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THESE UNIQUE DE DOCTORAT
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE
FELIX HOUPHOUËT-BOIGNY EN SCIENCES DES
PROCEDES CHIMIQUES, ALIMENTAIRES ET
ENVIRONNEMENTAUX
Spécialité :
Chimie Organique et des Substances Naturelles
Présentée par :
KONE Kouwelton Patrick Franck Olivier Ingénieur en Génie Chimique
APPLICATION DES TECHNIQUES DE
CHROMATOGRAPHIE ET DE
SPECTROSCOPIE DANS L’IDENTIFICATION
DES METABOLITES SECONDAIRES DE TROIS
PLANTES ANTIDIABETIQUES ET
ANTIHYPERTENSIVES DE LA PHARMACOPEE
IVOIRIENNE
Soutenue le 10/07/2018 devant le jury composé de :
M. YAO Kouassi Benjamin (Professeur titulaire, INP-HB/ Yamoussoukro) Président
M. BEDI Sahouo Gustave (Professeur titulaire, ENS/ Abidjan) Rapporteur
M. TRAORE Karim Sory (Professeur titulaire, UNA/ Abidjan) Rapporteur
Mme KONE Mawa (Maître de Conférences, UFHB/ Abidjan) Examinatrice
M. SORO Yaya (Maître de Conférences, INP-HB/ Yamoussoukro) Directeur de thèse
A mon fils Ibrahim Abdallah
REMERCIEMENTS
Nous tenons à remercier les institutions et personnes suivantes sans qui cette thèse
n’aurait pas vu le jour :
- L’INP-HB avec à sa tête le Directeur Général M. KOFFI N’guessan pour la création de
l’Ecole Doctorale Polytechnique ;
- L’EDP avec à sa tête le Directeur, Professeur YAO Kouassi Benjamin pour avoir permis
mon inscription en thèse ;
- Le LAPISEN avec à sa tête le Directeur du laboratoire, Professeur YAO Kouassi Benjamin
pour avoir le cadre technologique mis à notre disposition ;
- La Direction des Orientations et des Bourses pour la bourse dont nous avons bénéficier pour
effectuer nos travaux ;
- Le Laboratoire de Chimie Agroalimentaire (LCA) de Toulouse avec sa direction composée
du Professeur Gerard VILAREM et du Professeur Carlos VACA-GARCIA pour leur
accueil au sein de leurs locaux ;
- Le Département de Formation et de Recherche Génie Chimique et Agro-Alimentaire avec à
sa tête le Professeur ADIMA Amissa Augustin et le personnel enseignant pour toute l’aide
scientifique et moral.
- Professeur BROU Casmir pour avoir présider le jury de thèse en remplacement du
Professeur YAO Kouassi Benjamin ;
- Professeur BEDI Gustave, Professeur Titulaire en Chimie Organique Biologique à l’Ecole
Normale Supérieure (ENS), Président de la SOACHIM Côte d’Ivoire, point focal de la
convention de Stockholm sur les polluants organiques et Professeur TRAORE Karim Sory,
Professeur Titulaire en Chimie et Environnement de l’Université Nangui Abrogoua (UNA)
pour avoir instruit cette thèse, ainsi que Professeur MEITE Ladji, Maitre de Conférence à
l’UNA, pour avoir suppléer le Professeur TRAORE ;
- Docteur KONE Mawa, Maitre de Conférences en Chimie Théorique et Analytique à
l’Université Félix Houphouët Boigny (UFHB) au Laboratoire de Chimie Organique et des
Substances Naturelles (LCOSN) pour avoir examiné cette thèse.
Nos plus sincères remerciements vont vers celui qui a initié cette thèse, le Docteur
SORO Yaya, Maitre de Conférences, ainsi que le Docteur Siaka SORHO, Maitre de
Conférences, qui n’ont cessé de nous soutenir sur tous les aspects de notre travail, ne montrant
aucune fatigue et aucun rechignement dans nos incessantes sollicitations à son égard.
Remerciement spécial au Dr KOUASSI Appiah Kouadio Esaïe et à M. SANOGO
Bazoumana pour leurs soutiens moral et scientifique de tous les moments.
Je remercie l’ensemble des doctorants de l’UMRI 58.
KONE KOUWELTON PATRICK i
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
TABLE DES MATIERES
LISTE DES SCHEMAS .............................................................................................. xi
LISTE DES TABLEAUX ......................................................................................... xiii
LISTE DES FIGURES ............................................................................................... xv
SIGLES ABREVIATIONS ET FORMULES CHIMIQUES ................................ xxi
INTRODUCTION ........................................................................................................ 1
QUESTIONS DE RECHERCHE ............................................................................... 3
HYPOTHESES ............................................................................................................. 3
ORIGINALITE............................................................................................................. 4
PARTIE 1 : BIBLIOGRAPHIE .................................................................................. 5
CHAPITRE I: METABOLITES SECONDAIRES .............................................. 6
I. COMPOSES POLYPHENOLIQUES .......................................................... 6
I.1. Flavonoïdes .................................................................................................. 6
I.1.1. Anthocyanes .......................................................................................... 7
I.1.2. Flavan-3-ols........................................................................................... 7
I.1.3. Flavonols ............................................................................................... 8
I.1.4. Flavones ................................................................................................ 8
I.1.5. Isoflavonoïdes ....................................................................................... 9
I.1.6. Flavonoïdes mineurs ............................................................................. 9
I.1.6.1. Chalcones et dihydrochalcones ...................................................... 9
I.1.6.2. Aurones ........................................................................................ 10
I.1.6.3. Flavanones .................................................................................... 10
I.1.6.4. Dihydroflavonols.......................................................................... 11
I.2. Autres composés phénoliques ou non-flavonoïdes .................................... 11
I.2.1. Phénols simples ................................................................................... 12
KONE KOUWELTON PATRICK ii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2.2. Phénols éthers ...................................................................................... 12
I.2.3. Phénylpropanoïdes .............................................................................. 13
I.2.4. Hydroxycinnamates............................................................................. 13
I.2.5. Tanins .................................................................................................. 14
I.2.6. Quinones ............................................................................................. 17
I.2.7. Stilbènes .............................................................................................. 17
II. LES TERPENES ET TERPENOÏDES ....................................................... 18
II.1. Hémiterpènes ............................................................................................ 19
II.2. Monoterpènes ............................................................................................ 19
II.3. Sesquiterpènes .......................................................................................... 20
II.4. Diterpènes ................................................................................................. 21
II.5. Sesterterpènes ........................................................................................... 22
II.6. Triterpènes ................................................................................................ 23
II.6.1. Stérols ................................................................................................ 24
II.6.2. Saponins ............................................................................................. 25
II.7. Tétraterpènes ............................................................................................. 26
III. ALCALOÏDES ........................................................................................... 27
Conclusion partielle .......................................................................................... 28
CHAPITRE II: PLANTES DE L’ETUDE ............................................................ 29
I. ALCHORNEA CORDIFOLIA ..................................................................... 29
Introduction ...................................................................................................... 29
I.1. Description ................................................................................................. 29
I.2. Origine géographique ................................................................................. 30
I.3. Propriétés pharmacologiques ..................................................................... 30
I.4. Etudes phytochimiques réalisées ................................................................ 31
I.4.1. Feuilles ................................................................................................ 31
KONE KOUWELTON PATRICK iii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.4.2. Tige ..................................................................................................... 32
I.4.3. Racines ................................................................................................ 33
I.4.4. Graine .................................................................................................. 33
II. PHYLLANTHUS AMARUS ......................................................................... 35
Introduction ...................................................................................................... 35
II.1. Description botanique ............................................................................... 36
II.2. Origine géographique ............................................................................... 36
II.3. Propriétés pharmacologiques .................................................................... 37
II.4. Études phytochimiques ............................................................................. 40
III. TRIDAX PROCUMBENS ............................................................................ 41
Introduction ...................................................................................................... 41
III.1. Description botanique .............................................................................. 42
III.2. Biogéographie.......................................................................................... 42
III.3. Propriétés pharmacologiques ................................................................... 43
III.4. Etudes phytochimiques ............................................................................ 44
Conclusion partielle .......................................................................................... 45
CHAPITRE III: OPTIMISATION ET ANALYSES CHIMIQUES.................... 46
I. PLAN D’EXPERIENCES ET OPTIMISATION ....................................... 46
Introduction ...................................................................................................... 46
I.1. Plan d’expériences ..................................................................................... 46
I.1.1. Définition ............................................................................................ 46
I.1.2 Processus de conception expérimental ................................................. 46
I.1.3. Types de plan d’expérience ................................................................. 47
I.1.3.1. Plan factoriel ................................................................................ 47
I.1.3.2. Plan de Plackett et Burman .......................................................... 48
I.2. Optimisation ............................................................................................... 49
KONE KOUWELTON PATRICK iv
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2.1. Définition ............................................................................................ 49
I.2.2. Types d’optimisation ........................................................................... 49
I.2.2.1. Méthode de simplex ..................................................................... 49
I.2.2.2. Algorithme génétique ................................................................... 49
II. ANALYSES CHIMIQUES ........................................................................ 50
II.1. Techniques spectrométriques .................................................................... 50
II.1.1. Spectrométrie de masse ..................................................................... 50
II.1.1.1. Méthodes d'ionisation ................................................................. 51
II.1.1.2. Ions moléculaires et fragments par impact électronique ............ 51
II.1.1.3. Spectre de masse et pic de base .................................................. 51
II.1.1.4. Reconnaissance de l'ion moléculaire (parent), pic et détection des
isotopes ................................................................................................................. 51
II.1.1.5. Application de la spectroscopie de masse ................................... 52
II.1.1.6. Identification des métabolites secondaires par les ions parents issus
de la fragmentation par spectrométrie de masse .................................................. 52
II.1.2. Spectrométrie infrarouge ................................................................... 61
II.1.2.1. Théorie de la spectroscopie infrarouge ....................................... 61
II.1.2.2. Région d'empreinte digitale ........................................................ 61
II.1.2.3. Applications de la spectroscopie infrarouge ............................... 61
II.1.2.4. Interprétation des spectres infrarouges ....................................... 62
II.1.3. Spectroscopie ultraviolette ................................................................. 63
II.1.3.1. Théorie ........................................................................................ 63
II.1.3.2. Application.................................................................................. 63
II.2. Techniques chromatographiques .............................................................. 64
II.2.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) 64
II.2.2. Chromatographie en phase liquide à haute performance ................... 66
II.2.2.1. Théorie de la technique ............................................................... 66
KONE KOUWELTON PATRICK v
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II.2.2.2. Application de la technique ........................................................ 66
II.2.3. Chromatographie en phase gazeuse ................................................... 66
II.2.3.1. Théorie de la méthode ................................................................. 66
II.2.3.2. Application de la CPG ................................................................ 66
Conclusion partielle .......................................................................................... 67
PARTIE 2 : METHODOLOGIE .............................................................................. 68
CHAPITRE I: ANALYSES PHYTOCHIMIQUES ........................................... 69
I. BIBLIOMETRIE ........................................................................................ 69
II. RECOLTE DES ORGANES VEGETAUX ............................................... 69
III. EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT DES METABOLITES
SECONDAIRES .............................................................................................................. 70
III.1. Extraction des métabolites secondaires ................................................... 70
III.2. Fractionnement de l’extrait hydro-éthanolique ....................................... 70
IV. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE .............................................................. 71
IV.1. Test de détection des stérols et terpènes par la réaction de Lieberman et
Bürchard ....................................................................................................................... 72
IV.1.1. Sur le broyat ..................................................................................... 72
IV.1.2. Sur les extraits .................................................................................. 72
IV.2. Test de détection des polyphénols ........................................................... 72
IV.2.1. Sur le broyat ..................................................................................... 72
IV.2.2. Sur les extraits .................................................................................. 72
IV.3. Test de détection des flavonoïdes par la réaction à la cyanidine ............ 73
IV.3.1. Sur le broyat ..................................................................................... 73
IV.3.2. Sur les extraits .................................................................................. 73
IV.4. Test de détection des leucoanthocyanes .................................................. 73
IV.5. Test de détection des anthocyanes .......................................................... 73
IV.6. Tests de détection des tanins ................................................................... 73
KONE KOUWELTON PATRICK vi
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV.6.1. Tanins catéchiques ........................................................................... 73
IV.6.2. Tanins galliques................................................................................ 74
IV.7. Tests de détection des alcaloïdes ............................................................. 74
IV.7.1. Sur le broyat ..................................................................................... 74
IV.7.2. Sur les extraits .................................................................................. 74
IV.8. Test de détection des saponosides ........................................................... 74
IV.9. Test de détection des quinones et anthraquinones .................................. 75
IV.9.1. Sur les broyats .................................................................................. 75
IV.9.2. Sur les extraits .................................................................................. 75
IV.10. Test de détection des coumarines .......................................................... 75
IV.11. Test de détection des anthraquinones combinés ................................... 75
IV.11.1. Test de détection des O-hétérosides ............................................... 76
IV.11.2. Test de détection des C-hétérosides ............................................... 76
IV.12. Test de détection composés réducteurs ................................................. 76
IV. 13. Mucilages ............................................................................................. 76
Conclusion partielle .......................................................................................... 76
CHAPITRE II: MODELISATION ET OPTIMISATION DU RENDEMENT
D’EXTRACTION……. ...................................................................................................... 78
I. MODELISATION ...................................................................................... 78
I.1. Enumération des facteurs ........................................................................... 78
I.2. Domaines de valeurs .................................................................................. 78
I.3. Matrice de Plackett-Burman ...................................................................... 79
I.4. Réalisation des tests ................................................................................... 79
II. OPTIMISATION DU MODELE ................................................................ 79
Conclusion partielle .......................................................................................... 79
CHAPITRE III: IDENTIFICATION ET DETERMINATION STRUCTURALE ..... 81
KONE KOUWELTON PATRICK vii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I. IDENTIFICATION CHROMATOGRAPHIQUE ET
SPECTROSCOPIQUE ..................................................................................................... 81
I.1. Identification par chromatographie ............................................................ 81
I.1.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) .. 81
I.1.2. Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) ............................ 81
I.1.2.1. Conditions expérimentales pour Alchornea cordifolia ................ 81
I.1.2.2. Conditions expérimentales pour Phyllanthus amarus .................. 84
I.2. Identification par spectroscopie ................................................................. 86
I.2.1. Spectroscopie infrarouge ..................................................................... 86
I.2.2. Spectroscopie UV-visible .................................................................... 86
II. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN
PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE ....................... 86
II.1. Hydrolyse acide ........................................................................................ 86
II.2. Silylation des différents échantillons ........................................................ 87
II.3. Mode opératoire de la GC-MS .................................................................. 87
Conclusion partielle .......................................................................................... 88
PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION ......................................................... 89
CHAPITRE I: BIBLIOMETRIE ......................................................................... 90
I. PHYLLANTHUS AMARUS ......................................................................... 90
II. ALCHORNEA CORDIFOLIA ..................................................................... 92
III. TRIDAX PROCUMBENS ............................................................................ 94
Discussion......................................................................................................... 96
Conclusion partielle .......................................................................................... 97
CHAPITRE II: CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES ......................................... 98
I. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES BROYATS .............................. 98
I.1. Résultats ..................................................................................................... 98
I.2. Discussion ................................................................................................ 100
KONE KOUWELTON PATRICK viii
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES EXTRAITS DE TRIDAX
PROCUMBENS .............................................................................................................. 102
II.1. Criblages phytochimiques des extraits hydroalcooliques de Tridax
procumbens ................................................................................................................ 102
II.1.1. Résultats ........................................................................................... 102
II.1.2. Discussion ........................................................................................ 103
II.2. Criblage phytochimique des extraits dichlorométhane/éthanol des feuilles
suivi de la digestion et de la décoction ....................................................................... 104
II.2.1. Résultats ........................................................................................... 104
II.2.2. Discussion ........................................................................................ 104
III. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES FRACTIONS ISSUES DES
EXTRAITS HYDROALCOOLIQUES ......................................................................... 105
III.1. Résultats ................................................................................................ 105
III.2. Discussion .............................................................................................. 107
Conclusion partielle ........................................................................................ 109
CHAPITRE III: MODELISATION ET OPTIMISATION DES RENDEMENTS
D’EXTRACTION…… ..................................................................................................... 110
I. MODELISATION DES RENDEMENTS D’EXTRACTION DE A.
CORDIFOLIA ET DE T. PROCUMBENS ..................................................................... 110
I.1. Résultats ................................................................................................... 110
I.2. Discussion ................................................................................................ 111
I.2.1. Au niveau de Alchornea cordifolia ................................................... 111
I.2.2. Au niveau de Tridax procumbens ..................................................... 113
II. OPTIMISATION ...................................................................................... 115
III. VERIFICATION ET COMPARAISON DES DONNEES DES DEUX
MODELES…. ................................................................................................................ 115
Conclusion partielle ........................................................................................ 118
KONE KOUWELTON PATRICK ix
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE IV: IDENTIFICATIONS ET DETERMINATIONS
STRUCTURALES DES METABOLITES SECONDAIRES ...................................... 120
I. IDENTIFICATIONDES METABOLITES SECONDAIRES PAR
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE A HAUTE RESOLUTION
(HPTLC)…… ................................................................................................................. 120
I.1. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea
cordifolia .................................................................................................................... 120
I.1.1. Résultats ............................................................................................ 120
I.1.2. Discussion ......................................................................................... 126
I.2. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus
amarus ........................................................................................................................ 129
I.2.1. Résultats ............................................................................................ 129
I.2.2. Discussion ......................................................................................... 135
II. IDENTIFICATION PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE ............... 138
II.1. Spectres infrarouges des différentes fractions de Alchornea cordifolia . 138
II.1.1. Résultats ........................................................................................... 138
II.1.2. Discussion ........................................................................................ 142
II.2. Spectres infrarouges des différentes fractions de Phyllanthus amarus .. 143
II.2.1. Résultats ........................................................................................... 143
II2.2. Discussion ......................................................................................... 148
III. ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE COUPLEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-VIOLETTES ........ 149
III.1. Chromatographie en phase liquide à haute performance combinée à la
spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Alchornea cordifolia .......................... 150
III.1.1. Résultats ......................................................................................... 150
III.1.2. Discussion ....................................................................................... 156
KONE KOUWELTON PATRICK x
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE A HAUTE
PERFORMANCE COMBINEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-VIOLETTE DES
FRACTIONS DE PHYLLANTHUS AMARUS ............................................................... 157
IV.1. Résultats ................................................................................................ 157
IV.2. Discussion ............................................................................................. 169
V. COMPARAISON DES METHODES ANALYTIQUES DE CRIBLAGE
DES METABOLITES SECONDAIRES ....................................................................... 170
V.1. Résultats .................................................................................................. 172
V.2. Discussion ............................................................................................... 174
VI. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN
PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE ..................... 178
VI.1. Analyse GC-MS des composés de la fraction à l’acétate d’éthyle issue de
l’extrait hydro alcoolique des fleurs de Tridax procumbens ...................................... 178
VI.2. Analyse GC-MS des composés de la fraction au dichlorométhane issue de
l’extrait hydro alcoolique des fleurs Tridax procumbens linn ................................... 206
VI.3. Discussion sur les composés identifiés ................................................. 236
Conclusion partielle ........................................................................................ 237
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................... 238
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................ I
ANNEXES ............................................................................................................. XVIII
KONE KOUWELTON PATRICK xi
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
LISTE DES SCHEMAS
Schéma 1: Fractionnement de l'extrait hydro-éthanolique ...................................................... 71
Schéma 2:Réaction de silylation du groupement hydroxyle en présence de MSTFA ............ 87
Schéma 3: Décomposition du pic 1 ....................................................................................... 179
Schéma 4: Décomposition du pic 2 ....................................................................................... 181
Schéma 5: Décomposition du spectre du pic 3 ...................................................................... 182
Schéma 6: Décomposition du pic 4 ....................................................................................... 184
Schéma 7: Décomposition du pic 5 ....................................................................................... 185
Schéma 8: Décomposition du pic 6 ....................................................................................... 187
Schéma 9: Décomposition du pic 7 ....................................................................................... 188
Schéma 10: Décompostion du pic 8 ...................................................................................... 189
Schéma 11: Décomposition du pic 9 ..................................................................................... 191
Schéma 12:Décomposition du pic 9 ...................................................................................... 192
Schéma 13: Décomposition du pic 10 ................................................................................... 194
Schéma 14: Décomposition du pic 11 ................................................................................... 196
Schéma 15: Décomposition du pic 12 ................................................................................... 197
Schéma 16: Décomposition du pic 13 ................................................................................... 199
Schéma 17: Décomposition du pic 14 ................................................................................... 201
Schéma 18: Décomposition du pic 15 ................................................................................... 202
Schéma 19: Décomposition du pic 16 ................................................................................... 204
Schéma 20: Décomposition du pic 17 ................................................................................... 206
Schéma 21: Décomposition pic n°1 ....................................................................................... 208
Schéma 22: Décomposition du pic n°2 .................................................................................. 209
Schéma 23: décomposition du pic n°3 .................................................................................. 210
Schéma 24: Décomposition du pic n°4 .................................................................................. 211
Schéma 25: Décomposition du pic n°5 .................................................................................. 212
Schéma 26: Décomposition du pic n°6 .................................................................................. 213
Schéma 27: Décomposition du pic n°7 .................................................................................. 214
Schéma 28: Décomposition du pic n°7 .................................................................................. 215
Schéma 29: Décomposition du pic n°8 .................................................................................. 216
Schéma 30: Décomposition du pic n°9 .................................................................................. 217
Schéma 31: Décomposition du pic n°10 ................................................................................ 218
KONE KOUWELTON PATRICK xii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Schéma 32: Décomposition du pic n°11 ................................................................................ 219
Schéma 33: Décomposition du pic n°12 ................................................................................ 221
Schéma 34: Décomposition du pic n°13 ................................................................................ 222
Schéma 35: Décomposition du pic n°14 ................................................................................ 223
Schéma 36: Décomposition du pic n°15 ................................................................................ 224
Schéma 37: Décomposition du pic n°16 ................................................................................ 225
Schéma 38: Décomposition du pic n°17 ................................................................................ 226
Schéma 39: Décomposition du pic n°18 ................................................................................ 228
Schéma 40: Décomposition du pic n°19 ................................................................................ 229
Schéma 41: Décomposition du pic n°20 ................................................................................ 230
Schéma 42: Décomposition du pic n°21 ................................................................................ 232
Schéma 43: Décomposition du pic n°22 ................................................................................ 233
Schéma 44: Décomposition du pic n°23 ................................................................................ 235
Schéma 45: Décomposition du pic n°24 ................................................................................ 236
KONE KOUWELTON PATRICK xiii
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Listes des molécules déjà isolées dans Alchornea cordifolia ............................... 34
Tableau 2: Expériences pour un plan factoriel 23 ................................................................... 47
Tableau 3: Exemple de matrice d'expérience pour 7 facteurs de Plackett et Burman ............ 48
Tableau 4: Facteurs recensés ................................................................................................... 78
Tableau 5: Matrice des expériences ........................................................................................ 79
Tableau 6: Conditions expérimentales de la HPLC ................................................................ 82
Tableau 7: Gradient de solvant ............................................................................................... 82
Tableau 8: Conditions expérimentales de la HPLC ................................................................ 82
Tableau 9: Gradient de solvant ............................................................................................... 83
Tableau 10: Conditions expérimentales de la HPLC .............................................................. 83
Tableau 11: Gradient de solvant ............................................................................................. 83
Tableau 12: Conditions expérimentales de la HPLC .............................................................. 84
Tableau 13: Gradient de solvant ............................................................................................. 84
Tableau 14: Conditions expérimentales de la HPLC .............................................................. 84
Tableau 15: Gradient de solvant ............................................................................................. 85
Tableau 16: Conditions expérimentales de la HPLC .............................................................. 85
Tableau 17: Gradient de solvant ............................................................................................. 85
Tableau 18: Criblages phytochimiques des broyats de Tridax procumbens, Alchornea
cordifolia et Phyllanthus amarus ............................................................................................. 99
Tableau 19:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction hydro alcoolique de Tridax
procumbens ............................................................................................................................ 103
Tableau 20:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction dichlorométhane/éthanol des
feuilles suivie de la digestion et de la décoction .................................................................... 104
Tableau 21: Screening phytochimiques de trois familles de métabolites secondaires dans
Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus .......................................................................... 106
Tableau 22: Calcul de l'erreur expérimentale pour Alchornea cordifolia ............................. 111
Tableau 23: Détermination des facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia ................. 112
Tableau 24: Calcul de l'erreur expérimentale pour Tridax procumbens ............................... 113
Tableau 25: Détermination des facteurs significatifs Tridax procumbens ............................ 113
Tableau 26: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia ..................... 124
Tableau 27: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia (suite) .......... 125
KONE KOUWELTON PATRICK xiv
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 28: Composition chimique des différentes fractions de Phyllanthus amarus .......... 132
Tableau 29: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite) .............. 133
Tableau 30: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite et fin) .... 134
Tableau 31: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de
Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 155
Tableau 32: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de
Phyllanthus amarus ................................................................................................................ 167
Tableau 33: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de
Phyllanthus amarus (suite) ..................................................................................................... 168
KONE KOUWELTON PATRICK xv
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Structure générale des flavonoïdes et leur numérotation ........................................... 6
Figure 2: Structure carbonée d'un anthocyane .......................................................................... 7
Figure 3: Structure d'un flavan-3-ol .......................................................................................... 8
Figure 4: Structure d'un flavonol ............................................................................................... 8
Figure 5: Structure d'un flavone ................................................................................................ 9
Figure 6: Structure d'un isoflavone ........................................................................................... 9
Figure 7: Numérotation de la structure des chalcones et dihydrochalcones ........................... 10
Figure 8: Numérotation des aurones ....................................................................................... 10
Figure 9: Structure de base d'une flavanone ............................................................................ 11
Figure 10: Configurations des quatre formes possibles de dihydroflavonols ......................... 11
Figure 11: Exemple de structures de quelques phénols simples ............................................. 12
Figure 12: Structures de quelques phénols éthers ................................................................... 12
Figure 13: Structures de quelques phénylpropanoïdes ............................................................ 13
Figure 14: Structures de quelques hydroxycinnamates ........................................................... 14
Figure 15: Structures de quelques tanins ................................................................................. 16
Figure 16: Structures de quelques quinones ............................................................................ 17
Figure 17: Structures de quelques stilbènes ............................................................................ 18
Figure 18: Structures de quelques hémiterpènes ..................................................................... 19
Figure 19: Structures de quelques monoterpènes .................................................................... 20
Figure 20: Structures de quelques sesquiterpènes ................................................................... 21
Figure 21: Structures de quelques diterpènes .......................................................................... 22
Figure 22: Structure d'un sesterterpène ................................................................................... 22
Figure 23: Structures de quelques triterpènes ......................................................................... 24
Figure 24: Schéma de base et numérotation des stérols .......................................................... 25
Figure 25: Structures de deux saponines ................................................................................. 26
Figure 26: Structures de quelques tétraterpènes ...................................................................... 27
Figure 27: Structures de quelques alcaloïdes .......................................................................... 28
Figure 28: Photographie de Alchornea cordifolia ................................................................... 29
Figure 29: Phyllanthus amarus ............................................................................................... 36
Figure 30: Tridax procumbens ................................................................................................ 42
KONE KOUWELTON PATRICK xvi
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 31: Voies de fragmentation de l'acacétine (1) et de la 4,5-dihydroxy-7-méthoxyflavone
(2) (Justesen, 2001). ................................................................................................................. 53
Figure 32: Voies de fragmentation de la diosmétine (3) (Justesen, 2001). ............................. 54
Figure 33: Voies de fragmentation de l'isorhamnétine (Justesen, 2001) ................................. 55
Figure 34: Proposition de dissociation induite par collision de la quercitrine déprotonée en
l'aglycone radicalaire et en ions du produit aglycone (Hvattum and Ekeberg, 2003). ............. 55
Figure 35: Spectre des ions filles produits par activation collisionnelle de l'ion (M - H) - de
l'acide palmitique-7,7,8,8-d4 (Jensen and Gross, 1987) .......................................................... 56
Figure 36: Résumé des potentiels coupures par spectrométrie de masse d'un flavonoïde
glycosylé (Domon and Costello, 1988) .................................................................................... 57
Figure 37: Mécanisme possible d’isomérisation entre le 2’-hydrochalcone en flavanone (Van
de Sande et al., 1972) ............................................................................................................... 57
Figure 38: Schéma de fragmentation du squelette chalcone par spectrométrie de masse proposé
par Van de Sande et al. (1972) ................................................................................................. 58
Figure 39: Schéma de fragmentation du squelette flavanone par spectrométrie de masse
proposé par Van de Sande et al. (1972) ................................................................................... 58
Figure 40: Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B (Nowakowska,
2004) ......................................................................................................................................... 59
Figure 41: Nomenclature simplifiée pour désigner les fragments flavonoïdes (flavanone) en
mode négatif (Portet et al., 2008) ............................................................................................. 59
Figure 42: Nomenclature simplifiée des voies de fragmentation des flavonoïdes en mode positif
(Wolfender et al., 2000) ........................................................................................................... 60
Figure 43: Exemple de spectre infrarouge de la N-méthylaniline (Cozzolino, 2009) ............ 63
Figure 44:Nombre de publications par année sur Phyllanthus amarus ................................... 90
Figure 45: Classement des auteurs en fonction du nombre de publications ........................... 91
Figure 46: Camembert représentant la part de chaque type de publication sur Phyllanthus
amarus ...................................................................................................................................... 92
Figure 47:Nombre de publications sur Alchornea cordifolia au fil des années ...................... 93
Figure 48: Trois premiers auteurs en nombre de publications sur Alchornea cordifolia ........ 93
Figure 49: Répartition des différents types de publication sur Alchornea cordifolia ............. 94
Figure 50: Nombre de publication sur Tridax procumbens par an .......................................... 95
Figure 51: Classement des auteurs les plus prolifiques sur les publications sur Tridax
procumbens .............................................................................................................................. 95
KONE KOUWELTON PATRICK xvii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 52: Répartition des publications sur Tridax procumbens par type .............................. 96
Figure 53: Résultats des expériences sur Alchornea cordifolia ............................................ 110
Figure 54: Résultats des expériences sur Tridax procumbens .............................................. 111
Figure 55: Influences des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction de Alchornea
cordifolia ................................................................................................................................ 113
Figure 56: Influence des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction ....................... 114
Figure 57: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de
Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 116
Figure 58: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Alchornea cordifolia ......... 116
Figure 59: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de Tridax
procumbens ............................................................................................................................ 117
Figure 60: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Tridax procumbens ........... 117
Figure 61: Modélisation des données de Tridax procumbens avec le modèle de A. cordifolia
................................................................................................................................................ 118
Figure 62: Modélisation de Alchornea cordifolia avec le modèle de T. procumbens ........... 118
Figure 63: : Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia
................................................................................................................................................ 122
Figure 64: Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus amarus
................................................................................................................................................ 131
Figure 65: Spectres Infrarouge des fractions de Alchornea cordifolia ................................. 140
Figure 66: Spectres Infrarouge des fractions de Phyllanthus amarus ................................... 146
Figure 67: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane des feuilles de
Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 151
Figure 68: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle des
feuilles de Alchornea cordifolia ............................................................................................. 152
Figure 69: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction au butanol des feuilles de
Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 154
Figure 70: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane de Phyllanthus
amarus .................................................................................................................................... 159
Figure 71: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle de
Phyllanthus amarus ................................................................................................................ 163
Figure 72: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’eau de Phyllanthus
amarus .................................................................................................................................... 166
KONE KOUWELTON PATRICK xviii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 73: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour
Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 172
Figure 74: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour
Phyllanthus amarus ................................................................................................................ 173
Figure 75: Résumé des pourcentages de détection de famille de métabolites secondaires ... 174
Figure 76: Pourcentage de détection des métabolites secondaires ........................................ 175
Figure 77: Résumé des pourcentages de détection des familles de métabolites secondaires de
Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 177
Figure 78: Résumé des pourcentages de détection des familles de métabolites secondaires de
Phyllanthus amarus ................................................................................................................ 177
Figure 79: Chromatogramme de la fraction à l’acétate d'éthyle de Tridax procumbens ...... 178
Figure 80: 2,3 Diméthylbutan-2-ol ........................................................................................ 179
Figure 81: Spectre de masse du pic 1 .................................................................................... 179
Figure 82: Octan-1-ol ............................................................................................................ 180
Figure 83: Spectre du pic 2 .................................................................................................... 180
Figure 84: 4-Hydroxy benzoate de méthyle .......................................................................... 181
Figure 85: Spectre du pic 3 .................................................................................................... 182
Figure 86: Acide 4-hydroxybenzoïque .................................................................................. 183
Figure 87: Spectre du pic 4 .................................................................................................... 183
Figure 88: Ester méthylique de l'acide procatéchine ............................................................. 185
Figure 89: Spectre du pic 5 .................................................................................................... 185
Figure 90: Ester méthylique de l'acide coumarique .............................................................. 186
Figure 91: Spectre du pic 6 .................................................................................................... 186
Figure 92: (3-methoxy-4-en-1-yl) Benzène .......................................................................... 187
Figure 93: Spectre du pic 7 .................................................................................................... 188
Figure 94: Acide 3,4-dihydroxybenzoïque ............................................................................ 189
Figure 95: Spectre du pic 8 .................................................................................................... 189
Figure 96:4-[(2E)-butan-2-ylidene amino]-3-ethlbutane-1,2,4-triol ..................................... 190
Figure 97: Spectre du pic 9 .................................................................................................... 190
Figure 98: Malonate de diéthyle ............................................................................................ 191
Figure 99: Spectre du pic 10 .................................................................................................. 192
Figure 100: Acide (2E)-3-(4-hydroxyphényl) prop-2-énoïque ............................................. 193
Figure 101: Spectre du pic 11 ................................................................................................ 193
KONE KOUWELTON PATRICK xix
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 102: Acrylate de méthyle 3-(4-hydroxyphényle) ....................................................... 195
Figure 103: Spectre du pic 12 ................................................................................................ 195
Figure 104: Acrylate de méthyl-3-(3,4-dihydroxyphényle) .................................................. 196
Figure 105: Spectre du pic 13 ................................................................................................ 197
Figure 106: Acide férulique .................................................................................................. 198
Figure 107: Spectre du pic 14 ................................................................................................ 198
Figure 108: Acide caféique ................................................................................................... 200
Figure 109: Spectre du pic 15 ................................................................................................ 200
Figure 110: 2-(3,4-dihydroxyphényl)-3,5,7-trihydroxy-4h-chromèn-4-one ......................... 202
Figure 111: Spectre du pic 16 ................................................................................................ 202
Figure 112: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one ......... 203
Figure 113: Spectre du pic 17 ................................................................................................ 203
Figure 114: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one .............................. 205
Figure 115: Spectre du pic 18 ................................................................................................ 205
Figure 116: Chromatogramme de la fraction dichlorométhane de Tridax procumbens ....... 207
Figure 117: (Méthylamino) méthanol ................................................................................... 207
Figure 118: Spectre de masse du pic 1 .................................................................................. 208
Figure 119: (3E)-4-hydroxypent-3-en-2-one ......................................................................... 209
Figure 120: Spectre de masse du pic n°2 .............................................................................. 209
Figure 121: spectre du pic n°3 ............................................................................................... 210
Figure 122: Spectre de masse du pic n°4 .............................................................................. 211
Figure 123: Spectre de masse du pic n°5 .............................................................................. 212
Figure 124: Spectre de masse du pic n°6 .............................................................................. 213
Figure 125: Spectre de masse du pic n° 7 ............................................................................. 214
Figure 126: Spectre de masse du pic n°8 .............................................................................. 215
Figure 127: Spectre de masse du pic n°9 .............................................................................. 216
Figure 128: Spectre de masse du pic n°10 ............................................................................ 217
Figure 129: Spectre de masse du pic n°11 ............................................................................ 218
Figure 130: Spectre de masse n°12 ....................................................................................... 219
Figure 131: Spectre de masse du pic n°13 ............................................................................ 220
Figure 132: Spectre de masse du pic n°14 ............................................................................ 222
Figure 133: Spectre de masse du pic n°15 ............................................................................ 223
Figure 134: Spectre de masse du pic n°16 ............................................................................ 224
KONE KOUWELTON PATRICK xx
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 135: Spectre de masse du pic n°17 ............................................................................ 225
Figure 136: Spectre de masse du pic n°18 ............................................................................ 226
Figure 137: Spectre de masse du pic n°19 ............................................................................ 227
Figure 138: Spectre de masse du pic n°20 ............................................................................ 229
Figure 139: Spectre de masse du pic n°21 ............................................................................ 230
Figure 140: Spectre de masse du pic n°22 ............................................................................ 231
Figure 141: Spectre de masse du pic n°23 ............................................................................ 233
Figure 142: Spectre de masse du pic n°24 ............................................................................ 234
Figure 143: Spectre de masse du pic n°25 ............................................................................ 236
KONE KOUWELTON PATRICK xxi
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
SIGLES ABREVIATIONS ET FORMULES
CHIMIQUES
°C Degré Celsius
°C/min Degré Celsius par minute
ACP Analyse en composante principale
ADN Acide désoxyribonucléique
Br Brome
CCM Chromatographie sur couche mince
CH2Cl2 Dichlorométhane
Cl Chlore
Cm Centimètre
CPG Chromatographie en phase gazeuse
D/GalN/LPS D-galactosamine Lipopolysaccharide
DPPH 2,2 Diphényl-1 picrylhydrazylhydrate
EDP Ecole Doctorale Polytechnique
eV Electron Volt
FeCl3 Trichlorure de fer
g Gramme
GC Gas Chromatography
GC-MS Gas Chromatography - Mass spectrometry
H Heure
HCl Acide chlorhydrique
HET-CAM Hen's Egg Test, Chorioallantoic membrane
HPLC High pressure Liquid chromatography
HPLC UV High pressure Liquids chromatograghy coupled with ultra violet spectroscopy
HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography
IR Infra-Rouge
KBr Bromure de potassium
LAPISEN LAboratoire des Procédés Industriels de Synthèses, de l’environnement et des Energies Nouvelles
LC Liquid Chromatography
LDL Low Density Lipids (Lipides à faible densité)
M Mètre
m/z Masse par charge électrique
Mg Milligramme
MgSO4 Sulfate de magnésium
Min Minute
mL Millilitre
mL/g Millilitre par gramme
mL/min Millilitre par minute
mm Millimètre
MSTFA N méthyl N triméthylsilyltrifluoroacétanide
NH4OH Hydroxyde d'ammonium
nm Nanomètre
KONE KOUWELTON PATRICK xxii
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
OMS Organisation mondiale de la santé
RF Rapport frontale
RP Reverse phase
rpm Rotation par minute
scans/s Scans par seconde
TLC Thin Layer Chromatography (Chromatographie sur couche mince)
TMS Triméthylsilyle
uma/s Unité de masse atomique par seconde
UMRI Unité Mixte de Recherche et d’Innovation
UV Ultra-violet
v/v Volume par volume
Ycalc Réponse modélisées
Yexp Réponses expérimentales
ZnSe Séléniure de zinc
μ Micron
μL Microlitre
μm Micromètre
1
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
INTRODUCTION
La nature regroupe un nombre important de plantes qui jouent un rôle majeur dans la
vie des humains et des animaux en constituant une source alimentaire, cosmétique et de
médicaments (Cseke et al., 2016). Ces plantes contiennent des métabolites secondaires
responsables de leurs activités biologiques telles que les activités antioxydante, antidiabétique
(Croteau et al., 2000; Crozier et al., 2008; Smith, 2007; Verpoorte and Memelink, 2002) et
microbiologique (Bie et al., 2005; Biradar, 2016; Goly et al., 2015; Julien et al., 2015). L’étude
de la structure moléculaire de quelques substances naturelles a permis d’améliorer leurs
utilisations et de développer de nouvelles voies de leurs usages.
Les métabolites secondaires des plantes sont obtenus par plusieurs méthodes
d’extraction, parmi lesquelles la macération et la décoction (Jones and Kinghorn, 2006;
Stashenko et al., 2004). Ces méthodes d’extraction varient selon l’origine de la substance
naturelle (plante ou animal) et selon leurs utilisations (Starmans and Nijhuis, 1996).
L’extraction des métabolites secondaires des plantes médicinales permet de récupérer de faibles
quantités de substances actives dont la composition dépend du type de méthodes extractives.
Les méthodologies d’extraction méritent d’être explorées en vue d’améliorer le rendement
d’extraction et aussi de fournir une méthodologie simple et efficace à nos populations dans la
confection de médicaments traditionnels améliorés.
Après l’extraction des métabolites secondaires, l’une des étapes de l’étude
phytochimique de ces substances naturelles est la séparation des molécules suivie de
l’identification structurale. Cette identification passe généralement par des screening
phytochimiques qui utilisent une diversité de produits chimiques et réactifs dont l’accessibilité
pose un problème dans nos laboratoires. Il est donc nécessaire d’envisager de nouvelles
méthodes chromatographiques et spectroscopiques d’identification des métabolites
secondaires. C’est dans ce cadre que s’articule notre thèse qui s’intitule : « Application des
techniques de chromatographie et de spectrométrie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives ivoiriennes ».
L’objectif général de ce travail de thèse est d’appliquer les techniques de
chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de trois
plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne. Il se décline en
quatre objectifs spécifiques qui sont :
KONE KOUWELTON PATRICK 2
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
- la modélisation et l’optimisation de la méthode extractive des métabolites secondaires de
deux plantes de l’étude dans le but de maximiser leurs rendements d’extraction ;
- l’identification des trois grandes familles de métabolites secondaires à l’aide des techniques
de chromatographie et de spectroscopie ;
- la comparaison des méthodes chromatographiques et spectroscopiques dans l’identification
des trois grandes familles de métabolites secondaires ;
- la détermination structurale de quelques métabolites secondaires de Tridax procumbens
Linn.
Le document se présente comme suit : la première partie est consacrée à la bibliographie
sur les métabolites secondaires, les plantes soumises à l’étude (Alchornea cordifolia,
Phyllanthus amarus et Tridax procumbens), quelques méthodes chromatographiques et
spectroscopiques ainsi que sur la modélisation et l’optimisation. La seconde partie présente le
matériel et les méthodologies utilisées pour réaliser les screening phytochimiques, la
modélisation, l’optimisation, les analyses chromatographique et spectroscopique. La troisième
partie expose les résultats obtenus suivis de leur discussion. Une conclusion achèvera se
document suivi de recommandations et de perspectives.
KONE KOUWELTON PATRICK 3
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
QUESTIONS DE RECHERCHE
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) mène un programme de promotion et de
développement des médicaments traditionnels car plus de 80% de la population du tiers-monde
utilisent des plantes pour un usage médicinal. Ce programme vise à établir des inventaires des
pratiques efficaces, à apporter la preuve de l’innocuité, de l’efficacité et de la qualité des
remèdes traditionnels et à entreprendre des recherches appropriées du moment, le marché
mondial des plantes médicinales est en plein essor et l’amélioration des rendements d’extraction
ainsi que l’identification des métabolites secondaires responsables des activités biologiques et
pharmacologiques des plantes demeure un enjeu important. Cette étude vient répondre à
plusieurs questions en adéquation avec la vision de l’OMS. Elles sont les suivantes :
- comment peut-on améliorer les rendements d’extraction des métabolites secondaires
des plantes ?
- existe-t-il d’autres méthodes de criblages des métabolites secondaires des plantes
autres que les tests de coloration et de précipitation ?
