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1
Thèse de doctorat de l'Université Paris XII Val de Marne
Ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé
Soutenue publiquement par
Luc DANNHOFFER
Le 20 décembre 2006
TRANSPORTS IONIQUES TRANSÉPITHÉLIAUX DANS LES VOIES
AÉRIENNES HUMAINES NON-MUCOVISCIDOSIQUES ET
MUCOVISCIDOSIQUES
Directeur de thèse : Professeur Thierry CHINET
JURY
Pr. Frédéric Becq Université de Poitiers Rapporteur Dr. Jacky Jacquot INSERM Rapporteur Pr. Anh-Tuan Dinh-Xuan Université de Paris V René Descartes Examinateur Pr. Jean-François Bernaudin Université de Paris VI Pierre et Marie Curie Examinateur Dr Pascale Fanen Université de Paris XII Val de Marne Examinateur Pr. Thierry Chinet Université de Versailles St Quentin en Yvelines Examinateur,
Directeur de thèse
2
Remerciements
La direction de ce travail a été réalisée par le Professeur Thierry Chinet de l’Université de Versailles Saint-Quentin en Yvelines, à qui j’adresse mes plus sincères remerciements. Je tiens à lui exprimer ici toute ma gratitude pour la confiance qu’il m’a accordée tout au long de cette thèse. Je lui suis également extrêmement reconnaissant pour le soutien et le savoir dont il m’a fait bénéficier au cours de cette thèse, je n’oublierai pas ses traditionnelles petites phrases « mais c’est génial, ça !! » ou « il faut avancer, maintenant !! ». Que ce travail soit le témoignage de ma profonde reconnaissance.
Je remercie le Professeur Frédéric Becq, de l’Université de Poitiers, pour avoir
accepté de juger ce travail. Je le remercie également pour m’avoir initié au monde de la recherche durant les stages que j’ai effectué dans son laboratoire.
Je remercie le Docteur Jacky Jacquot, de l’INSERM, pour avoir accepté d’examiner
ce travail et d’en être rapporteur. Je remercie le Professeur Ahn-Tuan Dinh-Xuan, de l’Université Paris V, le
Professeur Jean-François Bernaudin, de l’Université de Paris VI, ainsi que le Docteur Pascale Fanen, de l’Université de Paris XII, pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de faire partie de mon jury.
Je veux aussi remercier le Dr Sabine Blouquit-Laye, pour m’avoir, entre autres,
appris à passer des heures sous une loupe binoculaire pour disséquer quelques millimètres de bronchioles...Je remercie également le Dr Agathe Régnier pour sa convivialité et pour son aide dans l’analyse des immunomarquages.
Je remercie également le Dr Pierre Bonnette et le Dr Philippe Puyo, du service de
chirurgie thoracique de l’hôpital Foch à Suresnes, et le Dr Emmanuel Naline pour m’avoir fourni des prélèvements de poumon humain.
Merci aussi à tous les membres du service de pneumologie et du service d’anatomie
pathologique de l’hôpital Ambroise Paré qui m’ont aidé, Brigitte et Tania, Mariama,… Je veux également remercier le Professeur Edith Puchelle, de l’unité INSERM de
Reims, pour m’avoir permis de réaliser des dosages d’Il-8 dans son laboratoire. Je remercie également Christelle Coraux et Konstantina Fragaki pour leur aide dans ces dosages et pour m’avoir épargné de leurs « bombes stress ».
Cette thèse n’aurait pas été possible sans le soutien financier de l’association Vaincre
La Mucoviscidose et de CARDIF ASSISTANCE auxquels j’adresse mes profonds remerciements.
Je voudrais remercier ma famille : Benoit, Cécile, Jérôme, Sophie, Pascal, Agnès, et
leurs « petiots » : Claire, Pierre-Louis, Charlotte, Ludmilla, Mathéo, Séléna, Juliette, Lucien, Manon et Louis.
3
Je souhaite remercier les michouls : Aurélie et Benoit, Dams, Laurette et leur bébé
girondin, Gégètte et Maud, Bubulle et ses Méganes et Camille. Je voudrais également remercier Nico et Angèle ainsi que « les têtes au froid » Marje et Nel pour leur soutien et les bons moments passés ensemble, mais vous ne pouvez donc pas vous empêcher de vous défiler…
Je voudrais tout spécialement remercier Anna : juste merci pour Tout. Et bien sur, je remercie tout particulièrement mes Parents pour « presque » Tout.
Ne laissons pas les chacals brouter nos idéals (Têtes Raides)
Maman, quand je s'rai grand, je voudrais pas être étudiant (Renaud)
4
Table des matières
1 LES VOIES AÉRIENNE1 LES VOIES AÉRIENNE1 LES VOIES AÉRIENNE1 LES VOIES AÉRIENNES HUMAINES NORMALESS HUMAINES NORMALESS HUMAINES NORMALESS HUMAINES NORMALES .................................................................................................................................................................... 12121212
1.1 DESCRIPTION DES VOIES AERIENNES HUMAINES .............................................................. 13
1.2 DESCRIPTION DE L'EPITHELIUM DES VOIES AERIENNES HUMAINES................................. 15
1.3 LIQUIDE DE SURFACE DES VOIES AERIENNES .................................................................... 23
1.4 PRINCIPALES FONCTIONS DE L'EPITHELIUM DES VOIES AERIENNES................................ 30
2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS IONIQUES DANS LES VOIESIQUES DANS LES VOIESIQUES DANS LES VOIESIQUES DANS LES VOIES AÉRIENNES HUMAINES AÉRIENNES HUMAINES AÉRIENNES HUMAINES AÉRIENNES HUMAINES .... 34343434
2.1 AU NIVEAU BRONCHIQUE ................................................................................................... 35
2.1.1 REGULATION DE L’ABSORPTION ACTIVE DE Na+....................................................................................... 41
2.1.2 REGULATION DE LA SECRETION DE Cl- ..................................................................................................... 46
2.2 AU NIVEAU BRONCHIOLAIRE ............................................................................................. 49
2.3 DIFFERENCES ET SIMILITUDES ENTRE LES TRANSPORTS D’IONS ET D’EAU DANS LES
VOIES AERIENNES HUMAINES PROXIMALES ET DISTALES ....................................................... 52
2.4 AU NIVEAU ALVEOLAIRE.................................................................................................... 53
2.5 REGULATION DU LIQUIDE DE SURFACE ............................................................................. 56
5
3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE ........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 64646464
3.1 LA MALADIE ....................................................................................................................... 65
3.2 L'ATTEINTE PULMONAIRE DANS LA MUCOVISCIDOSE ...................................................... 67
3.3 LE GENE CF ET LES MUTATIONS ....................................................................................... 69
3.3.1 DU GENE A LA PROTEINE .......................................................................................................................... 69
3.3.2 LES DIFFERENTES CLASSES DE MUTATIONS DE CFTR............................................................................... 76
3.3.3 CORRELATION GENOTYPE/PHENOTYPE ..................................................................................................... 81
3.3.4 LES GENES MODIFICATEURS ..................................................................................................................... 82
3.4 CFTR ................................................................................................................................. 88
3.4.1 FONCTIONS DE CFTR............................................................................................................................... 88
3.4.2 EXPRESSION DE CFTR ............................................................................................................................. 91
3.5 EFFETS DES MUTATIONS DE CFTR SUR LES MOUVEMENTS D'IONS ET D'EAU AU NIVEAU
DES VOIES AERIENNES PROXIMALES ET DISTALES .................................................................. 93
3.6 CONCEPTS ACTUELS SUR LA PHYSIOPATHOLOGIE DE L'ATTEINTE PULMONAIRE DE LA
MUCOVISCIDOSE ...................................................................................................................... 96
3.7 PERSPECTIVES THERAPEUTIQUES ................................................................................... 103
4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 109109109109
4.1 ETUDE DE L’EXPRESSION DE CFTR DANS LES VOIES AERIENNES DISTALES HUMAINES110
6
4.2 EFFETS DU MONOXYDE D'AZOTE (NO) SUR LES TRANSPORTS IONIQUES
TRANSEPITHELIAUX DANS LES VOIES AERIENNES HUMAINES PROXIMALES ET DISTALES
MUCOVISCIDOSIQUES ET NON MUCOVISCIDOSIQUES ............................................................ 111
4.3 DETERMINATION DU POURCENTAGE DE CELLULES NON-CF PERMETTANT DE
NORMALISER LES FONCTIONS EPITHELIALES D'UNE CULTURE PRIMAIRE DE CELLULES
EPITHELIALES BRONCHIQUES CF.......................................................................................... 112
5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR DANS LES VOIES AÉRI DANS LES VOIES AÉRI DANS LES VOIES AÉRI DANS LES VOIES AÉRIENNES HUMAIENNES HUMAIENNES HUMAIENNES HUMAINESNESNESNES........................................ 114114114114
5.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 115
5.2 MATERIELS ET METHODES .............................................................................................. 118
5.2.1 ORIGINE DES PRELEVEMENTS PULMONAIRES.......................................................................................... 118
5.2.2 COLORATION ET ANALYSE HISTOLOGIQUE DES PRELEVEMENTS ............................................................. 118
5.2.3 ANTICORPS ANTI-CFTR ......................................................................................................................... 119
5.2.4 PROCEDURES D'IMMUNOMARQUAGE ...................................................................................................... 120
5.2.5 ANALYSE STATISTIQUE .......................................................................................................................... 121
5.3 RESULTATS....................................................................................................................... 123
5.3.1 EXPRESSION DE CFTR ........................................................................................................................... 123
5.3.2 ETUDE COMPARATIVE ............................................................................................................................ 124
5.4 DISCUSSION ...................................................................................................................... 128
6 EFFETS DU NO SUR L6 EFFETS DU NO SUR L6 EFFETS DU NO SUR L6 EFFETS DU NO SUR LES TRANSPORTS IONIQUES TRANSPORTS IONIQUES TRANSPORTS IONIQUES TRANSPORTS IONIQUES TRANSÉPITHÉLIAUX ES TRANSÉPITHÉLIAUX ES TRANSÉPITHÉLIAUX ES TRANSÉPITHÉLIAUX
DANS LES VOIES AÉRIEDANS LES VOIES AÉRIEDANS LES VOIES AÉRIEDANS LES VOIES AÉRIENNES HUMAINES PROXIMNNES HUMAINES PROXIMNNES HUMAINES PROXIMNNES HUMAINES PROXIMALES ET DISTALES NONALES ET DISTALES NONALES ET DISTALES NONALES ET DISTALES NON
MUCOVISCIDOSIQUES ETMUCOVISCIDOSIQUES ETMUCOVISCIDOSIQUES ETMUCOVISCIDOSIQUES ET MUCOVISCID MUCOVISCID MUCOVISCID MUCOVISCIDOSIQUESOSIQUESOSIQUESOSIQUES .................................................................................................................................................................... 134134134134
7
6.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 135
6.1.1 HISTORIQUE ........................................................................................................................................... 135
6.1.2 SYNTHESE DU NO .................................................................................................................................. 136
6.1.2.1 LES NOS CONSTITUTIVES ............................................................................................................... 136 6.1.2.2 LA NOS INDUCTIBLE ...................................................................................................................... 140 6.1.2.3 VOIES DE TRANSDUCTION DU NO................................................................................................... 140 6.1.2.4 PRINCIPAUX EFFETS DU NO............................................................................................................ 144
6.2 MATERIELS ET METHODES .............................................................................................. 150
6.2.1 ORIGINE DES PRELEVEMENTS ................................................................................................................. 150
6.2.1.1 TISSUS NON MUCOVISCIDOSIQUES .................................................................................................. 150 6.2.1.2 TISSUS MUCOVISCIDOSIQUES .......................................................................................................... 150
6.2.2 CULTURE CELLULAIRE ........................................................................................................................... 151
6.2.2.1 OBTENTION DE CULTURES PRIMAIRES DE CELLULES EPITHELIALES BRONCHIQUES ET
BRONCHIOLAIRES HUMAINES...................................................................................................................... 151 6.2.2.1.1 IDENTIFICATION DES BRONCHES ET DES BRONCHIOLES........................................................... 151
6.2.2.1.2 ISOLEMENT DES CELLULES...................................................................................................... 153
6.2.2.1.3 ENSEMENCEMENT DES CELLULES ........................................................................................... 154
6.2.3 MESURE DES PROPRIETES BIOELECTRIQUES DES CULTURES PRIMAIRES BRONCHIQUES ET BRONCHIOLAIRES
DANS LES CHAMBRES DITES DE USSING........................................................................................................... 155
6.2.3.1 HISTORIQUE.................................................................................................................................... 155 6.2.3.2 DESCRIPTION DU SYSTEME UTILISE DANS LE LABORATOIRE ........................................................... 155 6.2.3.3 PROTOCOLES .................................................................................................................................. 159 6.2.3.4 ANALYSES STATISTIQUES ............................................................................................................... 160
6.3 RESULTATS....................................................................................................................... 161
6.3.1 CARACTERISTIQUES DES PRELEVEMENTS ............................................................................................... 161
6.3.2 EXPOSITION DES CULTURES BRONCHIQUES ET BRONCHIOLAIRES NON-CF A UN DONNEUR DE NO, LE SNP
........................................................................................................................................................................ 162
6.3.3 EXPOSITION DES CULTURES BRONCHIQUES ET BRONCHIOLAIRES CF A UN DONNEUR DE NO, LE SNP.... 164
6.3.4 EXPOSITION DES CULTURES PRIMAIRES DE CELLULES EPITHELIALES BRONCHIQUES NON-CF AU 8-BR-
GMPC ET AU ZAPRINAST................................................................................................................................. 166
6.3.5 EXPOSITION DES CULTURES PRIMAIRES DE CELLULES EPITHELIALES BRONCHIQUES NON-CF AU SNP EN
PRESENCE OU NON D'ODQ, UN INHIBITEUR DE LA GUANYLATE CYCLASE SOLUBLE ........................................ 168
6.4 DISCUSSION ...................................................................................................................... 170
8
7 DÉTERMINATION DU P7 DÉTERMINATION DU P7 DÉTERMINATION DU P7 DÉTERMINATION DU POURCENTAGE DE CELLULOURCENTAGE DE CELLULOURCENTAGE DE CELLULOURCENTAGE DE CELLULES NONES NONES NONES NON----CF PERMETTANT CF PERMETTANT CF PERMETTANT CF PERMETTANT
DE NORMALISER LES FODE NORMALISER LES FODE NORMALISER LES FODE NORMALISER LES FONCTIONS ÉPITHÉLIALESNCTIONS ÉPITHÉLIALESNCTIONS ÉPITHÉLIALESNCTIONS ÉPITHÉLIALES D'UNE CULTURE D'UNE CULTURE D'UNE CULTURE D'UNE CULTURE
PRIMAIRE DE CELLULESPRIMAIRE DE CELLULESPRIMAIRE DE CELLULESPRIMAIRE DE CELLULES ÉPITHÉLIALES BRONCH ÉPITHÉLIALES BRONCH ÉPITHÉLIALES BRONCH ÉPITHÉLIALES BRONCHIQUES CFIQUES CFIQUES CFIQUES CF ............................................................................................ 174174174174
7.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 175
7.1.1 IDENTIFICATION DES CELLULES CIBLES DANS LES VOIES AERIENNES...................................................... 177
7.1.2 LES DIFFERENTS VECTEURS UTILISES DANS LES VOIES AERIENNES HUMAINES ....................................... 179
7.1.2.1 LES VECTEURS VIRAUX................................................................................................................... 179 7.1.2.2 LES VECTEURS NON-VIRAUX........................................................................................................... 182
7.1.3 LA BARRIERE EPITHELIALE ..................................................................................................................... 183
7.1.4 LA THERAPIE GENIQUE DANS LE CADRE DE LA MUCOVISCIDOSE............................................................. 185
7.2 MATERIELS ET METHODES .............................................................................................. 187
7.2.1 ECHANTILLONS ...................................................................................................................................... 187
7.2.2 CULTURES CELLULAIRES ........................................................................................................................ 187
7.2.2.1 CO-CULTURES................................................................................................................................. 187
7.2.3 EVALUATION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE DURANT LE TEMPS DE CULTURE................................ 188
7.2.4 EVALUATION DE L'APOPTOSE AU COURS DU TEMPS DE CULTURE............................................................ 189
7.2.5 MESURE DES PROPRIETES BIOELECTRIQUES DES CULTURES PRIMAIRES BRONCHIQUES DANS LES
CHAMBRES DE USSING .................................................................................................................................... 190
7.2.3.4 PROTOCOLES .................................................................................................................................. 191
7.2.6 DOSAGE DES CYTOKINES IL-8 DANS LE SURNAGEANT DES CULTURES (KIT ELISA) ............................... 191
7.3 RESULTATS....................................................................................................................... 192
7.3.1 CARACTERISTIQUES DES PRELEVEMENTS ............................................................................................... 192
7.3.2 EVALUATION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE DURANT LE TEMPS DE CULTURE (KI67) .................... 192
7.3.3 EVALUATION DE L'APOPTOSE AU COURS DU TEMPS DE CULTURE PAR LA METHODE « TUNEL »............ 193
7.3.4 ÉTUDES EN CHAMBRES DE USSING ......................................................................................................... 194
7.3.5 DOSAGE DE L’IL-8 DANS LE SURNAGEANT DES CULTURES ..................................................................... 197
9
7.4 DISCUSSION ...................................................................................................................... 199
8 CONCLUSIONS ET PER8 CONCLUSIONS ET PER8 CONCLUSIONS ET PER8 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVESSPECTIVESSPECTIVESSPECTIVES .................................................................................................................................................................................................................................................... 203203203203
9 RÉFÉRENCES BIBLIOG9 RÉFÉRENCES BIBLIOG9 RÉFÉRENCES BIBLIOG9 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUESRAPHIQUESRAPHIQUESRAPHIQUES................................................................................................................................................................................................................................................ 207207207207
10
Liste des abréviations
A2b-R : Récepteur de l’adénosine de type 2b
AAV : Virus adéno-associé
AC : Adénylate cyclase
ADO : Adénosine
AMPc : Adénosine 3’-5’ monophosphate
cyclique
ASL : Liquide de surface des voies aériennes
ATP : Adénosine tri-phosphate
BAL : Lavage broncho-alvéolaire
BK : Bradikinine
BPCO : Broncho-pneumopathie chronique
obstructive
CaCC : Canaux C- activés par le Ca2+
CAP : Channel activating protease
CE : Clara cell secretory protein Expressing
CF : Cystic fibrosis / mucoviscidose
CFTR : Cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator
ClC : Canaux Cl-
CVF : Capacité vitale forcée
DAG : Diacylglycerol
ddp : différence de potentiel
DMEM/Ham-F12 : Dulbecco’s modified
eagle’s medim/nutrient mixture F-12 Ham
DPC : Diphénylamine-2-carboxylic acid
ENaC : Epithelial Na+ channel
GCs : Guanylate cyclase soluble
G-CSF : Granulocyte colony-stimulating factor
GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor
GMPc : Guanosine monophosphate cyclique
GnRH : Gonadotrophin releasing hormon
hCLCA : Canaux Cl- activés par le Ca2+
HLA : Human leukocyte antigen
HSP : Heat shock protein
huASH1: Absent, small or homeotic discs 1
iNANC : système inhibiteur non adrénergique
non cholinergique
IP3 : Inositol 1, 4, 5-triphosphate
Isc : Courant de court-circuit
LPS : Lipopolysaccharide
MAB1660 : Anticorps anti-CFTR dirigé contre
le domaine R
MAB25031 : Anticorps anti-CFTR dirigé
contre la partie C-terminale
MBL : Mannose binding lectin
MOI : Multiplicity of infection
MUC : Mucine
NEB : Neuroendocrin body
NBD ou SFN : Nucleotide binding domain ou
Site de fixation des nucléotides
NO : Nitric oxide, monoxyde d’azote
NOS : NO synthase
ORCC : Outwardly rectifying Cl- channel
P2Y2 : Récepteur purinergique couplé aux
protéines G
PBS : Phosphate buffered saline
PCL : Periciliary liquid / liquide péricilaire
PHA : Pseudo-hypo-aldostéronisme
PI/II : Pneumocyte de type I/II
PIP2 : Phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate
PKA : Protéine kinase A
PLC : Phospholipase C
PNEc : Pulmonary neuroendocrine cells
QRT-PCR : Quantitative RT-PCR
RSV : Respiratory syncitial virus
Rt : Résistance transépithéliale
11
RT-PCR : Reverse transcriptase-polymerase
chain reaction
SAF-B: Scaffold attachment factor-B
SDS : Sodium dodecyl sulfate
SLPI : Secretory leukocyte protease inhibitor
TBS : Tris-buffered saline
TLR : Toll-like receptor
TNF-α : Tumor necrosis factor-α
UTP : Uridine tri-phosphate
VEMS : Volume expiratoire maximal en une
seconde
ZO-1, 2, 3 : Zonula occludens 1, 2, 3
ZONAB: ZO-1 associated nucleic acid binding
protein
β2AR : Récepteur β2 adrénergique
12
1 LES VOI1 LES VOI1 LES VOI1 LES VOIESESESES AAAAÉÉÉÉRIENNESRIENNESRIENNESRIENNES HUMAINES HUMAINES HUMAINES HUMAINES
NORMALENORMALENORMALENORMALESSSS
13
1.1 Description des voies aériennes humaines
Les voies aériennes supérieures sont composées du nez, du pharynx et du larynx
(figure 1). Elles ont pour fonctions de réchauffer, filtrer, nettoyer et humidifier l'air qui
pénètre dans les poumons. Les voies aériennes de conduction qui font suite aux voies
aériennes supérieures comprennent tous les étages de l'arbre aérien depuis la trachée jusqu'aux
bronchioles terminales. Ces voies aériennes ont pour fonction de conduire l'air jusqu'aux
alvéoles. Les échanges gazeux entre l'air et le sang ont lieu dans les espaces alvéolaires situés
en aval des bronchioles terminales. Ces zones d'échange comportent plusieurs générations de
bronchioles respiratoires dans lesquelles s'ouvrent les canaux alvéolaires et les alvéoles. Au
niveau des alvéoles, le sang veineux provenant de l'organisme contient un taux élevé de CO2
et un taux réduit d'O2. Le CO2 diffuse le long d'un gradient de concentration du sang à l'air
alvéolaire. L'oxygène de l'air alvéolaire diffuse des alvéoles vers le sang.
Les voies aériennes proximales, constituées de la trachée et des bronches, sont
caractérisées par la présence de cartilage et de glandes sous-muqueuses dans leur paroi. En
progressant vers les régions distales, le diamètre des voies aériennes diminue et les cartilages
disparaissent au niveau des bronchioles. Les voies aériennes distales sont composées des
bronchioles et des alvéoles pulmonaires.
14
Figure 1 : Représentation des voies aériennes humaines de la cavité nasale aux alvéoles (d’après http://visualsonline.cancer.gov/).
15
1.2 Description de l'épithélium des voies aériennes
humaines
Les épithéliums sont des tissus dont les cellules sont jointives et solidaires les unes des
autres grâce à des jonctions intercellulaires comme les "tight junctions" ou jonctions serrées.
Dans ce type de tissus, les cellules sont polarisées. On distingue la région apicale de la cellule
et la région basale qui est accolée à la lame basale. L’épithélium des voies aériennes est
capable de maintenir des gradients de concentration chimiques entre les deux compartiments
qu’il sépare ainsi que de transférer sélectivement certaines molécules d’un côté vers l’autre.
L’épithélium des voies aériennes humaines est composé d’au moins une couche de
cellules reposant sur une lame basale qui sert de moyen d’ancrage aux cellules épithéliales. La
lame basale est sécrétée par les cellules épithéliales et est principalement composée de
protéoglycans, de collagène de type IV, de fibronectine, de laminine et d’entactine.
L’observation en microscopie électronique de la lame basale permet de distinguer 2 zones : la
lamina rara (ou lucida) composée principalement de mucopolysaccharides, et la lamina
densa composée de collagène de type IV et de glycoprotéines (laminine, fibronectine). La
lame basale et la lame réticulaire, sécrétée par les cellules du tissu conjonctif sous-jacent et
composée de fibre de collagène de type III, forment ensemble la membrane basale.
L’épithélium des voies aériennes est dit « pseudostratifié » car si toutes les cellules semblent
entrer en contact avec la lame basale, toutes n’atteignent pas la face apicale (Malm et
Toremalm 1988 ; Mercer et al. 1994).
16
Les principales cellules rencontrées dans les voies aériennes proximales sont les
cellules basales, les cellules ciliées et les cellules caliciformes (figure 2). Les cellules basales
n’atteignent pas la lumière apicale mais entrent largement en contact et sont fermement
attachées à la lame basale par des hemi-desmosomes (Evans et Moller 1991). Les cellules
ciliées possèdent une partie apicale avec de nombreux cils (environ 250 par cellule) et de
nombreux microvilli de 1 à 2 µm qui font sailli à la surface. La face apicale est recouverte par
un glycocalix probablement produit par les cellules ciliées elles-mêmes (Welsh 1987). Le
noyau des cellules caliciformes est situé dans la partie basale tandis que les granules
sécrétoires occupent la partie apicale du cytoplasme.
Les cellules basales, les cellules ciliées et les cellules caliciformes sont donc
les principaux types cellulaires rencontrés le long de l’arbre bronchique, mais la proportion de
ces cellules est variable le long de l’épithélium. Au niveau bronchique, les cellules basales
représentent environ 30 % de la population totale des cellules (Mercer et al. 1994; Boers et al.
1998), les cellules ciliées de 20 à 35 % et les cellules sécrétantes environ 10 %. Les autres
types cellulaires bronchiques sont les cellules préciliées, des cellules sécrétantes et
neurosécrétantes ou de phénotype indéterminé (Mc Dowell et al. 1978; Kelsen et al. 1992;
Mercer et al. 1994).
L'épithélium bronchique possède également des glandes séromuqueuses qui s'ouvrent
dans la lumière des voies aériennes (figures 3 et 4). La région la plus profonde de la glande est
composée d'acini bordés essentiellement par des cellules séreuses (Engelhardt et al. 1992).
Les acini s'ouvrent dans des tubules qui sont tapissés de cellules à mucus. Un canal collecteur
cilié conduit ensuite les sécrétions vers la lumière des voies aériennes.
17
Figure 2 : Principaux types cellulaires des voies aériennes proximales humaines (d’après http://www-sante.ujf-grenoble.fr).
Figure 3 : Aspect histologique des épithéliums bronchique, bronchiolaire et alvéolaire. Les tissus ont été colorés à l'hématoxyline et l'éosine. a) Bronches avec un épithélium pseudostratifié, cilié et mucosécrétant (flèche noire : cartilage, flèche blanche : glande séreuse). b) Bronchiole avec un épithélium cilié et mucosécrétant. c) Alvéoles avec des pneumocytes I (cellules plates) et des pneumocytes II (cellules cuboïdales). Barre d'échelle : 50µm (Photographies provenant du laboratoire).
18
Afin de faciliter la sortie des sécrétions, les glandes sont entourées par des cellules
myo-épithéliales contractiles (Murray et al. 1986). La partie la plus profonde de ces glandes
produit des sécrétions plutôt fluides tandis que les tubules muqueux produisent des sécrétions
plus denses et riches en mucines. Le nombre de glandes chez l'homme diminue au fur et à
mesure que l'on progresse vers les régions distales, ainsi à partir de la 6ème génération de
bronches, 30 % des individus ne possèdent plus de glandes sous-muqueuses.
Lorsque l'on progresse vers les régions distales, la hauteur de l'épithélium diminue.
Alors que l'épithélium bronchique mesure environ 50 à 60 µm, l'épithélium bronchiolaire ne
mesure plus qu'environ 10 µm de haut (Fishman 1988; Jeffery et al. 1988; Mercer et al.
1991). L'épithélium n'est alors plus pseudo-stratifié mais il prend l’aspect d’un épithélium
cuboïdal simple (figures 3 et 4). Le nombre des glandes sous-muqueuses et de cellules basales
diminue lorsque l’on progresse vers les régions distales. Dans les bronchioles de 0,5 mm de
diamètre, les cellules basales ne représentent plus que 6% du nombre total de cellules (Boers
et al. 1998). Les deux types cellulaires les plus importants au niveau des bronchioles d'un
diamètre de 1 à 0,4 mm sont les cellules ciliées (46%) et les cellules sécrétantes (34%)
(Mercer et al. 1994). Parmi ces dernières, 4 principaux types cellulaires ont été répertoriés :
les cellules à mucus, les cellules séreuses, les cellules neuroendocrines et les cellules de Clara.
Ces dernières qui sont absentes ou quasiment absentes dans les bronches et les bronchioles
proximales, représentent jusqu'à respectivement 11% et 20% des cellules des bronchioles
terminales et respiratoires humaines (Boers et al. 1999).
Des études ont montré que les cellules de Clara pouvaient servir de progéniteur pour
les cellules ciliées dans les bronchioles (Evans et al. 1976; Boers et al. 1999).
19
Figure 4: La paroi des voies aériennes. La paroi des voies aériennes comprend 3 composants majeurs : 1) une muqueuse, composée d'un épithélium reposant sur une lame basale, 2) un manchon de fibres musculaires lisses et 3) une enveloppe de tissu conjonctif partiellement pourvue de cartilage. L'épithélium pseudostratifié des voies aériennes proximales s'affine graduellement et se présente sous la forme d'une couche de cellules cuboïdales dans les bronchioles et très plates dans les alvéoles. L'enveloppe fibreuse se réduit également au fur et à mesure que l'on s'approche des alvéoles (d’après http://www.embryology.ch).
20
En plus de leur rôle de cellules sécrétantes, de leur rôle dans le renouvellement de l'épithélium
bronchiolaire, des études ont révélé que ces cellules, chez le lapin, étaient capables de
transports ioniques (Van Scott et al. 1989; Chinet et al. 1997). Ces études ont, en effet, révélé
que les cellules de Clara étaient capables d'absorption de sodium ainsi que de sécrétion de
chlore.
L'épithélium des voies aériennes est une structure polarisée qui constitue une barrière
entre deux compartiments. Pour assurer cette polarité, l'épithélium des voies aériennes est
doté de protéines spécialisées qui assurent les jonctions intercellulaires. Il existe plusieurs
types de jonctions intercellulaires : les jonctions serrées, les jonctions adhérentes, et les
desmosomes qui préservent l'intégrité de l'épithélium et les jonctions communicantes ou "gap
junctions" qui interviennent dans la communication intercellulaire (figure 5). Les jonctions
serrées sont localisées vers le côté apical des espaces intercellulaires formant une sorte de
ceinture continue impliquée dans le contrôle des échanges (d'eau et d'ions) effectués par la
voie paracellulaire (figures 5 et 6) (Schneeberger et al. 2004). La zone correspondant aux
jonctions serrées ou « zonula occludens » s’étend sur 0,1 à 0,7µm de hauteur. Ces jonctions
sont constituées d'un assemblage de plusieurs protéines comme ZO-1 (zonula occludens-1),
ZO-2, ZO-3, cinguline, occludine, claudine,... Les « claudines » dont il existe au moins 24
isoformes formeraient des pores sélectifs à certains ions, tandis que l'occludine entrerait en
relation avec des complexes cytosoliques (Schneeberger et al. 2004). Les jonctions serrées
jouent donc non seulement un rôle vital dans l'établissement de la polarité cellulaire mais de
plus en plus d'autres fonctions leur sont attribuées : la régulation de certains gènes, le contrôle
de la prolifération cellulaire,… (Schneeberger et al. 2004).
21
Figure 5 : Différents types de jonctions présentes au niveau de l’épithélium (d’après http://www.unifr.ch).
Figure 6 : Complexes de jonctions intercellulaires constitués de jonctions serrées (flèches étroites) et de desmosomes (flèche large) observées au microscope électronique à transmission (X96000) (d’après Schneeberger et al. 1978).
Figure 7 : Schéma de jonctions communicantes (d’après http://www.unifr.ch).
22
Située sous la "zonula occludens", se trouve la "zonula adherens" principalement
constituée de cadhérines, puis sous cette zone se trouve la "macula adherens" constituée des
desmosomes (figure 5). Ces jonctions renforcent la cohésion physique des cellules entre elles.
Les cadhérines pourraient également intervenir dans la reconnaissance cellulaire et leur
absence dans les carcinomes pourrait permettre aux cellules cancéreuses de migrer à distance
initiant le processus métastatique.
Ces différents types de jonctions assurent notamment un contrôle des mouvements de
molécules (eau, ions,…) au travers de la couche épithéliale. Les jonctions communicantes
permettent d'établir des communications entre les cellules adjacentes. Ces jonctions forment
en effet des canaux entre 2 cellules, chaque cellule possédant un demi-canal ou "connexon".
Ces connexons sont constitués de 6 connexines qui forment un pore (figure 7). Il existe au
moins une vingtaine d'isoformes pour ces protéines qui sont distribuées spécifiquement selon
les tissus. Les connexines sont finement régulées par plusieurs mécanismes ([Ca2+]
intracellulaire, phosphorylation,..) et possèdent des sélectivités différentes selon les isoformes
impliquées dans le canal. Les jonctions communicantes semblent ainsi impliquées dans la
coordination du battement ciliaire. L’expression différentielle des connexines, notamment de
la connexine 26, semble être impliquée dans le développement des voies aériennes ainsi que
dans le maintien de l'épithélium dans un état différencié (Kumar et al. 1996 ; Carson et al.
