 2. Carte variétale de l’arachide au Sénégal (Clavel et Ndoye, 1997) ................................................. 4 D = dormance, ND = non‐dormant ................................................................................................................ 9 Figure 3. a) un pied de la variété Fleur 11 avec repousses ; b) un pied de la variété 73‐30 sans repousse (CNRA en 2008, photo, Faye) ...................................................................................................................... 10 Figure 4. Pied d’arachide en phase de fructification (flèches montrent des boutons floraux) (d’après Faye, 2009) ............................................................................................................................................................ 11 Figure 5. Un pied d’arachide avec présence d’un gynophore inséré directement au collet et issu d’une fleur souterraine (d’après Faye, 2009) ........................................................................................................ 13 Figure 6. Relations entre le développement de la graine, les facteurs environnementaux, la dormance/germination des graines (D’après Li et Foley, 1997) ................................................................. 17 Figure 7. Schématisation d’un microsatellite entouré par les séquences flanquantes .............................. 28 Figure 8. Schéma de croisements effectués pour le développement des différentes générations filiales de chaque croisement ...................................................................................................................................... 46 Figure 9. Contrôle des hybrides F1 sur un échantillon de 44 individus, profil avec le marqueur microsatellite AC2C05 ................................................................................................................................. 57 Figure 10. Phénotypage (au laboratoire) de graines F2 issues de la population F1 contrôlée avec des marqueurs SSRs, au laboratoire de Biochimie du CERAAS.......................................................................... 58 La flèche indique une graine germée .......................................................................................................... 58 Figure 11. Plantules F2 repiquées en serre (CERAAS) et issues de la population F2 phénotypée au laboratoire ................................................................................................................................................... 59 Figure 12. Diagramme de distribution de fréquence de la dormance des graines fraîches dans la population F2 contrôlée aux marqueurs microsatellites ............................................................................. 77 Figure 13. Analyse de la ségrégation des microsatellites (en multiplex) sur les deux bulks, profils obtenus avec les marqueurs Ah3TC39C01 et Ai119C12 ........................................................................................... 92 Figure 14. Analyse de la ségrégation des microsatellites sur 60 individus F2 de la population contrôlée aux microsatellites, profils obtenus avec les marqueurs Seq9BO4 et Ah3TC39C01 ................................... 92 Figure 15. Répartition des différents loci marqueurs polymorphes (en rouge) entre les parents du croisement (Fleur 11 x 73‐30) et cartographiés sur la carte de Foncéka et al. (2009) ............................... 95

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1. Classification botanique de l’arachide cultivée (Arachis hypogaea L.) ....................................... 9 Tableau 2. Analyse de variance du nombre de jours avant germination des graines fraîches des six générations du croisement 55‐437 x 73‐30 ................................................................................................ 61 Tableau 3. Analyse de variance du nombre de jours avant germination des graines fraîches des six générations du croisement GC‐8‐35 x 73‐30 .............................................................................................. 61 Tableau 4. Analyse de variance du nombre de jours avant germination des graines fraîches des six générations du croisement Fleur 11 x 73‐30 .............................................................................................. 61 Tableau 5: Moyenne et écart‐type de la dormance (en jours) des populations parentales et des descendants des populations filiales F1, F2, BC1P1 et BC1P2 phénotypées au champ (CNRA‐Bambey, 2007) ..................................................................................................................................................................... 63 Tableau 6. Tests d’épistasies individuels A, B et C et le test combiné pour le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre 55‐437 et 73‐30 ........................................................................ 64 Tableau 7. Effets génétiques impliqués dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre 55‐437 et 73‐30 .............................................................................................................. 64 Tableau 8. Tests d’épistasies individuels A, B et C et le test combiné pour le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre GC‐8‐35 et 73‐30 ...................................................................... 65 Tableau 9. Effets génétiques impliqués dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre GC‐8‐35 et 73‐30 ............................................................................................................ 65 Tableau 10. Tests d’épistasies individuels A, B et C et le test combiné pour le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre Fleur 11 et 73‐30 ................................................................ 66 Tableau 11. Effets génétiques impliqués dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre Fleur 11 et 73‐30 ............................................................................................................ 66 Tableau 12. Composantes de la variance génétique estimées par REML chez le croisement 55‐437 x 73‐30 ................................................................................................................................................................. 68 Tableau 13. Composantes de la variance génétique estimées par REML chez le croisement GC‐8‐35 x 73‐30 ................................................................................................................................................................. 68 Tableau 14. Composantes de la variance génétique estimées par REML chez le croisement Fleur 11 x 73‐30 ................................................................................................................................................................. 68 Tableau 15. Estimation de l’héritabilité au sens large (H2) et au sens strict (h2) de la dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish chez les trois croisements ................................................................. 69 Tableau 16. Estimation du gain génétique escompté (Gs) chez les trois croisements ............................... 71 Tableau 17. Estimation du nombre minimum de gènes en cause dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez les trois croisements ................................................................................................. 72 Table 18: Rapports de ségrégation (dormant : non dormant) dans les générations filiales du croisement 55‐437 x 73‐30 ............................................................................................................................................. 73 Table 19. Rapports de ségrégation (dormant : non dormant) dans les générations filiales du croisement GC‐8‐35 x 73‐30 ........................................................................................................................................... 74 Table 20: Rapports de ségrégation (dormant: non dormant) dans les générations filiales du croisement Fleur 11 x 73‐30 ........................................................................................................................................... 74 Tableau 21: Rapport de ségrégation dans la population F2 contrôlée aux marqueurs microsatellites ...... 76

Résumé Au Sénégal, à l’instar des autres pays de la zone semi-aride tropicale (SAT), il existe très peu de variétés à cycle court et dormantes pour faire face aux pluies tardives qui tombent après que l’arachide ait atteint la maturité physiologique. Cependant, les travaux réalisés sur la génétique du caractère de la dormance des graines fraîches dans le compartiment des variétés du type botanique Spanish sont encore très limités. Dans le premier chapitre, sept lignées d’arachide avancées sélectionnées pour la dormance de leurs graines fraîches ont été phénotypées au champ et au laboratoire à côté des variétés parents témoins. Les entrées ont montré des différences significatives pour le pourcentage de germination aussi bien au champ qu’au laboratoire. L’intensité de la dormance a varié entre 15% à 100%. Une durée de dormance longue de 35 jours a été observée sur les lignées L2, L4 et L24. Le test au champ et celui au laboratoire ont donné des résultats assez similaires pour une entrée donnée par rapport à l’intensité de dormance. La durée de dormance a permis de classer les entrées dans différents niveaux de dormance selon l’échelle employée. Aussi bien pour l’intensité que la durée de dormance, les lignées L2, L4 et L24 se sont montrées plus prometteuses pour l’obtention de nouvelles variétés hâtives et dormantes. Des variations interannuelles observées ont donné une indication de l’effet de facteurs environnementaux sur l’expression du caractère. Dans le second chapitre, l’analyse du contrôle génétique réalisée sur trois croisements différents par la méthode des moyennes de générations a montré que le caractère est contrôlé par des effets d’additivité et de dominance. Toutefois, des effets liés aux facteurs non contrôlés peuvent induire une déviation par rapport au modèle additif-dominance. L’héritabilité au sens large (H2) a varié entre 0,72 et 0,89 et l’héritabilité au sens strict (h2) a été supérieure à 0,40 pour tous les trois croisements. L’identification des hybrides F1 au moyen de marqueurs microsatellites a montré que le caractère est monogénique et avec une dominance partielle de la dormance. Par conséquent, une sélection bulk ou de type pédigrée à partir des premières générations peut être efficacement pour développer des lignées à cycle court et dormantes issues de croisements Spanish x Spanish. Dans le troisième chapitre, l’analyse de mélanges en ségrégation dénommée bulk segregation analysis a été réalisée sur une population F2 du croisement Fleur 11 et 73-30 à partir de 97 marqueurs microsatellites polymorphes entre les parents. L’analyse de la liaison marqueur/gène à partir des 97 microsatellites n’a pas permis de trouver de marqueurs liés au gène. La projection des marqueurs polymorphes sur une carte génétique a indiqué que cinq groupes de liaisons a01, a05, a09, b01 et b10 n’ont pas été particulièrement suffisamment couverts, ainsi l’identification du gène de la dormance nécessitera le criblage d’autres marqueurs moléculaires. Toutefois, le niveau de polymorphisme parental (17%) observé dans cette étude est plus élevé que ceux observés dans les études antérieures. De ce fait, cette étude pose réellement la possibilité d’identifier et de cartographier des gènes d’intérêt à partir de croisement Spanish x Spanish en optimisant les chances de détecter du polymorphisme moléculaire entre les parents par l’utilisation de microsatellites de longue séquence. Mots-clés : arachide, dormance des graines fraîches, étude génétique et moléculaire, variétés Spanish

Abstract In Senegal as well as in most countries of the semi-arid tropical zone, there are a limited number of early-maturing peanut varieties with fresh seed dormancy that can cope with late rains which may occur after physiological maturity of seeds. However, studies on the inheritance of fresh seed dormancy among Spanish-type peanut varieties are still very limited. In the first chapter, seven advanced lines selected for fresh seed dormancy along with their parents used as checks were tested for their fresh seed dormancy. The entries have shown statistical differences for fresh seed dormancy in both field and laboratory germination environments. Intensity of dormancy ranged from 15% to 100%. Duration of dormancy has shown also large variation (7 to more than 35 days) between the entries. For a given entry, a quite good similarity was observed between field and laboratory evaluations. Furthermore, dormancy duration evaluation led to different rates of dormancy for the entries on the basis of the scale used. For intensity as well as dormancy duration, lines L2, L4 and L24 were consistently found to be more promising for developing early-maturing varieties with fresh seed dormancy. Variations over-seasons, for a given entry observed in this study, indicated the influence of environmental effects on the expression the character. In the second chapter, gene action studied using generation means analysis with three different crosses showed that the trait is under the control of additive and dominance effects. However, non-genetic factors could lead to deviations from additive-dominance. Broad sense heritability (H2) ranged from 0.72 to 0.89 and narrow sense heritability (h2) was higher than 0.4 in all the crosses. The control of hybrid F1 individuals with SSR markers showed that the trait is monogenic with dominance over non-dominance. Thus, one could effectively use bulk selection or pedigree selection from early segregating generations to develop early-maturing varieties with fresh seed dormancy using a Spanish x Spanish cross. In the third chapter, bulk segregation analysis performed on an F2 population derived from the cross Fleur 11 x 73-30 using 97 polymorphic SSR markers did not detect markers linked to the trait. In fact, the projection of the markers on a peanut map showed that the linkage groups a01, a05, a09, b01 and b10 were not saturated. Therefore, further screening of molecular markers is needed to find markers linked to the trait. Nevertheless, the parentage polymorphism (17%) observed in this study is higher than those previously reported in cultivated peanut. This level of polymorphism indicated that one could optimize gene mapping in Spanish x Spanish crosses by increasing chances of polymorphism detection between parents by screening long size microsatellites markers. Keywords: groundnut, fresh seed dormancy, genetic and molecular study, Spanish varieties

TABLE DES MATIERES INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................................ 1

Contexte de l’étude ............................................................................................................................... 1

Justificatifs et objectifs .......................................................................................................................... 5

CHAPITRE I: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................ 7

I.1. Présentation de l’espèce ..................................................................................................................... 8

I.1.1. Historique et classification botanique .......................................................................................... 8

I.1.2. Mode de reproduction de l’espèce ............................................................................................ 11

I.1.3. Les croisements chez l’arachide ................................................................................................. 12

I.1.4. Importance socio‐économique de l’arachide ............................................................................. 13

I.1.4.1. Au niveau mondial ............................................................................................................... 13 I.1.4.2. Au niveau national ............................................................................................................... 14

I.2. Dormance des graines ....................................................................................................................... 15

I.2.1. Définition de la dormance .......................................................................................................... 15

I.2.2. Les facteurs déterminants .......................................................................................................... 17

I.2.2.1. Les phytohormones ......................................................................................................... 17 I.2.2.1.1. L’éthylène ..................................................................................................................... 17 I.2.2.1.2. Les cytokinines ............................................................................................................. 18 I.2.2.1.3. L’acide abscissique ....................................................................................................... 18 I.2.2.1.4. L’acide gibberellique et les auxines .............................................................................. 18

I.2.2.2. Les facteurs physico‐chimiques ........................................................................................... 19 I.2.2.2.1. Oxygène et gaz carbonique .......................................................................................... 19 I.2.2.2.2. La température et la lumière ....................................................................................... 20

I.3. Les différentes phases de la germination d’une graine .................................................................... 20

I.4. Les approches biométriques : analyse des moyennes de générations ............................................. 21

I.5. L’hérédité de la dormance chez l’arachide ....................................................................................... 22

I.5.1. Croisements intersubspécifiques ............................................................................................... 22

I.5.2. Croisements intrasubspécifiques: Spanish x Spanish ................................................................. 23

I.5.3. Sources des controverses ........................................................................................................... 24

I.6. Le marquage génétique ..................................................................................................................... 25

I.6.1. L’arachide: une espèce à faible polymorphisme moléculaire .................................................... 26

I.6.2. Les microsatellites et leur utilisation en sélection ..................................................................... 28

I.7. Principe et intérêts de l’analyse de ségrégants regroupés ou bulk segregation analysis ................. 29

I.8. Cartes génétiques et leur utilisation en sélection chez l’arachide .................................................... 30

CHAPITRE II : PHENOTYPAGE DE LA DORMANCE DES GRAINES FRAICHES D’ARACHIDE: COMPARAISON DE DEUX METHODES ............................................................... 32

II.1. Introduction ...................................................................................................................................... 33

II.2. Synthèse des résultats ...................................................................................................................... 40

II.2.1. Intensité de dormance .............................................................................................................. 40

II.2.2. Durée de dormance et classement des entrées ........................................................................ 40

II.3. Conclusion ........................................................................................................................................ 41

CHAPITRE III : CONTROLE GENETIQUE DE LA DORMANCE DES GRAINES FRAICHES D’ARACHIDE AU SEIN DU GROUPE BOTANIQUE DES VARIETES SPANISH ....................... 42

III.1. Analyse quantitative: analyse des moyennes de générations ........................................................ 43

III.1.1. Introduction .............................................................................................................................. 43

III.1.2. Matériel .................................................................................................................................... 44

III.1.2.1. Variétés parents des croisements ..................................................................................... 44 III.1.2.2. Les hybridations: émasculation et pollinisation ................................................................ 44 III.1.2.3. Le dispositif génétique ou schéma de croisement ............................................................ 45

III.1.3. Phénotypage et méthodes d’analyses ..................................................................................... 47

III.1.3.1. Phénotypage de la dormance des graines fraîches ........................................................... 47 III.1.3.2. Analyse des effets génétiques ........................................................................................... 47 III.1.3.3. Les tests d’épistasies ......................................................................................................... 50 III.1.3.3.1. Les tests individuels A, B et C ..................................................................................... 50 III.1.3.3.2. Le test combiné de Cavallis ........................................................................................ 50

III.1.3.4. Analyse des composantes de la variance génétique ......................................................... 51 III.1.3.5. Paramètres génétiques: héritabilité et gain génétique .................................................... 52 III.1.3.6. Estimation du nombre minimum de facteurs génétiques ................................................ 53

III.1.4. Traitement et analyses statistiques des données .................................................................... 54

III.2. Analyse qualitative .......................................................................................................................... 54

III.2.1. Introduction .............................................................................................................................. 54

III.2.2. Matériel et méthodes ............................................................................................................... 55

III.2.2.1. Développement d’une population F2 contrôlée ................................................................ 55 III.2.2.1.1. Extraction d’ADN sur la population F1 ........................................................................ 55 III.2.2.1.2. Identification des hybrides F1 par contrôle avec des microsatellites ......................... 56 III.2.2.1.3. Phénotypage de la population F2 contrôlée ............................................................... 57

III.2.2.3. Analyses statistiques : le test d’adéquation .......................................................................... 59

III.3. Résultats et discussion .................................................................................................................... 60

III.3.1. Analyse quantitative ................................................................................................................. 60

III.3.1.1. Niveau de contrôle des facteurs environnementaux du test ............................................ 60 III.3.1.2. Différences génotypiques par rapport à la dormance des graines ................................... 61 III.3.1.3. Mode d’action génétique et tests d’épistasies ................................................................. 63

III.3.1.3.1. Croisement 1 (55‐437 x 73‐30) ................................................................................... 63 III.3.1.3.2. Croisement 2 (GC‐8‐35 x 73‐30) ................................................................................. 64 III.3.1.3.3. Croisement 3 (Fleur 11 x 73‐30) ................................................................................. 65

III.3.1.4. Composantes de la variance génétique par REML ............................................................ 67 III.3.1.5. L’héritabilité et le gain génétique escompté ..................................................................... 69 III.3.1.5.1. L’héritabilité ............................................................................................................... 69 III.3.1.5.2. Le gain génétique ou réponse à la sélection .............................................................. 70

III.1.3.6. Le nombre minimum de gènes .......................................................................................... 71 III.3.2. Analyse qualitative ................................................................................................................... 72

III.3.2.1. Rapports de ségrégations dans les populations non contrôlées ...................................... 72 III.3.2.2. Rapport de ségrégation dans la population contrôlée aux microsatellites ...................... 75

III.4. Conclusion et implications en termes de sélection ......................................................................... 78

CHAPITRE IV : RECHERCHE DE MARQUEURS MICROSATELLITES LIES AU GENE CONTROLANT LA DORMANCE DES GRAINES FRAICHES CHEZ DES VARIETES D’ARACHIDE DE TYPE SPANISH ...................................................................................................... 86

IV.2. Matériel et méthodes ..................................................................................................................... 88

IV.2.1. Matériel végétal ....................................................................................................................... 88

IV.2.2. Analyse des microsatellites ...................................................................................................... 88

IV.2.3. Constitution des bulks et analyse de mélanges en ségrégation .............................................. 89

IV.3. Résultats et discussion .................................................................................................................... 91

IV.3.1. Polymorphisme parental .......................................................................................................... 91

IV.3.2. Analyse de la ségrégation des marqueurs ............................................................................... 91

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES ......................................................................... 98

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................. 102

ANNEXES ................................................................................................................................................ 114

1

INTRODUCTION GENERALE

Contexte de l’étude

Au niveau international

La création de variétés adaptées aux conditions de culture est le principal rôle du

sélectionneur dans le dispositif de la recherche agricole. Dans la zone tropicale ou semi-tropicale,

avec l’avènement de la sécheresse à partir des années soixante-dix, les programmes nationaux de

recherches agricoles ont mis l’accent sur la sélection de variétés à cycle court et/ou tolérantes à la

sécheresse pour garantir de bons rendements même en conditions de déficit hydrique. Les

programmes nationaux de recherche dans la zone sub-saharienne continuent d’ailleurs de bénéficier

de l’appui technique et scientifique des institutions internationales comme l’ICRISAT et le CIRAD

dans le cadre de l’amélioration variétale de l’arachide pour l’adaptation à la sécheresse à travers

diverses sources de financements. De ces programmes sont sorties d’ailleurs différentes variétés

précoces qui sont actuellement largement cultivées en Afrique sub-saharienne. Cependant, ces

variétés à cycle court sont en général non dormantes et ainsi peuvent faire l’objet de germination au

champ, ce qui réduit significativement les rendements en gousses de ces variétés lorsque surviennent

des pluies dites « tardives ». Gautreau (1984) et Nautiyal et al. (2001) ont estimé entre 10 et 20% de

pertes de rendement en gousses liées à ces germinations intempestives. Ce taux de repousses est

d’autant plus élevé qu’un déficit hydrique ait été noté à la fin de l’hivernage. Or la zone semi-aride

tropicale connait très fréquemment des poches de sécheresse en fin de cycle (Ruivenkamp et Richard,

1994). Par ailleurs, le phénomène de germination au champ chez les variétés non-dormantes est un

des facteurs qui augmentent les risques d’infestation des gousses par le champignon Aspergillus

flavus, responsable de la contamination des graines par une mycotoxine cancérigène appelée

aflatoxine (Martin, 1999). D’après notre connaissance, la création de nouvelles variétés hâtives et

dormantes est peu nombreuse. En effet, seuls Upadhyaya et al. (1997) ont obtenu et homologué cinq

lignées d’arachides (ICGV 86155, ICGV 86156, ICGV 86158, ICGV 87378 et ICGV 87921). Cette

même équipe de l’ICRISAT a procédé à l’homologation de la lignée Spanish dormante ICGV 93470

issue du croisement entre les variétés Spanish ICGV 86015 et ICGV 86155 trois années après

(Upadhyaya et al. 2000). Ainsi, il y a lieu de constater un manque de disponibilité de variétés Spanish

dormantes.

2

Au plan national

Au Sénégal, la sécheresse a eu comme conséquences d’une part un glissement des isohyètes vers

le sud, une irrégularité des précipitations mais aussi une fin des hivernages variable d’une année

à l’autre, d’une région à l’autre. Cette irrégularité entraîne des risques de pluies après que

l’arachide ait atteint la maturité physiologique. L’hivernage 2009 à Bambey a donné un exemple

typique de cette fin de l’hivernage très variable, la première pluie utile a été enregistrée le 23 Juin

et la dernière est tombée le 27 Octobre après un stress hydrique de plus de 3 semaines de la fin

théorique de l’hivernage estimé à 3 mois en moyenne dans cette zone du pays. La fréquence des

hivernages avec pluies tardives est de deux sur dix dans la zone Centre du BA d’après le Service

d’agroclimatologie du CNRA de Bambey. D’ailleurs, le constat fait est que les hivernages avec

pluies tardives sont plus fréquents ces cinq dernières années qu’auparavant.

Par ailleurs, certaines variétés hâtives comme les variétés 55-437 et Fleur 11 qui sont

recommandées par la recherche agricole pour les régions nord et le centre du Bassin Arachidier

(BA), sont actuellement cultivées par les paysans dans le sud du Bassin (zone de Nioro). Cette

extension au-delà de leur domaine de recommandation a comme conséquence néfaste

d’importantes germinations observées chez les variétés non dormantes. En effet, celles-ci se

trouvent cultivées actuellement dans des zones où la longueur des hivernages est trop longue par

rapport à leur cycle semis-maturité. La carte variétale de l’arachide au Sénégal indique clairement

que les variétés hâtives notamment la variété Fleur 11 sont recommandées pour les régions du

centre et du nord du Bassin Arachidier non seulement parce que leur cycle correspond

approximativement à la longueur des hivernages dans ces zones mais également parce que ces

variétés peuvent subir d’importantes germinations in-situ si elles font face à des pluies après la

maturité physiologique des graines. Khalfoui (1991a) a construit une carte qui indique la limite la

longueur moyenne des hivernages au Sénégal (Figure 1). Partant des travaux de Khalfoui

(1991a), Clavel et Ndoye (1997) ont construit une carte variétale de l’arachide au Sénégal (Figure

2). Cette carte indique les différentes variétés cultivées au Sénégal et leur zone de

recommandation.

3

Figure 1. Durée de cycle estimé (en jours) satisfait pour les variétés d’arachide du Bassin Arachidier au Sénégal en rapport avec la longueur des hivernages (Khalfaoui, 1991a).

4

Figure 2. Carte variétale de l’arachide au Sénégal (Clavel et Ndoye, 1997)

Malheureusement, les paysans passent outre cette recommandation de la recherche agricole. A

titre d’exemple, on peut citer la variété Fleur 11 (90 jours après semis) qui est actuellement

cultivée comme arachide primeur dans la zone de Nioro où les risques de germination in-situ

d’une variété hâtive et sans dormance comme Fleur 11 sont extrêmement élevés du fait de la

longueur (120 jours) des hivernages dans cette zone (zone sud du BA).

Le service de création et amélioration variétale de l’arachide (ISRA/CNRA) a mis

l’accent sur la création de nouvelles obtentions qui sont très hâtives (80 jours). La plupart de ces

nouvelles variétés sont issues de croisements réalisés en utilisant la variété Chico (75 jours)

comme donneur de la précocité. Parmi celles-ci, certaines sont déjà homologuées et d’autres sont

en phase de pré-homologation. Ces lignées, très précoces, vont permettre de mieux répondre à la

demande des paysans en termes de variétés à cycle très court. Cependant, ces obtentions ne

possèdent pas la dormance des graines fraîches et peuvent ainsi faire l’objet de germination au

champ si des pluies tardives sont enregistrées. Récemment, le même service national de sélection

et d’amélioration variétale de l’arachide (ISRA/CNRA) conscient de l’importance de

5

l’introduction de la dormance des graines fraîches dans les variétés Spanish (hâtives) a entrepris

un important programme de création de lignées à cycle court et à graines fraîches dormantes. Des

lignées avancées obtenues à partir de ce travail seront évaluées par rapport à la dormance de leurs

graines fraîches dans cette étude. L’obtention de variétés à cycle court et possédant une dormance

des graines fraîches pourrait permettre aux paysans sénégalais de respecter leur calendrier

cultural en récoltant les céréales, notamment le mil précoce, avant de passer à l’arachide sans

risque de perdre une bonne partie de leur production arachidière lorsque des pluies tardives

surviennent. Aujourd’hui, la seule variété sénégalaise qui est à la fois précoce et dormante est la

variété 73-30. Cette variété a une dormance totale et longue mais présente un rendement en fanes

moindre comparativement aux autres variétés vulgarisées dans la même zone notamment les

variétés 55-437, Fleur 11, GC-8-35. Ainsi depuis quelques années, les surfaces emblavées avec la

variété 73-30 ont diminué au profit des autres variétés plus productives malgré les germinations

in situ constatées sur ces variétés. C’est pour cette raison que la création de variétés très précoces

et à graines fraîches dormantes est une priorité de recherche nationale pour permettre aux paysans

sénégalais en général et ceux du sud BA en particulier, d’avoir la possibilité de cultiver ces

variétés hâtives sans risque de germinations au champ lorsque surviennent des pluies après la

maturité physiologique des graines. Des variétés avec une durée de dormance d’au moins de 2 à 3

semaines permettrait de faire face aux pluies tardives qui tombent après la maturité physiologique

de l’arachide. L’obtention et la vulgarisation dans le centre et le sud du BA de variétés aussi

productives que les variétés hâtives qui y sont actuellement cultivées (55-437, Fleur 11 et GC-8-

35) et possédant une bonne dormance des graines fraîche est donc une priorité au niveau national.

Justificatifs et objectifs

Une bonne connaissance de l’hérédité de la dormance au sein du type botanique Spanish

est nécessaire pour entreprendre un programme efficace et rapide pour l’obtention de nouvelles

variétés d’arachide précoces et dormantes. En effet, le nombre de travaux encore très limité sur la

génétique de la dormance entre variétés Spanish est certainement l’une des causes de cette faible

disponibilité de variétés précoces et dormantes dans la zone semi-aride tropicale. De plus, les

quelques travaux antérieurs effectués à ce titre ont abouti à des conclusions souvent très

controversées. Par ailleurs, jusqu’à cette date aucune étude moléculaire n’a été menée sur la

dormance des graines d’arachides alors que chez les graminées cultivées telles que l’orge (Feng

6

et al. 1999), chez le blé et le riz (Anderson et al. 1993; Lan et al. 1997, 2002; Kato et al. 2001)

des QTLs (quantitative trait loci) impliqués dans le contrôle génétique ont été déjà identifiés et

cartographiés.

C’est ainsi que la présente étude a pour objectif général de mieux comprendre le contrôle

génétique de la dormance des graines fraîches de variétés d’arachide de type Spanish. Cet objectif

global peut être divisé en quatre objectifs spécifiques que sont:

i) étudier les effets génétiques et les composantes de la variance génétique à partir de trois

croisements différents en utilisant les modèles biométriques de Mather et Jinks (1982),

ii) estimer les composantes génétiques de la variance, les héritabilités « au sens large » et

«au sens strict » de la dormance au sein des variétés d’arachide de type Spanish, le gain

génétique escompté,

iii) estimer le nombre de gènes impliqués dans l’expression du caractère dormance des

graines fraîches chez des variétés d’arachide de type Spanish et

iv) rechercher et cartographier des marqueurs microsatellites liés au caractère de la

dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish.

Le plan de ce document est ainsi structuré en quatre chapitres dont le premier portera sur l’état

des connaissances sur l’espèce (Arachis hypogaea L.), la dormance d’une graine en général et

chez l’arachide en particulier, sur les marqueurs moléculaires et leur utilisation en sélection. Dans

le second chapitre il sera question de comparer les deux méthodes de phénotypage de la

dormance des graines fraîches d’arachide à partir de lignées d’arachide sélectionnées pour leur

dormance, de comparer les niveaux de dormance de ces lignées et appréhender l’effet des

facteurs environnementaux sur le caractère. Le troisième chapitre portera sur l’analyse des

moyennes de générations et des composantes de la variance génétique pour estimer l’héritabilité,

le gain génétique et faire l’analyse individuelle des descendances en ségrégation pour valider

l’estimation du nombre de gènes impliqué. Le quatrième chapitre sera réservé à la recherche et à

la cartographie de marqueurs microsatellites liés au caractère de la dormance en partant des

résultats acquis sur la connaissance de la génétique du caractère qui a fait l’objet du chapitre

précédent. En fin, la dernière partie sera consacrée aux conclusions et recommandations issues de

ces travaux.

7

CHAPITRE I: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I : Synthèse bibliographique

8

I.1. Présentation de l’espèce

I.1.1. Historique et classification botanique

L’arachide (Arachide hypogaea L.) est originaire de l’Amérique du Sud précisément

sur la côte nord-extrême du Pérou (Hammons, 1973a). D’après les études archéologiques, la

découverte de l’arachide est datée entre -1500 et -1200 ans. Cependant, la culture de

l’arachide a commencé à partir du XVIe siècle. A cette époque, elle était cultivée au Mexique,

sur les côtes nord-est et est du Brésil, en Argentine, au Paraguay, en Bolivie. Par la suite, son

expansion s’est faite sur toute la zone tropicale et subtropicale d’Amérique, d’Asie et sur les

côtes ouest et est de l’Afrique (Pattee et Young, 1982).

L’arachide appartient à la famille des Fabacées, la tribu des Aeschynomenées, la sous-

tribu des Stylosanthinées, au genre Arachis. Le genre Arachis comporte soixante neuf (69)

espèces dont la presque totalité sont des espèces diploïdes sauvages (Krapovickas et Gregory

(1994). Selon ces derniers auteurs, l’espèce cultivée, Arachis hypogaea L., est un

allotétraploïde (2n = 4x = 40), hybride interspécifique. En effet, ils ont observé que l’arachide

cultivée (A. hypogaea L.) possède deux sous-génomes dénommés AA et BB. Le sous-génome

AA se différencie du sous-génome BB par la présence d’une paire de chromosomes de petite

taille dénommée la paire de chromosomes "A". De plus, la méiose chez l’arachide est

identique à celle d’une espèce diploïde du fait que les appariements se font uniquement entre

chromosomes du même génome d’où l’espèce A. hypogaea L. est allotétraploïde. Les parents

sauvages (les plus consensuels actuellement) de l’espèce cultivée sont Arachis duranensis

(donneur du sous-génome AA) et Arachis ipaënsis (donneur du sous-génome BB)

(Moretzshon et al. 2004, Seijo et al. 2007; Foncéka et al. 2009).