- quelle est la composition chimique en familles de métabolites secondaires des
plantes ?
- quelle est la structure des molécules actives et/ou des nouvelles molécules ?
HYPOTHESES
La thématique de ce travail se base sur les hypothèses suivantes :
- Il est possible de trouver les paramètres qui influencent les rendements d’extraction
des métabolites secondaires des plantes ;
- Il est possible d’optimiser les rendements d’extraction des métabolites secondaires
des plantes ;
- les métabolites secondaires des plantes peuvent être identifiés par des méthodes
chromatographiques et spectroscopiques ;
- les structures des métabolites secondaires des plantes peuvent être établies
uniquement par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de
masse.
KONE KOUWELTON PATRICK 4
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
ORIGINALITE
Cette étude présente des résultats originaux quant à la détermination des paramètres qui
influencent les rendements d’extraction des métabolites secondaires de deux plantes et
l’optimisation de ces rendements. Les méthodes chromatographiques en phase liquide à haute
performance (HPLC) et sur couche mince à haute performance (HPTLC) ainsi que les méthodes
spectroscopiques Infrarouge (IR) et Ultra-Violette (UV) ont été employées avec succès dans
l’identification des famille de métabolites secondaires des plantes. Ces méthodes ont été
comparées entre elles et avec le criblage phytochimique par une analyse de données via des
tableaux croisés dynamiques.
5
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
PARTIE 1 : BIBLIOGRAPHIE
KONE KOUWELTON PATRICK 6
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE I: METABOLITES SECONDAIRES
Les plantes produisent divers composés organiques, dont la grande majorité ne semble
pas participer directement à leurs croissance et développement. Ces substances,
traditionnellement appelées métabolites secondaires, sont souvent distribuées différemment
parmi des groupes taxonomiques limités dans le règne végétal (Hanson, 2003). Ils sont
responsable des activités biologiques des plantes médicinales (Croteau et al., 2000; Hanson,
2003). Sur la base de leurs origines biosynthétiques, les métabolites secondaires des plantes
peuvent être divisés en trois grands groupes : les composés polyphénoliques, les terpénoïdes et
les alcaloïdes (Crozier et al., 2008).
I. COMPOSES POLYPHENOLIQUES
Les composés phénoliques sont caractérisés par au moins un cycle aromatique substitué
par un ou plusieurs groupes hydroxyles. Plus de 8000 structures de composés phénoliques ont
été rapportées dans la littérature et elles sont largement dispersées dans les plantes (Strack et
al., 1992). Ils peuvent être classés en fonction du nombre et de l'agencement de leurs atomes de
carbone et sont communément substitués par des sucres et des acides organiques (Crozier et al.,
2008). Les composés phénoliques peuvent être classés en deux groupes : les flavonoïdes et les
non-flavonoïdes.
I.1. Flavonoïdes
Les flavonoïdes dérivent de la flavone. Les structures des flavonoïdes sont constituées
de deux anneaux de benzène séparés par une unité de propane. Ils sont généralement
hydrosolubles. On les trouve généralement dans les plantes sous forme glycosilées. Les
différentes classes dans le groupe se distinguent par des anneaux hétérocycliques contenant de
l'oxygène et des groupes hydroxyles. Il s'agit notamment des chalcones, des flavones, des
flavonols, des flavanones, des anthocyanines et des isoflavones (figure 1) (Williams and
Grayer, 2004).
Figure 1: Structure générale des flavonoïdes et leur numérotation
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.1.1. Anthocyanes
Les anthocyanes sont des hétérosides oxygénés dont l’aglycone est appelé
anthocyanidine. Les anthocyanes sont des sous classes des flavonoïdes au sens large dont la
structure de base est l’ion flavylium. Ils sont des pigments naturels des feuilles, fruits et pétales.
Ils sont impliqués dans la protection des plantes contre la lumière excessive par l'ombrage des
cellules de la mésophile foliaire et ont également un rôle important dans l’attraction des insectes
pollinisateurs (Crozier et al., 2008). Ils constituent un défi pour les biochimistes en raison de
leurs importantes variations structurales et de la complexité de leurs biosynthèse (Harborne,
2013; Harborne and Williams, 2000). Les anthocyanes sont connues pour leurs activités anti-
inflammatoire, antioxydant (Szymanowska et al., 2015) et cardioprotective (Zhang et al.,
2017). La figure 2 présente une structure d’un anthocyane.
Figure 2: Structure carbonée d'un anthocyane
I.1.2. Flavan-3-ols
Les flavan-3-ols sont une sous classe de flavonoïdes qui se caractérise par leurs
structures reconnaissables par la saturation des liaisons sur le cycle C et la présence d’un
groupement hydroxyle en position 3 de ce cycle (figure 3). Elles ont abordé leur relation avec
les tanins condensés et les aspects de leurs caractéristiques chimiques et spectroscopiques ainsi
que le métabolisme (Haslam, 1982, 1975). Ils sont hydrosolubles. Les flavan-3-ols sont connues
pour leurs propriétés antioxydantes (Li et al., 2016), cytotoxiques (Navarro et al., 2017) et
anticancéreuses (Zhu et al., 2017).
KONE KOUWELTON PATRICK 8
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Figure 3: Structure d'un flavan-3-ol
I.1.3. Flavonols
Les flavonols sont des sous-groupes de flavonoïdes possédant un hydroxyle phénolique
en C3 et une fonction carbonyle en C4 (figure 4). Ils sont dispersés dans tout le règne végétal,
à l'exception des champignons et des algues. La répartition et les variations structurales des
flavonols sont très vastes (Fabre et al., 2001; Mollavali et al., 2016). Les flavonols tels que la
myricétine, la quercétine, l'isorhamnétine et le kaempférol sont le plus souvent sous forme de
O-glycosides (Strack et al., 1992). La liaison glycosidique se produit le plus souvent en position
3 du cycle C, mais des substitutions peuvent également se produire en positions 5, 7, 4’, 3’ et
5’ du cycle carbone. (Crozier et al., 1997).
Figure 4: Structure d'un flavonol
I.1.4. Flavones
Les flavones sont des sous familles des flavonoïdes dont la structure est bassée sur la
présence de la fonction carbonyle en C4. Ils ont une structure semblable à celle des flavonols
sans le groupement hydroxyle en C3 (figure 5). Les flavones ont des propriétés antitumorales
(Cabrera et al., 2007).
KONE KOUWELTON PATRICK 9
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 5: Structure d'un flavone
I.1.5. Isoflavonoïdes
Les isoflavonoïdes sont des isomères des flavonoïdes. Elles sont caractérisées par le fait
que le cycle B est attaché au cycle C en position 3 plutôt qu'en position C2 (Crozier et al., 2008).
Les isoflavonoïdes possèdent un squelette flavonoïde réarrangé (figure 6). Une variété de
modifications structurelles de ce squelette conduit à une grande classe de composés qui
comprend les isoflavones, les isoflavanones et la roténone. Les isoflavonoïdes sont des
composés spécifiques de la famille des Fabacées (Crout and Geissman, 1969). Ces composés
présentent des activités œstrogénique, insecticide et antifongique (Cornwell, 2004), en plus
d'une activité antifongique (Rivera-Vargas et al., 1993). Cependant certains isoflavonoïdes sont
des poisons puissants.
Figure 6: Structure d'un isoflavone
I.1.6. Flavonoïdes mineurs
Les flavonoïdes mineurs sont généralement constitués de chalcones, d’aurones, de
dihydrochalcones, de flavanones et de dihydroflavonols (Bohm, 1988).
I.1.6.1. Chalcones et dihydrochalcones
Les chalcones et les dihydrochalcones sont des composés C6-C3-C6 qui n'ont pas
d’hétérocyclique central. Les positions sur ces composés, sont identifiées à l'aide d'un système
de numérotation unique à ces groupes (figure 7) (Bohm, 1988). Les dihydrochalcones se
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distinguent des chalcones par l’hydrogénation de la double liaison exocyclique en position α et
β (figure 7) (Portet et al., 2007).
Ces composés sont présents en abondance dans les fruits comestibles, les légumes, les
épices, le thé et ont également montré des effets pharmacologiques tels que des activités
anticancéreuses, anti-inflammatoire, antimicrobienne et antioxydante (Gutierrez et al.,
2015)(Chimenti et al., 2009).
Figure 7: Numérotation de la structure des chalcones et dihydrochalcones
I.1.6.2. Aurones
Les aurones sont une sous classes des flavonoïdes dit mineurs. Les aurones sont basées
sur la 2-benzylidenecoumaranone (figure 8). Les positions dans les aurones sont identifiées à
l'aide de nombres pour le cycle B et des nombres primés sur le cycle C ; Les aurones sont à cet
égard des flavonoïdes « normaux ». Des activités anticancéreuses, antiparasitaires, et
antimicrobiennes ont été révélées pour les aurones (Boumendjel, 2003).
Figure 8: Numérotation des aurones
I.1.6.3. Flavanones
Les flavanones sont une sous famille de flavonoïdes qui ont une structure similaire à
celle des flavones mais sans la double liaison entre les carbones 2 et 3 du cycle C (figure 9)
(Lee et al., 2004; Zhishen et al., 1999). C'est la classe qui a plus grand nombre de composés
dans la catégorie des « flavonoïdes mineurs ». Les flavanones sont très réactives et peuvent
subir des réactions d'hydroxylation, de glycosylation et d'O-méthylation. Les flavanones sont
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des composants alimentaires présents dans les agrumes. La flavanone glycosylée la plus
courante est l'hespérétine-7-O-rutinoside (hespéridine) qui se trouve dans les écorces d'agrumes
(Crozier et al., 2008).
Figure 9: Structure de base d'une flavanone
I.1.6.4. Dihydroflavonols
Les dihydroflavonols sont une sous classe de flavonoïdes qui ont la même structure que
les flavonols à la différence que la liaison double entre les carbone 2 et 3 est hydrogénée. Les
dihydroflavonols ont deux centres d'asymétrie, en position C-2, C-3, et quatre configurations
(figure 10). La forme la plus commune est de loin (2R, 3R) (Crozier et al., 2008).
Figure 10: Configurations des quatre formes possibles de dihydroflavonols
I.2. Autres composés phénoliques ou non-flavonoïdes
Cette famille constitue une grande classe de composés dans lesquels un groupe
hydroxyle (groupe -OH) est lié à un cycle aromatique. Les non-flavonoïdes principaux sont les
acides phénoliques (C6-C1) (Brielmann et al., 2006; Crozier et al., 2008). La grande majorité
des produits naturels aromatiques de plantes sont des phénols (Brielmann et al., 2006). Nous
présenterons les grandes familles de ces composés phénoliques à savoir, les tanins, les quinones,
les phénols, les phénols éthers, les stilbènes, les phénylpropanoïdes et les phénols simples.
KONE KOUWELTON PATRICK 12
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I.2.1. Phénols simples
Les pénols simples sont des composés phénoliques dont la structure est faite d’un phényl
et d’un ou plusieurs groupements hydroxyles (figure 11). Ils sont hydrosolubles. La plupart des
phénols simples sont des monomères des polyphénols et des acides qui composent certains
tissus végétaux, y compris la lignine et la mélanine. L'hydroquinone, le catéchol, l'orcinol et
d'autres phénols simples se trouvent à des concentrations relativement faibles (Buckingham et
al., 2010).
Figure 11: Exemple de structures de quelques phénols simples
I.2.2. Phénols éthers
Les phénols éthers se reconnaissent par leurs structures composées de phényl rattachés
à un ou plusieurs éthers alkyliques. Beaucoup de phénols existent également sous forme
d’éthers méthyliques (figure 12). Le trans-anéthole est principalement responsable du goût et
de l'odeur des graines d'Anis (Pimpinella anisum). L’Apiole, puissant diurétique, est un
constituant majeur de la graine de l'huile essentielle de persil (Petroselinum crispum) (Louli et
al., 2004).
Figure 12: Structures de quelques phénols éthers
KONE KOUWELTON PATRICK 13
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I.2.3. Phénylpropanoïdes
Les phénylpropanoïdes contiennent une chaîne latérale à trois carbones attachés à un
phénol. Les exemples courants comprennent les hydroxycoumarines, les phénylpropènes et les
lignanes. Les différents types d'acides hydroxycinnamiques sont constitués des acides caféiques
et coumarique. La coumarine est fréquente pour de nombreuses plantes et est le composé volatil
qui à l'air doux, est libéré du foin nouvellement tondu. Les phénylpropènes sont des composants
importants de nombreuses huiles essentielles et comprennent l'eugénol, principal principe actif
de l'huile de clous de girofle (Eugenia caryophyllata ou Syzygium aromaticum) (Ntamila and
Hassanali, 1976). Les phénylpropènes comprennent également l'anéthole et la myristicine, les
principes actifs de la noix de muscade (Myristica fragrans) (Archer, 1988). Les acides caféïque
et de coumarique sont présents dans les grains de café vert et torréfié (Andrade et al., 1998).
L'umbelliférone et la scopolétine sont des phénylpropanoïdes de la classe des coumarines
connus depuis 1884 et isolés des racines de Scopolia japonica. Le phénylpropène eugénol a été
isolé de plusieurs sources végétales et a été utilisé comme analgésique dentaire (Samuelsson,
1991). La figure donne les structures de quelques phénylpropanoïdes.
Figure 13: Structures de quelques phénylpropanoïdes
I.2.4. Hydroxycinnamates
L'acide cinnamique est un composé C6-C3 qui est converti en une gamme
d'hydroxycinnamates qui, du fait qu'ils sont des produits de la voie phénylpropanoïde, sont
appelés collectivement les phénylpropanoïdes. Les hydroxycinnamates les plus courants sont
les acides p-coumarique, caféique et ferulique qui s'accumulent souvent comme leurs esters de
tartrate, de coutarique, de caftarique et de fertarique respectifs (figure 9). Les formes conjuguées
d'acide quinique, de l'acide caféique, tels que l'acide 3, 4 et 5-O-caféoylquinique, sont des
KONE KOUWELTON PATRICK 14
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composés courants des fruits et des légumes. Cet acide est fréquemment appelé acide
chlorogénique, bien que ce terme soit réservé à un groupe entier de composés apparentés. Les
acides chlorogéniques sont présents à 10% des feuilles de grains de café maté vert (Ilex
paraguariensis) et de café robusta vert (graines transformées de Coffea canephora) (Crozier et
al., 2008).
Figure 14: Structures de quelques hydroxycinnamates
I.2.5. Tanins
Les tanins sont des oligomères hydrosolubles, riches en groupes phénoliques, capables
de se lier ou de précipiter des protéines solubles dans l'eau (Hagerman and Butler, 1989). Les
tanins, communs aux plantes vasculaires, existent principalement dans les tissus ligneux, mais
KONE KOUWELTON PATRICK 15
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peuvent également être dans les feuilles, les fleurs ou les graines. Les tissus végétaux riches en
tanins ont un goût très amer et sont évités par la plupart des animaux. Les tanins peuvent être
divisés en deux groupes : qui sont les tanins condensés, et tanins hydrolysables. Les tanins
condensés sont formés biosynthétiquement par la condensation des flavanols pour former des
réseaux de polymères. Des exemples de tanins condensés (proanthocyanidines) sont présentés
à la figure 15. Les tanins hydrolysables sont, quant à eux, des esters d'un sucre (habituellement
le glucose) avec un ou plusieurs acides trihydroxybenzène-carboxyliques (acide gallique). Ces
composés donnent des précipités insolubles avec l'albumine, l'amidon ou la gélatine. La
réaction avec les protéines est utilisée industriellement pour convertir les peaux d'animaux en
cuir (bronzage). Des exemples de tanins hydrolysables (figure 15) comprennent la corilagine,
isolée des feuilles de sumac (Rhus spp.) et d'eucalyptus (Eucalyptus spp.) (Buckingham et al.,
2010) ainsi que la géraniine isolé de la géranium (Geranium spp.) et de Phyllanthus spp.
(Buckingham et al., 2010). La corilagine et la géraniine présente une activité anti-
immunodéficience humaine (VIH) en inhibant la transcriptase inverse (Notka et al., 2004).
KONE KOUWELTON PATRICK 16
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Figure 15: Structures de quelques tanins
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I.2.6. Quinones
Les quinones constituent une série de diènes plutôt que des composés aromatiques
comportant un noyau de benzène sur lequel deux atomes d'hydrogène sont remplacés par deux
atomes d'oxygène formant deux liaisons carbonyles (figure 16). Les quinones sont des
composés phénoliques qui forment généralement des pigments fortement colorés couvrant tout
le spectre visible. Ils se trouvent dans les régions internes de la plante. Elles jouent un rôle
important dans la respiration des plantes. Ils agissent comme des porteurs d'électrons qui
fonctionnent en convertissant les hydroquinones en quinones, agissant ainsi comme des couples
rédox. L'ubiquinone (coenzyme Q) sert spécifiquement de porte-électrons sur la membrane
mitochondriale interne en transférant des électrons afin de compléter une pompe à protons dans
la chaîne respiratoire. Les quinones jouent un rôle clé dans les membranes photosynthétiques.
Une double fonction est attribuée aux plastoquinones car elles agissent à la fois comme agents
d'extinction photochimiques et non photochimiques dans la photosynthèse.
Figure 16: Structures de quelques quinones
I.2.7. Stilbènes
Les stilbènes, de structure commune en C6-C2-C6, avec les deux carbones du milieu
possédant une double liaison. Ils sont des phytoaléxines, produites par les plantes en réponse à
une attaque par des agents pathogènes fongiques, bactériens ou viraux. Le resvératrol est le
stilbène le plus courant. Il se présente sur deux isomère cis et trans dans les tissus végétaux
principalement sous forme de trans-resvératrol-3-O-glucoside (figure 17), connu sous le nom
de piceide ou polydatine. Une famille de polymères de resvératrol (les viniférines) existe
également. Les principales sources de stilbènes sont les raisins, le vin, le soja et les produits de
l'arachide. Le trans-resvératrol et son glucoside se retrouvent dans des quantités
particulièrement élevées dans la plante d'Itadori (Polygonum cuspidatum), également connue
sous le nom de Knotweed japonais (Burns et al., 2002). En Asie, la racine d’Itadori est séchée
KONE KOUWELTON PATRICK 18
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et infusée pour produire un thé. Elle est utilisée pendant des siècles au Japon et en Chine comme
remède traditionnel pour de nombreuses maladies, y compris les maladies cardiaques et les
accidents vasculaires cérébraux (Kimura et al., 1985). En effet, le trans-resveratrol peut inhiber
l'oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDL) au stade initial de la pathogenèse de
l'athérosclérose (Soleas et al., 1997).
Figure 17: Structures de quelques stilbènes
II. LES TERPENES ET TERPENOÏDES
Les terpènes, ou isoprénoïdes, sont l'une des classes les plus diverses de métabolites
secondaires. Leur squelette carboné est constitué d'unités isopréniques reliées, c'est ce que l'on
appelle la règle de l'isoprène. Ces squelettes peuvent être arrangés de façon linéaire ou bien
former des cycles. (Brielmann et al., 2006). Ils sont des arômes et des parfums, des
antibiotiques, des hormones végétales et animales, des lipides membranaires, des attracteurs
d'insectes, des anti alimentaires et des médiateurs des processus essentiels de transport
d'électrons (Crozier et al., 2008). Les terpènes ont été appréciés comme constituants des huiles
essentielles et leur utilisation comme parfums pendant plus de deux mille ans (Van Bergen et
al., 1997). Les terpènes simples trouvés dans les parfums présentent une grande diversité
structurelle. Les terpènes sont constitués des unités fondamentales d'isoprène à cinq atomes de
carbone (Bohlmann et al., 1998). Ainsi, les terpènes peuvent être classés en hémiterpènes (C5),
KONE KOUWELTON PATRICK 19
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monoterpènes (C10), sesquiterpènes (C15), diterpènes (C20), sesterpènes (C25), triterpènes
(C30), tétraterpènes (C40).
II.1. Hémiterpènes
Les hémiterpènes (C5) sont constitués d'une unité à cinq atomes de carbone et sont les
plus simples de tous les terpènes. L'isoprène est produit par les feuilles de nombreuses plantes
et contribue à la brume naturelle dans certaines régions (Kang et al., 2001). On distingue de
nombreux composés à cinq atomes de carbone tels que l'alcool isoamylique, l'acide sénécioïque,
l'acide tiglique, l'acide angélique, les acides α et β-furoïques et l'isovaléraldehyde (figure 18).
Ces composés contribuent à la défense des plantes en repoussant les herbivores ou en attirant
des prédateurs et des parasites d'herbivores (Holopainen, 2004a).
Figure 18: Structures de quelques hémiterpènes
II.2. Monoterpènes
Les monoterpènes sont constitués de deux unités d’isoprène (figure 19). Une variété
étonnante d'arrangements de décane à base d'isoprène existe dans la nature (Liao et al., 2003).
Les monoterpènes (C10) sont le principal composant de nombreuses huiles essentielles. Ils ont
une importance économique en tant que saveurs et parfums. Les structures acycliques
comprennent le myrcène, le géraniol et le linalol. Les structures cycliques comprennent de
nombreux composés bien connus, tels que le menthol, le camphre, le pinène et le limonène. La
figure 19 donne les structures de quelques monoterpènes.
KONE KOUWELTON PATRICK 20
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 19: Structures de quelques monoterpènes
II.3. Sesquiterpènes
Dérivés de trois unités d'isoprène, les sesquiterpènes (C15) existent sous formes
aliphatiques, bicycliques et tricycliques (Fraga, 2003). Comme les monoterpènes, la plupart des
sesquiterpènes sont des composants des huiles essentielles de plantes. Un composé important
de cette série est le farnesol, qui présente une activité chimiopréventive du cancer (Crowell and
Gould, 2004). Certains des sesquiterpènes couramment rencontrés sont présentés à la figure 20.
KONE KOUWELTON PATRICK 21
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Figure 20: Structures de quelques sesquiterpènes
II.4. Diterpènes
Les diterpènes, de structure en quatre (4) unité d’isoprène (C20) sont un groupe très
varié de composés (Hanson, 2004). En raison de leurs points d'ébullition plus élevés, ils ne sont
pas considérés comme constituants des huiles essentielles. Ainsi, ils sont classiquement
considérés comme des résines. Quelques diterpènes usuels sont présentés à la figure 21.
KONE KOUWELTON PATRICK 22
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CH3
CH3
CH2 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
H
CH3 H
O OH
CH3 OH
CH3 CH3 CH3 CH3
O
O
CH3
O
OH
CH3HH
CH3
p-Camphorène
Acide abiétique
Phytol
Marrubiine
Figure 21: Structures de quelques diterpènes
II.5. Sesterterpènes
Cette famille de terpènes est composée de cinq (5) unités d’isoprène. Ce sont des
composés minoritaires dans la famille des terpènes (Crews and Naylor, 1985; Walker et al.,
1980; Wei et al., 2004). La figure 22 donne un exemple de sesterterpènes.
Figure 22: Structure d'un sesterterpène
KONE KOUWELTON PATRICK 23
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II.6. Triterpènes
Les terpènes de structure carbone en C30 sont basés sur six unités d'isoprène et sont
dérivés biosynthétiquement du squalène (Connolly and Hill, 2005). Ils sont souvent des
matières solides incolores à haut point de fusion et sont largement répartis entre les résines
végétales, le liège et les cutines. Il existe plusieurs groupes importants de triterpènes, parmi
lesquels les triterpènes simples, les stéroïdes, les saponines et les glycosides cardiaques. Parmi
ceux-ci se trouve l’azadirachtine (Schmutterer, 1988), issu des graines du neem (Azadirachta
indica). Il a été isolé pour la première fois en 1985 à partir de l'huile de neem. Seuls quelques-
uns des triterpènes communs sont largement répartis entre les plantes. Il s'agit notamment des
amyrines (Boar and Allen, 1973) et des acides uranique et oléanique (Liu, 1995), qui sont
communs dans les cires issues des feuilles et de la peau de certains fruits. D'autres triterpènes
comprennent les limonines et les cucurbitacines, considérés comme des antagonistes puissants
des hormones stéroïdes d'insectes (Miro, 1995). Quelques triterpènes sont présentés à la figure
23.
KONE KOUWELTON PATRICK 24
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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Figure 23: Structures de quelques triterpènes
II.6.1. Stérols
Un stérol est un lipide possédant un noyau de stérane dont le carbone 3 est porteur d'un
groupe hydroxyle (figure 24). Pratiquement tous les stéroïdes végétaux sont hydroxylés en C-3
KONE KOUWELTON PATRICK 25
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
et sont en fait des stérols. Dans le règne animal, les stéroïdes ont une importance profonde
comme hormones, coenzymes et provitamines. Cependant, le rôle des phytostérols est moins
bien compris. Il est prouvé que certains des phytostérols sont efficaces contre les maladies
cardiovasculaires (Kris-Etherton et al., 2002).
Figure 24: Schéma de base et numérotation des stérols
II.6.2. Saponins
Les saponines sont constituées de six unités d'isoprène et sont également dérivées du
squalène. Les saponines sont des glycosides triterpéniques de poids moléculaire élevé,
contenant un glycoside attaché à un stérol ou à d'autres triterpènes. Ils sont largement distribués
dans les plantes et se composent de deux parties : la glycone (sucre) et l'aglycone ou le génine
(triterpène) (Woitke et al., 1970). Typiquement, ils ont des propriétés détergentes, forment
facilement des mousses dans l'eau. Ils ont également un goût amer et sont piscicides (toxiques
pour les poissons). Beaucoup de plantes contenant des saponines ont été historiquement
utilisées comme savons. Il s'agit notamment des savons de racine de Chlorogalum
pomeridianum, d’écorce de Quillaja saponaria, de baie Sapindus saponaria et de noix de
Sapindus mukurossi (Hostettmann and Marston, 2005, 1995). Les aglycones peuvent être de la
classe des alcaloïdes triterpènes ou des stéroïdes. Les saponines peuvent être mono- ou
polydesmodiques, selon le nombre de fragments de sucre attachés. De nombreuses cyclases
enzymatiques impliqués dans leur biosynthèse ont été récemment déterminés (Haralampidis et
al., 2002). Deux saponines représentatives sont présentées à la figure 25.
KONE KOUWELTON PATRICK 26
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 25: Structures de deux saponines
II.7. Tétraterpènes
Les tétraterpènes les plus courants sont les caroténoïdes (Britton, 1995), un groupe
largement distribué de composés dont la chaine carbonée est en C40. Les caroténoïdes sont
généralement dérivés du lycopène. La cyclisation à une extrémité donne un γ-carotène et celle
aux deux extrémités fournit du β-carotène. Ce pigment a été isolé pour la première fois en 1831.
Il est pratiquement universel dans les feuilles des plantes supérieures. Comme le montre la
structure du polyène, de nombreux isomères sont possibles pour ces structures de base, qui
peuvent tous fournir des pigments aux couleurs vives. Dans les plantes, les caroténoïdes servent
de pigments nécessaires à la photosynthèse, où ils sont censés protéger les plantes contre la
suroxydation catalysée par d'autres pigments absorbant la lumière, comme les chlorophylles.
KONE KOUWELTON PATRICK 27
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Ils sont également responsables des couleurs variant du jaune au rouge dans les fleurs et les
fruits. Cette coloration attire les pollinisateurs (fleurs) et sert de source d'aliments pour les
herbivores, aidant ainsi à la dispersion des graines. Les tétraterpènes sélectionnés sont présentés
à la figure 26.
Figure 26: Structures de quelques tétraterpènes
III. ALCALOÏDES
Les alcaloïdes sont un groupe diversifié de composés à faibles poids moléculaires,
contenant de l'azote dérivés principalement d'acides aminés et trouvés dans environ 20% des
KONE KOUWELTON PATRICK 28
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
espèces végétales (Roberts, 2013). Ce sont des bases contenant de l'azote qui forment des sels
avec des acides. Cette capacité à former des sels et à complexer des ions métalliques a aidé leur
séparation et leur détection à l'époque avant la chromatographie (Hanson, 2003). Les alcaloïdes
jouent un rôle défensif dans la plante contre les herbivores et les agents pathogènes. En raison
de leurs activités biologiques puissantes, bon nombre d’alcaloïdes connus ont été exploités
comme produits pharmaceutiques, stimulants, narcotiques et poisons (Wink, 1998). Les
alcaloïdes sont généralement regroupés sur la base du système cyclique présent. Plusieurs
systèmes cycliques communs, tels que les systèmes indolizidine, quinolozidine (Michael,
2003a, 2003b), quinoléine, quinazoline et acridones (Michael, 2004a, 2004b) ont été étudiées,
(Herbert, 2003). Beaucoup d'alcaloïdes dérivent directement des acides aminés aromatiques, de
la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane. Un échantillonnage des classes d'alcaloïdes
est illustré à la figure 27.
Figure 27: Structures de quelques alcaloïdes
Conclusion partielle
Les métabolites secondaires peuvent être scindés en trois grands groupes : les alcaloïdes,
les terpènes et les composés phénoliques. Ils représentent une partie importante des substances
naturelles non seulement en nombre mais aussi par les activités biologiques et
pharmacologiques qu’ils confèrent aux plantes dans lesquelles ils se trouvent.
KONE KOUWELTON PATRICK 29
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE II: PLANTES DE L’ETUDE
I. ALCHORNEA CORDIFOLIA
Introduction
La médecine traditionnelle africaine utilise de nombreuses plantes qui constituent une
source énorme de molécules bioactives capables de traiter plusieurs maladies. Ces plantes
médicinales sont donc un domaine qui mérite d'être exploré pour leur grande diversité de
molécules chimiques (Tra Bi et al., 2008). Ce paragraphe aborde quelques études antérieures
menées sur Alchornea cordifolia, en termes d'activités pharmacologiques et de compositions
chimiques.
Dans les lignes suivantes, il s’agira de décrire la plante, puis de donner son origine
géographique et ses propriétés pharmacologiques pour enfin faire un état des lieux de sa
composition chimique.
I.1. Description
Alchornea cordifolia est un Euphorbiacée, observée principalement en Afrique
subsaharienne. C'est un arbuste stérilisant, ramifié à la laisse, à feuilles persistantes ou petit
arbre jusqu'à 8 m de haut ; Les jeunes pousses se dressent, devenant plus tard horizontales,
creuses, glabres (Mavar-Manga et al., 2007).
Figure 28: Photographie de Alchornea cordifolia
Source (http://www.westafricanplants.senckenberg.de)
Photographe: Philippe Birnbaum; Date: 25-01-2005 10:05:00
KONE KOUWELTON PATRICK 30
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2. Origine géographique
Alchornea cordifolia a été identifiée dans plusieurs pays, qui peuvent se résumer
essentiellement à la zone située entre les tropiques de l’Afrique. À partir de l'est du Sénégal au
Kenya (y compris la Côte d’Ivoire), on l'a également retrouvé en Tanzanie et en Afrique centrale
; Il est même cultivé au Congo pour ses vertus médicinales.
I.3. Propriétés pharmacologiques
De nombreuses propriétés pharmacologiques ont été démontrées sur des extraits
d’Alchornea cordifolia. Elles peuvent être différentes en fonction de l’organe de la plante et de
la nature de l’extrait ou de la fraction.
Les feuilles de A. cordifolia constituent l'organe le plus étudié de la plante. Elles
contiennent une grande variété de métabolites secondaires et possèdent de nombreuses
propriétés pharmacologiques en fonction du solvant d'extraction.
L’extrait à l’hexane possède des activités antibactériennes, antimicrobiennes et anti-
inflammatoires (Adeshina et al., 2012).
L'extrait au chloroforme présente des activités antiplasmodiques (Banzouzi et al., 2002),
antimicrobiennes (George et al., 2010; Owosini et al., 2015), antibactériennes (Noundou et al.,
2016), antifongiques et hépatoprotectives (Osadebe et al., 2012).
L'extrait à l'éther de pétrole a une activité antisplasmodique (Banzouzi et al., 2002) alors
que celui obtenu avec le butanol est antimicrobien (George et al., 2010).
L'extrait à l'éthanol a des effets anti-diarrhéiques (Agbor et al., 2004), antiplasmodiques
(Banzouzi et al., 2002), anti-diabétiques (Eliakim-Ikechukwu and Obri, 2009; Eliakim-
Ikechukwu and Riman, 2009), antimicrobiens, antibactériens (Okwu and Ukanwa, 2010),
hépatoprotecteurs (Olaleye et al., 2006), antioxydants, et anti-inflammatoires (Okoye et al.,
2011).
L’extrait méthanolique des feuilles possède des activités antimicrobiennes, anti-
bactérien et anti-inflammatoire in vivo. Ce extrait est utilisé comme un adjuvant
immunostimulant in vitro pour les vaccins (Ebi, 2001).
L'extrait aqueux d'Alchornea cordifolia est considéré comme un suppléments
nutritionnels pour les animaux (Alikwe, 2014); Il a également une activité anxiolytique
(Kamenan et al., 2013), immunomodulatrice (Kouakou et al., 2013), et anti-stress
KONE KOUWELTON PATRICK 31
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
anticonvulsivante (Umukoro and Aladeokin, 2010), Il a également des effets sur l'élastase et
l'anion superoxyde (Kouakou-Siransy et al., 2010).
Les propriétés anti-arthritiques (Adeneye et al., 2014), antihypertensives (Eliakim-
Ikechukwu and Riman, 2009), antibiotiques in vivo (Igbeneghu et al., 2007), et antidépresseur
(Ishola et al., 2014; Okeke et al., 1999) ont été mis en évidence dans l'extrait éthanolique.
L'extrait à l'acétate d'éthyle a des activités antimicrobiennes (George et al., 2010) et
antibactériennes (Noundou et al., 2016). Il a également un effet sur l'élimination des anions
superoxydes (Kouakou-Siransy et al., 2010) et possède des propriétés hépatoprotectives
(Osadebe et al., 2012).
L’écorce des plantes sont communément utilisé pour des besoins thérapeutiques.
Alchornea cordifolia n'échappe pas à cette règle. Les extraits à l’hexane, à l’acétone et à
l’acétate d’éthyle ont une activité antibactérienne (Ajali, 2000; Noundou et al., 2016) Les
extraits à l'éthanol et au méthanol sont antibactériens (Ajali, 2000) et antimicrobien (Ebi, 2001;
Mambe et al., 2016; Noundou et al., 2016; Owosini et al., 2015). L'extrait au chloroforme est
antibactérien, antimicrobien et antifongique (Noundou et al., 2016; Owosini et al., 2015).
Les études pharmacologiques des racines sont rares parce que la plupart du temps il faut
détruire l'arbuste. Toutefois, l’étude menée à ce jour, montre que l'extrait au méthanol est
antimicrobien et antibactérien (Ebi, 2001; Mambe et al., 2016).
L’extrait aqueux des graines a montré une activité antipaludique (Ayisi et al., 2011). La
pulpe de la graine est utilisée comme apport nutritionnel dans l'alimentation des poulets de chair
(Emenalom et al., 2012).
I.4. Etudes phytochimiques réalisées
Les différentes activités pharmacologiques observées sur Alchornea cordifolia sont dues
à des molécules bioactives qu'elle contient.
I.4.1. Feuilles
L'analyse phytochimique de l’extrait à l’hexane révèle la présence de tanins,
d'alcaloïdes, de flavonoïdes et de phénols. Les composés anti-inflammatoires isolés à partir de
cet extrait sont l'eugénol, le cadinol, la nanocosaine, les dérivés de stéroïdes, l'iso-allocholate
d'éthyle et le 3-acétoxy-7,8-époxylanostane-1-ol (Adeshina et al., 2012; George et al., 2010;
Okoye et al., 2011).
KONE KOUWELTON PATRICK 32
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
L’extrait à l’éthanol contient de nombreux métabolites secondaires. Le criblage
phytochimique révèle la présence d'alcaloïdes, de tanins, de saponines, de flavonoïdes, de
phénol, d'anthraquinone et de glycosides. Plusieurs composés tels que l’acide ellagique, la 5-
méthyl 4 '-propenoxy anthocyanidines 7-O-D - diglucopyranoside et des triterpénoïdes ont été
isolés dans cet extrait (Agbor et al., 2004; Banzouzi et al., 2002; Eliakim-Ikechukwu and
Riman, 2009; George et al., 2010; Noundou et al., 2016; Okwu and Ukanwa, 2010; Olaleye et
al., 2006; Osadebe et al., 2012; Owosini et al., 2015).
L'extrait au méthanol des feuilles contient des polyphénols, des tanins, des triterpènes,
des stérols, des alcaloïdes, des flavonoïdes et des saponines (Osadebe and Okoye, 2003). Les
composés isolés sont l’acide gallique, l’acide protocatéchique, la quécertine arabinose,
galactose-O-glycoside, la triosopentényl guanidine hyperoside, la quercitrine, le daucostérol,
l’acide acétylérolitolique, N1, N2-diisopentényl gaunidine, la N1, N2, N3-triisopentényl
guanidine, la β-sistérol et le phtalate de di-2-éthylhexyle (Ebi, 2001; Lamikanra et al., 1990;
Mambe et al., 2016; Manga et al., 2004; Mavar-Manga et al., 2008; Noundou et al., 2016;
Nworu et al., 2010; Osadebe et al., 2012; Osadebe and Okoye, 2003; Owosini et al., 2015).
Cinq composés ont été isolés de l’extrait à l’acétate d’éthyle, à savoir la quécèrtine, la
myricétine-3-glucopyranoside, la myricétine-3-rhamnopyranoside et la proanthocyanidine
(George et al., 2010; Kouakou-Siransy et al., 2010; Noundou et al., 2016; Osadebe et al., 2012).
I.4.2. Tige
Sept composés et responsables de l'activité antimicrobienne ont été isolé. Il s’agit de
stigmastérol, le stigmasta-4,22-dien-3-one; la friedeline; le friedelane-3-one-28-al; l’acide 3-O-
acétyl-aleuritolique; le 3-O-acétyl-érythrodiol et le méthyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (gallate de
méthyle) (Noundou et al., 2016). En ce qui concerne la composition phytochimique de l'écorce
d'Alchornea cordifolia, il existe une présence d'alcaloïdes, de flavonoïdes, de saponines, de
glycosides stéréoïdes, de terpénoïdes et de tanins dans l'extrait à l'acétone (Ajali, 2000),
d'alcaloïdes, de flavonoïdes, de saponines, de glycosides stéréoïdiens, de terpénoïdes et de
tanins dans l'extrait éthanolique (Ajali, 2000; Owosini et al., 2015). Des polyphénols, des
tanins, des triterpènes et des stérols ont été identifiés dans l'extrait au méthanol (Ajali, 2000;
Ebi, 2001; Mambe et al., 2016; Noundou et al., 2016). Les flavonoïdes, des terpénoïdes et des
KONE KOUWELTON PATRICK 33
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
saponines ont été isolé également dans l'extrait à l’éther de pétrole (Ajali, 2000; Owosini et al.,
2015).
I.4.3. Racines
Le criblage phytochimique des racines a montré la présence de polyphénol, de tanin, de
triterpènes et de stérols (Ebi, 2001; Mambe et al., 2016).
I.4.4. Graine
L'acide alchornoique a été isolé et identifié de l’extrait à l'éther de pétrole des graines
(Kleiman et al., 1977).
Le tableau 1 énumère quelques molécules isolées de cette plante ainsi que les activités
biologiques qui leur sont assignées.
KONE KOUWELTON PATRICK 34
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 1: Listes des molécules déjà isolées dans Alchornea cordifolia
Nom commun Organe Activité biologique Bibliographie
La quercétine Plante
entière,
feuille
Relaxation musculaire
lisse, activité
antibactérienne
Ogungbamila et al
1990, Lamikanra et al
1990
Di (2-éthylhexyle) phtalate Feuilles et
racines
Activité anti-
inflammatoire
Mavar-manga et al
2008
Acide anthranilique Les
racines
Non déterminé Correia et al 1962
5-Methyl 4'-propenoxy
anthocyannidines 7-O-β-D-
diglucopyranoside
Feuille Activité
antibactérienne
Okwu et al 2010
(E) -bicyclo [10.8.0]
eicosane
Feuille Activité de balayage Onocha et al 2011
Acide gallique Plante
entière,
feuille
Relaxation musculaire
lisse, activité
antibactérienne
Ogungbamila et al
1990, Lamikanra et al
1990
Stigmasta-4,22-dién-3-one Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
Guaijavérine Plante
entière
Relaxation musculaire
lisse
Ogungbamila et al
1990
N1, N2-diisopentényl
guanidine
Feuilles et
racines
Activité anti-
inflammatoire et
cytotoxique
Mavar-manga et al
2008
N1, N2, N3-triisopentényl
guanidine
Feuilles et
racines
Activité anti-
inflammatoire, activité
cytotoxique
Mavar-manga et al
2008
Triisopentyl gaunidine Feuille Activité
antibactérienne
Lamikanra et al 1990
Acide 3-O-acétyl-
aleuritolique
Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
Acide acétyl-érolitolique Feuilles et
racines
Activité anti-
inflammatoire
Mavar-manga et al
2008
Acétate de 11-tétradécyn-1-
ol
Feuille Activité de balayage Onocha et al 2011
Daucostérol Feuilles et
racines
Activité anti-
inflammatoire
Mavar-manga et al
2008
L'acide ellagique Plante
entière
Relaxation musculaire
lisse
Ogungbamila et al
1990
Hypérine Plante
entière
Relaxation musculaire
lisse
Ogungbamila et al
1990
Hypéroside Feuille Activité anti-
inflammatoire
Mavar-manga et al
2004
KONE KOUWELTON PATRICK 35
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Acide génique les racines Non déterminé Correia et al 1962
Quercitrine Feuille Activité anti-
inflammatoire
Mavar-manga et al
2004
Friedeline Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
(+) Acide cis-14,15-époxy-
cis-11-eicosénoïque
(alchornoic)
Graine Non déterminé Kleiman et al 1977
3-O-acétyl-érythrodiol Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
Hexadécyl-oxirane Feuille Activité de balayage Onocha et al 2011
β-sitostérol Feuilles et
racines
Activité anti-
inflammatoire
Mavar-manga et al
2008
Stigmastolaire Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
Galate de méthyle Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
Acide protocatéchique Feuille Activité
antibactérienne
Lamikanra et al 1990
Friedélane-3-one-28-al Tige Activité
antibactérienne
Noundou et al 2016
II. PHYLLANTHUS AMARUS
Introduction
Les plantes appartenant au genre Phyllanthus (Euphorbiaceae) sont largement
distribuées dans la plupart des pays tropicaux et subtropicaux. Linnaeus a décrit ce genre pour
la première fois en 1737. Il s'agit d'un très grand genre d'environ 550 à 750 espèces qui est
subdivisé en 11 sous-genres, qui sont Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Conani,
Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylla, Botryanthus , Ericocus et Phyllanthus (Calixto
et al., 1998). Les études sur Phyllanthus amarus ont été publié dans la majorité des revues
phytochimiques, pharmacologiques ou ethno-botaniques avec différents noms tel que
Phyllanthus niruri (Patel et al., 2011).
Dans ce paragraphe, il s’agira donc de faire une description de la plante, ensuite de
donner son origine géographique, puis enfin d’énumérer ses propriétés pharmacologiques et les
études phytochimiques déjà réalisées.