1998).
Les différents types de jonctions intercellulaires assurent donc le maintien de la
polarité des épithéliums mais loin d'être des complexes statiques, ces jonctions participent
activement à la vie cellulaire et leurs dysfonctionnements entraînent donc des pathologies. Les
jonctions serrées interviendraient dans la régulation de l'expression de certains gènes. La
23
découverte des protéines des jonctions serrées simplekine, ZO-1 et ZO-2 dans le noyau des
cellules prolifératives, et surtout des facteurs de transcription (huASH1, ZONAB et SAF-B)
associés aux jonctions serrées, a permis d’impliquer ces structures dans la régulation de
l’expression de certains gènes (Zarhaoui 2004). Dans la lignée cellulaire rénale d’origine
canine (MDCK), l’interaction ZO-1/ZONAB régule l’expression du gène codant pour le co-
récepteur du facteur de croissance épithélial, qui a un rôle important dans la différenciation
des cellules épithéliales. Des mutations touchant les "claudines" et entraînant une altération du
passage des ions Mg2+ au niveau des tubules rénaux ont également été rapportées. Les
jonctions adhérentes ainsi que les jonctions communicantes pourraient également intervenir
dans le processus cancéreux.
1.3 Liquide de surface des voies aériennes
L'épithélium de surface des voies aériennes est recouvert d'un liquide : l'ASL (Airway
Surface Liquid ou liquide de surface des voies aériennes). L'ASL est composé de deux phases
: une phase aqueuse (le liquide périciliaire) et une phase muqueuse (figure 8).
Le liquide périciliaire (PCL) baigne les cils dont on estime qu’il mesure à peu près la
même hauteur (environ 7 µm) et le mucus flotte sur le PCL. La composition ionique de ce
liquide a fait l'objet de nombreuses études chez l'animal et chez l'homme, mais compte tenu
de la difficulté de prélever ce liquide et des différentes techniques utilisées, des résultats
différents ont été obtenus. Ces résultats discordants ont provoqué l'émergence de deux écoles.
24
Figure 8 : a) Schéma du liquide de surface des voies aériennes représentant le liquide périciliaire, la couche de mucus et la vélocité normale du transport de mucus. b) Photographie en microscopie optique de cellules humaines bronchiques en culture distinguant une couche de mucus et le liquide périciliaire. Barre d’échelle : 10µm (d’après Boucher et al. 2004).
25
D'une part l'école hypotonique et d'autre part l'école isotonique. Pour les tenants de l'école
hypotonique, la concentration en NaCl du PCL était <50mM et donc inférieure par rapport à
la concentration plasmatique (120 à 140mM) (Zabner et al. 1998; Mc Cray et al. 1999). Ce
système impliquait que l'épithélium régulait la concentration plus que le volume de l'ASL et
que si l'épithélium était perméable au NaCl, il était en revanche imperméable à l'eau. Pour les
défenseurs de l'école isotonique, la concentration en NaCl dans le PCL est identique à celle du
plasma (Boucher et al. 1994a; Knowles et al. 1997; Matsui et al. 1998; Tarran et al. 2001).
Selon cette théorie, l'épithélium régule le volume de l'ASL plutôt que sa composition et
l'épithélium est à la fois perméable au NaCl et à l'eau.
Matsui et al. ont démontré que l'épithélium, par l'intermédiaire de l'escalator
mucociliaire, fait remonter le liquide périciliaire des voies aériennes distales vers la trachée
(Matsui et al. 1998). Or étant donné que la surface cumulée de chaque génération des voies
aériennes diminue des alvéoles (environ 70 m2) jusqu'à la trachée (environ 25 cm2), un
surplus important de liquide devrait donc être engendré par cette réduction de surface
cumulée. Une accélération de la vitesse de l’escalator mucociliaire au niveau des voies
aériennes proximales pourrait permettre d’éviter un « encombrement » des voies aériennes par
le surplus de liquide. Si cette accélération est réelle, elle reste toutefois largement insuffisante
pour compenser le surplus de liquide. L’augmentation de la hauteur de l’ASL pourrait
constituer une autre possibilité permettant de compenser le surplus de liquide provenant des
voies aériennes distales. Cependant, la hauteur de l’ASL demeure relativement constante le
long des voies aériennes (Boucher 1994a). Le surplus de liquide provenant des voies
aériennes distales est en fait réabsorbé au niveau des voies aériennes proximales. Ces données
sont en accord avec la théorie isotonique, l’absorption de liquide n’étant pas consistante avec
le modèle hypotonique dans lequel l’épithélium serait imperméable à l’eau. Cet argument
26
associé aux observations faites sur la concentration isotonique du PCL obtenues sur des
cultures de cellules normales et mucoviscidosiques ainsi que la diminution du volume du PCL
observée dans les cultures de cellules mucoviscidosiques (Jayaramn et al. 2001; Matsui et al.
1998; Tarran et al. 2001; Boucher 2004; Tarran et al. 2005) font qu'aujourd'hui il est admis
que l'ASL est isotonique au plasma.
La phase muqueuse piège les particules étrangères inhalées qui sont transportées par
l'escalator mucociliaire vers le larynx pour être ingérées (figure 9). Le mucus est composé de
glycoprotéines de haut poids moléculaire fortement glycosylées : les mucines. Elles forment
un ensemble de glycoprotéines enchevêtrées et enroulées aléatoirement, formant un réseau
lâche de densité variable qui donne au mucus ses propriétés (élasticité et viscosité) (Verdugo
et al. 1983). Cependant, le pH, les concentrations ioniques et le contenu en eau influencent
également la consistance du mucus (Knowles et al. 2002). Plusieurs gènes codant pour des
mucines (MUC) ont été clonés dans le poumon humain. Associé à un polymorphisme
génétique, une extraordinaire diversité des chaînes glycosylées des mucines confère à la phase
muqueuse le pouvoir de reconnaître, fixer et piéger potentiellement l'ensemble des types de
motifs se présentant dans les voies aériennes (Lamblin et al. 2000). Les mucines MUC1,
MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC11 et MUC13 sont exprimées dans les
voies aériennes. Il est généralement distingué deux principaux types de mucines : les mucines
monomériques et les mucines oligomériques. Les mucines monomériques (MUC1, MUC4,
MUC7, MUC11 et MUC13) sont principalement transmembranaires, tandis que les mucines
oligomériques sont sécrétées. Les mucines oligomériques MUC2, MUC5AC, MUC5B,
présentes dans le poumon humain, possèdent des domaines riches en cystéine permettant leur
oligomérisation. Ce sont donc principalement ces mucines oligomériques qui confèrent au
mucus ses propriétés rhéologiques (Thornton et Sheehan 2004).
27
Figure 9 : Schéma représentant l’ASL normal. Le mucus piège les particules étrangères (ici représentées par des bactéries) qui sont « remontées » vers l’oropharynx où elles seront ingérées (d’après Knowles et al. 2002).
28
MUC5AC et MUC5B sont présentes en plus grande quantité par rapport à MUC2 (Davies et
al. 1999). Thornton et al. ont suggéré dans leur étude que MUC5AC, produite principalement
par les cellules caliciformes, pourrait jouer un rôle prépondérant pour faciliter la clairance
mucociliaire tandis que MUC5B, provenant principalement des glandes sous-muqueuses,
interviendrait dans la formation d'un gel dont le rôle premier serait de faciliter l'évacuation de
pathogènes et autres particules inhalées (Thornton et Sheehan 2004). Cependant, les mucines
monomériques présentes dans les voies aériennes humaines joueraient également un rôle dans
la composition du mucus mais à l'heure actuelle peu de choses sont connues sur ces mucines
tant au niveau de leurs caractérisations biochimiques que de leurs concentrations ou que de
leurs fonctions.
La coordination du battement ciliaire entre les cellules ciliées voisines permet de faire
remonter le mucus et les particules piégées jusqu'à l'oropharynx où l'ensemble sera éliminé
par la déglutition. La vélocité du mucus est d'environ 4 mm par minute dans la trachée
(Widdicombe et al. 1995 ; Wanner et al. 1996). Des études ont montré que la vélocité du
mucus diminue avec le diamètre des voies aériennes (Wanner et al. 1996). Dans des cellules
ciliées bronchiolaires, récupérées par brossage dans un poumon obtenu après résection
pulmonaire, Clary-Meinesz et al. ont montré que la vitesse de battement ciliaire est inférieure
de 35% par rapport à des cellules épithéliales bronchiques obtenues par la même technique
(Clary-Meinesz et al. 1997). La vitesse du battement ciliaire est régulée par différents facteurs
comme par exemple par les nucléotides triphosphates extracellulaires (ATP et UTP) et par
l'augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+ (Donaldson et al. 2002). Cependant,
la vitesse du battement ciliaire peut également être inhibée par des agents pathogènes comme
la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ces études menées chez le cobaye suggèrent que cette
29
inhibition permettrait de ralentir l'élimination des bactéries des voies aériennes (Read et al.
1992 ; Denning et al. 1998).
Le mucus pourrait également servir de réservoir de fluide pour le PCL. En effet le
mucus pourrait permettre d'ajuster la hauteur du PCL pour que celui-ci reste continuellement
à la hauteur des cils permettant un battement ciliaire toujours efficace (Tarran 2004). Ce
phénomène pourrait expliquer les variations de la hauteur de la couche de mucus observées
(de 7 à 70 µm in vivo) (Tarran 2004).
L'ASL contient également des agents chimiques importants dans la défense du
poumon. Le lysozyme, la lactoferrine et le SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) font
partie de ces facteurs parmi les plus abondamment sécrétés par les glandes sous-muqueuses et
par l'épithélium de surface (figure 9) (Knowles et al. 2002). Le lysozyme est capable de cliver
les ponts glycosidiques de l’acide N-acétylmuramique entraînant des altérations dans la paroi
bactériennes et en définitive d’éliminer le pathogène par lyse cellulaire (Fernie-King et al.
2002). La lactoferrine a une action bactériostatique principalement en chélatant le fer et en le
rendant inaccessible pour le pathogène. Cependant, une action anti-bactérienne directe faisant
intervenir un domaine situé près de l’extrémité N-terminale et distincte de la partie liant le fer
a été reportée (Bellamy et al. 1992). Le mode d’action anti-microbien du SLPI reste encore
inconnu. Une étude a démontré que la combinaison des peptides deux par deux
(SLPI/lactoferrine, SLPI/lysozyme, lactoferrine/ lysozyme) était synergétique et que cet effet
synergétique était plus important encore quand les trois agents étaient combinés ensembles
(Singh et al. 2000). Le liquide périciliaire contient aussi des peptides antimicrobiens dont par
exemple, les beta-défensines et les cathelicidines (Singh et al. 2000). L'ASL protège donc
l'épithélium des particules infectieuses contenues dans l'air inhalé (Travis et al. 1999). Les
30
antimicrobiens contenus dans l'ASL constituent un "bouclier chimique" efficace pour
préserver l'intégrité de l'épithélium et permettent d’éliminer un grand nombre de pathogène
sans initier de réponse inflammatoire (Singh et al. 2000).
L'ASL par ses propriétés mécaniques et chimiques permet donc une protection
efficace de l'épithélium des voies aériennes. Ces propriétés et leur régulation sont des
éléments essentiels pour les fonctions de défense des poumons.
1.4 Principales fonctions de l'épithélium des voies
aériennes
Selon notre activité physique, nous inspirons quotidiennement entre 1000 et 21000
litres d'air (Wanner 1996). Cet air contient de nombreuses particules minérales et organiques
et parmi ces dernières des allergènes et des agents infectieux susceptibles d’exercer des effets
délétères sur l’organisme. L'épithélium des voies aériennes possède cependant des moyens de
défense permettant de lutter efficacement contre ces particules inhalées.
La clairance mucociliaire constitue une première ligne de défense de l’épithélium des
voies aériennes contre les agents inhalés comme nous l'avons vu précédemment. Nous avons
également vu que l'épithélium possède des défenses anti-infectieuses qui peuvent être des
composants de l'ASL. Les substances antimicrobiennes contenues dans l'ASL peuvent
détruire directement les bactéries ou inhiber la croissance bactérienne (dont le temps de
doublement en conditions optimales est de 20 minutes) pendant un laps de temps relativement
31
court (2 à 6 heures) mais suffisant en conditions normales pour permettre l'élimination des
voies aériennes des bactéries inhalées grâce à la clairance mucociliaire (Knowles et Boucher
2002).
L’épithélium des voies aériennes possède, en plus des peptides contenus dans l’ASL,
des protéines membranaires (récepteurs, transporteurs) situées à la face apicale des cellules
Les récepteurs Toll-like (TLR) semblent également participer à l'élimination des pathogènes
des voies aériennes. Les TLR sont des protéines transmembranaires possédant à leur extrémité
N-terminale extracellulaire des répétitions de motifs riches en leucine qui sont probablement
impliqués dans la liaison de leur ligand mais qui sont aussi probablement nécessaires pour
leur dimérisation (figure 10) (Basu et Fenton 2004). La présence de TLR-2, ARNm et
protéine, a été démontrée dans les pneumocytes de type II ainsi que dans les macrophages
(Droemann et al. 2003). TLR-4 est également exprimé au niveau des macrophages alvéolaires
et dans les cellules épithéliales trachéales humaines (Becker et al. 2000). TLR-4 est capable
de reconnaître le lipopolysaccharide (LPS), qui est le composé le plus pro-inflammatoire
présent sur l’enveloppe des bactéries à Gram négatif comme P. aeruginosa, et d'entraîner en
réponse à cette stimulation la production de cytokines pro-inflammatoires telle que l'IL-8
(Becker et al. 2000). Les TLR semblent également impliqués dans l'élimination des voies
aériennes du virus respiratoire syncitial (RSV pour respiratory syncytial virus). Des études ont
montré que chez des souris déficientes pour TLR-4 et infectées par le RSV l'expression d'IL-
6, d'IL-12 et d'IL-1β était inférieure par rapport aux souris possédant TLR-4 (Haynes et al.
2000; Kurt-Jones et al. 2001).
32
Figure 10 : Les récepteurs Toll-like et leurs ligands. HSP : heat shock protein 60 et 70 (d'après Basu et Fenton 2004).
33
L'épithélium en initiant et en maintenant l'inflammation mais également en attirant et
activant des granulocytes et des leucocytes, semble jouer un rôle majeur dans le déroulement
de la réaction inflammatoire (Cooper et al. 2001). En effet, les cellules épithéliales possèdent
des récepteurs aux médiateurs de l’inflammation comme le TNF-α (facteur nécrosant des
tumeurs / tumor necrosis factor) et l’interleukine-β, deux cytokines pro-inflammatoires
produites entre autres par les macrophages, les monocytes et l’endothélium. L’épithélium est
capable de produire ces mêmes cytokines mais également des éicosanoïdes et des espèces
réactives de l’oxygène qui interviennent dans le déroulement de la réponse immune et
inflammatoire (Adler et al. 1994). Les cellules épithéliales seraient aussi capables de sécréter
le GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) et le G-CSF (Granulocyte
Colony-Stimulating Factor) lorsqu’elles sont mises en présence de P. aeruginosa ou de
Staphylococcus aureus. Ces deux médiateurs auraient la propriété d’augmenter la survie des
polynucléaires neutrophiles en inhibant leur apoptose (Saba et al. 2002).
L’épithélium des voies aériennes possède donc une multitude de moyens de défense
pour protéger le poumon et l’organisme contre les particules inhalées. Dans les conditions
normales, la stérilité et l’intégrité de la barrière épithéliale sont assurées par l’élimination
mécanique de ces agents par l’escalator mucociliaire couplée à la déglutition, voire à la toux ;
par le bouclier chimique constitué pas les molécules antimicrobiennes dans l’ASL, et par les
interactions entres les cellules épithéliales, inflammatoires et immunitaires.
34
2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS IONIQUES DANS LES IQUES DANS LES IQUES DANS LES IQUES DANS LES VOIESVOIESVOIESVOIES
AÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNES HUMAINESHUMAINESHUMAINESHUMAINES
35
2.1 Au niveau bronchique
Les premières données sur la différence de potentiel (ddp), la résistance
transépithéliale (Rt), et le courant généré par le mouvement des ions à travers l’épithélium
polarisé (Isc) des voies aériennes humaines ont été obtenues dans les voies aériennes
proximales plus faciles à étudier. Ces différentes études ont reporté que la ddp au niveau de
l'épithélium nasal était environ de -30mV (Knowles et al. 1981). Si les valeurs de ddp
observées au niveau de l'épithélium trachéal sont proches de celles obtenues dans le nez, la
valeur de la ddp diminue avec le diamètre des voies aériennes (Knowles et al. 1982; Boucher
et al. 1994a).
D'autres études ont été réalisées en utilisant les chambres dites de Ussing (cf chapitre
6.2.3), qui permettent de mesurer la ddp, la Rt ainsi que l’Isc dans des tissus excisés ou des
cultures cellulaires polarisées. Ces études ont permis de mettre en évidence dans l'épithélium
des voies aériennes humaines proximales que le transport ionique majoritaire, dans les
conditions expérimentales, est l'absorption active de Na+. L'addition d'amiloride, un inhibiteur
des canaux Na+ épithéliaux, entraîne une diminution d'environ 40 à 60% du courant enregistré
chez des sujets normaux. Ces mouvements de Na+ entraînent une absorption passive de Cl- et
d'eau (Boucher et al. 1994b) (figure 11).
Les mécanismes moléculaires de ces mouvements d’ions impliquent des pompes,
canaux et co-transporteurs situés dans les membranes apicale et basolatérale des cellules
épithéliales et fonctionnent de manière coordonnée (figure 11).
36
Figure 11 : Régulation du volume du liquide périciliaire par des transports ioniques actifs. a) Description des voies de transport du Na+, du Cl- et de l’eau ainsi que des éléments impliqués dans ce transport. Les canaux Na+ épithéliaux (ENaC), les canaux Cl- cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) et les canaux Cl- activés par le Ca2+ (CaCC) sont représentés à la face apicale. CFTR est décrit comme un canal Cl- et comme régulateur d’ENaC et de CaCC. La pompe Na+/K+/ATPase, les canaux K+ et le co-transporteur Na+/K+/Cl2 sont représentés à la face basolatérale. b) Mécanismes de régulation d’un volume excessif du liquide périciliaire (PCL) par l’absorption de Na+ et de maintien d’un volume à une hauteur d’environ 7µm correspondant à la hauteur des cils en extension. c) L’épithélium des voies aériennes humaines peut passer d’un état absorbant à un état sécrétant. Quand un excès du liquide de surface des voies aériennes (ASL) est détecté, l’absorption active de Na+ via ENaC est dominante et les ions Cl- sont absorbés par la voie paracellulaire car il ne semble pas exister de force électromotrice (DFaCl- = 0mV) significative favorable à la sortie des ions Cl- de la cellule. Au contraire, le potentiel négatif de la membrane apicale (Va = -30mV)) et la faible concentration en Na+ intracellulaire (~20mM) favorisent l’entrée du Na+ dans la cellule. Quand le volume de l’ASL est trop faible, ENaC est inhibé rendant le potentiel de la membrane apicale plus négatif (Va = -35mV) et induit une force électromotrice (DFaCl- = -5mV) favorable à la sécrétion des ions Cl-. Il est supposé que les éléments détectant le volume de l’ASL sont contenus dans l’ASL (d’après Boucher 2004).
37
Certains de ces mouvements nécessitent de l'énergie (essentiellement l'ATP) ; on parle alors
de transports ioniques "actifs". Ces transports créent des gradients chimiques, et quand les
éléments transportés sont chargés électriquement comme les ions, ils génèrent des gradients
électriques de part et d’autre de l’épithélium. La résultante des gradients de concentration
ionique et des gradients électriques de part et d'autre d'une couche épithéliale ou d'une
membrane cellulaire est désignée sous le terme "gradient électrochimique". D’autres
transports, dits "passifs", ne consomment pas directement d'énergie mais suivent les gradients
électrochimiques. Le canal Na+ le plus connu est le canal Na+ épithélial amiloride-sensible
ENaC (epithelial Na+ channel). Ce canal qui a été cloné en 1994 (Canessa et al. 1994), est
composé de 3 sous-unités et est présent tout le long des voies aériennes humaines (Pitkänen et
al. 2001; Gaillard et al. 2000). Il est présent à la face apicale des cellules épithéliales et est
responsable de plus de 50 % de la conductance Na+ au niveau des voies aériennes proximales
humaines normales (Knowles et al. 1984). La localisation d’ENaC à la face apicale des
cellules constitue une voie d'entrée pour le Na+ dans la cellule. Au niveau de la membrane
basale, la présence de la pompe Na+/K+/ATPase constitue la voie de sortie du Na+ (Boucher et
al. 1991; Boucher et al. 1994a et b). Cette pompe extrait activement le Na+ avec pour
conséquence la diminution de la concentration intracellulaire de Na+ par rapport au milieu
extracellulaire, créant ainsi un gradient électrochimique favorable à l'entrée de Na+ à travers la
membrane apicale grâce aux canaux ENaC. Le couplage de la pompe Na+/K+/ATPase et des
canaux ENaC constituent la principale voie de transport du Na+ à travers l'épithélium, cette
voie est responsable de l’absorption active de Na+. Ces mouvements d'ions Na+ entraînent une
absorption passive du contre-ion du Na+, l'ion Cl-, afin de préserver l'électroneutralité des
solutions. On considère que l'absorption des ions Cl- se ferait principalement par voie
paracellulaire puisque les études avec des microélectrodes intracellulaires n’ont pas montré de
gradient électrochimique significatif pour le Cl- à travers la membrane apicale (Boucher et al.
38
1994b; Willumsen et al. 1989). Cette absorption de NaCl entraîne une absorption d'eau pour
maintenir l’osmolarité (figure 11). Les mouvements d’eau se font par la voie paracellulaire et
probablement par la voie cellulaire.
A l'état de base, il n'a pas été détecté de sécrétion de Cl- dans l'épithélium des voies
aériennes humaines dans les chambres de Ussing. Cependant, dans certaines conditions,
l'épithélium peut générer une sécrétion nette de Cl-. Cette voie de sécrétion fait intervenir le
co-transporteur électroneutre Na+/K+/2Cl- situé dans la membrane basale des cellules. Ce co-
transporteur utilise le gradient de Na+ de part et d’autre de la membrane basolatérale comme
force motrice et il fait entrer le Cl- dans la cellule du côté basolatéral. Du coté apical, la sortie
des ions Cl- fait intervenir des canaux ioniques (figure 11). Parmi ces canaux se trouvent le
canal CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) et le canal ORCC
(outwardly rectifying chloride channel). D'autres canaux Cl- ont également été mis en
évidence tels que les canaux Cl- activés par le Ca2+, les CaCC (calcium activated chloride
channel) ou les ClC (chloride channel) (figures 12 et 13). Parmi les CaCC, terme générique
regroupant l’ensemble des canaux Cl- activés par le Ca2+, les isoformes hCLCA1, 2, 3 et 4 ont
été identifiées dans les voies aériennes humaines (Eggermont 2004 ; Loewen et Forsyth
2005). hCLCA1 semble être surexprimé chez des personnes asthmatiques, et cette
surexpression pourrait être responsable en partie de la surproduction de mucus (Hauber et al.
2003; Loewen et Forsyth 2005). Les isoformes hCLCA2, hCLCA3 et hCLCA4 ont également
été observées dans les voies aériennes humaines (Loewen et Forsyth 2005). Leur structure
moléculaire est encore discutée. Des études ont démontré une activité de canal ionique pour
hCLCA1 et hCLCA2 (Gruber et al. 1998; Gruber et al. 1999) ce qui n’a pas (encore) été
démontré pour hCLCA3 et hCLCA4.
39
Figure 12 : Proposition de topologie membranaire des hCLCA. A) Topologie membranaire de hCLCA1 avec 4 domaines transmembranaires et un petit segment C-terminal clivé puis sécrété. B) Topologie alternative avec un seul domaine transmembranaire mais présentant un domaine de fixation von Willebrand A (VWA) (d’après Loewen et Forsyth 2005).
Figure 13 : Topologie membranaire des canaux chlorures ClC. La topologie transmembranaire des hélices 4 à 7 reste encore débattue. Deux modèles, basés sur des résultats discordants sont proposés. Les hélices transmembranaires 9 à 12 forment une importante région hydrophobe (d’après Mindell et al., 2001).
40
Les hCLCA étant présent dans les voies aériennes CF, leur activation pourraient constituer
une alternative à la sécrétion de Cl- AMPc-dépendante défectueuse dans ces tissus (Loewen et
Forsyth 2005).
Des canaux chlores appelés ClC, et ressemblant à des canaux voltage-dépendants ont
été initialement découverts chez la torpille (Waldegger et al. 2000). Des études de
cristallographie aux rayons X chez des procaryotes ont montrés que les canaux ClC forment
des dimères (Dutzler et al. 2002) dont chacune des sous-unités possède son propre pore et est
constituée de 18 hélices-α (Dutzler et al. 2004; Jentsch et al. 2005). Estevez et al. ont
démontré que la structure des CLC bactériens pouvait être extrapolée aux ClC des
mammifères (Estevez et al. 2003). A ce jour, 9 gènes codant pour les ClC ont été découverts
chez l'homme (Babini et Pusch 2004). Mummery et al. ont démontré par RT-PCR dans une
lignée cellulaire humaine glandulaire pulmonaire (Calu-3) la présence de l’ARNm des ClC-2,
ClC3,ClC-4, ClC-5, ClC-6, ClC-7, ClC-8, ClC-Ka et ClC-Kb (Mummery et al. 2005). La
présence des isoformes ClC-2 et ClC-3 a également été démontrée dans l’épithélium du
poumon fœtal humain dans lequel ils participeraient à la sécrétion apicale de Cl- et la
production du liquide pulmonaire (Lamb et al. 2001). Les ARNm de ClC2, ClC3 et ClC6
ainsi que les protéines correspondantes ont également été observés dans le poumon adulte
humain (Lipecka et al. 2002). Lipecka et al. ont démontré que ClC2 était exprimé à la face
apicale des cellules ciliées bronchiques humaines, semblant même se superposer avec CFTR
(Lipecka et al. 2002). Malgré leur appartenance à la famille des canaux dépendants du
voltage, les canaux ClC-2 et ClC-3 pourraient être régulés par la baisse du pH extracellulaire
et par l’augmentation du volume cellulaire (Waldegger et al. 2000 ; Jentsch et al. 2002).
L’étude des différents canaux Cl- présents dans la membrane apicale des cellules épithéliales
41
pourrait permettre d’activer d’autres voies de passage du Cl- chez les patients
mucoviscidosiques dont le canal Cl- CFTR est défectueux.
Le potassium (K+) intervient dans l’établissement de la ddp au travers de la membrane
basolatérale (et apicale indirectement) des cellules épithéliales. La présence dans la membrane
de la pompe Na+/K+/ATPase concentre les ions K+ à l’intérieur de la cellule. Ces ions peuvent
ressortir passivement de la cellule via des canaux K+ localisés à la membrane basolatérale de
la cellule. Clarke et al. ont montré, par des mesures de flux radio-isotopiques et des électrodes
intracellulaires que certaines préparations de cellules épithéliales nasales en réponse à l'ATP
pouvaient sécréter du K+. Les auteurs ont alors suggéré l'existence d'un canal K+ activé par
l'ATP et situé à la face apicale des cellules (Clarke et al. 1997).
Al-Bazzaz et al. ont démontré dans les voies aériennes proximales humaines
l'existence d'autres types de protéines intervenant dans les transports d'ions : les échangeurs
Na+/H+ et Cl-/HCO3- (Al-Bazzaz et al. 2001). Dans les cellules épithéliales nasales, il a été
montré l'existence de canaux cationiques non sélectifs (Jorissen et al. 1990). Chinet et al. ont
montré, par la technique du patch-clamp, qu'une partie de ces canaux au moins étaient
sélectifs pour le Na+, sensibles à l’amiloride mais pouvaient être dénaturés par l'excision du
patch (Chinet et al. 1993).
2.1.1 Régulation de l’absorption active de Na+
L'absorption active de Na+ constitue le transport ionique majoritaire dans l'épithélium
des voies aériennes humaines et une fine régulation de ce transport, comme celle du transport
42
de Cl-, est requise pour ajuster le volume de l'ASL. L'absorption de Na+ via ENaC est stimulée
par certains facteurs de l'inflammation. L'épithélium nasal humain possède des récepteurs à la
bradykinine (BK) couplés à la phospholipase C (PLC) qui lorsqu'ils sont activés augmentent
le transport de Na+ (Boucher et al. 1994b). L’exposition de la membrane basolatérale de
cultures de cellules épithéliales nasales humaines à l'ATP stimule l’absorption de Na+ (Mason
et al. 1991). Le mécanisme d'action de la BK et de l'ATP passerait par l'activation de canaux
K+ basolatéraux dont l’augmentation d'activité hyperpolariserait la cellule (figure 14). La
sortie des ions K+ créerait ainsi un gradient électrochimique favorable à l'entrée d'ions Na+ par
le pôle apical des cellules. L'augmentation de Na+ qui en résulte activerait la pompe
Na+/K+/ATPase permettant ainsi la sortie du Na+ de la cellule et aboutissant donc à une
augmentation de l’absorption transépithéliale de Na+ (Boucher et al. 1994b ; Clarke et al.
1992). ENaC pourrait également être régulé par des protéases extracellulaires (Donaldson et
al. 2002 ; Rossier et al. 2004). Des sérines-protéases appelées CAP (« Channel Activating
Protease ») sont capables d'activer ENaC par un mécanisme qui reste actuellement mal connu.
Dans des cellules épithéliales bronchiques humaines, il a été montré qu'un inhibiteur des
sérines-protéases diminuait le courant de base d'environ 30% (Rossier et al. 2004). Une autre
étude a démontré que sur des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, l'effet de cet
inhibiteur pouvait être annulé par l'addition de trypsine (Donaldson et al. 2002).
Il existe également des facteurs pouvant inhiber l’activité d’ENaC. Parmi ces
inhibiteurs, se trouvent les agonistes purinergiques (ATP, UTP), qui, s'ils peuvent activer
ENaC lors d'une application basolatérale, seraient susceptibles de l’inhiber lors d'une
application apicale (Boucher et al. 1994b ; Devor et al. 1999 ; Mall et al. 2000).
43
Figure 14 : Régulation des transports de Na+ par l’activation de récepteurs couplés à la PLC. Comparé à l’état de base (A), l’activation de récepteurs basolatéraux par un agoniste (B) entraîne une activation des canaux K+ basolatéraux qui hyperpolarisent l’intérieur de la cellule (le potentiel de la membrane, Va, devient plus négatif) ce qui augmente l’absorption transépithéliale de Na+ (d’après Boucher 1994b).
44
Les récepteurs purinergiques P2Y2, couplés à une protéine Gq, stimuleraient l'hydrolyse du
PIP2 (phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate), via l'activation de la PLC, en DAG
(diacylglycerol) et IP3 (inositol 1, 4, 5-triphosphate). La diminution de la concentration en
PIP2 serait responsable de l'inhibtion d'ENaC plus qu'une action directe de l'IP3/Ca2+ (Yue et
al. 2002 ; Kunzelmann et al. 2005). Kunzelman et al. ont émis l’hypothèse que la régulation
d’ENaC par le PIP2 ferait intervenir un site de fixation du PIP2 sur l’extrémité NH2-terminale
de la sous-unité ß d’ENaC (Kunzelmann et al. 2005).
L'endothéline semble également pouvoir réguler les transports de Na+. Si une étude
réalisée sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques humaines a montré que
l'endothéline n'avait pas d'effet significatif sur l'absorption de Na+ (Blouquit et al. 2003). Une
autre étude, réalisée dans la lignée cellulaire 3T3 d’origine fibroblastique de souris, a montré
que l'endothéline inhibait les transports de Na+ sensible à l’amiloride; cette étude indique
également que cette action passerait par les récepteurs à l'endothéline ETB (Huang et al.
2004). Ces résultats discordants pourraient être dus à l’utilisation d’une lignée cellulaire dans
une étude et de cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques dans l’autre, les lignées
cellulaires et les cultures primaires peuvent en effet présenter des différences de régulation.
ENaC peut également être régulé par des substances affectant son expression plutôt
que son activité. Une étude a démontré que des hormones circulantes, comme la
déxaméthasone, pouvaient augmenter le nombre de canaux ENaC à la surface des cellules
d'une lignée cellulaire pulmonaire humaine (H441) (Sayegh et al. 1999). Récemment, une
étude, par QRT-PCR (réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel), a
démontré que chez des prématurés (26 à 28 semaines de gestation) qui présentent
fréquemment une détresse respiratoire, la quantité d’ARNm d’ENaC était inférieure par
45
rapport aux enfants nés à terme (Helve et al. 2004). Les résultats de cette étude montrent
également que l’expression d’ENaC peut être augmentée par un traitement à la
déxaméthasone. La nicotine pourrait diminuer le nombre de canaux ENaC, par induction de
leur endocytose, et diminuer ainsi l'absorption de Na+ (Klimek et al. 2000). Une étude a
d'ailleurs démontré que les fumeurs présentaient une ddp nasale inférieure par rapport à des
non fumeurs (Knowles et al. 1982). L'état inflammatoire des voies aériennes module
également les transports de Na+. Galietta et al. ont observé sur des cultures épithéliales
bronchiques que l'exposition à l'interféron-γ diminuait l'absorption de Na+ et que ce processus
passait vraisemblablement par une inhibition de l'expression du canal ENaC (Galietta et al.