L’espèce Arachis hypogaea L. comporte deux sous-espèces, hypogaea et fastigiata qui

se différencient principalement par trois critères morphologiques (Gregory et al. 1980). La

sous-espèce hypogaea se caractérise par un port rampant à érigé, une absence d’inflorescences

sur la tige principale et une ramification séquentielle et par contre la sous-espèce fastigiata se

caractérise par un port est érigé, la tige principale comporte des inflorescences et une

ramification alternée. Chez la sous-espèce hypogaea (A. hypogaea ssp. hypogaea), on trouve

deux variétés botaniques hypogaea et hirsuta. Ces variétés botaniques correspondent

respectivement à la variété commerciale Virginia et Peruvian runner. Chez la sous-espèce A.

hypogaea ssp. fastigiata, on distingue deux variétés botaniques que sont fastigiata et vulgaris.

Ils correspondent respectivement à la variété commerciale Valencia et Spanish (Tableau 1).


9

Aujourd’hui, les variétés commerciales Virginia et Spanish sont les plus largement cultivées à

travers le monde. Les variétés Virginia ont des cycles semis-maturité intermédiaires (105

jours) à longs (120 jours) et sont donc cultivées dans les zones où les hivernages sont longs

alors que les variétés Spanish ont des cycles courts (80 à 90 jours). Ces dernières sont de ce

fait largement cultivées dans les zones où les hivernages durent en moyenne trois (3) mois.

Cette précocité des variétés de type botanique Spanish fait qu’elles deviennent de plus en plus

les variétés les plus répandues à travers le monde. Un autre caractère distinctif entre les deux

sous-espèces de l’arachide cultivée (A. hypogaea L.) qui nous intéresse particulièrement dans

cette étude c’est la dormance des graines fraîches. En effet, chez la sous espèce hypogaea, les

graines fraîches présentent une dormance intense et longue (pouvant aller jusqu’à 4 mois). A

titre d’exemple les travaux de Kumar et Patel (1999) ont montré une durée de dormance de 75

jours chez la variété Virginia JSP-23. Par contre, chez la sous-espèce fastigiata, les graines ne

présentent pas en général de dormance ou si elle existe cette dormance est de durée très

réduite (inférieur à 2 mois). Toutefois, chez les variétés d’arachide de type Spanish, il existe

des variétés ayant une dormance des graines fraîches. Mauboussin (1966), Kumar et al.

(1991) et Upadhyaya et Nigam (1999) ont analysé la dormance de différents cultivars

d’arachide de type Spanish et ont constaté une durée de dormance qui peut atteindre 45 jours

chez les génotypes les plus dormants (Mauboussin, 1966, Kumar et al. 1991) avec des

variations interannuelles (Kumar et al. 1991).

Tableau 1. Classification botanique de l’arachide cultivée (Arachis hypogaea L.)

Sous-espèce Variété

botanique

Type

commercial

Ramification Port Dormance

Hypogaea hypogaea Virginia Alternée rampant à érigé D

D hursita Peruvian

Alternée rampant Runner

Fastigiata fastigiata Valencia Séquentielle érigé ND

vulgaris Spanish Séquentielle érigé ND D = dormance, ND = non-dormant

L’existence d’une diversité génétique chez les variétés Spanish d’arachide pour le

caractère dormance des graines fraîches a été rapportée par plusieurs auteurs dont Hull

(1937), Varisai Muhammad et Dorairaj (1968), Pandya et Patel (1986) et Wadia et al. (1987),


10

Kumar et al. (1991). A titre d’exemple, on peut prendre l’exemple des variétés Spanish Fleur

11 et 73-30. En effet, Chez la variété Fleur 11 les graines germent très rapidement après la

maturité physiologique par contre chez la variété 73-30 les graines fraîches présentent une

bonne dormance (Figure 3a et 3b). Par conséquent, la sélection de variétés hâtives et

dormantes à partir de croisements entre variétés Spanish est envisageable. De telles variétés

pourraient limiter ou éviter les pertes de rendements liées aux germinations au champ dans la

zone semi-aride tropicale (SAT) où les pluies tardives sont très fréquentes.

Figure 3. a) un pied de la variété Fleur 11 avec repousses ; b) un pied de la variété 73-30 sans repousse (CNRA en 2008, photo, Faye)


11

I.1.2. Mode de reproduction de l’espèce

Chez l’arachide, les boutons floraux apparaissent à l’aisselle des feuilles au niveau des

rameaux florifères (Figure 4). Une inflorescence peut comporter jusqu’à cinq fleurs qui

sortent le plus souvent l’une après l’autre. L’arachide a une floraison indéterminée. La fleur

est sous-tendue par une bractée, les pièces stériles de la fleur comportent un calice vert, une

corolle jaune à orangé ou blanc (Norden, 1980). Le style, entouré de dix étamines dont deux

stériles, se trouve dans le tube calcinal qui s’allonge très rapidement en quelques heures pour

atteindre une longueur de 5 cm avant l’ouverture du bourgeon floral.

Figure 4. Pied d’arachide en phase de fructification (flèches montrent des boutons floraux) (d’après Faye, 2009)

La fécondation a lieu six à huit heures avant l’ouverture du bouton floral. Ce qui fait

que l’arachide est qualifiée de plante autogame-cléistogame (Pattee et al. 1991). L’ovaire

comporte deux ovules le plus souvent. Dix à treize (10 à 13) jours après la fécondation,

apparaît nettement le gynophore à la base de l’aisselle du rameau florifère. Le gynophore a

une croissance très rapide et pénètre dans le sol où la gousse se développera. L’arachide est

donc une légumineuse herbacée à fructification souterraine (Figure 4b). Ce comportement

géocarpique très particulier est caractéristique du genre Arachis (Singh et Simpson, 1994;

Herselman, 2003). En effet, le genre Arachis se différencie des autres genres auxquels il est

apparenté par la fructification géocarpique et la présence de gynophores. Chez les variétés de


12

type Spanish, les premières fleurs apparaissent approximativement vers le 23e JAS. Ensuite

c’est la gynophorisation qui débute une semaine après la fécondation de la fleur. Au bout

deux semaines après l’apparition des premières fleurs, apparaît à l’extrémité du gynophore la

gousse. La dernière phase de la fructification correspond à la phase appelée phase de

remplissage-maturation des gousses qui est la phase la plus longue et qui dure environ 2 mois

chez les variétés hâtives.

I.1.3. Les croisements chez l’arachide

Chez les espèces autogames comme l’arachide, la possibilité de réaliser des

croisements contrôlés est un atout majeur pour la sélection. Chez l’arachide, les boutons

floraux apparaissent à partir de 16 h, permettant de réaliser cent (100) castrations par jour et

par individu en trois (3) heures de temps. Les hybridations se font habituellement le

lendemain matin et de préférence avant 10 h pour permettre une bonne réussite des

hybridations. La plupart des cultivars d’arachide actuellement dans le monde sont issues de

croisements manuels entre les variétés élites maintenues dans les collections nationales

(Upadhyaya et al. 2003). Ces croisements sont réalisés au niveau des systèmes nationaux de

recherches agricoles (SNRA) mais aussi au niveau des institutions internationales comme

l’ICRISAT (Hyderabad-Patancheru, Inde) qui maintient l’une des plus grandes banques de

gènes de l’arachide. Le croisement chez l’arachide est techniquement assez simple mais

toutefois laborieux. Il peut être réalisé directement au champ. Pour mieux contrôler les

autofécondations sur les pieds femelles appelées hybridations, les croisements peuvent être

réalisés dans une serre ou un abri clôturé. En effet, chez l’arachide comme la plupart des

espèces autogames, il existe un taux d’allogamie estimé entre 0,2 à 6,6 % selon les types

botaniques, les variétés et les insectes présents (Hammons, 1973a; Norden, 1973). Ce dernier

auteur a montré que les abeilles sont principalement les insectes pollinisateurs chez l’arachide.

Par ailleurs, il existe chez l’arachide des fleurs qui sont directement rattachées à la

plante au collet. Leur position souterraine fait qu’elles peuvent ne pas être inaperçues par

l’expérimentateur et peuvent ainsi s’autoféconder (Tableau 5). Ces fleurs dites « fleurs albinos

» du fait que la leur calice est blanc sont aussi fertiles que les fleurs normales. Leur nombre

varie selon le type botanique, la variété et les conditions de culture. Ces fleurs atypiques

peuvent être à l’origine de croisements non contrôlés dans les populations en phase de

construction (Leuck et Hammons, 1969).


13

Figure 5. Un pied d’arachide avec présence d’un gynophore inséré directement au collet et issu d’une fleur souterraine (d’après Faye, 2009)

I.1.4. Importance socio-économique de l’arachide

I.1.4.1. Au niveau mondial

L’arachide (Arachis hypogaea L.) est l’une des principales légumineuses tropicales

cultivées dans le monde entre les latitudes 40°N et 40°S (Naidu et al. 1999). L’arachide est

donc une culture largement répandue à travers le monde. La production mondiale annuelle de

l’arachide est en augmentation. En effet, elle est passée de 35,6 millions de tonnes en 2003 à

37,1 millions en 2007 (FAO, 2007). Ainsi elle est classée au deuxième rang mondial des

oléagineux en termes de production par an. L’arachide constitue une importance ressource

alimentaire pour les populations pauvres vivant dans des pays africains et asiatiques et de

l’Amérique latine. En effet, 68% de la production mondiale de l’arachide provient des pays

asiatiques, 24% proviennent de l’Afrique (Dwevidi et Crouch, 2003). Dans les deux

continents que sont l’Asie et l’Afrique mais aussi le sous-continent Amérique du sud, cette

production constitue une importante source de revenus pour les populations pauvres qui y

vivent. D’ailleurs avec les estimations de la FAO en 2004, l’Asie et l’Afrique réunies

comptent 94,2% de la production en coques et 95,9 % des surfaces cultivées (FAO, 2004).

Au plan nutritionnel, l’arachide est une oléoprotéagineuse. La graine d’arachide contient

45 à 52% d’huile et est riche (12 à 36 %) également en protéines (Mugundi et al. 1998). Elle

constitue une importante source de protéines faciles à digérer, de sucres, de la vitamine A. Son

huile est d’une meilleure qualité nutritionnelle (moins d’acides gras insaturés) comparativement


14

aux autres oléagineux comme le soja (Dwevidi et al. 2003). En effet, sa teneur plus élevée en

acide oléique qu’en acide linoléique constitue une caractéristique nutritionnelle très importante.

De même, les fanes d’arachides servent à l’alimentation du bétail. Chez la plupart actuellement

cultivées, la fane représente presque la moitié de la matière sèche totale. Par ailleurs, la coque

d’arachide est utilisée dans la fabrication d’aliments de volaille.

Hormis ce rôle capital dans l’alimentation humaine et animale, cette légumineuse fixatrice

d’azote contribue également au maintien de la fertilité des sols dans les zones où le niveau

d’apport d’engrais reste faible. Dans les pays en voie de développement, ce niveau est estimé à 8

Kg ha-1 ce qui correspond à 10% de la moyenne mondiale (FAO, 2007). Mais du fait que les

jachères ont presque disparu dans la plupart des pays au sud du Sahara, l’arachide contribue ainsi

considérablement au maintien de la production agricole dans ces pays où elle est cultivée en

rotation avec les céréales. Elle est également cultivée en culture mixte dans certains pays en

Afrique de l’est (Stalker et Moss, 1987).

I.1.4.2. Au niveau national

Le Sénégal fut le plus grand exportateur d’arachide en Afrique de l’ouest pendant plus

d’un siècle. C’est ce qui faisait que l’arachide était considérée comme le moteur du

développement économique du Sénégal durant la période allant de la seconde guerre

mondiale jusqu’au début des années soixante-dix (Freud et al. 1997). Mais le Sénégal n’a pas

pu tirer profit de son avance et de ses potentialités agricoles puisque depuis la fin des années

quatre-vingt (80), le Sénégal a perdu progressivement sa place de premier pays africain

exportateur au profit du Nigeria. Par la suite d’autres pays comme le Soudan, le Burkina Faso,

le Mali ont vu leur production augmentée et leur classement s’amélioré.

Le désengagement de l’Etat du système semencier intervenu avec la Nouvelle

Politique Agricole (NPA) est certainement une des causes qui ont fait que la production

arachidière a baissé. Néanmoins, l’arachide continue d’occuper une place de choix dans

l’économie nationale. En effet, elle est la première culture de rente et occupe 40% des

superficies emblavées. Par ailleurs, la filière arachidière intéresse, de façon directe ou

indirecte, 50% de la population active du pays. L’arachide participe à hauteur de 10% des

exportations de produits agricoles. Egalement, la production de l’arachide continue de jouer

un rôle incontestable dans le domaine agro-industriel du pays (Houssou, 1991).


15

I.2. Dormance des graines

I.2.1. Définition de la dormance

Hilhorst (1995) définit la dormance d’une graine comme l’absence de germination pendant

une certaine période pendant laquelle la graine se trouve pour autant dans des conditions

favorables (d’humidité, de température, d’éclairement et d’oxygénation). Elle se caractérise

par l’inaptitude naturelle d’une graine à germer en étant dans des conditions favorables à la

germination. La dormance d’une graine peut être négative lorsqu’on veut re-semer aussitôt la

graine après sa maturité. Mais elle peut est positive quand cela évite les germinations

intempestives sur pied. Chez l’arachide précoce (Spanish), une dormance de 2 à 3 semaines

est un caractère avantageux pour éviter les repousses au champ. Chez l’arachide, la dormance

est de nature physiologique. Elle est liée à un équilibre entre stimulateurs et inhibiteurs de la

germination qui agissent sur l’axe embryonnaire (Ketring et Morgan, 1971, 1972; Hammons,

1973b). Lorsque cet équilibre est dévié du côté des stimulateurs, la dormance est levée et la

graine germe. A l’inverse, la graine reste en état de dormance. Nautiyal et al. (1994) ont

observé qu’en fonction de la variété commerciale (Virginia, Spanish, Valencia), d’autres

composantes notamment le tégument, les cotylédons contribueraient plus ou moins à la

dormance des graines fraîches chez l’arachide. Par exemple, chez les variétés Spanish,

l’enlèvement du tégument améliorait la germination des graines dormantes (Bandyopadhyay

et al. 1999).

La dormance des graines fraîches chez l’arachide est un caractère héréditaire et donc un

caractère intrinsèque (constitutif). Comme tout caractère physiologique, elle est influencée par

les facteurs environnementaux (Figure 6) plus que le sont en général les caractères liés à la

morphologie (couleur, port, etc.). En fait, la dormance est également sous l’effet de facteurs

environnementaux. Chacun de ces facteurs déterminants joue un ou des rôles dans le

processus de la germination qui est une conséquence de la levée de la dormance chez les

graines dormantes. Comme l’indique la figure 6, ces facteurs environnementaux peuvent agir

même pendant le développement de la graine.

On peut classer la dormance d’une graine en trois grands types:

- une dormance dite tégumentaire liée à une imperméabilité du tégument à l’eau

et/ou l’oxygène

- une dormance chimique liée à la présence de composés phénoliques dans les tissus

externes qui réduisent la disponibilité de l’oxygène au niveau de l’axe

embryonnaire


16

- une dormance physiologique liée surtout à l’équilibre entre simulateurs et

inhibiteurs de la germination dans l’embryon. Selon le sens de cet équilibre,

l’embryon germe ou entre en dormance.

Mais une combinaison de deux ou plusieurs composantes de la dormance est le plus souvent

observée avec une composante dominante. Ainsi Baskin et Baskin (2004) ont distingué cinq

types de dormance chez les végétaux supérieurs (gymnospermes and angiospermes) :

- la dormance physiologique est la plus commune à l’échelle du règne végétal. Elle

est encore appelée dormance embryonnaire et est liée à la présence dans l’embryon

d’inhibiteurs de la germination tels que l’acide abscissique (ABA) ou l’auxine

(AIA). La levée de la dormance physiologique peut être obtenue par un traitement

des graines avec les stimulateurs ou promoteurs de la germination que sont l’acide

gibbérellique (GA3), l’éthylène (C2H4), etc.

- la dormance morphologique est la dormance liée à une immaturité de l’embryon.

Bien que celui-ci soit nettement différencié en cotylédons, l’hypocotyle et la

radicule, il n’a pas encore atteint la maturité. Pour que cet embryon puisse germer,

il a besoin de grandir pour atteindre sa maturité.

- la dormance morphophysiologique est liée à la fois à présence d’inhibiteurs de la

germination dans l’embryon (dormance physiologique) et à un embryon non

encore mature (dormance morphologique).

- la dormance physique est liée à une imperméabilité à l’eau du tégument ou des

couches superficielles qui limite l’entrée de l’eau dans la graine. Elle peut être

levée par une scarification mécanique ou chimique.

- la dormance combinatoire comme son nom l’indique est une dormance liée à la

fois à la présence dans l’embryon d’inhibiteurs de la germination et à une

imperméabilité tégumentaire à l’eau.

Dans chacune de ces classes, il est possible même de faire une typologie en fonction

de l’intensité de la dormance à savoir: dormance légère, dormance intermédiaire et

dormance intense.


17

C.= Conditions Figure 6. Relations entre le développement de la graine, les facteurs environnementaux, la dormance/germination des graines (D’après Li et Foley, 1997)

I.2.2. Les facteurs déterminants

I.2.2.1. Les phytohormones

Les études sur les effets des phytohormones et de leurs interactions sur la dormance/germination

des graines d’arachide ont été entreprises entre les années soixante et soixante-dix. Elles ont

permis de connaître la nature de la dormance des graines chez cette espèce.

I.2.2.1.1. L’éthylène

Chez l’arachide, l’axe embryonnaire produit de l’éthylène lorsque les graines sont mises à

imbibition. Ketring et Morgan (1964) ont observé que chez la variété NC-13 (une variété

Virginia avec une forte intensité de dormance), la production d’éthylène est relativement

faible par contre elle est élevée chez les variétés d’arachide de type Spanish non dormantes.

Ketring et Morgan (1972) ont montré chez l’arachide qu’une concentration interne de 0,9 µl/g

de matière fraîche est nécessaire pour permettre une germination chez les graines les plus

dormantes. Les graines dormantes germent en même temps que les graines non-dormantes

lorsqu’elles sont incubées dans de l’éthylène. Ces résultats montrent clairement que l’éthylène

Post-maturation

Génotype

Environnement

Graine non dormante

Graine en dormance primaire

C. favorables

C. défavorables

Graine en dormance secondaire

Germination

Quiescence

C. défavorables prolongées

Développement de la graine


18

est la principale phytohormone impliquée dans la germination des graines non-dormantes et

dans la levée de la dormance chez les graines dormantes.

I.2.2.1.2. Les cytokinines

Narasimhareddy et Swamy (1978, 1979) ont montré que chez l’arachide les cytokinines

s’accumulent dans la graine au cours du développement la graine entre le 20e et le 30e jour de

la phase de remplissage des gousses. Mais au-delà cette date, elle régresse jusqu’à la maturité

de la graine. Par ailleurs, ces auteurs ont montré que les graines de variétés non-dormantes

contiennent plus de cytokinines que les graines de variétés dormantes. La kinétine stimule la

biosynthèse de l’éthylène et par conséquent lève la dormance chez l’arachide (Ketring et

Morgan, 1971).

Un traitement des graines dormantes par la kinétine, la benzylaminopurine, l’acide 2-

Chloroethylphosphonique permettent d’atteindre des taux de germination similaires à ceux

des graines non-dormantes. Par contre, la coumarine a un faible effet stimulateur de la

germination chez l’arachide. Alors que l’acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, l’acide 2,2-

dimethylhydrazide n’ont pas d’effet sur la germination des graines d’arachides (Ketring et

Morgan, 1971).

I.2.2.1.3. L’acide abscissique

L’acide abscissique (ABA) inhibe la synthèse de l’éthylène et par conséquent diminue

le taux de germination des graines d’arachide (Ketring et Morgan, 1972). Ces derniers auteurs

ont conclu que l’accumulation de l’acide abscissique augmente progressivement du 20e au 50e

jour de la phase de développement chez graines des variétés dormantes par contre diminue à

partir du 40e jour chez les variétés non-dormantes (Narasimhareddy et Swamy (1979). Ces

derniers auteurs ont montré que la dormance des graines d’arachide est associée à la présence

de quantités élevées d’acide abscissique interne dans les graines des variétés dormantes.

Cadman et al. (2006) ont rapporté, à partir d’une analyse d’un transcriptome, chez un écotype

sans dormance d’Arabidopsis thaliana des quantités élevées d’acide abscissique (ABA)

lorsque les graines sont imbibées. Cependant, l’effet inhibiteur de l’acide abscissique sur la

germination des graines d’arachide est contrecarré par l’effet de la kinétine (Narasimhareddy

et Swamy, 1979).

I.2.2.1.4. L’acide gibberellique et les auxines

Sreeramulu (1974) a trouvé des concentrations élevées de substances analogues à

l’acide gibbérellique (GA3) chez des variétés non dormantes après la maturation. Son effet se

fait via son action stimulatrice modérée sur la synthèse de l’éthylène. Cependant,


19

contrairement aux autres espèces végétales, chez l’arachide l’acide gibbérellique n’est pas

aussi efficace que la kinétine pour lever la dormance chez l’arachide.

Des substances induisant la rhizogenèse donc analogues aux auxines ont été mises en

évidence dans les racines de variétés d’arachides non dormantes (Nagarajan et

Gopalakrishnan, 1957 et 1958). De façon générale, l’acide 3-Indole acétique (AIA) est un

stimulateur de la germination des graines. Cependant, Shibuya (1938) a conclu de ses travaux

que chez les graines fraîches d’arachide, l’AIA ne stimule la germination que lorsque les

graines sont scarifiées. Ketring et Morgan (1970) ont rapporté que l’AIA améliore légèrement

la germination des graines dormantes chez l’arachide. Ces résultats semblent indiquer que

l’action des auxines sur la levée de la dormance est secondaire comparativement à celle de

l’éthylène et dans une moindre mesure à celle des cytokinines.

D’autres substances chimiques naturelles (éthrel, les nitrates, le sulfocarbamide) ont

également un effet stimulateur de la germination des graines d’Amaranthus occidentalis alors

que le chlorure de sodium (NaCl) a un effet inhibiteur de la germination (Gul et Weber,

1998). Chez l’arachide, les travaux de Ketring et Morgan (1971); Udadhyaya et Nigam (1999)

ont montré que l’éthrel lève la dormance des graines. L’effet stimulateur de la germination

des graines par cette dernière substance a été également noté chez l’haricot mungo (Vigna

mungo) (Varadarajan et Prakasa Rao, 2002).

I.2.2.2. Les facteurs physico-chimiques

I.2.2.2.1. Oxygène et gaz carbonique

L’oxygène et le gaz carbonique sont deux gaz qui entrent dans la composition de l’air

atmosphérique. Dans le cas d’un sol totalement compact ou d’un sol immergé, la réduction

significative de la disponibilité de l’oxygène du fait de sa lente diffusion peut entrainer une

asphyxie embryonnaire pouvant aller jusqu’à la mort de l’embryon.

L’oxygène a un rôle essentiel dans le phénomène d’oxydation qui a lieu lors de la respiration.

Or la germination s’accompagne d’un réveil physiologique nécessitant beaucoup d’énergie

par le biais de la respiration. Cependant, l’oxygène est très rarement un facteur limitant du fait

de sa forte affinité avec les cytochromes.

Le gaz carbonique ou dioxyde de carbone (CO2) a un effet positif sur l’activité de

l’ACC oxydase (1-aminocyclopropane-1-carboxylase). Par cet effet, le CO2 stimule la

germination de graines dormantes via son effet stimulateur la biosynthèse de l’éthylène dont

le précurseur est l’Acide 1-aminocyclopropane-1-carboxylique. La conversion de l’ACC en

éthylène est maximale lorsque la concentration du gaz carbonique et de l’oxygène se situent


20

entre 0,3-1% et 1–10% et en présence 2% et 21%, respectivement (Esashi et al. 1985, 1986).

Ce résultat montre le rôle important que joue chacun de ces deux gaz dans le processus de la

germination d’une graine.

Hormis ces facteurs environnementaux qu’on pourrait qualifier de facteurs classiques

dont les effets sur l’expression du caractère sont plus connus, il existe d’autres facteurs qui

peuvent influencer la dormance/germination des graines d’arachide comme une déficience en

calcium. Marchand (1971) a observé sur trois variétés d’arachide que l’épandage de plâtre

(calcium) n’affecte pas le rendement, mais a un effet bénéfique sur la qualité des graines

puisqu’il réduit le pourcentage d’embryons malformés. Chez les graines à embryons

malformés, la germination est retardée par rapport à celle des graines à embryons normaux.

I.2.2.2.2. La température et la lumière

Au-delà de l’humidité du substrat, la température est le premier facteur déterminant

sur la germination de l’arachide avec un optimum de température situé entre 22 et 32oC selon

Catherinet (1959). En effet, lors du processus de la germination, il y a un réveil physiologique

dû à une plus intense activité enzymatique et une respiration embryonnaire accrue. Or

l’activité enzymatique dépend de la température. Ces deux processus biologiques que sont la

respiration et l’activité enzymatiques sont inhibés lorsque la température est basse (inférieure

15°C) alors que des températures supérieures à 40°C peuvent entrainer une dénaturation des

enzymes.

La lumière n’améliore pas de manière significative la germination des graines d’arachide

(Toole et al. 1964). En effet, ces auteurs ont montré que les graines d’arachide germent à

l’obscurité comme sous l’éclairement.

I.3. Les différentes phases de la germination d’une graine La levée de la dormance d’une graine se manifeste par la germination. Mais la

germination est un processus qui comporte 3 phases :

- Phase I : qui débute par une absorption d’eau entrainant le gonflement de la

graine. Elle s’accompagne d’une forte intensité respiratoire. Elle est très brève et

dure environs 12h.

- Phase II : c’est la germination au sens physiologique. Elle est caractérisée par une

stabilisation de l’hydratation des tissus et de l’activité respiratoire. Elle s’achève

avec le début de l’émergence de la radicule. A partir de celle-ci le retour à la vie

ralentie devient irréversible.


21

- Phase III : elle correspond à la croissance de la radicule puis de la tigelle. C’est

pour cette raison qu’elle se manifeste par une reprise de l’augmentation de

l’activité respiratoire entrainant ainsi un épuisement des réserves de la graine.

Le phénotypage de la dormance d’une graine doit donc se faire en précisant la phase pour

laquelle la graine phénotypée est considérée comme germée. Dans cette étude, la graine a été

considérée germée avec l’émergence de la radicule (phase II).

I.4. Les approches biométriques : analyse des moyennes de générations Lorsqu’on mesure la dormance d’une graine en termes de nombre de jours avant

germination, on obtient une donnée ou variable quantitative qui peut être utilisée pour estimer

les effets génétiques d’un quelconque caractère (rendement, hauteur de la plante, etc.). Cette

approche est applicable aussi bien pour les caractères génétiquement complexes que pour les

caractères simples. Elle est à présent celle qui a le plus permis de connaître la génétique de

caractères d’intérêts économiques. En effet, elle vise à caractériser de façon globale les effets

des facteurs génétiques impliqués dans l’expression des caractères. Elle requiert au préalable

de disposer de dispositifs génétiques adéquats. De par son pouvoir prédictif, la génétique

quantitative a permis de réaliser les plus grands progrès obtenus jusqu’ici dans l’amélioration

des plantes et des animaux tant sur les paramètres de productivité (rendements, les

composantes du rendement) mais également sur les paramètres de qualité (goût, la forme, la

teneur en tel ou tel élément nutritif, couleur, propriétés culinaires, etc.).

L’analyse des moyennes de générations est une des méthodes employées en génétique

quantitative pour étudier le contrôle génétique des caractères d’intérêts. Elle repose comme

toutes les autres méthodes d’analyses génétiques sur les lois mendéliennes mais permet

d’analyser des caractères complexes, ce que l’analyse mendélienne ne permet pas. Elle est

assez simple et permet d’estimer les effets génétiques aussi bien pour les caractères à hérédité

complexe que pour les caractères génétiquement simples à partir de modèles tels que ceux

d’Hayman (1958), de Mather et Jinks (1982). L’analyse des moyennes de générations

présente un avantage sur les autres méthodes (diallèle, test-cross) puisqu’elle permet une

subdivision orthogonale des effets d’interactions épistasiques en effets « additivité x

additivité », «additivité x dominance» et «dominance x dominance». Cette méthode permet

également d’estimer l’héritabilité « au sens large » et l’héritabilité «au sens strict» à partir des

composantes de la variance. Par conséquent, elle permet ainsi de mieux raisonner les

méthodes de sélection en fonction de l’importance relative de la variance additive par rapport


22

aux autres variances (dominance, épistasique, environnementale) et selon le mode de

reproduction de l’espèce.

I.5. L’hérédité de la dormance chez l’arachide Les études antérieures réalisées sur le contrôle génétique de la dormance des graines

fraîches chez l’arachide sont encore très limitées. Parmi les quelques études réalisées sur le

contrôlé génétique de la dormance des graines chez l’arachide, celles à partir de croisements

intrasubspécifiques sont particulièrement rares. Ce chapitre fait l’état des connaissances sur la

génétique de la dormance des graines fraîches chez l’arachide en spécifiant les études de

croisements intersubspécifiques à celles issues des croisements intrasubspécifiques.

I.5.1. Croisements intersubspécifiques

Les parents de ce type de croisement appartiennent à des variétés botaniques

différentes. Hull (1937) et John et al. (1948) ont réalisés différents croisements impliquant

soit une variété Spanish ou Valencia (sous-espèce fastigiata) et une variété Virginia (sous-

espèce hypogaea) et ont conclu sur l’existence de phénomène d’épistasies. Par contre Lin et

Lin (1971) ont conclu à partir de leur étude entre sous-espèces différentes que la dormance est

monogénique avec dominance complète de la dormance par rapport à la non-dormance.

Ramchandran (1967) a observé une dominance partielle à partir de croisements Spanish X

Virginia. Nautiyal et al. (1994) a conclu à partir de ses travaux que le caractère dormance des

graines d’arachide est polygénique. Les investigations les plus récents pour ce caractère, à

notre connaissance, entre variétés de sous-espèces différentes sont ceux de Kumar et Patel

(1999) qui ont réalisé six croisements intersubspécifiques. Ils ont montré à partir de leurs

travaux sur des croisements intersubspécifiques que la dormance des graines fraîches est sous

le contrôle d’effets d’additivité, de dominance et d’interactions digéniques.

Wadia et al. (1987) ont montré que les lignées d’arachide issues de croisements entre

Virginia et Spanish présentent un allongement de la longueur du cycle par rapport au cycle du

parent Spanish. Cette vraisemblable liaison génétique et/ou la présence d’une pléiotropie entre

la dormance et la longueur du cycle chez les variétés Virginia a fait que le transfert de la

dormance aux variétés du type botanique Spanish à partir des variétés Virginia pose un certain

problème lorsqu’on ne veut pas contre-sélectionner la précocité d’où l’intérêt de travailler sur

des descendances issues de croisements entre variétés Spanish. En effet, dans un contexte de

raccourcissement des hivernages dans la zone sahélienne, un allongement du cycle de la

plante (semis-maturité) même de quelques jours, pourrait compromettre l’adaptabilité d’une


23

variété dans les environnements de la zone SAT où la durée des hivernages a beaucoup

diminué.