KONE KOUWELTON PATRICK 36
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 29: Phyllanthus amarus
II.1. Description botanique
Phyllanthus amarus est une herbe annuelle érigées de 10 à 60 cm de hauteur. Sa tige
principale est simple ou ramifiée. Les feuilles ont une dimension de 3-11 × 1.5-6 mm et une
forme ovales elliptiques, oblongues. Les fleurs possèdent 2 à 3 axes proximaux avec des
cymbales unisexuelles, chacune comprenant 1 mâle et 1 femelle ou 2 à 3 mâles et femelle ou 1
fleur masculine et 2 femelle ou une combinaison de celles-ci (Mitra and Jain, 1985). Les
capsules de graines sur les tiges ont une longueur de 1 à 2 mm, et sont rondes, lisses,et large de
2 mm, avec en moyenne six graines à l’intérieur. Lorsque les fruits éclatent, les graines sont
lancées. Les graines sont triangulaires, de couleur marron clair, de longueur moyenne 1 mm et
avec 5 à 6 côtes à l'arrière (Morton and others, 1981; Wessels Boer et al., 1976).
II.2. Origine géographique
Le genre Phyllanthus se compose d'environ 750 espèces dans 300 genres, (Webster,
1994). De nombreuses espèces de cette famille sont originaires de l'Amérique (Unander et al.,
1995). Le nom « Phyllanthus » signifie « feuille et fleur » parce que la fleur se confond aux
fruit et aux feuilles (Cabieses, 1993). La révision taxonomique sur ce genre par Webster
comprenait des genres étroitement liés à Phyllanthus amarus, sous la sous-section Swartiziani
de la section Phyllanthus. La nomenclature, la spécificité taxonomique et les proches parents
KONE KOUWELTON PATRICK 37
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
de Phyllanthus amarus ont été abordés en détail en fonction de la morphologie et de la
répartition géographique (Chaudhary and Rao, 2002). Elle est liée à Phyllanthus abnormis, qui
est endémique des zones sablonneuses du Texas et de la Floride au sud des États-Unis. Il est
donc très probable que Phyllanthus Amarus soit originaire de la région des Caraïbes comme
une espèce indirecte de Phyllanthus abnormis du sud des États-Unis et s'est répandue dans les
régions tropicales (Webster, 1957).
II.3. Propriétés pharmacologiques
L'activité antiamnésique de l'extrait aqueux de feuilles et de tiges de Phyllanthus amarus
a été évalué sur les fonctions cognitives et l'activité de souris mâles albinos suisses. Phyllanthus
amarus (50, 100 et 200 mg.kg-1) a produit une amélioration dose-dépendante dans les scores de
mémoire de souris jeunes et plus âgés. Elle a également inversé avec succès l'amnésie induite
par la scopolamine (0,4 mg.kg-1, i.p.) et le diazépame (1 mg.kg-1, i.p.) et l'activité du
cholinestérase cérébrale a également été réduite. Le piracétame 400 mg.kg-1, i.p. a été utilisé
comme contrôle positif (Joshi and Parle, 2007). Le 6-gingérol et la phyllanthine isolés de
Phyllanthus amarus ont montré une activité nootropique (augmentation de la mémoire). Ces
deux composés ont augmenté de manière significative les latences retardées chez les souris
âgées, et ont considérablement diminué l'activité de l'acétyle cholinestérase dans le cerveau
entier (Joshi and Parle, 2006).
Des extraits à l'hexane, au méthanol et à l'eau de parties aériennes de Phyllanthus
amarus ont été criblés pour des activités antimicrobiennes contre Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus et Candida albicans
en utilisant le protocole de diffusion d'agarcup. Les extraits aqueux et méthanoliques de
Phyllanthus amarus ont été actifs contre tous les microorganismes testés. L'extrait
méthanolique de Phyllanthus amarus a également montré un large spectre d'activité avec une
concentration inhibitrice minimale de 1,56 mg.mL-1 contre tous les microorganismes d'essai
(Alli et al., 2011). Les extraits méthanoliques à 80% obtenus à partir de sept genres de
Phyllanthus ont été évalués pour une activité antibactérienne en utilisant le dosage de
microdilution au bouillon. La meilleure activité antibactérienne a été obtenue pour Phyllanthus
amarus contre Staphylococcus aureus (gram-positif) avec une valeur de MIC de 17,7 g.mL-1
(Eldeen et al., 2011). L'activité antibactérienne des extraits éthanoliques des racines des feuilles
de Phyllanthus amarus a été évaluée contre Escherichia coli isolée à partir des échantillons de
KONE KOUWELTON PATRICK 38
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
selles de patients séropositifs au VIH avec ou sans diarrhée à l'aide de la méthode de diffusion
de disque Bauer. Les souches isolées des deux patients séropositifs contre le VIH étaient
sensibles à diverses concentrations des extraits (5, 10, 20, 40 et 80 mg.mL-1). Les zones
moyennes d'inhibition des extraits de racine variaient de 8,0 ± 0,33 à 25,0 ± 1,50 mm contre E.
coli tandis que les zones moyennes d'inhibition des extraits de feuilles variaient de 8,0 ± 0,50 à
26,0 ± 1,00 mm contre E. coli.
La cytotoxicité des extraits bruts (aqueux et au méthanol) Phyllanthus amarus ont été
criblées en utilisant le MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-
sulfophényl)-2H-tétrazolium). Il a été démontré que ces extraits et fractions inhibaient la
croissance des cellules MCF-7 (carcinome mammaire) et A549 (carcinome pulmonaire) avec
des valeurs de IC50 allant de 56 à 126 g.ml-1 et 150 à 240 g.ml-1 pour des extraits au méthanol
et aqueux respectivement. En comparaison, ils ont une toxicité plus faible sur les cellules
normales avec une viabilité cellulaire de 50% lorsqu'ils sont traités jusqu'à 1000 g.ml-1 pour les
extraits aqueux et au méthanol. Après avoir déterminé la dose efficace non toxique, plusieurs
tests d'antimétastase ont été réalisés et les extraits de Phyllanthus amarus ont permis de réduire
efficacement l'invasion, la migration et l'adhésion des cellules MCF-7 et A549. Ceci a été suivi
d'une évaluation des modes possibles de mort cellulaire qui ont eu lieu avec l'activité
antimétastatique. La capacité de Phyllanthus amarus à exercer des activités antimétastatiques
est principalement associée à la présence de composés polyphénoliques dans ses extraits (Lee
et al., 2011). L'extrait au méthanol de racines capillaires de Phyllanthus amarus a révélé une
activité antiproliférative puissante dans les cellules MCF-7 par induction de l'apoptose médiée
par l'augmentation des espèces d'oxygène réactif intracellulaire (ROS) associée à une
diminution du potentiel de la membrane mitochondriale (Abhyankar et al., 2010).
L'administration orale d'éthanol absolu (1 mL par 200 g de poids corporel) a permis
d'étudier des bandes rouges, allongées et rougeâtres d'érosions hémorragiques dans la muqueuse
gastrique du rat. Le groupe de contrôle de l'éthanol avait l'indice d'ulcère le plus élevé de 45,20
± 2,39. L'extrait aqueux de feuilles Phyllanthus amarus laisse et la cimétidine inhibent de
manière significative (p <0,001) l'ulcération de 59,3 et 41,2% respectivement. L'extrait à
l'acétone a donné un pourcentage d’inhibition de l'ulcère dépendant de la dose. Le plus faible
dosage de l'extrait aqueux a eu une inhibition plus élevée de l'ulcère (Shokunbi and Odetola,
2008). Les extraits au méthanol de feuilles et tiges de Phyllanthus amarus aux doses de 50, 200
et 1000 mg.kg-1 de poids corporel po, chez les rats Wistar mâles adultes inhibent de manière
KONE KOUWELTON PATRICK 39
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
significative les lésions gastriques induite par l'administration intragastrique d'éthanol absolu
(8 mL.kg-1 de corps poids). La mortalité, l'augmentation du poids de l'estomac, l'indice d'ulcère
et les saignements intraluminaux ont été significativement diminués par les extraits au méthanol
des feuilles et tige de Phyllanthus amarus. L'analyse biochimique a indiqué que la réduction de
la GSH de la muqueuse gastrique produite par l'administration de l'éthanol était
significativement élevée par un traitement avec à l’extrait au méthanol des feuilles et tige de
Phyllanthus amarus (Raphael and Kuttan, 2003). Les doses graduées de l'extrait aqueux des
feuilles et tige Phyllanthus amarus (100-800 mg.kg-1) ont été administrées par voie orale et ont
induit l’inhibition du transit intestinal le plus élevé de 31,65% avec 400 mg/kg chez des souris.
Dans la diarrhée induite par l'huile de ricin chez la souris, l'extrait aqueux de feuilles et
tige Phyllanthus amarus (400 mg.kg-1) a retardé l'apparition de la diarrhée et réduit la fréquence
de défécation. En outre, les activités de certaines enzymes de la muqueuse intestinale (maltase,
sucrase, lactase et phosphatase alcaline) chez les souris prétraitées avec de cet extrait avant la
prise de l'huile de ricin n'ont pas été aussi fortement affectées que celles chez les souris traitées
à l'huile de ricin (témoin) (Odetola and Akojenu, 2000).
L'effet de la nor-sécurinine, un alcaloïde isolé de Phyllanthus amarus, a été étudié contre
la germination des spores de certains champignons (Alternaria brassicae, Alternaria solani,
Curvularia pennisetti, Curvularia sp., Erysiphe pisi, Helminthosporium frumentacei) ainsi que
l'oïdium du pois (E. pisi) dans des conditions de serre. La sensibilité des champignons à la nor-
sécurinine variait considérablement et cette molécule était efficace contre la plupart des
champignons. H. frumentacei était la plus sensible même à la plus faible concentration (1000
g.mL-1). Les conidies d'E. pisi ont également été inhibées dans la formation partielle ou totale
d'appressorium. La pré-inoculation a montré une plus grande efficacité que la post-inoculation
dans l'inhibition du développement de la moisissure en poule dans une serre. Une inhibition
maximale s'est produite à 2000 g.mL-1 (Sahni et al., 2005). L'essai biologique antifongique en
termes de réduction de poids, de diamètre de colonie et de sporulation de la colonie fongique
ciblée a été effectué à l'aide de la méthode de dilution du bouillon. La fraction au chloroforme
de la partie aérienne de la Phyllanthus amarus a montré un effet inhibiteur important contre les
champignons dermatophytiques M. gypseum (Agrawal et al., 2004).
L'extrait aqueux de feuilles de Phyllanthus amarus a été étudié pour ses activités
analgésiques et anti-inflammatoires utilisant à la fois des modèles thermiques et chimiques
d'évaluation de la douleur chez les rats. Cet extrait (200 mg.kg-1) a provoqué une importante
KONE KOUWELTON PATRICK 40
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
inhibition de 70,20% de l'œdème de la patte, induite par la carraghénine chez les rats, plus
élevée que celle du médicament de référence (acide acétylsalicylique). Cet extrait a également
produit une activité analgésique marquée en inhibant à la fois les phases rapides et tardives du
stimulus de la douleur des pattes induites par la formol chez les rats Licking et aussi une
augmentation significative et associée à la dose dans l'inhibition de la durée moyenne
d'immersion de la queue à une température variable du bain d'eau (50, 55 et 60°C) (Iranloye et
al., 2011).
Les effets de l'extrait au méthanol à 75% de la plante entière de Phyllanthus amarus sur
différentes phases de l'inflammation ont été réalisés sur un œdème de patte induite par des
agents phlogistiques différents, une inflammation de la poche d'air induite par la carraghénine
et un granulome de granulés de coton chez des rats Wistar mâles. L’extrait au méthanol à une
dose de 250 mg.kg-1 de poids corporel inhibe de manière significative l'œdème de la patte
induite par la carraghénine, la bradicine, la sérotonine et la prostaglandine E1, mais n'a pas
réussi à inhiber l'œdème de la patte induite par l'histamine (Mahat and Patil, 2007).
L'activité antioxydante de l'extrait aqueux de la plante entière de Phyllanthus amarus à
la dose de 200 mg.kg-1 de poids corporel/jour a été évaluée chez les rats Wistar albinos induits
par la streptozotocine (Karuna et al., 2011). Cet extrait a montré un potentiel significatif (p
<0,05) dans le balayage des radicaux libres et dans l'inhibition de la peroxydation lipidique. En
outre, cet extrait s'est avéré contenir une teneur élevée en composés phénoliques qui ont eu des
corrélations positives fortes et significatives (p <0,05) avec le potentiel de balayage des
radicaux libres, la capacité d'inhibition de la peroxydation des lipides et l'efficacité cyto-
protectrice contre les dommages cellulaires oxydatifs induits par le chrome VI (Guha et al.,
2010).
II.4. Études phytochimiques
Les métabolites secondaires présents chez Phyllanthus amarus sont les alcaloïdes, les
flavonoïdes, les tanins hydrolysables (Ellagitanins), les lignanes majeurs, les polyphénols, les
triterpènes, les stérols et les composés volatiles de l’huile. Les lignanes isolés de la plante
entière sont la phyllanthine, l’hypophyllanthine, la nirurine, la niranthine, la phyltétraline, la
nirtétraline (A. M. Maciel et al., 2007; Chevallier, 2000; Huang et al., 2003; Kassuya et al.,
2006; Morton and al, 1981; Singh et al., 2009; Srivastava et al., 2008). Les flavonoïdes isolés
KONE KOUWELTON PATRICK 41
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
de la plante entière sont la quercétine, la quercétrine, la rutine, la gallocatéchine, la
phyllanthusiine, le kaempférol (Foo, 1993; Foo and Wong, 1992; Londhe et al., 2008; Morton
and others, 1981). Les Ellagitanins, la géraniine, l’amariine, la furosine, l’acide gélaniinique,
l’acide amariinique, l’amandine, l’acide répandusinique, la corilagine, l’isocorilagine,
l’élaéocarpusine, la phyllanthine D, l’acide gallique, l’acide répandusinique A ont également
été isolés de la plante entière (Foo, 1995, 1993; Foo and Wong, 1992). Les triterpènes isolés de
la plante entière sont le phyllanthénol, la phyllanthénone, le phytllanthéol (A. M. Maciel et al.,
2007; Foo and Wong, 1992). Les alcaloïdes isolés de la plante entière sont la sécurinine, la
dihydrosécurinine, la tétrahydrosécurinine, la sécurinol, la phyllanthine, l’allosécurine, la nor-
sécurinine, l’épibubbialine, l’isobubbialine, la 4-méthoxy dihydrosécurinine, la 4-
méthoxytétrahydrosécurinine et la 4-hydrosécurinine (Foo and Wong, 1992; Houghton et al.,
1996; Kassuya et al., 2006). Les stérols tels que l’amarostérol-A, l’amarostérol-B ont également
été isolés de la plante entière (Ahmad and Alam, 2003). L’huile essentielle de la partie aérienne
de la plante contient du linalool, et un phytol (Moronkola et al., 2009).
III. TRIDAX PROCUMBENS
Introduction
Tridax procumbens Linn appartient à la famille des Compositae communément appelée
«Ghamra» en raison de l'apparence de fleurs (Bhagwat et al., 2008). Elle est connue comme
mauvaise herbe, et a été l’objet de plusieurs études. Elle est utilisée dans la médecine
traditionnelle ivoirienne pour ses propriétés antihypertensives et antidiabétiques (Tra Bi et al.,
2008).
Tridax procumbens est la troisième plante de notre étude. Le paragraphe suivant revèlera
sa description botanique, sa biogéographie, ses études phytochimiques et quelques activités
pharmacologiques.
KONE KOUWELTON PATRICK 42
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 30: Tridax procumbens
III.1. Description botanique
Tridax procumbens porte des marguerites comme des fleurs blanches ou jaunes centrées
sur le jaune avec des fleurs de rayons à trois dents. Les feuilles sont dentées et généralement en
forme de flèche. Son fruit est un aquarium acharné recouvert de poils rigides et d'une plume,
d’un panache comme une aigrette blanche à une extrémité. Le cristallin est représenté par des
écailles ou réduit à aigrette. La plante est envahissante en partie parce qu'elle produit jusqu'à
1500 aquènes par plante, et chaque aquène peut, de par son aigrette, être porté à distance par le
vent. Cette herbe peut être trouvée dans les champs, les prairies, les terres cultivées, les zones
perturbées, les pelouses et les zones de la route comme pour les climats tropicaux (Kumar,
2012).
III.2. Biogéographie
Tridax procumbens est originaire d'Amérique tropicale et naturalisée en Afrique
tropicale, en Asie, en Australie et en Inde. C'est une plante sauvage répartie dans toute l'Inde
(Kumar, 2012).
KONE KOUWELTON PATRICK 43
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
III.3. Propriétés pharmacologiques
L'activité hépatoprotective des parties aériennes de Tridax procumbens est montrée une
protection significative pour atténuer la lésion hépatocellulaire induite par la D-
Galactosamine/Lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) (Mundada et al., 2010). En effet la D-
GalN/LPS est hépatotoxique en raison de sa capacité à détruire les cellules du foie. La nécrose
multifocale produite par D-GalN et la lésion de l'hépatite virale chez l'homme sont similaires.
On sait que cet amino-sucre bloque sélectivement la transcription et la synthèse indirecte de
protéines hépatiques. Elle provoque une hépatite fulminante dans les 8 heures après son
administration (Mundada et al., 2010).
L’extrait à l’éthanol des feuilles de Tridax procumbens ont un effet immunomodulateur
sur des rats Albino (Oladunmoye, 2006). De même, la fraction insoluble dans l'éthanol d'un
extrait aqueux de Tridax procumbens provoque une augmentation significative de l'indice
phagocytaire, du nombre de leucocytes et des cellules sécrétrices d'anticorps spleéniques. La
stimulation de la réponse immunitaire humorale a également été observée avec l'élévation du
titre d'anticorps anti-hémagglutination. La partie aérienne de la plante a un effet à la fois sur le
système immunitaire humoral et cellulaire (Tiwari et al., 2004).
La guérison des plaies implique une interaction complexe entre les cellules
épidermiques et dermiques, la matrice extracellulaire, l'angiogenèse contrôlée et les protéines
dérivées du plasma, toutes coordonnées par une gamme de cytokines et de facteurs de
croissance (Bhat et al., 2007). Tridax procumbens a antagonisé l'antiépithélisation et l'effet
déprimant de la dexaméthasone résistant à la traction (un agent inhibiteur de cicatrisation
connu) sans affecter l'anticontraction et l'action antigranulation de la dexaméthasone. L'extrait
aqueux a également été efficace par augmentation de la lysyl oxydase mais à un degré moindre
que l'extrait de plante entière. L'extrait des feuilles de cette plante favorise également la
cicatrisation des plaies chez les rats normaux et immunodéprimés (stéroïdes) dans un modèle
de cicatrisation des plaies mortes. La plante augmente non seulement la lysyl oxydase, mais
aussi la teneur en protéines et en acides nucléiques dans le tissu de granulation, probablement
en raison de l'augmentation de la teneur en glycosamino glycane (Nia et al., 2003).
Diverses herbes ont été utilisées sous forme de jus pour abaisser le taux de glycémie.
L'extrait hydro alcoolique de feuilles de Tridax procumbens a montré une diminution
significative du taux de glycémie dans le modèle de diabète induit par l'alloxane chez le rat
(Bhagwat et al., 2008).
KONE KOUWELTON PATRICK 44
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
L’extrait aqueux de la plante entière de Tridax procumbens possède des activités
antibactériennes sur diverses espèces de bactéries parmi lesquelles Pseudomonas aeruginosa.
La méthode de diffusion du disque a été utilisée pour tester l'activité antibactérienne. Le jus
frais de plante est appliqué deux fois par jour pendant 3 à 4 jours pour guérir les plaies (Mahato
and Chaudhary, 2005).
L’extrait aqueux des feuilles de Tridax procumbens a un effet hypotenseur. En effet, les
études réalisées sur le rat Sprague-Dawley anesthésié ont montré que cet extrait entraîne des
diminutions significatives de la pression artérielle. Une dose plus élevée de cet extrait a entraîné
une réduction significative de la fréquence cardiaque. (Salahdeen et al., 2004). Les huiles
essentielles des feuilles Tridax procumbens ont été évaluées pour leurs effets de répulsion
topique contre le vecteur paludique Anopheles stephensi (An. Stephensi) dans les cages à
moustiques. Toutes les huiles essentielles ont été testées à trois concentrations différentes (2, 4
et 6%). Parmi celles-ci, les huiles essentielles de Tridax procumbens ont présenté un effet de
répulsion relativement élevé (> 300 minutes à une concentration de 6%) (Rajkumar et al.,
2007). Tridax procumbens a également montré une activité anti-inflammatoire et anti-oxydante
lorsque le dosage de DPPH (2,2-dipényl-1-picrylhydrazylhydrate) et HET-CAM (membrane de
chorioallanthhoïque d'œufs de poule) a été effectué (Nia et al., 2003). Les feuilles de Tridax
procumbens ont été signalée pour leur effet préventif sur la chute des cheveux (Rathi et al.,
2008; Saxena and Albert, 2005).
III.4. Etudes phytochimiques
Le criblage phytochimique de Tridax procumbens a révélé la présence d'alcaloïdes, de
caroténoïdes, de flavonoïdes (catéchines et flavones), de tanins et de saponines. La plante est
riche en sodium, potassium et calcium. La feuille de Tridax procumbens contient
principalement 26% de protéines, 17% de fibre brute, 39% de glucides solubles, 5% d'oxyde de
calcium (Jhample et al., 2015). La lutéoline, la glucolutéoline, la quercétine et l'isoquercétine
ont été isolés dans les fleurs alors que l'acide fumarique, l’acide oléanolique, le β-sitostérol et
un tanin ont également été isolé dans la plante (Christudas et al., 2012). L'acide oléanolique
s'est révélé être un agent antidiabétique potentiel lorsqu'il a été testé contre l’α-glucosidase
(Nisha, 2015).
KONE KOUWELTON PATRICK 45
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Conclusion partielle
Alchornea cordifolia, Phyllanthus amarus et Tridax procumbens contiennent des
métabolites secondaires qui leur confèrent des propriétés biologiques et pharmacologiques. Les
études antérieures réalisées sur ces plantes ont montré qu’elles sont largement utilisées en
médecine traditionnelle. Elles ont également permis d’identifier quelques composés issus de
ces plantes.
KONE KOUWELTON PATRICK 46
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE III: OPTIMISATION ET ANALYSES CHIMIQUES
I. PLAN D’EXPERIENCES ET OPTIMISATION
Introduction
En recherche, l’un des buts ultimes est la compréhension des phénomènes naturels. Si
ce n’est le phénomène le but, sa compréhension aide beaucoup tant dans la reproduction de
celui-ci pour des buts utiles de la vie de tous les jours, pour résoudre des problèmes spécifiques
ou juste pour une meilleure compréhension de la nature. Le plan d’expérience est un outil qui
répond parfaitement à ces questions.
Il s’agira donc dans de définir le plan d’expérience et l’optimisation et d’étayer leurs
différents types.
I.1. Plan d’expériences
I.1.1. Définition
Le plan d'expérience et l'optimisation sont des outils utilisés pour examiner
systématiquement différents types de problèmes qui se posent dans la recherche, le
développement et la production. Il est évident que si les expériences sont effectuées au hasard,
sans planification, le résultat obtenu sera également aléatoire (Lundstedt et al., 1998).
I.1.2 Processus de conception expérimental
Le processus de conception expérimental peut être divisé en trois étapes :
- la planification de l'expérience qui implique la conception statistique des
expériences ;
- la mise en œuvre de l'expérience qui implique un schéma de randomisation et un
blocage possible ;
- et l'analyse et l'interprétation des données recueillies qui utilisent l'analyse
statistique des données (Smith, 2005).
Il est indispensable dans un processus de conception expérimentale de choisir les
conditions à modifier et les réponses à mesurer (Lundstedt et al., 1998).
Il existe plusieurs types de plan d’expérience. Nous attarderons sur les plans
d’expérience matriciels (plans factoriels et plan de plackett et burmann) du fait de leurs
simplicités d’utilisation.
KONE KOUWELTON PATRICK 47
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.1.3. Types de plan d’expérience
I.1.3.1. Plan factoriel
Un plan factoriel complet 2k nécessite toutes les combinaisons de deux versions de
chacune des k variables. Pour une variable continue, les deux versions deviennent le niveau
haut et bas de cette variable. Cependant pour une variable qualitative, les deux versions
correspondent par exemple, parfois à la présence et à l'absence de la variable. Les essais
comprenant la conception expérimentale sont commodément présentés dans l'une ou l'autre de
deux notations comme illustré dans le tableau 2 pour les huit essais comprenant un plan factoriel
23 (Box and Hunter, 1961).
Tableau 2: Expériences pour un plan factoriel 23
Numéro d’expériences Notation 1
Variables ABC
Notation 2
Variables 123
1 1 - - -
2 a + - -
3 b - + -
4 c - - +
5 ab + + -
6 ac + - +
7 bc - + +
8 abc + + +
Dans la notation 1, les variables sont identifiées par des lettres majuscules, et leurs deux
versions par la présence ou l'absence de la lettre minuscule correspondante. Lorsque toutes les
variables sont à leur niveau "bas" ou version, un "1" est utilisé. Dans la notation 2, les variables
sont identifiées par des nombres et les deux versions de chaque variable par un signe moins et
plus, ou par moins et plus un. La conception expérimentale peut ensuite être visualisée
géométriquement. Une exécution est représentée par un point dont les coordonnées sont les
versions -1 pour cette exécution. Par exemple, le plan factoriel 23 fournira les huit sommets
d'un cube dans un système de coordonnées tridimensionnel. La liste des exécutions
KONE KOUWELTON PATRICK 48
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
expérimentales est appelée la matrice de conception et est généralement notée D. Pour un
factoriel 2k, la matrice de conception contient k colonnes et N = 2k lignes. Il y a une colonne
pour chacune des variables k, et chaque ligne donne la combinaison de versions pour chaque
cycle (Box and Hunter, 1961).
I.1.3.2. Plan de Plackett et Burman
Les plans d’expérience de Plackett-Burman ont été élaborés en 1946 en vue de trouver
des modèles expérimentaux pour étudier la dépendance de certaines quantités
d’approvisionnements mesurées sur un certain nombre de variables indépendantes (facteurs).
Chaque valeur prend L niveaux, de manière à minimiser la variance des estimations des
dépendances en utilisant un nombre limité d’expériences (Plackett and Burman, 1946). Les
interactions entre les facteurs ont été considérées comme négligeables. Le modèle expérimental
implique que chaque combinaison de niveaux pour n'importe quelle paire de facteurs apparaît
le même nombre de fois, pendant toutes les expériences (Tableau 3). Une conception factorielle
complète satisferait ce critère, mais l'idée était de trouver des conceptions plus petites
(Anderson and Whitcomb, 2000).
Tableau 3: Exemple de matrice d'expérience pour 7 facteurs de Plackett et Burman
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7
1 + - + - + + -
2 - + - + - + +
3 + - + - + - +
4 + + - + - + -
5 - + + - + - +
6 + - + + - + -
7 - + - + + - +
8 - - - - - - -
Nous utiliserons dans la méthodologie le plan de Plackett et Burman pour les raisons
suivantes :
- la capacité de modélisation du modèle ;
- la détection des paramètres significatifs ;
KONE KOUWELTON PATRICK 49
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
- l’efficience : nombre de tests relativement petit malgré le grand nombre de
paramètres ;
- l’obtention d’un modèle linéaire facile à manipuler.
I.2. Optimisation
I.2.1. Définition
L'optimisation vise à modéliser, à analyser et à résoudre analytiquement ou
numériquement les problèmes consistant à minimiser ou maximiser une fonction sur un
ensemble (Vera Candioti et al., 2014).
Il existe de nombreuses méthodes d’optimisation de modèle, cependant nous décrirons
deux d’entre elles qui sont parmi les plus simples et les plus utilisées dans les modèles linéaires.
I.2.2. Types d’optimisation
Parmi les nombreuses méthodes d’optimisation qui sont liées à la fonction à optimiser,
la méthode de simplex et l’algorithme génétique seront présentées du fait de la récurrence de
leurs utilisations et de leur relative simplicité.
I.2.2.1. Méthode de simplex
La méthode de simplex est un algorithme très utilisée pour la programmation linéaire.
Le nom de l'algorithme est dérivé du concept d'un simplex et a été suggéré par T.S. Motzkin
(Murty, 1983). Les simplex ne sont pas réellement utilisés dans la méthode, mais une
interprétation de celle-ci est qu'elle fonctionne sur des cônes simplex, et ceux-ci deviennent un
simplex avec une contrainte additionnelle (Stone and Tovey, 1991; Strang, 1987). Ces cônes
sont les coins d'un objet géométrique appelé polytope dont la forme est définie par les
contraintes appliquées à la fonction objectif (Ficken, 2015).
I.2.2.2. Algorithme génétique
Un algorithme génétique est une métaheuristique inspirée par le processus de sélection
naturelle qui appartient à la plus grande classe des algorithmes évolutionnaires. Ces algorithmes
sont utilisés pour générer des solutions de haute qualité aux problèmes d'optimisation et de
recherche en s'appuyant sur des opérateurs bio-inspirés tels que la mutation, le croisement et la
sélection (Melanie, 1999).
KONE KOUWELTON PATRICK 50
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Dans un algorithme génétique, une population de solutions candidates (appelées
individus, créatures ou phénotypes) à un problème d'optimisation évolue vers de meilleures
solutions. Chaque solution candidate a un ensemble de propriétés (ses chromosomes ou son
génotype) qui peuvent être mutés et modifiés. Ainsi les solutions sont représentées en binaire
comme des chaînes de 0 et 1, mais d'autres codages sont également possibles (Whitley, 1994).
Dans la méthodologie nous utiliserons la méthode des simplex pour deux raisons : sa
facile accessibilité (car elle peut être réalisée avec Microsoft office Excel) et son adéquation à
l’optimisation des modèles linéaires
II. ANALYSES CHIMIQUES
Dans le but de séparer, d’identifier et de déterminer les structures des molécules,
plusieurs techniques d’analyse sont utilisées. Il s’agira dans cette partie de décrire les théories
qui accompagne des techniques spectrométriques et chromatographiques mises en œuvre dans
cette étude.
II.1. Techniques spectrométriques
II.1.1. Spectrométrie de masse
L'application extensive de la spectroscopie de masse dans la résolution des problèmes
de structures des molécules organiques n'a commencé qu'en 1960. Cette technique est basée sur
le seul principe de la détermination de la masse d'un ion en phase vapeur. Ainsi, un spectromètre
de masse ionise l'échantillon dans un faisceau d'électrons en phase vapeur. Les ions sont séparés
selon leurs rapports masse sur charge (valeurs m/e ou m/z) et leurs spectres de masse sont
enregistrés sous la forme de raies avec leurs abondances relatives (Yadav, 2013).
En réalité, le m/e est obtenu à partir d'un spectre de masse, mais pour des raisons
pratiques, il est égal à la masse m de l'ion, car les ions multichargés sont beaucoup moins
abondants que ceux avec une seule charge (e ou z = 1). La spectroscopie de masse est utile en
analyses chimiques car elle peut :
- donner les masses moléculaires exactes ;
- montrer la présence de certaines unités structurales et leurs points d'attachement
dans la molécule ;
- donner une idée de la structure de la molécule (Yadav, 2013).
KONE KOUWELTON PATRICK 51
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II.1.1.1. Méthodes d'ionisation
Les méthodes d'ionisation les plus importantes sont :
- l'impact électronique dans laquelle l'échantillon est bombardé en phase vapeur avec
un faisceau d'électrons à haute énergie (70 eV) ;
- l'ionisation chimique dans laquelle l'échantillon est introduit dans la chambre
d'ionisation à la pression atmosphérique avec un excès d'une substance intermédiaire
(méthane, isobutane ou ammoniac) également appelé gaz porteur.
II.1.1.2. Ions moléculaires et fragments par impact électronique
Le bombardement avec un faisceau d'électrons à haute énergie (70 eV) arrache l'électron
ayant le plus petit potentiel d'ionisation dans la molécule pour donner l'ion moléculaire ou ion
parent M+ en phase vapeur. L'ion moléculaire donne la masse moléculaire de l'échantillon car
la masse de l'électron perdue de la molécule est négligeable.
L'ordre de l'énergie nécessaire pour éliminer un électron d'une molécule pour donner
l'ion moléculaire est : Paire d’électrons < liaison π conjugué < liaison π non conjugué < liaison
σ (Jensen and Gross, 1987; Thompson, 2018).
Dans les alcanes, l'élimination d'un électron à partir de liaisons C-C est plus simple que
celle des liaisons C-H. L'énergie requise pour éliminer un électron à partir de molécules
organiques neutres est d'environ 10-12 eV. En pratique, on utilise une énergie beaucoup plus
élevée (70 eV) qui provoque une fragmentation supplémentaire de l'ion moléculaire résultant
en un fragment d'autres ions filles (Jensen and Gross, 1987).
II.1.1.3. Spectre de masse et pic de base
Le spectre de masse d'un composé est représenté graphiquement en traçant les valeurs
m/e des divers ions (ions moléculaires et ions fragments) par rapport à leurs abondances
relatives. Parfois, le pic de l'ion moléculaire lui-même peut être le pic de base. Généralement,
les spectres de masse sont représentés sous la forme d'un graphique à barres (Loudon and
Maccoll, 1970).
II.1.1.4. Reconnaissance de l'ion moléculaire (parent), pic et détection des isotopes
La reconnaissance du pic de l'ion moléculaire M+ (pic parent) dans le spectre de masse
d'un composé organique est très importante car elle donne la masse moléculaire du composé.
Le pic d'ion moléculaire est le pic du nombre de masse le plus élevé à l'exception des pics
KONE KOUWELTON PATRICK 52
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
isotopiques aux nombres de masse M+1, M+2 etc. (M = masse de l'ion moléculaire). Les pics
isotopiques (satellites) apparaissent en raison de la présence d'un certain nombre de molécules
contenant des isotopes plus lourds que les isotopes communs. Puisque l'abondance naturelle
des isotopes plus lourds est généralement beaucoup plus faible que celle de l'isotope le plus
léger, les intensités des pics isotopiques sont très faibles par rapport au pic parent. Cependant,
pour les composés contenant du chlore, du brome ou du soufre, les pics isotopiques sont
importants. Le pic isotopique M+2 dû à la présence d'un atome de chlore ou d'un atome de brome
est respectivement de 33% et 50% du pic de l'ion moléculaire. Ainsi, dans un composé chloré
ou bromé, le rapport d'intensité des pics M+ et M+2 sera respectivement de 3 : 1 ou 1 : 1. Cela
est dû à l'abondance naturelle de 37,6% de l’isotope 37Cl par rapport à 75,4% de l’isotope 35Cl
et à une abondance presque égale des isotopes 79Br et 81Br (Thompson, 2018).
II.1.1.5. Application de la spectroscopie de masse
La spectroscopie de masse est devenue au fil du temps un outil incontournable dans la
chimie organique des substances naturelles. Elle est d’une grande utilité dans la détermination
des structures moléculaires. Elle est très souvent couplée à une technique de chromatographie.
Comme exemple le couplage entre la chromatographie capillaire en phase liquide et la
spectroscopie de masse a permis de dresser le profil de métabolites secondaire d’Arabidopsis
(Von Roepenack-Lahaye et al., 2004) ; la spectrométrie de masse a été utilisée aussi dans
l’identification des flavonoïdes glycosilés (Stobiecki, 2000) ; elle a aussi été utilisé dans la mise
en place d’une base de données de métabolome de la tomate en couplage avec la
chromatographie liquide (Moco et al., 2006).
II.1.1.6. Identification des métabolites secondaires par les ions parents issus de la
fragmentation par spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse, très souvent couplée à la chromatographie en phase gazeuse,
est utilisée pour identifier les molécules. Plusieurs travaux ont permis de donner des approches
de coupures de molécules comme des flavonoïdes (Hvattum and Ekeberg, 2003; Justesen, 2001;
Stobiecki, 2000), les alcaloïdes (Takáts et al., 2004) et les terpènes et terpénoides (Bursey et
al., 1973; Dass and Stout, 1993; Jensen and Gross, 1987; Korfmacher, 2013; Loudon and
Maccoll, 1970; Sastia and Eiichiro, 2015).
Les figures 29 à 33 résument des exemples de coupures des plus souvent rencontrées
dans les différentes familles de métabolites secondaires.
KONE KOUWELTON PATRICK 53
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 31: Voies de fragmentation de l'acacétine (1) et de la 4,5-dihydroxy-7-
méthoxyflavone (2) (Justesen, 2001).
KONE KOUWELTON PATRICK 54
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 32: Voies de fragmentation de la diosmétine (3) (Justesen, 2001).
KONE KOUWELTON PATRICK 55
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 33: Voies de fragmentation de l'isorhamnétine (Justesen, 2001)
Figure 34: Proposition de dissociation induite par collision de la quercitrine déprotonée
en l'aglycone radicalaire et en ions du produit aglycone (Hvattum and Ekeberg, 2003).
KONE KOUWELTON PATRICK 56
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 35: Spectre des ions filles produits par activation collisionnelle de l'ion (M - H)
- de l'acide palmitique-7,7,8,8-d4 (Jensen and Gross, 1987)
Le modèle de base de décomposition, décrit dans les figures 29 à 33, a été énoncé par
Domon et Constello en 1988. La figure 34 résume les différentes voies de coupure d’un
flavonoïde glycosylé (Domon and Costello, 1988).
KONE KOUWELTON PATRICK 57
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 36: Résumé des potentiels coupures par spectrométrie de masse d'un flavonoïde
glycosylé (Domon and Costello, 1988)
Parmi les flavonoïdes, la fragmentation des chalcones et hydrochalcones par
spectrométrie de masse a été beaucoup étudié. Les travaux de Van de Sande vont dans ce sens.
Les figures 35 et 36 montrent d’abord une isomérisation possible des chalcones en flavanone
par ionisation de spectromètre de masse, puis un essai de mécanisme des différentes voies de
fragmentation de chalcones (Van de Sande et al., 1972).
Figure 37: Mécanisme possible d’isomérisation entre le 2’-hydrochalcone en flavanone
(Van de Sande et al., 1972)
KONE KOUWELTON PATRICK 58
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 38: Schéma de fragmentation du squelette chalcone par spectrométrie de masse
proposé par Van de Sande et al. (1972)
Ces auteurs ont aussi donné un essai de mécanisme de fragmentation des flavanones,
donnant ainsi les liaisons les plus susceptibles de se rompre et les fragments susceptibles de se
former. La figure 37 montre un essai de mécanisme de fragmentation du noyau des flavanones.
Figure 39: Schéma de fragmentation du squelette flavanone par spectrométrie de masse
proposé par Van de Sande et al. (1972)
KONE KOUWELTON PATRICK 59
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Nowakowska (2004) a donné une autre voie de décomposition des chalcones substitués
sur le cycle B. Ceci est détaillé dans la figure 38.
Figure 40: Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B
(Nowakowska, 2004)
La fragmentation des molécules en spectrométrie de masse dépend aussi du type
d’ionisation du spectromètre. Les figures suivantes résument les différentes fragmentations
possibles pour le noyau d’un flavonoïde en fonction du mode ionisation (positif ou négatif).
Les figures 39 (ionisation en mode négatif, chromatographie liquide) et 40 (ionisation en mode
positif, chromatographie liquide) décrivent ces fragmentations pour une meilleure
compréhension. La nomenclature adoptée est celle de Ma et Dougherty (Ma and Dougherty,
1997). Les notations i,jA- et i,jB- sont utilisées pour désigner les ions produits contenant les
cycles, respectivement A et B et les notations i j concernent les liaisons qui ont été scindées.
Figure 41: Nomenclature simplifiée pour désigner les fragments flavonoïdes
(flavanone) en mode négatif (Portet et al., 2008)
KONE KOUWELTON PATRICK 60
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 42: Nomenclature simplifiée des voies de fragmentation des flavonoïdes en
mode positif (Wolfender et al., 2000)
KONE KOUWELTON PATRICK 61
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II.1.2. Spectrométrie infrarouge
II.1.2.1. Théorie de la spectroscopie infrarouge
La spectroscopie infrarouge traite de l'enregistrement de l'absorption des rayonnements
dans la région infrarouge du spectre électromagnétique. La position d'une absorption infrarouge
donnée est exprimée en termes de longueur d'onde (en micron µ) ou plus communément en
termes de nombre d'onde ν en cm-1 puisqu'il est directement proportionnel à l'énergie. La région
infrarouge ordinaire 2,5 -15 µ (4000-667 cm-1) est la plus pratique pour les organiciens. La
région 0,8 -2,5 µ (12500 - 4000 cm-1) s'appelle proche infrarouge et la région 15-200 µ (667-
50 cm-1) s’appelle l'infrarouge lointain. L'absorption du rayonnement infrarouge par une
molécule se produit en raison des changements d'énergie vibratoires et rotatifs quantifiés
lorsqu'ils sont soumis à une irradiation infrarouge. Ainsi, les spectres IR sont souvent appelés
spectres de rotation vibratoire. Les différentes bandes observées dans un spectre IR
correspondent à divers groupes fonctionnels et des liaisons présentes dans la molécule. Ainsi,
la spectroscopie infrarouge est largement utilisée pour la détection de groupes fonctionnels et
l'identification de composés organiques (Yadav, 2013).
II.1.2.2. Région d'empreinte digitale
Il n'est pas possible pour deux composés différents (excepté les énantiomères) d'avoir
exactement le même spectre IR. Par conséquent, le spectre infrarouge d'un composé est appelé
son empreinte digitale. La région située au-dessous de 1500 cm-1 est appelée région d'empreinte
digitale car chaque composé possède un motif d'absorption unique dans cette région. Cette
région contient de nombreuses bandes d'absorption causées par des vibrations de flexion telles
que les bandes d'absorption causées par les liaisons carbone-carbone, carbone-oxygène (C-C,
C-0) comme dans les alcools, les éthers, les esters, et la liaison carbone-azote (C-N) comme
dans les amines, les acides aminés, les amides (Yadav, 2013).
II.1.2.3. Applications de la spectroscopie infrarouge
La spectroscopie IR est une méthode utilisée pour la détermination de la structure des
composés organiques. En effet, les vibrations moléculaires dépendent des distances
interatomiques, des angles de liaison et des forces de liaison plutôt que des propriétés en vrac
du composé. Ainsi, la spectroscopie infrarouge est utilisée en chimie organique pour la
KONE KOUWELTON PATRICK 62
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
détection des groupes fonctionnels, la confirmation de l’identité des composés et le suivi des
réactions.
a. Détection des groupes fonctionnels
Tous les groupes fonctionnels absorbent dans une région de fréquence définie. Ainsi, la
présence ou l'absence d'une bande dans une région de fréquence définie montre la présence ou
l'absence d'un groupe fonctionnel particulier dans le composé.
b. Confirmation de l'identité des composés
L'identité d'un composé est souvent établie en comparant son spectre IR à celui d'un
échantillon authentique. Si les spectres IR, enregistrés dans les mêmes conditions, sont
superposables, ils représentent le même composé. Le nombre de bandes, surtout dans la région
de l'empreinte digitale, est très utile pour l'identification. Les spectres infrarouges d'échantillons
impurs sont habituellement flous et ont de nombreuses bandes qui ne peuvent pas être
interprétées alors qu'un composé pur donne un spectre IR clair.
c. Suivi des réactions
La progression d'une réaction organique peut être suivie à l’aide d’une spectroscopie IR.
Ceci se fait en examinant les spectres IR des portions du mélange réactionnel prélevés à certains
intervalles de temps.