2000).
La protéine CFTR semble aussi jouer un rôle régulateur sur ENaC (Grubb et al. 1994,
Chinet et al. 1994). Dans les voies aériennes normales, l'augmentation intracellulaire d'AMPc
n'a pas d'effet sur l'absorption de Na+, alors que dans les voies aériennes CF, cette
augmentation induit une activation d'ENaC (Boucher et al. 1986). Dans des expériences de
co-expression de CFTR et d'ENaC, il a été montré que CFTR inhibait le canal ENaC (Stutts et
al. 1995; Jiang et al. 2000). Ismailov et al. ont observé qu'en présence de CFTR, le courant
porté par ENaC était plus faible que lorsque qu'ENaC était exprimé seul (Ismailov et al.
1997). Cependant, si ces différentes études indiquent fortement que CFTR inhibe ENaC, le/les
mécanisme(s) de cette régulation ne sont pas totalement élucidés. Des études ont toutefois
montré qu’une interaction physique existait (Ji et al. 2000; Kunzelmann et al. 1997). Le flux
et l’accumulation d’ions Cl- dans le cytoplasme semblent également essentiels pour une
inhibition d’ENaC (Briel et al. 1998; König et al. 2001). Une étude a montré que dans des
ovocytes de xénope co-exprimant CFTR et ENaC, l’effet inhibiteur de CFTR sur ENaC est
supprimé dans un milieu extracellulaire pauvre en Cl-, suggérant que l’influx de Cl- et
46
éventuellement son accumulation dans le cytosol sont nécessaires pour l’inhibition d’ENaC
(Briel et al. 1998, Kunzelmann 2003). Dans la mucoviscidose, les mutations du gène CF qui
conduisent à l’absence de protéine CFTR fonctionnelle lèvent l’inhibition tonique qu’exerce
CFTR sur ENaC et pourraient soit indirectement inhiber une voie de signalisation inhibitrice
d’ENaC ou bien au contraire permettre l’expression d’une voie de signalisation qui est
normalement réprimée dans les cellules des voies aériennes (Huang et al. 2004).
L’activité du canal ENaC apparaît donc finement contrôlée. Les dysfonctionnements
dans les voies de régulation peuvent conduire, comme dans la mucoviscidose, à une mauvaise
régulation du volume de l’ASL perturbant ainsi la fonction protectrice des voies aériennes.
2.1.2 Régulation de la sécrétion de Cl-
A l’état de base, dans les voies aériennes, il n’y a pas ou peu de transport net
transcellulaire de Cl- dans les voies aériennes humaines proximales. Ceci est dû au fait que
l’ion Cl- est à son équilibre électrochimique, c'est-à-dire que les forces provenant du gradient
de concentration de Cl- et de la ddp de part et d’autre de la membrane apicale se compensent
(Boucher et al. 1994a). Expérimentalement, une sécrétion de Cl- peut être initiée en bloquant
les canaux ENaC (par de l’amiloride). L’inhibition de l’absorption de Na+ entraîne une
hyperpolarisation de la membrane apicale modifiant ainsi les gradients chimiques qui
deviennent favorables à une sécrétion de Cl- (Boucher et al. 1994a). Avec une force
électrochimique motrice favorable, la sécrétion des ions Cl- est proportionnelle à l’état
d’activation de la conductance Cl- de la membrane apicale (Boucher et al. 1994a).
47
La régulation des transports de Cl- passe également par l’action de CFTR sur d’autres
canaux Cl- comme le canal ORCC (Egan et al. 1992 ; Gabriel et al. 1993 ; Schwiebert et al.
1995 ; Schwiebert et al. 1998). Des études de patch-clamp montrent que CFTR module la
sensibilité de ORCC à l’AMPc (Jovov et al. 1995 ; Hryciw et al. 2000). Des expériences
d’expression de CFTR dans une lignée humaine rénale (HEK293T) suggèrent que CFTR
pourrait également inhiber des canaux Cl- dépendant du volume cellulaire (Ando-Akatsuka et
al. 2002).
L’état inflammatoire du poumon peut, comme pour ENaC, modifier les transports de
Cl-. Une étude a en effet démontré que l'interféron-γ entraînait une diminution de l’expression
et de l’activité de CFTR dans des cultures de cellules épithéliales bronchiques humaines
(Galietta et al. 2000). En revanche, des cellules épithéliales bronchiques humaines exposées à
l’'interféron-γ développent, via les CaCC, une réponse significativement supérieure à une
application apicale d’UTP. Cet effet passerait probablement par l’activation des récepteurs
purinergiques (P2Y2) qui entraînerait une augmentation de la concentration du Ca2+
intracellulaire, en favorisant la mobilisation des stocks de Ca2+ intracellulaire ou en stimulant
l’expression des gènes codant pour les CaCC (Galietta et al. 2004). Une hypothèse alternative
serait l’activation, par l’interféron-γ, des canaux K+ basolatéraux, nécessaires dans
l’établissement de la force électrochimique motrice permettant la sécrétion de Cl-. Galietta et
al. ont également démontré que l’interleukine 4 (IL-4), qui joue un rôle important dans les
pathologies pulmonaires, inhibait d’une part l’absorption de Na+ en diminuant fortement le
niveau de l’ARNm de la sous-unité γ et dans une moindre mesure la sous-unité ß d’ENaC, et
stimulait d’autre part le courant Cl- porté par CFTR, probablement en augmentant le niveau
d’ARNm de CFTR (Galietta et al. 2002). L’IL-4 stimulerait également les CaCC par un
processus similaire à celui impliquant l'interféron-γ (Galietta et al. 2002). Enfin les effets de
48
l’IL-4 ont été reproduits par une autre cytokine : l’IL-13 (Galietta et al. 2002, Danahay et al.
2002). Ces agents qui agissent à la fois sur les mouvements de Na+ et de Cl- pourraient
permettre de diminuer l’absorption de fluide voire d’induire une sécrétion de fluide et donc de
faciliter la clairance mucociliaire. Une étude a montré que le TGF-β1 pouvait également
modifier l’activité d’ENaC et de CFTR dans des cellules provenant de polypes nasaux
(Prulière-Escabasse et al. 2005). Dans cette étude, les auteurs ont montré que le TGF-β1
induisait une diminution de l’expression et de la fonction de CFTR. Une étude récente a
démontré que la fumée de cigarette diminuait l’expression et l’activité de CFTR dans des
lignées cellulaires pulmonaires (Cantin et al. 2006). L'endothéline-1 intervient également sur
les transports de Cl-, une étude sur cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques
humaines montre en effet que l'endothéline-1 stimule la sécrétion de Cl-, cet effet impliquant
probablement les récepteurs à l'endothéline de type ETB et la voie de l'AMPc (Blouquit et al.
2003).
La relation entre CFTR et ENaC ne s’arrête pas au simple rôle répresseur de CFTR.
Des travaux ont montré que si la co-onjection de CFTR et d’ENaC dans l’ovocyte de Xénope
diminue la conductance Na+ portée par ENaC, elle augmente au contraire la conductance Cl-
portée par le canal CFTR (Ji et al. 2000). De même que pour la répression de la conductance
Na+ par CFTR, la suractivation de la conductance Cl- par ENaC requiert la présence de la
sous-unité β ou γ (Jiang et al. 2000). L’analyse de ce phénomène en canal unitaire a montré
une augmentation de la probabilité d’ouverture de CFTR, ainsi qu’un nombre de canaux
accessibles accrus (Jiang et al. 2000). Ces résultats ont été confirmés en microscopie
confocale, où le marquage membranaire de CFTR est augmenté de 50% lors de la co-inection
d’ENaC (Jiang et al. 2000).
49
Comme les transports de Na+, les transports de Cl- sont sous le contrôle de multiples
voies de modulation permettant une régulation fine du volume de l’ASL et assurant ainsi le
bon fonctionnement des mécanismes de défense du poumon.
2.2 Au niveau bronchiolaire
Bien que les voies aériennes distales constituent une surface cumulée bien plus
importante que l'épithélium proximal, les études portant sur les transports transépithéliaux
d'ions et d'eau ont été principalement réalisées sur des cellules provenant des voies aériennes
proximales plus faciles d’accès. En effet, la petite taille des bronchioles et la complexité des
structures distales du poumon rendent difficile l’étude de cet étage des voies aériennes. Les
transports d'eau et d'ions transépithéliaux dans les cellules épithéliales bronchiolaires ont en
conséquence fait l'objet de peu d'études.
Des études ont été menées sur les voies aériennes distales chez le mouton (Al-Bazzaz
et al. 1991, 1994, 2001) et chez le porc (Ballard et al. 1992 et 1994 ; Inglis et al. 1996) ; ces
études ont montré qu'à l'état basal les bronchioles de mouton d'un diamètre de 0,6 à 1mm
absorbaient du Na+ (représentant 50 à 65% de l’Isc total) tandis que les plus petites
bronchioles (227µm) sont capables à l'état basal d'une sécrétion de Cl-. En effet, l’utilisation
d’inhibiteurs des canaux Cl- apicaux (DPC : acide carboxylique 2-diphénylamine) ou du co-
transporteur Na+/K+/2Cl- situé dans la membrane basolatérale (bumétanide) induit une baisse
de la ddp d’environ 45%, indiquant que les bronchioles de mouton sont capables d’une
sécrétion de Cl- à l’état basal. Des études réalisées à partir de cultures de cellules
50
bronchiolaire de lapin (cellules de Clara) ont montré une absorption prédominante de Na+ en
conditions basales mais également qu'une sécrétion de Cl- pouvait être induite (Van Scott et
al. 1987; Chinet et al. 1997). Au total, l’ensemble des données obtenues dans les voies
aériennes distales animales met en évidence des similitudes entre les transports ioniques dans
les voies aériennes proximales et distales.
A ce jour, la seule étude portant les transports d'ions et de fluide transépithéliaux sur
des cultures primaires de cellules bronchiolaires humaines non CF a été effectuée par
Blouquit et al. (Blouquit et al. 2002). A partir de fragments de poumon provenant de
lobectomie, les auteurs ont disséqué les bronchioles puis après digestion enzymatique, les
cellules ont été ensemencées sur une membrane de collagène, elle-même reposant sur un
support pouvant être monté dans des chambres dites de Ussing (cf chapitres 6.2.2 et 6.2.3).
Les cultures obtenues sont majoritairement constituées de cellules ciliées et lorsqu'elles sont à
confluence, elles développent une ddp d'environ 1 à 2mV inférieure à celle observée dans des
cultures bronchiques humaines ainsi qu'une faible résistance transépithéliale indiquant un
épithélium très lâche (Blouquit et al. 2002).
L'étude en chambre de Ussing montre qu'à l'état de base, l'addition d'amiloride
entraîne une diminution du courant de court-circuit d'environ 40 % en rapport avec une
absorption active de Na+ (Blouquit et al. 2002). Les additions de forskoline et d'ATP
induisent une sécrétion de Cl-. Ces résultats suggèrent la présence d'ENaC, de CFTR ainsi que
de canaux Cl- activés par l'ATP. Blouquit et al. se sont également intéressés au transport de
fluide à travers l’épithélium bronchiolaire. Les auteurs ont déposé à la face apicale de
bronchioles coupées longitudinalement, 50µl de liquide (DMEM/Ham-F12) qu’ils ont
récupéré après 2h d’incubation (37°C, 5% CO2). Les auteurs ont répété cette opération deux
51
fois avec tout d’abord 50µl de liquide contenant de l’amiloride (10-5M) puis avec 50µl de
liquide contenant de la forskoline (10-5M) et de l’ATP (10-4M). A l’état de base (liquide sans
drogue), les auteurs ont observé une diminution significative (-23,4 ± 10,4 µl/h/cm2) du
volume de liquide déposé à la face apicale. En présence d’amiloride dans le liquide, la
diminution du liquide (-8,8 ± 6,2µl/h/cm2) était significativement inférieure par rapport à
l’état de base. En présence d’amiloride, l’addition de forskoline et d’ATP à la face apicale
entraîne une augmentation significative du volume du liquide (+46,3 ± 8,3µL/h/cm2) par
rapport à l’état de base (Blouquit et al. 2002). Cette étude indique que les transports d'ions
sont accompagnés par des mouvements de fluide transépithéliaux.
Les voies aériennes distales humaines, comme les voies aériennes proximales sont
capables des transports ioniques transépithéliaux intervenant dans la régulation du liquide de
surface des voies aériennes et compte tenu de l’atteinte précoce de cet étage des voies
aériennes dans des pathologies comme la mucoviscidose, l’étude de ces transports et de leurs
régulations demeure nécessaire pour une meilleure compréhension de la pathogenèse de la
mucoviscidose.
52
2.3 Différences et similitudes entre les transports
d’ions et d’eau dans les voies aériennes humaines
proximales et distales
Les voies aériennes distales humaines, comme les voies aériennes proximales, sont
caractérisées par une absorption d’ions et de fluide à l’état basal et peuvent également initier
une sécrétion d’ions et de fluide. Cependant, une étude récente a montré des différences
quantitatives au niveau des transports ioniques entre ces étages des voies aériennes humaines
(Blouquit et al. 2006). Dans cette étude, les auteurs ont étudié en chambres dites de Ussing,
des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires provenant des
mêmes patients minimisant ainsi les variabilités inter-individuelles. Blouquit et al. ont
observé que la ddp et la Rt étaient significativement inférieures dans les cultures
bronchiolaires par rapport aux cultures bronchiques. En revanche, ils n’ont pas observé de
différence de l’Isc de base, ni de l’Isc sensible à l’amiloride et ni de l’Isc sensible à l’ATP
entre les cultures bronchiolaires et bronchiques. A l’inverse, l’augmentation de l’Isc sensible à
la forskoline était significativement supérieure dans les cultures bronchiolaires comparée aux
cultures bronchiques, suggérant que la sécrétion de Cl- dépendante de l’AMPc était supérieure
dans les bronchioles. Des expériences de microscopie confocale ont révélé que la forskoline
entraînait une augmentation de la hauteur de l’ASL, reflétant la sécrétion de fluide, dans les
cultures bronchiques et bronchiolaires. Cette augmentation était significativement supérieure
dans les cultures bronchiolaires (Blouquit et al. 2006).
53
Les sécrétions de Cl- et de fluide plus importantes dans les voies aériennes distales
pourraient compenser, selon certains auteurs, la perte des sécrétions de fluide dues aux
glandes sous–muqueuses absentes dans les voies aériennes distales (Ballard et Inglis 2004).
L’absence de réponse à la forskoline dans les voies aériennes CF pourrait donc avoir des
conséquences plus sévères en terme de sécrétion de fluides dans les bronchioles par rapport
aux bronches.
2.4 Au niveau alvéolaire
Goodman et al. ont mis en évidence, dans le poumon isolé de rat, un transport
actif de Na+ transépithélial alvéolaire en 1987 (Goodman et al. 1987). Une autre étude a
démontré, dans des cultures primaires de pneumocytes de type II (PII) de rat adulte, que les
PII en culture formaient un épithélium polarisé capable de transports actifs d’électrolytes
(Mason et al. 1982). Les progrès techniques ont permis d’obtenir des cultures primaires de PII
humains (Matthay et al. 2003). Ces cellules représentent avec les pneumocytes de type I (PI)
les principales cellules de l'épithélium alvéolaire (Borok et al. 2002 ; Matalon et al. 1999 ;
O'Grady et al. 2003). Les cellules PI plus fines que les cellules PII cuboïdales, recouvrent
environ 95 % de la surface de l'épithélium alvéolaire (figure 15) (Weibel et al. 1989 ; Matthay
et al. 2003). La plupart des études ont été réalisées sur les cellules PII en partie parce qu'elles
sont plus faciles à isoler, mais cependant quelques travaux se sont intéressés aux cellules PI.
54
Figure 15 : Représentation schématique de l’épithélium pulmonaire distal capable de transports d’ions et d’eau (d’après Matthay et al. 2005).
55
Ceux-ci ont mis en évidence la présence d'aquaporines (aquaporine 5), impliquées dans les
transports d'eau (Dobbs et al. 1998), la présence de sous unités de la pompe Na+/K+/ATPase
(Ridge et Sznajder 1997) ainsi que la présence des sous-unités d'ENaC (Johnson et al. 2002,
Borok et al. 2002). Ces résultats suggèrent que les cellules PI peuvent intervenir dans les
transports de NaCl dans le poumon mais ne permettent cependant pas de l'affirmer.
La mise en culture de cellules PII de rat adulte a permis leur étude en chambre dites de
Ussing. Ces études ont montré que les cultures développaient une ddp (-0,2 à -1,0 mV) et que
le courant de court-circuit de base correspondait quasiment entièrement à une absorption
active de Na+ (Cheek et al. 1989, Cott et al. 1986). Cependant, d'autres voies de transports
pourraient également intervenir. En effet, d’autres travaux ont mis en évidence la présence de
co-transporteurs Na+/H+, Na+/phosphate, ainsi que d'autres canaux cationiques non sélectifs
qui pourraient être impliqués dans les transports de Na+ (Brown et al. 1985 ; Clerici et al.
1991 ; Nord et al. 1987).
La présence de CFTR a également été observée dans les PII (Engelhardt et al. 1992;
McCray et al. 1992). Cependant, dans une étude récente, Kreda et al. n'ont pas observé la
présence de protéine CFTR au niveau alvéolaire (Kreda et al. 2005). A l’inverse, Fang et al.
ont montré, par RT-PCR que le niveau d'expression des transcrits de CFTR était similaire à
ceux reportés dans les cellules épithéliales des voies aériennes et des études fonctionnelles ont
apporté la preuve de la présence de canaux Cl- CFTR au niveau alvéolaire (Fang et al.
2006).(cf chapitre 5). Des études récentes ont suggéré que CFTR pourrait jouer un rôle
important dans la régulation AMPc-dépendante de fluide (Fang et al. 2002; Matthay et al.
2005; Fang et al. 2006). Mais le rôle de CFTR dans les transports de Cl- et de fluide reste
56
cependant à élucider, notamment en égard à l'absence de pathologie alvéolaire dans la
mucoviscidose.
Des études sur les cellules alvéolaires fœtales et adultes ont montré la présence de
multiples familles de canaux K+, cependant leur identité et leur fonction restent peu connues
(Matthay et al. 2003). Des canaux K+ voltage-dépendant ont été identifiés dans la lignée
pulmonaire humaine A549 (Koong et al. 1993). Des canaux K+ dépendants de l’ATP ainsi
que des canaux activés par le Ca2+ ont été observés au niveau alvéolaire. Leurs rôles restent
cependant à déterminer, les canaux K+ dépendants de l’ATP pourraient participer au recyclage
des ions K+ nécessaire pour maintenir l'activité de la Na+/K+/ATPase (Matthay et al. 2003).
2.5 Régulation du liquide de surface
La composition du liquide de surface a fait l'objet d'une controverse entre son iso- ou
hypotonicité. Cependant, aujourd'hui la théorie isotonique est admise. La difficulté de mesurer
in vivo les changements de volume de l'ASL et les transferts transépithéliaux d'eau a fait que
les études de la régulation de la composition de l’ASL ont surtout fait appel à des cultures
cellulaires dont les propriétés de transports ioniques sont similaires à celles des tissus natifs
(Welsh 1987). Afin de mesurer les variations de fluide, Smith et al. ont déposé du milieu de
culture recouvert d'une huile minérale limitant ainsi l'évaporation, à la face apicale de cultures
cellulaires et ont récupéré ce liquide après un temps de latence (2 à 24h). Ces expériences ont
mis en évidence une absorption de fluide à l'état basal dans des cultures de cellules
épithéliales provenant de polypes nasaux. Ils ont également montré que cette absorption peut
57
être inhibée par l'amiloride et qu'une sécrétion peut être initiée par addition de forskoline en
présence d'amiloride (Smith et al. 1993). D'autres études ont montré que l'addition apicale
d'ATP ou d'UTP sur l’épithélium des voies aériennes induit une sécrétion d'ASL à la surface
de l'épithélium des voies aériennes et pouvait participer à l'hydratation du mucus pour faciliter
son transport (Tarran 2004). La stimulation de la sécrétion de fluide par la voie de l'ATP
impliquerait deux voies différentes : 1/ l'ATP est dégradé en adénosine par des ecto-
nucléotidases et des ecto-apyrases, situées dans la membrane apicale des cellules épithéliales
(Lazarowski et al. 2000; Picher et al. 2000) ou présentes dans l'ASL (Picher et al. 2003).
L'adénosine stimule ses récepteurs (A2b-R) couplés à une protéine G activant l'adénylate
cyclase qui entraîne une augmentation locale de l'AMPc aboutissant à une stimulation de
CFTR (Tarran 2004). CFTR est positivement régulé par la voie adenosine/AMPc mais cette
voie régule négativement ENaC permettant ainsi la création d'une "driving force" favorable à
la sécrétion de Cl- et de fluide (figure 16). 2/ L'ATP, en se fixant sur les récepteurs
purinergiques (P2Y2) entraîne une cascade de réactions aboutissant à l'activation des canaux
chlores dépendants du Ca2+ et l'inactivation des canaux ENaC par une diminution de la
concentration en PIP2. Il s'ensuit une sécrétion de Cl- et de fluide qui reste cependant limité
dans le temps, probablement à cause d'une internalisation des récepteurs purinergiques
(Matsui et al. 1998 ; Clarke et al. 1999 ; Schwiebert et al. 2001 ; Tarran 2004).
La capacité de l’épithélium de surface à réguler l’ASL pour maintenir le PCL à une
hauteur d’environ 7µm (soit environ la hauteur des cils en extension) est un élément clé dans
la défense des voies aériennes afin de permettre un battement efficace des cils et l’élimination
des particules étrangères piégées dans le mucus. Les mécanismes qui permettent de maintenir
la hauteur du PCL à cette hauteur sont encore mal connus. Cependant, les cils eux-mêmes ne
semblent pas jouer un rôle prépondérant dans ce processus.
58
Figure 16 : Régulateurs potentiels des transports ioniques actifs. A) L’ATP intracellulaire est sécrété en réponse à divers stimuli. Les ecto-nucléotidases (et autres enzymes) (eNT) dégradent l’ATP en adénosine (ADO), qui active les récepteurs A2b (A2b-R) couplés à des protéines G (Gs) et à l’adénylate cyclase entraînant une augmentation intracellulaire locale de l’AMPc. L’AMPc active la protéine kinase A, qui par phosphorylation active CFTR et inactive ENaC. B) L’ATP stimule de façon autocrine, les récepteurs purinergiques (P2Y2-R) couplés à des protéines Gs et à la PLC. L’activation de la PLC entraîne une augmentation de l’IP3 et du Ca2+. L’augmentation intracellulaire en Ca2+.active les canaux chlorures et ENaC est indirectement inhibé par la diminution de la concentration en PIP2 (d’après Tarran 2004).
59
En effet, le volume du PCL dans des cultures de cellules provenant de patients atteint de
dyskinésie ciliaire primitive, maladie dans laquelle les cils sont immobiles, est normal ainsi
que dans les cultures de cellules normales qui n’ont pas encore réalisé la ciliogénèse (Tarran
et al. 2006a).
Tarran et al. ont simulé une augmentation du volume de l’ASL, par le dépôt d’un
excès de liquide, sur des cultures de cellules des voies aériennes proximales humaines non-
CF. Cette augmentation du volume de l’ASL stimule l’absorption active de Na+. Cette
absorption s’arrête lorsque le volume de l’ASL atteint un certain niveau qui correspond
probablement à la hauteur des cils en extension. Si le niveau de l’ASL diminue au-delà de
cette limite, une sécrétion de Cl- peut être initiée permettant de restaurer le volume de
l’ASL.Ces observations suggèrent que la régulation du volume de l’ASL est en partie sensible
à la concentration de médiateurs solubles contenus dans l’ASL, les variations de volume de
l’ASL faisant varier la concentration de ces médiateurs (Tarran et al. 2006a). Parmi ces
médiateurs solubles, les auteurs ont démontré que la régulation du volume de l’ASL était
sensible aux CAP (protéases activatrices de canaux) et à un inhibiteur des CAP (l’aprotinine).
Nous avons vu précédemment qu’ENaC pouvait être activé par les CAP. Selon Tarran et al.,
l’augmentation du volume de l’ASL diluerait les inhibiteurs solubles des CAP, mais ne
diluerait pas les CAP membranaires, suggérant qu’elles sont proches d’ENaC (Tarran et al.
2006a). Lors d’une augmentation de volume de l’ASL, la dilution des inhibiteurs des CAP
permettrait donc aux CAP d’activer ENaC, l’absoprtion d’ions et d’eau résultante pourrait
ainsi résorber l’excès de volume de l’ASL.
La concentration en adénosine jouerait également un rôle dans la régulation du volume
de l’ASL en induisant une sécrétion de Cl- via CFTR. Tarran et al. ont déposé à la face
60
apicale de cellules épithéliales bronchiques en culture 20µl d’une solution de tampon
phosphate salin (PBS) en présence ou non de bumétamide, qui inhibe l’entrée de Cl- à la face
basolatérale. Dans les conditions standards, les auteurs ont observé que les cultures absorbent
l’excès de liquide en 12h et que l’ASL est maintenu à une hauteur de ~7µm. En présence de
bumétamide, la vitesse d’absorption est significativement supérieure durant les six premières
heures de l’expérience et la hauteur de l’ASL est stabilisée à ~3µm (Tarran et al. 2006a).
Tarran et al. ont estimé que le dépôt de 20µL de PBS à la face apicale des cellules diluait la
concentration de l’adénosine dans l’ASL d’environ 20 fois pour atteindre la concentration
d’environ 5nM, les auteurs ayant estimé le volume de l’ASL dans leur préparation à 1µl.
Selon les auteurs, cette concentration serait insuffisante pour activer les récepteurs A2b dont
l’EC50 dans les voies aériennes serait d’environ 1µM (Tarran et al. 2006a). L’augmentation
du volume de l’ASL stimulerait alors l’absorption active de Na+ entraînant ainsi une
diminution du volume de l’ASL. Lorsque le volume de l’ASL diminue la concentration en
adénosine augmente et pourrait alors activer les récepteurs A2b. Cette activation entraînerait
une augmentation de l’AMPc intracellulaire pouvant activer CFTR et ainsi initier une
sécrétion de Cl- permettant de maintenir l’ASL à une hauteur normale.
Clancy et al. ont observé que, dans une lignée cellulaire (COS-7), l’augmentation de la
concentration en AMPc intracellulaire induite par l’adénosine était inférieure de 20% par
rapport à l’augmentation de la concentration en AMPc induite par la forskoline pour une
augmentation de la sécrétion de Cl- via CFTR identique (Clancy et al. 1999). Les récepteurs
de l’adénosine (A1, A2a, A2b et A3) sont tous associés à des protéines G couplées à
l’adénylate cyclase (AC). Cependant, les récepteurs A2a et A2b régulent positivement l’AC
tandis que les récepteurs A1 et A3 la régulent négativement, entraînant respectivement une
augmentation ou une diminution de l’AMPc intracellulaire (Klinger et al. 2002). Huang et al.
61
ont proposé à partir d’expérience de patch clamp sur une lignée cellulaire (Calu-3), que CFTR
et les récepteurs A2b étaient proches et « séquestrés » à la membrane apicale. La stimulation
des récepteurs A2b par l’adénosine entraînerait une augmentation apicale et très localisée de
l’AMPc suffisante pour activer CFTR mais qui n’entraînerait pas d’activation globale des
autres voies de signalisation cellulaires dépendantes de l’AMPc (Huang et al. 2001).
La concentration ATP jouerait également un rôle dans la régulation du volume de
l’ASL en induisant une sécrétion de Cl- via les CaCC. Les voies aériennes sont soumises à des
forces d’étirements (« shear stress ») provoqués par les flux d’air respiratoires et les
mouvements thoraciques. Des études ont démontré que le shear stress entraînait le relargage
de nucléotides dans de nombreux types cellulaires (Burnstok et al. 2002 ; Guyot et al. 2002).
Tarran et al. ont développé, en partant de ce principe de relargage des nucléotides, un système
de culture cellulaire « dynamique » permettant d’appliquer des forces similaires à celles
observées in vivo aux cellules épithéliales bronchiques en cultures (Tarran et al. 2006b). Par
cette technique, les auteurs ont démontré que dans les conditions de cultures expérimentales
dynamiques, la hauteur du liquide périciliaire est de 14µm contre 7µm en conditions de
culture classique ou « statique » dans les cultures de cellules épithéliales non-CF (figure 17).
Tarran et al. ont observé que les conditions de culture expérimentales dynamiques induisaient
une libération d’ATP dans l’ASL. L’ATP ainsi libéré en se fixant sur ses récepteurs P2Y2
associés à des protéines G couplées à la PLC inhibait l’absorption de Na+ et activait une
sécrétion de Cl- dépendante du Ca2+ (cf régulation de transports de Na+ et de Cl-).
Tarran et al. ont observé que la libération d’ATP était principalement due au
changement d’état de stress des cellules (statique < > dynamique) plutôt qu’à l’intensité du
stress. Cette observation est en accord avec les résultats obtenus par Balcells et al. qui ont
62
démontré que la fréquence de l’étirement est plus importante que l’intensité dans divers tissus
dont l’épithélium pulmonaire de rat (Balcells et al. 2005). Ces résultats suggèrent que les
sécrétions de Cl- et d’ASL, in vivo, sont pulsatiles plutôt que constantes. L’augmentation du
volume de l’ASL qui en résulte est contrebalancée par l’absorption de Na+ permettant de
maintenir un volume constant de l’ASL.
En conclusion, dans les voies aériennes proximales humaines normales la
concentration de nucléosides/nucléotides dans l’ASL module l’absorption active de Na+ (via
ENaC) et les sécrétions de Cl- (via CFTR et CaCC) permettant de maintenir le volume de
l’ASL à un niveau approprié pour un battement ciliaire efficace assurant l’évacuation des
pathogènes piégés par le mucus et protégeant ainsi les voies aériennes des infections.
63
Figure 17 : Schéma décrivant les mécanismes de régulation de la hauteur de l’ASL par les transports ioniques actifs. a) L’épithélium non-CF en conditions de culture statique régule les transports de Na+ et de Cl- pour ajuster le volume du PCL d’une hauteur excessive (25µm) à une hauteur physiologique. La zone bleue représente la hauteur du PCL correspondant à la hauteur des cils en extension. b) En conditions de culture dynamique, l’épithélium non-CF, en réponse à une augmentation des nucléotides/nucléosides relargués dans l'ASL, induit une sécrétion de Cl- via CFTR et les CaCC entraînant une hauteur du PCL plus importante (d’après Tarran 2006).
64
3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE
65
3.1 La maladie
Les premières observations rapportées de la mucoviscidose datent du Moyen Age. A
cette époque, la tradition prédisait une mort imminente pour les enfants dont la peau laissait
un goût salé. A la fin du XVIème siècle, l'autopsie d'un enfant atteint révéla une atteinte
pancréatique. D'autres études montrèrent des observations similaires couplées à des diarrhées.
En 1936, Fanconi identifie l'association fibrose kystique congénitale du pancréas et
bronchectasies ; deux ans plus tard, Andersen fait une description anatomopathologique de la
fibrose kystique. C'est en 1945 qu'apparaît le terme mucoviscidose (pour « mucus visqueux »)
proposé par Farber qui affirme que la maladie résulte d'un mucus anormalement épais.
L'anomalie électrolytique n’est décelée qu'en 1953 avec les travaux de l'équipe de di
Sant'agnese. Ces travaux mettent en évidence un excès de NaCl dans la sueur des enfants
atteints de mucoviscidose. C'est à partir de cette découverte qu’est mis au point le « test de la
sueur », toujours utilisé de nos jours. Le gène, dont la mutation provoque la maladie, est
identifié en 1989 par Riordan et ses collaborateurs (Riordan et al. 1989).
La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies autosomiques récessives létales
dans les populations d'origine européenne. En France, elle concerne une naissance sur trois
mille en moyenne ; entre cinq et six mille personnes sont affectées par la maladie et environ
une personne sur vingt-cinq est porteuse du gène défectueux. La mucoviscidose est une
maladie qui affecte plusieurs organes : le pancréas, l'intestin grêle, les glandes sudoripares,
l'appareil reproducteur,… cependant, l'atteinte pulmonaire représente la principale cause de
morbidité et de mortalité (figure 18) (Davis et al. 1996).
66
Figure 18 : Principaux organes atteints au cours de la mucoviscidose (d’après http://www.planetegene.com).
67
3.2 L'atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose
Les voies aériennes CF sont morphologiquement normales in utero et durant les
premiers mois de la vie, avec toutefois une discrète dilatation des glandes sous-muqueuses
trachéales (De Rose 2002). Cependant, les voies aériennes distales CF, sites primitifs de
l’atteinte pulmonaire, présentent rapidement des bouchons de mucus épais et visqueux, des
bronchiolectasies, une augmentation de l’épaisseur de la paroi bronchiolaire et une diminution
de leur densité (Hamutcu et al. 2002 ; Long et al. 2004). Les voies aériennes des patients CF,
dont la clairance mucociliaire est altérée, sont infectées et colonisées par des pathogènes
comme Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus et surtout P. aeruginosa, qui colonise
les voies aériennes chez la majorité des patients CF. Certains patients présentent également
des infections à Burkholderia cepacia ou à des mycobactéries non tuberculeuses
(Mycobacterium abscessus) (Koehler et al. 2004).