I.5.2. Croisements intrasubspécifiques: Spanish x Spanish

Parmi les travaux antérieurs sur les croisements Spanish x Spanish, il y a ceux de

Khalfaoui (1991b) qui a conclu que le caractère dormance est sous le contrôle génétique

d’effets d’additivité, de dominance et d’épistasies digéniques. Par contre, Upadhyaya et

Nigam (1999) ont analysé plusieurs descendances de croisement Spanish x Spanish et sont

arrivés à la conclusion que le caractère dormance au sein des Spanish est monogénique et que

l’allèle de dormance est dominant. Kumar et Patel (1999) ont montré à partir d’un croisement

Spanish x Spanish que la dormance des graines fraîches est sous l’effet d’additivité et de

dominance et sans effets d’épistasies significatives. Par contre, Ndoye (2001) a conclu sur

l’existence d’effets d’additivité, de dominance et d’interactions digéniques. Ainsi les résultats

rapportés par ces travaux antérieurs montrent des controverses qu’il serait important

d’examiner en approfondissant l’étude de la dormance des graines fraîches. Une contribution

à l’étude génétique pourrait préciser certains points qui font l’objet de controverses en

s’appuyant sur une analyse combinée à partir de modèles biométriques, d’une analyse

qualitative et d’une utilisation de marqueurs moléculaires notamment des microsatellites.

Les phénomènes d’épistasies dans le contrôle des caractères héréditaires sont très peu

étudiés chez l’arachide. Chez les caractéristiques de la taille des graines d’arachide, Halward

et Wynne (1991), Upadhyaya et al. (1992) ont montré l’existence d’interactions interalléliques

en plus de leurs effets d’additivité, de dominance. Toutefois, les phénomènes d’épistasies

dépendent d’une part du fond génétique et des facteurs environnementaux d’autre part. En

effet, plus les parents du croisement sont génétiquement éloignés plus des interactions

épistasiques peuvent jouer un rôle important dans le contrôle génétique des caractères qui

ségrégent dans la population. Par ailleurs, les phénomènes d’épistasies interagissent avec

l’environnement plus que le font les effets d’additivité ou de dominance (Upadhyaya et

Nigam, 1998). Ce qui fait que pour un même caractère, les conclusions par rapport à

l’existence ou non d’épistasies peuvent être discordantes selon les conditions

environnementales. Une meilleure connaissance de la génétique du caractère au sein des

variétés du type botanique Spanish est souhaitable pour la formulation de recommandations

pour la sélection. Mais d’un point de vue de la sélection, c’est surtout la proportion de la

variance génétique due aux interactions épistasiques qui importe de plus que l’existence

d’effets d’epistasies. En effet, un caractère peut faire intervenir des effets d’épistasies sans


24

que celles-ci jouent un rôle important dans la variance génétique par contre le contraire n’est

pas vrai. C’est pour cette raison que cette étude abordera en plus de l’analyse des effets

génétiques en cause, l’analyse des composantes de la variance génétique pour le caractère

dormance des graines fraîches qui jusqu’ici n’a pas été faite chez l’arachide.

I.5.3. Sources des controverses

Les résultats souvent controversés sur les effets génétiques impliqués dans le contrôle

génétique de la dormance nous amènent à se poser la question de savoir à quel niveau se

situent les sources de ces controverses. Parmi les hypothèses plausibles, il y a deux

principales sources que sont les variations environnementales liées au dispositif expérimental

et les biais d’échantillonnage dans les populations testées. En effet, comme dans tout

phénotypage, le contrôle des effets environnementaux est plus ou moins bon selon le

dispositif expérimental utilisé, le nombre de répétitions par traitement étudié. De même, dans

le cas d’études génétiques, un biais peut provenir d’erreur d’échantillonnage notamment la

présence la présence d’individus issus de fleurs autofécondées. En dehors des facteurs

classiques tels que la température, la lumière, un déficit hydrique en fin de cycle qui peuvent

agir sur la dormance des graines fraîches par leur action sur la plante-mère. Le contrôle des

facteurs environnementaux reste une question délicate et varie en fonction du dispositif

expérimental utilisé, du nombre de répétitions pendant le test de germination proprement dit.

Si l’on se situe dans le cadre d’un test réalisé en milieu réel (au champ), les effets individuels

ou combinés de facteurs liés au dispositif de test qui peuvent induire des biais dans les

populations analysées sont principalement de deux ordres.

- D’une part la profondeur du semis: cette source d’erreurs peu être importante dans la

mesure où lorsque le semis n’est pas fait à la même profondeur, la croûte de sol au

dessus de la graine oppose à la levée de la graine une résistance plus ou moins

importante en fonction de la profondeur du semis. Ainsi des graines ayant germé le

même jour peuvent être décomptées à des dates différentes. Ainsi un semis superficiel

est plus adéquat dans le phénotypage au champ;

- D’autre part une irrigation non homogène: une irrigation homogène et régulière est

nécessaire lorsqu’on réalise un test de germination au champ du fait de l’importance

de l’eau dans le processus de la germination. En effet, l’humidité du sol peut être un

facteur limitant à la germination d’une graine.

Dans le cas d’un phénotypage au laboratoire, les variations liées à l’environnement du test

devraient être moins importantes. Cette méthode semble de ce fait la plus appropriée, du


25

moins si on se réfère uniquement au contrôle de l’environnement du test. Cependant, la

méthode au champ est plus proche des conditions naturelles dans lesquelles s’observe la

germination in-situ des graines fraîches de variétés non dormantes. Parmi les facteurs

environnementaux classiques (la température, l’humidité), il existe d’autres facteurs plus

difficilement contrôlables. Parmi ces facteurs dits secondaires, les embryons avec des

malformations ou les embryons immatures peuvent être à l’origine de biais de phénotypage.

Ces embryons germent moins rapidement que les embryons matures et normaux. Par contre,

les graines fraîches d’arachide dépelliculées germent plus rapidement que les graines avec

pellicules. Cela s’explique certainement par une imbibition de la graine plus rapidement. Par

ailleurs, indépendamment de la méthode de phénotypage, un biais dans les générations en

ségrégation pourrait être dû aux autofécondations pendant les croisements. Cela est d’autant

plus un problème crucial dans le cas de croisements entre variétés du même type botanique du

fait qu’on n’arrive difficilement à écarter les graines issues de l’autofécondation de celles qui

sont des hybrides. En effet, l’identification des hybrides issus de croisements du même type

botanique, à partir uniquement de différences morphologiques des individus hybrides, est

difficile à réaliser. Ainsi par exemple une population F1 non épurée peut contenir plusieurs

individus issus d’autofécondations et donc non hybrides.

I.6. Le marquage génétique Jusqu’ici on reconnait que la génétique quantitative est à l’origine des grands acquis

dans le domaine de l’amélioration des plantes et des animaux du fait de son rôle prédictif en

sélection. Cependant, la communauté scientifique est convaincue que les marqueurs

moléculaires devraient jouer une importance capitale vers l’autosuffisance alimentaire durant

les années à venir en apportant une aide particulière dans l’amélioration génétique des plantes

et des animaux. En effet, avec l’essor des biotechnologies à partir des années quatre-vingt

(80), la biologie moléculaire est un outil qui se développe de plus en plus dans le domaine de

l’amélioration des plantes. L’utilisation en sélection de marqueurs moléculaires a pour but de

limiter les inconvénients de la sélection basée exclusivement sur le phénotype. En effet, les

marqueurs moléculaires ne sont pas influencés par les facteurs environnementaux et les

interactions entre gènes (Staub et al. 1996 ; Sorrells et Wilson, 1997; Gupta et al. 1999).

Par ailleurs, les marqueurs moléculaires comparés aux marqueurs morphologiques et

biochimiques notamment protéiques, sont largement plus polymorphes (dix fois plus de

polymorphisme) mais également les marqueurs élargissent le champ d’investigation aux


26

régions non codantes (Bostein et al. 1980). Ces marqueurs moléculaires peuvent être utilisés à

différents niveaux de la sélection pour la rendre plus efficace:

• en amont de la sélection pour caractériser la diversité génétique d’un germplasme ou

d’une collection

• pour l’épuration d’une population de génotypes issus de croisements différents

• dans un programme de sélection pour suivre un gène donné d’une génération à une

autre par la cartographie génétique.

Ainsi depuis quelques années, le développement des marqueurs moléculaires a permis de

séquencer totalement le génome de plusieurs espèces végétales surtout les espèces modèles

comme Arabidopsis thaliana), le riz (Oryza sativa L.), la luzerne (Medicago trunculata), le

peuplier (Populus trichocarpa), la tomate (Lycopercison esculentum), le maïs (Zea mays). Les

avancées sur le marquage génétique d’une espèce dépendent surtout de son importance

économique, de la taille du génome, du niveau de polymorphisme moléculaire détectable avec

le type de marqueurs et l’avancée des biotechnologies.

I.6.1. L’arachide: une espèce à faible polymorphisme moléculaire

Chez l’arachide cultivée A. hypogaea L., bien qu’il existe une diversité

morphologique, physiologique et agronomique très large, le niveau de polymorphisme

moléculaire entre les variétés cultivées est relativement faible. Ce faible niveau de

polymorphisme est d’autant plus problématique entre les variétés de la même sous-espèce.

Les marqueurs de type RFLP, RAPD ou AFLP n’ont permis de mettre en évidence qu’un

faible niveau de polymorphisme moléculaire chez l’espèce Arachis hypogaea L. Halward et

al. (1991, 1992) n’ont mis en évidence qu’un très faible polymorphisme en utilisant les

techniques RFLP ou de RAPD sur vingt-cinq (25) lignées d’origines diverses (Amérique du

sud, Chine et Afrique). De même, Paik-Ro et al. (1992) n’ont trouvé que peu de

polymorphisme de marqueurs RFLP combinant trente et deux (32) endonucléases et plusieurs

sondes sur sept (7) accessions de la sous-espèce hypogaea et seize (16) accessions de la sous-

espèce fastigiata. Globalement, les marqueurs RFLPs (Kochert, 1991), RAPDs (Dos Santos et

al. 2003, Cunha da et al. 2007) et AFLPs (He et Prakash, 2001; Herselman, 2003 ;

Moretzsohn et al. 2004) ont permis surtout d’améliorer les connaissances de la diversité

génétique et la phylogénie du genre Arachis. Par contre, leur utilisation pour la cartographie

des gènes chez l’arachide est restée très limitée.

Ces dernières années, plusieurs équipes de recherches ont développé des marqueurs

microsatellites chez l’arachide qui ont permis de révéler plus de polymorphisme moléculaire


27

entre variétés de l’espèce cultivée (A. hypogaea L.) ainsi qu’entre celle-ci et les espèces

sauvages apparentées. Hopkins et al. (1999) utilisant 26 séquences microsatellites variant

entre 200 à 800 pb sondées avec des oligonucléotides (GT)10 et (CT)10, ont identifié six (6)

couples d’amorces permettant de mettre en évidence du polymorphisme sur vingt-deux (22)

génotypes d’arachide. D’autres travaux ont permis d’identifier un total de cent soixante et

deux (162) marqueurs microsatellites (Palmieri et al. 2002; He et al. 2003 ; Moretzsohn et al.

2004 ; Palmieri et al. 2005 ; Bravo et al. 2005 ; Gimenes et al. 2005). Moretzsohn et al. (2005)

ont proposé deux cent soixante-onze (271) nouveaux marqueurs microsatellites obtenus à

partir de banques génomiques enrichies, de séquences d’EST et de gènes disponibles dans

Genbank. Parmi ces 271 marqueurs, soixante-six (66) ont révélé du polymorphisme dans un

panel de six (6) variétés d’arachide cultivée. Cuc et al. (2008) ont développé cent soixante-dix

(170) microsatellites à partir de la variété d’arachide TMV2. Actuellement, le nombre de

SSRs développés chez l’arachide a atteint environ deux mille marqueurs dont certains n’ont

pas encore été publiés.

Le faible polymorphisme moléculaire chez l’arachide cultivée est dû au fait que

l’arachide cultivée A. hypogaea L. trouve son origine dans l’hybridation de deux espèces

diploïdes sauvages, suivie par une duplication spontanée des chromosomes de chaque

génome. L’espèce allotétraploïde qui en a résulté montre une vigueur hybride mais est restée

isolée des espèces sauvages du même genre, Arachis. Cette base génétique étroite de

l’arachide est due également en partie au fait que les programmes de sélection n’ont pas

exploité toute la diversité génétique au sein de l’espèce cultivée (Upadhyaya et al. 2003). Ces

auteurs ont montré que parmi les variétés existantes, seul un nombre restreint est

actuellement cultivé à travers le monde. On pense aujourd’hui que l’élargissement de la base

génétique de l’arachide cultivée pourrait se faire avec le développement de lignées

d’introgressions à partir de croisements entre l’espèce cultivée et les espèces sauvages

apparentées. Les travaux en cours au CNRA (Bambey, Sénégal) en vue de développer des

lignées d’introgressions entre variétés d’arachide cultivée (Fleur 11 et 55-437) et deux

amphidiploïdes sont parmi ceux qui pourraient permettre dans les années à venir d’isoler des

lignées isogéniques issues de croisements entre l’arachide cultivée et les espèces sauvages

apparentées. Ces telles lignées isogéniques permettront d’avoir des niveaux de production

similaires à ceux des variétés issues de croisements cultivé x cultivé et d’introgresser d’autres

gènes de résistances à diverses contraintes biotiques et abiotiques.


28

I.6.2. Les microsatellites et leur utilisation en sélection

Les microsatellites dénommés simple sequence repeats (SSRs) ou séquences répétées

en tandem sont constitués de quelques paires de bases répétées en tandem, montrant une

variation de longueur (Morgante et Olivieri, 1993). La Figure 7 schématise un microsatellite

entouré de part et d’autre par ses amorces flanquantes.

Figure 7. Schématisation d’un microsatellite entouré par les séquences flanquantes

Source: http://www.upmc.fr/

Les marqueurs microsatellites sont répartis sur l’ensemble du génome des eucaryotes et sont

particulièrement variables d’où leur bon potentiel pour l’utilisation en cartographie génétique.

Les autres caractéristiques des microsatellites qui font d’eux de bons marqueurs génétiques

sont:

• les microsatellites reposent sur la technique d’amplification en chaîne (PCR) et donc

nécessitent peu d’ADN,

• les marqueurs microsatellites sont codominants c’est-à-dire permettent d’identifier les

homozygotes des hétérozygotes, contrairement aux marqueurs de types RAPDs ou

AFLPs qui sont des marqueurs dominants,


29

• les marqueurs microsatellites sont spécifiques: les amorces flanquantes du

microsatellite sont spécifiques même si la séquence répétée ne l’est pas.

Même si les marqueurs détectés par la technique RFLP possèdent les critères génétiques

précités (codominants et locus spécifiques), leur utilisation en sélection assistée par

marqueurs (SAM) reste limitée par le fait que leur analyse est laborieuse et requiert plus de

technicité de la part de l’utilisateur. Les marqueurs de type RAPDs et les marqueurs de type

AFLPs sont dominants et non spécifiques, par conséquent moins informatifs pour la

cartographie génétique c’est-à-dire la construction de cartes génétiques et la recherche de loci

impliqués dans les caractères quantitatifs ou QTLs (quantitative trait loci). Par conséquent, les

microsatellites, même s’ils nécessitent des coûts plus élevés pour leur isolement et leur

caractérisation, sont aujourd’hui le type de marqueur moléculaire le plus indiqué pour la

cartographie génétique particulièrement chez les espèces dites récalcitrantes montrant un

faible polymorphisme moléculaire.

I.7. Principe et intérêts de l’analyse de ségrégants regroupés ou bulk segregation analysis

La recherche de loci impliqués dans les caractères quantitatifs (QTLs) est coûteuse

puisqu’elle repose sur le génotypage de tous les individus d’une population en ségrégation

(F2s, lignées recombinantes, des haploïdes doublés) avec souvent plusieurs centaines de

marqueurs polymorphes pour une bonne densité de marquage. Ce travail de génotypage est

couplé au phénotypage de tous les individus de la population de cartographie. De ce fait, cette

démarche est onéreuse et nécessite beaucoup de temps. En revanche, une alternative de

l’analyse QTLs fine peut être utilisée, lorsqu’on recherche un gène majeur, l’analyse de

mélanges en ségrégation peut être utilisée pour identifier et cartographier des marqueurs liés

aux caractères sous le contrôle d’un nombre limité de gènes. Il s’agit de l’analyse de

ségrégants regroupés ou bulk segregation analysis (BSA) (Michelmore et al. 1991). Dans la

méthode BSA, au lieu de génotyper toute la population ségrégante, deux échantillons ou

mélanges «bulks» sont constitués: l’un formé d’individus qui expriment fortement le

caractère, l’autre formé d’individus exprimant faiblement le caractère ou ne l’exprimant pas

du tout. Ainsi les marqueurs génétiquement liés au gène codant pour l’expression du caractère

sont représentés par des allèles différents dans les deux bulks par contre les marqueurs non

liés au gène seront répartis arbitrairement entre les bulks. Cette méthode permet non

seulement d’avoir un gain de temps mais nécessite un coût financier nettement plus bas. En

effet, le nombre de réactions PCR passe de N (nombre individus de la population) X nombre


30

de marqueurs à 2 X nombre de marqueurs analysés. Toutefois, le choix des individus est

délicat pour la constitution des bulks. Néanmoins, Mackay et Caligari (2000) ont montré que

la probabilité de faux-positifs est inférieure à 0,0001 avec des bulks constitués de 10 individus

et utilisant un type de marqueur codominant. Ce qui fait de la BSA une méthode très

avantageuse et qui peut être valablement utilisée pour la cartographie des caractères à

déterminisme génétique simple.

La recherche de QTLs ou l’analyse QTLs repose sur le fait que lorsqu’un marqueur

moléculaire est lié à un gène qui contrôle tout ou une partie de la variation d’un caractère, il

ségrège avec ce dernier dans la descendance du croisement. En sélection assistée de

marqueurs (SAM), c’est cette association entre marqueur locus et le gène ou le QTL qui est

mise à profit. Plus le marqueur locus est proche du gène mieux l’utilisation de ce marqueur est

approprié pour suivre le gène dans une descendance. En effet, le taux de recombinaison entre

l’allèle marqueur et le gène (QTL) est inversement proportionnel à la distance génétique qui

les sépare.

I.8. Cartes génétiques et leur utilisation en sélection chez l’arachide En plus du développement de marqueurs moléculaires, l’utilisation des outils

moléculaires pour la sélection nécessite la construction de cartes génétiques saturées. Ces

cartes génétiques permettent de déterminer les distances génétiques entre un gène ou QTL

donné et un marqueur moléculaire qui lui est lié. Chez l’arachide bien que le nombre

microsatellites isolés et publiés a beaucoup augmenté à partir de 2004, les de cartes

génétiques construites restent toujours peu nombreuses du fait du faible polymorphisme

moléculaire entre les variétés de l’espèce cultivée (A. hypogaea L.).

La construction de cartes génétiques chez l’arachide a débuté avec les travaux de

Halward et al. (1993) à partir d’une population F2 issue d’un croisement entre les deux

espèces sauvages diploïdes porteuses du génome A (A. stenosperma et A. cardenasii). Ces

mêmes parents ont été utilisés pour construire une carte génétique à partir d’une population

backcross BC1, cette carte comporte cent soixante sept (167) RAPDs et trente-neuf (39)

RFLPs (Garcia et al. 1995). La troisième carte génétique sur le sous-génome AA de l’arachide

est celle de Moretzshon et al. (2005) construite avec cent soixante-dix (170) SSRs avec onze

(11) groupes de liaisons (GL). Burow et al. (2001) ont construit la première carte génétique

tétraploïde de l’arachide à partir d’une descendance d’un rétrocroisement obtenu entre le

cultivar américain Florunner et un amphidiploïde TxAG-6 [A. batizocoi x (A. cardenasii x A.

diogoi)]X4. Cette carte tétraploïde comporte 23 groupes de liaisons avec une longueur totale


31

2210 cM, elle est aujourd’hui l’une des deux cartes génétiques tétraploïdes les plus saturées

construites chez l’arachide. La seconde carte génétique tétraploïde est celle construite par

Varshney et al. (2008). Elle est pour le moment la seule carte construite à partir d’un

croisement cultivé x cultivé chez l’arachide. Elle comporte 22 GLs mais avec six groupes de

liaisons ne comportant que deux (2) marqueurs ce qui veut qu’elle n’est pas saturée sur ces

groupes de liaisons. La dernière carte tétraploïde est celle que nous avons publiée (Foncéka et

al. 2009). Cette carte a été construite à partir d’une population BC1 issue du croisement entre

la variété sénégalaise Fleur 11 et l’amphidiploïde (A. ipaënsis x A. duranensis)x4. A. ipaënsis

et A. duranensis sont respectivement donneur du génome A et donneur du génome B de

l’espèce cultivée (A. hypogaea L.). Cette carte tétraploïde qui comporte 21 GLs et avec une

longueur totale de 1843,7 cM avec en distance moyenne de 6,1 cM entre marqueurs adjacents,

est la carte génétique la plus saturée après celle de Burow et al. (2001).

Du fait de ce nombre encore très limité de cartes génétiques construites chez

l’arachide, l’identification et la cartographie de marqueurs moléculaires pouvant être utilisés

dans les programmes de sélection reste faible. C’est pour cette raison que très peu d’études

ont encore été réalisées pour identifier des marqueurs moléculaires pouvant être utilisés pour

la sélection assistée par marqueurs chez l’arachide. Néanmoins, des résultats intéressants

notamment dans la résistance aux maladies de l’arachide ont été obtenus. Par exemple, Garcia

et al. (1996) ont identifié des marqueurs RAPD liés aux deux gènes contrôlant la résistance à

la galle du collet due au nématode Meloidogyne arenaria, à partir d’une analyse BSA.

Herselman et al. (2004) ont identifié des marqueurs AFLPs liés au gène récessif conférant la

résistance à la maladie de la rosette de l’arachide en utilisant la méthode BSA. Mondal et al.

(2007) ont trouvé deux marqueurs RAPD liés au gène de résistance à la rouille chez l’arachide

en adoptant la méthode BSA modifiée à partir du croisement entre VG 9514 et TAG 24. A

partir du croisement entre TAG24 et ICGV 86031, des QTLs impliqués dans l’adaptation à la

sécheresse chez l’arachide (la teneur en chlorophylle, l’indice de surface foliaire etc.) ont été

identifiés par Varshney et al. (2008). Selveraj et al. (2009) ont identifié des QTLs liés aux

caractéristiques des gousses et des graines chez l’arachide à partir du croisement entre

Tamrun OL01 (de type Runner) et BSS 56 (de type Spanish).

Vu la littérature sur la cartographie génétique chez l’arachide, le travail de recherche

de marqueurs moléculaires liés aux caractères d’intérêts à partir d’un croisement cultivé x

cultivé chez l’arachide qui va être réalisé dans cette thèse est à son début. Par ailleurs, à notre

connaissance, c’est la première étude où une recherche de marqueurs moléculaires liés à la

dormance des graines chez l’arachide a été effectuée.

Chapitre II : Phénotypage de la dormance des graines fraîches de l’arachide

32

CHAPITRE II : PHENOTYPAGE DE LA DORMANCE

DES GRAINES FRAICHES D’ARACHIDE:

COMPARAISON DE DEUX METHODES


33

II.1. Introduction En sélection, il y a lieu de distinguer la méthode de phénotypage d’un caractère donné

et la stratégie de sélection qui sont toutes importantes pour réussir un programme

d’amélioration d’un quelconque matériel végétal pour un caractère donné. La méthode de

phénotypage permet d’attribuer à chacun des individus de la population étudiée une valeur

donnée. Autant une méthode de phénotypage est précise mieux elle est plus appropriée pour

mesurer la variabilité du caractère entre individus et groupes d’individus proches ou éloignés

génétiquement. Par contre, la stratégie de sélection est la méthode de sélection efficace du

caractère qui ne peut être connue que sur la base d’une bonne connaissance du contrôle

génétique du caractère et du mode de reproduction de l’espèce. C’est pourquoi le phénotypage

est extrêmement important puisque l’analyse des effets génétiques de tout caractère ne saurait

être faite sans un bon phénotypage quelque la méthode d’analyses biométriques (diallèle, test-

cross, analyse des moyennes de générations) utilisée.

La dormance de l’arachide est, d’un point de vue du phénotypage, une caractéristique

de la graine prise individuellement et non une caractéristique de la plante toute entière à cause

du développement et de la maturité asynchrone des gousses et des graines d’un pied donné.

En effet, la floraison de l’arachide est indéterminée et par conséquent, sur un même pied, les

gousses sont à des niveaux de maturité plus ou moins différents. Par ailleurs, au sein d’une

même gousse, la graine basale serait plus dormante que la graine apicale. Ketring (1970) a

estimé qu’un décalage de 72 heures (3 jours) peut être observée entre le temps de germination

de la graine apicale et celle basale d’une même gousse. Toutefois, la justification de cette

différence de dormance entre graines d’une même gousse reste encore peu comprise.

Le phénotypage de la dormance des graines d’arachide se fait habituellement au

champ directement où au laboratoire. Cependant, aucune étude systématique n’a encore été

faite pour comparer les résultats de tests de la dormance des graines chez l’arachide par ces

deux méthodes de phénotypage. Ndoye (2001) et Nautiyal et al. (2001) ont trouvé un

coefficient de corrélation élevé entre les repousses de gousses sur les plantes-mères et les

résultats de test de germination réalisés au laboratoire. Khalfaoui (1991b) a réalisé ses travaux

sur la génétique du caractère de la dormance à partir de test de germination des graines.

D’autres auteurs comme Upadhyaya et Nigam (1999) ont travaillé au laboratoire en mettant

les graines fraîchement récoltées sur papier buvard imbibé d’eau. Cependant, à notre

connaissance, aucune étude n’a encore été réalisée sur une comparaison des résultats de tests

de germination au laboratoire avec ceux directement réalisés au champ. Par ailleurs, des tests

pluriannuels de phénotypage sont particulièrement importants pour évaluer l’effet de


34

variations interannuelles. Par rapport à ce dernier point, peu d’études ont été faites sur la

dormance des graines fraîches de l’arachide (Toole et al. 1964 ; Kumar et al. 1991).

Ainsi dans cette étude, cinq lignées avancées (L2, L4, L9, L19 et L24) issues du croisement

55-437 x 73-30 et deux (2) autres lignées avancées (L6 et L27) issues du croisement Fleur 11

x 73-30 ont été testées pour la dormance de leurs graines fraîches au champ et au laboratoire.

Ces sept lignées avancées ont été comparées à leurs parents (Fleur 11, 55-437 et 73-30)

utilisées comme témoins. Fleur 11 et 55-437 sont les témoins non dormants et 73-30 est le

témoin dormant.

C’est ainsi que ce travail a pour objectifs (i) comparer le niveau de dormance de

lignées sur deux années successives issues de croisements entre variétés Spanish (ii) comparer

les résultats de la dormance d’une lignée donnée pour le test au champ à celui réalisé au

laboratoire (iii) classer les entrées selon le niveau de dormance à partir de l’échelle de

Landfort et al. 1965.

Cette étude a fait l’objet d’un article intitulé « Evaluation of fresh seed dormancy on seven

peanut (Arachis hypogaea L.) lines derived from crosses between Spanish varieties :

variability on intensity and duration », par Issa FAYE, Ousmane NDOYE, Tahir A. Diop,

publié dans la revue Journal of Applied Science Research, 5 (7): 853-857, 2009

Journal of Applied Scienes Research, 5(7): 853-857, 2009

© 2009, INSInet Publication

Evaluation of Fresh Seed Dormancy on Seven Peanut (Arachis Hypogaea L.) LinesDerived from Crosses Between Spanish Varieties : Variability on Intensity and Duration

FAYE I., NDOYE O. and DIOP T.A.1,2 2 1

Université Cheikh Anta Diop, - Faculté des Sciences et Techniques-Laboratoire des1

Biotechnologies des Champignons (LBC), Fann-Dakar (Sénégal)Institut Sénégalais de Recherches Agricoles-Centre National de Recherches Agronomiques2

(CNRA), Bambey (Sénégal)

Abstract: Seven (7) advanced peanut (Arachis hypogaea L.) lines developed from crosses between the

dormant Spanish-type variety (73-30) and two non-dormant Spanish-type varieties (55-437 and Fleur 11),were studied and compared with their parents for fresh seed dormancy on-farm and laboratory test across

over two years. The intensity of dormancy ranged from 12% for the lines L6 to 100 % for line L2 andL4. These latter lines exhibited dormancy duration longer than 35 days while the line L6 showed a period

of dormancy of one to two weeks. On the basis of the dormancy’s scale used, the rate of the degree ofseed dormancy for the lines ranged from level 3 for the line L6 which was the least dormant line to level

8 for the lines L2 and L4 which were the most dormant lines. Our results showed strong similaritybetween the field test and the laboratory test. Therefore, one could use the laboratory test instead of the

field test to screen for fresh seed dormancy in peanut lines since the field test is more tedious than thelaboratory test.

Key words: Arachis hypogaea L., varieties, lines, intensity, duration of dormancy.

INTRODUCTION

Groundnut (Arachis hypogaea L) is the most

important oilseed and cash crop in semi-arid tropicsNtare et al. . Since the 70’s years, drought in sub-[16]

Sahelian tropics regions has induced a shortening ofthe rainy season and an erratic rainfall. These climatic

changes led to an occurrence of cultivars inenvironments out of their recommended area. In

Senegal, one of the most drought prone areas is thegroundnut growing area, usually called the “groundnut

basin”. The main focus of the groundnut improvementprogram carried out in the central and northern regions

of the Senegalese “groundnut basin” was to createearly groundnut varieties that could cope with drought

that may occur at the end of the rainy season periodAnnerose . Khalfaoui . However, such early varieties[1] [8]

belonging to Spanish-type usually lack fresh seeddormancy. Then rains that may fall at the harvest

period could cause in situ germination. Thisphenomenon is a major problem in Senegal. Gautreau[4]

found that the yield losses due to sprouts of Spanishvarieties are considerable and range from 10 to 20% of

the pod yield. Moreover, the sprouting is known toincrease the susceptibility of peanut to Aspergillus

infection, which can result in aflatoxin contaminationMartin . Then, sprouting may also result in low seed[13]

quality. Therefore, testing or breeding for fresh seed

dormancy in peanut is important in environments whererains may occur after peanut maturity.

Taxonomically, the cultivated peanut A. hypogaeaL. is divided into two subspecies, one with two

botanical varieties, and one with four. In the subspecieshypogaea var. hypogaea (Virginia and Runner market

types) and var. hirsuta, the varieties have long durationcycle and seeds are dormant. While in subspecies

fastigiata with var. fastigiata (Valencia market class)and var. vulgaris (Spanish market class), the varieties

are early-maturing but generally without fresh seeddormancy Krapovockas and Gregory . Attempts to[9]

select peanut lines from intersubspecies Virginia XSpanish crosses may lead to lines with fresh seed

dormancy but matures up to 10 days latter than theSpanish parent Wadia et al. . Some authors found[20]

genetic variability within ssp. fastigiata for fresh seeddormancy Hull ; Varisai Muhammad and Dorairaj ;[5] [19]

Pandya and Patel and Wadia et al. . However,[17] [20]

Spanish varieties released with fresh seed dormancy

still remain limited because of the little number thestudies involving Spanish x Spanish crosses.

Our objectives in this study were (i) to estimatethe intensity of dormancy of seven advanced peanut

lines selected from two Spansh x Spanish crosses (ii)to estimate the duration of their fresh seed dormancy

Corresponding Author: DIOP T.A., Université Cheikh Anta Diop, - Faculté des Sciences et Techniques-Laboratoire desBiotechnologies des Champignons (LBC), Fann-Dakar (Sénégal); Tel/Fax : 221 33 864 66 58E.mail: [email protected]

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and rank them using the scale of Landfort et al. , [11]

(iii) to compare results from the laboratory test to thosefrom on-farm test.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material: Seven advanced peanut lines (L2, L4,

L6, L9, L19, L24 and L27) developed from crossesbetween Spanish-type varieties were involved in this

study. They are the lines L2, L4, L9, L19 and L24which are selecting from the cross (55-437 x 73-30)

and the lines L6 and L27 selected from the cross(Fleur 11 x 73-30). These seven lines were compared

to their parents used as check varieties. The parentvarieties 55-437 and Fleur 11 are commonly cultivated

in the “Senegalese peanut basin” and are shortmaturing varieties (90 days) but without fresh seed

dormancy. The cv. Fleur 11 is the most susceptibleparent to in situ germination. The cultivar 73-30 (95

days) is a dormant variety, selected in Senegal, but it’snow less cultivated because its agronomical

performances are less high than the others twovarieties. However, its dormancy allows it to withstand

late rains.These three varieties used in this study, even

though they belong to the Spanish-type, are allunrelated by pedigree. The crosses were made at the

National Agronomical Research Institute (CNRA,Bambey-Senegal) and the seven lines selected were

developed by single seed descend from F2 to F7.