II.1.2.4. Interprétation des spectres infrarouges
Il n'y a pas de règles définies pour interpréter les spectres IR. Les chimistes organiciens
interprètent généralement les spectres IR en inspectant et en comparant la position, l'intensité
et la forme des bandes avec des données de référence disponibles dans les tableaux des
fréquences de groupes caractéristiques. La figure 41 présente un modèle de spectre infrarouge
du N-méthylaniline (Cozzolino, 2009).
KONE KOUWELTON PATRICK 63
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 43: Exemple de spectre infrarouge de la N-méthylaniline (Cozzolino, 2009)
II.1.3. Spectroscopie ultraviolette
II.1.3.1. Théorie
La spectroscopie UV (ultraviolet) visible est une technique de caractérisation de
molécules. En effet, elle est basée sur la capacité des composés à absorber un faisceau lumineux
(Yadav, 2013).
A chaque fonction organique correspond une plage d’absorption de rayonnement
lumineux dans le spectre UV-visible. L’intensité de l’absorption est aussi fonction de la nature
de liaisons chimiques (liaison σ ou π …) dans les molécules (Stem and Timmons, 1970).
II.1.3.2. Application
La spectroscopie UV-visible permet également de déterminer la concentration d’une
famille de molécules dans un extrait tels que le dosage des anthocyanes, polyphénol totaux,
flavonoïdes totaux (Giusti and Wrolstad, 2001).
KONE KOUWELTON PATRICK 64
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II.2. Techniques chromatographiques
La chromatographie englobe une série de techniques qui ont en commun la séparation
des composants d'un mélange. L’échantillon à séparer est entrainé par un courant de phase
mobile (gaz ou liquide) le long d’une phase stationnaire (papier ou silice…). La
chromatographie analytique est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d’un
mélange. La chromatographie préparative est utilisée pour séparer ou purifier les composantes
d’un mélange (Giddings, 2002).
Le mélange à séparer et analyser peut être un gaz, un liquide ou un solide. Le résultat
de cette interaction est la distribution différente des composants de l'échantillon entre les deux
phases, entraînant la séparation du composant de l'échantillon en zones ou bandes. Le principe
qui régit la séparation chromatographique constitue le fondement de la plupart des méthodes
physiques de séparation, par exemple la distillation et l'extraction liquide-liquide (Grob, 2004;
Waksmundzka-Hajnos et al., 2008).
La séparation des composants de l'échantillon peut être réalisée par les techniques
suivantes : Chromatographie sur Couche Mince (CCM), chromatographie sur couche mince
haute précision (HPTLC), chromatographie liquide haute pression (HPLC) et chromatographie
en phase gazeuse (GC). Dans cette partie, nous aborderons la CCM, la HPTLC, la GC et la
HPLC.
II.2.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC)
Une nouvelle approche de détermination analytique de substances naturelles a été mise
au point avec la HPTLC (Nicoletti et al., 2012). La chromatographie sur couche mince à haute
performance (HPTLC) est très utilisée dans les analyses qualitatives (Stahl, 1956). Avec le
développement de couches pré-revêtues modernes et l'introduction d'équipements partiellement
ou totalement automatisés des analyses quantitatives très précises sont maintenant possibles
(Hahn-Deinstrop, 2007).
La HPTLC est largement utilisée pour l'analyse qualitative de composés organiques,
l'isolement des composés purs à partir de mélanges à plusieurs composants. De nombreux types
de plaques pré-revêtues de CCM et de HPTLC sont commercialisés, par exemple celles avec
des couches d'adsorbant inorganiques (silice ou gel de silice et alumine) et organiques
(polyamide, cellulose), polaires liées de manière covalente, (diol, cyanopropyle et
KONE KOUWELTON PATRICK 65
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
aminopropyle) et non polaires (RP2, RP8, RP18). Les adsorbants appliqués en HPTLC ont des
caractéristiques de surface différentes et, par conséquent, des propriétés physicochimiques
différentes. De plus, il existe un large choix de phases mobiles qui peuvent être utilisées pour
séparer les composants du mélange. Celles-ci ont des propriétés différentes en tant que donneurs
de protons, accepteurs de protons et dipôles. En HPTLC, l'absorption ultraviolette (UV) des
solvants de la phase mobile n’influence pas la détection et la quantification des analytes, car la
phase mobile est évaporée avant la détection. La viscosité élevée d'un solvant peut être
considérée comme une propriété unique limitant son choix en tant qu’éluant. La multitude de
types des phases mobiles et fixes donne une abondance de combinaison possible rendant la
technique personnalisable aux mélanges complexes d’extraits de plantes.
La HPTLC est également une technique simple pour effectuer des séparations
bidimensionnelles. Un seul échantillon est appliqué dans le coin d'une plaque, et la couche est
développée dans la première direction avec la phase mobile 1. La phase mobile est séchée par
évaporation, et la plaque est ensuite développée avec la phase mobile 2 à un angle droit
(perpendiculaire ou direction orthogonale) ; la phase mobile 2 a des caractéristiques de
sélectivité différentes par rapport à la phase mobile 1. De cette manière, une séparation
complète peut être obtenue de mélanges très complexes tels que les extraits végétaux sur toute
la surface de la couche (Waksmundzka-Hajnos et al., 2008).
L’une des caractéristiques très utile dans l’interprétation d’un chromatogramme HPTLC
est la référence frontale. La référence frontale est le rapport entre le front de solvant, (distance
parcourue par l’éluant de la ligne de dépôt jusqu’à la ligne d’arrêt de l’élution), et le front de la
tâche (distance entre la tâche du composé et la ligne de dépôt). De part cette définition, la
référence frontale est comprise entre 0 et 1. Elle dépend des conditions expérimentales (nature
de la phase fixe et de la phase mobile). Lorsque les conditions expérimentales sont conservées,
la référence frontale est une caractéristique du composé et peut être utilisée pour identifier un
composé en fonction d’un standard (Litvinova, 2006).
La HPTLC est utilisé pour réaliser l’identification de métabolites secondaires. En effet,
elle est souvent couplée avec la spectrométrie de masse et UV dans l’identification de
métabolites secondaires des éponges marines (Klöppel et al., 2008). L’identification et la
quantification de composés dans des poches de perfusion pour de la chimiothérapie a été réalisé
en utilisant une HPTLC (Paci et al., 2003). Elle sert aussi à réaliser les études phytochimiques
sur les terpénoïdes des plantes médicinales (Yamunadevi et al., 2011).
KONE KOUWELTON PATRICK 66
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II.2.2. Chromatographie en phase liquide à haute performance
II.2.2.1. Théorie de la technique
La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est la plus puissante de toutes
les techniques chromatographiques.
La chromatographie en phase liquide à haute performance est une technique qui découle
de l'application à la chromatographie liquide (LC) des théories et de l'instrumentation
développées à l'origine pour la chromatographie en phase gazeuse (GC) (Sandy, 1991). La
chromatographie en phase liquide à haute performance base sa technique sur la pression de la
phase mobile (l’éluant). Elle se différencie de la chromatographie sur colonne du fait que
l’élution se fait par une pompe qui confère une forte pression agisssant sur la séparation des
composés (Snyder et al., 2011).
II.2.2.2. Application de la technique
La HPLC est une méthode qui a beaucoup d’application surtout au niveau de la chimie
des substances naturelles. En effet, elle est utilisée dans la séparation ou l’identification de
composés. Elle est souvent couplée avec la spectrométrie de masse ou la spectrométrie UV-
visible.
La HPLC est également utilisée pour l’identification, la séparation et la quantification
de certaines familles de molécules dans les extraits de plantes (Bobzin et al., 2000; Chandra et
al., 2001).
II.2.3. Chromatographie en phase gazeuse
II.2.3.1. Théorie de la méthode
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique de séparation de
molécules, basée sur une phase mobile gazeuse. La substance à analyser doit être vaporisable
pour être entrainée par le gaz vecteur (Grob, 2004).
II.2.3.2. Application de la CPG
La CPG est utilisée dans la plupart des cas en couplage avec la spectroscopie de masse
dans l’identification des composés organiques. Elle reste une technique de choix dans
l’identification car elle ne nécessite pas une séparation préalable de l’extrait. Cependant, les
KONE KOUWELTON PATRICK 67
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
extraits polaires nécessitent un prétraitement, à savoir des dérivations (méthylation ou
silylation) (Christie, 1998).
Un exemple courant est la détermination des structures des acides gras (lipides) par des
méthodes utilisant un couplage chromatographie en phase gazeuse et la spectroscopie de masse
(Christie, 1998). Ce couplage est aussi utilisé pour le suivi des réactions, et pour l’oxydation de
l’Acide Désoxyribo Nucléique (Dizdaroglu, 1994). La CPG peut aussi être couplée avec un
détecteur UV dans le but d’analyser une famille de métabolites bien précise comme l’analyse
de terpènes (Qiu et al., 2017).
Conclusion partielle
. Les techniques analytiques permettent de connaitre la nature et les propriétés des
substances chimiques. Elles sont utilisées pour l’identification, la séparation et la quantification
de certaines familles de molécules dans les extraits de plantes. Les plans d’expériences sont des
outils puissants de modélisation et d’optimisation qui permettent de cerner la relation entre des
phénomènes.
68
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
PARTIE 2 : METHODOLOGIE
KONE KOUWELTON PATRICK 69
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE I: ANALYSES PHYTOCHIMIQUES
I. BIBLIOMETRIE
La bibliométrie peut être définie comme « l’application des mathématiques et des
méthodes statistiques aux livres, articles et autres moyens de communication » (Pritchard,
1969). Elle est utilisée pour constater de l’état d’avancement de la recherche dans une
thématique bien définie. Dans notre cas, en substances naturelles, les thématiques concernent
soit des familles de molécules ou des substances bien définies, soit une plante source de
métabolites secondaires. Nos travaux s’orientent dans le deuxième cas de figure à savoir une
bibliométrie s’accentuant sur les différentes plantes soumises à notre étude.
La bibliométrie sur une thématique donnée (dans notre cas les il s’agit des trois plantes
soumises à notre étude) a été effectuée avec la plate-forme internet SCIFINDER qui répertorie
toutes les formes de publication traitant de la thématique à traiter. Sur ce site, les données
correspondant aux nombres de publications par années, le nombre de publications par auteur,
et le nombre de publication par type de publication ont été exporté vers la suite Excel du logiciel
Microsoft Office. Un traitement statistique des données est effectué et consiste dans la
réalisation de graphes en bâtons. Les graphes sont utilisés pour observés l’évolution dans le
temps de l’intérêt scientifique ainsi que le type de publication produit indiquant sur l’utilisation
technique des résultats (brevet).
II. RECOLTE DES ORGANES VEGETAUX
La récolte des différents organes des trois plantes a été effectuée dans une forêt claire
au sein de l’Institut National Polytechnique Félix HOUPHOUËT BOIGNY de Yamoussoukro
(INP-HB) de coordonnées 6°53’04.7’’Nord et 5°13’54.9’’ Ouest. Les organes ont été identifiés
par M. Amani N’Guessan, botaniste à l’INP-HB.
Pour Alchornea cordifolia il s’agit des feuilles, pour Tridax procumbens, les fleurs et
les feuilles ont été récoltées, pour Phyllanthus amarus, la plante entière a été utilisée. Les
différents organes ont été choisi en fonction de leurs utilisations (Tra Bi et al., 2008).
KONE KOUWELTON PATRICK 70
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
III. EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT DES METABOLITES
SECONDAIRES
III.1. Extraction des métabolites secondaires
L’extraction des métabolites secondaire se fait par macération dans l’objectif de réduire
la dégradation des molécules présentes dans nos plantes. Le solvant utilisé est composé de 30%
d’eau distillée et de 70% d’éthanol absolu. Pour chaque, plante le broyat est macéré dans le
solvant hydro-éthanolique avec un ratio masse/volume de solvant (1/10). La durée de
macération est de 24 heures et la vitesse d’agitation est de 600 rpm. Une fois la macération
terminée, le mélange est filtré sur papier Wattman et concentrée avec un évaporateur rotatif.
L’extrait obtenu après élimination du solvant constituera la matière première pour les
fractionnements.
III.2. Fractionnement de l’extrait hydro-éthanolique
L’extrait hydro-éthanolique obtenu a subi un fractionnement par une succession de
séparation liquide-liquide. Les solvants ont été choisis en fonction de leurs polarités : l’hexane,
le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle et le butanol. Les séparations se font de façon successive
comme le montre le schéma 1 : l’extrait est dissout dans de l’eau et une séparation liquide-
liquide est effectuée avec chaque solvant. On obtient à la fin de l’opération cinq fractions : la
fraction à l’hexane, la fraction au dichlorométhane, la fraction à l’acétate d’éthyle, la fraction
au butanol et la fraction résidu aqueux.
KONE KOUWELTON PATRICK 71
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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Schéma 1: Fractionnement de l'extrait hydro-éthanolique
IV. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
Le criblage a été réalisé suivant les différents tests tirés des travaux de Houghton sur le
criblage phytochimique des familles de métabolites secondaires (Houghton, 1995). Tous les
réactifs de pureté analytique ont été achetés chez across, Lancaster ou Merck et ont été utlisés
sans autre purification. Les solvants ont été acheté chez Polychimie et ACI. Ceux de pureté ont
été directement utilisés alors que les autres ont été purifiés par distillation avant leur utilisation.
Le choix de ces familles criblées se justifie par le fait que la majorité des propriétés
biologiques des plantes leur sont attribuées. Par exemple, les alcaloïdes ont des propriétés
d’anesthésie locale, les tanins sont des cicatrisant, antibactérien, antiseptique, les flavonoïdes
présentent des propriétés anti inflammatoire et antibactérienne. Les saponosides possèdent des
propriétés anti inflammatoire, anti œdémateuse et analgésique, les terpènes et stéroïdes sont
analgésique, anti inflammatoire et les dérivés quinoniques sont antibactériens (Bruneton, 1999).
La majorité des études réalisées sur Tridax procumbens concernent les activités
biologiques. L’extrait hydroalcoolique est celui qui donne généralement les meilleurs résultats
(Dhanabalan, 2008; Salahdeen et al., 2004). C’est pour ces raisons qu’il nous paraissait
important de voir le profil chimique de cet extrait. Les extraits hydroalcooliques des organes de
Extrait hydro-éthanolique
Extrait à l'Hexane Marc 1
Extrait au dichlorométhane
Marc 2
Extrait à l'acétate d'éthyle
Marc 3
Extrait au butanol Marc 4
Fraction résidu aqueux
Marc 5
KONE KOUWELTON PATRICK 72
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus ayant fait l’objet de criblages phytochimiques
dans plusieurs études de la littérature, il nous est apparu inutile de reprendre ces criblages.
IV.1. Test de détection des stérols et terpènes par la réaction de Lieberman et
Bürchard
IV.1.1. Sur le broyat
Une masse de 1g de broyat de l’organe végétal est macéré dans 20 mL d’hexane pendant
24h. L’extrait est filtré trois fois sur du coton puis une fois sur du papier Wattman. L’extrait à
l’hexane obtenu est complété à 20 mL.
Dans une capsule, 10mL d’extrait hexanique sont évaporés à sec et repris dans un tube
avec un mélange de 1 mL d’anhydride acétique et 1 mL de chloroforme. Un volume de 1 à 2
mL d’acide sulfurique est ajouté avec précaution dans le tube contenant l’extrait. En cas de
réaction positive, il se forme un anneau rouge-brunâtre ou violet à la zone de contact des deux
liquides.
IV.1.2. Sur les extraits
Un volume de 5 mL de la solution à analyser est évaporé à sec dans une capsule sur un
bain de sable. Le résidu obtenu est dissout à chaud dans 1 mL d’anhydride acétique puis
transvasé dans un tube à essais auquel est ajouté 0,5 mL d’acide sulfurique concentré avec
précaaution. La réaction est positive, s’il y a apparition d’un anneau pourpre ou violet virant au
bleu puis au vert.
IV.2. Test de détection des polyphénols
IV.2.1. Sur le broyat
Dans un tube à essais contenant 5 mL d’infusé à 5% (5g de broyat dans 100 mL d’eau
bouillante), est ajouté 1 mL d’une solution aqueuse diluée de trichlorure de fer (FeCl3) à 1%.
En présence de composés polyphénoliques, il se développe une coloration verdâtre ou bleu
noirâtre.
IV.2.2. Sur les extraits
Une goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique 2% est ajoutée à 2 mL d’extrait.
L’apparition d’une coloration bleue noirâtre ou verte plus ou moins foncée traduit la présence
de composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 73
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV.3. Test de détection des flavonoïdes par la réaction à la cyanidine
IV.3.1. Sur le broyat
Dans un tube à essais contenant 5 mL d’infusé à 5% sont ajoutés 5 mL d’alcool
chlorhydrique (mélange de même volume de l’alcool à 95°, de l’eau distillée et de l’acide
chlorhydrique concentré), 1 mL d’alcool isoamylique puis quelques copeaux de magnésium.
L’apparition d’une coloration rose-orangée (flavones) ou rose-violacée (flavanones) ou rouge
(flavonones, flavanonols) rassemblée dans la couche surnageante d’alcool isoamylique indique
la présence d’un flavonoïde libre (génine). Les colorations sont moins intenses avec les
hétérosides flavoniques.
IV.3.2. Sur les extraits
Deux (2) mL d’extrait sont évaporés. Après refroidissement, le résidu est repris par 5
mL d’alcool chlorhydrique dilué deux fois dans un tube à essais. On y ajoute 2 à 3 copeaux de
magnésium. L’addition de 3 gouttes d’alcool isoamylique intensifiant une coloration orange ou
violacée, indique la présence de flavonoïdes.
IV.4. Test de détection des leucoanthocyanes
Les leucoanthocyanes sont caractérisées par la réaction à la cyanidine sans ajout de
copeaux de magnésium avec un chauffage pendant 15 min au bain-marie. En présence de
leucoanthocyanes, il se développe une coloration rouge-cerise ou violacée. Quant aux catéchols,
elles donnent une teinte brun-rouge.
IV.5. Test de détection des anthocyanes
A 5 mL d’infusé à 5% présentant une coloration plus ou moins foncée, sont ajoutés 5
mL d’acide sulfurique puis 5 mL d’hydroxyde d’ammonium. Si la coloration s’accentue par
acidification puis vire au bleu-violacée en milieu basique, on peut conclure la présence
d’anthocyanes.
IV.6. Tests de détection des tanins
IV.6.1. Tanins catéchiques
Un (1) millilitre de solution d’alcool chlorhydrique (mélange de 5 mL d’alcool, 5 mL
d’eau distillée, 5 mL d’acide chlorhydrique concentré) est ajouté à 5 mL d’infusé. La solution
obtenue est ensuite portée à ébullition pendant 15 minutes. La formation de précipité rouge
soluble dans l’alcool amylique indique la présence de tanins catéchiques.
KONE KOUWELTON PATRICK 74
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV.6.2. Tanins galliques
Quinze (15) millilitres de réactif de Stiany (mélange de 10 mL de formaldéhyde à 40%
et 15 mL d’acide chlorhydrique concentré) sont ajoutés à 30 mL d’infusé. La solution obtenue
est portée à ébullition pendant 15 min au bain marie. La formation d’un précipité révèle la
présence de tanins galliques. La solution est filtrée et le filtrat est saturé par l’acétate de sodium,
puis quelques gouttes d’une solution de chlorure ferrique à 1% y sont ajoutées. Il apparaît une
coloration bleu-noire qui indique la présence de tanins galliques non précipités par le réactif de
Stiany.
IV.7. Tests de détection des alcaloïdes
IV.7.1. Sur le broyat
Dix (10) grammes de poudre végétale sont ajoutés à 50 mL d’une solution d’acide
sulfurique diluée au 1/10. Le mélange est agité et macéré pendant 24 heures à la température
ambiante du laboratoire puis filtré sur papier Whatmann. Dans 2 tubes à essais contenant chacun
1 mL de filtrat sont respectivement ajoutées 5 gouttes de réactifs de Mayer et de Dragendorff.
La présence d’alcaloïdes est révélée par l’apparition de précipité.
IV.7.2. Sur les extraits
Le résidu obtenu à partir de 6 mL d’extrait évaporé est repris dans 6 mL d’alcool à 60°
(degré alcoolique). La solution alcoolique ainsi obtenue est repartie dans 2 tubes à essais. Dans
le premier tube, sont ajoutées 2 gouttes de réactifs de Dragendorff. L’apparition d’un précipité
ou d’une coloration orange indique la présence d’alcaloïdes. Dans le deuxième tube, sont
ajoutées 2 gouttes de réactif de Mayer. L’apparition de coloration brune-rougeâtre indique une
présence d’alcaloïdes.
IV.8. Test de détection des saponosides
Une masse de 1 g de poudre végétale est introduite dans un erlenmeyer de 250 mL. Un
volume de 100 mL d’eau distillée est ajouté et le mélange est légèrement chauffé. Après
filtration et refroidissement, le mélange est complété à 100 mL avec de l’eau distillée qui
constitue le filtrat. Dans un tube à essais, 20 mL du filtrat sont introduits et agités
vigoureusement pendant 15 secondes, et le tube est placé verticalement pendant 15 minutes. Au
bout de cette période, si la mousse persiste alors la drogue végétale contient des saponines.
KONE KOUWELTON PATRICK 75
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV.9. Test de détection des quinones et anthraquinones
IV.9.1. Sur les broyats
Un (1) gramme de broyat est placé dans un tube avec 15 à 30 mL d’éther de pétrole.
Après 10 minutes d’agitation et un repos de 24 h, l’extrait est filtré et concentré à l’étuve. La
présence de quinones libres est confirmée quand la phase aqueuse vire au jaune, rouge ou violet,
lorsque l’on ajoute à l’extrait quelques gouttes de soude à 1/10 sur les extraits.
À 5 mL au l’extrait chloroforme des broyats, sont ajoutés 5 mL d’une solution aqueuse
d’hydroxyde de potassium à 10 % (v/v). Après agitation, la présence des anthraquinones est
confirmée par un virage de la phase aqueuse au rouge.
IV.9.2. Sur les extraits
Le réactif de Borntraeger (Ammonique dilué 2 fois), est utilisé pour mettre en évidence
des substances quinoniques.
Un volume de 2 mL d’extrait est évaporé à sec. Le résidu est repris avec 5 mL d’une
solution d’acide chlorhydrique dilué au 1/5, puis chauffé jusqu’à l’ébullition pendant 30
minutes au Bain-Marie dans un tube à essais. Après refroidissement sous courant d’eau froide,
l’hydrolysat est extrait avec 20 mL de chloroforme dans un tube à essais. A la phase organique
recueillie, est ajouté 0,5 mL d’ammoniaque dilué 2 fois. Le virage de la coloration au rouge ou
violet, indique la présence de composés quinoniques.
IV.10. Test de détection des coumarines
Un volume de 5 mL d’extrait à l’éther obtenu après une macération de 24 heures est
évaporé à l’air libre, puis repris avec 2 mL d’eau distillée chaude. La solution est partagée entre
deux tubes à essai. La présence de coumarines est testée après ajout dans l’un des tubes de 0,5
mL de solution d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) à 25% et observation de la fluorescence
sous une lampe UV à 366 nm. Une fluorescence bleue intense dans le tube où l’ammoniaque a
été ajoutée indique la présence de coumarines.
IV.11. Test de détection des anthraquinones combinés
Les anthraquinones combinées sont mises en évidence selon leur nature.
KONE KOUWELTON PATRICK 76
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV.11.1. Test de détection des O-hétérosides
Un hydrolysat est préparé à partir du résidu du broyat épuisé par le chloroforme. Des
volumes de 10 mL d’eau et de 1 mL d’acide chlorhydrique concentré y sont ajoutés et le tube
à essai est maintenu au bain-marie bouillant pendant 15 minutes. Un volume de 5 mL de
l’hydrolysat est agité avec 5 mL de chloroforme. A la phase organique, est ajoutée 1 mL de la
solution d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) diluée. Une coloration rouge plus ou moins
intense indique la présence de génines d’O-hétérosides.
IV.11.2. Test de détection des C-hétérosides
La solution à analyser est la phase aqueuse obtenue avec la solution à analyser des O-
hétérosides. A cette solution sont ajoutés 10 mL d’eau distillée et 1 mL de solution de FeCl3 à
1%. La solution est chauffée au bain-marie pendant 30 minutes. Elle est refroidie sous un
courant d’eau puis agitée avec 5 mL de chloroforme. La phase au chloroforme est soutirée et 1
mL de solution de NH4OH diluée est ajouté. L’apparition d’une coloration rouge plus ou moins
intense indique la présence de génines de C-hétérosides.
IV.12. Test de détection composés réducteurs
Un volume de 5 mL de décocté aqueux à 10 % est évaporé au bain-marie jusqu’à sec.
Après ajout de 1 mL de réactif de Fehling au résidu, l’obtention d’un précipité rouge-brique
indique la présence de composés réducteurs.
IV. 13. Mucilages
Les mucilages sont des substances végétales, constituées de polysaccharides, qui
gonflent au contact de l'eau en prenant une consistance visqueuse, parfois collante, semblable
à la gélatine.
A 1 mL de décocté à 10 % sont ajoutés 5 mL d’éthanol absolu. L’obtention d’un
précipité floconneux, par mélange, indique la présence de mucilages.
Conclusion partielle
Le screening phytochimique, basé sur des tests de coloration et de précipitation, permet
d’identifier des familles de métabolites secondaires des plantes. Plusieurs méthodes de
détection des alcaloïdes, des flavonoïdes, des stérols et terpènes, des tanins, des coumarines,
KONE KOUWELTON PATRICK 77
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
des composés réducteurs, des O- et C- hétérosides, des mucilages, des anthocyanes, des
leucoanthocyanes, des saponosides et des anthraquinones ont été décrites.
KONE KOUWELTON PATRICK 78
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE II: MODELISATION ET OPTIMISATION DU
RENDEMENT D’EXTRACTION
Dans cette partie, il s’agira de présenter le procédé employé pour modéliser et optimiser
l’extraction des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus.
I. MODELISATION
I.1. Enumération des facteurs
Nous avons choisi six facteurs influençant le rendement d’extraction des métabolites
secondaires qui sont la durée de séchage du matériel végétal, la granulométrie du broyat, le
pourcentage d’alcool dans le solvant, le ratio volume de solvant sur masse de broyat, la durée
de macération et la vitesse d’agitation (Chemat et al., 2015; Raaman, 2006; Walton and Brown,
1999). Notons que le solvant hydro-éthanolique est largement utilisé pour l’extraction des
métabolites secondaires des plantes (Chemat et al., 2015; Raaman, 2006; Walton and Brown,
1999) et il est proche de l’eau généralement utilisée en médecine traditionnelle.
I.2. Domaines de valeurs
Les domaines de valeurs des facteurs ont été fixés en fonction du matériel disponible au
laboratoire. Au niveau de la granulométrie et de la vitesse d’agitation, le choix a été fait par
rapport aux tamis et aux agitateurs magnétiques disponibles dans notre laboratoire. Quant aux
autres facteurs, le choix a été fait en tenant compte des conditions de macération trouvées dans
la littérature (Ćujić et al., 2016; Feknous et al., 2015; Huie, 2002). Le tableau 4 résume le choix
des valeurs des facteurs énumérés.
Tableau 4: Facteurs recensés
Codage Facteurs Valeur (-1) Valeur (+1)
X1 Durée de séchage 14 jours 28 jours
X2 Granulométrie <= 0,4 mm <=2 mm
X3 Pourcentage d’alcool du solvant 50% 90%
X4 Ratio (volume sur masse de broyat) 5 mL/g 10 mL/g
X5 Durée de macération 12h 24h
X6 Vitesse d'agitation 500 rpm 1600 rpm
KONE KOUWELTON PATRICK 79
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I.3. Matrice de Plackett-Burman
Pour l’établissement de la matrice de Plackett-Burman (Plackett and Burman, 1946;
Wallis, 1972), un facteur fictif (x7) a été ajouté pour que le nombre de facteurs k (fictifs et réels)
soit du type (k + 1), multiple de 4 et corresponde au nombre d’expériences. Le tableau 5 présente
la matrice des expériences.
Tableau 5: Matrice des expériences
Test x1
(semaines) x2 (mm) x3 (%)
x4
(g/mL) x5 (h) x6 (rpm)
1 4 0,4 50 10 12 1600
2 4 2 50 5 24 500
3 4 2 90 5 12 1600
4 2 2 90 10 12 500
5 4 0,4 90 10 24 500
6 2 2 50 10 24 1600
7 2 0,4 90 5 24 1600
8 2 0,4 50 5 12 500
I.4. Réalisation des tests
Le matériel végétal est séché pendant une durée x1 dans une salle à température
ambiante (entre 28 et 30°C) ; puis broyé et tamisé pour donner une poudre de granulométrie x2.
Une masse de 10 g du broyat est introduite dans un volume x3 d’un solvant hydro-éthanolique
de composition x4 et macéré pendant une durée x5 avec une vitesse de rotation x6. Après
filtration du mélange, le solvant évaporé et l’extrait obtenu est pesé.
Les tests 1 à 8 sont réalisés en prenant les valeurs des facteurs du tableau 5.
II. OPTIMISATION DU MODELE
L’optimisation du modèle obtenu après le traitement des résultats est réalisée en utilisant
la suite Excel du logiciel Microsoft Office avec le complément solveur qui permet de faire une
optimisation par la méthode des Simplex (Han et al., 2017; Ribeiro-Santos et al., 2017) . Cette
méthode est utilisée pour les modèles linéaires et elle permet de trouver une solution optimum.
Conclusion partielle
Les plans d’expériences planifient des expériences pour avoir des résultats à traiter en
vue de modéliser le phénomène et d’en tirer les conditions optimales de travail. Le plan de
Plackett et Burmann sera utilisé pour déterminer les paramètres significatifs qui influencent les
KONE KOUWELTON PATRICK 80
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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rendements des extractions. La méthode de simplex est proposée pour optimiser le rendement
d’extraction.
KONE KOUWELTON PATRICK 81
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE III: IDENTIFICATION ET DETERMINATION
STRUCTURALE
I. IDENTIFICATION CHROMATOGRAPHIQUE ET SPECTROSCOPIQUE
I.1. Identification par chromatographie
I.1.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC)
L’analyse chromatographique sur couche mince a été réalisée sur une plaque en verre
de 20 cm sur 20 cm, sur laquelle est recouvert un gel de silice. Chaque extrait de plante a sa
plaque sur laquelle ont été déposées les différentes fractions à faire éluer. Les points de dépôts
ont été espacés de 26,6 mm en commençant à 20 mm du bord gauche. Le dépôt des fractions
sur la plaque a été fait automatiquement par l’appareil CAMAG Automatic TLC Sampler III
(ATS3). Les fractions ont été déposées à 30 mm de la plaque et le front de solvant à la fin de
l’élution a été noté à 185 mm. La lampe de détection a été calibrée pour balayer les longueurs
d’ondes suivantes : 250, 280, 310, 340, 370 et 400 nm. Le solvant d’élution est un mélange
binaire hexane-acétate d’éthyle (1/3) (v/v). Les chromatogrammes sont générés en fichier PDF
sur l’ordinateur de l’appareil.
Les longueurs d’onde utilisées pour révéler les tâches en HPTLC permettent de repérer
les différents groupes chromophores et auxophores afin de corréler les spectres infra rouges et
les chromatogrammes HPTLC pour identifier les familles de métabolites secondaires.
I.1.2. Chromatographie liquide à haute pression (HPLC)
La chromatographie liquide à haute pression a été réalisée avec un chromatographe
HPLC de type Dionex RF 2000 équipée d’une pompe socratique P 680. Les échantillons ont
été préparés dans un solvant de même nature que l’éluant de départ à savoir un mélange eau-
acétonitrile (1:1), dilués au 1/10. Les conditions expérimentales de l’analyse sont données dans
les tableaux suivants selon la fraction analysée. Le détecteur utilisé est un détecteur UV-visible
à diode, et la longueur d’onde choisie dépend de la nature de l’extrait ou fraction analysé.
I.1.2.1. Conditions expérimentales pour Alchornea cordifolia
a. Fraction à l’acétate d’éthyle
Les tableaux 6 et 7 donnent les conditions de fonctionnement de la colonne ainsi que le
gradient de solvant appliqué.
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 6: Conditions expérimentales de la HPLC
Paramètres Valeurs
Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)
Quantité injectée 1,0 µL
Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)
Débit 1 mL/min
Détecteur à diode UV λ = 220 nm
Durée d’analyse 260 min
Tableau 7: Gradient de solvant
Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)
1 0 93 7
5 93 7
2 125 70 30
3 140 0 100
170 0 100
4 195 100 0
260 100 0
b. Fraction à l’hexane
Les tableaux 8 et 9 déroulent les conditions de fonctionnement de la colonne et le
gradient de solvant.
Tableau 8: Conditions expérimentales de la HPLC
Paramètres Valeurs
Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)
Quantité injectée 1,0 µL
Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)
Débit 1 mL/min
Détecteur à diode UV λ = 280 nm
Durée d’analyse 90 min
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 9: Gradient de solvant
Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)
1 0 100 0
20 100 0
2 60 0 100
65 0 100
3 70 50 50
75 75 25
4 80 100 0
90 100 0
c. Fraction au butanol
Les tableaux 10 et 11 nous donnent les conditions expérimentales de la réalisation de
la manipulation.
Tableau 10: Conditions expérimentales de la HPLC
Paramètres Valeurs
Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)
Quantité injectée 1,0 µL
Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)
Débit 1 mL/min
Détecteur à diode UV λ = 280 nm
Durée d’analyse 90 min
Tableau 11: Gradient de solvant
Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)
1 0 93 7
30 95 15
2 45 0 100
60 0 100
3 75 100 0
90 100 0
KONE KOUWELTON PATRICK 84
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I.1.2.2. Conditions expérimentales pour Phyllanthus amarus
a. Fraction à l’hexane
Tableau 12: Conditions expérimentales de la HPLC
Paramètres Valeurs
Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)
Quantité injectée 1,0 µL
Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)
Débit 1 mL/min
Détecteur à diode UV λ = 280 nm
Durée d’analyse 180 min
Tableau 13: Gradient de solvant
Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)
1 0 100 0
20 100 0
2 60 50 50
80 50 50
3 120 0 100
140 0 100
4 160 100 0
180 100 0
b. Fraction à l’acétate d’éthyle
Tableau 14: Conditions expérimentales de la HPLC
Paramètres Valeurs
Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)
Quantité injectée 1,0 µL
Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)
Débit 1 mL/min
Détecteur à diode UV λ = 280 nm
Durée d’analyse 190 min
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 15: Gradient de solvant
Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)
1 0 93 7
5 93 7
2 125 70 30
3 136 50 50
147 50 50
4 158 0 100
169 0 100
5 180 100 0
190 100 0
c. Fraction au résidu aqueux
Tableau 16: Conditions expérimentales de la HPLC
Paramètres Valeurs
Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)
Quantité injectée 1,0 µL
Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)
Débit 1 mL/min
Détecteur à diode UV λ = 280 nm
Durée d’analyse 90 min
Tableau 17: Gradient de solvant
Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)
1 0 90 3
30 85 15
2 45 0 100
60 0 100
3 75 100 0
90 100 0
KONE KOUWELTON PATRICK 86
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2. Identification par spectroscopie
I.2.1. Spectroscopie infrarouge
Les différentes fractions (hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanol et résidu
aqueux) ont été analysées en spectroscopie infrarouge. Cette analyse se déroule en deux étapes :
la préparation de la pastille à analyser et l’analyse proprement dite. Une masse de 5 à 10 mg de
l’échantillon à analyser est pesée, puis la masse est complétée à 300 mg avec du bromure de
potassium (KBr). L’ensemble est mélangé puis broyé manuellement en une fine poudre qui est
ensuite pressée à l’aide d’une presse manuelle jusqu’à 200 bars pendant 30 secondes. Une
pastille est obtenue par cristallisation de la poudre. Cette pastille est introduite dans la chambre
optique du spectroscope pour analyse. Une pastille neutre (ne contenant que du KBr) est utilisée
pour la mise à niveau de l’appareil. Un ordinateur couplé à l’appareil permet de recueillir le
spectre de l’échantillon. Dans le cas d’un échantillon liquide, des pastilles en ZnSe sont
utilisées. Elles sont préalablement rincées avec du chloroforme, puis une goutte de l’échantillon
est déposée entre deux pastilles de ZnSe. Elles sont ensuite introduites dans la chambre optique
pour analyse.
I.2.2. Spectroscopie UV-visible
Les spectres UV des échantillons ont été mesurés lors des analyses HPLC couplée à la
spectroscopie UV-visible grâce au détecteur à barrette diode.
II. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN
PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS)
permet l’identification de quelques composés. Pour les extraits de plante, cette analyse nécessite
une hydrolyse acide suivie de la silylation des différents échantillons.
II.1. Hydrolyse acide
A 10 g de poudre préalablement extrait par l’hexane jusqu’à épuisement des lipides,
sont additionnés 50 mL d’une solution d’acide chlorhydrique (HCl, 2N). L’ensemble est porté
à reflux pendant 2 heures. Après refroidissement, l’hydrolysat est traité par l’acétate d’éthyle
(3 × 50 mL) pour extraire les aglycones. Les fractions organiques sont regroupées et séchées
KONE KOUWELTON PATRICK 87
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sur sulfate de magnésium anhydre (MgSO4). Après filtration, le filtrat est concentré sous vide
et conservé sous azote.
II.2. Silylation des différents échantillons
La silylation est utilisée en GC-MS pour transformer les composés contenus dans les
extraits dérivés du triméthylsilyle (TMS) plus volatils, moins polaires et plus thermos tolérants.
Dans le cadre de notre étude, nous avons utilisé comme agent de silylation le N-méthyl-N-
triméthylsilyl trifluoroacétamide (MSTFA). La réaction de silylation du groupement hydroxyle
en présence de MSTFA est donnée dans le schéma 2. A 3 mg de chaque échantillon sont
additionnés 0,5 mL de dichlorométhane (CH2Cl2) distillé et 0,2 mL de MSTFA. L’ensemble est
chauffé à 37°C pendant 30 minutes.
R OH +
O
N
F
F
FCH3
Si
CH3
CH3
R O Si
CH3
CH3
CH3
CH3
Schéma 2:Réaction de silylation du groupement hydroxyle en présence de MSTFA
II.3. Mode opératoire de la GC-MS
L’analyse a été effectuée sur un chromatographe en phase gazeuse couplé à un
spectrophotomètre de masse de marque SHIMADZU, modèle QP2010SE avec une colonne
Zébron ZB-5ms de 20 m de long, d’un diamètre intérieur de 0,18 mm et d'une épaisseur de film
de la phase stationnaire de 0,18 µm. L'hélium a été employé comme gaz porteur, avec une
vitesse linéaire de 0,9 mL/s. La température (70 à 270°C) du four a été programmée à 4°C/min
et maintenue à 270°C pendant 20 minutes. Les températures de l'injecteur et du détecteur ont
été fixées respectivement à 280°C et 290°C. L’injection a été réalisée en mode splitless. Les
paramètres du spectromètre de masse pour le mode d’impact électronique sont : la température
de la source d’ionisation 230°C, l’énergie de 70 eV, la vitesse de scan 50 scans/s et la vitesse
d’acquisition 10 000 uma/s. L'identification des composés silylés a été possible, en comparant
les temps de rétention avec ceux des standards et les données spectrales obtenues à partir des
bibliothèques Wiley et NIST. Chaque détermination a été effectuée en trois exemplaires.
KONE KOUWELTON PATRICK 88
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Conclusion partielle
Les méthodes spectroscopique et chromatographique seront utilisées pour la séparation,
l’identification et la détermination structurale des métabolites secondaires des plantes. Leurs
principes sont basés sur la détection des fonctions chimiques caractéristiques des différentes
familles de molécules.
89
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION
KONE KOUWELTON PATRICK 90
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE I: BIBLIOMETRIE
Il a s’agit de faire un état des lieux des travaux effectués sur chacune des plantes
étudiées. Dans les prochaines lignes, nous étayerons les résultats de cette bibliométrie par
plante.
I. PHYLLANTHUS AMARUS
La première publication a été enregistrée en 1985. La période de notre bibliométrie
s’étant donc de 1985 au mois de mars de l’année 2016. 557 publications ont été enregistrées
dans cet intervalle de temps ; 433 publications (77,74% du total) parmi celles-ci ont été
enregistrées dans les dix dernières années (2006-2016) avec 60,05% dans les cinq dernières
années (2011-2016). Le pic de publications a été observé en 2011 avec 67 publications. Ces
chiffres montrent un engouement sur le sujet. C’est en moyenne sur toute la période d’étude,
17,41 publications par an sur Phyllanthus amarus avec 43,33 publications par an sur les cinq
dernières années, soit une augmentation de 149% sur la moyenne globale. Phyllanthus amarus
est donc une plante qui suscite l’intérêt scientifique. La figure 42 illustre le nombre de
publications par année sur la période d’étude (1985-2016).
Figure 44:Nombre de publications par année sur Phyllanthus amarus
Au niveau des auteurs, un peu plus de 950 ont publié sur le sujet. L’auteur qui a le plus
publié sur la thématique est Kuttan Ramasadan avec 16 publications. La figure 43 montre le
premier, deuxième et troisième meilleur auteur (en nombre de publications).
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 45: Classement des auteurs en fonction du nombre de publications
Concernant le type de publication, les journaux et articles de journaux viennent en tête
avec 40% des publications. Il faut noter aussi la pertinence en termes de découverte et utilité
scientifique de la plante qui s’observe avec un taux élevé de brevet (4,54% des publications).
Le journal désigne un ensemble d’article qui paraissent dans un même volume ; l’article de
journal est un chapitre du journal et un article est une publication qui parait seul de façon
individuelle sans être dans un ensemble d’autre article d’un journal. La figure 44 résume la part
de chaque type de publications dans le total.
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Kuttan Ramadasan Thyagarajan S P Foo L Yeap Krithika Rajesh
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 46: Camembert représentant la part de chaque type de publication sur
Phyllanthus amarus
II. ALCHORNEA CORDIFOLIA
La première publication sur Alchornea cordifolia a été écrite en 1921 ; mais la recherche
sur cette plante a démarré réellement dans les années 90. Les publications traitant de cette plante
sont au nombre de 110 sur une période entre 1921 et 2016. 75 d’entre elles ont été publier entre
2006 et 2016 et 53,33% de ces 75 dans les cinq dernières années (2011-2016). Le pic de
publication a été observé en 2010 avec 13 publications. La moyenne globale est de 1,2
publications par an, contre une moyenne de 6,8 publications entre 2006 et 2016, soit une hausse
de 489% sur la tendance globale, et une moyenne de 6,7 publications entre 2011 et 2016, soit
une baisse de 2,22% par rapport à la moyenne des dix dernières années. Si l’intérêt scientifique
sur Alchornea cordifolia ne cesse de croitre sur ces dix dernières années, il faut constater cette
croissance est en ralentissement sur les cinq dernières années. La figure 45 résume l’évolution
du nombre de publications au fil des années.
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Journal
Article
Article de journal
Fichier en ligne
Support à la recherche
Brevet
Review
Essai clinique
Essai clinique controllé
Etude comparative
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 47:Nombre de publications sur Alchornea cordifolia au fil des années
Au niveau des auteurs, c’est Pieters Luc qui vent en tête avec le plus grand nombre de
publication sur Alchornea cordifolia avec 8 publications. La figure 46 donne les trois auteurs
les plus prolifiques sur cette plante.