Les infections bronchopulmonaires à P. aeruginosa marquent un tournant évolutif
péjoratif dans l’évolution de la maladie. En effet, elles entraînent une inflammation locale
intense avec libération de cytokines et d’enzymes destructeurs tels que l’élastase neutrophile.
Ces enzymes protéolytiques destinées à lutter contre les pathogènes lèsent également les
cellules épithéliales bronchiques. Infections et inflammations détruisent les tissus pulmonaires
avec formation de bronchectasies et à un stade ultime, évolution vers l’insuffisance
respiratoire conduisant au décès (Chinet 1999).
68
ANOMALIES PROPOSITIONS THERAPEUTIQUES
Mutation génétique Thérapie génique
Diminution de la quantité de protéine
CFTR fonctionnelle
Drogues s'opposant aux effets de
certaines mutations (phénylbutyrate, …)
Anomalie des transports ioniques Amiloride, nucléotides triphosphates, …
Altération de la clairance mucociliaireKinésithérapie, sérum salé
hypertonique, amiloride, UTP
Altération des défenses anti-
microbiennesPeptides anti-microbiens
Infections bactériennes (P. aeruginosa ,
…)
Antibiothérapie (par cures IV, par
aérosols, …)
Inflammation localeAgents anti-inflammatoires (ibuprofène,
corticoïdes, …)
Hypersécrétion de mucus visqueuxDNase, kinésithérapie respiratoire,
Flutter®, …
Destruction du poumon, insuffisance
respiratoireTransplantation pulmonaire
Tableau 1 : Traitements actuels ou en cours d’évaluation de l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose (d’après Chinet 1999).
69
Les progrès obtenus jusqu’à présent sur les mécanismes de l’atteinte pulmonaire de la
mucoviscidose ont permis de proposer de nouvelles voies thérapeutiques, visant à corriger la
protéine CFTR elle-même, ou à lutter contre les conséquences des mutations de cette protéine
(tableau 1).
3.3 Le gène CF et les mutations
3.3.1 Du gène à la protéine
Le gène codant pour la protéine CFTR a été localisé sur le chromosome 7 au locus q31
en 1989 (figure 19). Ce gène d'environ 250 kilobases est constitué de 27 exons qui codent la
chaîne des 1480 acides aminés constituant la protéine CFTR (Riordan et al. 1989). La
protéine existe tout d'abord sous la forme d'un précurseur qui migre avec un poids moléculaire
(PM) d'environ 130 kDa (bande A) sur un gel de SDS polyacrylamide. Ce précurseur est
ensuite partiellement glycosylé (aux positions 894 et 900) donnant une protéine de 135 kDa
(bande B) sensible aux endoglycosidases H. La maturation se termine par l'ajout de chaînes
oligosaccharides complexes résistantes aux endoglycosidases H. La protéine CFTR mature de
PM de 170 kDa (bande C) peut alors être insérée dans la membrane cellulaire.
70
Figure 19 : La protéine CFTR : de sa localisation chromosomique à sa localisation membranaire (d’après Welsh et Smith 1995).
71
Cette insertion dans la membrane cellulaire résulte de la présence de deux groupes de
6 hélices α hydrophobes. CFTR possède deux domaines hydrophiles intracellulaires capables
de fixer et d’hydrolyser l'ATP : les NBD (« Nucleotide Binding Domain »), ainsi qu'un
domaine R (« régulateur ») qui présente des sérines phosphorylables par les protéines kinases
A et C. Ces caractéristiques structurales ont permis de classer la protéine CFTR parmi le
groupe des transporteurs ABC (« ATP Binding Cassette ») (figure 20).
Le domaine régulateur R de CFTR possède 9 sites consensus de phosphorylation par
la protéine kinase A (PKA) (Becq 2003). La phosphorylation est un processus important dans
le contrôle de l'activité de CFTR. Le rôle supposé du domaine R est de permettre l'ouverture
du canal. Sa phosphorylation entraîne des modifications de conformation de la protéine par
interactions avec les domaines NBD, permettant l'ouverture ou la fermeture du canal (figure
21). Une hypothèse concernant le mécanisme de régulation du domaine R est basée sur le
modèle « ball and chain » du canal K+ de type shaker. Dans ce modèle, le domaine R non
phosphorylé est considéré comme inhibiteur et sa phopshorylation par la PKA lèverait des
interactions inhibitrices (entre le domaine R et d’autres domaines de CFTR). Cependant, dans
une étude récente, Chappe et al. ont étudié, sur une lignée cellulaire (BHK), les interactions
intramoléculaires de la protéine CFTR. Les auteurs émettent une autre hyptothèse. Ils
suggèrent que la phosphorylation du domaine R par la PKA stimulerait les interactions du
domaine R avec d’autres parties de CFTR. Ce changement de conformation de la protéine, du
à ces interactions, permettrait l’activation du canal (figure 22) (Chappe et al. 2005).
Il a été montré que la présence d'ATP est nécessaire pour l'ouverture du canal après la
phosphorylation du domaine R (Tabcharani et al. 1991 ; Sheppard et al. 1999).
72
Figure 20 : La protéine CFTR. La structure de cette protéine comporte les éléments suivants : deux domaines transmembranaires avec 6 régions transmembranaires chacun (TM), 2 sites de fixations de nucléotides (SFN ou NBD) et 1 domaine régulateur (R) phosphorylable (d’après Chinet et al. 2003).
Figure 21 : Régulation de CFTR qui à partir d’un état fermé, non phosphorylé, passe à un état ouvert, phosphorylé sous l’action des protéines kinases (PKA) et de Mg-ATP. L’ouverture du canal permet le transport des ions Cl-. L’ATP va jouer un double rôle dans ce mécanisme, à la fois comme cofacteur de la réaction de phosphorylation par les PKA et comme régulateur au niveau des NBD (hydrolysé en ADP + Pi). P : groupement phosphorylés sur les dix sites consensus pour les PKA de la protéine (d’après Becq 2003).
73
Les deux domaines NBD possèdent des sites de fixation et d'hydrolyse de l'ATP et les
ouvertures/fermetures du canal dépendent de l’hydrolyse de l'ATP (Sheppard et al. 1999 ;
Gadsby et al. 1999) (figure 22). Il est admis que l'hydrolyse d'ATP par le NBD1 permet
l'ouverture du canal tandis que l'hydrolyse de l'ATP par le NBD2 ferme le canal (Becq et al.
2003). Récemment, des études biochimiques (Basso et al. 2003 ; Vergani et al. 2005) et de
cinétiques de CFTR (Vergani et al. 2003) ont suggéré que l’ouverture du canal CFTR était
couplée avec la formation d’un dimère NBD1/NBD2 intramoléculaire. La dissociation de ce
dimère, accélérée par l’hydrolyse de l’ATP sur le NBD2, entraînerait la fermeture du canal
(Vergani et al. 2005) (figure 23). Hanrahan et Wioland ont, pour leur part, proposé un modèle
de régulation de l’ouverture de CFTR reprenant des résultats de récentes études
d’électrophysiologie et de marquage radioactif (figure 24) (Hanrahan et Wioland 2004). Ce
modèle propose deux voies distinctes pouvant entraîner l’ouverture du canal CFTR : la voie
dite « hydrolytique » et la voie dite « non hydrolytique ». Dans la voie « hydrolytique », la
fixation d’ATP sur le NBD1, puis sur le NBD2 permettrait l’ouverture du canal et l’hydrolyse
de l’ATP sur le NBD2 sa fermeture. Cette voie serait dépendante du Mg2+. Dans la voie « non
hydrolytique », la fixation d’ATP sur le NBD1 du canal CFTR phosphorylé pourrait permettre
l’ouverture du canal indépendamment de la concentration en Mg2+ et surtout sans hydrolyse
de l’ATP (Hanrahan et Wioland 2004). Ces deux voies de contrôle de l’activation de CFTR
permettraient selon les auteurs de réconcilier les résultats discordants obtenus par différentes
équipes. En effet, selon les conditions expérimentales, l’une des deux voies pourraient être
prédominantes. La voie hydrolytique pourrait expliquer la dépendance à la température de
CFTR dans des expériences de patch clamp (Mathews et al. 1998) alors que la voie « non
hydrolytique » pourrait expliquer la faible dépendance à la température de l’activation dans
des bicouches lipidiques (Aleksandrov et Riordan 1998).
74
Figure 22 : Schéma résumant les effets de la phosphorylation de CFTR sur les interactions du domaine R. Le domaine R phosphorylé interagit avec l’extrémité NH2-terminale, cependant cette interaction est purement spéculative et le récepteur du domaine reste à identifier (d’après Chappe et al. 2005).
Figure 23 : Schéma illustrant le mécanisme de régulation d’ouverture ATP-dépendant de CFTR proposé par Vergani et al. La fixation d’ATP sur les NBD1 (en gris) et NBD2 (en noir) conduirait à des changements de conformation entraînant la formation de dimère intramoléculaire « tête-bêche » NBD1/NBD2. Ce changement de conformation permettrait l’ouverture du canal. L’hydrolyse d’ATP sur le NBD2 entraînerait la dissociation du dimère et la fermeture du canal (d’après Vergani et al. 2005).
75
Figure 24 : Représentation hypothétique des mécanismes d’ouverture de CFTR proposée par Hanrahan et Wioland. Selon ce modèle, l’ouverture « non hydrolytique » du canal phosphorylé aurait lieu spontanément en présence ou en absence de Mg2+ si de l’ATP se fixe sur le NBD1. Le cycle « hydrolytique » aurait lieu en présence d’ATP/Mg sur le NBD2. Les différentes conformations sont représentées par différentes formes. Le turn-over rapide de l’ATP est prédominant sur le NBD2 (d’après Hanrahan et Wioland 2004).
76
3.3.2 Les différentes classes de mutations de CFTR
Il a été identifié plus de 1500 mutations du gène à l'heure actuelle, ces mutations sont
recensées sur le site : www.genet.sickkids.on.ca/cftr. Bien qu'il existe un nombre très
important de mutations, l'une d'entre elles, la mutation ∆F508, représente près de 70% des
allèles mutés et environ la moitié des patients atteints de mucoviscidose sont homozygotes
pour cette mutation. Tous les domaines de CFTR sont touchés par des mutations. On peut
toutefois observer une forte concentration de mutations entraînant une pathologie sévère dans
le NBD1 (cf chapitre 3.3.3) (figure 25). Le nombre important de mutations a rendu nécessaire
leur classification. La classification proposée par Welsh et Smith en 1993, les avait réparties
en 5 classes. Cependant, 1 nouvelle classe de mutation est apparue dans la littérature (figure
26).
Classe 1 : Les mutants de cette classe sont caractérisés par l'absence de production de
la protéine CFTR. Les mutations de cette classe sont dues à un épissage anormal ou à
l'insertion prématurée d'un codon stop entraînant un ARNm instable qui ne sera pas traduit en
protéine. Les mutations non-sens peuvent réduire les niveaux d'expression des ARNm jusqu'à
5% du niveau d'expression normal (Hamosh et al. 1992). Ces mutations entraînent
habituellement des phénotypes sévères, notamment au niveau pulmonaire (dégénérescence
progressive des poumons) et pancréatique (insuffisance pancréatique).
Exemple de mutations de la classe 1 : G542X, W1282X, R553X
Classe 2 : Les mutants de la classe 2 ont une traduction complète, mais produisent une
protéine malformée qui ne passe pas le système de « contrôle » que constitue le réticulum
endoplasmique où elle est séquestrée puis dégradée. (Cheng et al. 1990 ; Thomas et Pedersen
77
1993 ; Ward et Kopito 1994). C'est à cette classe qu'appartient le mutant ∆F508 (délétion
d'une phénylalanine en position 508) qui représente environ 70% des allèles mutés. Tout
comme les mutants de la classe 1, ces mutants entraînent habituellement des formes sévères
de la mucoviscidose puisque la protéine CFTR est absente de la membrane.
Exemple de mutations de la classe 2 : ∆F508, N1303K
La mutation ∆F508 conduit à la formation d’une protéine anormale qui est dégradée à
99% par le complexe ubiquitine/protéasome (Ward et al. 1995). Du fait d’un repliement
inadéquat, la protéine CFTR mutée reste associée aux protéines de contrôle du reticulum
endoplasmique (RE) : la calnexine, les protéines de choc thermique 70 (hsp et hsc 70) et hsp
90 (Pind et al. 1994 ; Strickland et al. 1997 ; Loo et al. 1998). Par exemple, alors que la
liaison entre la protéine CFTR normale et hsp70 se dissocie pour que CFTR poursuive sa
maturation, le complexe CFTR(∆F508)/hsp70 reste associé dans le réticulum endoplasmique
pour y être dégradé. Une étude récente vient de montrer dans la lignée cellulaire CF d’origine
épithéliale pulmonaire CF15 (∆F508/ ∆F508), que la diminution et le maintien d’un faible
concentration de Ca2+ dans le RE, inhibait l’interaction CFTR/calnexine et restaurait un
transport de Cl- AMPc-dépendant, traduisant la normalisation de la maturation de CFTR
(Norez et al. 2006). La conformation anormale de la protéine mutée n’abolit pas
complètement sa capacité à transporter les ions Cl- (Li et al. 1993 ; Dormer et al. 2005). En
effet, des expériences d’expression hétérologue ont montré que le mutant ∆F508 pouvait
répondre à une stimulation par l’AMPc. Cependant, si la conductance unitaire n’apparaît pas
modifiée, les temps de fermeture semblent trois à quatre fois plus longs par rapport à la
protéine sauvage (Dalemans et al. 1991). Une autre équipe a montré, dans des cellules
nasales, que des patients CF homozygotes ∆F508 pouvaient posséder une activité résiduelle
de CFTR (Sermet-Gaudelus et al. 2002).
78
Ces patients présentaient une atteinte pulmonaire moins sévère que ceux ne possédant
pas cette activité. Le mutant ∆F508 apparaît donc fonctionnel quand il est normalement inséré
dans la membrane, mais la mutation ∆F508 est responsable d’une modification des
caractéristiques biophysiques du canal.
Classe 3 : Les protéines CFTR mutées de cette classe parviennent à la
membrane mais présentent des défauts de régulation notmamment par la protéine kinase A
(PKA). Cette classe de mutation entraîne habituellement des phénotypes sévères associés à
des insuffisances pancréatiques. Les mutations de cette classe peuvent interférer avec la
liaison et l’hydrolyse de l’ATP ainsi qu’avec la phosphorylation du domaine R.
Exemple de mutations de la classe 3 : G551D, G1244E
La protéine CFTR comportant la mutation G551D, la seconde mutation en fréquence,
est correctement adressée à la membrane mais la phosphorylation par la PKA n’entraîne pas
l’ouverture du canal. Des études biochimiques ont montré que le NBD1-G551D avait une
activité ATPase fortement réduite par rapport au CFTR sauvage (Howell et al. 2000). Dans le
cadre de la mutation G551D, c’est uniquement la liaison de l’ATP au NBD1 qui est affectée
puisque le domaine R est normalement phosphorylé (Chang et al. 1993).
Classe 4 : Les protéines CFTR mutées de cette classe sont insérées dans la membrane,
sont régulées normalement par la PKA mais présentent une diminution de la conductance aux
ions Cl- ainsi que des caractéristiques de cinétique altérées (Sheppard et al. 1993). Ces
mutations sont souvent retrouvées dans des régions qui forment le pore, ce qui explique la
modification du flux Cl-. Ces mutations sont généralement associées à des phénotypes moins
sévères.
79
Exemple de mutations de classe 4 : R117H, R234P, R334W
Classe 5 : Les mutations de la classe 5 ont pour conséquence de diminuer le nombre de
protéine CFTR fonctionnelle à la membrane. Elles sont principalement dues à des mutations
dans le promoteur et dans les introns qui contrôlent l'épissage des ARNm. Ces mutations
altèrent la stabilité de l’ARNm ou la maturation protéique. Les mutations de classe 5
entraînent habituellement des phénotypes modérés.
Exemple de mutations de classe 5 : A455E, P574H
Classe 6 : Les mutations de la classe 6 sont caractérisées par une altération des
fonctions régulatrices de CFTR. Ces mutations provoquent habituellement des phénotypes
modérés.
Exemple de mutations de la classe 6 : Q1412X
Si la totalité de la protéine CFTR peut être affectée par des mutations, la présence de
deux mutations en cis a également été observée. Une étude a montré que la présence de deux
mutations en cis, R347H et D979A associées habituellement associées à des phénotypes
modérés, pouvait entraîner un phénotype sévère (Clain et al. 2001). Selon les auteurs, les ces
doubles mutations en cis pourraient contribuer à la variabilité des phénotypes observés dans la
mucoviscidose.
80
Figure 25 : Distribution des mutations en fonction des domaines de CFTR. (DTM1 et 2 : domaine transmembranaire 1 et 2, SFN 1 et 2 : site de fixation des nucléotides 1 et 2, R : domaine régulateur) (d’après http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/resource/fig2.html).
Figure 26 : Différentes classes de mutations de CFTR (d’après http://www.123bio.net).
81
3.3.3 Corrélation génotype/phénotype
Plusieurs études ont montré que l’atteinte pancréatique dans le cadre de la
mucoviscidose, était corrélée au génotype (Merlo et Boyle 2003). Les mutations des classes 1,
2 et 3 sont habituellement associées à des insuffisances pancréatiques tandis que les mutations
de classe 4 et 5 provoquent des atteintes pancréatiques moins sévères (Zielenski 2000).
Cependant, le génotype ne permet généralement pas de prédire le degré de l’atteinte
pulmonaire (Merlo et Boyle 2003). Les mutations des classes 1,2 et 3, qui représentent 90%
des mutations dans la population américaine, sont associées à des atteintes pulmonaires
habituellement sévères mais avec de notables exceptions.
Toutefois, les mutations A455E (mutation de classe 5) et R117H (mutation de classe
4) sont clairement associées à l’état de la fonction pulmonaire. L’analyse de 33 patients
hétérozygotes composites ∆F508 / A455E a révélé une atteinte moins sévère de la fonction
pulmonaire (volume maximal expiré en une seconde, VEMS et capacité vitale forcée, CVF) et
un taux de colonisation par P. aeruginosa réduit par rapport à des homozygotes ∆F508 issus
de la même population (Gan et al. 1995). Une étude similaire portant sur 9 hétérozygotes
composites ∆F508 / A455E et 5 homozygotes ∆F508 canadiens, a abouti aux mêmes
conclusions (DeBraekeleer et al. 1997). Entre 1992 et 2002, De Gracia et al. ont étudié la
CVF et le VEMS chez 120 malades adultes atteints de mucoviscidose (De Gracia et. al 2005).
Les auteurs ont séparé les malades en 2 groupes en fonction de la présence (mutation de
classe 3, 4 ou 5) ou non (mutation de classe 1 ou 2 sur chaque chromosome) de la protéine à
la membrane. Les patients ayant des mutations de classe 1 ou 2 présentaient une baisse
significative de la fonction pulmonaire, des risques accrus de développer une pathologie
pulmonaire sévère et une espérance de vie inférieure par rapport aux patients ayant au moins
82
une mutation de classe 3, 4 ou 5. Cette étude suggère que la sévérité de l’atteinte pulmonaire
est (grossièrement) corrélée à la classe de mutation de CFTR.
Cependant, il a été démontré des variabilités dans la sévérité de l’atteinte pulmonaire
chez des patients mucoviscidosiques présentant le même génotype pour CFTR. Les facteurs
environnementaux ont été soupçonnés d’être responsables de ces variations. Cependant, les
études réalisées sur l’impact de ces facteurs environnementaux comme la nutrition, le statut
tabagique (in utero, actif ou passif), le statut socio-économique ne permettent pas d’expliquer
les variations observées dans l’atteinte pulmonaire chez des patients porteurs de la même
mutation de CFTR (Merlo et Boyle 2003). De plus, des études portant sur des jumeaux
monozygotes et dizygotes, ont révélé une plus grande concordance de l’atteinte pulmonaire
chez les jumeaux monozygotes par rapport aux jumeaux dizygotes (Mekus et al. 2000). Ces
études suggèrent que la sévérité de l’atteinte pulmonaire pourrait être modulée par des
facteurs génétiques secondaires plutôt que par la seule mutation de CFTR. Ces facteurs
génétiques sont appelés « gènes modificateurs ».
3.3.4 Les gènes modificateurs
Dans les maladies monogéniques, comme la mucoviscidose, des « gènes
modificateurs » pourraient jouer un rôle important dans l’expression clinique de la maladie.
Les produits des gènes modificateurs peuvent affecter l’épissage, la transcription, la
traduction, le trafficking, la glycosylation mais aussi, la dégradation ou la sécrétion de la
protéine mutée (Sontag et Accurso 2004). Cependant, les gènes modificateurs peuvent
également réguler d’autres phénomènes, indépendamment de la protéine comme
83
l’inflammation, la fibrose ou les transports ioniques,… L’identification des gènes
modificateurs potentiels repose aujourd’hui sur l’étude des SNP (« single nucleotide
polymorphisms »). Les SNP sont des variations d’une simple paire de base ; elles représentent
les variations les plus fréquentes du génome humain. Des SNP pouvant interférer dans le
phénotype des maladies ont été localisés dans le promoteur (modification de la transcription),
dans un exon (modification de la structure ou de la fonction de la protéine) ou dans un intron
(modification de l’épissage) (Brookes 1999).
Plusieurs gènes modificateurs ont été identifiés par leur influence sur le phénotype de
l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose. La MBL (« mannose binding lectin ») est une
composante importante du système immunitaire inné. La MBL participe au processus de
phagocytose des bactéries en reconnaissant le mannose à la surface des bactéries et en
activant la voie du complément. Quatre études ont montré que les patients homozygotes pour
la forme sauvage du MBL (notée MBL2-A) avaient une fonction pulmonaire
significativement supérieure par rapport aux patients possédant un allèle variant (MBL2-B, C,
D). Chacune de ces formes, conduisant à une diminution de la concentration en MBL, est
notée MBL2-0 (Slieker et al. 2005). Deux études ont montré que les patients MBL2-0 étaient
plus fréquemment colonisés par P. aeruginosa pour l’une (Gabolde et al. 1999) et B. cepacia
pour l’autre (Garred et al. 1999) par rapport aux homozygotes MBL2-A, cependant ces
résultats n’ont pas été confirmés par les deux autres études (Davies et al. 2004 ; Yarden et al.
2004). Néanmoins, ces études suggèrent que la MBL2 est un gène modificateur pouvant
moduler l’atteinte pulmonaire au cours de la mucoviscidose.
Contrairement à d’autres maladies inflammatoires des voies aériennes comme
l’asthme, la concentration en NO (monoxyde d’azote) dans l’air exhalé des patients
84
mucoviscidosiques est inférieure par rapport aux sujets sains contrôles (Thomas et al. 2000 ;
de Winter-de Groot et Van der Ent. 2005). Le NO est produit par les NOS (NO synthase, cf
chapitre 7). Une étude a montré qu’une répétition importante de la séquence nucléotidique
AAT dans le gène de la NOS-1 était corrélée avec une faible concentration en NO dans l’air
exhalé ainsi qu’à une plus forte susceptibilité aux infections par P. aeruginosa et A. fumigatus
(Graseman et al. 2000, Davies 2005). Graseman et al. ont également montré un lien entre le
polymorphisme de la NOS-3 (G847T), une plus forte concentration en NO dans l’air exhalé et
une sensibilité aux infections par P. aeruginosa diminuée, mais cette relation n’a été observée
que chez des sujets de sexe féminin (Graseman et al. 2003). Texereau et al. ont étudié chez 59
patients CF le nombre de répétitions du motif GT sur chacun des allèles de la NOS-1. Cette
équipe a montré que la diminution du VEMS était significativement inférieure chez les
patients qui possèdaient plus de 27 répétitions du motif GT sur les 2 allèles de la NOS-1 par
rapport à ceux qui ne possédaient pas ces répétitions ou seulement sur un seul allèle (Texereau
et al. 2004). D’après ces études, il apparaît donc que le gène de la NOS-1 serait un gène
modificateur (Slieker et al. 2005) alors que le gène de la NOS-3, selon certains auteurs, serait
plus dépendant de gènes modificateurs que directement impliqué comme modificateur lui-
même (Davies et al. 2005).
Les récepteurs β2 adrénergiques (β2AR) activés stimulent l’activité de l’adénylate
cyclase (AC) entraînant la formation d’AMPc pouvant activer par exemple CFTR. Le gène
codant pour le β2AR est hautement polymorphique et l’influence de ces allèles sur l’asthme
nocturne ou l’obésité a été démontrée (Merlo et Boyle 2005). Un variant très répandu (allèle
R16G) favorise la désensibilisation des β2AR après fixation du ligand. Une étude a montré
par PCR que les patients CF qui possédaient au moins une copie de l’allèle R16G,
85
présentaient un VEMS significativement inférieur par rapport aux patients homozygotes pour
l’allèle R16 (Buscher et al. 2002).
Plusieurs études ont tenté de déterminer l’influence de gènes modificateurs sur la
réponse inflammatoire. Le système HLA (human leukocyte antigène) représente un groupe de
gènes qui codent pour des protéines présentatrices d’antigène. L’efficacité de la réponse
immunitaire est dépendante en partie de ce système. La région HLA est l’une des plus
variables du génome humain. Certains allèles semblent associés à des maladies auto-
immunes, à l’asthme ou à des allergies (Davies 2005 ; Slieker et al. 2005). Une étude a
reporté que les patients CF porteurs de l’allèle HLA-DR7 avaient des voies aériennes plus
fréquemment colonisées par P. aeruginosa ainsi qu’une augmentation du niveau d’IgE par
rapport aux patients porteurs de l’allèle HLA-DR4 (Aron et al. 1999).
Le TNF-α et le TGF-β sont des cytokines pro-inflammatoires dont le polymorphisme
des allèles semble également impliqué dans la sévérité de l’atteinte pulmonaire. Le TGF-β
possède également des propriétés anti-inflammatoires et en particulier module dans
l’épithélium des voies aériennes la prolifération des fibroblastes. Une étude a montré chez des
patients CF homozygotes ∆F508, que le polymorphisme TGF-β (T869C) était associé à une
diminution de la production de TGF-β1, et d’un ralentissement de la dégradation de la
fonction pulmonaire (Arkwright et al. 2000). Les études sur le TNF-α, ont montré que le
polymorphisme TNF-α (G308A) dans la région promotrice du gène augmentait la production
de TNF-α. Les patients CF possédant cet allèle ont révélé des fonctions pulmonaires
significativement plus altérées que chez les patients CF non porteur de cet allèle (Hull et al.
1998 ; Slieker et al. 2005).
86
Le polymorphisme d’autres gènes (gluthation-S-transférase, enzyme de conversion de
l’angiotensine 1, α1-anti-trypsine, CLC-2,…) semble également être capable d’influencer la
sévérité de l’atteinte pulmonaire (tableau 2). Des études comprenant un grand nombre de
patients CF sont actuellement menées afin d’identifier de nouveaux gènes modificateurs et
d’étudier les possibles interactions entre les gènes modificateurs et leurs impacts sur
l’expression de la mucoviscidose (Merlo et Boyle 2003). Si les mutations de CFTR de classe
1 et 2 semblent associées à une atteinte pulmonaire plus sévère par rapport aux mutations des
autres classes, le polymorphisme de certains gènes modificateurs semblent également jouer un
rôle important.
87
Gène n Polymorphisme VEMS Radiographie de la poitrine
P.
aeruginosa
B.
cepacia Mortalité
149 A/0 + X/Y - 0 ++ ++ 558 A/0 + X/Y - 0 0 164 A/0 - 0
MBL
179 A/0 + X/Y - 0 75 AAT n>12 0 ++ 40 AAT n>12 0 ++ NOS1 59 GT n>27 + 0 0
NOS3 70 894G/T 0 +a 215 M/S, Z 0 ++ 269 M/S, Z 0 157 M/S, Z + 0 0 0 79 M/S, Z 0
716 M/S, Z 0 + 0 0 716 1237G/A 0 0 0 0
AAT
124 1237G/A + ++ - 98 DR4 -/+ 0 -
HLA-II 98 DR7 -/+ 0 +
TNF-α 53 -308G/A - 0 0 GST M1 53 A, B/0 0 - 0 GST M3 146 A/B + 0 TGF β1 171 869 T/C + 0 0 0
ACE 261 D/I + 0 0 0 β2AR 126 16 R/G - 0
CLC-2 31 variable 0 Tableau 2 : Gènes modificateurs potentiellement impliqués dans l’expression clinique de l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose. N : nombre de patients, VEMS : volume maximal expiré en une seconde ; MBL : mannose binding lectin, NOS1 et 3 : nitric oxide synthase 1 et 3, AAT : α1-antitrypsine, HLA : human leukocyte antigen, TNF-α : tumor necrosis factor α, GST : gluthation S-transférase, TGF- β1 : transforming growth factor β1, ACE : enzyme de conversion de l’angiotensine 1, β2AR : récepteur β2 adrénergique, CLC-2 : canal Cl- 2. Symboles : ++ : association très positive (p<0,01), + : association positive (p<0,05), 0 : pas de relation significative, - : association négative (p<0,05). a chez les sujets féminins seulement (d’après Slieker et al. 2005).
88
3.4 CFTR
3.4.1 Fonctions de CFTR
Canal ionique : Des études menées sur des protéines CFTR recombinantes ont
rapidement montré que la protéine CFTR était un canal Cl-. En effet, l’expression de CFTR
dans des lignées cellulaires (HeLa, CHO, NIH 3T3) ne l’exprimant pas de manière endogène
ont permis de montrer l’apparition d’une conductance Cl- en présence d’agoniste de l’AMPc
(Drumm et al. 1990 ; Rich et al. 1990 ; Rommens et al. 1991 ; Kartner et al. 1991). Des
études similaires réalisées avec le mutant CFTR ∆F508 ont démontré que l’expression de la
protéine mutée n’entraînait pas de conductance Cl- (Rich et al. 1990 ; Anderson et al. 1991a).
Une étude d’Anderson et al. a permis d’affirmer que CFTR était bien un canal Cl- : par
mutagenèse dirigée, les auteurs ont observé qu’en modifiant certains résidus constituant le
pore, la sélectivité du canal pour les ions Cl- était altérée, démontrant ainsi que la conduction
des ions Cl- s’effectuait par le canal CFTR (Anderson et al. 1991b).
Rôle régulateur : Il a été montré qu'en plus de sa fonction de canal Cl-, CFTR exerçait
un rôle régulateur sur d'autres protéines. Bien avant le clonage du gène CF, de nombreuses
anomalies avaient été répertoriées au sein des épithéliums. Parmi celles-ci, figure la régulation
altérée d’un autre type de canal Cl- : le canal ORCC (Egan et al. 1992). Une hyperabsorption
de Na+ a également été démontrée au sein de l'épithélium des voies aériennes (Knowles et al.
1981; Boucher et al. 1986; Chinet et al. 1994). Ces découvertes ont permis de supposer puis
de confirmer le rôle régulateur de CFTR sur d'autres canaux (cf 2.1.1 et 2.1.2) (figure 27).
89
Nous avons vu dans les chapitres 2.1.1 et 2.1.2 que CFTR et ENaC étaient capables de
se réguler mutuellement. La formation de complexes macromoléculaires de signalisation
semble intervenir dans ces mécanismes de régulation. L’extrémité C-terminale de CFTR
contient un domaine PDZ. Les domaines PDZ sont constitués de 80 à 100 acides aminés qui
interviennent notamment dans les interactions protéine-protéine (Guggino et Stanton 2006).
Le domaine PDZ de CFTR interagirait avec le domaine PDZ-1 de la protéine NHERF1
(Na+/H+ exchanger regulatory factor isoform-1). La protéine NHERF1 contient également un
domaine PDZ-2, qui interagirait avec la protéine YAP-65 (Yes associated protein 65kDa).
Celle-ci pourrait interagir par un domaine « WW » (région de 35 à 40 acides aminés
caractérisée par la présence de 4 acides aminés particulièrement conservés dont 2
tryptophanes) avec le domaine « PY » de l’extrémité C-terminale des trois sous-unités de la
proteine ENaC (figure 27) (d’après Guggino et Stanton 2006).
Récemment, une étude incluant 3 laboratoires indépendants ont cependant remis en
cause l’inactivation d’ENaC par CFTR dans des ovocytes de xénope (Nagel et al. 2005). Ces
3 équipes ont obtenus les mêmes résultats indépendamment et expliquent leurs résultats
discordants par les conditions expérimentales d’enregistrement des autres études pouvant
simuler une inhibition d’ENaC par CFTR. Selon les auteurs, les conditions expérimentales de
patch-clamp pourraient également expliquer pourquoi CFTR semble interagir avec les autres
transporteurs électrogéniques, canaux et transporteurs (Nagel et al. 2005). Cependant ces
résultats restent à être confirmés ou infirmés dans d’autres systèmes d’expression que les
ovocytes de Xénope.