Experimental Designs Field Tests: During the year2005, the ten entries (lines and the checks) were

cultivated at experimental station of CNRA (Bambey-Senegal) till harvest at 90 days after sowing (90 DAS).

At harvest (during the fall season), a sample of maturepods was randomly collected from each entry for the

fresh seed dormancy test. The pods were shelled andenough caution was taken to prevent any damage of

the seed components (testa, cotyledons and embryo).Prior to the planting, the seeds were spread with a

fungicide named Granox. The maturity of the pods wasassessed by the blackening of the internal inner

parenchyma of the pod Miller and Burns . Since[14]

apical seeds are known to be less dormant than basal

seeds Ketring and Morgan . Therefore, all the tests in[7]

this study were performed using apical seeds.

The experimental design is a randomized completeblock design with four replications. Each replication

consisted of ten seeds sown at 1 to 2 cm in a sandysoil for each entry. The seeds for the same entry were

50cm spaced. The inter-row spacing was set at 60 cm.The soil moisture was kept high during all the period

of the test (35 DAS) by watering.During the year 2006, the entries were re-tested

using the same experimental design at the same

location and at the same period. Germinated seeds were

eliminated each day and water was added if neededuntil the end of the experiment

Laboratory Test: Concurrently to the field test, a test

was performed in Petri-dishes washed with sodiumhypocrite (46°) in laboratory without using an incubator

in 2005. Ten seeds randomly selected were sown in aPetri-dish using filter paper moistened with distilled

water and replicated four times for each entry. Duringthe test, the mean day/night temperature in the

laboratory was 35/26°C. The filter paper wasmaintained moist by adding distilled water every day

and the experimentation lasted 14 days. Seed wasconsidered to germinate as soon as the radical

appeared. Here also germinated seeds were eliminatedeach day.

Estimated Parameters: The percentage of germinated

seeds for entry at a given date was calculated by thefollowing formula: Germination (%) = Number of

germinated seeds * 100/Total number of seeds Seeddormancy is characterized by its intensity and duration.

These parameters were estimated using the methodsuggested by Kumar et al. .[10]

According to these latter authors, intensity ofdormancy is defined as the percentage of seeds that not

germinated seven (7) days after the harvest. It wascarried out from field investigation and laboratory test

in 2005.The duration of dormancy was measured by the

number of days taken to attain 50% of germinatedseeds. Its agronomical implications are important since

it gives a date from which the losses on the pod yielddue to sprouting in the field will be considerable. The

dormancy duration was performed on data collected on-farm investigation over two seasons.

The scale devised by Landfort et al . was used to[11]

rate the degree of dormancy. It was performed on data

collected from on field investigation in 2005.

Statistical Analysis: Prior to statistical analysis,germination percentages were subjected to an angular

transformation [X’=2*arc sin(X) ]. Analysis of1 /2

variance was performed using the statistical package

MSTATC (version 2). The partitioning of means wasmade with Newman Keul’s Test at 5% probability

level.

RESULTS AND DISCUSSION

Results: The percentages of germinated seeds from thefield tests (2005 and 2006) are summarized in Table 1.

Analysis of variance has shown significant differences(P<0.0001) between the entries in both two years. The

lowest percentages of germinated seeds were observed

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Table 1: Germination percentages of entries tested at weekly internals after harvest in the field over two seasons

Year 2005 Year 2006

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Days after sowing (DAS)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Entry 7 14 21 28 35 7 14 21 28 35

L2 0c 5d 7c 10c 17b 2cd 4f 11e 15d 15d

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L4 0c 0d 5c 15c 22b 0d 1f 12e 14d 14d

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L6 47ab 60abc 72ab 77ab 80ab 25b 58bc 78bc 83ab 83ab

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L9 17bc 17cd 37bc 37bc 45b 19bc 44cd 51cd 71bc 71bc

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L19 15bc 32bcd 57abc 65abc 67ab 39b 74b 81abc 82ab 82ab

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L24 2c 2d 17bc 25bc 32b 1cd 5f 6e 9d 9d

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L27 20bc 22cd 35bc 42bc 52ab 5cd 24de 34de 39d 39d

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

73-30 10bc 15cd 27bc 40bc 47ab 4cd 10ef 12e 14d 14d

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

55-437 62a 77ab 97a 97a 97a 67a 91a 96ab 96a 96a

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Fleur 11 72a 95a 97a 97a 97a 46ab 96a 99a 99a 99 a

For a given date, values followed by different letters are statistically different at 5%

with lines L2 and L4 in 2005 and 2006. For a given

entry, percentages of germination have varied slightlyfrom one year to another. In fact, beyond

environmental conditions such as temperature andmoisture, others non-genetic factors could influence the

seed germination in peanut Toole et al. .[18]

For both two years, lines L2, L4 and L24 have

shown lower percentages of germinated seeds andstatistically similar to the dormant variety 73-30.

These lines are all selected from the cross 55-437 X73-30. The others lines L6 and L27 showed lower

percentages of germinated seeds bud were notstatistically different to the non-dormant check varieties

(Fleur 11 and 55-437).Table 2 sets the percentages of germinated seeds in

the laboratory test. Significant differences (P<0.0001)between the entries were also found in the laboratory

test. High values of percentages of germinationobtained in laboratory test compared to the field test

could be attributed to a higher incubation temperaturein the laboratory. Except for the line L6, all the lines

showed lower percentages of seed germinationcompared to non-dormant check varieties (Fleur 11 and

55-437). As in the field test, lines L2 and L4 exhibitedthe lowest percentages of germinated seeds and the

highest percentages of germinated seeds were observedin the non-dormant varieties (Fleur 11 and 55-437) and

line L6.

Intensity of Dormancy: Intensity of dormancy fromthe field investigation and laboratory test in 2005 was

presented in Table 3. The intensity of dormancy rangedfrom 100% to 15%. This finding is in agreement with

the results of Kumar (1991) with others genotypes.

Such large variations in the intensity of dormancy

could be related to genetic differences between theentries tested. The entries L2 and L4 and the dormant

variety 73-30 showed the highest values of intensity ofdormancy in both environments. While the non-dormant

varieties (Fleur 11 and 55-437) and line L6 exhibitedthe lowest intensity of dormancy.

Table 2: Germ ination percentage of entries at 7 DAS in the

laboratory

Entries Germination percentage (%)

L2 12c

L4 7c

L6 62ab

L9 32bc

L19 40bc

L24 20bc

L27 30bc

73-30 10c

55-437 85a

Fleur 11 87a

For a given date, values followed by different letters are statistically

different at 5%

Table 3: Intensity of dorm ancy evaluated on the field and at the

laboratory conditions in 2005

Intensity of dormancy (%)

---------------------------------------------------------------

Entries Field Laboratory

L2 100 88

L4 100 93

L6 53 38

L9 83 68

L19 85 60

L24 98 80

L27 80 70

73-30 90 90

55-437 38 15

Fleur 11 28 17

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Even if the intensity of dormancy of a given entryvaried slightly from the field conditions to thelaboratory conditions, similarity existed between theresults gained from these two environments. Actually,intensities from the field test were similar to thosefrom the laboratory investigation (Table 5). Thissimilarity between the field test and the laboratory testhas been reported by Ndoye . Furthermore the latter[15]

author found a high correlation coefficient betweenthese methods of screening for fresh dormancy.Therefore, laboratory test could be used to assesseffectively the intensity of dormancy in peanut. For apractical standpoint, the laboratory test will ease theassessment of a huge number of varieties or linesunder investigation.

Duration of Dormancy: The lines showed differentdormancy duration (Table 4). It ranged from more than35 DAS to seven (7) DAS. Line 2, line 4 and L24were persistently the more dormant lines. Theirduration of dormancy was more than 35 DAS as it wasfor the check dormant variety 73-30. In contrast, thecheck non-dormant varieties (Fleur 11 and 55-437) andline L6 have shown dormancy duration between oneand two weeks (14 DAS). These results were consistentwith the findings of many authors Hull . Pandya and[5]

Patel and Wadia et al. . In fact, they argued that[17] [21]

there’s genetic variability for seed dormancy amongSpanish-type peanut varieties.

We found that intensity and duration of dormancyseemed to be correlated as it was reported previouslyby Kumar et al. in some of the varieties he used in [10]

his study. Actually, the more the intensity of dormancywas the longer was dormancy duration (Table 3, 4)meaning that these lines showed strong and longduration seed dormancy.

As the intensity of dormancy, the duration ofdormancy for a given entry varied more or less overseasons due to non-genetic factors. Many authorsHull . Bailey et al. . Toole et al. . Ketring et[5] [2] [18]

Morgan . Kumar et al. reported that seed dormancy[7] [10]

is influenced by environmental conditions and moreoverthe mother-plant environment may have influence onthe dormancy of the seeds.

When the scale of Landfort et al. was used to [11]

rate the degree of seed dormancy of the entries, they

laid on different levels (Table 5). While the susceptible

check variety (Fleur 11) was on level 2, the most

dormant lines (L4, L2) were in the highest level of

dormancy (level 8). Therefore, we observed from the

rating that the tested lines were dispatched into two

groups depending on the level of dormancy (Table 5).

Definitely, we noted that line L6 and the non-dormant

varieties (Fleur 11 and 55-437) formed the group in

which entries were non-dormant. Nevertheless, line L6

was better than both the non-dormant varieties. The

remaining lines (L2, L4, L24, L9. and L27) and the

dormant check variety 73-30 set another group in

which the entries were actually dormant.

Furthermore, lines L2 and L4 performed better

than their better parent (73-30). This favorable

transgression in fresh seed dormancy was previously

reported by Khalfaoui . The latter investigator used the[8 ]

same donor parent (73-30) in his cross.

Table 4: Duration of dorm ancy of the entries tested in the field over

two seasons.

Different degrees of dormancy

---------------------------------------------------------------

Entries Year 2005 Year 2006

L2 > 35 >35

L4 > 35 >35

L6 7 14

L9 > 35 21

L19 21 14

L24 > 35 >35

L27 35 >35

73-30 > 35 >35

55-437 7 7

Fleur 11 7 14

Table 5: Entries classified using the scale of Landfort et al. (1965)

Percentage of not Dormancy scale Entries

germinated seeds (%)

0 0

0-10 1

11-20 2 Fleur 11

21-40 3 55-437

41-60 4 L6

61-70 5

71-80 6 L27, L19, L9

81-99 7 73-30 , L24TD

100 8 L2, L4

Conclusion: Lines tested have shown different intensity

and duration of fresh seed dormancy. Particularly, we

noted that lines L2, L4 and L24 were more dormant

than the others lines. These most promising lines will

be prepared for official registration. Our results

suggested that the dormant variety (73-30) could be

used as donor parent in breeding programs to select

lines with fresh seed among Spanish x Spanish crosses.

Inheritance of fresh seed dormancy among Spanish x

Spanish crosses is undergoing at CNRA for a better

understanding of the genetic control.

We noted strong similarity between the results

from the field test and those obtained from the

laboratory. Therefore, one could use an in vitro assay

to reliably assess the level of dormancy on peanut

lines.

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857


40

II.2. Synthèse des résultats L’analyse statistique a montré des différences significatives entre les entrées testées aussi bien

au champ qu’au laboratoire. Des variations interannuelles ont été notées sur ces certaines

entrées probablement dues à l’effet d’une série de divers facteurs environnementaux qui

peuvent même agir sur la dormance des graines durant la phase de maturation des graines.

Ces variations interannuelles ont été observées chez l’arachide (Toole et al. 1964 ; Kumar et

al. 1991) mais également chez les céréales notamment le blé (Mares, 1993; Biddulph et al.

2005).

II.2.1. Intensité de dormance L’analyse de l’intensité de la dormance des graines fraîchement récoltées de l’essai réalisée en

2005 a montré des différences significatives entre les entrées testées aussi bien pour le test au

champ que celui au laboratoire. Cette discrimination statistique est due aux différences

génétiques existant entre les entrées pour le caractère dormance des graines fraîches. Une

large variation (15% à 100%) a été observée entre les entrées pour l’intensité de dormance.

Chez le croisement avec 55-437, les lignées L2, L4 et L24 ont montré les intensités de

dormance plus élevées. Pour le croisement avec Fleur 11, la lignée L27 a également montré

une bonne intensité de dormance. Cette lignée est particulièrement intéressante en ce sens

qu’elle a des graines de calibre aussi gros que son parent femelle Fleur 11.

Bien que des différences aient été notées, pour une entrée donnée, sur l’intensité de dormance

obtenue au champ et celle obtenue au laboratoire, l’ordre de grandeur reste le même entre les

entrées d’une méthode à l’autre. Les intensités ont été légèrement moins élevées au champ

qu’au laboratoire. Par conséquent, les deux méthodes utilisées dans cette étude donnent une

bonne estimation de l’intensité de la dormance des graines d’arachide.

II.2.2. Durée de dormance et classement des entrées

La durée de dormance des entrées à partir des tests réalisés au champ a varié entre 7

jours à plus de trente cinq (35) jours après semis (JAS) pour les deux années 2005 et 2006.

Cette large variation observée entre les entrées testées sur un même environnement dénote des

différences génotypiques des entrées par rapport à la durée de la dormance de leurs graines

fraîches. Comme pour l’intensité de dormance, les lignées L2, L4, L24, L27 et le parent

témoin 73-30 ont présenté la durée de dormance la plus élevée (> 35 jours après semis). Ces

entrées ont à la fois une intensité et une durée de dormance élevées.


41

Sur la base de l’échelle de Landfort et al. (1965), les durées de dormance ont permis

de classer les entrées du niveau 2 au niveau 8 respectivement pour les entrées non dormantes

vers les entrées dormantes y compris les variétés témoins Fleur 11 et 55-437. Les lignées L2,

L4 et L24 et la variété 73-30 ont des niveaux de dormance de 8 et de 7 donc classées

particulièrement dormantes.

II.3. Conclusion Les lignées L2, L4 et L24 sont particulièrement prometteuse pour l’obtention de

nouvelles variétés à cycle court et possédant la dormance des graines fraîches. Compte tenu

du gros calibre de ces graines, la lignée L27 issue du croisement entre Fleur 11 et 73-30

pourrait toute de même être valorisée comme variété à cycle court et dormante. Ces lignées

prometteuses pourront être proposées à l’homologation après tests complémentaires.

La méthode au laboratoire donne des résultats similaires à ceux obtenus par la

méthode au champ qui elle est assez fastidieuse. Par conséquent, en lieu et place de cette

dernière, le test in vitro pourrait être effectivement utilisé.

Par ailleurs, la variété 73-30 pourrait être utilisée comme donneur de la dormance pour

l’introduction de la dormance dans des variétés du type botanique Spanish.

Chapitre III : Contrôle génétique de la dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish

42

CHAPITRE III : CONTROLE GENETIQUE DE LA

DORMANCE DES GRAINES FRAICHES D’ARACHIDE

DE TYPE SPANISH


43

III.1. Analyse quantitative: analyse des moyennes de générations

III.1.1. Introduction

Au vu des résultats sur le phénotypage de la dormance des lignées fixées et de leurs

parents (Chapitre II), le phénotypage de la dormance des graines fraîches peut être

effectivement réalisé au champ comme au laboratoire puisque le niveau de similarité des

résultats est satisfaisant.

Lorsqu’on analyse la dormance d’une graine en termes de nombre de jours avant

germination, la variable mesurée est une variable quantitative mesurée sur chaque individu de

la population ou sur un échantillon prélevé de la population. Ainsi une analyse quantitative

peut être effectuée sur les moyennes de générations issues de croisements entre parents

lignées pures pour étudier le mode d’action des gènes ainsi que les composantes de la

variance génétique. Cette approche dite quantitative a l’avantage de permettre d’estimer, en

plus du mode d’action des gènes, les composantes de la variance génétique. Elle permet ainsi

d’estimer l’héritabilité par conséquent le gain génétique espéré. Cette approche donne

également une estimation du nombre minimum de facteurs génétiques qui contrôlent le

caractère. Parmi les méthodes biométriques (diallèle, test-cross, analyse des moyennes de

générations) utilisées pour l’étude génétique des caractères, l’analyse des moyennes de

générations apparentées a l’avantage de permettre une subdivision des effets épistatiques en

trois types «additif x additif», «additif x dominant» et «dominant x dominant» (Singh and

Singh, 1992) à partir d’un dispositif génétique qui sera décrit plus haut. Cette subdivision des

effets d’interactions digéniques est particulièrement importante pour la recommandation de

méthodes de sélection appropriées.

Lorsqu’on effectue une analyse d’un caractère en regroupant les individus d’une

population en classes phénotypiques distinctes, on parle d’une approche dite mendélienne ou

qualitative. Cette analyse permet de déterminer le nombre de gènes ou facteurs génétiques en

cause. Toutefois, l’application de l’analyse qualitative requiert deux conditions:

• d’une part le caractère en question doit être génétiquement simple afin qu’un

regroupement des individus dans différents groupes phénotypiques puisse se faire sans

ambiguïté

• d’autre part la composante environnementale ne doit être pas trop importante au point

de rendre difficile répartition des individus phénotypés dans les différentes classes

phénotypiques


44

Ces deux méthodes (quantitative et qualitative) ne sont pas exclusives mais bien au contraire,

l’analyse qualitative est complémentaire à l’approche quantitative. En effet, l’analyse

qualitative permet de valider ou de préciser certains paramètres génétiques estimés à partir de

l’approche quantitative notamment le nombre de gènes en jeu.

Dans ce chapitre, les analyses quantitative et qualitative de descendances de trois croisements

entre lignées pures ont été effectuées pour mieux comprendre la transmission du caractère de

la dormance des graines fraîches au sein du compartiment des variétés Spanish chez

l’arachide cultivée (Arachis hypogaea L.). Les résultats obtenus ont permis de discuter, sur la

base de ces deux approches, le mode d’action génétique, l’héritabilité du caractère, le nombre

de gènes en cause et de faire des recommandations sur les méthodes de sélections appropriées.

III.1.2. Matériel

III.1.2.1. Variétés parents des croisements

Trois variétés d’arachide (55-437, Fleur 11 et GC-8-35) de type Spanish non-

dormantes ont été choisies pour constituer les parents femelles des croisements. Ces variétés

sont toutes susceptibles à la germination in-situ lorsque des pluies tardives surviennent après

la maturité des gousses. La variété Fleur 11 paraît comme plus susceptible comparativement

aux autres variétés. Ces variétés sont cultivées pratiquement partout dans le Bassin Arachidier

du Sénégal.

Chacune de ces trois variétés femelles a été croisée à la variété dormante 73-30 utilisée

comme parent mâle. Cette dernière variété est aujourd’hui la seule variété sénégalaise à cycle

court et possédant une dormance décrite comme bonne d’après les travaux de Gautreau

(1984), Khalfaoui (1991b) et Ndoye (2001). Par ailleurs, les résultats obtenus dans le chapitre

précédent de cette étude ont confirmé la bonne dormance des graines fraîches de cette variété.

III.1.2.2. Les hybridations: émasculation et pollinisation

Les croisements ont été réalisés dans des bacs d’hybridation installés dans abri grillagé

au CNRA (Bambey, Sénégal). Ils ont été réalisés selon la méthodologie décrite par Sudheer et

Kumar (1996). Brièvement, les opérations de castrations/hybridations ont été effectuées à

partir de l’apparition de la première fleur observée qui se situe environ au 23ème jour après

semis (JAS) chez les variétés Spanish. Les opérations de castrations/hybridations ont été

effectuées pendant 30 jours à partir de l’initiation de la floraison. A partir de cette date, les

fleurs qui apparaissent donnent très rarement des gousses du fait de leur position très haute

par rapport à la position du sol. Les castrations ont été donc effectuées sur les fleurs de pieds

femelles en ouvrant le boutant floral et en enlevant toutes les étamines chaque jour à partir de


45

l’apparition des premières fleurs entre 16 et 19 heures. Les pollinisations des fleurs castrées

ont été effectuées le lendemain pour permettre au tube calicinal des fleurs mâles d’atteindre

une longueur suffisante pour faciliter leur manipulation. Elles ont été réalisées tôt le matin

entre 7 h et 10 h, d’une part parce que le pollen de l’arachide est plus viable lorsqu’il est

collecté (DeBeer, 1963) d’autre part la réceptivité du stigmate de l’arachide est meilleure à

ces heures. Par ailleurs, pour permettre d’obtenir un bon taux de réussite des croisements, des

«chapeaux» en papier buvard imbibé d’eau ont été placés au dessus de chaque fleur pollinisée.

Cela permet de maintenir autour les fleurs fécondées une bonne très humidité relative pendant

au moins les quelques heures qui suivent l’hybridation afin de réduire l’incidence du

rayonnement solaire qui peut altérée la viabilité du pollen et du pistil. A partir de la fin des

opérations de castrations/hybridations, les boutons floraux qui apparaissent ont été enlevés

chaque soir pendant un mois, date à partir de laquelle toute fécondation n’a pratiquement

aucune chance de donner une graine mûre chez les variétés hâtives. A 90 JAS, les gousses

issues des croisements ont été récoltées après avoir déterré les pieds femelles. Plusieurs

croisements ont été ainsi effectués dans cette étude pour la mise au point du dispositif

génétique décrit ci-dessous.

III.1.2.3. Le dispositif génétique ou schéma de croisement

On entend ici par dispositif génétique les différentes générations d’un croisement

mises au point pour l’étude génétique du caractère. Le croisement original entre le parent

donneur (73-30) et chaque parent receveur a été réalisé durant la contre-saison de 2006 (Mars

à Juin). Le parent femelle sera désigné par P2 alors le parent mâle par P1. Dans la suite du

document, les trois croisements seront désignés ci-dessous: Croisement 1: 55-437 (P2) X 73-30 (P1)

Croisement 2: GC-8-35 (P2) X 73-30 (P1)

Croisement 3: Fleur 11 (P2) X 73-30 (P1)

Le croisement backross BC1P2 c’est-à-dire le croisement entre le parent femelle (P2) et des

individus F1 de chaque croisement a été réalisés durant l’hivernage 2006 (Juillet et

Septembre). En même temps, soixante (60) graines F1 de chaque croisement ont été semées au

champ pour donner par autofécondation une population F2. Le croisement backcross BC1P1

c’est-à-dire le croisement entre le parent mâle (P1) et des individus F1 de chaque croisement a

été effectué en contre-saison 2007. Parallèlement, une population F1 de chaque croisement a

été reconstituée. En résumé, P1 et P2 sont les populations parentales avec P1 comme le parent

qui exprime le caractère à étudier et P2 le parent ne possédant pas le caractère ou l’exprimant

faiblement. F1 et F2 désignent respectivement la première génération filiale et la deuxième


46

génération filiale. BC1P1 et BC1P2 désignent respectivement le backcross avec le parent P1 et

avec le parent P2. La figure 8 schématise les différentes populations développées pour l’étude

génétique du caractère.

Figure 8. Schéma de croisements effectués pour le développement des différentes générations filiales de chaque croisement

Fleur 11 x 73-30

F1

Fleur 11 x F1 = BC1P2

F2

73-30 x F1= BC1P1

55-437 x 73-30

F1

55-437 x F1 = BC1P2

F2

73-30 x F1= BC1P1

GC-8-35 x 73-30

F1

GC-8-35 x F1=BC1P2

F2

73-30 x F1= BC1P1


47

III.1.3. Phénotypage et méthodes d’analyses

III.1.3.1. Phénotypage de la dormance des graines fraîches

Pendant l’hivernage 2007, les populations parentales (P1 et P2) et les quatre

générations filiales (F1, F2, BC1P1 et BC1P2) de chaque croisement ont été semées au champ

selon un dispositif expérimental en blocs complets randomisés (DBCR) avec quatre

répétitions pour chaque entrée. L’essai a été réalisé dans une parcelle expérimentale (sole D1)

du CNRA (Bambey, Sénégal). Quatre lignes de 6m ont été semées par génération F2 par

répétition alors que pour les autres générations deux (2) lignes de 6m ont été semées par

répétition. L’interligne a été de 50 cm et les poquets contigus ont été séparés de 30 cm. Le

semis a été effectué à la main à raison d’une graine par poquet. Avant le semis, les graines ont

été traitées au fongicide Granox (Captofol 10% - Benomyl 10% - Carborufan 20%). Un bon

suivi de l’expérimentation a été réalisé en appliquant les pratiques culturales recommandées

pour l’arachide au Sénégal.

A la récolte, au 90 JAS, 80 graines matures ont été choisies au hasard à partir chaque

génération parentale (P1 et P2) et sur les générations F1, F2, les backross BC1P1 et BC1P2. La

maturité des graines a été déterminée par la méthode de Miller et Burns (1971). Cette

dernière caractéristique étant un indicateur du statut de la maturité des graines chez l’arachide

du type botanique Spanish. Ces graines immédiatement récoltées ont été testées pour leur

dormance sur la même parcelle (texture sableuse) avec le même dispositif expérimental décrit

plus haut. La méthode décrite par Khalfaoui (1991b) a été adoptée. La graine a été considérée

comme germée dès qu’on observe une poussée de la motte de terre. Durant toute la durée du

test de germination, le sol a été maintenu humide par un arrosage effectué au besoin. Le test a

été réalisé entre Octobre et Novembre, période pendant laquelle les températures au Sénégal

sont très élevées aussi bien le jour que la nuit. La température moyenne journalière a été de

37°C avec un maxima et un minima de températures situés respectivement à 39°C et 18°C.

Ces températures se situent dans la gamme de températures favorables à la germination chez

l’arachide (15-40°C). Le test de germination a duré 36 jours.

III.1.3.2. Analyse des effets génétiques

L’analyse des effets génétiques a été faite à partir du modèle génétique de Mather et

Jinks (1982). La régression linéaire multiple par la méthode des moindres carrés pondérés a

été utilisée pour estimer les différents paramètres génétiques (d, h, i, j, et l). Pour une

estimation sans biais des estimateurs du modèle, les moyennes des générations ont été


48

pondérées par le facteur [1/ (σ2)]. Cette pondération permet d’ajuster les biais liés aux

différences des variances entre les différents estimateurs (P1, P2, F1, BC1P1, BC1P2 et F2).

Pour chaque croisement, dans un premier temps, le modèle simple à 3 paramètres (m, d et

h) a été et si ce dernier n’est pas adéquat, le modèle génétique à 6 paramètres (m, d, h, i, j et l)

a été testé. Le modèle de Mather et Jinks (1982) suppose les conditions indiquées ci-dessous

et que nous admettons satisfaites dans cette étude:

• les gènes en cause ont une hérédité mendélienne c’est-à-dire non liés au sexe, sans

effet cytoplasmique (maternel, ne faisant pas intervenir le génome mitochondrial ou

chloroplastique)

• absence d’interaction génotype x environnement (G X E)

• indépendance (absence de liaison génétique) des gènes impliqués dans le contrôle

génétique

• tous les gènes à effets positifs sur le caractère sont situés sur le parent P1 et tous les

gènes qui ont des effets négatifs sur le caractère se trouvent chez le parent P2.

Dans le modèle à trois paramètres (m, d et h), on définit ces trois paramètres:

• m est la moyenne ou encore appelé parent-moyen et dépend des conditions générales

du test. Dans la régression linéaire multiple, elle correspond à la constante.

• d est l’effet d’additivité (d) qui correspond à la résultante des effets individuels des

différents gènes présents chez les deux parents et qui les différencient pour le caractère

étudié.

• h est l’effet de dominance (h) et correspond à l’écart entre la valeur de l’hétérozygote

F1 et le parent-moyen m.

• effet de dominance.

Dans le modèle à 3 paramètres de Mather et Jinks (1982), les moyennes des six générations de

chaque croisement sont définies en fonction des trois paramètres m, d et h comme suit:

P1 = m + d

P2 = m – d

F1 = m + h

BC1P1 = m + ½*d + ½*h

BC1P2 = m - ½*d + ½*h

F2 = m + ½*h

Ainsi les paramètres (m, d et h) à estimer et qui sont impliqués dans l’expression des six

générations (P1, P2, F1, BC1P1, BC1P2 et F2) sont :


49

m = ½*P1 + ½*P2 + 4*F2 - 2*BC1P1- 2*BC1P2

d = ½*P1 – ½* P2

h = 6*BC1P1 + 6*BC1P2 – 8*F2 – F1 – ½*P1 – ½*P2

Le modèle à six (6) paramètres inclut dans l’expression de la moyenne de chaque génération

en plus des effets simples d’additivité et de dominance, les effets interactions digéniques (i, j

et l). Les termes i, j et l désignent les interactions digéniques entre deux locus :

• i correspond à l’interaction «additif x additif» c’est-à-dire une interaction entre deux

locus homozygote.

• j correspond à l’interaction entre « additivité x dominance» qui spécifie les

interactions digéniques dont l’un est homozygote et l’autre locus est hétérozygote.

• l correspond à l’interaction de type «dominance x dominance» qui spécifie les

interactions digéniques dont les deux locus en cause sont tous hétérozygotes

Dans le modèle à 6 paramètres, il y a 6 paramètres à estimer et qui sont impliqués dans

l’expression des 6 générations, comme suit :

P1 = m + d + i

P2 = m – d + i

F1 = m + h + l

BC1P1 = m +½*d + ½*h + ¼*i + ¼*j + ¼*l

BC1P2 = m -½*d + ½*h + ¼*i – ¼*j + ¼*l

F2 = m + ½*h + ¼*l

Dans ce cas, les six paramètres (m, d, h, i, j et l) sont estimés à partir des six moyennes de

générations selon les équations ci- dessous :

m = ½*P1 + ½*P2 + 4*F2 - 2*BC1P1 - 2*BC1P2

d = ½*P1 – ½* P2

h = 6*BC1P1 + 6*BC1P2 – 8*F2 – F1 – ½*P1 – ½*P2

i = 2*BC1P1 + 2*BC1P2 – 4*F2

j = 2*BC1P1 – P1 – 2*BC1P2 + P2

l = P1 + P2 + 2*F1 + 4*F2 – 4*BC1P1 – 4*BC1P2

La valeur de la statistique t de Student de chaque effet génétique a été calculée à partir du

rapport entre la moyenne de l’effet génétique considéré et l’écart-type associée à la moyenne

elle-même,

t(d) = d / σ(d) avec d= effet additif, σ(d) = écart-type de la moyenne de la

moyenne de (d)


50

La signification de chaque effet génétique a été testée à partir du test t de Student (test

bilatéral) au seuil de signification de 5% pour le degré de liberté correspondant. Pour ce faire,

la valeur de t calculée est comparée à celle lue sur la table des distributions t de Student. Le

degré de liberté (ddl) est égal au total des individus observés moins le nombre de répétitions

(égal à 4).