Figure 48: Trois premiers auteurs en nombre de publications sur Alchornea cordifolia
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Pieters L Vlietinck A J Apers S
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Auteurs
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Les publications sur Alchornea cordifolia sont à 42% des articles de journaux. Il est à
souligner la présence de deux brevets et aucune revue bibliographique (jusqu’à la date de mars
2016).
Figure 49: Répartition des différents types de publication sur Alchornea cordifolia
III. TRIDAX PROCUMBENS
La première publication sur Tridax procumbens a été enregistré en 1930 ; mais l’intérêt
scientifique sur cette plante a pris son envol dans les années 1970. On compte 354 publications
sur la période entre 1930 et 2016 soit une moyenne de 4,07 publications par an. Cependant,
l’étude bibliométrique nous montre que nous sommes en plein dans les investigations sur Tridax
procumbens, avec 275 sur 354 publications entre 2006 et 2016. 75% (205) de ces publications
ont été enregistrées dans les cinq dernières années (2011-2016) avec le pic de publications en
2015 (51). Cela montre que les travaux scientifiques sur cette plante sont d’actualité. La figure
47 résume les observations du nombre de publications sur Tridax procumbens par an.
42%
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17% 13%
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2%
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Journal
Article
Article de Journal
Fichier en ligne
Support de recherchegouvernementalConférence
Etude comparative
Brevet
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 50: Nombre de publication sur Tridax procumbens par an
L’auteur le plus prolifique dans les publications sur Tridax procumbens est Yuan Ke
avec 9 publications. Les deuxièmes et troisièmes places sont données dans la figure 49.
Figure 51: Classement des auteurs les plus prolifiques sur les publications sur Tridax
procumbens
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Auteurs
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Le type de publication le plus répandu dans les publications sur Tridax procumbens est
le journal avec 51% des publications. Cette plante a de nombreuses potentialités à la vue du
nombre de brevets déposés (33) représentant 5% des publications. Une seule revue
bibliographique a été faite sur Tridax procumbens. La figure 50 illustre la répartition des
publications par type.
Figure 52: Répartition des publications sur Tridax procumbens par type
Discussion
Les trois études bibliométriques sur les plantes de notre travail ont toutes montrées une
évolution conséquente de l’intérêt scientifique porté sur elles. Cela est d’abord dû à
l’accroissement de l’activité scientifique de façon globale mais aussi de façon spécifique aux
domaines des substances naturelles dans le souci de trouver des alternatives aux composés de
synthèses tant dans l’industrie pharmaceutique que chimique. L’essor donc de nouvelles
méthodes d’analyses telles que la chromatographie en phase liquide à haute pression et la
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a impulsé
l’investigation de nouvelles molécules. L’utilisation de nouvelles techniques d’identification et
de séparation pourrait donc augmenter cet engouement scientifique autour de ces plantes. En
51%
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11%
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Journal
Fichier en ligne
Article
Ariticle de journal
Brevet
Support de recherchegouvernementale
Conférence
Etude d'évaluation
Review
KONE KOUWELTON PATRICK 97
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
effet des études bibliométrique effectuées sur les substances naturelles actives contre le cancer
ont montré un hausse substantielle des publications sur le sujet (Tang and Du, 2014). Une autre
étude sur l’économie botanique a montré aussi l’intérêt grandissant de la science sur les plantes
(Biswas et al., 2007).
Conclusion partielle
Les résultats de la bibliométrie nous indiquent que les plantes de l’étude ont des intérêts
scientifiques réels vu le nombre de plus en plus croissant de publications. Cette nouvelle
approche scientifique est de plus en plus utilisée et conseillée avant d’entreprendre des études
sur une thématique donnée.
KONE KOUWELTON PATRICK 98
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE II: CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES
I. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES BROYATS
I.1. Résultats
Les tests phytochimiques effectués ont permis de mettre en évidence la présence ou non
de différentes familles de composés recherchés dans les organes des plantes étudiées.
Les criblages phytochimiques du broyat des organes des différentes plantes ont porté
sur les familles de métabolites secondaires présents dans le tableau 18.
KONE KOUWELTON PATRICK 99
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 18: Criblages phytochimiques des broyats de Tridax procumbens, Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus
FAMILLES DE
METABOLITES
SECONDAIRES
Tridax procumbens Alchornea cordifolia Phyllanthus amarus
Racines Tiges Fleurs Feuilles Feuilles Plante entière
Alcaloïdes + - + + + +
Tanins catéchiques + + - - + +
Tanins galliques + + + + + +
Anthocyanes + - + - + +
Flavonoïdes + + + + + +
Leucoanthocyanes + + + + + -
Coumarines + + + + - -
Anthraquinones libres - - - - - -
O-hétérosides + - - - +
C-hétérosides + - - - +
Stérols et terpènes + + + + + +
Composés réducteurs + + + + - +
Mucilages + + + + - +
Saponines - - - - + +
+ : Présence ; - : Absence
KONE KOUWELTON PATRICK 100
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2. Discussion
L’analyse des résultats du tableau 18 montre que les racines de Tridax procumbens sont
les plus riches en métabolites secondaires avec la présence de douze (12) familles sur les
quatorze (14) recherchées soit 85,71% des métabolites secondaires recherchés. En effet, une
grande partie de ces métabolites secondaires sont des molécules de défense qui éloignent les
prédateurs ou inhibent la croissance de plantes concurrentes. Ces molécules sont concentrées
dans les racines, partie du végétal la plus exposée aux agressions de l'environnement. Les fleurs
de Tridax procumbens contiennent neuf (9) familles de métabolites secondaires sur les (14)
recherchées soit 64,29%. Enfin, les tiges et les feuilles de Tridax procumbens contiennent tous
les deux huit (8) familles sur les quatorze (14) recherchées soit 57,14% des métabolites
secondaires. Les résultats du criblage phytochimique révèlent l’absence d’anthraquinones libres
et de saponines dans l’ensemble des organes de Tridax procumbens. Les O-hétérosides et C-
hétérosides sont uniquement présents dans les racines. Les alcaloïdes sont présents dans les
fleurs, les racines et les feuilles mais absents dans les tiges. Les tanins galliques, les
leucoanthocyanes, les coumarines, les stérols et terpènes, les composés réducteurs et les
mucilages sont présents dans tous les organes de Tridax procumbens. Les tanins catéchiques
sont concentrés dans les racines et la tige et ils sont totalement absents dans les feuilles et les
fleurs. Les anthocyanes sont absents dans la tige alors que les autres flavonoïdes (en particulier
les flavones et / ou flavanones) sont présents dans tous les organes de la plante.
Il existe très peu d’études chimiques sur Tridax procumbens et la plupart de celles qui
existent concernent les feuilles. Les études antérieures réalisées sur les feuilles de l’espèce de
l’Inde ont révélé la présence d’alcaloïdes, de flavonoïdes (catéchine et flavone) ainsi que de
tanins (Christudas et al., 2012; Mundada et al., 2010) et celles réalisées au Nigeria ont révélé
la présence de saponines (Jude et al., 2009) alors que l’espèce ivoirienne de l’étude n’en
contient pas. Les travaux de la littérature auxquels nous avons eu accès n’ont pas rapporté la
présence de flavanones, de leucoanthocyanes, de coumarines, de composés réducteurs ni de
mucilages dans les feuilles. Cela pourrait être dû au fait que ces métabolites sont absents ou
n’ont pas été recherchés. Une étude sur les fleurs de l’espèce de l’Inde a révélé la présence de
saponines (Saxena and Albert, 2005) alors que l’espèce ivoirienne n’en contient pas. La
comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature montre que nous sommes en
présence d’un nouveau chémotype.
KONE KOUWELTON PATRICK 101
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Les feuilles de Alchornea cordifolia contiennent neuf (9) familles de métabolites
secondaires sur les (14) recherchées soit 64,29%. On note la présence d’alcaloïdes, de tanins
catéchiques et galliques, d’anthocyanes, de flavonoïdes, de leucoanthocyanes, de terpènes et
stérols ainsi que de saponines. Les mucilages, composés réducteurs et les O- et C- hétérosides
sont absents des feuilles de Alchornea cordifolia. Les résultats obtenus sont presque similaires
à ceux réalisés sur les feuilles de la plante récoltée au sud de la Côte d’Ivoire sauf que l’espèce
du sud ne contient pas d’alcaloïdes (N’guessan et al., 2011). Toutefois, les travaux réalisés sur
l’espèce malienne ont montré la présence d’alcaloïdes à un taux de 0,1 % dans les rameaux
feuillés de la plante (Togola, 2002). Nos résultats montrent la présence d’anthocyanes et de
saponines alors que ces deux familles de métabolites secondaires sont absentes dans l’espèce
malienne. Cependant, les coumarines, absentes des feuilles de notre étude, sont présentes dans
celles de N’guessan (2011) et de Togola Adiaratou (2002). Les mucilages et les composés
réducteurs, absents des deux espèces de la Côte d’Ivoire sont présents dans celle du Mali.
La plante entière de Phyllanthus amarus contient douze (12) familles sur les quatorze
(14) recherchées soit 85,71% des métabolites secondaires recherchés. Les leucoanthocyanes,
les coumarines et les anthraquinones libres sont absents de la plante entière. La présence de ces
douze familles de composés renforce les activités biologiques et pharmacologiques de la plante.
Les résultats obtenus sont proches de ceux de N’Guessan et de ses collaborateurs (N’Guessan
et al., 2009) qui notent cependant l’absence de tanins galliques et de saponines dans l’espèce
récoltée à Agboville dans le sud de la Côte d’Ivoire. L’espèce nigériane de cette plante contient
tous les métabolites secondaires présents dans la plante de notre étude (Umoh et al., 2013) alors
que les stérols et terpènes ainsi que les mucilages sont absents dans l’espèce étudiée au
Cameroun (Joseph et al., 2015).
Au total, la présence des familles de métabolites secondaires pourrait être à la base des
activités pharmaceutiques de Tridax procumbens, de Alchornea cordifolia et de Phyllanthus
amarus. En effet, l’activité antibiotique pourrait être due aux alcaloïdes des plantes (Kahlouche-
Riachi, 2014). Les activités antioxydantes, anti-inflammatoires et antivirales pourraient
provenir des composés polyphénoliques (Ecra et al., 2001). Les activités anti diarrhéiques et
antiseptiques pourraient provenir des tanins galliques (Becker et al., 2005). Par ailleurs, les tests
phytochimiques ont mis en évidence la présence de coumarines dans tous les organes de T.
procumbens linn qui pourraient justifier les activités antihypertensives et anti-inflammatoires
attribuées à cette plante (Becker et al., 2005). Les terpènes et stérols contenus dans ces plantes
KONE KOUWELTON PATRICK 102
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
pourraient leur conférer plusieurs propriétés biologiques. En effet, les stérols, de structures
proches de celle du cholestérol, limitent le passage de celui-ci dans le sang en détournant
l’organisme, entrainant ainsi l’élimination de la grande partie de ce dernier. De plus, les stérols
ne sont pas fabriqués par le corps humain et ils doivent donc être apportés par l’alimentation.
Quant aux terpènes, ils sont cytotoxiques sur diverses lignées cellulaires tumorales (Oberlies et
al., 2002; Sai Prakash et al., 2002; Shen, 2004), ils présentent des propriétés
immunomodulatrices, des activités trypanocides (Espindola et al., 2004; Hunter et al., 1997),
antileishmaniales et antiplasmodiales (Jullian et al., 2005) et une activité modérée contre
Mycobacterium tuberculosis (Kanokmedhakul et al., 2005).
II. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES EXTRAITS DE TRIDAX
PROCUMBENS
II.1. Criblages phytochimiques des extraits hydroalcooliques de Tridax
procumbens
II.1.1. Résultats
Les résultats du criblage phytochimique sur la poudre brute des différents organes de la
plante avaient révélé l’absence d’anthraquinones libres et de saponines. Ces résultats ont été
confirmés dans l’extrait hydro alcoolique (Tableau 19).
KONE KOUWELTON PATRICK 103
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 19:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction hydro alcoolique de
Tridax procumbens
FAMILLE DE
METABOLITES
SECONDAIRES
ORGANES DE LA PLANTE
Racines Tiges Fleurs Feuilles
Alcaloïdes + - + +
Tanins catéchiques + + - -
Tanins galliques + + + +
Anthocyanes - - - -
Flavones + - + -
Flavanones - + - +
Leucoanthocyanes + - + +
Coumarines + + + +
O-hétérosides - - - -
C-hétérosides - - - -
Stérols et terpènes + + + +
Composés réducteurs - - + +
Mucilages - - - +
+ : Présence ; - : Absence
II.1.2. Discussion
Les résultats du criblage phytochimique des extraits hydro alcooliques des différents
organes de la plante révèlent l’absence d’anthocyanes ainsi que de O- et C-hétérosides dans
l’ensemble des organes de la plante. Cela pourrait expliquer leur extraction par les solvants
polaires tels que le mélange butanol/eau. Les alcaloïdes sont présents dans l’extrait hydro
alcoolique des racines, des feuilles, et des fleurs mais absents dans les tiges, ce qui confirme les
résultats précédents. Les tanins galliques, les coumarines, les stérols et terpènes sont également
présents dans les extraits hydro alcooliques de tous les organes de la plante. Les tanins
catéchiques sont concentrés dans les tiges et les racines et sont absents dans les feuilles et les
fleurs. Les flavones sont uniquement présentes dans les racines et les fleurs alors que les
flavanones sont uniquement présentes dans la tige et les feuilles. Les leucoanthocyanes sont
KONE KOUWELTON PATRICK 104
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
absents dans la tige alors que les composés réducteurs sont concentrés dans les fleurs et les
feuilles. Les mucilages sont présents dans les feuilles.
II.2. Criblage phytochimique des extraits dichlorométhane/éthanol des feuilles suivi de la
digestion et de la décoction
II.2.1. Résultats
Les résultats du criblage phytochimique sur le broyat des feuilles ont révélé l’absence
de tanins catéchiques, d’anthocyanes, de flavones, d’anthraquinones libres, de O- et C-
hétérosides et de saponines. Ces résultats ont été confirmés dans l’extrait
dichlorométhane/éthanol (Tableau 20).
Tableau 20:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction
dichlorométhane/éthanol des feuilles suivie de la digestion et de la décoction
FAMILLE DE
METABOLITES
SECONDAIRES
Tridax procumbens FEUILLES DE LA PLANTE
CH2Cl2/EtOH Digesté aqueux
(50°C)
Décocté aqueux
(100°C)
Alcaloïdes + - +
Tanins galliques - + +
Flavanones - + +
Leucoanthocyanes - + +
Coumarines + + +
Stérols et terpènes - - -
Composés réducteurs - + +
Mucilages - + +
+ : Présent ; - : Absence
II.2.2. Discussion
Les résultats du tableau 20 montrent que le mélange dichlorométhane/éthanol a extrait
les alcaloïdes et les coumarines. L’eau (à 50°C) a extrait la plupart des métabolites secondaires
à l’exception des alcaloïdes, des stérols et des terpènes. L’eau (à 100°C) a également extrait la
plupart des métabolites secondaires à l’exception des stérols et terpènes.
KONE KOUWELTON PATRICK 105
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
III. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES FRACTIONS ISSUES DES
EXTRAITS HYDROALCOOLIQUES
III.1. Résultats
Le screening phytochimique des fractions de Tridax procumbens, de Alchornea
cordifolia et de Phyllanthus amarus se sont déroulés sur les trois familles de métabolites
secondaires les plus importantes à savoir les flavonoïdes, les alcaloïdes ainsi que les terpènes
et stérols. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 21.
KONE KOUWELTON PATRICK 106
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 21: Screening phytochimiques de trois familles de métabolites secondaires dans Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus
Fractions
Familles de métabolites secondaires
recherchées dans A. cordifolia
Familles de métabolites secondaires
recherchées dans P. amarus
Familles de métabolites secondaires
recherchées dans T. procumbens
Terpènes
et stérols Alcaloïdes Flavonoïdes
Terpènes
et stérols Alcaloïdes Flavonoïdes
Terpènes
et stérols Alcaloïdes Flavonoïdes
Hexane - + + + + + + - -
Dichlorométhane + - + - + + + - -
Acétate d’éthyle - - + + + + - - -
Butanol + + + - + + - + +
Eau - - + + + + + + +
+ : Présent ; - : Absence
KONE KOUWELTON PATRICK 107
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
III.2. Discussion
La fraction à l’hexane des feuilles de Alchornea cordifolia a révélé la présence de
flavonoïdes et d’alcaloïdes. Cela est confirmé par les travaux de Adeshina en 2012 sur la même
plante en provenance du Nigéria (Adeshina et al., 2012). Bien que les travaux récents réalisés
sur les feuilles de Alchornea cordifolia récoltées dans le sud de la Côte d’Ivoire indiquent la
présence de flavonoïdes dans la fraction à l’hexane, les auteurs n’ont pas détecté d’alcaloïdes
dans cette fraction (N’guessan et al., 2011). Cela confirme encore que nous sommes en présence
d’un nouveau chémotype de cette plante. Les terpènes et les flavonoïdes sont présents dans la
fraction au dichlorométhane alors que les alcaloïdes sont absents de cette fraction. Ces résultats
corroborent ceux de N’guessan en 2011 (N’guessan et al., 2011) qui ont plutôt utilisé le
chloroforme qui est aujourd’hui remplacé par le dichlorométhane à cause de sa plus grande
toxicité. Quant à la fraction à l’acétate d’éthyle elle ne contient que des flavonoïdes. Ces
résultats corroborent les travaux de la littérature (Adeshina et al., 2010; N’guessan et al., 2011).
La fraction au butanol contient tous les métabolites secondaires recherchés (alcaloïdes, terpènes
et flavonoïdes). Ces familles ont également été obtenues dans l’espèce nigériane (Mohammed
et al., 2013; Adeshina et al., 2010; N’guessan et al., 2011) mais seuls les flavonoïdes, recherchés
dans les travaux réalisés sur l’espèce du sud de la Côte d’Ivoire, ont été présents. La fraction
aqueuse ne contient que des flavonoïdes, ce qui est confirmé par les travaux de Nga en 2017
(Nga et al., 2017).
Le criblage phytochimique de la fraction à l’hexane de la plante entière de Phyllanthus
amarus a révélé la présence de toutes les familles de métabolites secondaires recherchées
(Alcaloïdes, terpènes et flavonoïdes). Des résultats similaires ont été obtenus par Zubair et ses
collaborateurs en 2017 (Zubair et al., 2017) lors de l’étude sur la même plante en provenance
du Nigéria. La fraction au dichlorométhane contient des flavonoïdes et des alcaloïdes mais ne
contient pas de terpènes et stérols. Ces résultats sont conformes à ceux de Khatoon en 2006
(Khatoon et al., 2006) mais en contradiction avec ceux de Okolo et ses collaborateurs en 2012
qui ont trouvé les trois familles de notre étude dans une espèce du Nigéria. La fraction à l’acétate
d’éthyle contient toutes les familles de métabolites recherchée (Alcaloïdes, terpènes et
flavonoïdes) comme précédemment confirmé par Karuna et ses collaborateurs en 2009 (Karuna
et al., 2009). La fraction au butanol contient des alcaloïdes et des flavonoïdes mais pas de
terpènes et stérols, alors que les trois familles de l’étude ont été retrouvées dans cette même
KONE KOUWELTON PATRICK 108
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
fraction au Nigéria (Okolo et al., 2012). Quant à la fraction aqueuse, elle contient toutes les
trois familles, comme l’ont montré des études antérieures (N’Guessan et al., 2009; Okolo et al.,
2012). Toutefois, les travaux réalisés par (Khatoon et al., 2006) ont mentionné uniquement la
présence de composés phénoliques dans cette fraction. Cela peut être dû au fait que la fraction
aqueuse analysée par Khatoon résulte d’une séparation successive par Soxhlet. L’absence des
deux autres familles serai donc dû au passage préliminaire des solvants apolaires.
Le criblage phytochimique des fractions à l’hexane et au dichlorométhane des feuilles
de Tridax procumbens a révélé uniquement la présence terpènes et stérols. La fraction à
l’acétate d’éthyle ne contient aucune des trois familles de métabolites recherchée (Alcaloïdes,
flavonoïdes, terpènes et stérols) alors que toutes ces familles sont présentes dans la fraction
aqueuse. Nous n’avons pas trouvé dans la littérature d’études sur les fractions issues d’un extrait
hydroalcoolique pour les comparer à nos résultats. Toutes les études de la littérature concernent
des extraits et non des fractions. Les extraits à l’éther de pétrole (qui est souvent utilisé en lieu
et place de l’hexane) des feuilles de la plante d’origine indienne ont également révélé la
présence de terpènes et stérols en plus des alcaloïdes qui ne sont pas détectés dans notre fraction
à l’hexane (Chistudas et al., 2012). Les études réalisées sur l’extrait au chloroforme (qui est
souvent remplacé par le dichlorométhane) des feuilles de la plante d’origine indienne sont en
accord avec nos résultats quant à la présence de terpènes et stérols. Toutefois, ces études
montrent en plus, la présence d’alcaloïdes (Chistudas et al., 2012) ou encore la présence
d’alcaloïdes et de flavonoïdes (Sawant et al., 2013). Notre fraction au butanol ne contient pas
de terpènes et stérols alors que l’extrait à l’éthanol de la plante d’origine indienne contient cette
famille (Chistudas et al., 2012). Nos résultats sur la fraction aqueuse qui contient tous les trois
métabolites secondaires recherchés sont conformes à ceux de Sawant et ses collaborateurs pour
un extrait Acétone /eau (Sawant et al., 2013).
Les différences observées au niveau des résultats pourraient s’expliquer par plusieurs
facteurs tels que la zone de récolte, la période de récolte, le mode de préparation des fractions
(extraction successive ou directe) ou encore par une différence entre espèce du même genre
(Ayerdi Gotor, 2008). A titre d’exemple, les différences observées entre nos travaux et ceux de
N’guessan Koffi et ses collaborateurs pourraient être liées au choix des organes de plantes. En
effet, les études de ces auteurs ont porté sur les feuilles de Phyllanthus amarus alors que nos
études ont concerné la plante entière.
KONE KOUWELTON PATRICK 109
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Conclusion partielle
Le criblage phytochimique a révélé une diversité de métabolites secondaires dans les
broyats et extraits des différentes plantes soumises à notre étude. Il a montré que les métabolites
secondaires présents dans les broyats se trouvent repartis dans les extraits en fonction de leur
polarité et leur affinité avec les différents solvants ou mélanges de solvants d’extraction.
KONE KOUWELTON PATRICK 110
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE III: MODELISATION ET OPTIMISATION DES
RENDEMENTS D’EXTRACTION
I. MODELISATION DES RENDEMENTS D’EXTRACTION DE A.
CORDIFOLIA ET DE T. PROCUMBENS
I.1. Résultats
Les résultats obtenus après la réalisation des expériences nous donnent, pour les deux
plantes, des rendements compris entre 0,04 et 0,24. Les rendements les plus élevés ont été
obtenus avec les feuilles de Alchornea cordifolia, qui sont compris entre 0,02 et 0,24. Quant à
la plante entière de Tridax procumbens, les rendements sont compris entre 0,004 et 0,11. Les
rendements sont plus élevés lorsque le ratio volume/masse du broyat est à sa borne +1, quel que
soit la plante. Les figures 51 et 52 résument les différents rendements obtenus en fonction des
facteurs mis en jeu.
Figure 53: Résultats des expériences sur Alchornea cordifolia
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,5 0,9 0,5 0,9
100 ML 50 ML
0,021
0,136
0,188
0,239
0,179
0,11
0,069
0,015
Re
nd
em
en
t
Facteurs
Alchornea cordifolia
0,4 mm - 2 SEMAINES - 12h - 500 rpm
0,4 mm - 2 SEMAINES - 24h - 1600rpm
0,4 mm - 4 semaines - 12h - 1600 rpm
0,4 mm - 4 semaines - 24h - 500 rpm
2 mm - 2 SEMAINES - 12h - 500 rpm
2 mm - 2 SEMAINES - 24h - 1600 rpm
2 mm - 4 semaines - 12h - 1600 rpm
2 mm - 4 semaines - 24h - 500 rpm
KONE KOUWELTON PATRICK 111
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 54: Résultats des expériences sur Tridax procumbens
I.2. Discussion
Les résultats obtenus ont été traité en régression linéaire multiple à l’aide de la suite
Excel de Microsoft Office.
I.2.1. Au niveau de Alchornea cordifolia
Le calcul de l’erreur expérimentale avec les valeurs non assignées et la détermination
des facteurs significatifs sont respectivement présentés dans les tableaux 22 et 23.
Tableau 22: Calcul de l'erreur expérimentale pour Alchornea cordifolia
Variables Coefficients Coeff*2 Facteur de
Student
Erreur
expérimentale
Constante 0,119625 0,23925 3,07768 0,06078
x7 0,009875 0,01975
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
12h 24h 24h 12h 12h 24h 24h 12h
0,4 mm 2 mm 0,4 mm 2 mm 0,4 mm 2 mm 0,4 mm 2 mm
0,5 0,9 0,5 0,9
10 ml/g 5 ml/g
0,088
0,004
0,102
0,04
0,106
0,02
0,092
0,022
Ren
de
men
ts
Facteurs
Tridax procumbens
4 semaines - 500 rpm
4 semaines - 1600 rpm
2 semaines - 500 rpm
2 semaines - 1600 rpm
KONE KOUWELTON PATRICK 112
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 23: Détermination des facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia
Variable Coefficients Effets Effet*2 Pertinence
Constante 0,119625 0,119625 0,23925 OUI
x1 0,008125 0,008125 0,01625 NON
x2 -0,026375 0,026375 0,05275 NON
x3 0,036125 0,036125 0,07225 OUI
x4 0,059375 0,059375 0,11875 OUI
x5 0,005375 0,005375 0,01075 NON
x6 0,006125 0,006125 0,01225 NON
Il ressort donc de ces analyses qu’il y a deux facteurs significatifs à savoir le pourcentage
d’alcool (x3) et le ratio volume sur la masse de broyat (x4). Le modèle obtenu est donc le
suivant (relation 1) :
𝑅𝑑𝑡 = 0,036125 × 𝑃 + 0,059375 × 𝑅 + 0,119625 (1)
Avec :
- Rdt, le rendement en métabolites secondaires ;
- P, le pourcentage en éthanol dans le mélange eau-éthanol (entre 50 et 90%) ;
- R, le ratio volume de solvant (en mL) sur la masse de broyat en g (entre 5 et 10
mL/g).
La figure 53 illustre la dépendance du rendement à ces deux facteurs. En effet, le
rendement est maximum pour un ratio de 10 mL/g et un pourcentage de 90% en éthanol dans
le solvant.
KONE KOUWELTON PATRICK 113
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 55: Influences des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction de
Alchornea cordifolia
I.2.2. Au niveau de Tridax procumbens
Le calcul de l’erreur expérimentale avec les valeurs non assignées à la détermination
des facteurs significatifs sont respectivement consignés dans les tableaux 24 et 25.
Tableau 24: Calcul de l'erreur expérimentale pour Tridax procumbens
Variables Coefficients Coeff*2 Facteur de
Student
Erreur
expérimentale
Constante 0,05925 0,1185 3,077683537 0,004616525
x7 0,00075 0,0015
Tableau 25: Détermination des facteurs significatifs Tridax procumbens
Variable Coefficients Effets Effet*2 Pertinence
Constante 0,05925 0,05925 0,1185 OUI
x1 -0,00125 0,00125 0,0025 NON
x2 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI
x3 0,03775 0,03775 0,0755 OUI
x4 -0,00775 0,00775 0,0155 OUI
x5 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI
x6 -0,00075 0,00075 0,0015 NON
0,298
0,418
0,036
0,205
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5 0,9
Re
nd
em
en
t
pourcentage en éthanol
10 ml/g
5 ml/g
KONE KOUWELTON PATRICK 114
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Il ressort de ces analyses qu’il y a quatre (4) facteurs significatifs à savoir la
granulométrie du broyat (x2), le ratio volume sur la masse de broyat (x3), le pourcentage en
éthanol dans le solvant (x4) et la durée de macération (x5). Le modèle obtenu est donc le
suivant (relation 2) :
𝑅𝑑𝑡 = −0,00475 × 𝐺 − 0,00775 × 𝑃 + 0,03775 × 𝑅 − 0,00475 × 𝐷𝑚 + 0,05925 (2)
Avec :
- Rdt, le rendement en métabolites secondaires ;
- G, la granulométrie du broyat (entre 0 et 4 mm) ;
- P, le pourcentage en éthanol dans le mélange eau-éthanol (entre 50 et 90%) ;
- R, le ratio volume de solvant (en mL) sur la masse de broyat (en g) (entre 5 et 10
mL/g) ;
- Dm, la durée de macération (entre 12 et 24h).
La figure 54 montre que le ratio volume de solvant sur masse de broyat est plus influent
que les autres facteurs significatifs car tous les rendements les plus hauts sont obtenus lorsqu’il
est à son niveau +1. Il y a une séparation visible en deux groupes du fait des deux bornes de ce
facteur.
Figure 56: Influence des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction
0,106
0,04
0,092
0,004
0,102
0,02
0,088
0,022
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,5 0,9 0,5 0,9
10 ml/g 5 ml/g
Re
nd
em
en
ts
Ratio Volume sur masse et pourcentage en éthanol
0,4 mm - 12h
0,4 mm - 24h
2 mm - 12h
2 mm - 24h
KONE KOUWELTON PATRICK 115
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II. OPTIMISATION
Les conditions optimales pour le modèle réalisé avec Alchornea cordifolia sont les
suivantes : une durée de séchage de 28 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm,
un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 90%, un ratio volume sur masse de 10 mL/g, une
durée de macération de 24 heures et une vitesse d’agitation de 1600 rpm.
Pour le modèle réalisé avec Tridax procumbens, les conditions optimales sont les
suivantes : une durée de séchage de 14 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm,
un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 50%, un ratio volume sur masse de 10 mL/g, une
durée de macération de 12 heures et une vitesse d’agitation de 500 rpm.
La granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm et le ratio volume sur masse de 10 mL/g
sont les deux conditions identiques pour les modèles et pourraient être maintenues pour
l’extraction des métabolites secondaires des plantes.
III. VERIFICATION ET COMPARAISON DES DONNEES DES DEUX
MODELES
Des comparaisons entre les données obtenues avec les modèles et les données
expérimentales ont été effectuées en calculant les coefficients de détermination linéaire (Cohen
et al., 2013; Faul et al., 2009; Lin, 1992). Les différents résultats obtenus sont présentés dans
les figures 55 et 56 pour Alchornea cordifolia avec un coefficient de corrélation de 0,9915 et
dans les figures 57 et 58 pour Tridax procumbens avec un coefficient de corrélation de 0,9933.
KONE KOUWELTON PATRICK 116
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 57: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle
de Alchornea cordifolia
Figure 58: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Alchornea cordifolia
18,80%
1,50%
6,90%
17,90%
23,90%
11,00%
13,60%
2,10%
17,81%
0,51%
7,89%
16,91%
24,89%
11,99% 12,61%
3,09%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
1 2 3 4 5 6 7 8
Ren
dem
ent
Test
Y exp Y calc
y = 0,9831x + 0,002R² = 0,9831
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 20,00% 25,00% 30,00%
Do
nn
ées
exp
érim
enta
les
Données modélisées
Y Mac
Linéaire (Y Mac)
KONE KOUWELTON PATRICK 117
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 59: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle
de Tridax procumbens
Figure 60: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Tridax procumbens
Quant à la comparaison entre le modèle développé sur A. cordifolia et celui développé
sur T. procumbens, chaque modèle a été testé sur les données de l’autre plante. Il est ressorti de
ce test que le modèle de A. cordifolia modélise mieux les données de T. procumbens que le
modèle de ce dernier pour les données de la première. En effet, comme le montre les figures 59
et 60, le coefficient de corrélation de A. cordifolia (R²=0,6920²=0,4789) est plus grand que celui
de T. procumbens (R²=0,3329²=0,1108). Cela montre que le type de plante influe sur le
10,60%
2,20% 2,00%
10,20%
9,20% 8,80%
0,40%
4,00%
10,87%
1,67% 2,12%
10,07%
8,52%9,32%
1,08%
3,73%
0,00%
2,00%
4,00%
6,00%
8,00%
10,00%
12,00%
1 2 3 4 5 6 7 8
Ren
dem
ent
Test
Y exp Y calc
y = 0,9863x + 0,0008R² = 0,9866
0,00%
2,00%
4,00%
6,00%
8,00%
10,00%
12,00%
0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00% 12,00%
Do
nn
ées
exp
érim
enta
les
Données modélisées
Y Mtp
Linéaire (Y Mtp)
KONE KOUWELTON PATRICK 118
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
rendement d’extraction, cependant le coefficient du modèle de A. cordifolia nous rassure quant
à une relation permettant de faire passer le modèle d’une plante à une autre.
Figure 61: Modélisation des données de Tridax procumbens avec le modèle de A.
cordifolia
Figure 62: Modélisation de Alchornea cordifolia avec le modèle de T. procumbens
Conclusion partielle
Un plan de Plackett-Burmann a permis de déterminer les paramètres influençant le
rendement d’extraction de métabolites secondaires. Ce sont le ratio volume de solvant sur masse
y = 0,3602x + 0,0162R² = 0,4789
0,00%
2,00%
4,00%
6,00%
8,00%
10,00%
12,00%
0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 20,00% 25,00% 30,00%
Do
nn
ées
exp
érim
enta
les
de
T.
pro
cum
ben
s
Données modélisées avec A. cordifolia
modèle de T. procumbens par A.cordifolia
Linéaire (modèle de T.procumbens par A. cordifolia)
y = 0,6451x + 0,0814R² = 0,1108
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00% 12,00%
Do
nn
ées
exp
érim
enta
les
A. c
ord
ifo
lia
Données modélisées par T. procumbens
modèle de A. cordifolia avecTridax
Linéaire (modèle de A. cordifoliaavec Tridax)
KONE KOUWELTON PATRICK 119
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
de broyat et le pourcentage d’éthanol dans le solvant hydroalcoolique pour Alchornea cordifolia
et le ratio volume de solvant sur masse de broyat et le pourcentage d’éthanol dans le solvant
hydroalcoolique, la granulométrie du broyat et la durée de macération pour Tridax procumbens.
Les modèles obtenus ont été optimisés par la méthode des simplex et des conditions
expérimentales optimales ont été établies. Chaque modèle est proche de l’expérimentation avec
des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99. Il ressort de cette étude que le modèle de
Alchornea cordifolia modélise mieux les données de Tridax procumbens que celui de cette
dernière pour la première.
KONE KOUWELTON PATRICK 120
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CHAPITRE IV: IDENTIFICATIONS ET DETERMINATIONS
STRUCTURALES DES METABOLITES
SECONDAIRES
L’identification des métabolites secondaires a concerné Alchornea cordifolia et
Phyllanthus amarus. En effet, ces deux plantes ayant fait l’objet de plusieurs études, nous
disposons d’assez de données pour comparer les différentes méthodes analytiques. La
détermination structurale a quant à elle été réalisée sur Tridax procumbens car il existe très peu
d’études dans ce sens concernant cette plante.
I. IDENTIFICATION DES METABOLITES SECONDAIRES PAR
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE A HAUTE RESOLUTION
(HPTLC)
I.1. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea
cordifolia
I.1.1. Résultats
Les chromatogrammes HPTLC ont été obtenus pour les fractions à l’hexane (FHA), au
dichlorométhane (FDA), à l’acétate d’éthyle (FAA), au butanol (FBA) et à l’eau (FEA) issues des
extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia (annexe 01). Les spectres ont été mesurés à
six (6) longueurs d'onde (250, 280, 310, 340, 370 et 400 nm) en fonction des familles de
métabolites secondaires recherchés (Senior et al., 2012). Les résultats des analyses ont été
traités dans la figure 61.
KONE KOUWELTON PATRICK 121
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Analyse de la fraction à l’hexane
b.Analyse de la fraction au dichlorométhane
c. Analyse de la fraction à l 'acétate d'éthyle
d. Analyse de la fraction au butanol
0,01 0,050,1 0,14
0,23
0,43 0,44 0,46 0,47 0,48
0,9
00,10,20,30,40,50,60,70,80,91
0
10
20
30
40
50
60
tach
e 0
1
tach
e 0
2
tach
e 0
3
tach
e 0
4
tach
e 0
5
tach
e 0
6
tach
e 0
7
tach
e 0
8
tach
e 0
9
tach
e 1
0
tach
e 1
1
Rap
po
rt f
ron
tal
% A
bso
rpti
on
Titre de l'axe
250 280 310 340 370 400 RF
0,010,05 0,06
0,1
0,9 0,91
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
tache 01 tache 02 tache 03 tache 04 tache 05 tache 06
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
0,01
0,89 0,9
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0
20
40
60
80
100
Tache 01 Tache 02 Tache 03
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
0,01
0,36
0,89
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0
20
40
60
80
100
Tache 01 Tache 02 Tache 03
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
KONE KOUWELTON PATRICK 122
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
e. Analyse de la fraction à l 'eau
Figure 63: : Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia
0,01
0,89 0,9
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
tache 1 tache 2 tache 3
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
KONE KOUWELTON PATRICK 123
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Les chromatogrammes HPTLC ont été interprétés en se basant sur les bandes
d’absorption UV des familles de métabolites secondaires et nous ont permis de classer les
métabolites secondaires des fractions en trois grandes familles. En effet, les zones d’absorption
des différentes taches nous renseignent sur les métabolites qui y sont présents. La révélation
s’est faite sur six (6) longueurs d’onde à savoir 250, 280, 310, 340, 370 et 400 nm. L’attribution
des familles de métabolites secondaires s’est faite sur la base du pourcentage d’absorption
maximale sur l’ensemble des longueurs d’ondes pour chaque tache en se basant sur les
longueurs d’onde de la littérature à savoir 250 et 280 nm pour les terpènes et stérols (Traina et
al., 1990), 310 nm pour les alcaloïdes (Sangster and Stuart, 1965) et 340, 370 et 400 nm pour
les flavonoïdes (Marinova et al., 2005; Menziani et al., 1990). Les valeurs maximales du
rapport frontal (Rf) des composés séparés en utilisant un système d’éluant (Hexane/acétate
d’éthyle : 1/3 (V /V)) et les pourcentages des composés dans le mélange ont été obtenues. Le
choix du solvant est un paramètre important pour obtenir la meilleure séparation (Pothier and
Galand, 2005) et le solvant ne doit pas absorber dans la région de l’UV concernée pour éviter
des interférences. L’ensemble des résultats est consigné dans le tableau 26.
KONE KOUWELTON PATRICK 124
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 26: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia
Fractions Taches
% d’Absorption à différentes longueurs d’ondes
(nm) Rf
max
Proportion de
la tache (en
%)
Familles de métabolites secondaires recherchés
250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes et stérols
FHA
1HA 38,32 33,88 40,52 43,23 36,20 24,13 0,01 35,64 + - -
2HA 0,00 0,00 0,00 6,92 7,35 11,00 0,05 3,45 + - -
3HA 0,00 0,00 0,00 9,18 13,14 17,88 0,10 5,49 + - -
4HA 0,00 0,00 0,00 7,70 7,65 10,53 0,14 3,49 + - -
5HA 0,00 0,00 0,00 0,00 13,53 18,92 0,23 4,62 + - -
6HA 18,38 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,43 3,93 - - +
7HA 0,00 6,38 16,25 14,74 0,00 0,00 0,44 5,84 - + -
8HA 0,00 0,00 3,33 4,53 4,33 4,00 0,46 2,21 + - -
9HA 1,59 0,00 0,00 0,00 4,11 3,63 0,47 1,39 + - -
10HA 7,86 7,15 11,12 13,70 13,69 9,90 0,48 9,89 + - -
11HA 33,85 52,59 28,79 0,00 0,00 0,00 0,90 24,04 - - +
FDA
1DA 82,02 67,30 79,58 85,12 79,24 72,31 0,01 76,99 + - -
2DA 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 11,10 0,05 1,30 + - -
3DA 0,00 0,00 5,57 8,26 9,18 0,00 0,06 3,50 + - -
4DA 0,00 0,00 0,00 9,18 11,58 16,59 0,10 4,39 + - -
5DA 0,00 0,00 12,53 0,00 0,00 0,00 0,90 13,36 - + -
6DA 0,00 0,00 2,32 0,00 0,00 0,00 0,91 0,46 - + -
KONE KOUWELTON PATRICK 125
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 27: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia (suite)
Fractions Taches
% d’Absorption à différentes longueurs d’ondes
(nm) Rf max
Proportion de
la tache en %
Famille de métabolites secondaires
recherchées
250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes et
stérols
FAA
1AA 88,57 41,86 50,83 100,00 100,00 100,00 0,01 91,14 + - -
2AA 6,15 0,00 7,72 0,00 0,00 0,00 0,89 2,79 - + -
3AA 0,00 20,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,9 6,07 - - +
FBA
1BA 75,30 50,76 77,19 100,00 100,00 100,00 0,01 76,57 + - -
2BA 0,00 6,85 0,00 0,00 0,00 0,00 0,36 2,03 - - +
3BA 14,72 42,39 22,81 0,00 0,00 0,00 0,89 21,39 - - +
FEA
1EA 69,84 48,46 73,63 100,00 100,00 100,00 0,01 73,11 + - -
2EA 0,00 51,54 26,37 0,00 0,00 0,00 0,89 21,51 - - +
3EA 30,16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,9 5,38 - - +
KONE KOUWELTON PATRICK 126
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.1.2. Discussion
La figure 61 montre des différences dans les empreintes chromatographiques des taches
dans les différentes fractions qui n’ont pas le même nombre de taches pour un même extrait.
En effet, les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau
issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia ont respectivement 11, 6, 3, 3 et 3
taches traduisant ainsi une plus grande richesse en famille de métabolites secondaires des deux
premières fractions. Lors d’une extraction liquide/liquide par polarité croissante de solvant, les
premiers solvants utilisés récupèrent le maximum de produits par épuisement de l’extrait. Ces
derniers sont donc faiblement épuisés par le solvant suivant entrainant ainsi son
appauvrissement. Les taches n’absorbent pas toutes aux six (6) longueurs d’ondes de l’étude et
cela est lié à la nature de leurs groupes chromophores. En effet, les caractéristiques d’absorption
des molécules organiques dans la région de l’Ultra-Violet (UV) dépendent des transitions
électroniques qui peuvent se produire et de l’effet de l’environnement atomique sur la transition
(Silverstein, 2005). Les résultats obtenus montrent que la quantité de métabolites détectée est
liée à la longueur d’ondes utilisée et à la nature de la fraction. A titre d’exemple, la tache 1HA
de la fraction à l’hexane de A. cordifolia est détectée aux six longueurs d’onde alors que dans
cette même fraction, la tache 6HA n’est détectée qu’à 250 nm (figure 61, a).