90
Figure 27 : NHERF1 permettrait l’interaction CFTR/ENaC et faciliterait la régulation mutuelle de ces deux canaux ioniques. Les interactions entre CFTRet ENaC pourraient impliquer un complexe dynamique de signalisation contenant des protéines à domaine PDZ et des protéines kinases. CFTR se lierait avec le domaine PDZ-1 de NHERF1 (Na+/H+ exchanger regulatory factor isoform-1). YAP-65 (Yes associated protein 65kDa) interagirait avec le domaine PDZ-2 de NHERF1. Le domaine « WW » de YAP-65 interagirait avec le domaine « PY » des trois sous-unités de la protéine ENaC (une seule sous-unité représentée). Le domaine SH3 (Src homology 3) de YAP-65 pourrait interagir avec la tyrosine kinase c-YES (membre de la famille des kinases c-Src). c-SRc étant un inhibiteur puissant d’ENaC, il serait possible que c-YES participe à l’inhibition de l’activité d’ENaC par CFTR (d’après Guggino et Stanton 2006).
91
CFTR pourrait également intervenir dans le métabolisme des lipides (Mehta et al.
2005), dans le contrôle des flux de glutathion dans les cellules épithéliales des voies aériennes
(Kogan et al. 2003 ; Hudson et al. 2004). D’autres fonctions régulatrices de CFTR qui avaient
été suggérées, comme le relargage d’ATP (Reisin et al. 1994 ; Braunstein et al. 2001) ou
l’acidification des organelles intracellulaires (Barasch et al. 1991) ont été remises en
questions par d’autres études (Reddy et al. 1996 ; Bradbury et al. 1999).
3.4.2 Expression de CFTR
La mucoviscidose est une maladie qui affecte plusieurs organes. En effet, les
personnes atteintes de la mucoviscidose souffrent d'atteintes pancréatique, hépatique,
intestinale, des glandes sudoripares, de l'appareil reproducteur et de l'appareil respiratoire. Il a
été démontré que la protéine CFTR était exprimée dans chacun de ces organes.
CFTR est exprimé au niveau du pancréas qui est l'un des sites majeurs de l'expression
de CFTR durant le développement (Foulkes et al. 1993). CFTR apparaît principalement
localisé au niveau des cellules épithéliales des canaux intra- et inter lobulaires (Foulkes et al.
1993). L'absence de CFTR au niveau du pancréas aboutit à la destruction du pancréas dû à
l'accumulation d'enzymes digestives. Lorsque la fibrose atteint les îlots de Langerhans, on
peut observer l'apparition d'un diabète insulinodépendant.
Dans le foie, CFTR est exprimé dans l’épithélium des canaux biliaires et de la vésicule
biliaire où la protéine participe à la formation de la bile.
92
Dans les glandes sudoripares, CFTR est exprimé à la face apicale des cellules
canalaires et participe avec le canal ENaC à la réabsorption de NaCl. Dans la mucoviscidose,
l'absence de CFTR associée à une mauvaise régulation d'ENaC, entraîne une réduction de la
réabsorption canalaire de sodium expliquant ainsi le caractère salé de la sueur chez les
patients CF (Becq et al. 2003).
La protéine CFTR est exprimée dans différents épithéliums où elle participe aux
transports d'ions et d'eau ainsi qu'à leur régulation. Au niveau pulmonaire, les résultats
obtenus sur l'expression de CFTR sont contradictoires notamment au niveau des voies
aériennes distales. Nous discuterons de l'expression de CFTR au niveau pulmonaire dans le
chapitre 5.
Toutefois, la protéine CFTR n’est pas exclusivement exprimée dans les tissus
épithéliaux. Des études récentes ont démontré, par immunolocalisation, la présence de CFTR
dans des cellules musculaires lisses de la trachée chez le rat (Robert et al. 2004 ; Vandebrouck
et al. 2006). Selon Vandebrouck et al., l’augmentation en AMPc intracellulaire due à la
stimulation des récepteurs β2-adrénergiques couplés à l’adénylate cyclase, activerait la
protéine CFTR qui pourrait intervenir dans la bronchodilatation (Vandebrouck et al. 2006).
Une étude a également démontré par RT-PCR que la protéine CFTR était présente et
fonctionnelle au niveau des myocytes cardiaques (Hart et al. 1996). CFTR au niveau
cardiaque pourrait être impliqué dans le contrôle de la durée du potentiel d’action. Il a été
montré des modifications post-traductionnelles dans l’expression de CFTR durant certaines
formes de cardiomyopathies (Davies et al. 2004) Toutefois, le rôle fonctionnel et les
conséquences cliniques de ces modifications ne sont pas clairement définis (Duan et al. 2005).
93
La présence de CFTR a également été observée dans le cerveau (Mulberg et al. 1998 ;
Weyler et al. 1999). Weyler et al. ont démontré, par western blot, que la protéine CFTR était
exprimée dans une lignée cellulaire neuronale provenant de l’hypothalamus humain où elle
pourrait moduler les neurosécrétions, notamment celle de GnRH (gonadolibérine ou
gonadotrophin releasing hormon). Selon les auteurs, l’activation de CFTR stimulerait le
trafficking et la sécrétion des vésicules contenant la GnRH.
La protéine CFTR est exprimée dans de nombreux tissus pouvant ainsi expliquer les
atteintes pluri-organiques observées dans la mucoviscidose. Toutefois, l’atteinte pulmonaire
est à l’origine de 90% de la morbidité et de la mortalité de cette maladie.
3.5 Effets des mutations de CFTR sur les mouvements
d'ions et d'eau au niveau des voies aériennes proximales et
distales
Les mutations du gène CF provoquant l'absence ou le dysfonctionnement de la
protéine CFTR à la membrane apicale des cellules épithéliales des voies aériennes entraînent
une réduction de la perméabilité membranaire de ces cellules aux ions Cl- (Riordan 1993 ;
Kopito 1999). Ajouté à ce phénomène, la levée de l'inhibition tonique qu'exerce CFTR sur
ENaC provoque une hyperabsorption de Na+ dans les voies aériennes. De plus l'absence de
CFTR entraîne également des perturbations dans la régulation du canal ORCC.
94
L'hyperabsorption de Na+ et d'eau à l'état basal associée à un défaut de sécrétion des ions Cl-
en réponse aux β–adrénergiques entraînent une diminution de la hauteur du liquide périciliaire
(Chinet 2003) (figures 28 et 29). L'hyperabsorption de Na+ a été mise en évidence par la
perfusion d'amiloride qui fait chuter la ddp nasale de 75 à 90 % contre seulement environ 55
% chez les personnes non mucoviscidosiques. La mesure de la ddp nasale, significativement
plus élevée chez les personnes mucoviscidosiques (Knowles 1981), peut d'ailleurs constituer
une alternative au test à la sueur pour diagnostiquer la mucoviscidose (Chinet 1994). La
sécrétion de Cl- activée par la voie de l'AMPc est absente ou fortement réduite dans les voies
aériennes mucoviscidosiques tandis que la sécrétion de Cl- Ca2+-dépendante stimulée par
l'ATP est normale ou augmentée (Knowles 1991).
Ces altérations des transports ioniques observées dans les voies aériennes proximales,
provoquent une diminution de la hauteur du liquide de surface, altérant la clairance
mucociliaire et offrent ainsi un terrain favorable aux infections bactériennes. Celles-ci
entraînent une réponse inflammatoire qui devient délétère pour le tissu pulmonaire. Dans une
étude récente, Frizzell et Pilewski ont démontré que la surexpression de la sous-unité β du
canal ENaC provoquait une diminution de la hauteur du liquide de surface chez la souris due
à une augmentation de l’absorption active de Na+. Cette diminution était associée à un état
inflammatoire même en l'absence de toute infection, suggérant que l’inflammation peut
résulter en partie des anomalies des transports d’ions et d’eau (Frizzell et Pilewski, 2004).
95
Figure 28 : Transports d’ions et d’eau dans l’épithélium pulmonaire normal et CF. Voies de transport des ions Na+, Cl- et d’eau dans les voies aériennes normales (A) et mucoviscidosiques (C) et transporteurs impliqués dans les mouvements d’ions. Représentation du liquide de surface des voies aériennes avec la couche de mucus, le liquide péricilaire (PCL) et la vélocité normale du mucus dans les voies aériennes normales (B) et représentation de l’ASL dans les voies aériennes CF avec déplétion du PCL, formation de plaques de mucus adhérentes et statiques (d’après Boucher 2004).
Figure 29 : Dysfonctionnements dans la régulation de la hauteur du liquide périciliaire par l’épithélium CF (a) Images de microscopie confocale 0h, 6h et 48h après addition de 20µl de tampon phosphate coloré au dextran rouge Texas sur des cultures de cellules épithéliales non-CF et CF, (b) hauteur moyenne du PCL en fonction du temps dans les cultures non-CF (carrés) et CF (cercles) (d’après Tarran et al. 2005).
96
3.6 Concepts actuels sur la physiopathologie de
l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose
La mise en culture de cellules épithéliales nasales et bronchiques CF et non CF et plus
récemment de cellules épithéliales bronchiolaires CF et non CF ont permis de mieux
comprendre les transports d'ions et d'eau transépithéliaux et notamment l'implication de
canaux ioniques comme ENaC ou CFTR (Yankaskas et al. 1985 ; Randell et al. 2001 ;
Blouquit et al. 2002 ; Blouquit et al. 2006). Ces études ont permis de réaliser des progrès
considérables dans la compréhension de la pathogenèse de la mucoviscidose. De récentes
études viennent encore d'ouvrir de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension
de la régulation de l'ASL. Tarran et al. ont développé un système de culture cellulaire
dynamique (cf chapitre 2.6) (Tarran et al. 2006). Pour rappel, le système de culture
dynamique est censé mimer les mouvements cycliques (« shear stress ») auxquels est soumise
la muqueuse des voies aériennes durant la respiration, mouvements provoqués par les flux
d’air et les mouvements thoraciques dans les voies aériennes, entraînant la libération de
nucléotides pouvant participer à la régulation des transports ioniques. Les auteurs ont appliqué
ce système de culture à des cellules épithéliales CF.
A l’aide de cette technique, Tarran et al. ont démontré que la hauteur du liquide de
surface est de 7 µm dans les cultures de cellules épithéliales CF en conditions de culture
dynamique contre 3 µm en conditions de culture statique (figure 30). Les auteurs ont observé
que les conditions expérimentales dynamiques induisaient la libération d'ATP dans l'ASL.
97
Figure 30 : Schéma décrivant les mécanismes de régulation de la hauteur de l’ASL par les transports ioniques actifs dans l’épithélium CF (a) Dans l’épithélium CF en condition statique, le défaut de régulation de l’absorption de Na+ et l’incapacité d’induire une sécrétion Cl- conduit à une diminution de la hauteur du liquide péricilaire (PCL), (b) Dans l’épithélium CF en conditions de culture dynamique, le relargage d’ATP dans le PCL est suffisant pour inhiber l’absorption de Na+ et induire une sécrétion de Cl- via les CLCA et restaurer une hauteur du PCL physiologique (d’après Tarran 2006).
98
Ils ont également observé que la libération des nucléotides était peu dépendante de l’intensité
du stress, en revanche elle semblait liée au changement d’état de stress de la cellule (statique
< > dynamique) (Tarran et al. 2006). L'ATP libéré entraîne une activation des canaux CLCA
ainsi qu'une inactivation des canaux ENaC, favorisant ainsi la sécrétion de NaCl et d'eau.
Cependant, sous l’action d’enzymes (ecto-nucléotidases et apyrases), l’ATP, l’ADP et l’AMP
sont dégradés en adénosine. Or dans les cellules CF, et contrairement aux cellules non-CF,
l’adénosine stimule les canaux ENaC (Boucher et al. 1986). D’après Tarran et al., dans les
cellules CF en conditions expérimentales dynamiques, l’inhibition du canal ENaC par l’ATP
« dominerait » l’activation d’ENaC par la voie de l’adénosine, suggérant une possible
hierarchie des récepteurs purinergiques (Tarran et al. 2006). Selon Tarran et al., cette
sécrétion de Cl- induite par l’ATP pourrait expliquer en partie les différences observées in
vitro sur des cultures de cellules épithéliales bronchiques CF (absence totale de transport de
mucus) (Matsui et al. 1998 ; Tarran et al. 2001) et les données in vivo chez de jeunes patients
CF (transport de mucus réduit mais existant) (Robinson et al. 2002).
Outre les altérations des transports ioniques (cf chapitre 3.5), il a été observé que les
voies aériennes des personnes atteintes de mucoviscidose étaient fréquemment infectées par
des pathogènes tel que P. aeruginosa. En effet, plus de 80 % des sujets atteints de
mucoviscidose ont les voies aériennes colonisées par ce pathogène. Deux types de
mécanismes son invoqués. 1/ Des mécanismes non spécifiques à P. aeruginosa et valables
pour toutes les bactéries. La diminution du volume du liquide de surface des voies aériennes
CF entraîne une altération de la clairance mucociliaire, augmentant ainsi le temps de présence
des pathogènes, leur permettant de léser l'épithélium. Les systèmes de défense non spécifiques
(lysozymes, défensines et NO) semblent altérés dans les voies aériennes de patients CF. La
diminution de l’expression de la forme inductible des NO synthases et de la production de NO
99
(cf chapitre 6) chez les patients CF, pourraient altérer le processus d’élimination non
spécifiques des pathogènes (Chmiel et Davis 2003). 2/ Des mécanismes spécifiques pour
l’infection et la colonisation à P. aeruginosa sont également invoqués. Des études ont montré
que P. aeruginosa est capable de se fixer à des cellules en voie de réparation au niveau de
l'épithélium lésé mais pas aux cellules de l'épithélium intact (De Bentzmann et al. 1996 ;
Plotkowski et al. 1999). D'autres travaux, controversés, suggèrent que P. aeruginosa pourrait
se fixer sur CFTR, au niveau du premier segment extracellulaire de la protéine, en entraînant
ainsi une internalisation du germe et sa destruction avec la cellule (Pier et al. 1996 et 1997).
L'absence de CFTR à la membrane, notamment dans le cas de la mutation ∆F508, perturberait
ainsi ce processus. Selon une autre hypothèse, la modification de la composition biochimique
des mucines chez les patients atteints de mucoviscidose permettrait une adhérence
préférentielle des certains germes comme P. aeruginosa (Carnoy et al. 1993 ; Zhang et al.
1995). Des études ont montré une adhérence plus importante sur les mucines salivaires de
sujets mucoviscidosiques que de sujets non mucoviscidosiques (Carnoy et al. 1993).
Entre autre, la diminution de la hauteur du PCL permettrait également au mucus, et
notamment aux mucines sécrétées MUC5AC et MUC5B, d’entrer en contact avec les mucines
présentes à la surface cellulaire, MUC1 et MUC4 (Knowles et Boucher 2002). Ces
interactions « colleraient » la couche muqueuse à l’épithélium des voies aériennes abolissant
la clairance par la toux. Ces interactions seraient renforcées par le pH acide de l’ASL observé
dans les voies aériennes CF (Boucher 2004). Malgré l’inefficacité de la clairance
mucociliaire, les cellules caliciformes et les glandes sous-muqueuses continueraient à sécréter
des mucines qui entraîneraient la formation de plaques de mucus statiques. L’épaississement
du mucus associé à l’augmentation de la consommation d’O2 de cellules épithéliales CF
créeraient des gradients d’O2 à l’intérieur de la couche de mucus (figure 31) entraînant la
100
formation de zones hypoxiques dans le mucus (Worlitzsch et al. 2002). Selon Worlitzsch et
al., des bactéries comme P. aeruginosa peuvent pénétrer dans la couche de mucus et migrer
vers les zones d’hypoxie (Worlitzsch et al. 2002). Dans ces conditions, la croissance
bactérienne serait ralentie par rapport à des conditions de normoxie. Toutefois, le stress
environnemental (milieu hypoxique) entraînerait une augmentation de la production
d’alginate, un facteur de virulence, par P. aeruginosa. Worlitzsch et al. suggèrent que
l’augmentation de la production d’alginate pourrait participer au passage du phénotype non
mucoïde à un phénotype mucoïde de P. aeriginosa (Worlitzsch et al. 2002).
Les infections bactériennes broncho-pulmonaires récurrentes entraînent une
inflammation locale intense, persistante avec un afflux massif de polynucléaires neutrophiles.
De nombreux facteurs chémo-attractants pour les neutrophiles sont retrouvés à des taux très
élevés dans les sécrétions bronchiques des patients atteints de mucoviscidose, au premier rang
desquels se situe l'interleukine-8 (IL-8). Les neutrophiles peuvent contribuer aux lésions
inflammatoires des voies aériennes par plusieurs mécanismes. Les neutrophiles libèrent des
protéinases, telles que l'élastase ou la collagénase. Ce relargage de protéases créerait des
déséquilibres protéases/anti-protéases qui pourraient également être amplifiés par une
diminution de l'efficacité des inhibiteurs (dégradation, inactivation ou diminution de sécrétion
des anti-protéases) (Meyer et al. 1991). Ces déséquilibres seraient responsables d'une
dégradation protéolytique de la matrice extracellulaire. L'intensité du déséquilibre
élastase/anti-élastase serait directement corrélée à la sévérité de l’atteinte pulmonaire (Bruce
et al. 1985).
101
Figure 31 : Schémas hypothétiques des événements menant aux infections chroniques à P. aeruginosa dans les voies aériennes CF (a) Epithélium des voies aériennes normales, une fine couche de mucus (vert clair) repose sur le liquide periciliaire (blanc). Les voies aériennes normales présentent une clairance mucociliaire efficace (représentée par le vecteur) et la consommation d’O2 est normale (QO2). (b-f) voies aériennes CF. (b) l’hyperabsorption de Na+ entraîne une diminution de la hauteur du liquide périciliaire (flèches verticales) et l’adhérence du mucus à l’épithélium de surface stoppe la clairance mucociliaire (flèche bidirectionnelle). (c) l’hypersécrétion constante de mucus (flèches) entraîne une augmentation de la hauteur de la couche de mucus. L’augmentation de la consommation en O2 génère des zones d’hypoxie dans la couche de mucus (zone bleue dans la barre). (d) P. aeruginosa pénètre dans la couche de mucus et gagne les zones d’hypoxie. (e) Les bactéries P. aeruginosa s’adaptent au milieu hypoxique avec une augmentation de la sécrétion d’alginate et la formation d’un biofilm. (f) Les neutrophiles ne sont pas capables d’éliminer le biofilm bactérien. L’augmentation du nombre de bactéries et la présence des neutrophiles entraînent la formation d’un mucus purulent hypoxique (d’après Worlitzsch et al. 2002).
102
Les infections chroniques entraînent donc une inflammation persistante dans les voies
aériennes CF. Toutefois, certains auteurs se sont interrogés sur le moment d’apparition de
l’inflammation bronchopulmonaire dans l’histoire naturelle de la mucoviscidose. Une étude a
retrouvé une augmentation du nombre des polynucléaires neutrophiles, de la concentration
d’IL-8 et des complexes élastase-α1-antiprotéase dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire
(BAL) d’enfants mucoviscidosiques de 1 à 12 mois, même indemnes d’infections
bronchopulmonaires (Khan et al. 1995). Cependant, ce résultat n’a pas été confirmé par un
autre travail portant sur des enfants mucoviscidosiques âgés de moins de 6 mois (Armstrong
et al. 1997). Dans une étude plus récente, Armstrong et al. ont comparé les lavages
bonchoalvéolaires de 70 patients CF âgés de 1,5 à 71 mois infectés ou non. Les auteurs ont
observé une augmentation de la concentration en IL-10 dans les BAL des patients infectés par
rapport aux patients non infectés. Les auteurs en concluent que l’infection précède et
maintient l’inflammation dans les voies aériennes CF (Armstrong et al. 2005). D’autres
travaux ont montré que les glandes sous-muqueuses CF présentaient une production plus
élevée d’IL-8 par rapport aux glandes non-CF en absence d’infection (Tabary et al. 1998).
Cette équipe a également démontré que le fluticasone propionate, un anti-inflammatoire
stéroidien, pouvait entraîner une diminution de la production d’IL-8 dans les glandes sous-
muqueuses CF (Escotte et al. 2003). Les auteurs ont montré que le fluticasone propionate
entraînait une augmentation de la concentration cytosolique de Iκ-Bα, un inhibiteur du facteur
de transcritpion NF-κB ; facteur qui intervient notamment dans la voie de régulation de gènes
codant pour des cytokines pro-inflammatoires. Dans leur étude, Escotte et al. ont également
montré que le fluticasone propionate entraînait une diminution de la concentration des sous-
unités α et β la kinase IKK, qui intervient dans l’activation de NF-κB. Les auteurs ont émis
l’hypothèse que l’augmentation de l’expression de la kinase IKK, et notament de IKK-β,
pourrait constituer un mecanisme possible pour expliquer la réponse inflammatoire dans les
103
voies aériennes CF. Dans une étude récente, Mall et al. ont observé que la surexpression
d’ENaC réduisait le volume du liquide périciliaire chez la souris (Mall et al. 2004). Les
auteurs ont également observé une inflammation (augmentation du nombre de neutrophiles et
de de la sécrétion de cytokines) en absence de toute infection. Ces observations suggèrent que
les altérations des transports ioniques dans les voies aériennes pourraient engendrer un
processus inflammatoire avant toute infection.
L’inflammation primitive et secondaire aux infections bronchopulmonaires joue un
rôle central dans les manifestations de la maladie en participant aux lésions des voies
aériennes.
3.7 Perspectives thérapeutiques
Après la découverte du gène CF, le développement de molécules capables de moduler
l’activité du canal CFTR normal et muté est devenu rapidement un point crucial dans la
compréhension du rôle physiologique de CFTR mais également dans l'optique de développer
des agents thérapeutiques. Une première génération d'activateurs de CFTR a été identifiée à
partir des études sur les voies de signalisation intracellulaire. Cependant, s'il a été démontré
qu'il était possible d'activer le canal CFTR porteur de la mutation ∆F508 à l'aide d'agents
pharmacologiques en 1999, très peu de ces molécules étaient capables de restaurer les
fonctions de CFTR muté en clinique. Avec le développement de nouvelles techniques (« high
throughput screening »), une seconde génération de composés pouvant activer CFTR et
104
potentiellement utilisable en clinique, est apparue (Chappe et al. 1998 ; Galietta et al. 2001 ;
Ma et al. 2002 ; Noel et al. 2006 ; pour revue Becq 2006).
Le screening de composés cycliques de la famille des benzoquinolizinium (MPB) a
permis de trouver des activateurs de la protéine CFTR normale mais également de la protéine
mutée G551D et de corriger le trafficking de CFTR-∆F508 (Becq et al. 1999 ; Dormer et al.
2001 ; Dérand et al. 2001 ; Stratford et al. 2003). Des études sur les relations
structures/activités à partir de ces composés ont permis d’identifier et de localiser des
groupements importants pour l’activation de CFTR : un groupe OH, un atome de chlore, un
groupement alkyl semblent essentiels pour l’activation de CFTR. Les mécanismes d’action
des composés MPB restent encore à déterminer. Cependant, il s’agirait d’une voie
indépendante de l’AMPc, des phosphatases, des kinases, des phosphodiestérases (Becq et al.
1999). Une interaction directe des MPB avec CFTR semble être à l’origine de l’activation ;
cependant la nature de cette interaction et le site de fixation des MPB restent à déterminer
(Becq et al. 2006).
Récemment, une étude a montré qu’une molécule prescrite dans le traitement de la
maladie de Gaucher, le miglustat (ou NB-DNJ), un inhibiteur de l’alpha-1,2-glucosidase,
permettait de restaurer une sécrétion de Cl- dans des lignées cellulaires épithéliales CF ∆F508
d’origine nasale et glandulaire (JME/CF15 et CFKM4). Le NB-DNJ interviendrait au niveau
de l’interaction calnexine/CFTR-∆F508 (Norez et al. 2006). La même équipe vient de
montrer par la technique de patch-clamp et d’efflux d’iodure dans des lignées cellulaires
(Calu-3, CHO), que des dérivés pyrrolo[2,3-b]-pyrazines (dérivés RP) étaient capables
d’activer la protéine CFTR normale et portant les mutations ∆F508 etG551D (Noel et al.
2006). D’après cette étude, les dérivés RP activent CFTR avec une très forte affinité (< 1µM)
105
et par une voie indépendante de l’AMPc. L’activation pharmacologique de la protéine CFTR
mutée semble donc réalisable, toutefois le développement de nouveaux composés mais
surtout la compréhension de la relation structure/activité devront être poursuivis. Ces
molécules peuvent constituer un réservoir important dans l'optique d'un traitement
pharmacologique de la mucoviscidose. Ces composés devront également suivre la voie de
développement en vue d’une application clinique.
Afin d’augmenter le volume de l’ASL, dont la déplétion est à l’origine de l’atteinte
pulmonaire, des études portant sur la restauration du volume du PCL ont été entreprises. La
technique la plus utilisée a été l’inhalation de solutions salines normo ou hypertoniques
devant induire une sécrétion d’eau (Boucher 2004). Si des études ont montré une accélération
de la clairance mucociliaire chez des patients CF (Robinson et al. 1996 ; 1997), l’inhalation
de solutions salines hypertoniques semble avoir des effets limités dans le temps. Récemment,
une équipe a étudié les effets de l’inhalation de 7ml d’une solution hypertonique 2 fois par
jour pendant 48 semaines chez 164 patients CF (Elkins et al. 2006). Cette étude montre que
l’inhalation d’une solution hypertonique sur une longue période améliore la fonction
pulmonaire et diminue la fréquence des exacerbations infectieuses.
Des approches alternatives ont également été développées. Celles-ci consistent à
déposer à la surface des voies aériennes des composés qui ne sont pas activement transportés
et faiblement absorbés (Boucher 2004). Robinson et al. ont montré, in vitro, que le mannitol
pouvait restaurer le volume de l’ASL pendant plusieurs heures. Cependant, la même équipe a
montré que in vivo le mannitol avait une action très limitée dans le temps (environ 20
minutes) sur la clairance mucociliaire (Robinson et al. 1999).
106
Toujours dans l’optique de restaurer le volume de l’ASL, des études ont montré que
l’application de nucléotides triphosphates (par exemple l’UTP ou les dérivés de l’UTP) à la
face apicale de cellules épithéliales nasales en culture, entraînait une inhibition de l’absorption
de Na+ et stimulait une sécrétion de Cl- dépendante du Ca2+ (Knowles et al. 1991 ; Mall et al.
2000 ; Tarran et al. 2006). Le développement d’analogues de ces nucléotides a permis
d’améliorer l’efficacité de ces composés notamment par une meilleure résistance à
l’hydrolyse, comme le composé INS37217 (Yerxa et al. 2002). Ce composé peut être
administré par voie d’inhalation ; lors d’essai de phase I, il a montré qu’il n’était pas toxique.
Des essais de phases III sont en cours testant notamment l’efficacité de ce composé dans
l’amélioration de la fonction pulmonaire chez les malades CF (Boucher 2004).
L’utilisation d’inhibiteur du canal Na+, ENaC, comme l’amiloride, a également
été envisagée. En effet, dans le pseudohypoaldostéronisme (PHA), les canaux ENaC sont
absents et les patients présentent une augmentation du volume de l’ASL qui est compensée
par une accélération de la clairance mucociliaire (Kerem et al. 1999). Cependant, des études
sur les propriétés pharmacodynamiques de l’amiloride ont montré que ce produit avait une
demi-vie relativement courte (20/30 minutes). Une étude clinique a par ailleurs démontré que
l’amiloride n’entraînait pas d’amélioration de la fonction pulmonaire (VEMS, CVF) ou de
diminution de la fréquence des exacerbations chez des patients CF (Graham et al. 1993).
En conclusion, les progrès dans la connaissance de la pathogenèse de la
mucoviscidose ont permis de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Le
développement de nouvelles molécules activatrices de CFTR ou de sécrétions de Cl-
alternatives ainsi que les avancées de la thérapie génique laissent supposer que le traitement
de la mucoviscidose pourrait être amélioré dans les prochaines années. En effet, plus d’une
107
vingtaine d’essais cliniques, portant sur la restauration des transports ioniques, des thérapies
anti-inflammatoire et anti-infectieuse,…, sont actuellement en cours. Ces études sont
recensées sur le site www.cff.org (figure 32).
108
Figure 32 : Etat des lieux des essais cliniques en cours dans le cadre de la mucoviscidose (d’après www.cff.org).
109
4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS
110
4.1 Etude de l’expression de CFTR dans les voies
aériennes distales humaines
La mucoviscidose est une maladie qui affecte plusieurs organes, cependant c’est
l'atteinte pulmonaire qui est responsable de la grande majorité de la morbidité et de la
mortalité. En effet, les infections bactériennes récurrentes, l'inflammation et l'obstruction des
voies aériennes provoquent à terme la destruction du tissu pulmonaire (cf chapitre 3).
Cependant tous les étages de l'arbre aérien ne sont pas touchés avec la même sévérité,
contrairement aux bronches et aux bronchioles, les alvéoles ne semblent pas jouer un rôle
majeur dans l’évolution de la maladie.
Afin de mieux comprendre la pathogenèse de la mucoviscidose, l’expression et la
distribution de la protéine CFTR dans les voies aériennes ont été étudiées. Dans les voies
aériennes proximales, l’expression de la protéine CFTR est bien renseignée. Des études ont
démontré que les glandes sous-muqueuses constituaient le principal site d’expression de la
protéine CFTR et que les cellules ciliées de l’épithélium de surface bronchique exprimaient la
protéine CFTR à la face apicale. Cependant, les différentes études portant sur l'expression de
CFTR dans les voies aériennes distales (épithéliums de surface bronchiolaire et alvéolaire) ont
produit des résultats discordants. En effet selon les différentes études, l’expression de la
protéine CFTR varie d’une absence de marquage à un marquage prononcé dans les
épithéliums bronchiolaire et alvéolaire.
Le but de ce travail a donc été de décrire l'expression de CFTR dans les épithéliums
bronchiolaires et alvéolaires humain non-CF. Pour réaliser cette étude, nous avons utilisé
111
deux anti-corps anti-CFTR (MAB25031 et MAB1660), dont la spécificité et la sensibilité ont
été démontrées dans des études antérieures.
4.2 Effets du monoxyde d'azote (NO) sur les
transports ioniques transépithéliaux dans les voies
aériennes humaines proximales et distales
mucoviscidosiques et non mucoviscidosiques
Le monoxyde d’azote (NO) a été identifié comme une molécule régulatrice importante
dans la physiologie du poumon humain, intervenant dans la vasodilatation, dans la réponse
inflammatoire, comme neurotransmetteur,… (cf chapitre 6). Le NO, qui est produit par les
NO synthases (NOS) dont les trois isoformes ont été retrouvées dans le poumon, agit
notamment en stimulant la guanylate cyclase soluble (GCs) entraînant la formation d’un
second message, la guanosine 3’, 5’ monophosphate cyclique (GMPc).
Il a été proposé que la concentration en NO dans l’air exhalé reflétait l’état
d’inflammation des voies aériennes. En effet, des études ont montré une augmentation de la
production de NO durant les exacerbations chez des patients asthmatiques, les rhinites
allergiques ou le syndrome de détresse respiratoire aigu. Cependant, il a été démontré que la
concentration de NO dans l’air exhalé était inférieure chez les personnes mucoviscidosiques
par rapport aux sujets normaux. Plus récemment, des études ont montré que le NO pouvait
moduler (effets activateur et/ou inhibiteur) les transports ioniques dans les voies aériennes
112
humaines. Bien que certaines études aient produit des résultats discordants, ces résultats
suggèrent que le NO peut jouer un rôle important dans le contrôle des transports ioniques
transépithéliaux et donc dans la clairance mucociliaire. La diminution de la concentration en
NO dans les voies aériennes CF pourrait en effet participer aux perturbations dans les
transports d’ions et de fluide caractéristiques de la mucoviscidose.
Les effets du NO sur les transports ioniques transépithéliaux dans les voies aériennes
bronchiques et bronchiolaires non-CF et CF restent encore peu connus. Etant donné
l’importance des transports d’ions et de fluide dans les voies aériennes humaines et leurs
implications dans l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose, nous nous sommes intéressés
aux effets du NO sur les transports ioniques dans les voies aériennes proximales et distales
non mucoviscidosiques et mucoviscidosiques. Nous avons donc exposé des cultures primaires
de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires non-CF et CF à un donneur de NO.
Nous avons également exploré le mécanisme d’action du NO en modulant la concentration
intracellulaire du GMPc dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-
CF humaines.
4.3 Détermination du pourcentage de cellules non-CF
permettant de normaliser les fonctions épithéliales d'une
culture primaire de cellules épithéliales bronchiques CF
113
Le clonage du gène CF a suscité des espoirs de thérapie génique pour lutter contre la
mucoviscidose. Des études de transfert de gène ont donc été réalisées afin de tester la
faisabilité de la thérapie génique dans le cadre de cette maladie. Au niveau de l'épithélium
pulmonaire, différents vecteurs (adénovirus, rétrovirus, lentivirus,…), différents supports
(cultures primaires ou lignées cellulaires) et diverses MOI (multiplicity of infection, nombre
de virus par cellules) ont été utilisés (cf chapitre 7). Il ressort de ces différentes études qu'un
pourcentage de cellules relativement faible (<20%) exprimant la protéine CFTR sauvage
permettrait de normaliser les transports de Cl-. Cependant, il semble qu'un pourcentage plus
important de cellules devra être corrigé afin de restaurer les transports de Na+.