III.1.3.3. Les tests d’épistasies

III.1.3.3.1. Les tests individuels A, B et C

Trois tests individuels d’épistasie A, B, C (Mather et Jinks, 1982) ont été calculés à

partir des moyennes des populations. Dans le cas d’une adéquation du modèle génétique à un

contrôle additive-dominance (c’est-à-dire sans interaction épistasique), la valeur de chaque

test A, B, C serait nulle à la limite de l’écart-type associée à sa moyenne. Autrement dit, la

signification de l’un au moins des tests indique la présence d’épistasie dans le contrôle du

caractère. Les tests A et B sont indicatifs par rapport à l’épistasie de type i, j, l. Par contre, le

test C est indicatif de l’existence d’épistasies de type l.

A = 2*BC1P1 - P1 - F1

B = 2*BC1P2 - P2 - F1

C = 4*F2 - 2*F1 - P1 - P2

Les variances de ces tests ont été ainsi calculées comme suit:

σ2(A) = 4*σ2BC1P1 + σ2P1 + σ2F1

σ2(B) = 4*σ2BC1P2 + σ2P2 + σ2F1

σ2(C) = 16*F2 + 4*F1 + σ2P1 + σ2P2

La signification de chaque test d’épistasie a été déterminée par le test t de Student (test

bilatéral) à un seuil de probabilité de 5% en comparant la valeur de t calculée à celle lue sur la

table de distribution t de Student pour un degré de liberté (ddl) égal à 236 pour A et B; à 316

pour C dans notre étude.

III.1.3.3.2. Le test combiné de Cavallis

Les résultats du mode d’action des gènes ont été approuvés par les tests d’épistasies

individuels A, B et C (Mather et Jinks, 1982) et le test combiné d’épistasie de Cavallis (1952).

Le test combiné a été déterminé à partir du test khi-deux (χ2) qui repose sur l’ajustement entre

les moyennes observées et les moyennes attendues des 6 six générations (P1, P2, F1, F2, BC1P1

et BC1P2). Les moyennes des générations attendues ont été calculées selon le modèle à 3

paramètres de Mather et Jinks (1982). Le test combiné de Cavallis (1952) présente un double

avantage comparativement aux tests individuels:


51

• puisqu’il repose sur toutes les moyennes des six générations, il est de ce fait plus

indicatif et plus robuste que tout test d’épistasie pris individuellement.

• Il donne directement une valeur estimée de chaque paramètre du modèle (m, d et h) et

permet ainsi d’obtenir la valeur attendue de chacune des 6 générations.

Les moyennes attendues calculées à partir des trois paramètres (m, d, h) de chacune des six

générations ont été comme suit :

P1= m + d

P2= m - d

F1= m + h

F2= m + ½*h

BC1P1= m + ½*d + ½*h

BC1P2= m -1/2*d + ½*h

La valeur du khi-deux (χ2) calculée est la somme des carrés des écarts entre les

moyennes observées et les moyennes attendues pondérés par le coefficient [1/ (σ2)] qui est

l’inverse de la variance associée à chaque moyenne observée. Cette méthode pondérée donne

la meilleure estimation des paramètres du modèle linéaire puisque les moyennes de

générations ne sont pas connues avec la même précision. La valeur calculée du khi-deux (χ2) a

été comparée à celle lue sur la table de distributions khi-deux. Le nombre degré de liberté est

égal ici à 3 puisqu’il y a trois paramètres (m, d et h) à estimer à partir de six moyennes de

populations. Une signification de la statistique khi-deux (χ2) indique une déviation

significative par rapport au modèle additive-dominance, c’est-à-dire à l’existence d’épistasies

dans le contrôle génétique du caractère étudié.

III.1.3.4. Analyse des composantes de la variance génétique

Les différentes composantes de la variance génétique ont été estimées par la méthode

de régression du maximum de vraisemblance restreinte (Restricted Maximum Likelihood,

REML en anglais) en admettons que les résidus d’épistasies ne sont pas négligeables dans la

valeur phénotypique d’une population. Cette méthode donne une bonne estimation des

composantes de la variance comparativement aux méthodes telles que la méthode des

moindres carrés. Cependant, l’estimateur obtenu par la méthode du maximum de

vraisemblance est biaisé particulièrement en échantillon fini. Une telle violation entraîne une

surestimation de certaines composantes de la variance génétique (Lynch et Walsh, 1997).

Ainsi elle est plus appropriée pour les échantillons de très grande taille afin que les moyennes

de populations utilisées dans le modèle soient avec la plus grande précision (variances très


52

faibles). Néanmoins, même dans une population de taille réduite, elle permet d’avoir une

indication sur l’importance relative des différentes composantes de la variance génétique.

Ainsi elle permet de faire des inférences par rapport à la stratégie de sélection efficace en se

basant sur la comparaison entre la portion additive et celle non-additive. Cette dernière est liée

aux de dominance et d’interactions entre gènes (épistasies).

III.1.3.5. Paramètres génétiques: héritabilité et gain génétique

L’héritabilité «au sens large» notée H2 d’un caractère génétique mesure l’efficacité de

sa sélection. Ainsi, l’héritabilité «au sens large» représente le rapport entre la variance

génétique sur la variance totale. Elle donne une mesure du degré de confiance dans

l’évaluation de la valeur génotypique par la valeur phénotypique. Elle a été calculée à partir

de la population F2 de chaque croisement comme suit :

H2 = σ2F2 – σ2VE / σ2F2

La variance environnementale VE a été calculée à partir des populations parentales par la

méthode de Warner (1952) et par la méthode de Lush (1948). La méthode de Lush (1948)

corrige tout biais dû à une inégalité des variances des populations parentales. La variance

environnementale (VE) a été calculée comme suit:

VE1 = (σ2P1 + σ2P2)/2 d’après Warner (1952)

VE2 = (σ2P1 * σ2P2)1/2 d’après Lush (1948)

L’héritabilité au sens strict notée (h2) représente le rapport de la variance additive sur

la variance totale. Elle détermine le degré de ressemblance entre les descendants et leurs

parents. Dans le cas d’une espèce autogame, pour un caractère sans interaction épistasique, la

variance additive (Vd) dans la variance d’une génération F2 est calculée selon l’expression:

Vd = ½*d2 avec d étant l’effet d’additivité

Ainsi l’héritabilité au sens strict h2 a été calculée comme suit :

h2 = Vd / σ2F2

Le gain génétique (Gs) espéré correspond à l’augmentation relative de la moyenne

espérée des descendants si les conditions environnementales restent inchangées. Le gain

génétique (Gs) est donc le changement de la valeur moyenne dans la population entre

générations successives. Elle dépend de la pression de sélection, de l’héritabilité (h2) du

caractère et la précision de mesure du caractère (écart-type de la population).

Dans cette étude, elle a été calculée aux intensités de sélection k de 5% et de 10 %.

Les différentiels de sélection standardisés (i) correspondant aux pressions de sélection 5% et


53

10% sont respectivement 2,6 et 1,76 (Weber, 1967). Le gain génétique est déterminé par

l’héritabilité h2. Il a été calculé selon la méthode de Hallauer et Miranda (1988) comme suit :

Gs = h2*i*(σ2F2)1/2

Avec h2 = héritabilité au sens strict; i = est appelé intensité de sélection ou différentiel de

sélection standardisé; (σ2F2)1/2 mesure l’écart-type entre les individus de la population, ici la

population F2.

III.1.3.6. Estimation du nombre minimum de facteurs génétiques

Le nombre minimum de gènes contrôlant la dormance des graines chez les variétés

d’arachide de type Spanish a été estimé avec les méthodes II et III de Lande (1981) et celle de

Wright (1968). Ces méthodes reposent sur le rapport entre la différence phénotypique

parentale et la portion de la variance totale transmise à la descendance (variance additive).

Ces méthodes permettent d’estimer le nombre « minimum » c’est-à-dire le nombre de loci

polymorphes qui différencie les parents du croisement et qui intervient effectivement dans le

contrôle du caractère en question. Ce nombre est dit « minimum » parce que ne tenant pas

compte des loci monomorphes entre les parents du croisement.

Chacune de ces méthodes suppose les conditions suivantes:

• les gènes qui ont un effet positif sur l’expression du caractère sont portés uniquement

par le parent P1 alors que tous les gènes à effet négatif sur le caractère sont portés

exclusivement par le parent P2 qui n’exprime pas le caractère,

• tous les gènes impliqués ont des effets égaux sur le caractère,

• le caractère étudié ne fait intervenir ni de la dominance, ni de l’épistasie ou encore des

interactions génotype x environnement (Wright, 1968).

Au cas où une de ces trois hypothèses n’est pas satisfaite pour une raison quelconque, la

valeur calculée est sous-estimée quel que soit la méthode. Toutefois, la méthode de Wright

(1968) donne une meilleure estimation que celle de Lande.

Méthode II Lande (1981)

Nm1 = (P1-P2)2 / 8*(2*σ2BC1P1- σ2BC1P2)

Méthode III de Lande (1981)

Nm2 = (P1 – P2)2 / [8*(σ2BC1P1+σ2BC1P2-2*σ2F1]-(σ2P1 + σ2P2) /2

Méthode de Wright (1965)

Nm3 = (P1-P2)2*{1,5-[2*R*(1-R)}/8*[σ2F2-0,25*(2*σ2F1+ σ2P1 + σ2P2) avec

R = (F1-P1) / (P2-P1)


54

Certes, les modalités d’application de ces différentes méthodes évoquées plus haut sont fortes

mais elles permettent d’avoir une estimation du nombre de facteurs génétiques polymorphes

en jeu pour le caractère donné. Par ailleurs, il faut préciser que le « nombre minimum de

facteurs génétiques » estimé dans par cette approche ne tient pas compte de l’éventuel « pool

de gènes monomorphes » entre les parents du croisement qui peut participer dans l’expression

d’un caractère donné. Ainsi l’estimation faite du nombre de gènes ne tient pas compte de

gènes monomorphes entre le couple de parents du croisement.

III.1.4. Traitement et analyses statistiques des données

Les données collectées sur les six générations apparentées (P1, P2, F1, F2, BC1P1,

BC1P2) ont été saisies au tableur Excel. Les données ont été soumises d’abord à une analyse

de variance avant l’analyse génétique à l’aide du logiciel GENSTAT, version 9.1 (VSN

International Ltd., England). Pour se conformer aux appellations de différentes générations

dans le modèle d’analyse de Mather et Jinks (1982) qui a été utilisé pour l’analyse des effets

génétiques, les générations filiales (F1, F2, BC1P1 et BC1P2) ont été désignées sur la base du

génotype de la plante-mère. Toute l’analyse quantitative a été effectuée avec le logiciel

spécialisé de génétique (GENSTAT version 9 (VSN International Ltd., England) selon la

méthode de régression linéaire multiple en utilisant la procédure « pas à pas » ou

« Stepwise ».

III.2. Analyse qualitative

III.2.1. Introduction

L’analyse qualitative a été faite pour valider ou confirmer les résultats obtenus sur

l’étude génétique effectuée par l’approche quantitative. En effet, en génétique, lorsqu’un

caractère n’est pas très complexe, une approche qualitative basée sur la répartition des

individus d’une population en ségrégation en classes phénotypiques, permet d’étudier le mode

d’action génétique ainsi que le nombre de gènes en jeu.

Dans cette étude, une analyse qualitative de la dormance des graines fraîches des

populations en ségrégation a été faite en comparant les fréquences observée à celles attendues

dans les différentes populations filiales. Cette approche mendélienne a été réalisée sur les

deux types de populations: d’une part sur les générations filiales utilisées dans l’analyse

quantitative d’autre part à partir d’une population F2 issue d’individus F1 contrôlés par des

marqueurs microsatellites.


55

Ce contrôle moléculaire permet d’éviter tout biais d’échantillonnage qui serait dû à la

présence de fleurs autofécondées durant le développement des croisements de la première

génération F1.

III.2.2. Matériel et méthodes

III.2.2.1. Développement d’une population F2 contrôlée

Pour identifier les hybrides F1 de croisements intrasubspécifiques comme c’est le cas

dans cette étude, l’utilisation de marqueurs microsatellites a été utilisée. Pour ce faire, une

population F1 issue d’un croisement entre Fleur 11 et 73-30 a été développée durant la contre-

saison (Mars-Juin) 2008. Les individus F1 ont été contrôlés à l’aide de dix marqueurs

microsatellites (PM050, TC6E01, TC1E05, Seq4F10, TC11A04, TC1D02, TC3E05,

TC11H02 et TC2D02) polymorphes entre les parents. L’analyse des marqueurs

microsatellites a été faite au séquenceur de type LICOR (LICOR, USA). L’extraction d’ADN

sur chaque individu putatif F1 et la méthode de contrôle sont décrites dans les chapitres qui

suivent.

III.2.2.1.1. Extraction d’ADN sur la population F1

Un échantillon de soixante-dix huit (78) graines putatives F1 récoltées à partir du

croisement Fleur 11 x 73-30 ont été semées en serre dans des pots à raison d’une graine par

pot au CERAAS en Août 2008. Quinze (15) jours après germination des graines, un

prélèvement de jeunes folioles (approximativement 100 mg) a été effectué sur chaque

individu pour l’extraction d’ADN. Immédiatement après prélèvement, les feuilles ont été

étalées sur du papier aluminium et stockées dans de la glace à 4°C. L’extraction d’ADN a été

faite au tampon MATAB préchauffé au bain-marie à 74°C pendant 20 mn selon une méthode

modifiée du protocole d’extraction mis au point par Risterucci et al. (2000). Brièvement,

l’échantillon de folioles prélevées sur chaque plante a été broyé dans de l’azote liquide (-

196°C) à l’aide d’un mortier et d’un pilon préalablement rincés à l’alcool 70%.

Immédiatement après broyage, l’échantillon a été mis dans un tube d’Eppendorf contenant

750 µl de MATAB (tampon d’extraction) préchauffé, ensuite laissé au bain-marie pendant 20

minutes en vortexant la solution toutes les 5 mn. La solution a été refroidie ensuite pendant 5

mn sur la paillasse. L’extraction d’ADN est faite dans 750 µl de chloroforme Isoamyl Alcool

(CIA à 24:1). Le mélange ainsi obtenu a été d’abord remué doucement pour faciliter

l’homogénéisation pendant quelques minutes ensuite centrifugée (13000 rpm) pendant 20 mn

à la température de 18°C. L’ADN est récupéré dans le surnageant en y prélevant un aliquot de

600 µl. Après ajout de 600 µl d’Isopropanol dans le tube, l’ADN se précipite et forme un


56

culot. Le culot d’ADN a été ensuite lavé avec 300 µl d’alcool 70% puis une centrifugation

(13000 rpm) à la température de 4°C pendant 20 mn a été effectuée. L’ADN a été re-suspendu

dans 500 µl de Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) pour conservation.

III.2.2.1.2. Identification des hybrides F1 par contrôle avec des microsatellites

Dix marqueurs microsatellites (PM050, TC6E01, TC1E05, Seq4F10, TC11A04,

TC1D02, TC3E05, TC11H06 et TC2D06) polymorphiques entre les parents Fleur 11 et 73-30

et présentant des profils d’électrophorèse faciles à lire ont été utilisés. Les amorces

microsatellites ont été synthétisées en prenant soin d’incorporer une queue M13 (5’-

CACGACGTTGTAAAACGAC-3’) marquée au colorant IRD700 ou IRD800 à l’extrémité 5’

de l’amorce reverse. Les réactions PCR (Réaction de polymérisation en chaîne en français)

ont été effectuées au thermocycleur MJ Research PTC-100TM (Waltham, MA, USA) ou avec

une machine du type Eppendorf Mastercycler dans 25 ng d’ADN pour un volume final de 10

µl de tampon (10 mM Tris-HCl (pH 8), 100 mM KCl; 0,05% w/v gélatine; 2,0 mM MgCl2)

contenant 0,1 µM de la queue M13 marquée au fluorochrome IRD700 ou IRD800 (MWG,

Allemagne); 0,1µM de chaque amorce forward et reverse, 160 µM de dNTP, 1 unité de

l’ADN polymérase Taq (Life Technologies, USA).

Le programme de la polymérisation en chaîne (PCR) utilisé a comporté: une dénaturation

initiale à 95°C pendant 1 mn, 10 cycles à 94°C pendant 30s, température d’hybridation Tm

(+5°C, -0,5°C/cycle) pendant 1 mn, puis à 72°C pendant 1 mn. Une phase additionnelle de 25

cycles à 94°C pendant 30s, Tm pendant 1 mn, 72°C pendant 1 mn et une étape élongation

finale à 72°C pendant 8 mn. Les produits PCR marqués à l’IRD700 ou IRD800 ont été dilués

dans du bleu-urée (tampon de charge) sept fois pour l’IRD700 et cinq fois pour l’IRD800. La

révélation des produits PCR a été faite au séquenceur automatique (LI-COR, USA) sur gel de

polyacrylamide 6,5 %. Seuls les individus F1 portant à la fois l’allèle des deux parents (mâle et

femelle) à tous les 10 loci marqueurs ont été retenus comme des hybrides F1 (Figure 9).


57

a = Fleur 11, b = 73-30, H = hybride, S = individu issu d’une autofécondation

Figure 9. Contrôle des hybrides F1 sur un échantillon de 44 individus, profil avec le marqueur microsatellite AC2C05

Après identification des hybrides F1, ils ont été avancés par autofécondation en

génération F2 au CERAAS (Centre d’Etudes Régional pour l’Amélioration à l’Adaptation à la

Sécheresse) à Thiès (Sénégal). Cette population F2 sera dénommée dans la suite de ce

document « population F2 contrôlée » puisque issue d’individus F1 contrôlés aux

microsatellites.

III.2.2.1.3. Phénotypage de la population F2 contrôlée

Les graines F2 issues des vrais hybrides F1 ainsi obtenus ont été phénotypées pour

servir à un test de confirmation des résultats obtenus sur les populations non contrôlées

utilisées dans le cadre de l’étude quantitative. Soixante-treize (76) graines F2 issues de la

population contrôlée ont été testées pour leur dormance à côté de cent (100) graines de chaque

parent (Fleur 11 et 73-30) (Figure 10). Les graines ont été phénotypées au laboratoire en les

mettant sur papier buvard imbibé d’eau placé dans des boîtes de Pétri à la température de 30 ±

1°C. Le papier buvard a été maintenue humide par aspersion d’eau distillée durant toute la

durée du test de germination (35 jours). Les graines ont été au préalable traitées à

l’hypochlorite de sodium (46°). Pour tester la viabilité des graines non germées après 15

jours, un traitement à l’éthrel ou Acide 2-Chloroethylphosphonique (C2H6ClO3P) (SISCO

Research Laboratory Ltd, Mumbai-India) a été effectué. En fait, le traitement à consister à

tremper les graines non encore germées dans la solution d’éthrel 10-3M pendant 6 heures.

L’éthrel est un produit chimique sous forme liquide qui est facilement converti en éthylène

(Ketring et Morgan, 1971). Elle favorise la levée de la dormance des graines. Après

traitement, les graines ont été rincées à l’eau puis replacées immédiatement sur les papiers

buvard dans les boîtes de Pétri jusqu’à leur germination. Le critère d’évaluation de la

dormance des graines reste le même que celui employé avec les populations non contrôlées,

c’est-à-dire le nombre de jours avant germination.


58

Figure 10. Phénotypage (au laboratoire) de graines F2 issues de la population F1 contrôlée avec des marqueurs SSRs, au laboratoire de Biochimie du CERAAS

La flèche indique une graine germée

Pour les besoins du génotypage, chaque plantule de la population F2 a été immédiatement

transplantée dans un pot contenant 20 kg de sol (Figure 11). Chaque plantule a été identifiée

par un numéro inscrit sur le pot de culture.


59

Figure 11. Plantules F2 repiquées en serre (CERAAS) et issues de la population F2 phénotypée au laboratoire

III.2.2.3. Analyses statistiques : le test d’adéquation

Si nous faisons l’hypothèse que nos populations parentales sont des génotypes

homozygotes fixés, nous connaissons exactement la proportion attendue dans les générations

ultérieures. L’adéquation entre les fréquences observées et celles attendues a été réalisée par

le test khi-deux (χ2) à partir de l’hypothèse d’un seul gène dominant. Il permet d’évaluer

l’ajustement des effectifs théoriques aux effectifs observés et de tester l’existence de

distorsions de ségrégations. Cette analyse de ségrégations a été réalisée sur l’ensemble des

populations en ségrégation ayant servi pour l’analyse quantitative. Elle a aussi été réalisée sur

la population F2 issue des individus F1 contrôlés aux marqueurs microsatellites.

Vu que les moyennes des populations parentales non dormantes (55-437, Fleur 11 et

GC-8-35) ont été inférieures à 5 jours aussi bien pour le test de champ que celui réalisé au

laboratoire (population F2 contrôlée), le classement des descendances en ségrégation issues

des croisements a été fait ainsi:


60

• les graines germées entre les cinq premiers jours ont été classées comme non

dormantes

• les graines germées après le 5e jour ont été classées comme dormantes, sans

distinction entre les homozygotes et les hétérozygotes dormantes.

A partir de ce classement en deux (2) groupes phénotypiques des individus des générations

filiales, l’analyse statistique a consisté à déterminer le test χ2 d’ajustement (test unilatéral)

entre les valeurs observées et les valeurs attendues au seuil de signification de 5% pour

l’accord avec le rapport de ségrégation attendu. Le test χ2 est un test non-paramétrique. Ce test

requiert comme modalité d’application que l’effectif minimum d’une classe phénotypique soit

égal au moins à cinq (5) individus. Il a été calculé selon la formule ci-dessous:

χ2 = (O-E)2/ E

Avec O et E correspondent respectivement à l’effectif observé et à l’effectif attendu ou

théorique pour la classe phénotypique considérée.

III.3. Résultats et discussion III.3.1. Analyse quantitative

III.3.1.1. Niveau de contrôle des facteurs environnementaux du test

Analysant la part des effets génétiques et celle des facteurs non-génétiques

(environnementaux) sur le caractère dormance des graines fraîches chez l’arachide, il était

d’abord important, avant toute analyse approfondie, d’estimer le niveau de contrôle de la

variabilité environnementale sur le site de notre expérimentation. Le bloc est non pas le

facteur étudié mais plutôt le facteur contrôlé. L’analyse montre que l’effet bloc n’est pas

significatif au seuil de signification de 5%.

L’analyse de variance a montré que les moyennes des générations sont statistiquement

significatives (P < 0,001) pour les trois croisements étudiés (Tableaux 2, 3, 4). Cette

différence significative entre les générations d’un croisement indique que les parents des

croisements sont suffisamment divergents pour le caractère étudié pour permettre une étude

génétique du caractère. L’interaction « Génération x Bloc » n’est pas statistiquement

significative pour les trois croisements étudiés (Tableaux 2, 3 et 4).


61

Tableau 2. Analyse de variance du nombre de jours avant germination des graines fraîches des six générations du croisement 55-437 x 73-30

Source de

variation

d.d.l. S.C. C.M. r.v. F pr.

Génération 5 11233,21 2246,64 48,91 < 0,001

Bloc 3 27,24 9,08 0,20 0,898

Bloc.Génér. 15 572,25 38,15 0,83 0,644

Erreur 456 20947,55 45,94

Total 479 32780,25

Tableau 3. Analyse de variance du nombre de jours avant germination des graines fraîches des six générations du croisement GC-8-35 x 73-30

Source de

variation

d.d.l. S.C. C.M. r.v. F pr.

Génération 5 10251,19 2050,24 47,27 < 0,001

Bloc 3 223,94 74,65 1,72 0,162

Bloc.Génér. 15 809,42 53,96 1,24 0,235

Erreur 456 19778,35 43,37

Total 479 31062,90

Tableau 4. Analyse de variance du nombre de jours avant germination des graines fraîches des six générations du croisement Fleur 11 x 73-30

Source de

variation

d.d.l. S.C. C.M. v.r. F pr.

Génération 5 8692,49 1738,50 40,95 < 0,001

Bloc 3 168,62 56,21 1,32 0,266

Bloc.Génér. 15 748,79 49,92 1,18 0,287

Erreur 456 19359,35 42,45

Total 479 28969,25

III.3.1.2. Différences génotypiques par rapport à la dormance des graines

L’analyse de variance de la dormance des graines fraîches a montré des différences

significatives (P < 0,001) entre les générations de chaque croisement. Les moyennes de la


62

durée de dormance se situent autour de 3 à 5 jours pour les trois parents femelles. Par contre,

pour le parent dormant (73-30), la moyenne a varié entre 17 et 18 jours dans les conditions du

test.

Les populations filiales ont des variances plus élevées que les populations parentales

(lignées pures). En effet, les variances des populations filiales comportent plus de la variance

environnementale, une variance de ségrégation qui est de nature génétique que nous

estimerons dans la suite du document (Tableau 5). On constate que la valeur phénotypique du

rétrocroisement avec le parent donneur du caractère est statistiquement similaire à celui du

parent dormant (variété 73-30) pour le croisement avec GC-8-35. De même, pour le

croisement Fleur 11 x 55-437, la moyenne de la dormance dans cette population reste assez

élevée bien que statistiquement inférieure à celle du parent mâle. En génétique, les caractères

pour lesquels la moyenne du premier rétrocroisement avec le parent donneur (BC1P1) est

statistiquement similaire avec celle du parent donneur, sont génétiquement assez faciles à

transférer par backcross. Cette remarque est particulièrement importante parce que la méthode

de transfert dite « par rétrocroisement » d’un caractère d’une variété donnée à une autre est

envisageable lorsque le caractère en question est contrôlé par un nombre restreint de gènes.

Le coefficient de variation (C.V.) similaire entre les trois croisements permet de faire

des comparaisons entre ces derniers. Cette similarité du coefficient de variation pourrait

s’expliquer d’une part par le fait que tous les trois croisements ont comme parent donneur la

même variété 73-30 et que les parents sont tous des variétés génétiquement proches

(appartenant à la même sous-espèce). D’autre part, les génotypes ont été testés dans les

mêmes conditions environnementales. Néanmoins, les valeurs élevées des coefficients de

variation montrent une variabilité entre les générations d’un même croisement. Cette

variabilité est indiquée également par l’amplitude de la variation (entre 1 et 36 jours) dans les

populations en ségrégation (Tableau 5).


63

Tableau 5: Moyenne et écart-type de la dormance (en jours) des populations parentales et des descendants des populations filiales F1, F2, BC1P1 et BC1P2 phénotypées au champ (CNRA-Bambey, 2007)

Génération

Croisement

55-437 x 73-30*** Fleur 11 x 73-30*** GC-8-35***

P1 17,44 ± 4,84 c 18,10 ± 5,36 c 18,09 ± 5,32 c

P2 3,35 ± 1,16 a 3,71 ± 1,18 a 4,15 ± 2,19 a

F1 13,08 ± 7,37 b 10,08 ± 7,44 b 11,95 ± 7,68 b

BC1P1 15,25 ± 9,59 b 12,23 ± 7,25 b 14,69 ± 8,26 c

BC1P2 7,20 ± 4,57 a 9,61 ± 7,32 b 7,03 ± 4,67 a

F2 13,45 ± 9,14 b 11,93 ± 7,94 b 12,19 ± 8,83 b

Moyenne (jours) 11.63 ± 6,74 10,94 ± 6,54 11,35 ± 6,63

C.V.(%) 58 59,8 58,4

Amplitude 1-35 1-36 1-35 C.V. = coefficient de variation ; sur la même colonne les moyennes (en jours) suivies par la même lettre ne sont pas statistiquement différentes au seuil; *** = significatif au seuil de probabilité de 0,001.

III.3.1.3. Mode d’action génétique et tests d’épistasies

III.3.1.3.1. Croisement 1 (55-437 x 73-30)

Les tests d’épistasie individuels (A, B et C) de même que le test combiné sont tous

non significatifs au seuil de signification de 5% (Tableau 6). Par conséquent, pour ce

croisement les résultats montrent que le contrôle génétique du caractère se limite à des effets

d’additivité et de dominance (Tableau 7). Ces résultats sont en accord avec ceux de Sudheer-

Kumar et Patel (1999) dont les travaux ont porté sur le croisement entre les variétés Spanish

JL-24 et J-11.

On note que l’effet d’additivité (d) et l’effet de dominance (h) sont statistiquement

significatifs (Tableau 7). On constate également à partir de nos résultats que la valeur de

l’effet additif (d) est plus élevée que celle de l’effet dominance (h) (Tableau 7). L’effet additif

est par conséquent le facteur le plus déterminant dans la moyenne des générations. La valeur

positive de l’effet dominance signifie que la dormance domine sur la non-dormance des

graines fraîches.


64

Tableau 6. Tests d’épistasies individuels A, B et C et le test combiné pour le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre 55-437 et 73-30

Tests individuels

Valeur estimée Ecart-type Valeur t Probabilité t

A (ddl= 236) -0,012 2,360 -0,005 P > 0,05

B (ddl= 236) -2,025 1,319 1,53 P > 0,05

C (ddl= 316) 6,862 4,445 -1,54 P > 0,05

Test combiné (χ2)

(ddl = 3) 6,208 - - 0,101

Pour les tests A, B et C et pour le test combiné, la valeur t critique au seuil de 5% est égale à 1,96 et 7,81

respectivement.

Tableau 7. Effets génétiques impliqués dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre 55-437 et 73-30

Effet génétique


m 10,46 0,27 38,74 < 0,001

d 7,13 0,27 26,46 < 0,001

h 2,22 0,68 3,26 < 0,001

III.3.1.3.2. Croisement 2 (GC-8-35 x 73-30)

Aussi bien les tests individuels (A, B et C) que le test combiné d’épistasies ne sont pas

significatifs (Tableau 8). Comme pour avec le croisement 1, l’analyse montre les effets

génétiques se limitent aux effets d’additivité et de dominance (Tableau 9). Ce qui indique que

l’adéquation du modèle additif-dominance pour le contrôle génétique du caractère étudié.

Pour le croisement 3, on note également que la valeur de l’effet d’additivité (d) a une

valeur identique (Tableaux 7 et 9). Par contre, l’effet de dominance (h) a baissé et n’a pas été

significatif pour le croisement 2 (Tableau 9). Toutefois, sa valeur reste positive comme avec

le croisement 55-437 x 73-30, ce qui confirme bien que la dormance domine sur la non-

dormance. Le fait que l’effet de dominance ne soit pas significatif ici pourrait être très

probablement dû à un biais de phénotypage lié aux facteurs non contrôlés (facteurs

environnementaux) dont les effets sont plus importants sur l’estimation de l’effet de

dominance qu’ils ne le sont sur l’effet d’additivité. En effet, l’effet de dominance est estimé à


65

partir des moyennes de toutes les six générations du croisement par contre l’effet d’additivité

a été estimé à partir seulement des moyennes des deux populations parentales (Modèle de

Mather et Jinks dans la partie Matériel et méthodes). Toutefois, d’un point de vue de la

sélection, l’effet de dominance n’a pratiquement pas d’importance chez les espèces

autogames comme l’arachide. En effet, chez les espèces autogames comme l’arachide, les

variétés commercialisées sont mises au point après plusieurs cycles d’autofécondations. Or,

l’effet de dominance est lié à l’hétérozygotie qui s’annule au cours des autofécondations

successives. Par contre, l’effet de dominance est très exploité chez les espèces allogames où la

commercialisation de variétés hybrides est particulièrement importante et entretenue par les

multinationales qui travaillent dans la production de semences.

Tableau 8. Tests d’épistasies individuels A, B et C et le test combiné pour le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre GC-8-35 et 73-30

Tests individuels

Valeur estimée Ecart-type Valeur t Probabilité

A (ddl= 236) -0,662 2,122 -0,31 P > 0,05

B (ddl= 236) -2,050 1,375 -1,49 P > 0,05

C (ddl= 316) 2,613 4,355 0,6 P > 0,05

Test combiné (χ2)

(ddl = 3) 3,263 - - 0,353

Pour les tests A, B et C et pour le test combiné, la valeur t critique est au seuil de 5% égale à 1,96 et 7,81

respectivement.