Le chromatogramme de la fraction à l’hexane de Alchornea cordifolia présente onze
(11) taches dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,9. L’analyse du tableau 26
montre que les taches 1HA (Rf = 0,01), 11HA (Rf = 0,9) sont les plus abondantes dans cette
fraction avec respectivement des proportions de 35,64 % et 24,04 % en fonction des composés
révélés aux différentes longueurs d’ondes suivies des taches 10HA (Rf = 0,48) (9,89 %) et 7HA
(Rf = 0,44) (5,84 %) Les taches 8HA et 9HA sont les moins abondantes dans cette fraction avec
des proportions respectives 2,21 % et 1,39 %. La tache 1HA présente un pourcentage
d’absorption maximale (43,23) à 340 nm qui indique qu’elle est composée de métabolites
secondaires de la famille des flavonoïdes alors que la tache 11HA présente un pourcentage
d’absorption maximale (52,59) à 280 nm et contient ainsi des terpènes et stérols (probablement
des terpènes à cause de la polarité de cette fraction). La tache 7HA présente un pourcentage
d’absorption maximale (16,25) à 310 nm et est constituée d’alcaloïdes. L’analyse de l’ensemble
des taches montre que les taches 1HA, 2HA, 3HA, 4HA, 5HA, 8HA, 9HA et 10HA sont
constituées de flavonoïdes et représentent une proportion totale de 66,18 %. Les taches 6HA et
11HA sont constituées de terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de la polarité
KONE KOUWELTON PATRICK 127
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
de cette fraction) et représentent une proportion totale de 27,97 %. La tache 7HA est constituée
d’alcaloïdes et représentent une proportion totale de 5,84 %. Au total, la fraction à l’hexane
contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour
les flavonoïdes suivie des terpènes et stérols et une faible proportion d’alcaloïdes.
Le chromatogramme de la fraction au dichlorométhane de Alchornea cordifolia présente
six (6) taches dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,91. La tache 1DA, la plus
abondante (76,99 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (85,12) à 340 nm qui
indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivis de la tache 5DA (Rf = 0,90) (13,36 %) qui
présente un pourcentage d’absorption maximale (12,53) à 310 nm indiquant qu’elle contient
des alcaloïdes (figure 61 b, tableau 26). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les
taches 1DA, 2DA, 3DA et 4DA sont constituées de flavonoïdes et représentent une proportion
totale de 86,18 %. Les taches 5DA et 6DA sont constituées d’alcaloïdes et représentent une
proportion totale de 13,82 %. Au total, la fraction au dichlorométhane contient deux familles
de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour les flavonoïdes suivis des
alcaloïdes. Cette fraction ne contient pas de terpènes et stérols détectables par cette méthode.
Le chromatogramme de la fraction à l’acétate d’éthyle de Alchornea cordifolia présente
trois (3) taches dont les rapports frontaux sont de 0,01 ; 0,9 et 0,91. La tache 1AA, la plus
abondante (91,14 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et
400 nm qui indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivie de la tache 3AA (Rf = 0,90)
(6,07 %) présentant un pourcentage d’absorption maximale (20,10) à 280 nm et contenant
uniquement des terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité de cette
fraction) (figure 61 c, tableau 26). La tache 2AA (Rf = 0,89) (2,79 %), la moins abondante
présente un pourcentage d’absorption maximale (7,72) à 310 nm qui indique qu’elle est
composée d’alcaloïdes. Au total, la fraction à l’acétate d’éthyle contient les trois familles de
métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour les flavonoïdes suivis des
terpènes et stérols ainsi qu’une faible proportion d’alcaloïdes.
Le chromatogramme de la fraction au butanol de Alchornea cordifolia présente trois (3)
taches dont les rapports frontaux sont 0,01 ; 0,36 et 0,89. La tache 1, la plus abondante (76,57
%) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et 400 nm qui indique
qu’elle est composée de flavonoïdes suivie des taches 3BA (Rf = 0,89) (21,39 %) et 2BA (Rf
= 0,36) (2,03 %) qui présentent des pourcentages d’absorption maximale respectifs de (42,39)
et (6,85) à 280 nm et qui indiquent qu’elles sont composées de terpènes et stérols (probablement
KONE KOUWELTON PATRICK 128
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
des stérols à cause de la polarité de cette fraction) (figure 61 d, tableau 26). Au total, la fraction
au butanol contient deux familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée
pour flavonoïdes suivis des terpènes et stérols. Les alcaloïdes ne sont pas détectables par cette
méthode dans cette fraction.
Le chromatogramme de la fraction à l’eau de Alchornea cordifolia présente trois (3)
taches dont les rapports frontaux sont 0,01 ; 0,89 et 0,90. La tache 1EA, la plus abondante
(73,11 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et 400 nm qui
indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivie des taches 2EA (Rf = 0,89) (21,51 %) et
3EA (Rf = 0,90) (5,38 %) qui présentent des pourcentages d’absorption maximale respectifs de
(51,54) à 280 et (30,16) à 250 nm et qui indiquent qu’elles sont composées de terpènes et stérols
(probablement des stérols à cause de la polarité de cette fraction) (figure 61 d, tableau 26). Au
total, la fraction à l’eau contient deux familles de métabolites recherchées avec une tendance
plus prononcée pour flavonoïdes suivis des terpènes et stérols. Les alcaloïdes ne sont pas
détectables par cette méthode dans cette fraction.
Nous n’avons pas trouvé dans la littérature des données similaires afin de les comparer
à nos résultats. Toutefois, l'étude de l'extrait éthanolique de E. alsinoides par HPTLC a révélé
la présence de stéroïdes, de terpénoïdes et de glycosides dans cet extrait (Gomathi et al., 2012).
La HPTLC a été utilisée pour la détermination comme un outil utile pour validation
analytique des nouvelles formes de produits naturels et a permis de déterminer une quantité du
composé adultérant légèrement supérieure à celle contenue dans un comprimé de Viagra
(Nicoletti, 2011). Cette technique analytique a été appliquée avec succès à l'identification et à
la quantification de la sibutramine ajoutée illégalement dans certains produits amaigrissants
commercialisés sur les marchés (Ariburnu et al., 2012). Elle a été appliquée pour les estimations
simultanées du Telmisartan et du Ramipril sous forme de doses combinées (Patel et al., 2010)
ou encore de la β-Sitostérol-D-glucoside et de la Withaférine A (Jirge et al., 2011). Cette
technique a été utilisée en préparative pour la séparation et l’isolation de flavonoïdes de
Launaea procumbens (Mishra et al., 2012).
KONE KOUWELTON PATRICK 129
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus
amarus
I.2.1. Résultats
Les chromatogrammes HPTLC ont été obtenus pour les fractions à l’hexane (FHP), au
dichlorométhane (FDP), à l’acétate d’éthyle (FAP), au butanol (FBP) et à l’eau (FEP) issues de
l’extrait hydroalcoolique de P. amarus issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus
amarus (annexe 02). Les spectres ont été mesurés à 6 longueurs d'onde (250, 280, 310, 340,
370 et 400 nm) en fonction des familles de métabolites secondaires recherchés (Senior et al.,
2012). Les résultats des analyses ont été traités dans les figures 61.
KONE KOUWELTON PATRICK 130
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a: Analyse de la fraction à l 'hexane
b: Analyse de la fraction au dichlorométhane
c: Analyse de la fraction à l’acétate d'éthyle
d: Analyse de la fraction au butanol
0,01
0,09
0,49
0,61
0,71 0,720,78 0,79
0,94
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
tache01
tache02
tache03
tache04
tache05
tache06
tache07
tache08
tache09
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
0,01 0,030,07 0,08
0,13
0,25
0,61
0,68 0,7 0,71
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
10
20
30
40
50
60
70
Tache01
Tache02
Tache03
Tache04
Tache05
Tache06
Tache07
Tache08
Tache09
Tache10
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
0,01 0,03 0,04 0,07 0,08 0,09
0,270,32 0,34
0,6 0,620,7 0,73 0,74
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
tach
e 0
1
tach
e 0
2
tach
e 0
3
tach
e 0
4
tach
e 0
5
tach
e 0
6
tach
e 0
7
tach
e 0
8
tach
e 0
9
tach
e 1
0
tach
e 1
1
tach
e 1
2
tach
e 1
3
tach
e 1
4
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
0,010,04
0,08
0,690,74
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
tache 01 tache 02 tache 03 tache 04 tache 05
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
KONE KOUWELTON PATRICK 131
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
e: Analyse de la fraction à l 'eau
Figure 64: Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus amarus
Les chromatogrammes HPTLC ont été interprétés comme précédemment. L’ensemble des résultats est consigné dans le tableau XX.
0,01
0,71 0,730,77
0,94 0,95
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tache 01 Tache 02 Tache 03 Tache 04 Tache 05 Tache 06
Rap
po
rt f
ron
tal
Ab
sorp
tio
n %
250 280 310 340 370 400 RF
KONE KOUWELTON PATRICK 132
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 28: Composition chimique des différentes fractions de Phyllanthus amarus
Fractions Taches
% d’Absorption à différentes longueurs
d’ondes (nm) Rf
max
Proportion
de la tache
(en %)
Familles de métabolites secondaires
recherchés
250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes et
stérols
FHP
1HP 7,65 7,71 20,65 31,27 24,62 14,17 0,01 11,71 + - -
2HP 0,00 0,00 1,99 10,11 13,75 15,54 0,09 2,68 + - -
3HP 4,21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,49 1,51 - - +
4HP 2,99 6,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,61 3,48 - - +
5HP 79,62 78,73 0,00 0,00 0,00 0,00 0,71 56,30 - - +
6HP 0,00 0,00 52,85 58,62 61,63 58,00 0,72 16,44 + - -
7HP 0,00 0,00 12,35 0,00 0,00 0,00 0,78 1,30 - + -
8HP 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,29 0,79 0,96 + - -
9HP 5,53 6,74 12,16 0,00 0,00 0,00 0,94 5,64 - + -
FDP
1DP 37,10 38,65 48,25 41,06 35,19 29,54 0,01 38,09 - + -
2DP 0,00 0,00 7,14 8,12 9,01 10,00 0,03 5,20 + - -
3DP 2,55 4,31 9,31 10,78 9,78 9,65 0,07 7,35 + - -
4DP 3,10 4,04 9,37 15,12 19,24 19,83 0,08 11,11 + - -
5DP 0,00 0,00 0,00 4,32 5,85 6,83 0,13 2,63 + - -
6DP 0,00 0,00 5,57 3,62 0,00 0,00 0,25 1,34 - + -
7DP 0,00 4,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,61 0,89 - - +
8DP 0,00 0,00 13,15 8,58 7,11 0,00 0,68 4,21 - + -
9DP 57,25 48,80 0,00 0,00 13,83 0,00 0,70 22,90 - - +
10DP 0,00 0,00 7,21 8,41 0,00 24,14 0,71 6,27 + - -
KONE KOUWELTON PATRICK 133
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 29: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite)
Fractions Taches
% d’Absorption à différentes longueurs
d’ondes (nm) Rf
max
Proportion
de la tache
(en %)
Familles de métabolites secondaires
recherchés
250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes
et stérols
FAP
1AP 68,47 63,63 73,72 77,21 75,02 67,12 0,01 70,56 + - -
2AP 2,31 4,91 0,00 7,54 6,31 7,79 0,03 4,50 + - -
3AP 0,00 0,00 10,81 0,00 0,00 0,00 0,04 2,12 - + -
4AP 0,00 1,81 0,00 3,40 0,00 0,00 0,07 0,96 + - -
5AP 0,00 2,46 0,00 0,00 11,74 0,00 0,08 1,92 + - -
6AP 0,00 2,46 4,40 6,25 0,00 15,00 0,09 4,27 + - -
7AP 0,00 1,86 2,97 0,00 0,00 0,00 0,27 1,00 - + -
8AP 1,53 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,24 - - +
9AP 3,55 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,34 0,57 - - +
10AP 0,00 2,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,60 0,45 - - +
11AP 0,00 0,00 3,27 0,00 0,00 0,00 0,62 0,64 - + -
12AP 22,13 13,53 0,00 5,60 6,93 10,09 0,70 9,64 - - +
13AP 0,00 0,00 4,83 0,00 0,00 0,00 0,73 0,95 - + -
14AP 0,00 9,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,74 2,19 - - +
KONE KOUWELTON PATRICK 134
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 30: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite et fin)
Fractions Taches
% d’absorption aux différentes longueurs d’ondes
(nm) Rf
max
Proportion
de la tache
(en %)
Famille de métabolites secondaires
recherchés
250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes
et stérols
FBP
1BP 40,09 48,24 83,70 100,00 100,00 93,17 0,01 66,46 + - -
2BP 1,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,47 - - +
3BP 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,83 0,08 0,54 + - -
4BP 42,87 26,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,69 18,47 - - +
5BP 15,10 25,43 16,30 0,00 0,00 0,00 0,74 14,06 - - +
FEP
1EP 20,99 13,99 33,14 100,00 100,00 100,00 0,01 31,65 + - -
2EP 0,00 21,44 32,58 0,00 0,00 0,00 0,71 15,22 - + -
3EP 36,48 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,73 8,85 - - +
4EP 28,33 49,34 22,95 0,00 0,00 0,00 0,77 32,22 - - +
5EP 14,21 15,22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,94 9,95 - - +
6EP 0,00 0,00 11,33 0,00 0,00 0,00 0,95 2,11 - + -
KONE KOUWELTON PATRICK 135
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
I.2.2. Discussion
La figure 62 montre des différences dans les empreintes chromatographiques des taches
dans les différentes fractions qui n’ont pas le même nombre de taches pour un même extrait.
En effet, les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau
issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus amarus ont respectivement 9, 10, 14, 5 et
6 taches traduisant ainsi une plus grande richesse en famille de métabolites des trois premières
fractions. Les taches n’absorbent pas toutes aux six (6) longueurs d’ondes de l’étude et cela est
lié à la nature de leurs groupes chromophores. En effet, les caractéristiques d’absorption des
molécules organiques dans la région de l’UV dépendent des transitions électroniques qui
peuvent se produire et de l’effet de l’environnement atomique sur la transition (Silverstein,
2005). Les résultats obtenus montrent que la quantité de métabolites détectée est liée à la
longueur d’ondes utilisé et à la nature de la fraction. A titre d’exemple, la tache 1HP de la
fraction à l’hexane de Phyllanthus amarus est détectée aux six longueurs d’onde alors que dans
cette même fraction, les lots de taches (8HP et 9HP) et 10HP et 11HP ne sont respectivement
détectés qu’à 250, 280 et 310 nm (figure 62, a).
Le chromatogramme de la fraction à l’hexane de Phyllanthus amarus présente neuf (9)
taches dont les rapports frontaux maximums sont compris entre 0,01 et 0,94. La tache 5HP (Rf
= 0,71), la plus abondante de cette fraction (56,30 %) présente un pourcentage d’absorption
maximale (79,62) à 250 nm qui indique qu’elle est composée de métabolites secondaires de la
famille des terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de la polarité de cette fraction)
suivie de la tache 6HP (Rf = 0,72) (16,44 %) qui présente un pourcentage d’absorption
maximale (61,63) à 370 nm et contient ainsi des flavonoïdes. Les taches 7HP (Rf = 0,78) (1,30
%) et 9HP (Rf = 0,94) (5,64 %) présentent des pourcentages d’absorption maximale respectifs
de (12,35) et (12,16) à 310 nm indiquant qu’elles sont composées d’alcaloïdes (figure 62 a,
tableau 28). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les taches 1HP, 2HP, 6HP, et 8HP
sont constituées de flavonoïdes et représentent une proportion totale de 31,79 %. Les taches
3HP, 4HP et 5HP sont constituées de terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de
la polarité de cette fraction) et représentent une proportion totale de 61,28 %. Les taches 7HP
et 9HP sont constituées d’alcaloïdes et représentent une proportion totale de 6,94 %. Au total,
la fraction à l’hexane contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance
plus prononcée pour les terpènes et stérols suivis des flavonoïdes et une faible proportion
d’alcaloïdes.
KONE KOUWELTON PATRICK 136
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Le chromatogramme de la fraction au dichlorométhane de Phyllanthus amarus présente
dix (10) taches dont les rapports frontaux maximums sont compris entre 0,01 et 0,71. La tache
1DP (Rf = 0,01), la plus abondante (38,09 %) présente un pourcentage d’absorption maximale
(48,25) à 310 nm qui indique qu’elle est composée d’alcaloïdes suivie de la tache 9DP (Rf =
0,70) (22,90 %) qui présente un pourcentage d’absorption maximale (57,25) à 250 nm
indiquant qu’elle est composée de terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de la
polarité de cette fraction) (figure 62 b, tableau 28). L’analyse de l’ensemble des taches montre
que les taches 1DP, 6DP et 8DP sont constituées d’alcaloïdes et représentent une proportion
totale de 43,64 %. Les taches 2DP, 3DP, 4DP, 5DP et 10DP sont constituées de flavonoïdes et
représentent une proportion totale de 32,56 %. Les taches 7DP et 9DP sont constituées terpènes
et stérols (probablement des terpènes à cause de la polarité de cette fraction) et représentent une
proportion totale de 23,79 % (figure 62 b, tableau 28). Au total, la fraction au dichlorométhane
contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour
les alcaloïdes suivis des flavonoïdes et des terpènes et stérols.
Le chromatogramme de la fraction à l’acétate d’éthyle de Phyllanthus amarus présente
quatorze (14) taches dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,74. La tache 1AP
(Rf = 0,01), la plus abondante (70,56 %) présente un pourcentage d’absorption maximale
(75,02) à 370 nm qui indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivis de la tache 12AP (Rf
= 0,70) (9,64 %) qui présente un pourcentage d’absorption maximale (22,13) à 250 nm
indiquant qu’elle est composée de terpènes et stérols (figure 62 c, tableau 29). L’analyse de
l’ensemble des taches montre que les taches 1AP, 2AP, 4AP, 5AP et 6AP sont constituées de
flavonoïdes et représentent une proportion totale de 82,21 %. Les taches 3AP, 7AP, 11AP et
13AP sont constituées d’alcaloïdes et représentent une proportion totale de 4,71 %. Les taches
8AP, 9AP, 10AP, 12AP et 14AP sont constituées terpènes et stérols et représentent une
proportion totale de 13,09 % (figure 62 c, tableau 29). Au total, la fraction à l’acétate d’éthyle
contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée des
flavonoïdes suivis des terpènes et stérols ainsi qu’une faible proportion d’alcaloïdes.
Le chromatogramme de la fraction au butanol de Phyllanthus amarus présente cinq (5)
taches dont les rapports frontaux maximums sont compris entre 0,01 et 0,74. La tache 1BP (Rf
= 0,01), la plus abondante (66,46 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00)
à 340 et 370 nm qui indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivis des taches 4BP (Rf =
0,69) (18,47 %) et 5BP (Rf = 0,74) (14,06 %) qui présentent des pourcentages respectifs
KONE KOUWELTON PATRICK 137
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
d’absorption maximale (42,87) à 250 nm et (25,43) à 280 nm indiquant qu’elles sont composées
de terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité de cette fraction) (figure
62 d, tableau 30). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les taches 1BP, et 3BP sont
constituées de flavonoïdes et représentent une proportion totale de 67,00 %. Les taches 2BP,
4BP et 5BP sont constituées terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité
de cette fraction) et représentent une proportion totale de 33,00 %. Au total, la fraction au
butanol contient deux familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée
des flavonoïdes suivis des terpènes et stérols. Cette fraction ne contient pas d’alcaloïdes.
Le chromatogramme de la fraction à l’eau de Phyllanthus amarus présente six (6) taches
dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,95. La tache 4EP (Rf = 0,77), la plus
abondante (32,22 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (49,34) à 280 nm qui
indique qu’elle est composée de terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la
polarité de cette fraction) suivis de la tache 1EP (Rf = 0,01) (31,65 %) qui présente un
pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et 400 nm indiquant qu’elle est
composée flavonoïdes (figure 62 e, tableau 30). La tache 2EP (Rf = 0,71) (15,22 %) présente
un pourcentage d’absorption maximale (32,58) à 310 nm indiquant qu’elle est composée
d’alcaloïdes (figure 62 e, tableau 30). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les taches
1EP est constituée de flavonoïdes et représente une proportion totale de 31,65 %. Les taches
2EP et 6EP sont constituées d’alcaloïdes et représentent 17,33 %. Les taches 3EP, 4EP et 5EP
sont constituées de terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité de cette
fraction) et représentent une proportion totale de 51,02 %. Au total, la fraction à l’eau contient
les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour les terpènes
et stérols suivis des flavonoïdes puis des alcaloïdes. La présence d’alcaloïdes dans cette fraction
alors qu’ils sont absents de la fraction précédente pourrait s’expliquer par la présence d’un sucre
ou de plusieurs sucres liés à un aglycone alcaloïde dont l’ensemble est très soluble dans l’eau.
Nous n’avons pas trouvé dans la littérature des données similaires afin de les comparer
à nos résultats. Toutefois, L'étude de l'extrait éthanolique de E alsinoides par HPTLC a révélé
la présence de stéroïdes, de terpénoïdes et de glycosides dans cet extrait (Gomathi et al., 2012).
La HPTLC a été utilisée pour la détermination comme un outil utile pour validation
analytique des nouvelles formes de produits naturels et a permis de déterminer une quantité du
composé adultérant légèrement supérieure à celle contenue dans un comprimé de Viagra
(Nicoletti, 2011). Cette technique analytique a été appliquée avec succès à l'identification et à
KONE KOUWELTON PATRICK 138
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
la quantification de la sibutramine ajoutée illégalement dans certains produits amaigrissants
commercialisés sur les marchés (Ariburnu et al., 2012). Elle a été appliquée pour les estimations
simultanées du Telmisartan et du Ramipril sous forme de doses combinées (Patel et al., 2010)
ou encore de la β-Sitostérol-D-glucoside et de la Withaférine A (Jirge et al., 2011). Cette
technique a été utilisée en préparative pour la séparation et l’isolation de flavonoïdes de
Launaea procumbens (Mishra et al., 2012).
II. IDENTIFICATION PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE
Les spectres Infrarouge (IR) sont utilisés pour identifier les groupes fonctionnels de
métabolites secondaires sur la base de la valeur des pics dans la région de 4000 à 500 cm-1. Un
spectre Infra Rouge permet d’obtenir des informations sur le groupe caractéristique dans la
molécule étudiée. Chaque bande d’absorption est associée à un type de liaison ce qui permet de
retrouver le groupe caractéristique. Les symboles suivants et leurs significations ont été
utilisés : ν (Elongation), β (Flexion dans le plan), γ (Flexion hors du plan), ω (Hochement ou
Déformation angulaire hors du plan), ρ (Balancement ou Déformation angulaire dans le plan),
τ (Torsion), δ (Cisaillement), a (asymétrique), s (symétrique). La liaison chimique concernée
par la fréquence de vibration est en gras. Les longueurs d’ondes sont exprimées en cm-1. Les
attributions ont été faites selon Silverstein et al. (2005), Rolere et al. (2015), Xu et al. (2012),
Vijayalakshmi et Ravindhran (2012), Belboukhari et al. (2013) et Bulama et al.
(2015)(Belboukhari et al., 2013; Bulama et al., 2015; Rolere et al., 2015; Silverstein, 2005;
Vijayalakshmi and and Ravindhran, 2012). Cette étude a été réalisée sur les différentes fractions
de Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus.
II.1. Spectres infrarouges des différentes fractions de Alchornea cordifolia
II.1.1. Résultats
Les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau de
Alchornea cordifolia sont respectivement notées FHA, FDA, FAA, FBA et FEA. L’ensemble
des spectres est donné dans la figure 63.
KONE KOUWELTON PATRICK 139
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre IR de la fraction à l’hexane de A. cordifolia
b. Spectre IR de la fraction au dichlorométhane de A. cordifolia
c. Spectre IR de la fraction à l’acétate d'éthyle de A. cordifolia
d. Spectre IR de la fraction au butanol de A. cordifolia
3412
3012
2925,5
2853,5
1736
1620
1464,5
1377,5
1171,5
1036,5
719,5
50
55
60
65
70
75
80
85
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FHA
3421,5 2921,5
2850,5 1715
1617
1513,5
1463,51318 1200
1038,5
50
60
70
80
90
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FDA
3405,5
2978
2930,5
1701,5
1618
1536
15141449,5
1339,5
1199
1112,5;
1036971
923
882,5
770
10
20
30
40
50
60
70
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FAA
3411
2969
2931,5
1711,5
1616,5
1511 1449,5
1331,5
1208,51089,5
1041
967
909,5
872
762
15
25
35
45
55
65
75
85
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FBA
KONE KOUWELTON PATRICK 140
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
e . Spectre IR de la fraction à l’eau de A. cordifolia
Figure 65: Spectres Infrarouge des fractions de Alchornea cordifolia
3414,52920
1715
1616,5
1446,5 1344,51212 1045,5
864,5
766
669,5
609,5
15
25
35
45
55
65
75
5001000150020002500300035004000TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FEA
KONE KOUWELTON PATRICK 141
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Le spectre de FHA (figure 63 a) montre la présence de bandes à 3412 cm-1 (ν N-H) ; 3012
(ν –C=C-H), 2925,5 (νa -CH3), 2853,5 (νa -CH2-), 1736 (ν –(C=O)-OR), 1620 (ν –(C=C)-) ,
1464,5 (δ -C-H), 1377,5 (δ -CH3), 1171,5 (ω -CH2-), 1036,5 (ν C-N), 719,5 (ρ -CH2-).
L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupement amine, de chaines aliphatiques
saturées et insaturées, de groupements carbonyles (ester). La différence entre la bande de
l’amine et celle de l’alcool réside dans la taille de la bande. En effet, la bande correspondant à
OH est large alors que celle de NH est moyenne (Silverstein, 2005).
Le spectre de FDA (figure 63 b) montre la présence de bandes à 3421,5 cm-1 (υ N-H et υ
O-H) , 2921,5 (νa -CH2-), 2850,5 (νa -CH2-), 1715 (ν –(C=O)-OR), 1617 (ν –(C=C)-) , 1513,5
(ν Ar), 1463,5 (δ -C-H), 1318 (δs -CH3), 1200 (νa -O-C=C-), 1038,5 (ν C-N). L’ensemble de
ces résultats montre la présence de groupements amine et hydroxyle, de chaines aliphatiques,
de structures carbonées avec des liaisons multiples et de groupements carbonyles (ester).
Le spectre de FAA (figure 63c) montre la présence de bandes à 3405,5 cm-1 (υ O-H),
2978 (νa -CH3), 2930,5 (νa -CH2-), 1701,5 (ν –(C=O)-OH), 1618 (ν –(C=C)-), 1536 (νa CO2-
), 1514 (ν Ar), 1449,5 (δ -CH2-), 1339,5 (δa -CH3), 1199 (νa -O-C=C-), 1112,5 (ν C-C + ω -
CH2-), 1036 (ρ -CH3), 971 (τ C=C, Ar), 923 (ν C-C), 882,5 (ω -CH3), 770 (ω -C-H, Ar).
L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements alcools (acides carboxyliques),
de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons multiples, de groupements
carbonyles (acide) et de cycles aromatiques.
Le spectre de FBA (figure 63 d) montre la présence de bandes à 3411 cm-1 (υ O-H), 2969
(νa -CH3), 2931,5 (νa -CH2-), 1711,5 (ν –(C=O)-OH), 1616,5 (ν –(C=C)-), 1511 (ν Ar), 1449,5
(δ -CH2-), 1331,5 (δa -CH3), 1208,5 (νa -O-C=C-), 1089,5 (τ -CH2-), 1041 (ρ -CH3), 967 (τ
C=C, Ar), 909,5 (ν C-C), 872 (ω -CH3), 762 (ω -C-H, Ar).
L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements alcools (acides
carboxyliques), de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons multiples, de
groupements carbonyles (acide) et de cycles aromatiques.
Le spectre de FEA (figure 63 e) montre la présence de bandes à 3414,5 cm-1 (υ O-H),
2920 (νa -CH2-), 1715 (ν –(C=O)-OH), 1616,5 (ν –(C=C)-), 1446,5 (δ -CH2-), 1344,5 (δa -
CH3), 1212 (νa -O-C=C-), 1045,5 (ρ -CH3), 766 (ω -C-H, Ar), 669,5 (ω C=C, Phénol), 609,5
(ω O-H, Phénol).
KONE KOUWELTON PATRICK 142
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
L’ensemble des résultats obtenus montre la présence de groupements alcools (acides
carboxyliques, phénols), de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons
multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques (phénols).
II.1.2. Discussion
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’hexane montre la présence de la
fonction amine traduite par deux bandes à 3412 (ν N-H) et 1036,5 (ν C-N) indiquant la présence
d’alcaloïdes (Hocquemiller et al., 1984). Les autres bandes notamment celles à 1377,5 (δ -CH3)
et 1620 (ν –(C=C)-) indiquent également la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980;
Holopainen, 2004b). L’absence de bandes correspondant à des groupements aromatique et
hydroxyle traduit l’absence de flavonoïdes. On peut noter que le spectre ne présente pas de
bandes à 815, 824, 872 ou 882 cm-1 qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols
(Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où l’absence de cette famille dans la fraction à l’hexane.
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au dichorométhane montre la présence
de la fonction amine traduite par deux bandes à 3421,5 (ν N-H) et 1038,5 (ν C-N) indiquant la
présence d’alcaloïdes (Hocquemiller et al., 1984). Les bandes à 1377,5 (δ -CH3) et 1620 (ν –
(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b). La
présence de la large bande à 3421,5 (υ O-H) ainsi que des bandes à 1200 (νa -O-C=C-) et à
1513,5 (ν Ar) indique la présence de flavonoïdes dans cette fraction. La présence simultanée
des groupements hydroxyle et amine à 3421,5 cm-1 donne une superposition de leurs bandes
d’absorption habituelle. On peut noter que le spectre ne présente pas de bandes à 815, 824, 872
ou 882 cm-1 qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et
al., 1976) d’où l’absence de cette famille dans cette fraction.
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’acétate d’éthyle montre la présence
de la fonction hydroxyle traduite par la bande à 3405,5 (υ O-H). La présence de cette bande
ainsi que de celle des bandes à 1199 (νa -O-C=C-) et à 1514 (ν Ar) indique la présence de
flavonoïdes dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par les
bandes à 971 (τ C=C, Ar), 770 (ω -C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par les bandes à
1701,5 (ν –(C=O)-OH) et 1536 (νa CO2-) indiquent la présence de composés phénoliques
(Williams and Grayer, 2004). Les bandes à 1339,5 (δa -CH3) et 1618 (ν –(C=C)-) indiquent la
présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre
KONE KOUWELTON PATRICK 143
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
présente une bande à 882,5 (ω -CH3) qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols
(Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où la présence de cette famille dans la fraction à
l’acétate d’éthyle. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au butanol montre la présence de la
fonction hydroxyle traduite par la bande à 3411 (υ O-H). La présence de cette bande ainsi que
de celle des bandes à 1208,5 (νa -O-C=C-) et à 1511 (ν Ar) indique la présence de flavonoïdes
dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par les bandes à 967
(τ C=C, Ar), 762 (ω -C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par les bandes à 1711,5 (ν –
(C=O)-OH) indiquent la présence de composés phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les
bandes à 1331,5 (δa -CH3) et 1616,5 (ν –(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et
al., 1980; Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre présente une bande à 872 (ω -CH3)
qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976)
d’où la présence de stérols dans cette fraction. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’eau montre la présence de la
fonction hydroxyle traduite par la bande à 3414,5 (υ O-H). La présence de cette bande ainsi
que de celle des bandes à 1212 (νa -O-C=C-), 766 (ω -C-H, Ar), 669,5 (ω C=C, Phénol) et
609,5 (ω O-H, Phénol) indique la présence de flavonoïdes dans cette fraction. En plus, la
présence de la fonction acide traduite par les bandes à 1715 (ν –(C=O)-OH) indiquent la
présence d’acides phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les autres bandes à 1344,5 (δa -
CH3) et 1616,5 (ν –(C=C)-) indiquent également la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980;
Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre ne présente pas une bande à 872 (ω -CH3)
qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976)
d’où l’absence de cette famille dans la fraction aqueuse. Les alcaloïdes sont également absents
de cette fraction.
II.2. Spectres infrarouges des différentes fractions de Phyllanthus amarus
II.2.1. Résultats
Les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau
de Phyllanthus amarus sont respectivement notées FHP, FDP, FAP, FBP et FEP. L’ensemble des
spectres est donné dans la figure 64.
KONE KOUWELTON PATRICK 144
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre IR de la fraction à l’hexane de P. amarus
2982
2930,5
2852
1728,5
1601
1581
1516
1446,5
1391
1367,5
1286
1173,5
1124,5 1074
1040,5
1018,5
745,5
30
40
50
60
70
80
90
100
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FHP
KONE KOUWELTON PATRICK 145
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
b. Spectre IR de la fraction au dichlorométhane de P. amarus
c. Spectre IR de la fraction à l’acétate d'éthyle de P. amarus
3401,5
2923,5 2853,51731
1602
1515,5
1447,5
1446,5
1366,5
1285,51174,5
1123,5
1074,5
1039
862,5
745,5
706
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FDP
3413,52926
2854
1717,5
1613
1515,5
1449
1304 1206,5
1076,5
1036,5
872,5
744,5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FAP
KONE KOUWELTON PATRICK 146
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
d. Spectre IR de la fraction au butanol de P. amarus
e. Spectre IR de la fraction à l’eau de P. amarus
Figure 66: Spectres Infrarouge des fractions de Phyllanthus amarus
33932926,5
2854,51725,5
1615,5
1516,5
1448
1368
1285,5 1206 1074
1039
744
20
30
40
50
60
70
80
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FBP
3428 2928
1619,5
1384,5
10791046
877,5
820,5
77420
25
30
35
40
45
50
55
60
5001000150020002500300035004000
TRA
NSM
ITTA
NC
E EN
%
LONGUEUR D'ONDE EN cm-1
FEP
KONE KOUWELTON PATRICK 147
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Le spectre de FHP (figure 64 a) montre la présence de bandes à 2982 (ν –C-H), 2930,5
(νa -CH3), 2852 (νa -CH2-), 1728,5 (ν –(C=O)-OR), 1601 (ν –(C=C)-), 1516 (ν Ar), 1446,5 (δ
-C-H), 1367,5 (δ -CH3), 1286 (ν -C-O), 1173,5 (ω -CH2-), 1124,5 (ν C-C + ω -CH2-), 1074 (τ
-CH2-), 1040,5 (ρ -CH3), 745,5 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence
de chaines aliphatiques saturées et insaturées, de groupements carbonyles (ester) et de cycles
aromatiques.
Le spectre de FDP (figure 64 b) montre la présence de bandes à 3401,5 cm-1 (υ N-H et υ
O-H ), 2923,5 (νa -CH2-), 2853,5 (νa -CH2-), 1731 (ν –(C=O)-OR), 1602 (ν –(C=C)-), 1515
(ν Ar), 1446,5 (δ -C-H), 1366,5 (δs -CH3), 1285,5 (ν -C-O), 1174,5 (νa -O-C=C-), 1123,5 (ν
C-C + ω -CH2-), 1074 (τ -CH2-), 1039 (ν C-N), 862,5 (ω -CH3), 745,5 (ω -C-H, Ar).
L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements amines et éthers, de chaines
aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons multiples et de groupements carbonyles
(esters).
Le spectre de FAP (figure 64 c) montre la présence de bandes à 3413,5 cm-1 (υ O-H),
2926 (νa -CH2-), 2854 (νa -CH2-), 1717,5 (ν –(C=O)-OH), 1613 (ν –(C=C)-), 1515 (ν Ar),
1449 (δ -CH2-), 1304 (δa -CH3), 1206,5 (νa -O-C=C-), 1076,5 (τ -CH2-), 1036,5 (ρ -CH3),
872,5 (ω -CH3), 744,5 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence de
groupements alcools (acides carboxyliques), de chaines aliphatiques, de structures carbonées
avec des liaisons multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques.
Le spectre de FBP (figure 64 d) montre la présence de bandes à 3393 cm-1 (υ O-H),
2926,5 (νa -CH2-), 2854 (νa -CH2-), 1725,5 (ν –(C=O)-OH), 1615,5 (ν –(C=C)-), 1516,5 (ν
Ar), 1448 (δ -CH2-), 1368 (δs -CH3), 1285,5 (ν -C-O), 1206 (νa -O-C=C-), 1074 (τ -CH2-),
1039 (ρ -CH3), 744 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence de
groupements alcools (acides carboxyliques), de chaines aliphatiques, de structures carbonées
avec des liaisons multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques.
Le spectre de FEP (figure 64 e) montre la présence de bandes à 3428 cm-1 (υ O-H), 2928
(νa -CH2-), 1619,5 (ν –(C=C)-), 1384,5 (δa -CH3), 1079 (τ -CH2-), 1046 (ρ -CH3), 877,5 (ω -
CH3), 744 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements
alcools (acides carboxyliques, phénols), de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec
des liaisons multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques (phénols).
KONE KOUWELTON PATRICK 148
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
II2.2. Discussion
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’hexane montre la présence de
bandes à 1367,5 (δ -CH3) et 1601 (ν –(C=C)-) qui indiquent la présence de terpènes (Dosseh
et al., 1980; Holopainen, 2004b). La présence de bandes à 1728,5 (ν –(C=O)-OR), 1516 (ν Ar)
et 1286 (ν -C-O) confirme la présence d’esters aromatiques. Ces composés pourraient aussi être
des flavonoïdes ou des acides phénoliques dont les fonctions hydroxyles et acides ont été
éthérifiées ou estérifiés, ce qui confirmerait la présence de ces deux familles dans la fraction.
L’absence de bandes correspondant à la fonction amine qui traduit l’absence d’alcaloïdes. En
outre, le spectre ne présente pas de bandes à 815, 824, 872 ou 882 cm-1 qu'on attribue au groupe
méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où l’absence de stérols
dans cette fraction.
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au dichlorométhane montre la
présence de la fonction amine traduite par deux bandes à 3401,5 (ν N-H) et 1039 (ν C-N)
indiquant la présence d’alcaloïdes (Hocquemiller et al., 1984). Les bandes à 1366,5 (δ -CH3) et
1602 (ν –(C=C)) indiquent également la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen,
2004b). La présence de la large bande à 3401,5 (υ O-H) ainsi que des bandes à 1174,5 (νa -O-
C=C-), à 1515 (ν Ar) et à 745,5 (ω -C-H, Ar) traduit la présence de flavonoïdes dans cette
fraction. La présence simultanée des groupements hydroxyle et amine donne une superposition
de leurs bandes d’absorption habituelle. Le spectre présente une bande à 862,5 (ω -CH3) qu'on
attribue au groupe méthyle terminal des stérols et traduit la présence de cette famille dans la
fraction au dichlorométhane (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976).
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’acétate d’éthyle montre la présence
de la fonction hydroxyle traduite par la bande à 3413,5 (υ O-H). La présence de cette bande
ainsi que de celle des bandes à 1206,5 (νa -O-C=C-) et à 1515 (ν Ar) indique la présence de
flavonoïdes dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par la
bande à 770 (ω -C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par la bande à 1717,5 (ν –(C=O)-
OH) indiquent la présence de d’acides phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les bandes à
1304 (δa -CH3) et 1613 (ν –(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980;
Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre présente une bande à 872,5 (ω -CH3) qu'on
attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où la
présence de stérols dans cette fraction. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.
KONE KOUWELTON PATRICK 149
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au butanol montre la présence de la
fonction hydroxyle traduite par la bande à 3393 (υ O-H). La présence de cette bande ainsi que
de celle des bandes à 1206 (νa -O-C=C-) et à 1516,5 (ν Ar) indique la présence de flavonoïdes
dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par la bande à 744 (ω
-C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par la bande à 1725,5 (ν –(C=O)-OH) indique la
présence d’acides phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les bandes à 1368 (δa -CH3) et
1615,5 (ν –(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b).
Les stérols et alcaloïdes sont absents de cette fraction.
L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’eau montre la présence de la
fonction hydroxyle traduite par la bande à 3428 (υ O-H). La présence de cette bande ainsi que
de celle de la bande à 744 (ω -C-H, Ar) confirme la présence de flavonoïdes dans cette fraction.
Les autres bandes à 1384,5 (δa -CH3) et 1619,5 (ν –(C=C)-) indiquent également la présence
de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre présente une
bande à 877,5 (ω -CH3) qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Itou et al., 1976 ;
Bulama et al., 2015) d’où la présence de cette famille dans la fraction. Les alcaloïdes sont
absents de cette fraction.
III. ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE COUPLEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-
VIOLETTES
La chromatographie en phase liquide à haute performance combinée à la spectroscopie
Ultra-Violette (HPLC-UV) est adaptée à la séparation des constituants d'un mélange même très
complexe tel que la matrice végétale. L'identification des produits élués se fait à l'aide d’un
détecteur UV/visible. Cette technique a été utilisée pour analyser les fractions issues des extraits
hydroalcooliques de Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus. L’identification des
terpènes et stérols s’est basée sur les travaux de Bulama et de ses collaborateurs (Bulama et al.,
2015), de Makin et Gower (2010) et de Brahim Harkati (2011) (Harkati, 2011; Makin and
Gower, 2010). Ces métabolites secondaires sont dotés de doubles liaisons conjuguées qui
absorbent fortement le rayonnement UV dans la plage de longueur d'onde comprise entre
environ 220 et 350 nm. L’identification des flavonoïdes s’est basée sur les maximum
KONE KOUWELTON PATRICK 150
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
d’absorption autour de 270 nm relatif à la bande II et autour de 350 nm relatif à la bande I (Bae
et al., 2015; Kassi, 2013; Mabry et al., 1970; Michel, 2011). Les alcaloïdes ont été identifiés
par les absorptions maximales autour de 228, 275 et 292 nm (Bruneton et al., 1974; Roblot et
al., 1978).
III.1. Chromatographie en phase liquide à haute performance combinée à la
spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Alchornea cordifolia
III.1.1. Résultats
Dans cette partie, seules trois (3) fractions issues de l’extrait hydroalcoolique des
feuilles de Alchornea cordifolia ont été étudiées. Les chromatogrammes HPLC des fractions à
l’hexane (FHA), à l’acétate d’éthyle (FAA) et au butanol (FBA) de Alchornea cordifolia donnent
respectivement quatre (4) pics, sept (7) pics et huit (8) pics (annexe 03). Les spectres en
spectroscopie Ultra-Violette des précédentes fractions sont donnés dans les figures 65, 66 et 67.
KONE KOUWELTON PATRICK 151
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre UV du composé AH1
b. Spectre UV du composé AH2
c. Spectre UV du composé AH3
d. Spectre UV du composé AH4
Figure 67: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane des feuilles de Alchornea cordifolia
KONE KOUWELTON PATRICK 152
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre UV du composé AA2
b. Spectre UV du composé AA3
c. Spectre UV du composé AA4
d. Spectre UV du composé AA6
Figure 68: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle des feuilles de Alchornea cordifolia
KONE KOUWELTON PATRICK 153
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre UV du composé AB1
b. Spectre UV du composé AB2
c. Spectre UV du composé AB3
d. Spectre UV du composé AB4
KONE KOUWELTON PATRICK 154
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
e. Spectre UV du composé AB5
f. Spectre UV du composé AB6
g. Spectre UV du composé AB7
h. Spectre UV du composé AB8
Figure 69: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction au butanol des feuilles de Alchornea cordifolia
L’analyse des données spectrales a permis d’identifier les métabolites secondaires présents dans ces fractions (Tableau 31).