Le but de ce travail a donc été de déterminer si un faible pourcentage (10%) de cellule
exprimant une protéine CFTR normale permettait de normaliser à la fois les transports de Na+
et de Cl-. Nous avons donc réalisé trois types de culture primaire de cellules épithéliales
bronchiques humaines : 1/ 100% non-CF, 2/ 100% CF et 3/ cultures mixtes comprenant 90%
de cellules bronchiques CF et 10% de cellules bronchiques non-CF (« co-cultures »). La
prolifération cellulaire ainsi que l'apoptose ont été évaluées au cours du temps de culture afin
de s'assurer que le pourcentage initial était conservé. Les propriétés bioélectriques des trois
types de cultures cellulaires ont été étudiées en chambres dites de Ussing. Nous avons
également entrepris le dosage d'une cytokine pro-inflammatoire, l’IL-8 dont la sécrétion est
exagérée dans la mucoviscidose, dans le surnageant des différents types de cultures afin de
déterminer si d’autres fonctions cellulaires étaient normalisées dans les co-cultures.
114
5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR DANS LES DANS LES DANS LES DANS LES VOIESVOIESVOIESVOIES
AÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNES HUMAINHUMAINHUMAINHUMAINESESESES
115
5.1 Introduction
CFTR est une protéine membranaire principalement exprimée dans les tissus
épithéliaux dans lesquels elle régule plusieurs fonctions comme les transports transépithéliaux
d’eau et d’ions. CFTR est un canal chlorure activé par l’AMPc mais cette protéine intervient
également dans la régulation d’autres canaux comme le canal sodique sensible à l’amiloride
(ENaC) ou d’autres canaux chlorures (Hryciw et Guggino 2000 ; Kunzelmann et al. 1999 ;
Schreiber et al. 1997 ; Schwiebert et al. 1999). Les mutations du gène CF qui code pour la
protéine CFTR entraînent la mucoviscidose ce qui démontre le rôle crucial de cette protéine
au niveau des épithéliums (Riordan et al. 1989). Bien que la mucoviscidose affecte plusieurs
organes, l’atteinte pulmonaire est responsable de la majorité de la mortalité observée dans la
mucoviscidose. En effet, des infections bactériennes récurrentes, l’inflammation et
l’obstruction des voies aériennes provoquent la destruction du tissu pulmonaire. Dans les
bronches et les bronchioles CF, le défaut de sécrétion chlore activée par l’AMPc associée à
une hyperabsorption de sodium entraînent une diminution de l’ASL perturbant la clairance
mucociliaire et favorisant ainsi la colonisation bactérienne (Blouquit et al. 2006 ; Boucher et
al. 2004 ; Tarran et al. 2005). Contrairement aux bronches et aux bronchioles, les alvéoles ne
semblent pas jouer un rôle majeur dans l’évolution de la maladie (Boucher et al. 2004 ; Davis
et al. 1996).
Malgré les avancées au niveau génétique, moléculaire ou dans la physiopathologie de
la mucoviscidose et particulièrement au niveau pulmonaire, les études sur l’expression de la
protéine CFTR notamment au niveau du tissu pulmonaire restent discordantes. Selon les
116
différentes études, l’expression de CFTR oscille entre absence et forte présence au niveau de
l’épithélium de surface des bronches, des glandes sous muqueuses, de l’épithélium
bronchiolaire et alvéolaire. Crawford et al. n’ont pas pu détecter de marquage par
immunocytochimie dans les cellules épithéliales dans aucun des différents étages pulmonaires
étudiés (bronches, bronchioles et alvéoles) (Crawford et al. 1991). Dans une autre étude,
Engelhardt et al. ont observé par immunocytochimie, un léger marquage au niveau de
l’épithélium de surface ainsi qu’un intense marquage au niveau des glandes sous-muqueuses
(Engelhardt et al. 1992). Des résultats similaires ont été obtenus par Tizzano et al. par
hybridation in situ dans des poumons de nouveaux-nés (Tizzano et al. 1994a). Jacquot et al.
ont également observé un important marquage de CFTR au niveau des glandes sous
muqueuses de la trachée humaine (Jacquot et al. 1993). Cependant, dans une étude récente,
Kreda et al. n’ont observé qu’un faible voire une absence de marquage dans les glandes sous-
muqueuses aussi bien au niveau de l’ARNm que de la protéine CFTR (Kreda et al. 2005). Au
niveau distal, Tizzano et al. ont démontré une forte expression de CFTR au niveau de
l’épithélium bronchiolaire mais pas au niveau de l’épithélium alvéolaire (Tizzano et al.
1994a). Kreda et al. ont observé une diminution de l’expression de CFTR le long des voies
aériennes jusqu'à une faible voire une absence d’expression au niveau alvéolaire (Kreda et al.
2005). Ces résultats sont discordants avec les travaux d’Engelhardt et al., qui ont démontré la
présence d’ARNm de CFTR ainsi que de la protéine dans une sous population de cellules
épithéliales à la fois au niveau bronchiolaire et au niveau alvéolaire (Engelhardt et al. 1994).
Récemment, Fang et al. ont mis en évidence par RT-PCR l’expression de CFTR au niveau de
pneumocytes de type II humains ; le niveau des transcrits de CFTR est comparable à celui
reporté au niveau des cellules épithéliales bronchiques (Fang et al. 2006). Ces résultats
discordants sur l’expression de CFTR dans les voies aériennes non CF peuvent en partie être
dus au faible niveau d’expression de la protéine (Kartner et al. 1992 ; Trapnell et al. 1991)
117
mais également aux différentes techniques utilisées et notamment aux différents anti-corps
utilisés.
La connaissance de la distribution de la protéine CFTR dans les voies aériennes
demeure importante pour une meilleure appréhension de l’atteinte pulmonaire de la
mucoviscidose mais également pour émettre de nouvelles hypothèses. Le but de cette étude
est de décrire l’expression de CFTR dans les épithéliums bronchique, bronchiolaire et
alvéolaire humain non CF. Pour réaliser cette étude, nous avons utilisé deux anti-corps anti-
CFTR MAB25031 (Mab24-1) et MAB1660 (Mab13-1). Des études antérieures ont démontré
la haute spécificité et sensibilité de ces deux anti-corps pour l’étude de CFTR parmi un panel
d’anti-corps anti-CFTR (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Coucet et al. 2003). Nous avons
également comparé le niveau d’expression de CFTR dans les bronches, les bronchioles et les
alvéoles obtenues à partir d’un même patient.
118
5.2 Matériels et méthodes
5.2.1 Origine des prélèvements pulmonaires
Les échantillons de tissu ont été obtenus à partir des poumons de 27 patients (23
hommes) non CF opérés pour la plupart pour des cancers pulmonaires. Tous ces protocoles
ont été effectués en accord avec la législation française en vigueur. Les échantillons ont été
sélectionnés sur l’absence d’anomalies « grossières ». L’âge des patients de cette étude est
compris entre 46 et 80 ans (moyenne d’âge ± SE : 61,3 ± 2,1 ans). Dix-sept patients étaient
fumeurs, 2 non fumeurs et pour 8 d’entre eux le statut tabagique n’était pas renseigné. Des
échantillons de bronches, de bronchioles et de tissus alvéolaires ont été obtenus pour chaque
patient. Les bronches ont été identifiées sur les bases d’un diamètre compris entre 3 et 7 mm
et sur la présence de cartilage. Les bronchioles ont été identifiées sur les bases d’un diamètre
égal ou inférieur à 2mm et sur l’absence de cartilage. Les échantillons alvéolaires ont été
obtenus à partir de fragments de parenchyme d’environ 1cm3. Vingt-quatre patients sur les 27
ont permis d’obtenir un échantillon de bronches, de bronchioles et d’alvéoles et 3 patients ont
permis d’obtenir 2 échantillons de chaque. Les prélèvements ont été fixés aléatoirement dans
du formol 10 % ou dans du liquide de Bouin puis inclus en bloc de paraffine.
5.2.2 Coloration et analyse histologique des prélèvements
119
Les coupes des prélèvements fixés en paraffine, ont été colorées par l’hémalun de
Mayer et l'éosine dans la coloreuse Autostainer XL (Leica, Rueil Malmaison, France), puis
elles ont été montées automatiquement par une colleuse (RCM 90, Tech-Inter, Maurepas,
France) qui permet de coller les lamelles automatiquement sur les lames. Les lames ont
ensuite été examinées sous microscope optique (Olympus, Le Pecq, France). Nous n'avons
conservé, pour l'étude immunohistochimique, que les prélèvements dont les épithéliums
bronchique, bronchiolaire et alvéolaire étaient conservés, d'aspect histologique normal, et
nous avons éliminé les prélèvements comportant un épithélium érodé, ou hypersécrétant, ou
présentant une métaplasie malpighienne, ou une hyperplasie des cellules basales, ou des
remaniements inflammatoires (Engelhardt et al. 1992).
5.2.3 Anticorps anti-CFTR
MAB 25031 est un anticorps monoclonal de souris de type IgG2a. Il est dirigé contre la
partie C-terminale de CFTR et plus précisément contre les acides aminés 1377-1480,
correspondant aux exons 23 et 24. Il a d’abord été commercialisé par Genzyme (Brezillon et
al. 1995 ; Dupuit et al. 1995 ; Brezillon et al. 1997 ; Dray-Charrier et al. 1999) puis par R&D
Systems Europe (Lille, France) (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Castillon et al. 2002 ; Doucet
et al. 2003 ; Wioland et al. 2000). MAB1660 est un anticorps monoclonal de souris de type
IgG1. Il est dirigé contre le domaine R de CFTR, et plus précisément contre les acides aminés
590-830, correspondant à l'exon 13. Il est commercialisé par R&D Systems Europe (Lille,
France) (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Doucet et al. 2003).
120
5.2.4 Procédures d'immunomarquage
Pour chaque patient, l’étude immunohistochimique a été réalisée dans le même temps
pour les 3 étages. Les prélèvements ont été placés sur des lames Super Frost Plus pré-traitées,
puis séchés durant toute une nuit à 37° dans une étuve. Les lames ont ensuite été
déparaffinées dans 3 bains de toluène pendant 10 minutes chacun puis réhydratées dans 3
bains successifs d’alcool (100 %) pendant 5 minutes par bain, et rincées dans de l’eau
courante pendant 5 minutes. Les lames ont ensuite été placées dans un tampon de citrate
10mM à pH=6, chauffées au bain marie à 95°C, pendant 40 minutes, puis refroidies pendant
20 minutes et rincées au PBS. Pour éliminer l’activité endogène de la peroxydase, quelques
gouttes d’H2O2 à 0,03% (du kit EnvisionTM) ont été appliquées sur les lames pendant 5
minutes à température ambiante pour MAB25031, 30 minutes pour MAB1660. Les lames ont
été rincées au PBS puis au TBS (Tris-Buffered Saline) (50mM TRIS, 150mM NaCl, pH= 7,6)
pendant 5 minutes pour MAB25031 et 10 minutes pour MAB1660.
Sur chaque lame, ont été déposés 200 µl de l’anticorps primaire MAB25031 à
concentration de 1/200ème pendant 1 heure et à température ambiante, ou 200 µl de l’anticorps
primaire MAB1660 à concentration 1/100ème pendant toute une nuit à 4°C. Les lames ont été
ensuite rincées au TBS pendant 10 minutes pour MAB25031, 30 minutes pour MAB1660.
Deux cent µl de l'anticorps secondaire, un anticorps de lapin dirigé contre les anticorps de
souris couplé à un complexe peroxydasique (du kit EnvisionTM) ont ensuite été appliqués
pendant 30 minutes, également à température ambiante. Après avoir été rincées au TBS, les
lames ont été exposées à une solution contenant le chromogène diaminobenzidine
(EnvisionTM+ system, DakoCytomation, Trappes, France) pendant 5 minutes à température
ambiante selon les recommandations du fabricant. Les lames ont été rincées au TBS pendant 5
121
minutes, puis contre-colorées à l’hémalun de Mayer pendant 1 minute. Les lames ont enfin été
montées par la colleuse.
Deux types de contrôles négatifs ont été réalisés pour chaque prélèvement : pour l’un
des contrôles négatifs, l’anticorps primaire n’a pas été appliqué sur la lame; pour l’autre
contrôle négatif, nous avons utilisé, à la place de l’anticorps primaire une immunoglobuline
non spécifique de souris (Ig2a pour MAB25031, et Ig1 pour MAB1660), exactement dans les
mêmes conditions que pour l’anticorps correspondant (même concentration et même temps
d’application) et au même moment.
Nous avons considéré comme témoin positif l’épithélium des glandes séreuses visibles
dans la muqueuse bronchique. En effet, les cellules séreuses, qui forment ces glandes,
expriment très fortement la protéine CFTR (Engelhardt et al. 1992 ; Puchelle et al. 1992 ;
Wioland et al. 2000).
5.2.5 Analyse statistique
Chaque section a été observée par deux observateurs indépendants qui ont évalués
semi-quantativement le niveau d'expression de la protéine dans l'épithélium de surface. La
notation de l'intensité du marquage a varié de 0 à 4 (0 pour une absence de marquage, 1 pour
un marquage léger, 2 pour un marquage modéré, 3 pour un marquage intense et 4 pour un
marquage très intense). Cette valeur a été considérée comme une variable quantitative pour
l’anayse statistique, pour laquelle nous avons utilisé des tests non paramètriques univariés.
Nous avons comparé les scores moyens des mesures entre les observateurs, les anticorps, les
122
fixateurs et la région du poumon. Pour tester l’effet des fixateurs, nous avons utilisé le test de
Mann-Whitney et pour les autres critères (observateurs, anticorps et région du poumon), nous
avons utilisés le test de Wilcoxon. Nous avons considéré comme significatif un p < 0,05.
L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel STATA (StataCorp LP, USA).
123
5.3 Résultats
Trente "lots" de bronches, bronchioles et d'alvéoles ont été étudiés au cours de ce
travail, 21 ont été fixés dans le formol et 9 ont été fixés dans le liquide de Bouin. L'analyse
histologique des échantillons sélectionnés n'a pas révélé d'anomalies tissulaires telles qu'une
inflammation, une hyperplasie des cellules basales, une métaplasie malpighienne ou encore
une érosion épithéliale. Les bronches étaient caractérisées par la présence de cartilage, de
glandes sous muqueuses et l'épithélium était composé de cellules ciliées, de cellules
caliciformes et de cellules basales. L'épithélium bronchiolaire était formé de cellules ciliées,
de cellules caliciformes et la hauteur de l'épithélium était inférieure à l'épithélium bronchique.
L'épithélium alvéolaire contenait des pneumocytes de type I (PI) et II (PII).
5.3.1 Expression de CFTR
Nous avons observé un marquage plus fort pour les prélèvements fixés dans le liquide
de Bouin par rapport aux prélèvements fixés dans le formol (p < 0,05) mais cette différence
était faible et constante le long des voies aériennes (Tableau 3). L'anticorps MAB25031 a
marqué les tissus bronchiques et bronchiolaires, principalement au niveau des cellules ciliées
(figure 33). Au niveau bronchique et bronchiolaire, les 2 observateurs ont remarqué que
l'intensité du marquage est variable entre les cellules d'un même prélèvement et que cette
variation se retrouve avec les 2 types de fixateurs utilisés. Nous avons observé un marquage
au niveau des cellules basales et des cellules caliciformes. Dans les glandes séro-muqueuses,
124
les cellules séreuses sont marquées contrairement aux cellules à mucus (figure 33). Au niveau
alvéolaire, les PI et les PII sont clairement marqués (figure 33).
MAB1660 a également marqué les cellules ciliées dans les épithéliums bronchiques et
bronchiolaires ainsi que les cellules séreuses des glandes séro-muqueuses. Contrairement à
MAB25031, MAB1660 a marqué les cellules nerveuses, musculaires et endothéliales (figure
34). Les PI et les PII sont également marqués par l'anticorps MAB1660.
5.3.2 Etude comparative
Le tableau 3 résume les intensités de marquage de CFTR par MAB25031 et
MAB1660 dans les 3 régions du poumon étudiées selon chaque observateur et selon chaque
fixateur. Nous n'avons pas observé de différence significative entre les observateurs et entre
les anticorps. L'évaluation moyenne de l'intensité du marquage de CFTR est similaire dans les
bronches et les bronchioles. Cependant, dans les alvéoles l'évaluation de l'intensité est
inférieure par rapport aux régions bronchiques (p < 0,02) et bronchiolaires (p < 0,01).
125
Observateur 1 Observateur 2
Formol Liquide de Bouin
Formol Liquide de Bouin
Epithélium bronchique 2,0 ± 0,2 2,4 ± 0,5 2,2 ± 0,2 2,7 ± 0,3
Epithélium bronchiolaire 2,2 ± 0,2 2,6 ± 0,4 2,1 ± 0,2 3,0 ± 0,2 MAB25031
Epithélium alvéolaire 2,5 ± 0,1 2,7 ± 0,3 2,3 ± 0,1 3,1 ± 0,3
Epithélium bronchique 2,2 ± 0,2 3,4 ± 0,3 2,1 ± 0,2 3,1 ± 0,2
Epithélium bronchiolaire 2,2 ± 0,2 2,8 ± 0,4 2,2 ± 0,2 2,7 ± 0,3 MAB1660
Epithélium alvéolaire 1,6 ± 0,2 1,1 ± 0,2 1,6 ± 0,2 1,8 ± 0,2
Tableau 3 : Intensité du marquage obtenu avec MAB25031 et MAB1660 pour chaque observateur, chaque étage pulmonaire et chaque fixateur (moyenne ± SEM, n = 21 pour le formol et 9 pour le liquide de Bouin pour chaque étage pulmonaire et pour chaque anticorps).
126
Figure 33 : Détection immunohistochimique de CFTR dans A) épithélium de surface bronchique, B) glandes séro-muqueuses bronchiques, C) épithélium bronchiolaires et D), épithélium alvéolaire, avec l’anticorps MAB25031 sur des prélèvements fixés en formol (barre = 50µm).
D C
B A
127
Figure 34 : Détection immunohistochimique de CFTR dans A) épithélium de surface bronchique, B) glandes séro-muqueuses bronchiques, C) épithélium bronchiolaires et D), épithélium alvéolaire, avec l’anticorps MAB1660 sur des prélèvements fixés en formol (barre = 50µm).
D
B A
C
128
5.4 Discussion
Cette étude apporte de nouvelles informations concernant l’expression de CFTR dans
le poumon humain adulte. Malgré l’apport des études fonctionnelles démontrant l’expression
de CFTR dans les régions bronchiques, bronchiolaires et alvéolaires, il n’existe pas de
consensus sur la localisation de CFTR dans l’épithélium respiratoire (Boucher 1994 ;
Blouquit et al. 2002 ; Blouquit et al. 2006 ; Fang et al. 2006). L’existence d’anticorps anti-
CFTR spécifiques possédant une bonne sensibilité, nous a permis d’étudier l’expression de
CFTR dans le poumon humain des bronches jusqu’aux alvéoles. Chez les personnes non-CF,
nous avons observé une expression de CFTR dans l’épithélium de surface des bronches, des
bronchioles, dans les tissus alvéolaires et dans les glandes bronchiques. Nous avons
également observé que CFTR est exprimé 1) principalement au niveau des cellules ciliées et
des cellules glandulaires séreuses dans l’épithélium bronchique, 2) principalement au niveau
des cellules ciliées dans l’épithélium bronchiolaire ainsi qu’au niveau des tissus alvéolaires
dans les PI et les PII. Nous n’avons pas observé de différence d’intensité de l’expression de
CFTR entre les étages bronchiques et bronchiolaires contrairement aux alvéoles où nous
avons observé une légère diminution de l’intensité.
La qualité d’une étude immunohistochimique dépend largement de la sensibilité et de
la spécificité des anticorps ainsi que du protocole, comme la procédure de fixation. Nous
avons donc effectué des études préliminaires (résultats non montrés) en faisant varier la
dilution de l’anticorps primaire ou le temps d’incubation en partant des recommandations du
fabricant et ceci afin d’optimiser le protocole. L’étape de fixation des tissus constituant un
point clé dans la procédure nous avons utilisé deux types de fixateurs (le formol et le liquide
129
de Bouin). Nous avons obtenu un marquage plus intense sur les tissus fixés dans le liquide de
Bouin par rapport à ceux fixés dans le formol. Nous avons également utilisé deux anticorps
anti-CFTR différents reconnaissant des épitopes différents de CFTR. Ces deux anticorps ont
déjà été utilisés par le passé dans des études qui ont démontré leur spécificité et leur
sensibilité (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Castillon et al. 2002 ; Dupuit et al. 1995).
Cependant, une étude a révélé que MAB25031 avait une meilleure sensibilité que MAB1660
dans le tissu nasal humain (Doucet et al. 2003). Notre étude, en étant consistante avec les
études fonctionnelles, confirme la haute sensibilité de ces 2 anticorps. Les études
fonctionnelles, plus sensibles que les études immunohistochimiques, ont en effet apporté des
preuves de l’expression de CFTR dans les épithéliums bronchiques, bronchiolaires et
alvéolaires (Blouquit et al. 2002 ; Boucher 1994 ; Boucher 2004 ; Fang et al. 2006). Nous
avons observé que MAB1660 dans les voies aériennes marquait l’épithélium respiratoire mais
également les cellules musculaires, nerveuses et endothéliales. Cependant des études ont
démontré l’expression de CFTR dans les cellules musculaires (Robert et al. 2004), dans les
cellules nerveuses (Mulberg et al. 1995 ; Weyler et al. 1999) et dans les cellules endothéliales
(Tousson et al. 1998).
Plusieurs études ont rapporté le fait que la distribution et l’intensité du marquage de
CFTR était variable entre les individus normaux (Kreda et al. 2005). Nous abondons dans ce
sens également. Les explications d’une telle hétérogénéité demeurent toutefois inconnues.
Cependant, elle pourrait être expliquée par la faible expression de CFTR dans les cellules
épithéliales des voies aériennes (Kartner et al. 1992 ; Trapnell et al. 1991 ; Trezise et
Buchwald 1991), par des facteurs environnementaux ou par le degré de différenciation,
d’inflammation et de remodelage de l’épithélium (Brezillon et al. 1997 ; Dupuit et al. 1995).
Afin de réduire l’impact de ces facteurs, nous avons sélectionné des tissus
130
morphologiquement normaux et pour comparer l’expression de CFTR dans les 3 régions
pulmonaires, nous avons utilisé des échantillons provenant du même patient. La plupart des
patients qui ont fourni les prélèvements permettant cette étude sont fumeurs. Une étude
récente a démontré que l’exposition in vitro à des extraits de fumée de cigarette diminuait
l’expression de CFTR au niveau du gène, de la protéine et au niveau fonctionnel dans une
lignée cellulaire épithéliale respiratoire humaine (Calu-3) (Cantin et al. 2006). De plus, la
mesure in vivo de la différence de potentiel nasal chez les fumeurs est consistante avec des
troubles de CFTR (diminution de la réponse à un milieu sans chlore et à l’isoprotérénol
comparativement à des non fumeurs). Le statut tabagique des patients est peu susceptible
d’avoir affecté nos résultats étant donné que nous avons observé un marquage dans les
épithéliums de chaque patient, cependant nous ne pouvons pas exclure une possible
diminution de l’intensité du marquage de CFTR due au tabagisme des patients ce qui pourrait
participer à la variabilité du marquage.
L'expression de CFTR a clairement été mise en évidence dans l'épithélium bronchique
et principalement au niveau des cellules ciliées, et dans les glandes séromuqueuses,
principalement dans les cellules séreuses. Les 2 anticorps ont donné les mêmes résultats. Ces
profils d'expression sont en accord avec les études fonctionnelles. Les défauts de régulation
du transport de chlore porté par CFTR ont été mis en évidence dans l'épithélium de surface
bronchique ainsi que dans les glandes trachéobronchiques, apportant la preuve du rôle de
CFTR dans ces structures pulmonaires (Boucher 1994 ; Yamaya et al. 1991). Nous avons pu
détecter une expression de CFTR dans les cellules de l'épithélium de surface, même si selon
Trapnell et al. le gène CF est exprimé à un faible niveau dans les cellules épithéliales
bronchiques (1-2 transcrits par cellule) (Trapnell et al. 1991). Ceci indique soit que nos
anticorps sont suffisamment sensibles pour détecter un tel niveau d'expression soit que CFTR
131
est exprimé à un plus fort niveau que précédemment démontré. La plupart des études
précédentes ont démontré que les glandes séromuqueuses étaient le principal site d'expression
de CFTR (ARNm et protéine) chez les personnes non CF (Jacquot et al. 1993 ; Tizzano et al.
1994b). Le marquage de CFTR se retrouvait au niveau des cellules séreuses (Jacquot et al.
1993 ; Tizzano et al. 1994b). Notre étude confirme donc que l'épithélium de surface et que les
glandes séromuqueuses dans les bronches sont les principaux sites d'expression de CFTR dans
le poumon adulte humain.
Nous avons également observé un net marquage au niveau de l'épithélium de surface
bronchiolaire et principalement au niveau des cellules ciliées. L'expression de CFTR au
niveau des bronchioles était attendue étant donné que les bronchioles sont clairement
impliquées dans la pathogenèse pulmonaire dans la mucoviscidose. Chez les enfants, la
mucoviscidose est premièrement une maladie des voies aériennes distales. Les études de
poumon de jeunes patients CF ont démontré que les voies aériennes distales sont caractérisées
par des obstructions causées par du mucus et par des bronchiolectasies (Hamutcu et al. 2002 ;
Long et al. 2004 ; Martinez et al. 2005 ; Wood et al. 1976). De plus, des études ont montré
que les obstructions causées par le mucus affectent plus sévèrement les voies aériennes
distales que les voies aériennes proximales (Mellins 1969 ; Ranganathan et al. 2004). Une
autre étude a montré que les bronchioles non CF sont capables d'une sécrétion de Cl- et de
fluide dépendante de CFTR (Blouquit et al. 2002). Enfin, une autre étude a démontré des
défauts de sécrétion de Cl- et de fluide dans les bronchioles CF dus aux dysfonctionnements
de CFTR (Blouquit et al. 2006).
L'étude comparative réalisée indique que le niveau d'expression de CFTR est similaire
dans les épithéliums bronchiques et bronchiolaires. Les transports d'eau et d'ions ont été
132
étudiés dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires
obtenues à partir du même patient. Les sécrétions de Cl- et de fluide en réponse à l’AMPc
étaient significativement supérieures dans les cultures bronchiolaires par rapport aux cultures
de cellules épithéliales bronchiques (Blouquit et al. 2006). Nous avons donc émis l'hypothèse
que le niveau d'expression de CFTR dans les voies aériennes distales était supérieur au niveau
d'expression dans les voies aériennes proximales. Les résultats de cette étude ne nous
permettent pas de conclure dans ce sens, cependant les études fonctionnelles restent plus
sensibles que les études immunohistochimiques et peuvent donc être plus aptes à détecter de
faibles différences. Une autre explication pourrait être une différence d'expression de CFTR
entre les tissus natifs et les cultures primaires de cellules épithéliales ou bien encore
l'implication d'autres facteurs que CFTR dans la réponse à l'AMPc.
Nous avons également observé un net marquage dans les pneumocytes de type I et de
type II, mais avec une intensité légèrement inférieure à celle notée dans les épithéliums
bronchiques et bronchiolaires. Ce résultat peut apparaître surprenant étant donné que
contrairement aux voies aériennes proximales (bronches) et distales (bronchioles), les alvéoles
apparaissent plutôt préservées au cours de la pathogenèse de la mucoviscidose. De plus dans
une étude récente Kreda et al. n'ont pas retrouvé de marquage de CFTR au niveau des
bronchioles terminales et des alvéoles (Kreda et al. 2005). Cependant, l'expression de CFTR a
été décrite dans les cellules épithéliales alvéolaires fœtales humaines (Engelhardt et al. 1992 ;
McCray et al. 1992). Fang et al. ont récemment montré que CFTR était exprimé dans des
cultures de PII isolées à partir d'un poumon adulte humain. Ils ont montré, par RT-PCR que le
niveau d'expression des transcrits de CFTR était similaire à ceux reportés dans les cellules
épithéliales des voies aériennes et des études fonctionnelles ont apporté la preuve de canaux
Cl- CFTR (Fang et al. 2006). Notre étude abonde dans ce sens en confirmant l'expression de
133
la protéine CFTR dans les cellules épithéliales alvéolaires humaines adultes, à la fois dans les
PI et les PII. Le rôle de CFTR dans les transports d'eau d'ions et de fluide reste à élucider,
notamment au regard de l'absence de pathologie alvéolaire dans la mucoviscidose. Des études
récentes ont suggéré que CFTR pourrait jouer un rôle important dans la régulation AMPc-
dépendante des fluides (Fang et al. 2002 ; Fang et al. 2006 ; Matthay et al. 2005).
Pour résumer, nous avons montré que, dans le poumon humain adulte, CFTR est
fortement exprimé tout le long de l'épithélium de surface des voies aériennes, ainsi que dans
les glandes bronchiques séromuqueuses. Le profil d'expression de CFTR est similaire dans
l'épithélium de surface bronchique et bronchiolaire et diminue légèrement au niveau
alvéolaire. L'importance potentielle de l'expression de CFTR au niveau alvéolaire devra faire
l'objet d’études ultérieures, en particulier dans le cadre de la mucoviscidose.
134
6 6 6 6 EFFETS DU NOEFFETS DU NOEFFETS DU NOEFFETS DU NO SSSSURURURUR LESLESLESLES TRANSPORTSTRANSPORTSTRANSPORTSTRANSPORTS
IONIQUESIONIQUESIONIQUESIONIQUES TRANSTRANSTRANSTRANSÉÉÉÉPITHPITHPITHPITHÉÉÉÉLIAUXLIAUXLIAUXLIAUX DANS LES VOIESDANS LES VOIESDANS LES VOIESDANS LES VOIES
AAAAÉÉÉÉRIENNES HUMAINES PRORIENNES HUMAINES PRORIENNES HUMAINES PRORIENNES HUMAINES PROXIMALESXIMALESXIMALESXIMALES ET ET ET ET
DISTALESDISTALESDISTALESDISTALES NON MUCOVISCIDOSIQUENON MUCOVISCIDOSIQUENON MUCOVISCIDOSIQUENON MUCOVISCIDOSIQUES ET S ET S ET S ET
MUCOVISCIDOSIQUESMUCOVISCIDOSIQUESMUCOVISCIDOSIQUESMUCOVISCIDOSIQUES
135
6.1 Introduction
6.1.1 Historique
Furchgott et Zawadzki ont démontré l'existence d'une substance paracrine ayant une
forte activité vasodilatatrice (Furchgott et Zawadzki 1980). Les auteurs ont baptisé cette
substance EDRF pour "endothelium derived relaxing factor" (ou facteur relaxant dérivé de
l'endothélium). Si plusieurs études avaient démontré que l'action de l'EDRF passait au moins
par la formation de GMPc (Rapoport 1983), la nature chimique de l'EDRF restait sujette à
débats pendant plusieurs années jusqu'à ce que deux équipes indépendantes suggèrent que
cette substance possédait toutes les caractéristiques du monoxyde d'azote (NO) (Palmer 1987 ;
Ignarro 1987). Cette découverte fut d'autant plus surprenante que le NO était surtout reconnu
comme une molécule toxique de l'environnement, notamment contenue dans la fumée de
cigarette, les gaz d'échappement des véhicules et participant à la destruction de la couche
d'ozone et à la formation de pluies acides (Ricciardolo et al. 2004). Des études ultérieures ont
cependant confirmé que l'EDRF et le NO étaient la même molécule (Moncada et al.1991).
Rapidement, d'autres travaux ont démontré que le NO était impliqué dans la régulation de
l'agrégation plaquettaire (Radomski et al. 1990) ou bien pouvait agir comme
neurotransmetteur (Bredt et Snyder 1989). Ces observations sur les fonctions du NO ont mis
en évidence l'importance biologique de cette molécule et dont le rôle dans certaines
conditions physiologiques et/ou pathologiques est tel que la communauté scientifique l'a
désignée comme "molécule de l'année 1992". Furchgott, Ignarro et Murad ont par ailleurs
reçu le prix Nobel de physiologie en 1998 pour l'ensemble de leurs travaux sur le NO.
136
6.1.2 Synthèse du NO
Le NO est formé à partir de l'un des deux atomes d'azote terminal du groupement
guanidine de la L-arginine d'une part et de l'oxygène moléculaire d'autre part (Barnes et
Belvisi 1993 ; Dinh-Xuan 1996) (figure 35). Cette réaction qui produit également de manière
stœchiométrique de la L-citrulline, est catalysée par une famille d'enzyme : les NO synthases
(NOS). Ces enzymes, identifiées en 1990 par Bult et al., existent sous trois isoformes
distinctes : NOS neuronale (NOS I ou nNOS), NOS inductible (NOS II ou iNOS) et NOS
endothéliale (NOS III ou eNOS) (Bult et al.1990). Ces trois isoformes sont situées sur des
gènes distincts, diffèrent entre elles par leurs fonctions, leurs localisations cellulaires ainsi que
par leurs caractéristiques biochimiques (tableau 4). Elles sont ditribuées spécifiquement selon
les tissus (Lamas et Michel 1997) mais les 3 isoformes sont cependant présentent dans les
voies aériennes (Fischer et al. 1996 ; Hamid et al. 1993 ; Kobzik et al. 1993 ; Robbins et
al.1994 ; Shaul et al. 1994).