Tableau 9. Effets génétiques impliqués dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre GC-8-35 et 73-30

Effet génétique


m 11,12 0,309 35,99 < 0,001

d 7,036 0,306 22,97 < 0,001

h 0,222 0,732 0,30 0,762

III.3.1.3.3. Croisement 3 (Fleur 11 x 73-30)

Avec le croisement Fleur 11 x 73-30, le test d’épistasie A et par conséquent le test

combiné de Cavallis ont été statistiquement significatifs au seuil de probabilité de 5%

(Tableau 10). Ce qui indique une déviation par rapport au modèle additif-dominance.


66

L’introduction dans le modèle des trois paramètres d’interactions digéniques (i, j et l) a

montré un effet significatif de l’interaction de type «additif x dominance» (Tableau 11).

Toutefois, l’effet d’additivité a été statistiquement significatif et sa valeur reste

approximativement égale à celle observée dans les autres croisements 1 et 2. Ce qui indique

que l’effet d’additivité joue un rôle important dans le contrôle génétique de la dormance des

graines fraîches de variétés d’arachide de type botanique Spanish.

Tableau 10. Tests d’épistasies individuels A, B et C et le test combiné pour le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre Fleur 11 et 73-30

Tests individuels


A (ddl= 236) 3,71 1,92 1,93 P > 0,05

B (ddl= 236) 5,45 1,84 2,96 P< 0,05

C (ddl= 316) 5,76 3,97 1,45 P > 0,05

Test combiné (χ2) 17,41** - - < 0,001

Pour les tests A, B et C et pour le test combiné, la valeur t critique est au seuil de 5% égale à 1,96 et 7,81

respectivement ; ** = significatif au seuil de 0,01%

Tableau 11. Effets génétiques impliqués dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez le croisement entre Fleur 11 et 73-30


Effet génétique

m 14,93 4,24 3,52 < 0,001

d 7,19 0,31 23,45 < 0,001

h -7,16 9,99 -0,72 0,474

i -4,02 4,23 -0,95 0,342

j -9,16 2,39 -3,84 < 0,001

l 2,29 6,08 0,38 0,707

En résumé des résultats sur les effets génétiques, il ressort que la dormance des graines

fraîches d’arachide de type Spanish est contrôlé par des effets d’additivité et de dominance

pour les croisements 1 et 2.

Toutefois, chez le croisement avec Fleur 11 (croisement 3), une déviation statistiquement

significative par rapport au modèle additif-dominance avec l’effet épistasique de type

« additivité x dominance» significatif. Cette déviation pouvant être liée à diverses raisons


67

notamment aux effets environnementaux notamment à un simple biais d’échantillonnage, il

serait hasardé de conclure de façon hâtive sur l’existence de phénomènes d’épistasies dans ce

croisement sans d’autres analyses plus approfondies. A cet effet, l’analyse qualitative qui sera

abordée dans ce chapitre nous permettra de mieux discuter l’existence ou non d’épistasies

dans le contrôle génétique de la dormance des graines fraîches d’arachide au sein des variétés

de type botanique Spanish. L’analyse qualitative sera faite sur les générations filiales obtenues

avec les trois croisements étudiés ici. Cette analyse nous permettra de confirmer ou d’infirmer

l’existence d’interactions épistasiques dans le contrôle de la dormance des graines fraîches

pour le croisement entre Fleur 11 et 73-30.

III.3.1.4. Composantes de la variance génétique par REML

L’analyse des composantes de la variance génétique par la méthode du maximum de

vraisemblance restreinte, en utilisant le modèle à six paramètres (m, d, h, i, j et l) de Mather et

Jinks (1982), est donnée dans les tableaux 12, 13 et 14. Les estimations des composantes de la

variance génétique confirment les résultats sur les effets génétiques. En effet, pour les trois

croisements, la composante additive de la variance a une valeur supérieure à celles dues à la

dominance et aux effets d’épistasies. D’ailleurs, excepté pour le croisement avec Fleur 11,

aucune variance due aux effets d’épistasies n’a pas été significative. Ce qui corrobore que le

caractère est sous contrôle d’additivité et de dominance. Même avec le croisement Fleur 11 x

73-30, la variance additive reste la principale composante de la variance génétique. La

contribution des effets de dominance et d’épistasies dans la variabilité observée est presque

négligeable comparé à celle de l’effet additif des gènes. Autrement dit, la composante additive

prédomine sur la variance génétique de la dormance des graines fraîches d’arachide de type

Spanish. Mais dans le cas d’effectif de taille réduite comme dans cette étude, l’estimation par

la méthode de vraisemblance conduit à une surestimation des composantes génétiques (Lynch

et Walsh, 1998), par conséquent, la valeur estimée de chaque composante de la variance

génétique, par cette méthode, doit être prise à titre indicatif.


68

Tableau 12. Composantes de la variance génétique estimées par REML chez le croisement 55-437 x 73-30

Composante d.d.l. S.C. Variance Prob.

D 1 941,84 941,84 < 0,001

H 1 10,60 10,60 0,001

I 1 0,08 0,08 0,771

J 1 3,30 3,30 0,069

L 1 2,83 2,83 0,093 D = variance additive, H = variance de dominance, I = variance additive x additive, J = variance additive x dominance, L = variance dominance x dominance

Tableau 13. Composantes de la variance génétique estimées par REML chez le croisement GC-8-35 x 73-30


D 1 608,03 608,03 < 0,001

H 1 0,09 0,09 0,762

I 1 0,10 0,10 0,757

J 1 1,42 1,42 0,233

L 1 1,75 1,75 0,186 D = variance additive, H = variance de dominance, I = variance additive x additive, J = variance additive x dominance, L = variance dominance x dominance Tableau 14. Composantes de la variance génétique estimées par REML chez le croisement Fleur 11 x 73-30


D 1 764,739 764,739 < 0,001

H 1 0,002 0,002 0,966

I 1 2,552 2,552 0,110

J 1 14,713 14,713 < 0,001

L 1 0,141 0,141 0,707 D = variance additive, H = variance de dominance, I = variance additive x additive, J = variance dominance x dominance, L = variance dominance x dominance

A notre connaissance, cette étude est la première investigation où l’analyse des

composantes de la variance génétique a été faite pour la dormance des graines fraîches chez

l’arachide. Bien que ce travail ait été réalisé uniquement entre variétés Spanish, la

prédominance de la variance additive sur le contrôle génétique de la dormance des graines


69

fraîches peut être généralisée même pour des croisements entre types botaniques différents

(Spanish x Virginia), bien entendu sa proportion pourrait être moindre dans les cas de

croisements entre deux variétés appartenant à des sous-espèces différentes. En effet, d’autres

investigations chez l’arachide ont montré que la plupart des caractères (agronomiques) liées

aux graines a une variance additive plus élevée que les autres composantes de la variance

génétique. Toutefois, dans les croisements entre deux variétés de types botaniques différents

(donc génétiquement plus éloignés) la part de la variance liée à l’effet de dominance et aux

interactions épistasiques devient importante. De même, un effet d’hétérosis pourrait même

être observé pour certains caractères dans les premières générations (Halward et Wynne,

1991 ; Upadhyaya et Nigam, 1998; Harisprasanna et al. 2008).

III.3.1.5. L’héritabilité et le gain génétique escompté

III.3.1.5.1. L’héritabilité

L’estimation de l’héritabilité au sens large (H2) de la dormance des graines fraîches

d’arachide de variétés du type botanique Spanish basée sur le nombre de jours avant

germination a donné des valeurs élevées comprises entre 0,72 et 0,90. L’héritabilité au sens

strict (h2) a varié entre 0,41 et 0,47 (Tableau 15).

Tableau 15. Estimation de l’héritabilité au sens large (H2) et au sens strict (h2) de la dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish chez les trois croisements

Croisement

Héritabilité

H12 H2

2 h2

55-437 x 73-30

0,77 0,89 0,46

GC-8-35 x 73-30

0,72 0,80 0,41

Fleur 11 x 73-30 0,73 0,88 0,47 H1

2 et H22 sont les valeurs de l’héritabilité au sens large selon respectivement la méthode de Warner (1952) et la

méthode de Lush (1948).

Ces valeurs indiquent que plus de 70% de la variance totale est liée aux effets

génétiques et que moins de 30% sont liés aux effets non-génétiques. Cette influence des

facteurs environnementaux sur la dormance des graines fraîches est assez prévisible du fait

que les caractères physiologiques sont, en général, influencés par l’environnement (Mousseau

et Roff, 1987). D’ailleurs, les variations interannuelles (Chapitre II) constatées sur ce


70

caractère corroborent l’importance du nombre de facteurs environnementaux qui peuvent

influencer la dormance des graines fraîches d’arachide. Nos estimations sont proches de celles

obtenues par Ndoye (2001) bien qu’il ait estimé l’héritabilité sur la base du nombre de

repousses sur les plantes-mères. La similarité de nos résultats avec ceux de Ndoye (2001)

confirme bien que la sélection de lignées d’arachide de type Spanish possédant le caractère

dormance des graines fraîches dans les descendances en ségrégation peut être faite à partir du

décompte du nombre de repousses sur les plantes-mères au champ ou en réalisant des tests de

germination des graines au champ ou au laboratoire. Par contre, nos estimations sont plus

élevées que celle obtenue par Khalfoui (1991b) en ce qui concerne l’héritabilité au sens large

(H2) par contre très proche pour l’héritabilité au sens strict (h2). Cet auteur a estimé

l’héritabilité au sens large et l’héritabilité au sens strict de la dormance des graines fraîches

d’arachide à partir du croisement Chico x 73-30 respectivement à 0,57 et 0,49 en utilisant le

même critère de phénotypage que celui utilisé dans cette étude. Cette différence sur

l’héritabilité au sens large (H2) peut être due à un meilleur contrôle des facteurs

environnementaux dans notre étude comparativement à celle de Khalfaoui (1991b) soit à une

différence génotypique du fait que nous n’avons pas utilisé le même parent femelle. Ainsi,

l’héritabilité au sens strict (h2) rapproche bien nos résultats. En effet, l’héritabilité au sens

strict (h2) et l’héritabilité au sens large (H2) sont des paramètres génétiques prédictifs qui

dépendent à la fois des facteurs génétiques et des conditions environnementales. Toutefois,

l’héritabilité au sens large (H2) est moins généralisable puisqu’elle dépend plus des facteurs

environnementaux et de l’interaction génotype –environnement que l’est l’héritabilité au sens

strict (h2).

III.3.1.5.2. Le gain génétique ou réponse à la sélection

Le gain génétique escompté (Gs) calculé à partir de la moyenne de la population F2 de chaque

croisement montre que la moyenne de la population des descendances d’individus F2

augmenterait de 5 à 9 jours (Tableau 16). Ainsi, avec une pression de sélection de 5%, la

moyenne de la descendance des individus de la population F3 va atteindre 22, 18 et 21 jours

respectivement avec le croisement 1, 2 et 3, dans les mêmes conditions environnementales

(Tableau 16).


71

Tableau 16. Estimation du gain génétique escompté (Gs) chez les trois croisements

Croisement

Gain génétique escompté (Gs) en jours

k = 5% k = 10%

55-437 x 73-30

9 6

GC-8-35 x 73-30

8 5

Fleur 11 x 73-30

9 6

D’un point de vue du calendrier cultural au Sénégal, cette durée de dormance est

suffisamment longue pour permettre au paysan de disposer d’un temps utile pour finaliser la

récolte des céréales notamment le mil, sans risque de perdre une bonne partie de sa production

d’arachide, si des pluies tardives sont enregistrées après la maturité physiologique des graines

d’arachide. Vu que le contrôle génétique du caractère est simple, le gain génétique escompté

(Gs) ne devrait pas changer beaucoup au cours des premières générations d’autofécondation

successives qui seront développées à partir de la population F2. En effet, la variance génétique

additive elle-même ne changera pas significativement au cours des premières générations

d’autofécondation successives du fait que le caractère est génétiquement simple.

III.1.3.6. Le nombre minimum de gènes

L’estimation du nombre de gènes en jeu a donné des valeurs approximativement

égales à un (1) pour les trois croisements (Tableau 17). Autrement dit, un seul locus

polymorphe entre chaque couple de parents est responsable de la variation de la dormance des

graines fraîches. La moyenne des trois estimations par croisement indique qu’un seul gène est

impliqué dans le contrôle du caractère dans les trois croisements. Les méthodes d’estimation

du nombre minimum (Nm) de gènes étant sujettes à des hypothèses fortes, les valeurs

obtenues ne sont qu’une estimation grossière de la valeur exacte du nombre recherché (Lande,

1981).


72

Tableau 17. Estimation du nombre minimum de gènes en cause dans le contrôle de la dormance des graines fraîches chez les trois croisements

Croisement

Nombre minimum de gènes

Nm1 Nm2 Nm3 Moyenne

55-437 x 73-30 0,45 0,43 0,94 0,60

GC-8-35 x 73-30 0,66 0,63 0,45 0,58

Fleur 11 x 73-30 1,30 0,53 0,31 0,71

A notre connaissance, ce travail constitue la première étude où l’estimation du nombre

de gènes en jeu dans la dormance des graines fraîches de variétés d’arachide de type Spanish,

a été déterminé à partir de méthodes basée sur l’approche quantitative. Upadhyaya et al.

(1991) et Asibuo et al. (2008) qui sont arrivés à la même conclusion à partir d’autres

croisements entre variétés Spanish en utilisant l’analyse qualitative. Dans notre étude, on note

que la troisième hypothèse d’application (absence de dominance) des méthodes d’estimation

du nombre de gènes n’est pas satisfaite, ce qui probablement a fait que les estimations du

nombre minimum de gènes ont sous-estimées la valeur exacte (égale à 1). Ainsi nos résultats

confirment ceux obtenus par Upadhyaya et Nigam (1991) et Asibuo et al. (2008) qui ont

procédé par analyse de ségrégation de populations. L’analyse qualitative réalisée dans cette

étude devrait permettre de valider cette estimation du nombre de gènes d’autant plus que nous

l’estimerons à partir de plusieurs générations apparentées.

III.3.2. Analyse qualitative

Les résultats sur l’héritabilité au sens large (H2) montrent qu’il n’y a pas une

surimposition des facteurs environnementaux sur le caractère par conséquent une approche

basée sur une analyse qualitative se justifie comme l’ont réalisé Udadhyaya et Nigam (1999)

et Asibuo et al. (2008). Par ailleurs, les estimations du nombre de gènes en cause par

l’approche quantitative a indiqué que le nombre de facteurs génétiques en jeu est restreint.

Ces résultats indiquent que l’approche qualitative peut être effectuée pour l’analyse génétique

de la dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish.

III.3.2.1. Rapports de ségrégations dans les populations non contrôlées

Chez le croisement 55-437 x 73-30, le khi-deux (χ2) calculé sur la base d’un gène

dominant a été statistiquement non significatif (P > 0,05) aussi bien avec la population F2 que

la population BC1P2s (Tableau 18). Cela indique une bonne adéquation entre les proportions


73

observées avec celles attendues sur la base d’un seul gène dominant. Autrement dit, ce

résultat nous conduit à accepter l’hypothèse d’un seul gène dominant responsable de la

variabilité observée dans la dormance des graines fraîches de ces populations en ségrégation.

Pour les populations F3 et BC1P1s, le test khi-deux a été significatif au seuil de probabilité de

5%. Toutefois, ces déviations n’ont pas été importantes pour rendre inadéquat le modèle

additive-dominance (Tableau 7). Cette faible déviation dans ces deux populations est

probablement due aux effets non-génétiques y compris la présence dans les échantillons de

graines issues d’autofécondations lors des croisements.

Table 18: Rapports de ségrégation (dormant : non dormant) dans les générations filiales du croisement 55-437 x 73-30

Dormant Non-dormant Khi-deux (χ2)

observé attendu observé attendu

F2 (3:1) 58 60 22 20 0.13

F3 (5:3) 60 50 20 30 5.33*

BC1P1s (7:1) 67 70 16 10 3.73

BC1P2s (3:5) 41 30 39 50 6.45*

Valeur critique χ2 (ddl=1) = 3,84 au seuil de signification de 5%; * = significatif ; ** = non significatif

De même, pour le croisement GC-8-35 x 73-30, mis à part la population BC1P2s, on

note une bonne adéquation entre les valeurs observées et celles attendues (Tableau 19). Pour

ce croisement également, la déviation observée avec la population BC1P2s n’a pas été aussi

importante pour induire une inadéquation du modèle additive-dominance (Tableau 9). La

déviation dans cette population par rapport aux fréquences attendues serait probablement liée

à la même cause évoquée avec le croisement 55-437 x 73-30.


74

Table 19. Rapports de ségrégation (dormant : non dormant) dans les générations filiales du croisement GC-8-35 x 73-30



F2 (3:1) 57 60 23 20 0.60

F3 (5:3) 55 50 25 30 1.33

BC1P1s (7:1) 68 70 12 10 0.46

BC1P2s (3:5) 42 30 38 50 7.68*

Valeur critique χ2 (ddl =1) = 3,84 au seuil de signification de 5% ; * = significatif

Avec le croisement 3, des distorsions de ségrégation très hautement significatives (P <

0,001) observées chez le croisement Fleur 11 x 73-30 ont été observées pour les générations

F2 et BC1P1s (Tableau 20). L’inadéquation du modèle additivité-dominance avec ce

croisement (Tableau 11) est en mettre en relation avec ces déviations très hautement

significatives. Par contre, les rapports de ségrégations observées dans les générations F3 et

BC1P2s sont en accord avec les proportions attendues. Ces dernières générations confirment le

caractère est sous le contrôle d’un seul gène dominant. Table 20: Rapports de ségrégation (dormant: non dormant) dans les générations filiales du croisement Fleur 11 x 73-30



F2 (3:1) 41 60 39 20 24.06**

F3 (5:3) 55 50 25 30 1.33

BC1P1s (7:1) 55 70 25 10 25.71**

BC1P2s (3:5) 37 30 43 50 2.61

Valeur critique χ2 (ddl=1) = 3,84; ** = significatif au seuil de 0,01


75

III.3.2.2. Rapport de ségrégation dans la population contrôlée aux microsatellites

Sur les soixante-dix huit (78) plantes putatives F1 du croisement Fleur 11 x 73-30, 38

individus ont été identifiés comme des hybrides F1 du croisement (soit un pourcentage de

48%). Bien que ce pourcentage puisse varier d’un échantillon à un autre dans le même

croisement, il donne une indication de l’importance du nombre d’individus issus

d’autofécondations qui pourraient exister dans une population F1 ou dans un rétrocroisement

(backross). Cela suggère l’intérêt et l’importance qu’il faut accorder au contrôle systématique,

par quelques marqueurs microsatellites, des descendants de croisements entre parents

génétiquement proches. Gomez et al. (2008) ont également souligné l’importance du contrôle

des individus hybrides issus de croisements entre variétés génétiquement proches par des

microsatellites. D’ailleurs, les travaux de Smith et Register (1998) sur la tomate, de Salgado et

al. (2006) sur le maïs, Yashitola et al. (2002) sur le riz et Dongre et Parkhi (2005) sur le coton

ont souligné l’intérêt des marqueurs moléculaires pour mieux faciliter l’identification de

descendants de croisements, au lieu de se limiter uniquement aux observations basées sur des

critères morphologiques.

Aussi bien avec le test effectué au laboratoire comme celui réalisé au champ, la

moyenne de la population parentale femelle, Fleur 11 est de cinq (5) premiers jours alors que

celle de la variété parent mâle 73-30, les graines ont germé entre le 11e jour et le 35e jour du

test. Cela montre d’une part la bonne dormance des graines de la variété 73-30 et d’autre part

la possibilité de classer les individus de chaque descendance filiale en groupes phénotypiques

pour l’analyse qualitative.

On note par ailleurs que l’amplitude de la variation a été grande (1 à 35 jours) et

comparable à celle obtenue avec les tests au champ (1 à 36 jours) (Tableau 20). Upadhyaya et

Nigam (1999) ont réalisé avec le même type de test de viabilité (à l’éthrel) et ont observé des

germinations jusqu’à 35 jours dans des populations en ségrégation sur d’autres croisements

entre variétés du type botanique Spanish. Le test de viabilité a confirmé que les embryons

d’arachide étaient tout simplement dormants. Marchand (1971) a observé également chez

l’arachide une viabilité des embryons de graines mises à germer jusqu’à 21 jours en utilisant

un colorant des cellules embryonnaires appelé le triphényl-2, 3, 5, tétrazolium.

Le test du khi-deux χ2 réalisé sur cette population contrôlée a été statistiquement non

significatif (P > 0,05), indiquant ainsi une adéquation entre les proportions observées et les

proportions attendues sur la base d’un gène dominant (Tableau 21). Par conséquent, les

distorsions de ségrégations observées dans les populations non contrôlées sont probablement

dues d’une part à l’effet des facteurs environnementaux non contrôlées, d’autre part à un de


76

biais d’échantillonnage lié à la présence de graines issues d’autofécondation de fleurs durant

les croisements initiaux (F1) et/ou durant le développement des backcross avec les parents de

chaque croisement.

Tableau 21: Rapport de ségrégation dans la population F2 contrôlée aux marqueurs microsatellites

Phénotype Total Variation Khi-deux Prob.

Dormant Non

dormant

χ2

Attendu

57 19 76

2-35

3,40 P > 0,05 Observé 49 27 76

Valeur critique χ2 (ddl=1) = 3,84 au seuil de signification de 5%

Il apparaît évident à partir de ce test que le contrôle génétique dans ce croisement

comme chez les deux autres croisements, ne fait intervenir que de l’effet d’additivité et de

dominance. En définitif, on note que l’effet d’interaction épistasique de type additif-

dominance (j), statistiquement significatif observé chez le croisement avec Fleur 11, est

probablement dû aux effets combinés de facteurs environnementaux et la présence d’individus

issus d’autofécondations dans les populations non contrôlées. Nos résultats sont en accord

avec ceux de Lin et Lin (1971), d’Upadhyaya et Nigam (1999) et Asibuo et al. (2008) qui ont

travaillé sur d’autres croisements. Si ces auteurs ont trouvé aucune déviation significative

dans leurs études c’est probablement le fait que leurs travaux ont tous étaient réalisés en

conditions contrôlées. Par ailleurs, Upadhyaya et Nigam (1999) ont mentionné avoir identifié

et isolé tous les individus issus d’autofécondation dans leurs croisements de sorte à éviter tout

biais dû aux autofécondations lors des croisements. En effet, l’identification des hybrides aux

moyens d’observations sur la morphologie des plantes est certes difficile mais pas impossible

si les deux parents du croisement considéré diffèrent d’un ou de plusieurs caractères

facilement détectables, ce qui n’est pas le cas dans notre étude.

Le diagramme de distribution de fréquences construit à partir de cette population F2

contrôlée est bimodal (Figure 12). Cette bimodalité de la distribution de fréquences corrobore

l’idée d’un seul gène dominant indiquée par l’analyse de ségrégations. Mather (1949), Lynch

et Walsh (1998) ont montré que lorsque le diagramme de distribution de fréquences d’une

population F2 issue de parents lignées pures est bimodal alors un seul gène est responsable de


77

la variation phénotypique observée. En définitif, les résultats de l’analyse qualitative ont

permis de valider que le caractère est monogénique mais que des effets environnementaux et

la présence de graines issues d’autofécondation peuvent induire des déviations plus ou moins

importantes.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

1‐5 6‐10 11‐15 16‐20 21‐25 26‐30 31‐35

Fréq

uence (%

)

Jours avant germination

Figure 12. Diagramme de distribution de fréquence de la dormance des graines fraîches dans la population F2 contrôlée aux marqueurs microsatellites

On note une large variation (11 à 35 jours) de la durée de dormance entre les individus

dormants de la population F2 contrôlée (Figure 12). Cette variation observée entre les

individus dormants donne une indication sur le niveau de la dominance du gène de la

dormance des graines fraîches. Dans le cas d’un phénotypage en conditions contrôlées, la

variance environnementale est réduite à son plus bas niveau. Par conséquent, cette variation

de la durée de dormance est vraisemblablement due à une dominance partielle de la dormance

sur la non dormance dans ce croisement. En effet, cette variation semble montrer qu’il existe

une différence entre la valeur phénotypique d’un hétérozygote et celle d’un homozygote

dormant (porteur de l’allèle de 73-30). Dans le cas d’une dominance partielle, la valeur

génotypique (phénotypique) d’un individu hétérozygote dormant serait proche de celle d’un

individu mais ne lui est pas égale, ce qui conduirait à une large variation au sein des dormants,

comme observé dans cette étude. Stokes et Hull (1930) et Ramchandran et al. (1967) sont

arrivés également à la même conclusion sur d’autres croisements chez l’arachide. Par contre,


78

Lin et Lin (1971) ont observé une dominance totale. En fait, la dominance peut varier d’un

croisement à un autre si les formes alléliques en présence diffèrent d’un croisement à un autre.

Cette dominance partielle ou complète selon les croisements, rapportée dans la littérature,

semble confirmer l’idée d’une diversité génétique pour la dormance des graines fraîches

d’arachide de type Spanish. D’ailleurs, les investigations antérieures de Hull (1930), Varisai

et Doraijaj (1968), Pandya et Patel (1986), Wadia et al. (1987) ont déjà souligné l’existence

de cette diversité génétique.

L’analyse de la ségrégation par familles F2:3 de cette population contrôlée aux

marqueurs microsatellites a été envisagée dans notre étude mais malencontreusement une

attaque des plantes F3 par des mouches blanches a fait qu’aucune analyse statistique n’a pu

être réalisée sur ces données. Néanmoins, on a constaté une ségrégation dans certaines des

familles F2:3 issues de plantes F2 hétérozygotes au locus du gène de la dormance. Cette

ségrégation dans des familles F2:3 confirme la dominance de l’allèle de dormance sur celui de

non dormance.

III.4. Conclusion et implications en termes de sélection Au vu des résultats sur les trois croisements de cette étude, le contrôle génétique se

limite à des effets d’additivité et de dominance. Par ailleurs, les valeurs de l’héritabilité au

sens large (H2) du caractère dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish sont

moyennes à élevées. De même, l’héritabilité au sens strict (h2) du caractère se situe dans la

gamme des valeurs élevées (h2 > 0,4), en génétique végétale. Ainsi, on peut conclure à partir

de ces résultats que la dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish a une

hautement héritable. L’estimation du nombre de gènes montre qu’un seul locus est

responsable de la variation observée dans les populations en ségrégation. Par conséquent, la

sélection de lignées d’arachide précoces et à graines fraîches dormantes peut être valablement

envisagée, à partir des premières générations de croisement entre variétés Spanish, en utilisant

une méthode de sélection classique de type pédigrée ou sélection bulk, en réalisant des tests

de germination au champ ou dans des boîtes de Pétri au laboratoire.

Pour être optimisée, la sélection de lignées d’arachide dormantes nécessiterait d’opérer

un bon contrôle des facteurs non-génétiques d’une part par un contrôle systématique, par

quelques des marqueurs moléculaires, des individus de la population F1 et d’autre part en

effectuant les tests de germination au laboratoire pour réduire l’effet des facteurs

environnementaux. Toutefois, il y a des risques de pertes de plants avec le test au laboratoire

du fait que les légumineuses sont particulièrement sensibles aux lésions (comparativement


79

aux céréales) et tiennent plus difficilement au repiquage. Un repiquage effectué dès

qu’apparaît la radicule pourrait permettre de minimiser ces pertes de pieds. Ce repiquage

réalisé dans un environnement avec une humidité relative très élevée favoriserait un excellent

taux de réussite des repiquages. D’autre part, du fait de la difficulté à identifier les hybrides

dans un croisement Spanish x Spanish au moyen uniquement d’observations sur la

morphologie des plantes, nos résultats suggèrent qu’un contrôle soit effectué au moyen de

marqueurs moléculaires (microsatellites) à tous les niveaux de croisement pour éviter tout

biais lié aux fleurs autofécondées.

Cette partie de ce chapitre a fait l’objet d’un article intitulé « Inheritance of fresh seed dormancy in Spanish-type peanut (Arachis hypogaea L.): bias introduced by inadvertent selfed flowers as revealed by microsatellite markers control » publié à la revue African Journal of Biotechnology, 9 (13), 1905-1910, 29 March, 2010

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African Journal of Biotechnology Vol. 9(13), pp. 1905-1910, 29 March, 2010 Available online at http://www.academicjournals.org/AJB ISSN 1684–5315 © 2010 Academic Journals Full Length Research Paper

Inheritance of fresh seed dormancy in Spanish-type peanut (Arachis hypogaea L.): bias introduced by

inadvertent selfed flowers as revealed by microsatellite markers control

Faye Issa1,4, Foncéka Danièl2, Rami Jean-François2, Tossim Hodo-Abolo3, Sall Mbaye Ndoye3,

Diop A. Tahir4 and Ndoye Ousmane1,3*

1Centre National de Recherches Agronomiques (CNRA/ISRA), BP : 53 Bambey, Sénégal. 2Centre de Coopération Internationale en Recherches Agronomiques pour le Développement (CIRAD), UMR

Développement et Amélioration des plantes, TA A96/3, Avenue Agropolis, Montpellier, France. 3Centre d’Etude Régional pour l’Amélioration de l’Adaptation à la Sécheresse (CERAAS/ISRA/CORAAF), BP 3320

Thiès, Sénégal. 4Université Cheikh Anta Diop, Faculté des Sciences et Techniques, Laboratoires des Biotechnologies des

Champignons, Fann-Dakar, Sénégal.

Accepted 11 march, 2010

Production and seed quality in peanut (Arachis hypogaea L.) can be reduced substantially by in situ germination under unpredictable rainfed environments. Inheritance of fresh seed dormancy in Spanish x Spanish crosses was studied with two sets of segregating populations, an F2 population derived from true F1 hybrids identified with peanut microsatellites markers and other populations (F2, BC1P1S and BC1P2S) from randomly-selected F1 individuals. In the F2 population developed with true F1 hybrids, the chi square test was not significant for the deviation from the expected 3:1 (dormant: non-dormant) ratio. In addition, the bimodal frequency distribution curve with the F2 population gave more evidence that fresh seed dormancy is controlled by a single dominant gene. The average frequency (48%) of true F1 hybrids give evidence that deviations from expected ratios in the populations (F2 and BC1P1S) developed from non-tested F1 individuals, is most likely due to inadvertent selfs. This study emphasized the need to identify with molecular markers the cross progenies in self-pollinated crops as peanut before testing for any trait. Key words: Peanut, true F1 hybrids, fresh seed dormancy, SSR markers.

INTRODUCTION More than 94% of world peanut (Arachis hypogaea L.) production comes from the rainfed crop grown largely by resource-poor farmers (Dwivedi et al., 2003). In such dry areas, the end of the rainy season is variable and late rains that may occur after peanut maturity can cause in *Corresponding author. Email: [email protected]. Tel: + 221 33 951 49 94. Fax: + 221 33 951 49 95.

situ germination in peanut. Gautreau (1984) reported significant (20%) pod yield losses with the variety 55 - 437 in field experimentation in Senegal. Martin (1999) found that in situ germination may cause more suscep-tibility to aflatoxin contamination in seeds thus, reducing the seed quality.