KONE KOUWELTON PATRICK 155
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 31: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Alchornea cordifolia
Fractions Composés Tr (mn) Pourcentage (%) λmax Familles de métabolites
Flavonoïdes Alcaloïdes Stérols et terpènes
Hexane
AH1 0,84 15,56 270 / 326 + - -
AH2 33,33 64,01 207 / 222 / 238 - - +
AH3 46,29 2,75 206 - - -
AH4 69,14 17,68 222 / 278 - + -
Acétate
d’éthyle
AA1 1,33 17,77 - - -
AA2 3,15 16,18 213 / 262 - - +
AA3 4,05 5,57 213 / 260 - - +
AA4 32,50 50,03 217 / 272 - + -
AA5 56,28 3,36 - - -
AA6 139,93 2,49 225 / 277 - + -
AA7 174,47 4,60 - - -
Butanol
AB1 1,47 2,53 267,1 / 386,9 + - -
AB2 2,00 6,13 218,5 / 272,8 / 395,9 + - -
AB3 3,33 9,14 213 / 267,1 / 342,2 + - -
AB4 4,05 39,03 218 / 274,1 / 341,9 + - -
AB5 6,75 3,55 208 / 218,1 / 262,2 - - +
AB6 35,54 32,82 215,1 / 270,7 / 337,6 + - -
AB7 36,00 1,50 203 / 255,2 / 357,4 + - -
AB8 64,18 5,31 254,4 / 360,2 + - -
KONE KOUWELTON PATRICK 156
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
III.1.2. Discussion
L’analyse des spectres UV de la fraction à l’hexane montre que tous les composés
séparés absorbent à la longueur d’onde de 220 nm. Les mesures réalisées aux bases et au
maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont identiques pour les
composés AH1, AH3 et AH4, ce qui entraine une superposition des différents spectres pour
chacun de ces composés ce qui n’est pas le cas pour le composé AH2 où les spectres ne sont
pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales
pratiquement identiques. Ce composé se présente alors sous forme de conformères dont les
intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires (Gros, 2013). Cette
fraction contient les trois familles de métabolites secondaires recherchées. Les stérols et
terpènes sont majoritaires avec 64,01 % suivis des alcaloïdes (17,68 %) et des flavonoïdes
(15,56 %). Cette fraction contient également 2,75 % du composé AH3 identifié comme étant
un ester ou un acide aliphatique (Silverstein, 2005).
L’analyse des spectres UV de la fraction à l’acétate d’éthyle montre que les composés
AA1, AA5 et AA7 n’absorbent pas en UV à 220 nm, ce qui traduit l’absence de groupes
chromophores absorbant à la longueur d’onde de l’étude dans ces molécules. Par conséquent,
leurs familles de métabolites secondaires n’ont pu être déterminées alors qu’ils représentent
25,74 %. Les mesures réalisées aux bases et au maximum des pics chromatographiques à une
allure gaussienne sont identiques pour les composés AA2, AA4 et AA6 entrainant ainsi une
superposition des différents spectres pour chacun de ces composés ce qui n’est pas le cas pour
le composé AA3 où les spectres ne sont pas superposables mais ont la même allure avec des
valeurs d’absorptions maximales pratiquement identiques. Le composé AA3 se présente alors
sous forme de conformères dont les intensités des spectres UV sont relativement stables et donc
similaires (Gros, 2013). Cette fraction contient deux familles de métabolites secondaires
recherchées. Les alcaloïdes (composés AA4 et AA6) sont majoritaires avec 52,52 % suivis des
stérols et terpènes (composés AA2 et AA3) qui représentent 21,75 %. Les flavonoïdes sont
absents de cette fraction.
L’analyse des spectres UV de la fraction au butanol montre que tous les composés
absorbent en UV à 220 nm. Les mesures réalisées aux bases et au maximum des pics
chromatographiques à une allure gaussienne sont identiques pour le composé AB4 entrainant
ainsi une superposition des différents spectres pour ce composé ce qui n’est pas le cas pour les
composés AB1, AB3, AB5, AB6, AB7 et AB8 où les spectres ne sont pas superposables mais
KONE KOUWELTON PATRICK 157
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
ont la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales pratiquement identiques. Ces
derniers se présentent alors sous forme de conformères dont les intensités des spectres UV sont
relativement stables et donc similaires (Gros, 2013). Les spectres de AB2 ne sont pas
superposables et n’ont pas la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales
pratiquement différents. Cette fraction contient deux familles de métabolites secondaires
recherchées. Les flavonoïdes (composés AB1, AB2, AB3, AB4, AB6, AB7 et AB8) sont
majoritaires avec 96,46 % suivis des stérols et terpènes (composé AB5) qui représentent 3,55
%. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.
Nous n’avons pas trouvé d’études similaires dans la littérature pour les comparer à notre
étude. Toutefois, l’analyse UV des macromolécules biologiques telles que les protéines et les
acides nucléiques a permis d’utiliser les valeurs de leurs absorbances pour mesurer leurs
concentrations, pour détecter des changements conformationnels et pour suivre les réactions
enzymatiques (Schmid, 2001). Cette technique a également été utilisée pour caractériser le β-
sitostérol de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l'écorce de racine de Terminalia glaucescens
(Bulama et al., 2015) ou encore pour la détermination simultanée de quinze (15) composés
phénoliques et de la caféine dans les thés et les matés (Bae et al., 2015). Plusieurs flavonoïdes
ont été identifiés en utilisant la spectroscopie Ultra-Violette (Kassi, 2013; Mabry et al., 1970).
IV. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
COMBINEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-VIOLETTE DES FRACTIONS
DE PHYLLANTHUS AMARUS
IV.1. Résultats
Dans cette partie, seules trois (3) fractions issues de l’extrait hydroalcoolique de la
plante entière de Phyllanthus amarus ont été étudiées. Les chromatogrammes HPLC des
fractions à l’hexane (FHP), à l’acétate d’éthyle (FAP) et à l’eau (FEP) de Phyllanthus amarus
montrent que ces fractions donnent respectivement neuf (9) pics, dix-sept (17) pics et huit (8)
pics (annexe 04). Les spectres en spectroscopie Ultra-Violette des précédentes fractions sont
donnés dans les figures 68, 69 et 70.
KONE KOUWELTON PATRICK 158
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre UV du composé PH1
b. Spectre UV du composé PH3
c. Spectre UV du composé PH4
d. Spectre UV du composé PH5
KONE KOUWELTON PATRICK 159
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
e. Spectre UV du composé PH7
f. Spectre UV du composé PH8
g. Spectre UV du composé PH9
Figure 70: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane de Phyllanthus amarus
KONE KOUWELTON PATRICK 160
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre UV du composé PA1
b. Spectre UV du composé PA3
c. Spectre UV du composé PA4
d. Spectre UV du composé PA5
KONE KOUWELTON PATRICK 161
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
e. Spectre UV du composé PA6
f. Spectre UV du composé PA7
g. Spectre UV du composé PA8
h. Spectre UV du composé PA9
KONE KOUWELTON PATRICK 162
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
i . Spectre UV du composé PA10
j . Spectre UV du composé PA11
k. Spectre UV du composé PA12
l . Spectre UV du composé PA13
KONE KOUWELTON PATRICK 163
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
m. Spectre UV du composé PA14
n. Spectre UV du composé PA15
o. Spectre UV du composé PA16
p. Spectre UV du composé PA17
Figure 71: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle de Phyllanthus amarus
KONE KOUWELTON PATRICK 164
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Spectre UV du composé PAQ1
b. Spectre UV du composé PAQ2
KONE KOUWELTON PATRICK 165
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
c. Spectre UV du composé PAQ3
d. Spectre UV du composé PAQ4
e. Spectre UV du composé PAQ5
f. Spectre UV du composé PAQ6
KONE KOUWELTON PATRICK 166
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
g. Spectre UV du composé PAQ7
Figure 72: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’eau de Phyllanthus amarus
L’analyse des données spectrales a permis d’identifier les métabolites secondaires présents dans ces fractions (Tableau 32).
KONE KOUWELTON PATRICK 167
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 32: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Phyllanthus amarus
Fractions Composés Tr (mn) Pourcentage (%) λmax Familles de métabolites
Flavonoïdes Alcaloïdes Stérols et terpènes
Hexane
PH1 0,84 1,22
PH2 60,98 80,40 209,7 / 238 / 274,9 - + -
PH3 63,57 0,40 232,7 / 283,3 - + -
PH4 67,66 2,73 203,3 / 282,2 - - +
PH5 70,94 5,60 201,5 / 229,9 / 279,9 - + -
PH6 71,37 0,55
PH7 75,22 4,49 204,4 / 281,4 - - +
PH8 77,32 4,21 202,6 / 279,4 - - +
PH9 144,43 0,40 255,2 - - -
Acétate
d’éthyle
PA1 0,91 2,53 212,7 / 261,2 - - +
PA2 3,12 7,65
PA3 4,04 0,81 213 / 260,7 / 326,3 + - -
PA4 4,13 3,03 228,3 / 284,3 - + -
PA5 21,89 13,96 221,5 / 282,9 - + -
PA6 27,23 11,34 218 / 277,6 - - +
PA7 31,12 3,64 218,3 / 270,7 - - +
PA8 32,59 2,42 216,3 / 271,8 - - +
KONE KOUWELTON PATRICK 168
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Tableau 33: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Phyllanthus amarus (suite)
Fractions Composés Tr (mn) Pourcentage (%) λmax
Familles de métabolites secondaires
Flavonoïdes Alcaloïdes Stérols et
terpènes
Acétate
d’éthyle
PA9 38,01 8,28 220,4 / 277,8 - + -
PA10 130,67 21,18 226,7 / 275,2 - + -
PA11 143,73 2,87 203,2 / 282,3 - - +
PA12 147,22 6,11 201,4 / 229,9 / 279,9 - + -
PA13 151,29 4,64 204,5 / 281,4 - - +
PA14 152,40 4,21 202,8 / 279,8 - - +
PA15 156,68 2,68 224,8 / 276,9 - + -
PA16 172,99 1,75 204,6 / 248,8 - - -
PA17 173,23 2,89 255,8 - - -
Eau
PAQ1 1,91 1,08 208,5 - - -
PAQ2 2,29 0,85 217,5 / 272,1 - - +
PAQ3 2,62 35,70 216,7 / 323,9 + - -
PAQ4 3,37 22,85 214,4 / 296,9 - - +
PAQ5 4,05 9,15 216,3 / 272,1 - - +
PAQ6 4,31 27,75 218,9 / 279,1 - + -
PAQ7 7,33 2,18 221,5 / 275,4 / 343,9 + - -
PAQ8 64,18 0,44 -
KONE KOUWELTON PATRICK 169
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
IV.2. Discussion
L’analyse des spectres UV de la fraction à l’hexane montre que les composés PH1 et
PH6 n’absorbent pas en UV à 220 nm traduisant l’absence de groupes chromophores absorbant
à la longueur d’onde de l’étude dans ces molécules. Les mesures réalisées aux bases et au
maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont identiques pour les
composés PH4, PH7, PH8 et PH9 entrainant ainsi une superposition des différents spectres
pour chacun de ces composés ce qui n’est pas le cas pour les composés PH2, PH3, PH5 et PH6
où les spectres ne sont pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs
d’absorptions maximales pratiquement identiques. Ces derniers se présentent alors sous forme
de conformères dont les intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires
(Gros, 2013). Cette fraction contient deux des trois familles de métabolites secondaires
recherchées. Les alcaloïdes sont majoritaires avec 86,40 % suivis des stérols et terpènes (11,43
%) alors que les flavonoïdes sont absents. Cette fraction contient également 0,40 % du composé
PH9 identifié comme étant un acide 3,4-hydroxybenzoïque (composé phénolique) (Amiot et
al., 1989; Michel, 2011).
L’analyse des spectres UV de la fraction à l’acétate d’éthyle montre que le composé
PA2 n’absorbe pas en UV à 220 nm traduisant l’absence de groupes chromophores absorbant
à la longueur d’onde de l’étude dans cette molécule. Par conséquent, ses familles de métabolites
secondaires n’ont pu être déterminées alors qu’il a une proportion de 7,65 %. Les mesures
réalisées aux bases et au maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont
identiques pour les composés PA3, PA6, PA7, PA9, PA10, PA11, PA13, PA14, PA15, PA16
et PA17 entrainant ainsi la superposition des différents spectres pour chacun de ces composés
ce qui n’est pas le cas pour les composés PA1, PA4, PA5, PA8 et PA12 où les spectres ne sont
pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales
pratiquement identiques. Ces derniers se présentent alors sous forme de conformères dont les
intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires (Gros, 2013). Cette
fraction contient les trois familles de métabolites secondaires recherchées. Les alcaloïdes
(composés PA4, PA5, PA9, PA10, PA12 et PA15) sont majoritaires avec 55,24 % suivis des
stérols et terpènes (composés PA1, PA6, PA7, PA8, PA11, PA13 et PA14) qui représentent
31,65 %. Les flavonoïdes sont minoritaires dans cette fraction avec une proportion de 0,81 %.
Le composé PA16 n’a pu être identifié alors que le composé PA17 a été identifié comme étant
un acide p-hydroxybenzoïque (composé phénolique) (Amiot et al., 1989; Michel, 2011).
KONE KOUWELTON PATRICK 170
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
L’analyse des spectres UV de la fraction aqueuse montre que le composé PAQ8
n’absorbe pas en UV à 220 nm traduisant ainsi l’absence de groupes chromophores absorbant
à la longueur d’onde de l’étude dans cette molécule. Par conséquent, ses familles de métabolites
secondaires n’ont pu être déterminées même s’il ne représente que 0,44 %. Les mesures
réalisées aux bases et au maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont
identiques pour le composé PAQ5 entrainant ainsi une superposition des différents spectres
pour ce composé ce qui n’est pas le cas pour les composés PAQ1, PAQ2, PAQ3, PAQ4, PAQ6
et PAQ7 où les spectres ne sont pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs
d’absorptions maximales pratiquement identiques. Ces derniers se présentent alors sous forme
de conformères dont les intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires
(Gros, 2013). Cette fraction contient les trois familles de métabolites secondaires recherchées.
Les flavonoïdes (composés PAQ3 et PAQ7) sont majoritaires avec 37,88 % suivis des stérols
et terpènes (composés PAQ2, PAQ4 et PAQ5) et des alcaloïdes (composé PAQ6) qui
représentent respectivement 32,85 % et 27,75 %. Le composé PAQ1 (1,08 %) a été identifié
comme étant un acide aliphatique (Silverstein, 2005).
Nous n’avons pas trouvé d’études similaires dans la littérature pour les comparer à notre
étude. Toutefois, l’analyse UV des macromolécules biologiques telles que les protéines et les
acides nucléiques a permis d’utiliser les valeurs de leurs absorbances pour mesurer leurs
concentrations, pour détecter des changements conformationnels et pour suivre les réactions
enzymatiques (Schmid, 2001). Cette technique a également été utilisée pour caractériser le β-
sitostérol de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l'écorce de racine de Terminalia glaucescens
(Bulama et al., 2015) ou encore pour la détermination simultanée de quinze (15) composés
phénoliques et de la caféine dans les thés et les matés (Bae et al., 2015). Plusieurs flavonoïdes
ont été identifiés en utilisant la spectroscopie Ultra-Violette (Kassi, 2013; Mabry et al., 1970).
V. COMPARAISON DES METHODES ANALYTIQUES DE CRIBLAGE DES
METABOLITES SECONDAIRES
Afin de comparer les méthodes analytiques de criblages des métabolites secondaires de
Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus, un traitement statistique des données s’avèrent
nécessaire. Il existe plusieurs méthodes statistiques telle que l’analyse en composante principale
(ACP), la classification ascendante hiérarchique et le tableau croisé dynamique. C’est cette
dernière méthode que nous avons utilisée car c’est une méthode simple qui permet de générer
KONE KOUWELTON PATRICK 171
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
une synthèse d'une table de données brutes, d’en effectuer une analyse interactive et de proposer
une représentation synthétique des résultats (Altom, 2011; Chen, 2007; Montondon and Marsh,
2006). La présence d’une famille de métabolites secondaires initialement matérialisée par un
signe (+) sera matérialisée par le chiffre un (1) et l’absence par le chiffre zéro (0). Le tableau
résultant est donné en annexe 05 et son illustration est donnée dans les figures 71 et 72
respectivement pour Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus.
KONE KOUWELTON PATRICK 172
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
V.1. Résultats
Figure 73: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour Alchornea cordifolia
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
HP
LC U
V
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
HP
LC U
V
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
HP
LC U
V
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
Fraction à l'hexane Fraction audichlorométhane
Fraction à l'acétate d'éthyle Fraction au butanol Fraction résiduelle
Alchornea cordifolia
Métabolites secondaires Alcaloïdes Métabolites secondaires Flavonoïdes Métabolites secondaires Tepènes et stérols
KONE KOUWELTON PATRICK 173
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 74: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour Phyllanthus amarus
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
HP
LC U
V
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
HP
LC U
V
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
Scre
enin
g ch
imiq
ue
HP
TLC IR
HP
LC U
V
Fraction à l'hexane Fraction audichlorométhane
Fraction à l'acétate d'éthyle Fraction au butanol Fraction résiduelle
Phyllanthus amarus
Métabolites secondaires Alcaloïdes Métabolites secondaires Flavonoïdes Métabolites secondaires Tepènes et stérols
KONE KOUWELTON PATRICK 174
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
La méthode des tableaux croisés dynamiques est utilisée pour analyser les résultats de
détection (1) ou non (0) des familles de métabolites secondaires. Les données sont notées dans
un tableau et elles sont croisées entre elles (ligne et colonne) par le logiciel Excel, ce qui permet
de calculer le pourcentage de détection d’une méthode donnée dans la détection d’une famille
de métabolites secondaires choisie. Les différents résultats de cette méthode sont illustrés dans
la figure 73.
Figure 75: Résumé des pourcentages de détection de famille de métabolites
secondaires
V.2. Discussion
La figure 73 compare la détection globale des méthodes de criblage. La méthode qui a
un pourcentage de détection similaire dans toutes les familles de métabolites est la méthode de
criblage par HPTLC. Elle a un minimum de 30% de détection globale dans toutes les familles
de métabolites. La méthode de criblage par screening phytochimique est celle qui a les résultats
les plus satisfaisants avec deux pourcentages au-dessus de 30%. Il n’y a qu’au niveau des
terpènes et stérols que la détection est en dessous de 20%. La méthode de criblage par IR est
très satisfaisante pour les terpènes et stérols. La méthode par HPLC UV est celle qui donne les
moins bons résultats. La figure 74 résume le pourcentage de détection de chacune des méthodes
dans une famille de métabolites secondaires
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
HPLC UV HPTLC IR Screeningchimique
Somme de Alcaloïdes
Somme de Flavonoïdes
Somme de Tepènes et stérols
KONE KOUWELTON PATRICK 175
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
a. Pourcentage de détection dans les Alcaloïdes
b. Pourcentage de détection dans les Flavonoïdes
c. Pourcentage de détection des Terpènes et stérols
Figure 76: Pourcentage de détection des métabolites secondaires
22,73%
31,82%13,64%
31,82%
HPLC UV
HPTLC
IR
Screeningchimique
12,12%
30,30%
27,27%
30,30%
HPLC UV
HPTLC
IR
Screeningchimique
20,00%
30,00%33,33%
16,67%HPLC UV
HPTLC
IR
Screeningchimique
KONE KOUWELTON PATRICK 176
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Les alcaloïdes sont mieux détectés la HPTLC (31,82%) et le screening chimique (31,82
%) suivis de la HPLC-UV. La méthode de criblage par Infrarouge est la moins sensible
(13,64%). Cela pourrait être dû à la superposition des bandes des amines et des alcools
(Silverstein, 2005).
Les flavonoïdes sont mieux détectés la HPTLC (30,30%) et le screening chimique
(30,30%) suivis de l’Infrarouge (27,27 %). La méthode HPLC-UV est la moins sensible (12,12
%). Cela pourrait être dû à la grande influence de l’environnement moléculaire, des conditions
d’analyses dans cette méthode et surtout au choix de la longueur d’onde du détecteur qui
pourrait empêcher l’absorption des groupes chromophores de certains flavonoïdes.
Les Terpènes et stérols sont mieux détectés l’IR (33,33%) suivis de la HPTLC (30,00
%) puis de la méthode HPLC-UV (20,00 %). La méthode la moins sensible est le screening
chimique (16,67 %).
Il ressort de tous ces résultats que la méthode de criblage par HPTLC est la plus
satisfaisante. En effet, quel que soit la famille de métabolites à détecter, elle a des pourcentages
de détection supérieurs à 30%. Cela est dû au fait que cette méthode, en plus de balayer un large
spectre détection en longueurs d’onde UV, sépare d’abord les composants en taches ce qui
annulent les encombrements et évitent qu’une famille majoritaire rende difficile la détection
d’une autre qui existe belle et bien dans la fraction.
Des analyses similaires ont été réalisées en séparant les résultats par plante afin de vérifier
une potentielle influence du matériel végétal lors des criblages. Les résultats des figures 75 et
76 confirme l’efficacité de la méthode HPTLC avec 33,33%, 31,25% et 28,57% de détection
respective des alcaloïdes, flavonoïdes et terpènes et stérols dans les fractions de Alchornea
cordifolia et également avec 30,77%, 29,41% et 31,25% de détection respective des alcaloïdes,
flavonoïdes et terpènes et stérols dans les fractions de Phyllanthus amarus.
KONE KOUWELTON PATRICK 177
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 77: Résumé des pourcentages de détection des familles de métabolites secondaires de
Alchornea cordifolia
Figure 78: Résumé des pourcentages de détection des familles de métabolites secondaires de
Phyllanthus amarus
22,22%
33,33%
22,22%
22,22%
12,50%
31,25%
25,00%
31,25%
21,43%
28,57%
35,71%
14,29%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
HPLC UV HPTLC IR Screening chimique
Somme de Alcaloïdes Somme de Flavonoïdes Somme de Tepènes et stérols
23,08%
30,77%
7,69%
38,46%
11,76%
29,41%29,41%
29,41%
18,75%
31,25%
31,25%
18,75%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
HPLC UV HPTLC IR Screening chimique
Somme de Alcaloïdes Somme de Flavonoïdes Somme de Tepènes et stérols
KONE KOUWELTON PATRICK 178
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VI. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN
PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE
L'identification des composés a été possible, en comparant les temps de rétention avec
ceux des standards et les données spectrales obtenues à partir des bibliothèques Wiley et NIST.
Les fractions analysées sont les fractions au dichlorométhane et à l’acétate d’éthyle issues de
l’extrait hydro alcoolique des fleurs.
VI.1. Analyse GC-MS des composés de la fraction à l’acétate d’éthyle issue de
l’extrait hydro alcoolique des fleurs de Tridax procumbens
Le chromatogramme CG-MS, présenté en figure 77, montre la présence de plusieurs
pics correspondant à plusieurs composés silylés avec des temps de rétention compris entre 4,243
et 17,126 minutes.
Figure 79: Chromatogramme de la fraction à l’acétate d'éthyle de Tridax procumbens
Le pic 1 (temps rétention 4,243 minutes) est le 2,3 diméthylbutan-2-ol représenté sur la
figure (78). Son spectre de masse (celui de son dérivé silylé) (figure (79)) montre que trois
fragments se distinguent avec le fragment de masse 73 m/z (C2H7OSi) qui est le plus abondant.
Il dérive de la coupure la liaison silice carbone (schéma 3). Ce composé peut être classé parmi
les terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 179
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Figure 80: 2,3 Diméthylbutan-2-ol
Figure 81: Spectre de masse du pic 1
Schéma 3: Décomposition du pic 1
KONE KOUWELTON PATRICK 180
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Le pic n°2 (temps de rétention de 6,340 minutes) est l’octan-1-ol (figure 80). Son spectre
de masse (figure 81) révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 187 m/z ce qui
correspondrait au départ de groupement méthyle en fin de chaine de la molécule. Les fragments
de masse 129 m/z et 73 m/z proviendraient de la rupture de la liaison entre l’oxygène et le
silicium. Le fragment de masse 89 m/z correspondrait au groupement C3H9OSi résultant de la
rupture entre l’oxygène et le carbone (schéma 4). Ce composé peut être classé dans la famille
des terpènes et stérols.
Figure 82: Octan-1-ol
Figure 83: Spectre du pic 2
KONE KOUWELTON PATRICK 181
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Schéma 4: Décomposition du pic 2
Le pic n°3 (temps de rétention 8,310 minutes) est le 4-hydroxy benzoate de méthyle
(figure 82). La masse de son dérivé sylilé est de 224 m/z ; le fragment le plus abondant a une
masse de 209 m/z et serai du soit au départ du groupement méthyle de l’oxygène du groupement
ester, soit d’un méthyle relié au silicium (figure 83). Le fragment de masse 224 m/z
correspondrait à la molécule elle-même. Le fragment de masse 135 m/z serait le fragment
C8H7O2 résultat de la rupture entre l’oxygène et du cycle aromatique. Les fragments de masse
149 m/z et 73 m/z proviendraient du départ du groupement triméthylsilyl (schéma 5). Ce
composé peut être classé parmi les composés phénoliques.
Figure 84: 4-Hydroxy benzoate de méthyle
KONE KOUWELTON PATRICK 182
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Figure 85: Spectre du pic 3
Schéma 5: Décomposition du spectre du pic 3
Le pic n°4 (temps de rétention 9,04 minutes) est l’acide 4-hydroxybenzoïque (figure
84). Son spectre de masse révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 267 m/z qui
KONE KOUWELTON PATRICK 183
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résulte du départ d’un groupement méthyle lié à l’un des siliciums présents dans le dérivé silylé
(figure 85). Les fragments de masse 193 m/z et 89 m/z (91 m/z sur le spectre, une différence
qui peut être due à des isotopes) proviendraient de la scission de la liaison entre un carbone et
un oxygène lié au silicium. Les fragments de masse 73 m/z et 209 m/z (251 sur le spectre)
viennent du départ du groupement triméthylsilyl (schéma 6). Ce composé peut être classé parmi
les composés phénoliques.
Figure 86: Acide 4-hydroxybenzoïque
Figure 87: Spectre du pic 4
KONE KOUWELTON PATRICK 184
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Schéma 6: Décomposition du pic 4
Le pic n°5 (temps de rétention 9,527) est 3,4 dihydroxy benzoate de méthyle (figure 86).
Le fragment le plus abondant du spectre de masse de son dérivé silylé a une masse de 193 m/z
(figure 87). Le fragment pourrait provenir de la rupture d’un des groupements silyles et le départ
de l’oxygène et du groupement methoxyle du carbone du groupement carbonyle. Les fragments
de masse 166 m/z (165 sur le spectre) et 73 m/z proviendraient du départ d’un groupement
triméthylsilyl (schéma 7). Ce composé peut être classé parmi les composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 185
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Figure 88: Ester méthylique de l'acide procatéchine
Figure 89: Spectre du pic 5
Schéma 7: Décomposition du pic 5
KONE KOUWELTON PATRICK 186
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Le pic n°6 (temps de rétention 9,910) est l’ester méthylique de l’acide coumarique
(figure 88) ; son spectre de masse montre que le fragment le plus abondant est l’ion formé par
la molécule entière avec pour masse 250 m/z suivi par le fragment de masse 235 m/z qui découle
du départ d’un groupement méthyle (figure 89). Le fragment de masse 219 m/z provient du
départ d’un oxygène du fragment de masse 235 m/z ; la perte d’un autre oxygène conduit au
fragment de masse 203 m/z. Le fragment de masse 73 m/z résulte du départ du groupement
triméthylsilyl (schéma 8). Ce composé peut être classé parmi les composés phénoliques.
Figure 90: Ester méthylique de l'acide coumarique
Figure 91: Spectre du pic 6
KONE KOUWELTON PATRICK 187
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Schéma 8: Décomposition du pic 6
Le pic n°7 (temps de rétention 9,977 minutes) est le 3-metoxypent-4-1-yl benzène
(figure 90). Le spectre de son dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse
de 73 m/z qui correspond au départ du groupement triméthylsilyle (figure 91). L’autre fragment
qui vient juste après en abondance a une masse de 233 m/z et résulte du départ d’un groupement
méthyle (schéma 9). Ce composé fait partie des terpènes et stérols.
Figure 92: (3-methoxy-4-en-1-yl) Benzène
KONE KOUWELTON PATRICK 188
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Figure 93: Spectre du pic 7
Schéma 9: Décomposition du pic 7
Le pic n°8 (temps de rétention 10,013) est l’acide 3,4-dihydroxybenzoïque (figure 92).
Le spectre de masse de son dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse
de 193 m/z (figure 93) ; ce fragment résulterait du départ de deux groupements triméthylsilyles
(fragment de masse 73 m/z) sur trois et la fragmentation du groupement carbonyle avec départ
des oxygènes sur le carbone du carbonyle. Les fragments de masse 355 m/z et 310 m/z (311 sur
le spectre) résultent respectivement du départ d’un (1) groupement méthyle et de quatre (4)
groupements méthyles (schéma 10). Ce composé est dans la famille des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 189
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Figure 94: Acide 3,4-dihydroxybenzoïque
Figure 95: Spectre du pic 8
Schéma 10: Décomposition du pic 8
KONE KOUWELTON PATRICK 190
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Le pic n°9 (temps de rétention 10,340 minutes) (figure 94) a un spectre de masse qui est
dominé par le fragment de masse 73 m/z (figure 95). Ce fragment est le triméthylsilyle qui se
détache de la molécule (schéma 11). Ce composé est de la famille des alcaloïdes.
Figure 96:4-[(2E)-butan-2-ylidene amino]-3-ethlbutane-1,2,4-triol
Figure 97: Spectre du pic 9
KONE KOUWELTON PATRICK 191
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Schéma 11: Décomposition du pic 9
Le pic n°10 est un diester : le malonat de diéthyle (figure 96). Le fragment le plus
abondant dans le spectre de masse à une masse de 73 m/z (figure 97). Il correspond à l’ion issu
de la rupture entre le silicium et le carbone, ce qui donne le départ de l’ion triméthylsilyle
(schéma 12). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
Figure 98: Malonate de diéthyle
KONE KOUWELTON PATRICK 192
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Figure 99: Spectre du pic 10
Schéma 12:Décomposition du pic 10
Le pic n°11 (temps de rétention 10,620 minutes) est l’acide 4-hydroxyphénylpropan-2-
enoïque (figure 98) ; le spectre de masse du dérivé silylé montre que le fragment le plus
abondant a une masse de 73 m/z (figure 99). Ce fragment correspond au groupement
KONE KOUWELTON PATRICK 193
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
triméthylsilyle. Le fragment de masse 235 m/z résulte du départ du groupement triméthylsilyl.
Les fragments de masse 293 m/z et 248 m/z (249 sur le spectre) résultent respectivement du
départ d’un (1) et de quatre (4) groupements méthyles. Les fragments de masse 219 m/z et 89
m/z (88 sur le spectre) résulte de la scission de la liaison entre l’oxygène et un carbone
appartenant au cycle aromatique (schéma 13). Ce composé est de la famille des composés
phénoliques.
Figure 100: Acide (2E)-3-(4-hydroxyphényl) prop-2-énoïque
Figure 101: Spectre du pic 11
KONE KOUWELTON PATRICK 194
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Schéma 13: Décomposition du pic 11
KONE KOUWELTON PATRICK 195
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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Le pic n°12 (temps de rétention 10,673 minutes) est l’acrylate de méthyl 3-(4-
hydroxyphényle) (figure 100). Son dérivé donne un spectre de masse dont le fragment le plus
abondant a une masse de 250 m/z (figure 101). Il se forme par le départ de deux groupements
méthyles. Les fragments de masse 221 m/z (219 sur le spectre) et 59 m/z résultent de la rupture
de la liaison carbone carbone entre le carbone du groupement carbonyle et celui de la liaison
multiple. Le fragment de masse 73 m/z correspond au groupement triméthylsilyl (schéma 14).
Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
Figure 102: Acrylate de méthyle 3-(4-hydroxyphényle)
Figure 103: Spectre du pic 12
KONE KOUWELTON PATRICK 196
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Schéma 14: Décomposition du pic 12
Le pic n°13 (temps de rétention 10,933 minutes) est l’acrylate de méthyl-3-(3,4-
dihydroxyphényle) (figure 102) ; son spectre de masse révèle que le fragment le plus abondant
a une masse de 220 m/z (219 sur le spectre) (figure 103). Il provient du départ du groupement
triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z) et un groupement méthyle. Les fragments de masse
265 m/z et 192 m/z résultent du départ de respectivement un (1) et deux (2) groupements
triméthylsilyls (schéma 15). Ce composé fait partie des composés phénoliques.
Figure 104: Acrylate de méthyl-3-(3,4-dihydroxyphényle)
KONE KOUWELTON PATRICK 197
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 105: Spectre du pic 13
Schéma 15: Décomposition du pic 13
Le pic n°14 (temps de rétention 11,297 minutes) est l’acide férulique (figure 104). Le
spectre de masse de son dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse de
KONE KOUWELTON PATRICK 198
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
73 m/z et provient de du départ des groupements triméthylsilyls (figure 105). Les fragments de
masse 249 m/z et 89 m/z résultent de la rupture de la liaison entre l’oxygène et le cycle
aromatique. Le fragment de masse 308 m/z résulte du départ de deux groupements méthyls
(schéma 16). Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
Figure 106: Acide férulique
Figure 107: Spectre du pic 14
KONE KOUWELTON PATRICK 199
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Schéma 16: Décomposition du pic 14
Le pic n°15 (temps de rétention 11,483 minutes) est l’acide caféique (figure 106). Le
fragment le plus abondant su spectre de masse de son dérivé silylé a une masse de 219 m/z (issu
de la rupture de la liaison carbone-carbone au niveau du carbone du groupement carbonyle)
suivi du fragment de masse 73 m/z (issu du départ de quatre (4) groupements méthyles et du
fragment de masse 117 m/z (115 sur le spectre)) (figure 107). Le fragment de masse 381 m/z
résulte du départ d’un (1) groupement méthyl (schéma 17). Ce composé est de la famille des
composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 200
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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Figure 108: Acide caféique
Figure 109: Spectre du pic 15
KONE KOUWELTON PATRICK 201
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Schéma 17: Décomposition du pic 15
Le pic n°16 (temps de rétention 16,193 minutes) est un flavonoïde (2-3,4-
dihydroxyphényl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromèn-4-one (figure 108). Le spectre de masse
montre un fragment abondant de masse 647 m/z qui découle du départ d’un groupement
méthyle (figure 109). Le fragment de masse 559 m/z résulte du départ de deux (2) groupements
méthyls et un groupement triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z) (schéma 18).
KONE KOUWELTON PATRICK 202
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 110: 2-(3,4-dihydroxyphényl)-3,5,7-trihydroxy-4h-chromèn-4-one
Figure 111: Spectre du pic 16
Schéma 18: Décomposition du pic 16
Le pic n°17 (temps de rétention 16,813 minutes) est aussi un flavonoïde (2-3,4-
dihydrophenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one) (figure 110). Le fragment le
plus abondant du spectre de masse du dérivé silylé a une masse de 589 m/z (figure 111). Ce
KONE KOUWELTON PATRICK 203
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
fragment découle du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 485 m/z provient
du départ de huit (8) groupements méthyls. Les fragments de masse 531 m/z et 73 m/z résultent
du départ d’un groupement triméthylsilyl (schéma 19).
Figure 112: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one
Figure 113: Spectre du pic 17
KONE KOUWELTON PATRICK 204
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Schéma 19: Décomposition du pic 17
Le pic 18 (temps de rétention 17,127 minutes) est aussi un flavonoïde, le 3,5,7-
trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one (figure 112). Le spectre de son dérivé
silylé nous révèle que le fragment majoritaire est issu du départ d’un groupement méthyle et a
une masse de 559 m/z (figure 113). Le fragment de masse 471 m/z résulte du départ d’un
groupement méthyl et d’un groupement triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z) (schéma 20).
KONE KOUWELTON PATRICK 205
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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Figure 114: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one
Figure 115: Spectre du pic 18
KONE KOUWELTON PATRICK 206
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Schéma 20: Décomposition du pic 18
Les composés identifiés sont connus mais la littérature ne mentionne pas la présence de
beaucoup d’entre eux dans les extraits des fleurs de Tridax procumbens linn. En effet, cet
organe de la plante n’a pratiquement pas fait l’objet d’étude chimique dans l’objectif de
déterminer les structures des composés présents.
VI.2. Analyse GC-MS des composés de la fraction au dichlorométhane issue de
l’extrait hydro alcoolique des fleurs Tridax procumbens linn
Le chromatogramme CG-MS, présenté sur la figure 114, montre la présence de plusieurs
pics correspondant à plusieurs composés silylés avec des temps de rétention compris entre 3,862
et 13,337 minutes. Les composés identifiés sont obtenus à partir des composés silylés
correspondants et ils appartiennent à plusieurs familles. Ils peuvent constituer trois groupes :
KONE KOUWELTON PATRICK 207
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
les dérivés des acides hydroxycinnamiques, des acides hydroxybenzoïques ainsi que des acides
organiques non aromatiques.
Figure 116: Chromatogramme de la fraction dichlorométhane de Tridax procumbens
L’identification des composés a été réalisée avec les spectres de masse.
Le pic n°1 (temps de rétention 3,853 minutes) est le méthylamino méthanol (figure 115).
Son spectre de masse nous montre que le fragment le plus abondant a une masse de 160 m/z
(figure 116). Il est obtenu avec le départ de trois groupements méthyles. Les fragments de masse
60 m/z (59 sur le spectre) et de masse 87 m/z résultent respectivement du départ des deux (2)
groupements triméthylsilyles (fragment de masse 73 m/z) et de trois groupements méthyles et
un (1) groupement triméthylsilyle. Le fragment de masse 175 m/z résulte du départ de deux (2)
groupements méthyles (schéma 21). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
Figure 117: (Méthylamino) méthanol
KONE KOUWELTON PATRICK 208
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 118: Spectre de masse du pic 1
Schéma 21: Décomposition pic n°1
Le pic n°2 (temps de rétention 4,003 minutes) est le (3E)-4-hydroxypent-3-en-2-one
(figure 117). Son spectre nous montre que les fragments les plus abondants sont ceux avec une
masse de 73 m/z et de 157 m/z (figure 118). Le fragment de masse 73 m/z est obtenu par la
rupture de la liaison oxygène silicium, tandis que le fragment de masse 157 m/z est obtenu par
le départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 115 m/z résulte du départ de quatre
(4) groupements méthyles (schéma 22). Ce composé fait partie des terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 209
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 119: (3E)-4-hydroxypent-3-en-2-one
Figure 120: Spectre de masse du pic n°2
Schéma 22: Décomposition du pic n°2
KONE KOUWELTON PATRICK 210
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
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Le pic n°3 (temps de rétention 4,453 minutes) est le phénol. Son spectre de masse
montre que le fragment majoritaire a une masse de 151 m/z (figure 119). Il se forme par le
départ d’un groupent méthyle (schéma 23). Ce composé est de la famille des composés
phénoliques.
Figure 121: spectre du pic n°3
Schéma 23: décomposition du pic n°3
Le pic n°4 (temps de rétention 5,433 minutes) est l’acide hydroxyacétique. Le spectre
de masse de son dérivé silylé (figure 120) montre qu’il y a deux fragments abondants, l’un de
masse 73 m/z et l’autre de masse 147 m/z qui résulte tous de deux de la rupture de la liaison
oxygène-silicium (schéma 24). Le fragment de masse 205 m/z résulte du départ d’un
KONE KOUWELTON PATRICK 211
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
groupement méthyl. Le fragment de masse 177 m/z résulte du départ de trois (3) groupements
méthyles. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
Figure 122: Spectre de masse du pic n°4
Schéma 24: Décomposition du pic n°4
Le pic n°5 (temps de rétention 5,907 minutes) est l’acide 3-ethoxy-3-oxopropanoïque.
Son spectre de masse (figure 121) révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 75
m/z. Il peut se former par soit le départ d’un groupement triméthylsilyl soit de la rupture entre
l’oxygène et le carbone du carbonyle (schéma 25). Le fragment de masse 131 m/z résulte du
départ d’un groupement triméthylsilyl. Le fragment de masse 159 m/z résulte du départ du
KONE KOUWELTON PATRICK 212
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
groupement éther d’éthyle rattaché au carbone du crabonyle. Ce composé fait parte des terpènes
et stérols.
Figure 123: Spectre de masse du pic n°5
Schéma 25: Décomposition du pic n°5
Le pic n°6 (temps de rétention 6,060 minutes) est le phénylméthanol. Le spectre de
masse (figure 122) de son dérivé silylé montre deux fragments abondants : l’un de masse 91
m/z dû à la rupture de la liaison carbone oxygène, l’autre de masse 165 m/z dû au départ d’un
groupement méthyle (schéma 26). Le fragment de masse 135 m/z résulte du départ de trois
groupements méthyles. Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 213
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 124: Spectre de masse du pic n°6
Schéma 26: Décomposition du pic n°6
Le pic n°7 (temps de rétention 6,307 minutes) est le 3-hydroxy-4,4-
diméthyldihydrofuran-2(3H)-one. Son dérivé silylé a un spectre de masse (figure 123) qui
révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 75 m/z. Il se formerai par départ du
groupement triméthylsilyle (schéma 27). Le fragment de masse 187 m/z résulte du départ d’un
groupement méthyle, alors que le fragment de masse 142 m/z lui résulte du départ de quatre (4)
groupements méthyles. Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 214
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 125: Spectre de masse du pic n° 7
Schéma 27: Décomposition du pic n°7
Le pic n°8 est l’acide 3-méthylheptanedioïque. Le spectre de masse du dérivé silylé de
cet acide révèle que le fragment majoritaire a une masse de 156 m/z (figure 124). Ce fragment
serait dû à une rupture la liaison entre deux carbones les plus éloignés des carbonyles dont l’un
est trisubstitué (schéma 28). Le fragment de masse 245 m/z résulte du départ du groupement
triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z). Les fragments de masse 73 m/z, 128 m/z et 117 m/z
résultent de la scission des liaisons carbone-carbone et oxygène-silicium. Les fragments de
masse 89 m/z et 56 m/z résultent de la rupture des liaisons oxygène-silicium et la liaison
carbone-carbone. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 215
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 126: Spectre de masse du pic n°8
Schéma 28: Décomposition du pic n°8
Le pic n°9 (temps de rétention 6,710 minutes) est l’acide 4-ethoxy-4-oxobutanoïque. Le
spectre de masse du dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse de 91
m/z (figure 125). Il résulterait de la rupture entre l’oxygène lié au silicium et le carbone du
carbonyle ; cette rupture est aussi à l’origine du fragment de masse 129 m/z (schéma 29). Le
fragment de masse 73 m/z est le groupement triméthylsilyl qui se détache de la molécule en
formant un autre fragment de masse 145 m/z. le fragment de masse 158 m/z résulte du départ
de quatre (4) groupements méthyles. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 216
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 127: Spectre de masse du pic n°9
Schéma 29: Décomposition du pic n°9
Le pic n°10 (temps de rétention 7,223 minutes) est l’acide 2,3-dihydroxypropanoïque.