6.1.2.1 Les NOS constitutives
Les isoformes eNOS et nNOS appartiennent aux NOS dites constitutives, et sont
normalement présentes à l’état physiologique. L’expression de ces NOS permet la synthèse du
NO respectivement en tant que médiateur paracrine de la vasodilatation et neurotransmetteur
du système non adrénergique non cholinergique inhibiteur (iNANC).
137
Figure 35 : La formation du NO par les NO synthases entraîne la formation de L-citrulline à partir de L-arginine. Cette réaction nécessite des co-facteurs tels que les flavones (FAD, FMN) et la tétrahydrobioptérine (BH4). Les NOS sont compétitivement inhibées par des dérivés de l'arginine (L-NMMA, L-NAME, L-NOARG). Le NO peut être oxydé en nitrite (NO2
-), nitrate (NO3-) et peroxynitrite (ONOO-) (d'après Barnes et Belvisi
1993).
Isoformes Endothéliale
(eNOS) Neuronale (nNOS) Inductible (iNOS)
Localisation
chromosomique 7q35-36 12q24.2 17cen-q12
Masse moléculaire
de la portéine 135kDa 150kDa 130kDa
Activité Constitutive Constitutive Inductible
Fonction du produit
NO Vasodilatation Neurotransmission
Bactéricidie
tumoricidie
Cofacteurs
Ca2+/calmoduline Dépendante Dépendante Indépendante
Effecteurs
membranaires
Acétylcholine,
bradykinine, etc.
Acides aminés
neuro-excitateurs
LPS, IL-1, TNF α,
etc.
Tableau 4 : Les trois principales isoformes des NO synthases (d'après Dinh-Xuan 1996).
138
Les NOS constitutives sont dépendantes du Ca2+ et de la calmoduline et, lorsqu'elles sont
activées, produisent de faibles concentrations de NO (de l'ordre du fento ou du picomolaire)
(figure 36) (Ricciardolo et al. 2004). Le clonage de l'isoforme endothéliale des NOS a permis
de préciser ses lieux d'expression (Janssens et al. 1992). Shaul et al. ont démontré que
l’isoforme eNOS est constitutivement exprimée dans la lignée cellulaire épithéliale (Shaul et
al. 1994) ainsi que dans les PII (Pechkovsky et al. 2002). Des études ont également démontré
la présence par immunomarquage d'eNOS dans les cellules épithéliales au niveau de la
muqueuse nasale (Kawamoto et al. 1998).
Plusieurs équipes ont démontré, par immunohistochimie, la présence l'isoforme
neuronale des NOS dans les nerfs au niveau des voies aériennes aussi bien chez l'animal (Dey
et al. 1993 ; Diaz et al. 1993) que chez l'homme (Diaz et al. 1993 ; Fischer et Hoffmann
1996 ; Guembe et Villaro 1999). Ces fibres sont présentes au contact de fibres musculaires
lisses des voies aériennes, le NO est le principal médiateur de la relaxation du muscle lisse
(Ricciardolo 2003 ; Belvisi et Barnes 1992). Une étude a démontré que le nombre des fibres
nerveuses exprimant la nNOS diminuait parallèlement avec le diamètre des voies aériennes
(Fischer et Hoffmann 1996). Cette diminution du nombre de fibres nerveuses serait associée à
une diminution de la bronchodilatation d'origine nerveuse régulée par le système iNANC
(Ellis et Undem 1992 ; Widdicombe 1998).
139
Figure 36 : Représentation simplifiée du transport et du métabolisme de la L-arginine. La L-arginine est transportée dans la cellule par le système CAT (cationic amino acid transport) et peut être métabolisée par 2 types d'enzymes. 1/ Les NOS convertissent la L-arginine en L-citrulline en deux étapes. La L-citrulline peut être recyclée en L-arginine par l'arginosuccinate. Les NOS constitutives sont activées par une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+. 2/ L'arginase métabolise la L-arginine en L-ornithine. Les LPS et plusieurs types de cytokines augmentent le transport de L-arginine et l'activité de l'arginase. Le NG-hydroxy-L-arginine inhibe l'activité de l'arginase. Le NO peut se lier à des groupements thiols entraînant la formation de S-nitrosothiols (R-SNO) (d'après Ricciardolo et al. 2004).
140
6.1.2.2 La NOS inductible
L'isoforme inductible des NOS est normalement absente à l'état physiologique et ne se
manifeste que dans des états pathologiques comme par exemple lors du choc septique induit
par les endotoxines bactériennes. La régulation de la iNOS se fait au niveau pré-traductionnel
et peut être induite par des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l'INF-γ ou l'IL-
1β (Morris et Billiar 1994). Contrairement aux formes constitutives, l'isoforme iNOS est
responsable d'une production en grande quantité de NO (de l'ordre du nanomolaire) qui peut
avoir des effets cytotoxique à des concentrations ainsi atteintes (figure 37).
L'isoforme inductible des NOS a été détectée au niveau des macrophages (Lyons et al.
1992) mais des travaux ont montré que les macrophages n'étaient pas le seul type cellulaire à
exprimer iNOS au niveau des voies aériennes humaines. Les PII, les cellules musculaires
lisses, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les neutrophiles et les chondrocytes
peuvent exprimer la forme inductible des NOS (Ricciardolo et al. 2004). L'induction de cette
isoforme de NOS dans les voies aériennes peut se faire sous l'action de plusieurs stimuli tels
que : les cytokines, les toxines bactériennes, les infections virales, les allergènes,…
6.1.2.3 Voies de transduction du NO
Du fait de sa nature radicalaire, le NO est extremement instable. En effet, il peut
facilement être capté par des protéines à groupement prosthétique héminique, comme
l’hémoglobine, et par l’oxygène et ses dérivés comme l’anion superoxyde.
141
Figure 37 : Représentation de la voie de signalisation provoquant une augmentation de l'expression de iNOS. Plusieurs types de signaux peuvent entraîner l'activation la tyrosine kinase qui permet par l'inhibition puis dégradation d'IκB, l'activation du facteur de transcription NF-κB. NF-κB est translocalisé dans le noyau entraînant la transcription du gène codant pour iNOS. L'ARNm d'iNOS va ensuite être traduit, puis la protéine iNOS sera synthétisée. La L-arginine sera convertie en L-citrulline et NO sous l'action de l'enzyme nouvellement synthétisée (d'après Ricciardolo et al. 2004).
142
Le NO a de ce fait une durée de vie biologique très faible (de l’ordre de quelques secondes) et
donc une action locale, restreinte au voisinage immédiat de son lieu de synthèse et de
sécrétion. Le NO produit par les NOS peut agir directement sur le fonctionnement d’enzymes
ou sur des facteurs de transcription (Gunther et al 1997 ; Goodwin et al 1998). Cependant la
cible principale du NO, en concentrations physiologiques, est la guanylate cyclase soluble
(GCs) (Hanafy et al 2001). La GCs est une enzyme qui, activée par le NO, catalyse la
transformation du GTP en GMPc (Murad et al. 1986, 1993) (figure 38). Le GMPc, second
médiateur du NO ainsi formé, peut agir sur plusieurs cibles. La principale cible du GMPc
semble être la protéine kinase G1 (PKG-1) qui est à l’origine de la relaxation du muscle lisse
(Hanafy et al. 2001). Le GMPc peut également inhiber l’agrégation plaquettaire, moduler
l’activité de canaux ioniques dépendant des nucléotides cycliques (CNG channel pour cyclic-
nucleotide gated channel) dont on peut retrouver certaines isoformes (CNG-1) dans le
poumon (Qiu et al. 2000).
Le GMPc intervient également dans la régulation des phosphodiestérases (PDE). Ces
enzymes, dont il existe 11 familles (PDE1 à 11), interviennent dans la dégradation des
nucléotides cycliques (GMPc, AMPc) en nucléotide (GMP, AMP). Les PDE jouent un rôle
primordial au niveau de plusieurs organes comme dans le poumon, l’œil, le cerveau,... Les
PDE constituent également les cibles de médicaments. Les propriétés anti-inflammatoires des
inhibiteurs de la PDE-4 ont entrainé l’utilisation de ces inhibteurs dans des maladies comme
l’asthme ou les BPCO (broncho-pneumopathies chroniques obstructives). La PDE-5 est
également la cible d’un inhibiteur spécifique : le sildénafil ou viagra. Cette drogue en inhibant
la PDE-5 permet de conserver un taux de GMPc intracellulaire suffisamment élevé pour
activer la PKG-1 entraînant un relâchement des muscles lisses du corps caverneux permettant
l’érection (Moreland et al. 1998 ; Hanafy et al. 2001).
143
Figure 38: Résumé des voies de transduction du NO (d'après Hanafy 2001).
144
6.1.2.4 Principaux effets du NO
L'action principale du NO est la vasodilatation des vaisseaux sanguins, conférant au
NO un rôle important dans la régulation du flux sanguin. Le NO est aussi connu pour induire
une bronchodilatation (Dinh-Xuan 1996). Cependant, des études ont démontré que le NO
intervenait dans de nombreux autres processus. En effet, des études ont révélé une expression
à la fois spatiale et temporelle au cours du développement du poumon chez le rat (Kawai et al.
1995 ; Xue et al. 1996). Une expression différentielle de l'isoforme eNOS a également été
observée chez le poumon fœtal de mouton. L'expression d'eNOS a été démontrée, chez le
mouton, au niveau des voies aériennes proximales mais pas au niveau des bronchioles
respiratoires ni au niveau alvéolaire (Sherman et al. 1999). Une étude a montré, chez le
babouin, une augmentation de l’expression des NOS durant le troisème trimestre de la
gestation. Cette augmentation de la production NO serait associée à une meilleure compliance
pulmonaire et à une diminution de la résistance expiratoire juste après la naissance (Shaul et
al. 2002).
Le NO intervient également comme neuromédiateur du système iNANC. Dans les
voies aériennes humaines, il assurerait la totalité de la réponse au système iNANC
(Ricciardolo et al. 2004). Des travaux ont montré que les effets du NO dans le système
iNANC semblaient impliquer la voie du GMPc intracellulaire dans la régulation du calibre
des voies aériennes (Ward et al. 1995). L’activation de canaux ioniques K+ dépenants du Ca2+
semblerait également intervenir dans la relaxation du muscle lisse induite par le système
iNANC (Kannan et Johnson 1995). Une étude a montré que les réponses du système iNANC
étaient significativement réduites chez les personnes atteintes de la mucoviscidose. L’état
145
inflammatoire des voies aériennes des patients CF pourrait être à l’origine de cette altération,
cependant le mécanisme reste à déterminer (Barnes et Belvisi 1993).
Le NO joue également un rôle important au niveau des processus inflammatoires. Les
mécanismes de régulation du NO durant un épisode inflammatoire dépendent en partie du
panel de cytokines dans l’environnement. En effet certaines cytokines (TGF-β, l’IL-4 ou l’IL-
10) inhibent l’expression de la NOS inductible (Nijkamp et Folkerts 1994) tandis que d’autres
(TNF-α, IL-1β, INF-γ) stimulent l’expression de cette isoforme des NOS (Robbins et al
1994). Le NO peut agir en tant qu’espèce radicalaire en produisant des peroxynitrites (ONOO-
) par réaction avec l’anion superoxyde (O2.-), les peroxynitrites possédant des propriétés
microbicides vont contribuer à lutter contre l’infection (Muijsers et al. 1997). Dans les voies
aériennes, le NO diminue la contraction induite par l’histamine et pourrait limiter l’infiltration
par les polynucléaires neutrophiles, limitant ainsi la réaction inflammatoire (Meng et al.
2000).
La concentration en NO dans l’air exhalé peut être utilisée comme témoin de
l’inflammation des voies aériennes. Des études ont démontré que cette concentration était plus
élevée en cas de rhinites, de bronchiectasies, de syndrome de détresse respiratoire aiguë et
pendant les exacerbations d’asthme (Kharitonov et al. 1995 ; Ricciardolo et al. 2004).
Cependant, la concentration de NO dans l’air exhalé n’est pas toujours liée à l’état
d’inflammation des voies aériennes. En effet, des études ont rapporté de faibles
concentrations de NO dans l’air exhalé chez des patients atteints de dyskinésie ciliaire
primitive (PCD) et de mucoviscidose (Balfour-Lynn et al. 1996 ; Ricciardolo et al. 2004).
Dans ces pathologies, la faible concentration de NO dans l’air exhalé pourrait être liée à une
diminution de l’expression de la NOS inductible qui semble être la source majeure de NO
146
dans les cellules épithéliales des voies aériennes (Downey et Elborn 2000 ; Meng et al. 2000).
Par ailleurs, Darling et Evans ont démontré que la production de NO diminuait l'adhérence et
stimulait l'élimination par internalisation des bactéries dans des cellules épithéliales
bronchiques humaines. Ces résultats suggèrent que la faible concentration de NO observée
chez les patients mucoviscidosiques pourrait participer à l'infection et à la colonisation par P.
aeruginosa (Darling et Evans 2003).
La motilité ciliaire est un facteur important dans le mécanisme de défense des voies
aériennes. Des équipes se sont intéressées aux effets des cytokines telles que l'IL-1β ou le
TNF-α sur cette motilité ciliaire. Jain et al. ont montré que ces cytokines pouvaient augmenter
la fréquence du battement ciliaire dans des cellules épithéliales de voies aériennes bovines
(Jain et al. 1995). Les effets stimulateurs de l'IL-1β ou du TNF-α sont inhibés par le L-
NMMA, un inhibiteur compétitif de la NOS et restaurés par l'ajout de L-arginine, le substrat
des NOS, ou de SNP, un donneur de NO. Ces résultats suggèrent que le l'IL-1β ou le TNF-α
stimulent le battement ciliaire en augmentant la production de NO endogène par l'activation
de NOS (Jain et al. 1995). Ces données peuvent être mises en relation avec les faibles
concentrations en NO dans l'air exhalé chez les patients atteints de PCD chez lesquels il est
observé un dysfonctionnement du battement ciliaire qui peut être amélioré par un traitement à
la L-arginine (Loukides et al. 1998). De plus, des études ultra-structurelles chez le rat ont
démontré la localisation d’eNOS au niveau des microtubules dans l'épithélium cilié (Xue et
al. 1996) où le NO pourrait donc jouer un rôle dans la régulation du battement ciliaire.
Le NO peut entraîner la formation de SNO (S-nitrosothiol) (figure 36) pouvant
moduler les transports ioniques. En effet, des études ont montré que des niveaux
147
physiologiques de SNO pouvaient augmenter l'expression, la maturation ainsi que la fonction
de la protéine CFTR contenant la mutation ∆F508 (Andersson et al. 2002 ; Howard et al.
2003 ; Zaman et al. 2001). Ce processus passerait par la S-nitrosylation de protéines
impliquées dans l'ubiquitination et la dégradation de CFTR. Une autre étude a montré que les
espèces réactives de l'oxygène issues d'un donneur de NO modifient l'état de nitration de
CFTR, induisant sa dégradation (Bebök et al. 2002).
Lu et al. ont montré que le NO pouvait directement moduler les transports ioniques
épithéliaux d’organes autres que les voies aériennes tels que le rein ou le colon (Lu et al. 1997
et 1998). Cependant, seulement quelques études se sont intéressées aux effets du NO sur les
transports ioniques dans les voies aériennes. Tamaoki et al. ont démontré que le NO pouvait
potentialiser la sécrétion de Cl- induite par les tachykinines dans la trachée de lapin. En effet,
les auteurs ont observé qu'en présence d'amiloride, la ddp trachéale était augmentée après
exposition de la muqueuse aux tachykinines. Cette augmentation était partiellement inhibée
en présence d'un inhibiteur de la formation du NO (L-NAME) et serait probablement due à
une sécrétion de Cl- (Tamaoki et al. 1995). Un autre étude a montré que la production de NO
induite par les macrophages pourrait inhiber le canal Na+ sensible à l’amiloride dans des
cellules alvéolaires fœtales de rat (Ding et al. 1998). Elmer et al. ont également observé dans
l'épithélium nasal murin, que le NO pourrait participer à l’inhibition de l'absorption de Na+ et
à la stimulation d’une sécrétion de Cl- (Elmer et al. 1999). Jain et al. ont observé, dans des
pneumocytes de type II de rat que les effets du NO sur les transports de Na+ et de Cl-
passaient par une variation du taux de GMPc intracellulaire (Jain et al. 1998). Duszyk a
montré que l'exposition au NO entraînait l'activation d'une sécrétion d'anion dépendante de la
voie du GMPc intracellulaire dans une lignée cellulaire pulmonaire (Calu-3) (Duszyk 2001).
Kamosinska et al. ont montré dans la lignée cellulaire pulmonaire humaine A549 que le NO
148
provoquait l'activation d'une sécrétion Cl- non portée par CFTR et dépendante de la voie du
GMPc (Kamosinska et al. 1997). Cependant, une étude plus récente n'a pas retrouvé ces effets
du NO sur les transports de Na+ ou de Cl-. En effet, Rückes-Nilges et al. n'ont pas observé
d'effet inhibiteur sur l'absorption de Na+ ni d'effet activateur sur la sécrétion de Cl- dans des
cultures primaires de cellules épithéliales humaines nasales non-CF et CF (Rückes-Nilges et
al. 2000). Les différences observées entre ces études peuvent provenir d'une régulation
différente dans les types cellulaires utilisés, les effets du NO sur l'épithélium nasal ne reflétant
pas forcément son effet sur les cellules épithéliales des autres étages des voies aériennes. De
plus, les lignées cellulaires et les cellules en cultures primaires peuvent avoir des propriétes
différentes. Cependant, ces différences peuvent également être dues à la différence de
concentration utilisée dans les différentes études. Rückes-Nilges et al. ont utilisé des
concentrations de NO plus élevées que dans les études sur les lignées.
Le NO peut donc moduler les transports ioniques dans les épithéliums. Les 3 types de
NOS sont présentes dans les voies aériennes humaines. Les travaux sur les transports ioniques
transépithéliaux chez l'homme ont principalement été réalisés sur des lignées cellulaires ou
sur des cultures primaires de cellules nasales. Ces différentes études ont produit des résultats
discordants. Le but de ce travail a donc été de déterminer les effets du NO sur les transports
ioniques transépithéliaux dans les voies aériennes humaines. Nous avons donc pour cela
réalisé des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires humaines
non CF que nous avons exposées à un donneur de NO, le SNP. Compte tenu des variations de
concentrations de NO dans l'air exhalé dans certaines pathologies des voies respiratoires
(concentration anormalement élevée dans l'asthme et plus faible dans la mucoviscidose), nous
avons également entrepris d'étudier les effets de ce donneur de NO sur des cultures primaires
de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF. Afin de préciser les effets éventuels
149
du NO sur les transports ioniques, nous avons également modulé la concentration en GMPc
intracellulaire dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF.
150
6.2 Matériels et méthodes
6.2.1 Origine des prélèvements
6.2.1.1 Tissus non mucoviscidosiques
Les fragments de lobes pulmonaires sont prélevés lors de lobectomie ou de
pneumonectomie indiquées généralement pour des cas de cancer bronchiques. Ils sont
conservés dans une solution dite de « décontamination » à 4°C et parviennent au laboratoire
quelques heures après l'opération. L'obtention de ces prélèvements est conforme à la
législation française et ceux-ci n'ont pas fait l'objet d'études génétiques. Les bronches et les
bronchioles sont isolées pour la mise en culture.
Composition de la solution dite de « décontamination » : DMEM/HAM-F12 supplémenté
avec : pénicilline/streptomycine (1mg/ml), amphotéricine B (100µg/ml) et gentamycine
(0,5mg/ml).
6.2.1.2 Tissus mucoviscidosiques
Ces fragments sont obtenus lors de transplantation et parviennent au laboratoire au
plus tard le lendemain de l'opération. Ils sont conservés dans une solution dite de
« décontamination » supplémentée de deux antibiotiques : la ceftazidime (500 µg/ml) et la
151
ticarciline (500 µg/ml). Les bronches et les bronchioles sont isolées à partir de ces
prélèvements pour être utilisées en culture cellulaire.
La figure 39 illustre les différences d'aspect entre un fragment de poumon non
mucoviscidosique et un fragment de poumon provenant d'un patient atteint de mucoviscidose
homozygote pour la mutation ∆F508.
6.2.2 Culture cellulaire
6.2.2.1 Obtention de cultures primaires de cellules épithéliales
bronchiques et bronchiolaires humaines
6.2.2.1.1 Identification des bronches et des bronchioles
Bronches et bronchioles sont identifiées selon la présence de plaques cartilagineuses
dans leur paroi. Les bronches ont un diamètre externe variant de 3 à 7 mm, ces segments
appartiennent à l'étage des bronches sous segmentaires, c'est à dire de la 4ème à la 7ème
génération (Weibel 1963). Les bronchioles sont dépourvues de cartilage et ont un diamètre
externe inférieur à 2 mm (0,5 mm pour les plus petites). Les bronchioles ont une longueur,
sans embranchement, variable selon le lobe pulmonaire dont elles proviennent, de 4 à 12 mm
(les plus longues provenant des lobes inférieurs).
152
Figure 39 : Fragments de poumon normal (A) et mucoviscidosique (B). Le tissu mucoviscidosique présente des voies aériennes dilatées remplies d’un mucus abondant et infecté (flèche).
A
B
153
Dans les prélèvements mucoviscidosiques, l'identification des étages bronchiolaires se
révèle plus difficile du fait d'’importants remaniements, qui peut cependant être variable d'un
lobe à l'autre. De plus, les bronchioles remplies de mucus présentent un diamètre supérieur
aux bronchioles non-CF ; l'absence de cartilage reste alors un moyen de déterminer si les
prélèvements proviennent de l'étage bronchique ou bronchiolaire.
Les bronches et les bronchioles sont disséquées du parenchyme sous loupe binoculaire
à l'aide de ciseaux de microdissection dans du milieu de décontamination. A cette étape, il est
nécessaire de « nettoyer » les bronches et les bronchioles des tissus avoisinant, afin de limiter
la contamination par d'autres types cellulaires épithéliaux (fibroblastes et hématies), et par le
mucus (ce qui pourrait permettre de limiter les infections dues aux bactéries et aux
champignons).
6.2.2.1.2 Isolement des cellules
Les fragments de bronches ou de bronchioles sont mis en suspension dans un tube
contenant du milieu de culture contenant de la protéase (0,1%) et de la désoxyribonucléase I
(0,01%) pendant environ 24 heures à 4°C. La digestion enzymatique est stoppée par addition
de sérum de veau fœtal (10% du volume). Les segments de bronches ou de bronchioles sont
retirés du tube puis les cellules sont récupérées après centrifugation (600 rotations par minute
pendant 5 minutes) sous forme d'un culot cellulaire.
Composition du milieu de culture : DMEM/HAM-F12 supplémenté avec : insuline (5µg/ml),
transferrine (7,5µg/ml), hydrocortisone (10-6M), ECGS (2µg/ml), EGF (25ηg/ml),
triiodothyronine (3,10-8M), L-glutamine (1mM), pénicilline/streptomycine (100µg/ml). Pour
154
les cultures de cellules épithéliales issues de prélèvements mucoviscidosiques deux
antibiotiques sont ajoutés à ce milieu : la ceftazidime (125µg/ml) et la tobramycine
(100µg/ml). Tous les produits proviennent de chez Sigma Aldrich (St Quentin Fallavier).
6.2.2.1.3 Ensemencement des cellules
Les cellules sont ensemencées sur une membrane de collagène perméable reposant sur
un support en polycarbonate appelé « CMS » pour « Collagen Matrix Support » décrit par
Yankaskas et al. en 1985. Ce support est percé en son centre d'un trou d'un diamètre de 2 mm
ou de 3,5 mm. C'est sur celui-ci qu’est alors disposé la membrane de collagène et ce en
plusieurs couches. Tout d'abord, une couche d'un mélange de collagène de type I (15 mg/ml
dans acide acétique 0,2%) et de glutaraldéhyde (2,5%) est appliquée, puis une couche de
collagène pur, puis, après une étape de solidification par du glutaraldéhyde, une couche de
vitrogène (Interchim, Montluçon, France). Les cellules sont ensemencées à la face supérieure
du CMS n'entrant ainsi en contact avec le milieu de culture que par leur face basolatérale, en
effet aucun liquide, excepté le faible volume déposé en même temps que les cellules lors de
l'ensemencement, n'est rajouté sur leur face apicale. Ce type de culture est donc appelé :
culture en interface air-liquide. Les cellules sont ensuite mises à l'incubateur (37°C, 5% CO2)
pendant 7 à 12 jours, le milieu de culture étant changé tous les deux jours.
155
6.2.3 Mesure des propriétés bioélectriques des cultures
primaires bronchiques et bronchiolaires dans les chambres
dites de Ussing
6.2.3.1 Historique
La technique des chambres de Ussing a été mise au point par Hans Ussing dans les
années 1950 afin d'étudier les transports vectoriels d'ions au travers de la peau de grenouille.
Ussing a démontré l'existence d'un transport actif transépithélial de Na+ à travers la peau de
grenouille qui est à l'origine de la ddp entre les deux faces de la peau de grenouille (Ussing et
Zerhan 1951). Koefoed-Johsen et Ussing ont également démontré que le transport de Na+ est
couplé à une entrée active de K+ par la membrane basale et à un transport passif de Cl- du
milieu extérieur vers le milieu intérieur (Koefoed-Johnsen et Ussing 1958). Depuis cette
époque, les chambres de Ussing ont été utilisées pour étudier les transports ioniques d’un
grand nombre de préparations cellulaires épithéliales.
6.2.3.2 Description du système utilisé dans le laboratoire
Les supports des cultures cellulaires sont montés entre deux hemi-chambres en
plexiglas reliées chacunes à une cuve (figure 40). Celles-ci sont indépendantes et peuvent
donc contenir la même solution expérimentale ou deux solutions différentes.
156
Figure 40 : Installation des chambres de Ussing.
157
Cette séparation permet aussi l’addition de drogues à la face désirée (apicale, basale ou les
deux) de la culture étudiée. Les solutions contenues dans les cuves sont chauffées à 37°C et
un système de bullage par un mélange 95% O2/5% CO2 permet de faire circuler les solutions.
La configuration en U permet d'assurer une pression hydrostatique équivalente sur les deux
faces de la culture, évitant ainsi d'éventuels transports passifs dus à une différence de
pression.
Une électrode de mesure de voltage est située dans chacune des hemi-chambres et au plus
près de la culture étudiée. Ces électrodes, constituées d’agar-KCl 3M, sont reliées à un
voltmètre (DVC 1000, WPI, Aston UK) et permettent de mesurer la différence de potentiel
(ddp) développée par la culture cellulaire en cours d’étude. Deux autres électrodes composées
d’agar-KBR également situées dans chacune des hemi-chambres et elles aussi reliées au DVC
1000 permettent de mesurer le courant de court-circuit (Isc pour short circuit current). Afin de
mesurer cet Isc, la technique de « voltage clamp » peut être utilisée : l’épithélium est « court-
circuité » par l’injection d’un courant permettant de maintenir la ddp transépithéliale à 0mV.
Le courant de court circuit correspond à la valeur du courant nécessaire pour annuler la ddp,
celle-ci est mesurée en continue par le voltmètre (DVC 1000). Périodiquement, un voltage
déterminé par l’expérimentateur et non nul (+2mV lors de nos expériences) est imposé afin
d’obtenir une estimation de la résistance transépithéliale (Rt). Celle-ci pourra être obtenue par
l’équation d’Ohm :
Rt(Ω) = ∆U(mV)/ ∆Isc (µA)
Le DVC 1000 est relié à un enregistreur graphique qui retranscrit l’Isc au cours de
l’expérience (figure 41). Les propriétés électriques des épithéliums sont classiquement
représentées en un circuit électrique décrit figure 42.
158
Figure 41 : Exemple de tracé représentant l’enregistrement de l’Isc d’une culture de cellules épithéliales bronchiques non-CF. Avant chaque expérience, un support contrôle sans cellule est placé dans les chambres de Ussing et sa résistance est mesurée et annulée par le DVC1000. La ddp et l’Isc sont enregistrés en continu, pour obtenir la résistance de la culture cellulaire, on applique la loi d’Ohm en divisant le voltage imposé par le ∆Isc correspondant.
Figure 42 : Modélisation de la barrière épithéliale en un circuit électrique. La membrane apicale est représentée comme une pile au Na+ (ENa) montée en parallèle avec une pile au Cl- (ECl). Ces deux piles sont montées en série avec une résistance (respectivement RNa et RCl). La membrane basolatérale est représentée comme une seule pile (Rb) montée en série avec une résistance (Rb). Rs (Rshunt) représente la somme des résistances dues aux jonctions serrées et aux « espaces latéraux intercellulaires » et est représentée comme une simple résistance car les bains apicaux et basolatéraux ont la même concentration ionique. Le circuit externe est représenté comme un générateur de courant (∞).
159
6.2.3.3 Protocoles
Effets du NO : Les cultures confluentes sont exposées au SNP (sodium nitroprusside,
10-4M) ou à son véhicule (eau distillée) pendant 20 à 30 minutes dans un incubateur (37°C,
5% CO2), puis sont montées en chambre de Ussing comme décrit précédemment. Cent
microlitres de SNP (10-4M) ou de son véhicule sont aussitôt ajoutés dans les cuves apicale et
basolatérale. Après stabilisation du système et mesure des paramètres de base (ddp, Isc et R),
les drogues amiloride (10-5M en apical), forskoline (10-5M en apical et en basolatéral) et ATP
(10-4M en apical) sont ajoutées séquentiellement.
Effets du GMPc : Les cultures confluentes sont montées dans les chambres de Ussing
et après stabilisation du système, le 8-bromo-GMPc (10-4M, analogue perméant du GMPc et
plus résistant à l'hydrolyse des phosphodiestérases) et le Zaprinast (10-4M, un inhibiteur de
phosphodiestérase) sont ajoutés en même temps, et après stabilisation des variables
bioélectriques, suivi de l'amiloride (10-5M en apical), de la forskoline (10-5M en apical et en
basolatéral) et de l'ATP (10-4M en apical).
Inhibition de la voie du GMPc : Les cultures confluentes sont exposées à l'ODQ
(10µM en apical et en basolatéral) ou à son véhicule (DMSO dilué dans du KBR) pendant 15
à 20 minutes en incubateur (37°C, 5% CO2), les cultures sont ensuite exposées au SNP (10-4M
en apical et en basolatéral) pendant 20 à 30 minutes également en incubateur. Les cultures
sont ensuite montées dans les chambres de Ussing comme décrit précédemment. 100µl de
SNP (10-4M) sont aussitôt ajoutés dans les cuves apicale et basolatérale. Après stabilisation du
système et mesure des paramètres de base (ddp, Isc et R), les drogues amiloride (10-5M en
160
apical), forskoline (10-5M en apical et en basolatéral) et ATP (10-4M en apical) sont ajoutées
séquentiellement.
6.2.3.4 Analyses statistiques
Nous avons utilisé un test t de Student pour l’analyse statistique et les résultats sont
considérés comme significativement différents lorsque p < 0,05.
161
6.3 Résultats
6.3.1 Caractéristiques des prélèvements
Les caractéristiques des patients inclus dans les différents protocoles sont résumées
dans le tableau 5. Les 2 patients de l’étude « SNP, bronche CF » étaient homozygotes pour la
mutation ∆F508. Sur les 6 patients CF inclus dans l’étude « SNP, bronchioles CF », 2 étaient
homozygotes ∆F508, 2 hétérozygotes ∆F508/XX, pour 2 patients le génotype et le sexe n’ont
pu être renseignés.
SNP 8-Br-GMPc + Zaprinsat
ODQ
Bronches non-CF
Bronchioles non-CF
Bronches CF
Bronchioles CF
Bronches non-CF
Bronches non-CF
n 4 8 2 6 5 8
Moyenne d’âge ± SE (ans)
62,7 ± 3,7 63,4 ± 3,1 28,5 ± 0,5 22,3 ± 4,8 66,0 ± 6,9 60,6 ± 2,2
Sexe (homme/femme)
3h/1f 8h 2h 3h/1f 4h/1f 8h
Tableau 5 : Tableau récapitulatif des caractéristiques des donneurs (n correspond au nombre de patients).
162
6.3.2 Exposition des cultures bronchiques et bronchiolaires
non-CF à un donneur de NO, le SNP
Cellules épithéliales bronchiques non-CF : Les cultures exposées au SNP (10-4M)
pendant 20 minutes sur les faces apicale et basolatérale présentent un Isc et une ddp de base
significativement inférieures par rapport aux cultures exposées au véhicule du SNP (eau
distillée) (tableau 6). Le SNP inhibe significativement les variations de l’Isc induites par
l’amiloride, par la forskoline et par l’ATP (figure 43).