The species A. hypogaea L. has been divided into two subspecies: A. hypogaea subsp. hypogaea and A. hypo-gaea subsp. fastigiata. In the subspecies A. hypogaea subsp. hypogaea var. hypogaea (Virginia and Runner

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�

1906 Afr. J. Biotechnol. market types) and var. hursita, varieties have long duration cycle and seeds are dormant. While in subspecies fastigiata involving var. fastigiata (Valencia market class) and var. vulgaris (Spanish market type), varieties are early-maturing but generally lack fresh seed dormancy (Krapovickas and Gregory, 1994). Spanish and Valencia varieties are currently the most commonly cultivated peanut varieties in dry areas, particularly in Africa and Asia where the shortening of the rainy season is a paramount constraint. However, these early-maturing varieties lack generally fresh seed dormancy and are prone to in situ germination. The growing trend of areas occupied by early-maturing varieties will still increase during the next coming decades since drought is now a worldwide abiotic constraint for peanut production. There is a need to develop short duration peanut varieties having fresh seed dormancy to prevent yield losses due to field sprouting in unpredictable rainfall environments.

During the last decade, a few studies on the inheritance of fresh seed dormancy among Spanish type varieties were carried out. Depending on whether epistasis was detected or not in inheritance of the trait, breeders suggested different strategies of selection. In fact, the conclusions of these investigations were not consistent. Khalfaoui (1991) indicated that duplicated epistasis controls fresh seed dormancy. Nautiyal et al. (1994) found that the trait is quantitatively inherited; whereas Kumar (1999) has reported that the trait is under additive-dominance control. Upadhyaya and Nigam (1999) studied different populations from many crosses and found that seed dormancy in that peanut-type is controlled by a single gene and dormancy allele is dominant. More recently, Ndoye (2001) studied three crosses between Spanish varieties and reported that beyond additive and dominance effects, there is duplicate epistasis in the control of fresh seed dormancy. Pheno-typing for fresh seed dormancy in peanut can be reliably carried out at the field (Khalfaoui, 1991) or in vitro assay (Upadhyaya and Nigam, 1999; Asibuo et al., 2008). Our previous work gives strong evidence that field test and in vitro assay give similar results for fresh seed dormancy (Faye et al., 2009) when seed germination tests are performed under right convenience of humidity, light and appropriated temperatures.

Breeding for new varieties requires development and evaluation of a cross progeny. In self-pollinated crops (for example, cowpea, rice, cotton, common beans and groundnut), the breeding process starts commonly with hand pollination. Hybridization requires laborious manual emasculation and pollination as well as manual removing of non-crossed flowers. In groundnut, some underground uncolored flowers as fertile as external flowers may not be removed by the operator and produce undesirable self-pollinations. Therefore, distinguishing true F1 hybrids from plants coming from inadvertent selfs is very impor-

tant before deriving F2 population and subsequent families. In groundnut, distinguishing true F1 hybrids from inadvertent selfs may be easy to achieve base on plant morphology when dealing with crosses for which parents are much divergent. In contrast, for intrasubspecies crosses (e.g. Spanish x Spanish), true F1 hybrids are not easily distinguishable from female parent using morpho-logical characteristics.

The purpose of this paper is to study the inheritance of fresh seed dormancy in a Spanish x Spanish cross. In this study, an F2 population derived from true F1 hybrids identified using microsatellite markers was compared with an F2, a BC1P1s and a BC1P2S populations developed without conformity control of F1 plants. MATERIALS AND METHODS Populations’ development During the spring of the year 2006, one of the most susceptible in situ germination varieties (Fleur 11) cultivated in the “Senegalese peanut basin” was crossed to a dormant variety (73-30). The female parent Fleur 11 is non-dormant but high-yielding specie since it is very prolific and its underground uncolored flowers are remarkably numerous. The genotype 73-30 is a dormant variety and medium-yielding. Fleur 11 and 73-30 are both early-maturing varieties; they mature at 90 days after sowing (DAS). They have no common ancestor in their pedigree. The crosses were made as suggested by Sudheer and Kumar (1996). At harvest, the putative F1 seeds were randomly divided into two subsets before processing to the subsequent generations.

One subset was assigned to molecular screen for identifying true hybrid F1 individuals (described below) using simple sequence repeat (SSR) markers. In that subset, once a plant was identified as true F1 hybrid (DNA extraction and microsatellite analysis), it was allowed to self-pollinate to give controlled F2 seeds.

Another subset of putative F1 seeds was used to develop back-cross progeny with each of the parents that is, BC1P1 [73-30 x F1 (Fleur 11 x 73-30)] and BC1P2 [Fleur 11 x F1 (Fleur 11 x 73-30)]. These backcross progenies and the remaining non controlled F1 seeds were planted at field station (Bambey, Senegal) and allowed to self-pollinate, then selfed backcross between BC1P1S, BC1P2S populations and an F2 population, respectively. These three populations were referred to as non-controlled populations in the present paper. DNA extraction A set of seventy eight (78) putative F1 plants were grown in pots filled with sandy soil along with five plants of each parent in the greenhouse at Regional Center for Studies on the Improvement of Plant Adaptation to Drought (CERAAS) near Thiès, Senegal. At 15 days after emergency, young leaves were harvested from each plant and immediately stored at 4°C in ice before DNA extraction. DNA was extracted from 100 mg of fresh leaves following a slightly modified mixed alkyl trimethylammonium bromide (MATAB) pro-tocol (Risterucci et al., 2000). Briefly, leaves were ground in liquid nitrogen using a mortal and pestle and dissolved in 750 µl of MATAB buffer at 74°C. The samples were incubated for 20 min at 74°C and cooled for 5 min at room temperature. A volume of 750 µl of

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Faye et al. 1907

Table 1. List of peanut microsatellite markers used to identify true F1 hybrids.

Name Primer “Forward’’ 5’-3’ Primer “Reverse’’ 5’-3’ Motif PM50 caattcatgatagtattttattcgaca ctttctcctccccaatttga (TAA)4 + (GA)19 TC6E01 cagcaaagagtcgtcagtcg gaaagttcacttgagcaaattca (GA)29 TC1E05 gaaggataagcaatcgtcca ggatgggattgaacatttgg (GA)30 AC2C05 caaggaagcgtgaattgttag tgtggactatgcttgtcatgtt (TG)17 Seq4F10 tgcgaaacccctaactgact tctatgttgctgccgttgac (TG)7 + (GA)8 TC11A04 actctgcatggatggctacag catgttcggtttcaagtctcaa (CT)16 + (CT)33 TC1D02 gatccaaaatctcgccttga gctgctctgcacaacaagaa (TC)30 TC3E05 tgaaagataggtttcggtgga caaaccgaaggaggaacttg (CT)26+(CA)7+ (CA)5 TC11H06 ccatgtgaggtatcagtaaagaaagg ccaccaacaacattggatgaat (AG)34 TC2D06 agggggagtcaaaggaaaga tcacgatcccttctccttca (AG)30

Table 2. Chi square value and probability of goodness of fit for a ratio of 3 dormant: 1 non-dormant in the F2

generation developed from true F1 hybrids.

Data Phenotype

Total Range (days)

Chi square χχχχ2

Probability value Dormant Non-dormant

Expected 57 19 76 2 - 35 3.40 p > 0.05

Actual 49 27 76 chloroform\isoamylalcohol (CIA) (24:1) was added to each sample and all samples were shaken gently until homogenization before centrifugation at 12000 rpm for 20 min. The supernatant was then harvested and the DNA precipitated with 600 µl of 2-propanol. After centrifugation, pellets were washed with 300 µl of 70% ethanol, air dried and dissolved in 500 µl of TE. Microsatellite analysis Ten SSRs (PM050, TC6E01, TC1E05, AC2C05, Seq4F10, TC11A04, TC1D02, TC3E05, TC11H06 and TC2D06) polymorphic between the parents were used to identify the true hybrid individuals. The primers used for the identification of true F1 hybrids are listed in Table 1.

For a given SSR locus, the forward primer was designed with a 5'-end M13 tail (5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'). Polymerase chain reaction (PCR) amplifications were performed in a MJ Research PTC-100TM thermocycler (Waltham, MA, USA) or in an Eppendorf Mastercycler on 25 ng of DNA in a 10 µl final volume of buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8), 100 mM KCl, 0.05% w/v gelatin, and 2.0 mM MgCl2) containing 0.1 µM of the M13-tailed primer, 0.1 µM of the other primer, 160 µM of dNTP, 1 U of Taq DNA polymerase (Life Technologies, USA.) and 0.1 µM of M13 primer-fluorescent dye IR700 or IR800 (MWG, Germany). The touchdown PCR pro-gramme used was as follow: initial denaturation at 95°C for 1 min; following by 10 cycles of 94°C for 30 s, Tm (+ 5°C, - 0.5°C/cycle) for 1 min, and 72°C for 1 min. After these cycles, an additional round of 25 cycles of 94°C for 30 s, Tm for 1 min, and 72°C for 1 min and a final elongation step at 72°C for 8 min was performed. IR700 or IR800-labeled PCR products were diluted 7-fold and 5-fold respectively, subjected to electrophoresis in a 6.5% polyacrylamide gel and then sized by the IR fluorescence scanning system of the sequencer (LI-COR, USA). A plant was considered as true hybrid

(H) if it has both alleles of the two parents for all ten primers tested while inadvertent selfs (S) had only the allele of the female parent (Table 2). Phenotyping for fresh seed dormancy Maturity of the seeds was assessed by scoring for blackening of the internal inner parenchyma of the pod (Miller and Burns, 1971). In the field test, seeds were treated with a fungicide (Granox) prior the planting.

The non-controlled F2, BC1P1S and BC1P2S populations were phenotyped along with the parents (Fleur 11 and 73-30) using the method described by Khalfaoui (1991) for fresh seed dormancy at the experiment field of the research station (CNRA, Bambey-Senegal) where their mother-plants were cultivated. During the germination test, day mean temperature was 27°C. The soil was kept moist by regular watering.

Eighty seeds randomly sampled from each non-controlled segre-gating population (F2, BC1P1S and BC1P2S) and from each parental population (Fleur 11 and 73-30) were phenotyped for fresh seed dormancy. The number of seeds that germinated was counted each day. Monitoring continued until all the seeds germinated (35 DAS).

Seventy-six seeds from the F2 population derived from controlled F1 plants along with one hundred (100) seeds from each of the two parents were incubated at room temperature (30°C ± 1) for fresh seed dormancy test. The test was performed in Petri dishes using filter paper moistened with distilled water. Before the test, Petri dishes were washed with sodium hypochlorite (46°). Filter papers were kept moist with distilled water until all the seeds germinated (35 DAS). Seeds that had not germinated at 15 DAS were soaked for 6 h in 2-chloroethylphosphonic acid (10-3 M) solution. This compound is known to be effective in breaking seed dormancy and was used to confirm the viability of the dormant seeds. This

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1908 Afr. J. Biotechnol.

Figure 1. Microsatellite marker survey of a subset of 44 F1 putative hybrids using primer pair AC2C05. a = Female parent allele (Fleur 11); b = male parent (73-30) allele; H = hybrid; S = inadvertent self.

product, commonly called ethereal, is readily converted to ethylene (Ketring and Morgan, 1971). After treatment with ethereal, treated seeds was returned to room temperature until they germinated for scoring. Compared on the phenotype of the parents, the segre-gating F2 seeds were classified as dormant or non-dormant. Statistical analysis The chi square (�2) test was calculated to examine the goodness-of-fit between the observed and the expected ratios in all the populations at the probability p=0.05 level of significance. RESULTS AND DISCUSSION The percentage of true F1 hybrids identified with SSR markers Of the seventy eight (78) putative F1 plants tested, thirty eight (38) were true F1 hybrids, corresponding to a percentage of 48%. Figure 1 set out a profile of bands for detecting true F1 hybrids with the primer AC2C05. This percentage of true F1 hybrids indicated most likely that inadvertent selfs were collected at harvest, although caution was taken to remove underground uncolored flowers till 60 days after emergency. The average percentage of true F1 hybrids found in this study was lower than the percentage (60 - 70%) observed by Gomez et al. (2008). However, percentage of true hybrids in self-pollinated crops depends on the female parent used in the cross since the number of underground flowers may vary from one cultivar to another. Further-more, the percentage of true-hybrids depends upon the climatic conditions as described by Kotzamanidis (2006) who observed in peanut a lower (16%) percentage of successful crosses under low temperatures. It was however noted that inadvertent selfs could be important for one or another reason in cross progenies of peanut.

Segregation ratios for fresh seed dormancy in the different populations In the field test as well as in the Petri-dishes test, average day taken before germination was 5 days after sowing (DAS) for the seeds of the non-dormant parent (Fleur 11) while for the dormant parent (73-30), seeds germinated from 11 DAS to 35 DAS. This good level of dormancy of the donor parent 73-30 is a confirmatory of the investi-gations previously reported by Gautreau (1984), Khalfaoui (1991) and Ndoye (2001). Therefore, in the hetero-geneous populations studied here, seeds that germinated within 5 DAS were classified as non-dormant and those that took more days to germinate were classified as dormant.

The chi square test performed on the F2 population derived from true F1 hybrids, assuming 3:1 (dormant: non-dormant) ratio was not significant (P = 0.08), indicating that the trait is controlled by a single dominant gene (Table 2). These findings agreed with those previously reported by Upadhyaya and Nigam (1999) and Asibuo et al. (2008). In addition, the range of variation (2 - 35 DAS) observed in this study (Table 2) for the dormancy duration is consistent with the observed range of variation by Upadhyaya and Nigam (1999) although they used different parents.

The frequency distribution curve of fresh seed dormancy was bimodal, indicating that the trait can be treated in a qualitative fashion (Figure 2). Figure 2 brought out clearly two statistic modes, one (at 1 - 5 DAS) corresponding to the non-dormant seeds and the second (from 16 - 20 DAS) to the dormant seeds.

This finding corroborated with the segregation ratio that a single gene controls fresh seed dormancy in Spanish x Spanish crosses. Mather (1949), Lynch and Walsh (1998) argued that when the frequency distribution curve of a given trait is bimodal, the trait under study is

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Faye et al. 1909

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��

��

��

��

��

��

1 - 5 6 - 10 11 - 15 16 - 20 21 - 25 26- 30 31 - 35

��

Days before germination

Freq

uenc

y

Figure 2. Frequency distribution for fresh seed dormancy of the F2 individuals (n = 76) derived from true hybrid F1 individuals.

Table 3. Chi square value and probability of goodness of fit for the expected ratios in the developed populations derived from non tested F1 hybrids.

Generation Expected ratio

(dormant: non-dormant) Total

Observed values Chi square χχχχ2

Probability value Dormant Non-dormant

F2 3 :1 80 41 39 24.06 p < 0.0001 BC1P1S 7 :1 80 55 25 25.71 p < 0.0001 BC1P2S 3 :5 80 37 43 2.76 p > 0.05

qualitative in nature. Segregation of F2 and selfed backcross (BC1P1S and BC1P2S) seeds from non-controlled F1 plants Although the temperature varied slightly from one study to another; the range of variation for the number of days taken before germination (2 - 35) in the laboratory test as well as in the field test were very similar. Consequently, seeds in segregating generations (F2, BC1P1S and BC1P2S) were classified using the same criterion than in the controlled F2 population.

Phenotypic data from the populations (F2, BC1P1S and BC1P2S) which were developed from non-tested F1 indivi-duals were also investigated (Table 3). For the selfed backcross BC1P1S and BC1P2S, the chi square test was performed assuming a 7: 1 and 3: 5 (dormant: non-dormant) ratio, respectively. The chi square value was highly significant (P < 0.0001) for the F2 and BC1P1S populations in comparison to the expected ratios, but not

for the BC1P2S population. In the F2 population, inadvertent selfs from the putative

F1 plants are probably the major source of the deviation from the expected ratio. The phenotypic data showed thirty nine (39) germinated seeds out of 80 seeds leading to a neat deviation from the expected ratio (3: 1). The expected ratio was most probably biased due to self inadvertent seeds among the putative F1 self pollinated to develop that F2 population.

In the selfed backcross BC1P1S population, the source of deviation could be attributed to inadvertent selfs in the F1 as well as in the BC1P1 [73-30 x F1 (Fleur 11 x 73-30)] because the recurrent parent 73-30 was used as female parent (Table 3). Therefore, the source of deviation was most likely caused by the bias in the F1 generation. Although much care was taken to remove them, abun-dant underground uncolored flowers observed in the female parent induced a shift in the expected ratios between dormant and non-dormant seeds.

In contrast to the F2 and BC1P1S populations in the BC1P2S population, the chi square test was not significant

�

�

1910 Afr. J. Biotechnol. (p > 0.05); that means that actual phenotypic data fitted the expected ratio (Table 3). Good fit between observed and expected ratios in that population could be explained by mere chance since the sampling of putative F1 used to develop the subsequent generations was at random. So the ratio may depend upon the percentage of self inadvertent plants collected at the harvest of the cross progeny, particularly the F1 generation.

The results of the present study revealed that deviation from the expected proportions in non-controlled populations (F2 and BC1P1S) is most likely due to self inadvertent selfs during the populations’ development. In the context of the contradictory conclusions about the inheritance of fresh seed dormancy in peanut among Spanish crosses, this may be prominently a consequence of the presence of inadvertent selfs in phenotyped populations. In our know-ledge, except Upadhyaya and Nigam (1999), most of the few available previous reports on the inheritance of fresh seed dormancy among crosses of Spanish-type peanut (Arachis hypogaea, L.) did not mention precautions used to discard these problematic inadvertent selfs from popu-lations under study. In fact, inadvertent selfed flowers may be one of the causes of the misleading conclusions reported on the inheritance of fresh seed dormancy among Spanish-type varieties.

Beside the inadvertent selfs, various non-genetic factors such as environmental factors that have been extensively studied by Toole et al. (1964) and recently reviewed by Finch-Savage and Metzger (2006) could obscure the phenotyping work. However, the average to high heritabilities observed in this and other studies (Khalfaoui, 1991; Ndoye, 2001) indicated that environ-mental factors can be overcome. Conclusion This study has given more evidence that fresh seed dormancy in Spanish x Spanish crosses is controlled by single dominant gene. Therefore, fresh seed dormancy in Spanish varieties is qualitative in nature. Pedigree selection from an F2 population could be suggested to be an effective strategy to obtain peanut lines with earliness and fresh seed dormancy. The variety 73-30 could be used as donor parent in breeding programs.

This work has outlined the importance of microsatellite markers for identifying true F1 hybrids in cross progenies in self-pollinated crops. Since then, many SSR markers are now published in peanut. Future work will be the identification of SSR markers linked to the gene con-trolling fresh seed dormancy in Spanish-type peanut by using a bulk segregation analysis approach.

ACKNOWLEDGEMENTS The authors thank Dr M. D. Burow (Texas A&M Univer-sity) for helpful reviews and comments. This research was supported by the Collaborative Research Support Program (CRSP) and the Generation Challenge Program (GCP). REFERENCES Asibuo JY, Akromah R, Safo-Kantanka O, Adu-Dupaah H, Seth KO,

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Chapitre IV : Recherche de marqueurs microsatellites liés au gène contrôlant la dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish

86

CHAPITRE IV : RECHERCHE DE MARQUEURS

MICROSATELLITES LIES AU GENE CONTROLANT

LA DORMANCE DES GRAINES FRAICHES CHEZ DES

VARIETES D’ARACHIDE DE TYPE SPANISH


87

IV.1. Introduction

L’arachide cultivée (Arachis hypogaea L.) est une espèce allotétraploïde (2n = 4x =

40) comportant un génome A et un génome B (Krapovickas et Gregory, 1994). Burow et al.

(2001) ont estimé la taille totale du génome de l’arachide cultivée à 2200 cM. Foncéka et al.

(2009) ont estimé à 1843 cM la longueur totale du génome de l’arachide. Ces estimations

montrent l’immensité du génome de cette espèce. D’après Krapovickas et Gregory (1994), le

génome de l’arachide comporte deux sous-génomes (AA et BB).

Le faible polymorphisme moléculaire observé chez l’arachide cultivée est la première

contrainte pour la cartographie génétique chez cette légumineuse malgré une diversité

phénotypique très large. Par ailleurs, la cartographie génétique chez les espèces polyploïdes

est moins bien étudiée que celle chez des espèces diploïdes malgré l’importance du nombre

(80%) des espèces polyploïdes dans le règne végétal. Par ailleurs, parmi ces espèces

polyploïdes, les cultures à haute valeur ajoutée comme le blé, la patate, le soja, le coton, la

canne à sucre etc., sont majoritairement représentées (Hilu, 1993; Masterson, 1994). Ce retard

dans la connaissance du polymorphisme moléculaire des espèces polyploïdes est lié à

l’immensité de leur génome mais surtout à la complexité des profils électrophorétiques qui

peuvent être obtenus sur un point locus donné du fait du niveau de ploïdie. Au sein des

polyploïdes, cette difficulté technique est particulièrement complexe chez les espèces

autopolyploïdies du fait que des appariements entre chromosomes de différents génomes. Par

contre, chez les espèces allopolyploïdes comme l’arachide, les appariements se font

uniquement entre chromosomes appartenant au même génome. En effet, quel que soit le type

de marqueur moléculaire utilisé, les profiles électrophorétiques sont moins complexes chez

ces dernières puisque les appariements de chromosomes se font uniquement au sein d’un

même génome et non entre génomes différents (sous-génomes).

La seconde contrainte technique à lever pour l’identification et la cartographie de marqueurs

liés aux caractères d’intérêt chez les espèces polyploïdes comme l’arachide est d’arriver à

identifier sur lequel des sous-génomes se cartographie chaque marqueur polymorphe entre les

deux parents du croisement. Autrement dit, il faut disposer d’une carte génétique saturée sur

chacun des sous-génomes AA et BB.


88

IV.2. Matériel et méthodes

IV.2.1. Matériel végétal

La population F2 issue du croisement contrôlée par les marqueurs microsatellites a été utilisée.

Rappelons à ce titre que cette population phénotypée au laboratoire (conditions contrôlées) a

été constituée de soixante seize (76) individus F2. L’extraction d’ADN a été effectuée au

CERAAS. La méthodologie de l’extraction d’ADN utilisée est celle de Risterucci et al. (2000)

décrite dans le chapitre précédent (Chapitre III).

IV.2.2. Analyse des microsatellites

Cette partie et celle qui suit ont été entièrement réalisées au Centre de Coopération

International en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD, Montpellier- France).

Un pré-criblage de 558 marqueurs microsatellites de l’arachide, et particulièrement

polymorphes chez l’arachide et les espèces sauvages apparentées, tirés des publications

scientifiques (Hopkins, 1999; Palmieri, 2002; He et al. 2003; Ferguson et al. 2004;

Moretzsohn et al. 2004, 2005; Gimenes et al. 2007; Cuc et al. 2008) ou de travaux non publiés

de Bertioli (Embrapa, Brésil) a été effectué. Ce test de pré-criblage ciblé a permis d’optimiser

les chances de détecter du polymorphisme moléculaire entre les parents Fleur 11 et 73-30. Ces

marqueurs sont pour la plupart longues de séquence (Annexe 1) ce qui offre plus de chance de

relever du polymorphisme moléculaire entre variétés cultivées. Cela est d’autant plus

important que les parents utilisés dans ce croisement (Fleur 11 x 73-30) sont tous des variétés

proches génétiquement puisqu’ appartenant au même type botanique, le type Spanish. Ce

choix se justifie par le fait que Moretzshon et al. (2005) ont montré chez l’arachide que le

pourcentage de polymorphisme moléculaire avec les microsatellites passe de 10% à 70%,

lorsque le nombre de motifs répétitifs passe de 10 à 25 motifs répétitifs. Ces marqueurs de

motifs longs (comportant 13 à 20 unités répétitives) sont très polymorphes chez l’arachide.

Ces microsatellites sont des marqueurs qui ont un contenu d’information du polymorphisme

ou Polymorphism Information Content (PIC élevé c’est-à-dire un PIC > 0,5). L’analyse des

microsatellites a été détaillée dans le chapitre précédent (Chapitre III), et a été effectuée au

séquenceur automatique de type LI-COR (USA). Pour gagner du temps, les analyses des

microsatellites ont été multiplexées lors de la PCR et de la révélation par électrophorèse

(révélation de produits PCR des microsatellites par fluorescence grâce aux colorants IRD 700

et en IRD 800) sur séquenceur automatique gel.


89

Pour identifier le génome sur lequel se cartographie chaque marqueur testé, le pré-

criblage des différents marqueurs a été effectué en incluant aussi les deux parents sauvages

supposées être à l’origine de l’arachide cultivée, par fusion cellulaire suivie d’un

dédoublement chromosomique de chaque génome. Il s’agit de l’espèce Arachis ipaënsis pour

le sous-génome AA et Arachis duranensis porteur du sous-génome BB.

IV.2.3. Constitution des bulks et analyse de mélanges en ségrégation

A la lumière de nos résultats sur l’estimation du nombre de gènes en cause, la

recherche et la cartographie des microsatellites liés au gène de la dormance a été effectuée à

partir d’une analyse de mélanges en ségrégation dénommée en anglais « Bulk Segregation

Analysis (BSA) ». Les deux bulks (pools) d’ADN (dormant et non dormant) ont été

constitués chacun de cinq individus F2 en mélangeant en quantité égale leur ADN dilué. Ces

deux bulks ont été testés à côté de 10 individus dormants et de 10 individus non dormants

échantillonnés parmi les individus à phénotype extrême. Ces deux groupes constitués chaque

par 10 individus sont aussi désignés sous le même nom de bulks. Dans la suite du document,

le terme bulk indiquera ces deux groupes de phénotypes différents et extrêmes sauf sur

indication contraire. Le bulk « dormant » est constitué de 10 individus dont le phénotype a

varié entre 16 et 35 jours. A l’inverse, dans le bulk « non-dormant » le phénotype a varié entre

2 à 3 jours. La liste des individus F2 est donnée en Annexe 2. De même, la liste des individus

de chaque bulk est donnée dans cette annexe (Annexe 2). Le décompte des individus

recombinants a été fait comme suit :

• dans les individus du bulk « dormant », tout individu homozygote avec l’allèle de

Fleur 11 a été décompté doublement parce que cet évènement n’est possible que si et

seulement si l’individu en question est issu de deux gamètes F1 recombinants le gène

et le marqueur.

• de même, tout individu dans le bulk « non-dormant », homozygote avec l’allèle du

parent 73-30 a été décompté doublement pour la même raison.

• par contre, dans ce dernier bulk, tout individu hétérozygote a été décompté une seule

fois car supposé être issu d’une union entre 2 gamètes F1 dont l’un présente une

recombinaison marqueur/gène et l’autre parental.

Tout individu dans le bulk «dormant», homozygote pour l’allèle de 73-30 au locus marqueur a

été décompté comme un individu non recombinant (parental). De même, dans le bulk « non-

dormant », tout individu homozygote pour l’allèle Fleur 11 au locus marqueur est un individu

non recombinant.


90

Chaque marqueur microsatellite testé a été ainsi soumis à un test d’indépendance de

ségrégation c’est-à-dire à un test de liaison en calculant le taux de recombinaison dans

l’échantillon des 20 individus (10 dormants et 10 non-dormants). L’hypothèse nulle (H0) de

travail a été qu’il y a indépendance entre loci si le taux de recombinaison R est égal à 50 %.

Autrement dit dès que R atteint 50% alors le marqueur est déclaré non lié au gène recherché.

Plus un locus marqueur est génétiquement proche du gène recherché moins il va recombiner

avec ce dernier. Le taux de recombinaison entre deux marqueurs donnés correspond

approximativement à la distance génétique (exprimée en cM) lorsque les marqueurs sont

assez proches pour que les événements de double crossing-overs soient négligeables. Par

contre, le taux de recombinaison sous-estime la distance génétique lorsque le taux de

recombinaison commence à être grand (> 10 cM) à cause des doubles crossing-overs qui

donnent lieu à des génotypes parentaux. Par ailleurs, les erreurs de lecture de gel dans la

population génotypée surtout lorsque le nombre d’individus analysés est limité (analyse de

ségrégants en mélange) peut également constituer une source de biais stochastique dans

l’estimation du taux de recombinaison (Kraft, 1999). C’est pour cette raison, il est de

précaution de déclarer indépendant deux locus lorsque le taux de recombinaison R est

supérieur à 30%. R(%) = Nombre d’individus recombinés*100 /Effectif de l’échantillon analysé

De plus, pour se prémunir de tout bruit de phénotypage ou toute erreur de typage des

individus qui serait à même d’induire un biais significatif avec des effectifs de 10 individus

par bulk, l’analyse a été reconduite sur un effectif plus élevé comportant 37 individus

dormants et 23 individus non dormants pris à partir de la même descendance F2. Cette analyse

complémentaire a été faite avec 40 marqueurs microsatellites choisis parmi les 96 marqueurs

polymorphes entre les parents selon deux critères:

• la position du marqueur sur le génome afin d’avoir la meilleure répartition possible sur

les 21 groupes de liaisons que compte la carte de Foncéka et al. (2009)

• la facilité à lire le profil obtenu au séquenceur afin d’éviter les marqueurs locus pour

lesquels les allèles des parents sont trop rapprochés (séparés pratiquement d’une seule

unité du motif du microsatellite) ce qui rend difficile la lecture du profil chez les

individus hétérozygotes à ce locus.

Pour voir, les parties couvertes par l’analyse des microsatellites, les différents loci

cartographiés (en rouge) dans notre étude été projetés sur la carte de Foncéka et al. (2009)

construite à partir du croisement Fleur 11 x (Arachis ipaënsis x Arachis duranensis)x4. Le

choix porté sur cette carte génétique se justifie d’abord par le fait que nous avons en commun


91

le parent Fleur 11. Ensuite, cette carte génétique est aujourd’hui l’une des plus saturées cartes

développées sur l’arachide à partir de marqueurs microsatellites chez l’arachide. Ainsi la qusi-

totalité des marqueurs SSRs polymorphes entre Fleur 11 et 73-30 que nous avons testée, est

cartographiée sur cette carte. Enfin, cette carte a été construite de façon a identifier

l’appartenance aux sous-génomes AA ou BB des marqueurs microsatellites, ce qui jusqu’ici

n’était pas fait dans les autres cartes génétiques tétraploïdes construites chez l’arachide. Ce

qui apporte une précision complémentaire en matière de cartographie de gènes chez une

espèce polyploïde.

IV.3. Résultats et discussion

IV.3.1. Polymorphisme parental

Parmi les 558 marqueurs analysés chez les parents du croisement Fleur x 73-30, seuls

97 marqueurs microsatellites ont été polymorphes. La liste des noms de ces 97 microsatellites

polymorphes ainsi que leurs motifs répétitifs sont consignées en Annexe 1. Cela correspond à

un pourcentage de polymorphisme parental de 17%. Ce pourcentage, bien que relativement

plus élevé que ceux rapportés dans plusieurs travaux antérieurs (Moretzsohn et al. 2004,

2005 ; Gimenes et al. 2007 ; Cuc et al. 2008 ; Varshney et al. (2008), confirme le faible

polymorphisme moléculaire chez l’arachide. Ces derniers auteurs ont construit une carte

génétique de microsatellites à partir d’un croisement arachide cultivée x arachide cultivée, et

ont relevé un pourcentage polymorphisme de 12,6% en criblant 1147 microsatellites. Si le

pourcentage de polymorphisme parental est relativement plus élevé avec notre étude

comparativement à ceux rapportés dans les études antérieures, c’est probablement lié au

criblage ciblé de marqueurs à séquences longues (> à 50 bp) dans notre étude.

IV.3.2. Analyse de la ségrégation des marqueurs

La figure 13 donne le profil électrophorétique obtenu au séquenceur avec l’analyse (en

multiplex) des marqueurs Ah3TC39C01 et Ai119C12 sur les 20 individus (10 premiers sont

des individus dormants et les autres des individus non-dormants) et les deux bulks d’ADN.