Le spectre de masse de son dérivé silylé montre un fragment majoritaire de masse 73 m/z (figure
126) correspondant au départ du groupement triméthylsilyle (schéma 30). Le fragment de masse
103 m/z résulte du départ de trois groupements triméthylsilyls. Les fragments de masse 142 m/z
et 43 m/z résultent de la rupture d’une liaison oxygène carbone et du départ de neuf (9)
groupements méthyles. Les fragments de masse 186 m/z, 292 m/z et 307 m/z résultent
respectivement du départ de neuf (9), deux (2) et un (1) groupements méthyles. Ce composé
fait partie des terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 217
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 128: Spectre de masse du pic n°10
Schéma 30: Décomposition du pic n°10
Le pic n°11 (temps de rétention 7,410 minutes) est l’acide 2-hydroxybutanedioïque. Le
spectre de masse du dérivé silylé nous renseigne sur le fragment majoritaire qui a une masse de
73 m/z (figure 127), résultant du départ du groupement triméthylsilyle générant dans le même
temps le fragment de masse 130 m/z (schéma31). Le fragment de masse 172 m/z résulte de la
KONE KOUWELTON PATRICK 218
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
rupture de deux liaisons oxygène-carbone du groupement carbonyle, ce qui provoque le départ
du groupe C3H9OSi qui est le fragment de masse 89 m/z. le fragment de masse 117 m/z résulte
de la rupture d’une liaison carbone-carbone du carbonyle avec génération du fragment de masse
233 m/z. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
Figure 129: Spectre de masse du pic n°11
Schéma 31: Décomposition du pic n°11
Le pic n°12 (temps de rétention 7,733 minutes) est la 3,4-dihydroxydihydrofuran-2(3H)-
one. Le spectre de masse nous montre que le fragment le plus abondant a une masse de 73 m/z
(figure 128). Il se forme par le départ du groupement triméthylsilyle. Le fragment de masse 100
m/z résulte du départ de deux groupements triméthylsilyls et d’un atome d’oxygène. Le
KONE KOUWELTON PATRICK 219
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
fragment de masse 143 m/z résulte du départ de trois (3) groupements méthyles et un
groupement triméthylsilyl. Le fragment de masse 189 m/z résulte du départ du groupement
triméthylsylil. Le fragment de masse 233 m/z résulte du départ de deux groupements méthyles
(schéma 32). Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
Figure 130: Spectre de masse n°12
Schéma 32: Décomposition du pic n°12
KONE KOUWELTON PATRICK 220
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Le pic n°13 (temps de rétention 8,193 minutes) est la 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-
4H-pyran-4-one. Le spectre de masse du dérivé silylé révèle plusieurs fragments dont le plus
abondant à une masse de 271 m/z (figure 129) ; celui-ci est formé par le départ d’un groupement
méthyle. Le fragment de masse 197 m/z résulte de la rupture de la liaison entre l’oxygène lié
au silicium et le carbone lié au cycle aromatique. Le fragment de masse de 213 m/z résulte du
départ du groupement triméthylsilyle (fragment de masse 73 m/z) (schéma 33). Ce composé est
de la famille des composés phénoliques.
Figure 131: Spectre de masse du pic n°13
KONE KOUWELTON PATRICK 221
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Schéma 33: Décomposition du pic n°13
Le pic n°14 (temps de rétention 8,370 minutes) est l’acide 3-hydroxy-3-(4-
hydroxyphenyl)propanoïque. Le fragment majoritaire a une masse de 73 m/z comme l’indique
le spectre de masse de son dérivé silylé (figure 130). Ce fragment est issu du départ du
groupement triméthylsilyle et le fragment de masse 135 m/z se forme également ainsi que du
CO2. Le fragment de masse 267 m/z est formé en par la rupture de la liaison entre le carbone
lié au cycle aromatique et le carbone lié au carbone du groupement carbonyle (schéma 34). Ce
composé est de la famille des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 222
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 132: Spectre de masse du pic n°14
Schéma 34: Décomposition du pic n°14
Le pic n°15 (temps de rétention 8,433 minutes) est l’acide hex-2-énoïque. Son spectre
de masse nous montre que le fragment majoritaire a une masse de 156 m/z (figure 131). Il
résulte du départ d’un groupement éthyle issu de la rupture de la chaine principale. Les
fragments de masse 113 m/z et de masse 73 m/z résultent de la scission de la liaison entre
l’oxygène et le silicium (schéma 35). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 223
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 133: Spectre de masse du pic n°15
Schéma 35: Décomposition du pic n°15
Le pic n°16 (temps de rétention 9,043 minutes) est l’acide 4-hydroxybenzoïque. Le
fragment le plus abondant, d’après le spectre de masse de son dérivé silylé, a une masse de 267
m/z (figure 132). Il résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 222 m/z
résulte du départ de quatre (4) groupements méthyles. Les fragments de masse 136 m/z et 73
m/z proviennent de la rupture des liaisons oxygène-silicium (schéma 36). Ce composé est de la
famille des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 224
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 134: Spectre de masse du pic n°16
Schéma 36: Décomposition du pic n°16
Le pic n°17 (Temps de rétention 9,133 minutes) est l’acide benzène-1,2-dicarboxylique.
Le fragment de masse 73 m/z est le plus abondant selon le spectre de masse du dérivé silylé
(figure 133). Le départ du groupement triméthylsilyle en serait la cause. Le fragment de masse
KONE KOUWELTON PATRICK 225
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
221 m/z résulte de la rupture d’une liaison entre l’oxygène lié au silicium et un carbone du
groupement carbonyle. Le fragment de masse 250 m/z est le résultat du départ de quatre (4)
groupements méthyles (schéma 37). Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
Figure 135: Spectre de masse du pic n°17
Schéma 37: Décomposition du pic n°17
Le pic n°18 (temps de rétention 9,477 minutes) est le décane-1,10-diol. Le fragment
majoritaire a pour masse 73 m/z et serait dû au départ du groupement triméthylsilyle (figures
134). Les fragments de masse 145 m/z et 173 m/z résultent de la rupture de la liaison carbone-
KONE KOUWELTON PATRICK 226
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
carbone au sein de la chaine aliphatique. Le fragment de masse 303 m/z résulte du départ d’un
groupement méthyle (schéma 38). Ce composé fait partie des terpènes et stérols.
Figure 136: Spectre de masse du pic n°18
Schéma 38: Décomposition du pic n°18
KONE KOUWELTON PATRICK 227
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Le pic n°19 (temps de rétention 9,750 minutes) est l’acide 3-hydroxy-4-
methoxybenzoïque. Son spectre de masse nous montre que le fragment le plus abondant a une
masse de 297 m/z (figure 135) ; il résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de
masse 267 m/z résulte du départ de trois (3) groupements méthyles. Les fragments de masse
166 m/z et 73 m/z proviennent de la rupture des liaisons oxygène-silicium (schéma 39). Ce
composé est de la famille des composés phénoliques.
Figure 137: Spectre de masse du pic n°19
KONE KOUWELTON PATRICK 228
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Schéma 39: Décomposition du pic n°19
Le pic n°20 (temps de rétention 9,907 minutes) est l’acide nonanedioïque. Le spectre de
masse de son dérivé silylé révèle que le fragment majoritaire a une masse de 73 m/z (figure
136). Il dérive du départ du groupement triméthylsilyle. Le fragment de masse 317 m/z résulte
du départ d’un groupement méthyle. Les fragments de masse 201 m/z et 131 m/z proviennent
de la scission de la liaison entre le carbone lié au carbone du groupement carbonyle et son
carbone adjacent (schéma 40). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.
KONE KOUWELTON PATRICK 229
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 138: Spectre de masse du pic n°20
Schéma 40: Décomposition du pic n°20
Le pic n°21 (temps de rétention 10,010 minutes) est l’acide dihydroxybenzoïque. Le
fragment ayant pour masse 193 m/z est le plus abondant, étant donné le spectre de masse de
son dérivé silylé (figure 137). Ce fragment provient du départ de deux (2) groupements
méthyles et deux (2) groupements triméthylsilyles. Les fragments de masse 151 m/z et 73 m/z
proviennent de la rupture des liaisons oxygène-silicium. Le fragment de masse 355 m/z résulte
du départ d’un groupement méthyle (schéma 41). Ce composé est de la famille des composés
phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 230
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 139: Spectre de masse du pic n°21
Schéma 41: Décomposition du pic n°21
Le pic n°22 (temps de rétention 10,390 minutes) est l’acide 4-hydroxy- 3,5-
dimethoxybenzoïque. Le spectre de masse du dérivé silylé indique que le fragment majoritaire
a une masse de 73 m/z (figure 138) ce qui correspond au départ du groupement triméthylsilyle.
Le fragment de masse 327 m/z résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de
KONE KOUWELTON PATRICK 231
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
masse 209 m/z résulte de la rupture d’une liaison entre un oxygène lié au silicium et un carbone
et au départ de trois (3) groupements méthyles (schéma 42). Ce composé est de la famille des
composés phénoliques.
Figure 140: Spectre de masse du pic n°22
KONE KOUWELTON PATRICK 232
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trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Schéma 42: Décomposition du pic n°22
Le pic n°23 (temps de rétention 10,620 minutes) est l’acide 3-(4-hydroxyphenyl)prop-
2-énoïque. Le spectre de masse ce son dérivé silylé montre que le fragment majoritaire a une
masse de 73 m/z ce qui correspond au groupement triméthylsilyle (figures 139). Le fragment
293 m/z résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 219 m/z provient
de la rupture d’une liaison entre un oxygène lié au silicium et un carbone (schéma 43). Ce
composé est de la famille des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 233
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 141: Spectre de masse du pic n°23
Schéma 43: Décomposition du pic n°23
Le pic n°24 (temps de rétention 11,293 minutes) est l’acide 3-(4-hydroxy-3-
methoxyphényl)prop-2-énoïque. Le spectre de masse du dérivé silylé nous montre que le
KONE KOUWELTON PATRICK 234
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
fragment le plus abondant a une masse 338 m/z (figure 218). Cela doit être dû au départ d’un
électron du dérivé silylé (figure 140). Les fragments de masse 308 m/z, 293 m/z et 249 m/z
résultent respectivement du départ de deux (2), trois (3) et six (6) groupements méthyles. Les
fragments de masse 192 m/z et 73 m/z se forment par la rupture des liaisons oxygène-silicium
(schéma 44). Ce composé est de la famille des composés phénoliques.
Figure 142: Spectre de masse du pic n°24
KONE KOUWELTON PATRICK 235
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Schéma 44: Décomposition du pic n°24
Le pic n°25 (temps de rétention 13,337 minutes) est l’inositol. Le fragment 73 m/z est
le plus abondant comme l’indique le spectre de masse du dérivé silylé (figure 141). Il
correspond au départ du groupement silylé. Le fragment 317 m/z est issue du départ de quinze
(15) groupements méthyles (schéma 45). Ce composé fait partie des composés phénoliques.
KONE KOUWELTON PATRICK 236
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Figure 143: Spectre de masse du pic n°25
Schéma 45: Décomposition du pic n°25
Les composés identifiés sont connus mais la littérature ne mentionne pas la présence de
beaucoup d’entre eux dans les extraits des fleurs de Tridax procumbens. En effet, cet organe de
la plante n’a pratiquement pas fait l’objet d’étude chimique.
VI.3. Discussion sur les composés identifiés
Les composés identifiés au niveau de Tridax procumbens sont pour la plupart des
composés phénoliques. Ces composés sont connues pour leur activités antioxydantes
(Djeridane et al., 2006; Rice-Evans et al., 1997). Ces résultats attestent des propriétés
médicinales conférées à cette plante. Ce sont des molécules qui ont déjà été isolées dans d’autres
KONE KOUWELTON PATRICK 237
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
plantes mais pas encore dans les fleurs de Tridax procumbens car elle n’a pas encore été l’objet
d’étude phytochimique approfondie.
Conclusion partielle
Les différentes méthodes chromatographiques et spectroscopiques ont permis
d’identifier la composition en familles de métabolites secondaires des plantes étudiées. La
comparaison entre ces méthodes a montré que la chromatographie sur couche mince à haute
performance est la plus efficace alors que la chromatographie Liquide à haute performance
couplée à la spectroscopie Ultra-Violette a été la moins efficace. Les structures de quelques
métabolites secondaires de Tridax procumbens ont été élucidées par la chromatographie en
phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.
KONE KOUWELTON PATRICK 238
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
L’objectif de notre travail était l’identification des familles de métabolites secondaires
de trois plantes médicinales ivoiriennes par l’application de techniques chromatographiques et
spectrométriques. Pour atteindre les objectifs, une bibliographie sur le thème ainsi qu’une
méthodologie de travail ont été réalisées et ont permis d’avoir des résultats intéressants.
La bibliométrie des trois plantes a été réalisée pour évaluer l’engouement scientifique
que suscite leurs études. Ainsi, ces plantes sont largement étudiées avec des moyennes de
publications sur les cinq dernières années de 43 publications pour Phyllanthus amarus, de 7
pour Alchornea cordifolia et de 41 publications pour Tridax procumbens.
L’optimisation du rendement d’extraction des métabolites secondaires a débuté par la
détermination des paramètres influençant cette extraction, puis le rendement a été modélisé par
un plan de Plackett et Burmann. Le modèle a ensuite été optimisé par la méthode des simplex
pour trouver les conditions optimales d’extraction des métabolites secondaires des plantes.
Ainsi, la modélisation et l’optimisation sur Alchornea cordifolia et Tridax procumbens ont
montré que le rendement d’extraction est très sensible à la nature de la plante et que les
paramètres les plus significatifs sont le ratio volume du solvant sur masse du broyat et la
proportion en éthanol du solvant hydro-alcoolique. Il serait intéressant d’approfondir ce travail
en agrandissant le domaine de valeurs choisi et aussi en variant les plantes utilisées.
Les extraits hydro-alcooliques des métabolites secondaires ont été fractionnés par des
solvants de polarité croissante à savoir l’hexane, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle, le
butanol et l’eau. Chaque fraction obtenue a été analysée en Chromatographie sur couche mince
à haute performance (HPTLC), en Chromatographie liquide à haute performance couplée à la
spectroscopie Ultra-Violette (HPLC-UV) et en spectroscopie Infrarouge (IR). De toutes ces
méthodes, la HPTLC a été la plus efficace dans l’identification des familles de métabolites
secondaires des plantes de l’étude. Une Chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse (GC-MS) a permis de déterminer la structure de quelques molécules de
Tridax procumbens.
Les perspectives de ce travail sont nombreuses. Ainsi, les résultats de l’optimisation
devront être approfondies en validant le modèle avec une plus grande base de données et un
domaine de confiance plus large. Il serait intéressant de voir l’influence des paramètres
KONE KOUWELTON PATRICK 239
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
d’extraction sur la sélectivité des familles de métabolites secondaires. L’optimisation des
conditions d’extraction pourrait aussi contribuer à améliorer les conditions d’élaboration des
médicaments traditionnels améliorés et pourrait être entreprise en vue d’améliorer le rendement
en familles de métabolites biologiquement actifs.
L’utilisation des méthodes chromatographiques et spectroscopiques dans
l’identification des familles de métabolites secondaires dans des extraits de plantes devra être
poursuivie afin de normaliser ces méthodes qui pourraient constituer une alternative
intéressante à la méthode de criblage phytochimique très utilisée actuellement.
I
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
BIBLIOGRAPHIE
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KONE KOUWELTON PATRICK XVII
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
XVIII
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
ANNEXES
Annexe 01 : Chromatogrammes HPTLC de Alchornea cordifolia
Annexe a: Fraction à l'hexane
Annexe b: Fraction au dichlorométhane
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KONE KOUWELTON PATRICK XIX
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Annexe c: Fraction à l'acétate d'éthyle
Annexe d: Fraction au butanol
Annexe e: Fraction résiduelle aqueuse
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Annexe 02 : Chromatogramme HPTLC de Phyllanthus amarus
Annexe f: Fraction à l'hexane
Annexe g: Fraction au dichlorométhane
0
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Annexe h: Fraction à l'acétate d'éthyle
Annexe i: Fraction au butanol
Annexe j: Fraction résiduelle aqueuse
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Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites
secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Annexe 03 : Chromatogramme HPLC de Alchornea cordifolia
KONE KOUWELTON PATRICK XXIII
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Annexe 04 : Chromatogramme HPLC de Phyllanthus amarus
KONE KOUWELTON PATRICK XXIV
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
KONE KOUWELTON PATRICK XXV
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Annexe 05 : Tableau de comparaison des méthodes de criblage
Plantes médicinales Fractions Méthode de screening Métabolites secondaires
Alcaloïdes Flavonoïdes Terpènes et stérols
Alchornea cordifolia
Fraction à l'hexane
Screening chimique 1 1 0
HPTLC 1 1 1
IR 1 0 1
HPLC UV 1 1 1
Fraction au dichlorométhane
Screening chimique 0 1 1
HPTLC 1 1 0
IR 1 1 1
Fraction à l'acétate d'éthyle
Screening chimique 0 1 0
HPTLC 1 1 1
IR 0 1 1
HPLC UV 1 0 1
Fraction au butanol
Screening chimique 1 1 1
HPTLC 0 1 1
IR 0 1 1
HPLC UV 0 1 1
Fraction résiduelle
Screening chimique 0 1 0
HPTLC 0 1 1
IR 0 1 1
KONE KOUWELTON PATRICK XXVI
Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de
trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne
Plantes médicinales Fractions Méthode de screening Métabolites secondaires
Alcaloïdes Flavonoïdes Tepènes et stérols
Phyllanthus amarus
Fraction à l'hexane
Screening chimique 1 1 1
HPTLC 1 1 1
IR 0 1 1
HPLC UV 1 0 1
Fraction au dichlorométhane
Screening chimique 1 1 0
HPTLC 1 1 1
IR 1 1 1
Fraction à l'acétate d'éthyle
Screening chimique 1 1 1
HPTLC 1 1 1
IR 0 1 1
HPLC UV 1 1 1
Fraction au butanol
Screening chimique 1 1 0
HPTLC 0 1 1
IR 0 1 1
Fraction résiduelle
Screening chimique 1 1 1
HPTLC 1 1 1
IR 0 1 1
HPLC UV 1 1 1
Détermination des paramètres influençant le rendement
d’extraction hydro-alcoolique des métabolites
secondaires de Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae) et
Tridax procumbens linn (Asteraceae)
Kouwelton Patrick Franck Olivier Koné, Yaya Soro et Sorho Siaka
Journal de la Société Ouest-Africaine de Chimie J. Soc. Ouest-Afr. Chim.(2017), 044 : 15 - 22
22èmeAnnée, Décembre 2017
ISSN 0796-6687 Code Chemical Abstracts : JSOCF2
Cote INIST (CNRS France) : <27680> Site Web: http://www.soachim.org
J. Soc. Ouest-Afr. Chim. (2017) 044; 15- 22
K.P.F.O. Koné et al 15
Détermination des paramètres influençant le rendement d’extraction hydro-alcoolique des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae) et Tridax
procumbens linn (Asteraceae)
Kouwelton Patrick Franck Olivier Koné, Yaya Soro* et Sorho Siaka
Laboratoire des Procédés Industriels de Synthèse, de l’Environnement et des Energies Nouvelles (LAPISEN), Institut National Polytechnique Félix HOUPHOUËT-BOIGNY, BP 1093 Yamoussoukro, Côte d’Ivoire
(Reçu le 21/11/2017 – Accepté après corrections le 22/12/ 2017)
Résumé : Une étude des facteurs influençant le rendement d’extraction a été menée sur les feuilles de Alchornea cordifolia et sur la plante entière de Tridax procumbens. Le plan de criblage a été réalisé suivant la méthode de Plackett et Burmann pour analyser six facteurs qui sont : la durée de séchage, la granulométrie du broyat, le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique, le ratio volume de solvant par masse de broyat, le temps de macération et la vitesse d’agitation. La méthodologie utilisée a consisté en une série d’extraction des métabolites secondaires en variant simultanément les facteurs retenus et en réalisant une analyse statistique des rendements obtenus. Une optimisation a été faite en utilisant la méthode des simplex. Les résultats ont montré que le ratio volume de solvant par masse de broyat et le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique sont les deux facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia alors que le ratio volume de solvant par masse de broyat, le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique, la granulométrie du broyat et la durée de macération sont les quatre facteurs significatifs pour Tridax procumbens.
Mots clés : Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, plan de criblage, métabolites secondaires, rendement, optimisation.
Determination of the parameters influencing the hydroalcoholic extraction yield of the secondary metabolites of Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae) and Tridax
procumbens linn (Asteraceae)
Abstract: A study of the extraction yield influencing factors was conducted on the leaves of Alchornea cordifolia and on the whole plant of Tridax procumbens. The screening plan carried out according to the Plackett and Burmann method aimed at analyzing the six following factors: the drying time, grinded matter particle size, ethanol percentage in hydroethanolic solvent, solvent volume per grinded matter mass ratio, maceration time and stirring speed. The methodology used consisted of a series of secondary metabolites extraction by varying the selected factors and simultaneously performing a statistical yields analysis. An optimization was done using the simplex method. The results showed that the solvent volume per grinded matter mass ratio and the ethanol percentage in the hydroethanolic solvent are the two significant factors for Alchornea cordifolia extraction yield, whereas the solvent volume per grinded matter mass ratio, the percentage of ethanol in the hydro-ethanolic solvent, the grain size of the crushed stone and the maceration time are the four significant factors for Tridax procumbens extraction yield. Key words: Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, screening plan, secondary metabolites, yield, optimization.
* Auteur correspondant : Soro Yaya ; [email protected]
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1. Introduction
Alchornea cordifolia et Tridax procumbens sont deux plantes médicinales largement utilisées dans la pharmacopée ivoirienne pour la prise en charge du diabète et de l’hypertension artérielle [1]. Tridax procumbens est connue pour ses activités antivirales, antibiotiques, cicatrisantes, insecticides, antioxydantes, anti-inflammatoires et anticancéreuses [2,3]. Le screening phytochimique de Tridax procumbens linn a indiqué la présence d’alcaloïdes, de caroténoïdes, de flavonoïdes (catéchine et flavones), de tannins, de l'acide fumarique, du sitostérol fluoré, de saponines et de glycosides [4,5]. Ses feuilles contiennent 26% de protéines, 17% de fibres, 39% de carbohydrates solubles et 5% d’oxyde de calcium [6] et la plante entière est riche en ions comme le sodium, le potassium et le calcium [7]. Alchornea cordifolia est largement utilisée comme antidysentérique, anti-inflammatoire, antalgique, antimicrobien, antiparasitaire, veinotonique, antioxydant et astringent [8], dans le traitement du paludisme [9] ou encore dans la phytothérapie de la maladie hémorroïdaire [10-13]. Le screening phytochimique de Alchornea cordifolia révèle la présence de la quercétine et du gallate d’éthyle dans les feuilles [14], du l’indole, de stérols et des glycosides terpéniques dans les racines, des acides alchornoïques, l’alchorneïne et l’alchonidine dans les graines [15]. Les deux plantes renferment de nombreux métabolites secondaires responsables de leurs propriétés médicinales [16,17]. Il est donc important de maximiser l’extraction de ceux-ci en vue d’une meilleure exploitation de ces ressources comme des sources potentielles de nouveaux médicaments naturels, d’antibiotiques, d’insecticides et d’herbicides. La présente étude vise à déterminer les facteurs qui influencent les rendements et les conditions optimales de l’extraction des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia et Tridax procumbens.
2. Matériel et méthodes
2.1. Matériel végétal
Les feuilles de Alchornea cordifolia et la plante entière de Tridax procumbens ont été récoltées tôt le matin avant le lever du soleil en juin 2016 à Yamoussoukro (6°53’04.7’’ Nord et 5°13’54.9’’Ouest) au centre de la Côte d’Ivoire, en saison pluvieuse. Les plantes ont été identifiées par M. Amani N’Guessan, botaniste à l’Institut National Polytechnique Félix HOUPHOUËT-BOIGNY de Yamoussoukro.
2.2. Choix des facteurs influençant le rendement d’extraction Nous avons choisi six facteurs influençant le rendement d’extraction des métabolites secondaires qui sont la durée de séchage du matériel végétal, la granulométrie du broyat, le pourcentage d’alcool dans le solvant, le ratio volume de solvant sur masse de broyat, la durée de macération et la vitesse d’agitation [18-20]. Notons que le solvant hydro-éthanolique est largement utilisé pour l’extraction des métabolites secondaires des plantes [18-20] et il est proche de l’eau généralement utilisée en médecine traditionnelle.
2.3. Domaines de valeurs
Les domaines de valeurs des facteurs ont été fixés en fonction du matériel disponible au laboratoire. Au niveau de la granulométrie et de la vitesse d’agitation, le choix a été fait par rapport aux tamis et aux agitateurs magnétiques disponibles dans notre laboratoire. Quant aux autres facteurs, le choix a été fait en tenant compte des conditions de macération trouvées dans la littérature [21,22]. Le tableau I résume le choix des valeurs des facteurs énumérés.
Tableau I: Valeurs des facteurs recensés
2.4. Matrice de Plackett-Burman
Pour l’établissement de la matrice de Plackett-Burman [23,24]
, un facteur fictif (x7) a été ajouté pour que le nombre de facteurs k (fictifs et réels) soit du type (k + 1), multiple de 4 et corresponde au nombre d’expériences. Le tableau II présente la matrice des expériences.
Tableau II: Matrice des expériences
Tests x1 (semaines)
x2 (mm)
x3 (%)
x4 (g/mL)
x5 (h)
x6 (rpm)
1 4 0,4 50 10 12 1600 2 4 2 50 5 24 500 3 4 2 90 5 12 1600 4 2 2 90 10 12 500 5 4 0,4 90 10 24 500 6 2 2 50 10 24 1600 7 2 0,4 90 5 24 1600 8 2 0,4 50 5 12 500
Codage Facteurs Valeur (-1) Valeur (+1) X1 Durée de séchage 2 semaines 4 semaines X2 Granulométrie ≤ 0,4 mm ≤ 2 mm X3 Pourcentage d’alcool 50% 90%
X4 Ratio volume sur masse de broyat
5 mL/g 10 mL/g
X5 Durée de macération 12h 24h
X6 Vitesse d'agitation 500 rpm 1600 rpm
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2.5. Procédure générale de réalisation des tests
Les feuilles de Alchornea cordifolia et la plante entière de Tridax procumbens ont été séchées pendant une durée x1 au laboratoire à l’abri de la lumière à une température de 28±2 °C. Elles ont ensuite été broyées à l’aide d’un broyeur électrique de marque IKA M20 (France) et tamisés pour donner une poudre de granulométrie x2. Les poudres obtenues ont été conservées au réfrigérateur dans des bocaux colorés à 4 °C pour les futurs tests. Une masse de 10 g du broyat a été introduite dans un volume x3 d’un solvant hydro-éthanolique de composition x4 et macérée pendant une durée x5 avec une vitesse de rotation x6. Après filtration sur du coton puis sur du papier wattman, l’extrait obtenu est concentré à l’évaporateur rotatif à 40 °C. Le résidu obtenu est pesé afin de calculer le
rendement d’extraction. Les tests 1 à 8 ont été réalisés trois fois dans les conditions du tableau 2.
2.6. Optimisation du modèle
L’optimisation du modèle obtenu après le traitement des résultats est réalisée par la suite Excel du logiciel Microsoft Office avec le complément solveur qui permet de faire une optimisation par la méthode des Simplex [25,26]. Cette méthode est utilisée pour les modèles linéaires et permet de trouver une solution optimum.
3. Résultats et discussion
3.1. Rendements des extractions
Les rendements obtenus, après la réalisation des expériences pour les deux plantes, sont donnés dans les figures 1 et 2.
Figure 1:Rendements des extractions des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia
Figure 2: Rendements des extractions des métabolites secondaires de Tridax procumbens
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Les rendements sont compris entre 0,004 et 0,24 %, les plus élevés (compris entre 0,02 et 0,24) ayant été obtenus avec les feuilles de Alchornea cordifolia. Quant à la plante entière de Tridax procumbens, les rendements sont compris entre 0,004 et 0,11. Les rendements sont plus élevés lorsque le ratio volume/masse du broyat est à sa borne (+1) quel que soit la plante. Les résultats obtenus confirment que les rendements d’extraction dépendent de plusieurs facteurs. Les résultats obtenus ont été traité en régression linéaire multiple à l’aide de la suite Excel de Microsoft Office avec le niveau de confiance fixé à 90%, α = 0,1. Ainsi, le calcul de l’erreur expérimentale avec les valeurs non assignées et la détermination des facteurs significatifs sont consignés respectivement dans les tableaux III et IV . Il ressort des résultats du tableau IV qu’il y a deux (2) facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia, à savoir le pourcentage d’éthanol dans le solvant (x3) et le ratio volume sur la masse de broyat (x4). Le modèle obtenu est donc de la forme : ��� � 0,036125 � � 0,059375 � � � 0,119625 (1) avec Rdt le rendement en métabolites secondaires, P le pourcentage en éthanol dans le solvant eau-éthanol (entre 50 et 90%) et R le ratio volume de solvant sur la masse de broyat (entre 5 et 10 mL/g).
La figure 3 illustre la dépendance du rendement à ces deux facteurs. En effet, le rendement est maximum pour un ratio de 10 mL/g et un pourcentage de 90%
en éthanol dans le solvant.
Figure 3: Influence des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction
Les résultats du tableau IV montrent également qu’il y a quatre (4) facteurs significatifs pour Tridax procumbens à savoir la granulométrie du broyat (x2), le ratio volume sur la masse de broyat (x3), le pourcentage en éthanol dans le solvant (x4) et la durée de macération (x5). Le modèle obtenu est donc de la forme :
��� � �0,00475 � � � 0,00775 � � 0,03775 � � � 0,00475 �
�� � 0,05925 (2) avec Rdt le rendement en métabolites secondaires, G la granulométrie du broyat (entre 0 et 4 mm), P le pourcentage en éthanol dans le solvant eau-éthanol (entre 50 et 90%), R le ratio volume de solvant sur la masse de broyat (entre 5 et 10 mL/g) et Dm la durée de macération (entre 12 et 24h).
Tableau III : Calcul des erreurs expérimentales
Plantes Variables Coefficients Coeff*2
Facteur de Student
Erreur expérimentale
Alchornea cordifolia Constante 0,119625 0,23925 3,07768 0,06078 x7 0,009875 0,01975
Tridax procumbens Constante 0,05925 0,1185 3,07768 0,00462 x7 0,00075 0,0015
Tableau IV: Détermination des facteurs significatifs Plantes Variable Coefficients Effets Effet*2 Pertinence
Alchornea cordifolia
Constante 0,119625 0,119625 0,23925 OUI x1 0,008125 0,008125 0,01625 NON x2 -0,026375 0,026375 0,05275 NON x3 0,036125 0,036125 0,07225 OUI x4 0,059375 0,059375 0,11875 OUI x5 0,005375 0,005375 0,01075 NON
x6 0,006125 0,006125 0,01225 NON
Tridax procumbens
Constante 0,05925 0,05925 0,1185 OUI x1 -0,00125 0,00125 0,0025 NON x2 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI x3 0,03775 0,03775 0,0755 OUI x4 -0,00775 0,00775 0,0155 OUI x5 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI x6 -0,00075 0,00075 0,0015 NON
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La figure 4 montre que le ratio est plus influant que les autres facteurs significatifs car tous les rendements les plus élevés sont obtenus lorsqu’il est à son niveau (+1). Il y a une séparation visible en deux groupes du fait des deux bornes de ce facteur.
Figure 4: Influence des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction
3.2. Optimisation des modèles
Les conditions optimales pour le modèle réalisé avec Alchornea cordifolia sont les suivantes : une durée de séchage de 28 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm, un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 90%, un ratio volume sur masse de 10 mL/g, une durée de macération de 24 heures et une vitesse d’agitation de 1600 rpm. Pour le modèle réalisé avec Tridax procumbens, les conditions optimales sont les suivantes : une durée de séchage de 14 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm, un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 50%, un ratio volume sur masse de 10
mL/g, une durée de macération de 12 heures et une vitesse d’agitation de 500 rpm. La granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm et le ratio volume sur masse de 10 mL/g sont les deux conditions identiques pour les modèles et pourraient être maintenues pour l’extraction des métabolites secondaires des plantes.
3.3. Vérification et comparaison
Des comparaisons entre les données obtenues avec les modèles et les données expérimentales ont été effectuées en calculant les coefficients de détermination linéaire [27,28,29]. Les différents résultats obtenus sont présentés dans les figures 5 et 6 pour Alchornea cordifolia avec un coefficient de corrélation de 0,9915 entre les données expérimentales et calculées et dans les figures 7 et 8 pour Tridax procumbens avec un coefficient de corrélation de 0,9933.
Figure 5: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de Alchornea cordifolia
Figure 6: corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Alchornea cordifolia
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
1 2 3 4 5 6 7 8
Ren
dem
ent
TestY exp
Y calc
y = 0.9831x + 0.002
R² = 0.9831
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
30.00%
0.00% 5.00% 10.00% 15.00% 20.00% 25.00% 30.00%
Do
nn
ée
s e
xp
éri
me
nta
les
Données modélisées
Y Mac
Linéaire (Y Mac)
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Les figures 6 et 8 montrent une bonne corrélation entre les modèles obtenus et les données expérimentales, ce qui permet de valider nos modèles. 3.4. Modélisation des données d’une plante avec le modèle de l’autre
La comparaison entre les modèles développés sur Alchornea cordifolia et sur Tridax procumbens a été menée en testant le modèle d’une plante sur les données de l’autre. Les résultats obtenus sont présentés dans les figures 9 et 10.
Figure 6: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de Tridax procumbens
Figure 8: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Tridax procumbens
.
Figure 9: Modélisation des données de Tridax procumbens avec le modèle de A. cordifolia
0.00%
2.00%
4.00%
6.00%
8.00%
10.00%
12.00%
1 2 3 4 5 6 7 8
Re
nd
em
en
t
Test
Y exp Y calc
y = 0.9863x + 0.0008
R² = 0.9866
0.00%
2.00%
4.00%
6.00%
8.00%
10.00%
12.00%
0.00% 2.00% 4.00% 6.00% 8.00% 10.00% 12.00%
Do
nn
ée
s e
xpé
rim
en
tale
s
Données modélisées
Y Mtp
Linéaire (Y Mtp)
y = 0.3602x + 0.0162
R² = 0.4789
0.00%
2.00%
4.00%
6.00%
8.00%
10.00%
12.00%
0.00% 10.00% 20.00% 30.00%
Do
nn
ée
s
exp
éri
me
nta
les
de
T.
pro
cum
be
ns
Données modélisées avec A. cordifolia
modèle de T.
procumbens par A.
cordifolia
Linéaire (modèle de
T. procumbens par A.
cordifolia)
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Figure 10: Modélisation des données de Alchornea cordifolia avec le modèle de Tridax procumbens
Il ressort de cette étude que le modèle de Alchornea cordifolia modélise mieux les données de Tridax procumbens que celle de cette dernière pour la première. En effet, comme le montre les figures 9 et 10, le coefficient de corrélation de Alchornea cordifolia (0,6920) est plus grand que celui de Tridax procumbens (0,3329). Cela montre que le type de plante influe sur le rendement d’extraction. Cependant, le coefficient du modèle de Alchornea cordifolia pourrait rassurer sur une potentielle relation permettant de faire passer le modèle d’une plante à une autre. 4. Conclusion
Un plan de criblage suivant la méthode de Plackett et Burmann a été réalisé pour déterminer les facteurs influençant le rendement d’extraction des métabolites secondaires dans les feuilles de Alchornea cordifolia et sur la plante entière de Tridax procumbens. Des six (6) facteurs sélectionnés, deux (2) se sont avérés significatifs pour Alchornea cordifolia et quatre (4) pour Tridax procumbens. Les modèles obtenus ont été optimisés et des conditions expérimentales optimales ont été établies. Chaque modèle est proche de l’expérimentation avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99. Il serait intéressant de confirmer leur précision avec des données expérimentales autres que celles de nos expériences. La présente étude pourrait être une contribution intéressante dans l’amélioration des rendements d’extraction des métabolites secondaires en médecine traditionnelle.
5. Remerciements Les auteurs remercient Dr Akmel Djédjro clément et Dr Nogbou Arsène tous les deux membres du LAPISEN pour avoir apporté des corrections au texte initial.
6. Bibliographie [1] Tra Bi F., Irié G., N’Gaman K., Mohou C. Études de quelques plantes thérapeutiques utilisées dans le traitement de l’hypertension artérielle et du diabète : deux maladies émergentes en Côte d’Ivoire. Sci. Nat. (2008) 5, 39–48. [2] Suseela L., Sarsvathy A., Brindha P. Pharmacognostic studies on Tridax procumbens L. (Asteraceae). Journal of Phytological Research (2002) 15 (2), 141-147. [3] Manjamalai A., Kumar M.J., Grace V.M. Essential Oil of Tridax procumbens L. Induces Apoptosis and Suppresses Angiogenesis and Lung Metastasis of the B16F-10 Cell. Line in C57BL/6 Mice. Asian Pac. J. Cancer Prev. (2012) 13(11), 5887-5895. [4] Ali M., Rawinder E., Ramachamdram R. A new flavonoid from the aerial parts of Tridax procumbens L. Fitoterapia (2001) 72(3), 313-315. [5] Yadawa R.N., Saurabh K. A new flavone glycoside: 5,7,4-Trihydraxy- 6,3-dimethasey Falavone 5-0 alpha-L-rhamnopyramoside from the leaves of Tridax procumbens Linn. J. Asian Nat. Prod. Res. (1998) 1(2), 147-152. [6] Verma R.K., Gupta M.M. Lipid constituents of Tridax procumbens. Phytochemistry (1988) 27(2), 459-463. [7] Mohammed A., Earla R., Ramidi R. A new flavonoids from the aerial parts of Tridax procumbens Linn. Fitoterapia (2001) 72, 313-315. [8] Dibong S.D., Mpondo Mpondo E., Ngoye A., Kwin N.F. Plantes médicinales utilisées par les populations bassa de la région de Douala au Cameroun. Int. J. Biol. Chem. Sci. (2011) 5 (3), 1105-1117. [9] Mustofa A.V., Francoise B., Yves P., Koné-Bamba D., Mallié M. Antiplasmodial activity of plant extract used in west african traditional medicine. J. of Etno. Pharm. (2000) 73, 145-151. [10] Ilumbe B.G., Van Damme P., Lukoki L.F., Joiris V., Visser M., Lejoly J. Contribution à l'étude des plantes médicinales dans le traitement des hémorroïdes par les pygmées Twa et leur voisin Oto de Bikoro, en RDC. Congo Sci. (2014) 2 (1), 46-54. [11] Dibong S.D., Ottou P.B.M., Vandi D., Ndjib R.C., Mpondo Mpondo E. Ethnobotanique des plantes médicinales anti hémorroïdaires des marchés et villages du Centre et du Littoral Cameroun. J. Appl. Biosci. (2015) 96, 9072-9093. [12] Ngene J.P., Ngoule C.C., Kidik P.C., Ottou P.M., Dibong S.D., Mpondo Mpondo E. Importance dans la pharmacopée traditionnelle des plantes à flavonoïdes vendues dans les marchés de Douala est (Cameroun). J. Appl. Biosci. (2015) 88 (1), 8194-8210. [13] Nga E. N., Yinyang J., Baran à Bidias E., Etame-Loe G., Dibong S.D. Étude phytochimique et pharmacologique d’Alchornea cordifolia (Schum. & Thonn.) Mull. Arg. et de Mangifera indica dans le traitement traditionnel de la maladie hémorroïdaire. J. Appl. Biosci. (2017) 109, 10649-10661. [14] Pruja S. Contribution à l´étude phytochimique de Alchornea cordifolia. 1987, INP de Toulouse. [15] Ajali U. Anibacterial activity of Alchornea cordifolia stem bark. Fitoterapia (2000), 436-438. [16] Adeshina G.O., Onaolapo J.A., Ehinmidu J.O., Odama L.E., Kunle O.F., Phytochemical and Antibacterial Studies of the Hexane Extract of Alchornea cordifolia Leaf, Phytochemicals as Nutraceuticals - Global
y = 0.6451x + 0.0814
R² = 0.1108
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
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Données modélisées par T. procumbens
modèle de A. cordifolia avec
Tridax
Linéaire (modèle de A.
cordifolia avec Tridax)
J. Soc. Ouest-Afr. Chim. (2017) 044; 15- 22
K.P.F.O. Koné et al 22
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RESUME
L’étude de Alchornea cordifolia, Phyllanthus amarus et Tridax procumbens a été menée afin d’identifier
les grandes familles de métabolites secondaires en appliquant des techniques chromatographiques et
spectroscopiques. La bibliographique sur le thème et la méthodologie de travail adoptée ont permis
d’aboutir à plusieurs résultats. Une première étude des facteurs influençant le rendement d’extraction a
été menée sur les feuilles de A. cordifolia et sur la plante entière de T. procumbens. Le plan de criblage
a été réalisé suivant la méthode de Plackett et Burmann pour analyser six facteurs et une optimisation a
été faite en utilisant la méthode des simplex. Les résultats ont montré que le ratio volume de solvant par
masse de broyat et le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique sont les deux facteurs
significatifs pour A. cordifolia alors que le ratio volume de solvant par masse de broyat, le pourcentage
en éthanol du solvant hydro-éthanolique, la granulométrie du broyat et la durée de macération sont les
quatre facteurs significatifs pour T. procumbens. Une deuxième étude sur l’identification des
métabolites secondaires des trois plantes par des méthodes de criblage phytochimique (CP), de
Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC), de Chromatographie liquide à haute
performance couplée à la spectroscopie Ultra-Violette (HPLC-UV) et de spectroscopie Infra rouge (IR)
a été effectuée. Ces méthodes ont montré quelques différences dans la détection des familles de
métabolites secondaires. Une comparaison de ces méthodes à l’aide de l’analyse de données par des
tableaux croisés dynamiques a montré que la méthode de criblage par HPTLC est la plus satisfaisante
avec des détections de 30,00-31,82 % suivie du CP (16,67-31,82 %), de l’IR (13,64-33,33 %) et de la
HPLC-UV (12,12-22,73 %). La détermination structurale de quarante et un (41) métabolites secondaires
de T. procumbens a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectroscopie de
masse.
Mots clés : Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, Phyllanthus amarus plan de criblage, métabolites
secondaires, rendement, optimisation, criblage phytochimique, méthodes chromatographiques,
méthodes spectroscopiques.
ABSTRACT
The study of Alchornea cordifolia, Phyllanthus amarus and Tridax procumbens was conducted to
identify large families of secondary metabolites by applying chromatographic and spectroscopic
techniques. The bibliography on the subject and methodology of work gave several results. A first study
of the extraction yield influencing factors was conducted on the leaves of A. cordifolia and on the whole
plant of T. procumbens. The screening was done using the simplex method according to the Plackett and
Burmann method aimed at analyzing six factors and optimization. The results showed that the solvent
volume per grinded matter mass ratio and the ethanol percentage in the hydroethanolic solvent are the
two significant factors for A. cordifolia extraction yield, whereas the solvent volume per grinded matter
mass ratio, the percentage of ethanol in the hydro-ethanolic solvent, the grain size of the crushed stone
and the maceration time are the four significant factors for T. procumbens extraction yield. A second
study was performed on the identification of secondary metabolites of the three plants by methods of
Phytochemical Screening (PS), High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), High
Performance Liquid Chromatography coupled with Ultra-Violet spectroscopy (HPLC-UV) and Infra-
Red (IR) spectroscopy. These methods have shown some differences in the detection of families of
secondary metabolites. A comparison of these methods using Pivot Tables data analysis showed that the
HPTLC screening method is the most satisfactory with detections of 30.00-31.82% followed by CP
(16.67-31.82%), IR (13.64-33.33%) and HPLC-UV (12.12-22.73%). The structural determination of
forty-one (41) secondary metabolites of T. procumbens was performed by gas chromatography coupled
with mass spectroscopy.
Key words: Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, Phyllanthus amarus, screening plan, secondary
metabolites, yield, optimization, Phytochemical Screening, chromatographic methods, spectroscopic
methods.