Par exemple, avec le marqueur Ah3TC39C01, le taux de recombinaison calculé est de 63%

(>50%) ce qui indique il n’y a pas de liaison génétique entre ce marqueur et le gène de la

dormance dans ce croisement.

La figure 14 donne le profil électrophorétique obtenu au séquenceur avec l’analyse des

marqueurs Ah3TC39C01 et Seq3B04 sur les soixante (60) individus de la population.


92

P- = Fleur 11 (en rouge bordeau), P+ = 73-30 (en bleu), B+= bulk dormant; B- = bulk non dormant) et avec 10 individus dormants et 10 individus non dormants sur gel de polyacrylamide au séquenceur LICOR, ici avec les marqueurs Ah3TC39C01 et Ai119G12 Figure 13. Analyse de la ségrégation des microsatellites (en multiplex) sur les deux bulks, profils obtenus avec les marqueurs Ah3TC39C01 et Ai119C12

La flèche en rouge indique le parent Fleur 11 (non dormant) et la flèche en rouge le parent 73-30 (dormant) A partir de la gauche, 37 individus dormants et 23 non dormants sur gel de polyacrylamide au séquenceur LICOR, ici avec le marqueur Ah3TC39C01. Figure 14. Analyse de la ségrégation des microsatellites sur 60 individus F2 de la population contrôlée aux microsatellites, profils obtenus avec les marqueurs Seq9BO4 et Ah3TC39C01

B+ Dormants Non dorm

B‐

P‐

P+


93

Parmi les 97 marqueurs polymorphes, 87 ont été positionnés sur la carte de Foncéka et

al. (2009). Ces 87 marqueurs cartographient 117 loci sur l’ensemble du génome du fait que

certains marqueurs cartographient deux loci dont l’un situé sur le génome AA et l’autre sur le

génome BB (par exemple le marqueur Ah3TC20E08). Les dix (10) marqueurs restants sont

pour la majorité des marqueurs monomorphes entre les parents du croisement Fleur 11 x [(A.

ipaënsis x A. duranensis)]x4 qui a servi à la construction de la carte de Foncéka et al. (2009) et

non pas étaient cartographiés. Les 117 loci polymorphes entre Fleur 11 et 73-30 sont indiqués

en rouge sur la carte (Figure 15).

L’analyse de la liaison marqueur/gène n’a pas permis de trouver des marqueurs liés au

gène. En effet, malgré le pourcentage de polymorphisme assez élevé observé, des parties du

génome restent non couvertes sur des distances génétiques largement supérieures à 30 cM

(Figure 15). Ces zones se situent sur les groupes de liaison a01, a05, a09, b01 et b10.

D’ailleurs, cette liste serait élargie à d’autres parties du génome si n’on considère qu’un

marqueur ne peut baliser qu’un rayon maximum de 20 cM autour de lui. Par ailleurs, même si

la carte de Foncéka et al. (2009) est assez bien saturée globalement, il y existe des groupes de

liaisons comme les groupe de liaison b08 et b11 qui vraisemblablement sont loin de la

saturation. Ce qui fait dans ces groupes de liaison précisément, la détection de la liaison

marqueur/gène est compromise à cause de cette sous-saturation.

Bien que les marqueurs soient naturellement répartis de façon aléatoire sur l’ensemble du

génome, certaines régions en comportent plus (marqueurs groupés en "cluster"), d’autres au

contrairement en possèdent moins. Sur les 117 locus cartographiés, 72 loci cartographiés sur

le sous-génome AA et 45 loci sur le sous-génome BB. Ce niveau de polymorphisme plus

élevé avec le sous-génome AA comparativement au sous-génome BB a été mis en évidence

avec le croisement entre l’amphidiploïde (A. ipaënsis x A. duranensis)x4 et la variété Fleur 11

(Foncéka et al. 2009). Ainsi ce résultat confirme le faible polymorphisme de l’arachide

particulièrement au niveau du sous-génome BB.

Ainsi un criblage supplémentaire de marqueurs permettra probablement de saturer ces

parties du génome et d’identifier des marqueurs microsatellites liés au caractère dormance des

graines fraîches chez l’arachide. Cette étude a été la première tentative d’identifier et de

cartographier des marqueurs moléculaires liés au gène de la dormance chez l’arachide. Cette

étude bien que n’ayant pas pu identifier des marqueurs liés à gène de la dormance chez

l’arachide, elle a toutefois permis de constater un niveau de polymorphisme suffisamment

élevé entre deux variétés Spanish pour permettre un travail de cartographie de gènes d’intérêt

contrairement à l’idée d’un polymorphisme trop faible pour envisager toute possibilité


94

actuelle chez l’arachide d’entreprendre de la cartographie génétique sur un croisement entre

variétés du même groupe botanique. D’ailleurs, les descendances issues de croisements entre

parents éloignés génétiquement (croisements intersubspécifiques) donnent lieu souvent à des

liaisons génétiques entre gène d’intérêt et d’autres gènes à effets négatifs donc indésirables

souhaitables (Wadia et al. 1987). En effet, les liaisons génétiques (co-localisations) entre

gènes codant pour des caractères différents font que des gènes à effets négatifs sur

l’expression du caractère d’intérêt ou sur d’autres caractères notamment agronomiques

peuvent être co-transmis avec le gène d’intérêt. La suppression de telles liaisons génétiques

nécessite le plus souvent plusieurs cycles de rétrocroisements avec le parent récurrent.


95

a01 a02 a03 a040 TC2E05_A

5.7 gi-0919_A

12.9 IPAHM287_A

23.9 IPAHM177_A

34.9 Ah3TC23F04_A2

44.8 Seq16G08_A

56.4 RN9A05_A56.4 RN23A07_A

66.8 Ah-126_A68.5 Ah-21_A70.2 TC4H02_A71.3 Seq3E05_A71.3 Ah3TC36D11_A71.3 Seq19C03_A71.3 TC2D06_A72.4 seq13A10_A74.7 Seq4B09_A77.7 TC1D01_A79.2 Ah-193_A82.6 Ah-594_A386.6 TC7H09_A90.6 Ad92L24_A97.5 Ah3TC31C09_A99.8 RN11A07_A100. Ai119C17_A105. Ah3TC38C01_A

111. Seq4H11_A2111. IPAHM531_A117 Seq18A08_A2118. Seq4D04_A118. Ah3TC20E08 A118. Seq4A06_A122. Ah3TC27H12 A

135. TC3H02 A

148. Ah3TC16A10_A149. Seq8E12_A

156. RN17F12_A

0 seq11H01_A

5.7 PM230_A

18.5 Ah3TC28B01_A

24.2 PM032_A

28.8 TC4F12_A31.1 RM13A09_A32.2 Seq18B11_A32.2 Seq11G03 A32.2 Seq11G07_A33.3 Seq1B09_A35.6 IPAHM406_A38.1 Seq12E03_A

49.6 RI1F06_A

61.1 RM2H10_A

69.2 Ag39_A71.5 TC1E01 A76.1 RI2A06_A76.1 Seq2F05 A

0 Ah3TC31H02 A

13.8 TC4G02 A

19.1 gi-0560_A21.7 Seq19H03_A1

33.3 Ah-30_A

41.3 Ah3TC41C11_A

45.9 Seq2C11_A47 PM003_A

53.9 PM201_A56.2 TC0A01 A57.9 PM015_A159.6 PM042_A2

74.8 gi-4925_A

81.7 PM238_A82.8 TC2C07_A

93.2 Ah-636_A95.5 Ah3TC39C01 A

100.1 Seq18G09_A2

105.8 Ag140_A106.9 TC1E06_A106.9 TC11E04_A

108 Ah3TC22G05_A109.1 Seq13E06A_A118.3 Seq3D09_A

137.4 Seq4F10 A140.8 TC3E02_A

142 Ah3TC40A02 A

0 RN12E01_A1.1 Ah3TC13G05_A

10.3 Ah3TC39A10_A

13.7 Ah-569_A14.9 Ah-408_A

23.75 Ah-594_A1

32.6 IPAHM108_A34.9 PM120_A

56.6 TC9E08_A258 Ah3TC39B04_A

60.9 Seq18A08_A362.3 gi-0832_A62.3 Seq3B10_A63.4 RN35B05_A68.6 RM17H09_A

82 seq12E10_A

86.6 TC9E08_A1

103.1 Ah-229_A

112.9 TC11B04_A1

122.7 TC7G10 A

Figure 15. Répartition des différents loci marqueurs polymorphes (en rouge) entre les parents du croisement (Fleur 11 x 73-30) et cartographiés sur la carte de Foncéka et al. (2009)


96

a05 a06 a07 a08 a090 gi-0620_A

4.6 Seq10H01A_A4.6 gi-0385_A

44.2 Ah-614_A

54.6 Ah-742_A

60.3 Ah3TC19D09_A

64.9 Ah3TC28A12 A66 Ah3TC22H12_A66 Seq11E11_A66 TC6E01 A66 PM045_A66 seq19E09_A66 Seq10D04_A

67.1 TC3G05_A75.1 seq8C10_A77.5 Ah6-125_A

0 AC2H11_A2.3 TC3H07 A

8 IPAHM659_A10.3 Seq4H06_A12.6 RN31A05_A14.9 RN21H01_A14.9 Seq15D03 A17.2 PM035 A21.8 Seq18G09_A1

33.4 Ah3TC28E0

41.5 Ah-20_A43.8 Seq18A08_A146.1 TC9C06_A

50.7 TC11A04_A50.7 TC1A02_A57.6 Ah3TC38A07_A

69.8 Ah3TC19B03_A

82 Seq18G01_A83.1 gi-0936_A84.2 gi-0623_A

97 Seq19H03_A2

0 RN13D04_A

3.7 Seq2E06_A

12.6 Seq5D05_A14.9 Ah3TC23E04_A18.3 Ah3TC22D09_A21.7 PM042_A1

42.1 Seq14D01_A

46.7 Ah-594 A249 IPAHM290 A49 IPAHM123_A

50.1 TC9H08_A51.2 seq3A01_A56.9 Seq3B08_A59.2 Ad90K4_A

65 seq16G04_A65 PM204 A

70.8 TC4G10_A

96.8 Ah3TC38F01

106 Seq2A06_A

111. RM2D04_A111. TC6G09_A

0 TC9B08_A

4.7 RM7E04_A7 TC3B05_A

28.8 TC7A02_A32.2 TC3B04_A

39.1 seq3A08_A41.4 seq2G03_A41.4 RN22A12_A

55.4 Ah3TC23H09_A

70.6 RM5G08_A

76.3 RN18H05_A79.15 TC6H03_A

82 Ah3TC21D06_1_A

86.6 TC9F10_A86.6 Ad90F2_A92.3 Ah3TC22C01_A

106.3 TC1E05_A

112.1 IPAHM229_A113.3 IPAHM540_A

0 IPAHM468_A0 PM015_A2

9.5 TC9B07_A11.8 seq17E03_A13.2 Ad90P7 A17.5 TC1D02_A17.5

Ah3TC25B04_A

29.1 seq9B04_A

45.6 seq4G02_A49 TC5D06_A

60.7 RN25B01_A

74.8 PM170_A75.9 RN35H04_A

96.1 gi-1107_A

99.7 seq8D09_A

Seq16G08_Ba10 b01 b02 b03 b04

0 AC3F07_A

15.2 PM145_A

23.9 Seq9F01_A25.6 AC2B03_A25.6 Ah3TC23F04_A125.6 AC3C02_A25.6 Ah3TC23D04_B25.6 seq12F07_A25.6 AC1G11_A25.6 seq11D04_A27.9 Seq14F05_A35.9 Seq4H11_A142.8 TC1G04_A

52.1 TC11B04_A2

83.3 Ah3TC38G04_A

0

18.2

36.4 IPAHM037_B

51.8 seq18B08_B

59.9 Ah3TC20D05_B59.9 seq17E01_B59.9 Ap152_B65.6 TC7D03_B67.9 TC1A08_B

69 Ah-3_B69 Ah3TC16A10_B

70.1 Seq13A07_B71.2 TC7H02_B72.3 Ah-126_B75.7 Seq4A06_B

78 Seq19H03_B288.7 seq9E08_B1

116 1 IPAHM171c B

0 Seq14G03_B

5.8 Seq2F05_B6.9 RI2A06_B6.9 gi-0342_B

16.1 TC1E01 B16.1 Ag39_B

30.3 Ah3TC13E05_B

45.2 seq14D11_B248 RI1F06_B

59.6 Seq2G04_B

67.7 Seq1B09_B67.7 AC2C05_B

75.7 PM032_B

82.9 TC1B02_B

0 AC1G11_B1.1 PM238_B

10.65 Ah3TC40C03_B1

20.2 PM201_B21.3 Seq19H03_B121.3 seq9E08_B222.4 RM14H12_B

27 PM003_B

48.8 seq14C11_B

61.7 IPAHM093_B

73.3 TC7E04_B75.6 Seq19D09_B

0TC11H06_B

0 Seq4H11_B

23.2 gi-0832_B25.8 PM035_B

35 Ah3TC12A01_

67.7 IPAHM108_B

84.05 seq15C12

100.4 Ah3TC13G05_B

Ah3TC20E08_B

Figure 14 (suite 1)


97

b05 b06 b07 b08 b09 b10 b110 Ah3TC19D09_B

18.1 PM050_B21.5 IPAHM354_B

39.4 seq19D06_B

45.2 Ah3TC22F10_B47.5 AC2C02_B149.8 TC6E01_B

57.9 Ah3TC19E01_B

0 IPAHM165_B0 AC2C02_B2

21.7 TC3H07_B

34.5 PM137_B

42.6 Ah3TC24B05_B44.9 Ah3TC19F05_B48.3 seq19A05_B

56.4 seq3C02_B1

69.1 PM210_B

77.4TC1A02_B

77.4 TC11A04_B

85.65 IPAHM524_B1

93.9 TC4D09_B

104.4 Seq18G01_B

0 Seq2E06_B

8.2 Ah3TC41A11_B8.2 Ah3TC41A11_1_B

16.6 Seq5D05_B

35.3 Seq15C10_B

54.4 TC4G10_B

65.9 seq14D11_B1

73 seq3C02_B2

82.2 TC3B05_B

86.8 RM7E04_B

92.5 TC7A02_B92.5 TC3B04_B

111.7 Ah3TC40C03_B2

0 Ah3TC31E08_B2.3 Ah3TC38C01_B

9.2 IPAHM123_B10.3 Ai123M2_B10.3 Ah3TC40E08_B10.3 Ah3TC24E01_B11.4 IPAHM229_B12.5 IPAHM177_B14.8 IPAHM540_B17.1 AC2C12_B19.4 TC6H03_B21.7 Ah3TC20B05_B22.8 Ad90F2_B29.8 IPAHM406_B

0 Ah3TC25G11_B1.1 seq4G02_B

27.1 Seq7G02_B

36.3 Lec-1_B38.6 gi-1107_B

44.3 Seq14H06_B

57.1 TC1D02_B

61.7 Ai119C17_B

0 Ah3TC38F01_B0 Ah3TC22G05_B

34 Seq7H06_B

52.7 AC2B03_B

59.9 Ah3TC31C09_B

64 IPAHM689_B64 Ah3TC23F04_B

66.7 TC3E05_B

78.3 AC3F07_B

82.9 Ah3TC23H10_B

0 TC3E02_B

8.2 TC2A02_B10.9 Ah3TC29H08_B

15.1 Ah3TC23E04_B

Figure 15 (suite 2)

Conclusions générales et perspectives

98

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES


99

Le contexte de ce travail est une forte demande de variétés à cycle court et dormantes

dans toute la zone semi-aride tropicale en général et en Afrique Sub-saharienne en particulier

où des pluies dites tardives peuvent occasionner d’importantes pertes de rendement chez les

variétés d’arachide non dormantes. Malheureusement, le constat fait aujourd’hui dans

plusieurs pays où l’arachide est cultivée, c’est une faible disponibilité de variétés hâtives qui

peuvent rester quelques semaines sans germination in-situ lorsque des pluies sont enregistrées

après la maturité physiologique des gousses. L’indisponibilité de ces variétés à cycle court et

à graines fraîches dormantes est en mettre en relation avec la connaissance limitée du contrôle

génétique du caractère. C’est pourquoi ce travail a été accompli pour une meilleure

connaissance de la génétique de la dormance des graines fraîches d’arachide à cycle court

(Spanish) afin de faire des recommandations sur le phénotypage, l’approche de sélection

efficace et l’identification et la cartographie des marqueurs microsatellites liés au caractère.

Dans le premier chapitre, nos résultats ont montré que le phénotypage de la dormance

des graines fraîches d’arachide peut être réalisé efficacement aussi bien au champ qu’au

laboratoire. Une bonne similitude a été notée entre les résultats obtenus avec ces deux

méthodes de phénotypage de la dormance des graines fraîches d’arachide. Toutefois, la

méthode au laboratoire présente l’avantage d’être moins fastidieuse. De plus, elle a l’avantage

de limiter les effets environnementaux sur l’expression du caractère. Par ailleurs, variations

interannuelles observées sur la durée de la dormance indiquent un effet de la variation

environnementale sur l’expression du caractère. L’évaluation de la dormance de lignées

avancées a permis de constater que les lignées L2, L4 et L24 issues du croisement entre 55-

437 et 73-30 sélectionnées pour la dormance des graines fraîches montrent une bonne

dormance. Leurs intensité et durée de la dormance ont été similaires à celles du témoin de

dormance, la variété 73-30. De même, la lignée L27 issue du croisement avec Fleur 11 a une

assez bonne dormance, de plus elle possède de grosses graines du même calibre que celles du

parent femelle Fleur 11. Nos résultats ont permis également de confirmer la bonne dormance

de la variété 73-30 qui peut être valablement utilisée comme donneur de la dormance des

graines fraîches dans les programmes de création de variétés hâtives et dormantes à partir de

croisements entre variétés Spanish non-dormant x Spanish dormant.

Dans le second chapitre, l’étude du mode d’action génétique à partir des modèles de

Mather et Jinks (1982) a montré que la dormance des graines fraîches chez les Spanish est

génétiquement simple. Des effets d’additivité et de dominance contrôlent l’expression du

caractère dans les trois croisements étudiés. Cependant, compte tenu des facteurs non

contrôlés (environnementaux, individus issus de fleurs autofécondées), une déviation


100

significative par rapport au modèle additivité-dominance a été observée pour le croisement

avec Fleur 11. L’héritabilité au sens large (H2) du caractère est assez élevée et confirme les

travaux antérieurs. Par ailleurs, l’héritabilité au sens strict (h2) se situe également dans la

gamme des héritabilités élevées. L’analyse qualitative a permis de valider l’estimation par

l’approche quantitative du nombre de gènes en jeu dans le caractère étudié. L’utilisation des

marqueurs microsatellites a permis de préciser que les déviations par rapport aux proportions

attendues sur certaines populations non contrôlées sont probablement dues à l’effet des

facteurs environnementaux mais aussi à la présence des graines issues de fleurs autofécondées

lors des croisements. De ce fait, notre étude suggère un contrôle systématique, par quelques

marqueurs microsatellites, des hybrides F1. L’estimation du nombre de gènes qui contrôle la

dormance des graines fraîches d’arachide de type Spanish a montré qu’un seul gène dominant

est responsable du caractère. Compte tenu de ces résultats, la sélection bulk ou la méthode

pédigrée peut efficacement être utilisée pour sélectionner des lignées dormantes et précoces à

partir des premières générations de croisement Spanish non x Spanish dormant.

Dans le troisième chapitre de ce travail, nous avons utilisé l’analyse de mélanges en

ségrégation (bulk segregation analysis) pour identifier et cartographier des marqueurs

microsatellites liés au gène de la dormance dans une population F2 issue du croisement entre

Fleur 11 et 73-30. Bien que le pourcentage de marqueurs polymorphes (17%) soit plus élevé

que ceux rapportés dans d’autres études antérieures sur des croisements arachide cultivée x

arachide cultivée, des parties du génome situées sur les groupes de liaison a01, a05, a09, b01

et b10 n’ont pas été couvertes par des marqueurs polymorphes. Ce qui a fait certainement que

cette étude n’a pas permis de trouver de marqueurs microsatellites liés au caractère dormance

des graines fraîches d’arachide.

En perspectives, des tests complémentaires de germination au laboratoire et au champ

seront réalisés sur les lignées prometteuses L2, L4, L24 et L27 sur deux années encore afin de

les proposer à l’homologation. Ces tests complémentaires prendront en compte l’évaluation

de paramètres agronomiques notamment le rendement et ses composantes. Pour ce faire, des

essais pour une évaluation agronomique de ces lignées pourront être implantés sur deux sites

dont l’un dans le centre et l’autre dans le sud du Bassin Arachidier. A ce titre, les travaux

préliminaires réalisés par le laboratoire de sélection sur ces lignées montrent un niveau de

production en gousses et en fanes similaires à celui des parents. Cette homologation permettra

donc certainement aux paysans sénégalais de disposer de variétés à cycle court et à graines

fraîches dormantes. Ce qui réduirait significativement les pertes de rendements liées aux


101

germinations in-situ provoquées par les pluies qui surviennent après la maturité physiologique

des graines.

La recherche de marqueurs microsatellites liés au caractère étudié initiée avec cette

étude pourra être poursuivie en criblant d’autres marqueurs microsatellites ou des marqueurs

de type AFLPs ou de type RFLPs pour saturer les parties du génome non encore bien

couvertes. Pour optimiser les chances d’identifier des marqueurs liés au caractère, il sera

particulièrement intéressant de construire une carte génétique à partir du croisement Fleur 11

x 73-30 pour d’une part une meilleure estimation des distances génétiques entre différents loci

d’un même groupe de liaisons et d’autre part une cartographie de tous marqueurs moléculaires

qui seront polymorphes entre les parents du croisement. En effet, le taux de recombinaison

(distance génétique) varie en fonction du nombre d’individus analysés mais surtout avec la

parenté génétique entre le couple de parents utilisés. Par conséquent, les distances génétiques

entre marqueurs peuvent augmenter ou diminuer plus ou moins d’un croisement à un autre.

Burnham et al. (2003) ont montré que la fréquence de recombinaisons varie selon

l’éloignement entre les parents du croisement. La population de cartographie pourrait être une

population de lignées recombinantes (RILs) ce qui mettra d’avoir une reproductibilité des

résultats. Si parmi les marqueurs qui seraient liés au gène, un marqueur se situerait très proche

du gène, il pourrait être directement utilisé dans un programme de sélection assistée par

marqueurs pour l’identification de lignées hâtives et dormantes. Ainsi l’utilisation de

marqueurs moléculaires liés au caractère rendra plus efficace la sélection et permettra de

gagner du temps. Par ailleurs, une fois des marqueurs moléculaire liés au caractère identifiés,

le travail pourra être poursuivi dans le sens de réaliser le clonage positionnel du gène.

Références bibliographiques

102

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES


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Annexes

ANNEXES

Annexes

ANNEXE 1: Nom, séquence et référence des 97 marqueurs SSRs polymorphes entre Fleur 11 et 73-30 testés pour la cartographie du gène de la dormance des graines fraîches Nom du locus marqueur

Séquence Référence

AC2C05 (TG)17 Moretzsohn et al. 2005 Ad90F2 (TAT)25 Bertioli Ad90K4 (AT)23 Bertioli Ad90P7 (AT)18 Bertioli Ad92L24 (AT)39 Gimenes et al. 2007 Ah-126 (GA)8…(GA)9 Moretzsohn et al. 2004 Ah-193 (AAC)5+(GA)24 Moretzsohn et al. 2004 Ah-3 (GA)15(AG)7(GT)7(GA)7 Gimenes et al. 2007 Ah3TC13E05 (TC)23 Bertioli Ah3TC19D09 (CT)20 Bertioli Ah3TC20E08 (GT)14+(GA)24+(TG)15 Bertioli Ah3TC21D06 (TC)21 Bertioli Ah3TC22C01 (CT)21 Bertioli Ah3TC22D09 (GA)19 Bertioli Ah3TC22H12 (TC)23 Bertioli Ah3TC23E04 (GA)24 Bertioli Ah3TC23H09 (TC)17+(CT)14+(TC)20 Bertioli Ah3TC24B05 (TC)30 Bertioli Ah3TC25B04 (CT)22 Bertioli Ah3TC25G11 (CT)20 Bertioli Ah3TC28A12 (AG)6 Bertioli Ah3TC28E09 (TC)21 Bertioli Ah3TC31H02 (GA)20 Bertioli Ah3TC36D11 (AG)21 Bertioli Ah3TC38A07 (AG)21 Bertioli Ah3TC38F01 (GA)27 Bertioli Ah3TC38G04 (TC)18+(CT)14+(TC)7 Bertioli Ah3TC39A10 (AG)12+(GA)9 Bertioli Ah3TC39C01 (AG)21 Bertioli Ah3TC40A02 (CT)20 Bertioli Ah3TC42A02 (AG)21 Bertioli Ai119C17 (AT)19 Bertioli Ai119G12 (CAT)18+(TTA)14 Bertioli Ai119P2 (AAT)28 Bertioli Ap-152 (CT)15 Palmieri et al. 2002 gi-4925 (ATT)13 Moretzsohn et al. 2005 IPAHM093 (CT)15 Cuc et al. 2008 IPAHM123 (GA)18 Cuc et al. 2008 IPAHM165 (GA)13 Cuc et al. 2008 IPAHM290 (TA)3+(CA)3+CC(CA)5+(TA)8 Cuc et al. 2008 IPAHM352 (GA)9+GG(GA)8 Cuc et al. 2008 IPAHM373 (TTG)6+CT(GTT)8 Cuc et al. 2008 IPAHM524 (GA)20+AA(GA)3 Cuc et al. 2008

Annexes

IPAHM540 (TA)4+(TG)12 Cuc et al. 2008 IPAHM659 (GA)18 Cuc et al. 2008 IPAHM689 (GA)20 Cuc et al. 2008 Lec-1 (AT)18 Hopkins et al. 1999 PM003 (GA)14 He et al. 2003 PM035 (GA)18+(GAA)2 He et al. 2003 PM050 (GA)19 He et al. 2003 PM183 (CT)24 He et al. 2003 PM204 (GA)20 He et al. 2003 RI1F06 (ATA)6+(ATT)4+(GA)6 Moretzsohn et al. 2005 RM2D04 (GA)13 Proite et al. 2007 RM7E04 (GA)12 Proite et al. 2007 Seq11G03 (TTC)28 Ferguson et al. 2004 Seq12E10 (AAT)14 Ferguson et al. 2004 Seq15C10 (AAT)16 Ferguson et al. 2004 Seq15C12 (ATT)28 Ferguson et al. 2004 Seq15D03 (CT)18 Ferguson et al. 2004 Seq17E01 (TAT)31 Ferguson et al. 2004 Seq17E03 (TCT)15 Ferguson et al. 2004 Seq18E07 (TAA) Ferguson et al. 2004 Seq18G01 (TTG)6 Ferguson et al. 2004 Seq19D06 (AAT)19 Ferguson et al. 2004 Seq19D09 (TAT)18 Ferguson et al. 2004 Seq2C11 (TTA)17(TGG)10 Ferguson et al. 2004 Seq2D12 (AAT)16 Ferguson et al. 2004 Seq2E06 (GA)12 Ferguson et al. 2004 Seq2F05 (TTA)17 Ferguson et al. 2004 Seq2G04 (TAA)23 Ferguson et al. 2004 Seq3A08 (AAT)20 Ferguson et al. 2004 Seq3B08 (TTA)21 Ferguson et al. 2004 Seq3D09 (CA)9(CT)19 Ferguson et al. 2004 Seq4F10 (TG)7+(GA)8 Moretzsohn et al. 2005 Seq4G02 (AG)9 Ferguson et al. 2004 Seq4H11 (GA)26 Ferguson et al. 2004 Seq5D05 (GA)32 Ferguson et al. 2004 Seq9B04 (TTG)16 Ferguson et al. 2004 TC0A01 (AG)29 Moretzsohn et al. 2005 TC11A04 (CT)16+(CT)33 Moretzsohn et al. 2005 TC11B04 (TC)20 Moretzsohn et al. 2005 TC11H06 (AG)34 Moretzsohn et al. 2005 TC1A02 (TC)35 Moretzsohn et al. 2005 TC1D02 (TC)30 Moretzsohn et al. 2005 TC1E01 (GA)29 Moretzsohn et al. 2005 TC1E05 (GA)30 Moretzsohn et al. 2005 TC1G04 (TTC)5+(TC)33 Moretzsohn et al. 2005 TC2A02 (TC)32 Moretzsohn et al. 2005 TC2D06 (AG)30 Moretzsohn et al. 2005 TC3E05 (GA)25 Moretzsohn et al. 2005

Annexes

TC3H07 (GA)20+(TTC)4 Moretzsohn et al. 2005 TC4G02 (TC)27 Moretzsohn et al. 2005 TC4H02 (TC)16+(CT)5 Moretzsohn et al. 2005 TC6E01 (GA)22 Moretzsohn et al. 2005 TC9E08 (GA)10 Moretzsohn et al. 2005 TC9F04 (TC)23 Moretzsohn et al. 2005 TC9H08 (AG)21 Moretzsohn et al. 2005

ANNEXE 2: Phénotype des 60 individus de la population F2 issue du croisement (Fleur 11 x

73-30) contrôlé aux marqueurs SSRs

D = dormant ; ND = non-dormant ; les valeurs mises entre parenthèses désignent le nombre de jours avant germination ; les 10 individus indiqués en rouge constituent les dormants (bulk dormant) et les 10 individus les individus non dormants en vert (bulk non-dormant) sur lesquels l’analyse des 97 loci SSRs a été réalisée.

Individu Phénotype (D ou ND) 15-1-5 D (16) 15-1-8 D (21) 13-1-4 D (16) 13-1-11 D (24) 13-1-15 D (35) 16-1-8 D (35) 16-1-7 D (31) 15-1-7 D (16) 15-1-9 D (31) 1-1#-3 D (16) 13-1-1 D (11) 13-1-2 D (15) 13-1-3 D (16) 13-1-6 D (16) 13-1-7 D (16) 13-1-8 D (16) 13-1-9 D (17) 13-1-10 D (17) 13-1-12 D (24) 13-1-13 D (26) 13-1-14 D (31) 16-1-1 D (11) 16-1-2 D (16) 15-3-1 D (16) 16-1-5 D (19) 16-1-6 D (19) 15-1-1 D (16) 15-1-2 D (16) 15-1-3 D (16) 15-1-4 D (16)

Annexes

15-1-9 D (16) 1-1#-3 D (16) 1-1#-4 D (16) 1-2#-7 (D) 16 1-2#-8 (D) 16 1-2#-9 (D) 16 11-1-1 (D) 16 16-2#-1 (ND) 2 16-1#-1 (ND) 2 1-1#-1 (ND) 2 1-2#-2 (ND) 2 1-2#-5 (ND) 2 1-2#-6 ND (2) 16-2#-2 ND (2) 16-2#-4 ND (2) 4-3#-2 ND (3) 12-4#-1 ND (2) 1-2#-1 ND (2) 1-2#-3 ND (2) 1-2#-4 ND (2) 16-1#-3 ND (2) 16-1#-4 ND (2) 16-2#-3 ND (2) 16-2#-6 ND (2) 16-2#-7 ND (2) 4-3#-1 ND (3) 16-2#-10 ND (2) 16-2#-5 ND (2) 16-2#-9 ND (2) 16-2#-8 ND (2)

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THESE E - ceraas.orgceraas.org/IMG/pdf/Issa faye THESE-DEFINITIVE.pdf · Kandioura NOBA, Professeur Titulaire, ... Mohamed Faye mes frères et sœurs et mes amis ... Dr Ndiaga Cissé