Véhicule (n = 20) SNP (n = 20) p
ddp basale (mV) -5,2 ± 0,5 -3,5 ± 0,5 < 0,05
Isc basal (µA/cm2) 54,2 ± 6,1 33,2 ± 4,2 < 0,01
Rt basale (Ω.cm2) 106,2 ± 9,1 107,1 ± 7,8 NS
∆Isc amiloride (µA/cm2)
-22,8 ± 3,8 -7,0 ± 1,4 < 0,01
∆Isc forskoline (µA/cm2)
1,9 ± 0,5 0,4 ± 0,1 < 0,01
∆Isc ATP (µA/cm2) 22,2 ± 2,5 16,1 ± 1,2 < 0,05
Tableau 6 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).
Cellules épithéliales bronchiolaires non-CF : Les cultures exposées au SNP (10-4M)
présentent une ddp et un Isc significativement inférieurs comparées aux cellules exposées au
véhicule du SNP (tableau 7). Le SNP inhibe significativement les variations de l’Isc induites
par l’amiloride et par la forskoline (figure 43).
163
Véhicule (n = 11) SNP (n = 10) p
ddp basale (mV) -2,7 ± 0,5 -1,5 ± 0,2 < 0,05
Isc basal (µA/cm2) 60,0 ± 7,9 39,1 ± 4,1 < 0,05
Rt basale (Ω.cm2) 45,0 ± 6,7 40,3 ± 7,0 NS
∆Isc amiloride (µA/cm2)
-27,7 ± 5,3 -11,8 ± 1,7 < 0,05
∆Isc forskoline (µA/cm2)
5,0 ± 1,0 0,6 ± 0,2 < 0,01
∆Isc ATP (µA/cm2) 30,9 ± 7,1 24,6 ± 5,2 NS
Tableau 7 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiolaires non-CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).
Le SNP inhibe les transports de Na+ et de Cl- dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires non-CF
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
∆∆ ∆∆Is
c (µ
A/c
m2)
bronches véhicule SNP
bronches SNP
bronchioles véhicule SNP
bronchioles SNP
Figure 43 : Histogramme des variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires non-CF humaines exposées au SNP (barre : différence significative).
Forskoline (10-5M) ATP (10-4M)
Amiloride (10-5M)
164
6.3.3 Exposition des cultures bronchiques et bronchiolaires
CF à un donneur de NO, le SNP
Cellules épithéliales bronchiques CF : Les cultures exposées au SNP (10-4M) pendant
20 minutes sur les faces apicale et basale, présentent un Isc significativement inférieur par
rapport aux cultures exposées au véhicule du SNP (eau distillée) (tableau 8). Le SNP inhibe
significativement les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (figure 44).
Véhicule (n = 10) SNP (n = 7) p
ddp basale (mV) -3,8 ± 0,6 -2,4 ± 0,4 NS
Isc basal (µA/cm2) 33,4 ± 4,2 21,2 ± 2,2 < 0,05
Rt basale (Ω.cm2) 122,7 ± 18,4 128,7 ± 27,2 NS
∆Isc amiloride (µA/cm2)
-16,7 ± 3,4 -6,8 ± 0,9 < 0,05
∆Isc forskoline (µA/cm2)
0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1 NS
∆Isc ATP (µA/cm2) 31,9 ± 6,2 23,5 ± 5,3 NS
Tableau 8 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).
Cellules épithéliales bronchiolaires non-CF : Les cultures exposées au SNP présentent
un Isc de base significativement inférieur par rapport aux cultures qui ont été exposées au
véhicule du SNP (tableau 9). Le SNP inhibe significativement les variations de l’Isc induites
par l’amiloride et l’ATP. Les cultures exposées au SNP présentent une Rt significativement
supérieure par rapport aux préparations cellulaires exposées au véhicule du SNP (figure 44).
165
Véhicule (n = 22) SNP (n = 20) p
ddp basale (mV) -4,9 ± 0,7 -4,9 ± 0,6 NS
Isc basal (µA/cm2) 41,0 ± 4,3 28,6 ± 2,9 < 0,05
Rt basale (Ω.cm2) 123,2 ± 16,5 173,0 ± 18,2 < 0,05
∆Isc amiloride (µA/cm2)
-27,9 ± 4,1 -17,5 ± 2,6 < 0,05
∆Isc forskoline (µA/cm2)
0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 NS
∆Isc ATP (µA/cm2) 35,1 ± 4,2 22,6 ± 2,3 < 0,05
Tableau 9 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiolaires CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).
Le SNP inhibe les transports de Na+ dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
∆∆ ∆∆Is
c (µ
A/c
m2)
bronches CF véhicule SNP
bronches CF SNP
bronchioles CF véhicule SNP
bronchioles CF SNP
Figure 44 : Histogramme représentant les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF humaines exposées au SNP (barre : différence significative).
Forskoline (10-5M) ATP (10-4M)
Amiloride (10-5M)
166
6.3.4 Exposition des cultures primaires de cellules épithéliales
bronchiques non-CF au 8-Br-GMPc et au zaprinast
Cellules épithéliales bronchiques non-CF : L’addition du 8-Br-GMPc et du zaprinast
ou de leurs véhicules (eau distillée + DMSO) entraîne une diminution de l'Isc similaire
indiquant que le véhicule est responsable de cet effet (tableau 10). En effet, même si le
DMSO, véhicule du zaprinast, est dilué pour atteindre une concentration finale < 0,1%, il
pourrait être à l'origine de cette diminution de l'Isc. Cependant les valeurs de la résistance
transépithéliale indiquent que l'épithélium conserve son intégrité au cours de l'expérience. Le
« cocktail 8Z » inhibe significativement les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la
forskoline et l’ATP (figure 45).
Véhicule (n = 10) "8Z" (n = 11) p
ddp basale (mV) -3,4 ± 0,7 -2,6 ± 0,4 NS
Isc basal (µA/cm2) 56,3 ± 10,1 42,6 ± 8,6 NS
Rt basale (Ω.cm2) 63,4 ± 7,7 77,6 ± 19,6 NS
∆Isc véhicule ou "8Z"
-15,3 ± 4,1 -9,8 ± 3,6 NS
∆Isc amiloride (µA/cm2)
-18,5 ± 2,7 -9,8 ± 2,5 < 0,05
∆Isc forskoline (µA/cm2)
5,6 ± 1,7 1,7 ± 0,5 < 0,05
∆Isc ATP (µA/cm2) 21,7 ± 2,1 11,9 ± 2,0 < 0,05
Tableau 10 : Effets du "cocktail 8Z" (8-Br-GMPc + zaprinast, 10-4M en apical) sur les variables bioélectriques de base et sur les réactions à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).
167
Les effets du SNP sont reproduits par le cocktail 8Z dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF
-30
-20
-10
0
10
20
30∆∆ ∆∆
Isc
(µA
/cm
2)
bronches non-CF véhicule8Zbronches non-CF 8Z
Figure 45 : Histogramme représentant les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF humaines exposées au 8-Br-GMPc et au Zaprinast (barre : différence significative).
168
6.3.5 Exposition des cultures primaires de cellules épithéliales
bronchiques non-CF au SNP en présence ou non d'ODQ, un
inhibiteur de la guanylate cyclase soluble
Cellules épithéliales bronchiques non-CF : Les cultures exposées en incubateur au
véhicule de l'ODQ puis au SNP présentent un Isc de base significativement inférieur comparé
aux cultures exposées au SNP en présence d'ODQ (tableau 11). En présence du véhicule de
l'ODQ, le SNP inhibe les variations de l’Isc induites par l’amiloride et la forskoline (figure
46).
ODQ + SNP
(n = 16)
Véhicule ODQ +
SNP (n = 17) p
ddp basale (mV) -3,5 ± 0,4 -3,1 ± 0,4 NS
Isc basal (µA/cm2) 65,5 ± 6,6 46,3 ± 5,0 < 0,05
Rt basale (Ω.cm2) 53,8 ± 5,2 72,3 ± 8,3 NS
∆Isc amiloride (µA/cm2)
-23,8 ± 3,4 -14,5 ± 0,9 < 0,05
∆Isc forskoline (µA/cm2)
2,8 ± 0,4 0,9 ± 0,3 < 0,05
∆Isc ATP (µA/cm2) 35,8 ± 4,8 25,7 ± 4,3 NS
Tableau 11 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) en présence d'ODQ (10µM en apical et en basolatéral) ou de son véhicule (DMSO) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc induites par l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-
4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).
169
Les effets du SNP sont inhibés par l'ODQ dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50∆∆ ∆∆
Isc
(µ
A/c
m2)
bronches non-CF ODQ + SNP
bronches non-CF véhicule ODQ +SNP
Figure 46 : Histogramme représentant les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF humaines exposées au SNP en présence d’ODQ ou de son véhicule (barre : différence significative).
170
6.4 Discussion
Nous avons observé que, dans les cultures bronchiques et bronchiolaires non-CF,
l'exposition au SNP entraînait une diminution de la ddp de base ainsi que de l'Isc de base.
Dans les deux types de préparations cellulaires non-CF exposées au SNP, nous avons
également observé une diminution significative des variations de l’Isc en réponse à
l’amiloride et à la forskoline. Les effets du SNP, dans des cultures de cellules épithéliales
bronchiques non-CF, sont reproduits par l'exposition au 8-Br-GMPc et au zaprinast et sont
inhibés en présence de l'ODQ. Dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques
et bronchiolaires CF, l'exposition au SNP induit des diminutions significatives de l'Isc de base
et de la variation de l'Isc sensible à l'amiloride.
L'exposition au SNP des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et
bronchiolaires non-CF entraîne une diminution de l'Isc de base. Ce courant étant
majoritairement porté par l'absorption active de Na+, nos résultats suggèrent que le NO inhibe
cette absorption. La variation de l’Isc sensible à l’amiloride qui est significativement plus
faible en présence de SNP va également dans ce sens. Le NO pourrait donc inhiber les canaux
ENaC, sensibles à l'amiloride, ou la pompe Na+/K+/ATPase située à la membrane basolatérale
ou bien encore des canaux K+ basolatéraux qui participent à la création de gradient de
concentration permettant l'entrée de Na+ par les canaux ENaC. L'exposition des préparations
cellulaires bronchiques non-CF au 8-Br-GMPc et au zaprinast entraîne une diminution de la
variation de l’Isc en réponse à l'amiloride. Les effets du SNP sur l'Isc de base et sur la
variation de l’Isc en réponse à l'addition d’amiloride sont abolis par la présence de l'ODQ, un
inhibiteur de la guanylate cyclase soluble. Ces résultats suggèrent que l'action du NO
171
implique la voie du GMPc. Nos résultats sont en accord avec les résultats obtenus par Elmer
et al. sur l'épithélium nasal murin (Elmer et al. 1999). En effet, ces auteurs ont observé que le
NO pouvait participer à l’inhibition de l’absorption active de Na+. Une autre étude réalisée sur
des pneumocytes de type II de rat indique également que le NO inhibe l'absorption de Na+ à la
fois par une action sur ENaC et sur la pompe Na+/K+/ATPase (Guo et al. 1998). Kelley et
Drumm ont également montré, chez la souris, que le NO pouvait entraîner une inhibition de
l'absorption de Na+ et que cet effet impliquait la voie du GMPc (Kelley et Drumm 1998).
L'inhibition de l'absorption de Na+ par le NO et l'implication de la voie du GMPc observées
dans notre étude sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et
bronchiolaires non-CF sont donc en accord avec ces études. Cependant, nos résultats sont
discordants avec les résultats obtenus par Rückes-Nilges et al. sur des cultures primaires de
cellules nasales humaines (Rückes-Nilges et al. 2000). En effet, dans leur étude, Rückes-
Nilges et al n'ont pas observé d'effet du NO sur les transports de Na+ dans des cultures de
cellules nasales provenant de patients non-CF et CF. Ces différences pourraient être
expliquées par un mode d'action différent du NO sur les transports ioniques selon les étages
de l'arbre aérien. Cependant, Schwiebert et al. ont montré que le NO pouvait stimuler les
canaux dépendant des nucléotides cyclique cationiques (cNTP-dépendants) dans les cellules
trachéales de rat (Schwiebert et al. 1997). L'ARNm de ces canaux a été retrouvé dans
l'épithélium nasal humain. Les observations de Rückes-Nilges et al. pourraient donc résulter
d’un effet combiné : activation de ces canaux cNTP-dépendants et inhibition des canaux
ENaC. Lazrak et al. ont observé que l’exposition au NO ou l’augmentation de la
concentration en GMPc intracellulaire inhibait l’absorption de Na+ sensible à l’amiloride dans
la lignée cellulaire alvéolaire humaine A549 (Lazrak et al. 2000). Nos résultats sont donc en
accord avec cette étude.
172
Nous avons également observé dans notre étude une inhibition de la sécrétion de Cl-
AMPc-dépendante dans les cultures de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires
non-CF. Elmer et al. ont observé que le NO provoquait une augmentation de la sécrétion de
Cl- dans l’épithélium nasal murin (Elmer et al. 1999). En revanche, une autre étude montre
que, dans le poumon fœtal de mouton, le NO diminue la production de liquide due à la
sécrétion de Cl- et d'eau, suggérant une inhibition de la sécrétion active de Cl- (Cummings et
Wang 2001). Les auteurs ont également montré que ces effets passeraient par une
augmentation de la concentration du GMPc intracellulaire. Kamosinska et al. ont observé que
le NO pouvait stimuler la sécrétion de Cl- dans la lignée cellulaire pulmonaire A549 par la
voie du GMPc (Kamosinska et al. 1997). Cependant, les auteurs précisent que cette sécrétion
de Cl- est indépendante de CFTR. A l’inverse, Rückes-Nilges et al. n'ont pas observé d'effet
sécrétagogue du NO dans des cultures primaires de cellules nasales (Rückes-Nilges 2000).
Les résultats obtenus par Kamosinska et al. et Elmer et al. ont été obtenus sur des lignées
cellulaires et ne reflètent donc pas forcément les propriétés des tissus correspondants.
Nos résultats montrent que le SNP induit également une diminution de l'Isc de base
ainsi qu'une diminution de la variation de l’Isc sensible à l'amiloride dans les cultures
primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires humaines CF. Ces résultats
indiquent que le NO inhibe l'absorption active de Na+ sensible à l’amiloride dans les voies
aériennes mucoviscidosiques. Rückes-Nilges et al. n'ont pas observé d’effet inhibiteur du NO
sur l'absorption de Na+ dans des cultures primaires de cellules nasales CF (Rückes-Nilges et
al. 2000). En revanche, Texereau et al. ont récemment montré que chez des patients CF les
valeurs de la ddp nasale et la concentration en NO dans l'air exhalé étaient inversement
corrélées (Texereau et al. 2005). Les auteurs montrent en effet que les plus hautes valeur de
NO dans l'air exhalé sont associées au plus basses valeurs de ddp et inversement avec
173
toutefois une disparition de cette relation pour des valeurs de ddp nasale supérieure à -50mV.
Les auteurs ont suggéré que le NO pouvait inhiber l'absorption de Na+, en partant du fait que
celle-ci est la principale composante de la conductance transépithéliale basale. Par ailleurs,
Kelley et Drumm ont démontré chez des souris knock-out pour CFTR que la perfusion
d'inhibiteur des NOS augmente les valeurs de la différence de potentiel transépithéliale nasale
(Kelley et Drumm 1998). Les résultats que nous avons obtenus au cours de cette étude sur les
cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF sont donc en accord avec ces derniers
résultats.
En conclusion, nous avons observé que le NO inhibe les transports de Na+ et de Cl-
transépithéliaux au niveau des voies aériennes humaines proximales et distales non-CF et CF
et que ces effets semblent passer par la voie du GMPc. Ces résultats peuvent avoir une
implication importante dans le cadre de la mucoviscidose. En effet la diminution de la
concentration en NO dans l'air exhalé observée chez les patients mucoviscidosiques pourrait
participer à l'hyperabsorption de Na+, altérant la clairance mucociliaire et favorisant les
infections bactériennes chroniques. L’administration de NO pourrait donc représenter un
moyen potentiel pour normaliser le transport de Na+ dans les voies aériennes
mucoviscidosiques.
174
7 D7 D7 D7 DÉÉÉÉTERMINATION DUTERMINATION DUTERMINATION DUTERMINATION DU POURCENTAGE DEPOURCENTAGE DEPOURCENTAGE DEPOURCENTAGE DE
CELLULESCELLULESCELLULESCELLULES NONNONNONNON----CF PERMETTANT DECF PERMETTANT DECF PERMETTANT DECF PERMETTANT DE
NORMALISER LESNORMALISER LESNORMALISER LESNORMALISER LES FONCTIONS FONCTIONS FONCTIONS FONCTIONS ÉÉÉÉPITHPITHPITHPITHÉÉÉÉLIALESLIALESLIALESLIALES
D'UNE CULTURE PRIMAID'UNE CULTURE PRIMAID'UNE CULTURE PRIMAID'UNE CULTURE PRIMAIRE DE CELLULES RE DE CELLULES RE DE CELLULES RE DE CELLULES
ÉÉÉÉPITHPITHPITHPITHÉÉÉÉLIALESLIALESLIALESLIALES BRONCHIQUES BRONCHIQUES BRONCHIQUES BRONCHIQUES CFCFCFCF
175
7.1 Introduction
Les maladies génétiques, comme la mucoviscidose, sont dues à des mutations
génétiques entraînant la synthèse de protéine altérée voire l'absence de protéine provoquant
des dysfonctionnements cellulaires et organiques. Afin de restaurer les fonctions
physiologiques, plusieurs stratégies peuvent être envisagées. 1/ L'utilisation d'agents
pharmacologiques. Dans le cadre de la mucoviscidose, la mutation la plus fréquemment
rencontrée est la mutation ∆F508 qui entraîne l'absence de la protéine à la membrane mais la
protéine mutée reste potentiellement fonctionnelle. L'utilisation d'agents pharmacologiques
permettant d'adresser ce mutant à la membrane peut donc constituer une voie thérapeutique.
De tels activateurs sont en cours de développement (Noel et al. 2006; VanGoor et al. 2006).
2/ Le remplacement du gène défectueux par le gène sauvage (non muté) par thérapie génique.
Le succès de la thérapie génique repose sur plusieurs points importants, parmi lesquels
l’incorporation efficace du gène et du promoteur correspondant dans la cellule cible. Après
cette incorporation, la protéine doit être produite à un taux physiologique et doit remplir son
rôle fonctionnel au sein de la cellule. Idéalement, le transfert de gène doit entraîner une
expression permanente ou au moins à long terme dans les cellules malades et prévenir ainsi la
cascade physiopathologique causée par la mutation.
Le principe de la thérapie génique est « simple », il « suffit » de remplacer le gène
muté par le gène normal (figure 47). Cette stratégie thérapeutique concerne essentiellement
les maladies provoquées par le dysfonctionnement d’un seul gène, comme la mucoviscidose
ou le déficit en α1-anti-trypsine. Cependant, des études récentes suggèrent que cette thérapie
pourrait être envisagée dans le traitement des cancers (Cross et Burmester 2006).
176
Figure 47 : Schéma simplifié du principe de la thérapie génique. Le vecteur contenant la copie normale du gène responsable de la maladie reconnaît spécifiquement sa cellule cible. Le vecteur est internalisé dans la cellule cible, la copie du gène normal pénètre dans le noyau dans la cellule et s’intègre dans le génome de la cellule. La protéine normale est alors correctement produite, adressée (à la membrane apicale pour CFTR) et est fonctionnelle (d’après http://www.gensuisse.ch).
177
Si la thérapie génique semble constituer la stratégie idéale pour « guérir » les personnes
atteintes par ces maladies monogéniques, le choix du vecteur et des cellules cibles, le mode
d’administration,… demeurent des facteurs cruciaux dans son efficacité.
7.1.1 Identification des cellules cibles dans les voies aériennes
Le choix de la/les cellule(s) à corriger demeure une des conditions essentielles pour
que la thérapie génique puisse être efficace. Les études portant sur l’expression de CFTR ont
permis de relativement bien définir sa distribution dans les voies aériennes proximales
(Engelhardt et al. 1992 ; Kreda et al. 2005). Kreda et al. ont observé, par immunohistochimie,
que les cellules ciliées étaient les seules cellules exprimant CFTR dans l’épithélium de surface
des voies aériennes, de la trachée aux bronchioles proximales. Kreda et al. n’ont en revanche,
pas détecté de marquage spécifique de la protéine CFTR dans les bronchioles terminales,
respiratoires et dans les alvéoles (Kreda et al. 2005). Cependant, nous avons observé au
laboratoire, un marquage spécifique correspondant à la protéine CFTR au niveau des alvéoles.
Nos données sont en accord avec les résultats de Fang et al. qui ont récemment montré que
CFTR était exprimé dans des cultures de pneumocytes de type II isolées à partir d'un poumon
adulte humain. Ils ont montré, par RT-PCR que le niveau d'expression des transcrits de CFTR
était similaire à ceux reportés dans les cellules épithéliales des voies aériennes et des études
fonctionnelles ont apporté la preuve de canaux chlore CFTR (Fang et al. 2006). Ces données
suggèrent 1/ que la protéine CFTR est exprimée tout le long des voies aériennes humaine et 2/
que les cellules ciliées sont le principal site d’expression dans l’épithélium de surface
bronchique et bronchiolaire. Les cellules ciliées peuvent donc constituer les cellules à corriger
aussi bien dans les voies aériennes proximales que distales.
178
Cependant, les cellules ciliées sont des cellules différenciées dont la durée de vie est
estimée à 3 mois chez l’homme (Anson et al. 2006). Une efficacité à plus long terme de la
thérapie génique impliquerait donc de cibler les cellules progénitrices (cellules avec un
nombre de divisions cellulaire défini, sans capacité d’auto-renouvellement et quelques
caractéristiques de différenciation) ou les cellules souches (cellules avec un nombre de
division cellulaire non défini, des capacités d’auto-renouvellement et des capacités à générer
des cellules progénitrices) à l’origine des cellules ciliées (Hong et al. 2001). Dans les voies
aériennes proximales humaines, les cellules souches n’ont pas encore été clairement
identifiées. Une étude récente a cependant démontré que dans les voies aériennes proximales,
les cellules basales isolées à partir de tissu pulmonaire humain adulte étaient capables de
restaurer un épithélium des voies aériennes bien différencié et fonctionnel (Hajj et al. 2006).
Ces résultats suggèrent que les cellules basales sont progénitrices de l’épithélium de surface
des voies aériennes proximales.
Dans les voies aériennes distales, dans lesquelles les cellules basales sont absentes, les
cellules de Clara ont montré des capacités de renouvellement dans l’épithélium des voies
aériennes de rongeur. Ces résultats suggèrent que les cellules de Clara pourraient constituer
des cellules régénératrices de l’épithélium des voies aériennes de mammifères (Boers et al.
1999). Chez l’homme, une hypothèse suggère qu’elles remplacent les cellules basales
progénitrices absentes des voies aériennes distales. Chez la souris, Reynolds et al., après avoir
détruit les cellules de Clara par exposition au naphtalène ont identifié deux types cellulaires
capables de proliférer : les CE (Clara cell secretory protein Expressing) et les PNEc
(Pulmonary NeuroEndocrine cells) situées dans des corps pulmonaires neuroendocrines
(NEB) (Reynolds et al. 2000). Les PNEc présentent des capacités d’autorenouvellement,
cependant, la présence des cellules CE semble être nécessaire pour induire la régénération de
179
l’épithélium (Hong et al. 2001). Au niveau alvéolaire, il est généralement admis que les PII
possèdent des propriétés de cellules progénitrices (Bishop et al. 2004 ; Anson et al. 2006).
En conclusion, la réparation et la régénération de l’épithélium pulmonaire ne fait
probablement pas appel à un seul type de cellules souches/progénitrices, chaque étage des
voies aériennes semblant en effet posséder son propre réservoir.
7.1.2 Les différents vecteurs utilisés dans les voies aériennes
humaines
Le faible niveau de transfection obtenu avec l’ADN nu a conduit à l’utilisation de
vecteurs afin d’améliorer l’efficacité du transfert et l’expression du gène. L’ADNc du gène
CF, pour la mucoviscidose, est utilisé comme matériel de transfert. Il est intégré dans un
vecteur biologique. Les vecteurs peuvent être divisés en deux groupes : les vecteurs viraux
modifiés et les vecteurs non viraux (tableau 12).
7.1.2.1 Les vecteurs viraux
Les adénovirus ont été fréquemment utilisés lors des premiers essais de thérapie
génique dans le cadre de la mucoviscidose.
180
Viraux
Retrovirus Lentivirus
Adénovirus
AAV
Parainfluenza virus 1
Sendai virus
Non viraux
ADN nu
Liposomes
Cationiques
Vecteurs Avantages Inconvénients
Pas de gènes viraux, pas de protéines
virales, intégration dans les génome hôte
(rétrovirus)
Pas de réaction immunitaire, applications
répétées possibles, sureté
Possible insertion mutagène, division
cellulaire nécessaire pour l'intégration
(rétrovirus), faible concentration
Réponse immunitaire, inefficace lors
d'applications répétées
Taille ADNc limitée, synthèse difficile
Inflammation, réponse immunitaire
Transduction inefficace
Expression transitoire et faible
Efficacité, ne nécessite pas de division
cellulaire, produit en grande
concentration
Pas de gènes viraux, pas de protéines
virales, ne nécessite pas de division
cellulaire
Génome ARN, récepteurs apicaux,
réplication dans le cyoplasme
Simplicité, sureté, faible coût, pas de
réaction immunitaire
Tableau 12 : Avantages et désavantages des vecteurs actuellement utilisés pour le transfert de gène dans les voies aériennes (d’après Kolb et al. 2006).
181
Ces virus sont en effet naturellement capables d’infecter les voies aériennes humaines. Le
transfert de gène s’opère selon le principe d’une infection virale. Le virus, préalablement
rendu non virulent, se fixe sur la cellule cible et libère la copie du nouveau gène.
Malgré plusieurs générations d’adénovirus contenant de moins en moins de séquences
virales et un temps d’expression de la protéine amélioré, l’administration de ce type de
vecteur entraîne une réaction immunitaire dirigée contre les protéines virales (pour la
première génération d’adénovirus) et contre les composants de la capside virale (Flotte et
Laube 2001). De plus, les adénovirus ne permettent pas l’intégration du gène dans le génome
de la cellule et nécessite donc des administrations répétées. L’utilisation des adénovirus a
diminué lors de ces dernières années principalement à cause d’une efficacité insuffisante et du
développement d’une réaction inflammatoire (Griesenbach et al. 2006).
Les virus adéno-associés (AAV) ne semblent pas associés dans leur état sauvage à des
pathologies humaines et sont retrouvés fréquemment dans les voies aériennes et le tractus
gastro-intestinal (Anson et al. 2006). Les vecteurs AAV possèdent plusieurs avantages par
rapport aux adénovirus, ils peuvent en effet s’intégrer dans le génome de la cellule hôte, « ils
ont un assez fort pouvoir « infectieux » et ne sont pas pathogènes. Le principal défaut des
AAV est leur capacité limitée de transport (4,7kb). L’insertion de la protéine CFTR, 4,5kb,
laisse donc une place limitée pour l’insertion d’éléments de contrôle transcritpionnel (Anson
et al. 2006). Des études pré-cliniques ont montré un transfert de gène et une expression sur un
temps relativement long (de 3 à 6 mois) dans les cellules épithéliales bronchiques de lapin ou
de primates (Flotte et al. 2005). Des essais cliniques de phase I puis de phase II ont montré un
transfert de gène efficace jusqu'à 30 jours après l’exposition initiale à l’AAV (rAAV2-CFTR).
Cependant, lors de ces études, des anticorps ont été détectés et la répétition de l’exposition à
182
l’AAV a montré une diminution de l’efficacité du transfert de gène (Flotte et al. 2005). La
génération d’autres AAV (AAV1, 4, 5, 6) qui ont montré une efficacité de transfection
supérieure à l’AAV2 (Zabner et al. 2000 ; Halbert et al. 2001 ; Virella-Lowell et al. 2005) ou
la restauration de transport de Cl- dans un lignée cellulaire CF (Sirninger et al. 2004) en font
des vecteurs de thérapie génique potentiellement intéressants dans le cadre de la
mucoviscidose.
Les lentivirus (Human Immunodeficiency Virus -1, Feline Immunodeficiency Virus,
Eequine Infectious Anaemia Virus, Simian Immunodeficiency Virus (SIV),…) ont également
été utilisés comme vecteurs. Une étude a montré que l’utilisation du SIV permettait une
expression à relativement long terme (200 jours) dans l’épithélium nasal murin (Griesenbach
et al. 2006). Cependant, le type de cellules transfectées n’a pas été déterminé dans cette étude.
La faisabilité de l’administration répétée de vecteurs lentiviraux dans les voies aériennes est
actuellement étudiée par plusieurs groupes.
7.1.2.2 Les vecteurs non-viraux
L’utilisation de vecteurs non viraux est également étudiée dans le cadre de la thérapie
génique. Ces vecteurs sont principalement les liposomes cationiques et les polymères
synthétiques (Montier et al. 2004 ; Davies 2006). Les mécanismes par lesquels les liposomes
cationiques libèrent l’ADNc dans la cellule ne sont pas encore totalement élucidés. Toutefois,
la diminution de la réponse inflammatoire et de la toxicité des vecteurs apparaîssent comme
des points importants en faveur des vecteurs non viraux. Des essais cliniques ont montré que
l’utilisation de liposomes pour transférer le gène CF dans l’épithélium nasal humain
183
permettait des corrections fonctionnelles (amélioration des transports de Cl-, pas d’effet sur
les transports de Na+) (Alton 2004 ; Davies 2006). Ces observations ont conduit à
l’administration de l’ADNc de CFTR dans le poumon de patients CF. Les auteurs ont observé
une amélioration des transports de Cl-, une diminution de l’adhérence bactérienne mais pas
d’amélioration des transports de Na+ (Alton et al. 1999 ; Alton 2004). Selon Davies,
l’administration répétée de vecteurs cationiques non viraux (DC-Chol/DOPE) serait bien
tolérée et resterait efficace (Davies 2006).
Les vecteurs viraux et non viraux possèdent chacun des avantages mais également des
désavantages, il apparaît que le vecteur « idéal » devra tenir compte des avantages de chacun.
Selon Alton et al., le vecteur idéal devrait répondre à 5 critères : 1/ administrable de façon
répétitive, 2/ stable et correspondant aux standards GMP (Good Manufacturing Pratices), 3/
administrable par inhalation, 4/ profil de « sûreté acceptable », 5/ capable d’être utilisé pour
des essais cliniques dans les 5 ans (Alton et al. 2004).
7.1.3 La barrière épithéliale
L’une des fonctions principales de l’épithélium des voies aériennes est de protéger
l’organisme d’agents pathogènes contenus dans l’air inhalé. Mais les systèmes de défense de
l’épithélium (clairance mucociliaire, jonctions serrées, localisation basolatérale des récepteurs
des vecteurs viraux, glycocalyx) limitent également l’efficacité des vecteurs utilisés dans les
essais de thérapie génique (Pickles 2004 ; Anson et al. 2006). Nous avons vu précédemment
que l’escalator mucociliaire permettait d’éliminer efficacement les particules inhalées et que
les complexes jonctionnels assuraient « l’étanchéité » de l’épithélium. Les récepteurs des
184
adénovirus et du virus de Coxsackie (CAR) sont séquestrés dans la partie basolatérale de la
membrane (Pickles et al. 1998). Pickles et al., dans la lignée cellulaire MDCK, ont réussi à
faire exprimer des CAR à la face apicale des cellules. Cependant, l’infection par les
adénovirus était toujours peu efficace. Après un traitement enzymatique permettant d’éliminer
les composants du glycocalyx, l’infection était 30 à 40 fois plus efficace (Pickles et al. 2000).
Des études ont estimé que 70% à 90% des adénovirus étaient séquestrés dans les macrophages
24h après leur administration (Pickles 2004). Selon les auteurs, les composants du glycocalyx
pourraient « présenter » les adénovirus aux macrophages entraînant ainsi leur dégradation par
phagocytose (Pickles 2004). Le développement d’une réponse immunitaire acquise, humorale
ou cellulaire, a montré une diminution de l’efficacité de plusieurs vecteurs lors de leur ré-
administration (Ferrari et al. 2003). Finalement, il existe également des barrières
intracellulaires pouvant limiter l’expression du gène. Le protéasome et les lysosomes
interviendraient entre autres dans l’élimination intracellulaire des vecteurs (Montier et al.
2004, Anson et al. 2006).
Si les études de thérapie génique, dans le cadre du traitement de la mucoviscidose, ont
démontré une certaine efficacité (amélioration des transports de Cl- principalement) et permis
de réaliser de nombreux progrès aussi bien techniques que théoriques, la thérapie génique doit
encore « mûrir » avant de proposer une solution alternative (définitive ?) à celles déjà
existantes. Cependant, l’amélioration de l’efficacité du transfert de gène (électroporation,
ultrason, magnétisme), le développement rapide des vecteurs non viraux (faible toxicité,
immunogénicité, facilité de fabrication,…) font que la thérapie génique reste envisageable.
185
7.1.4 La thérapie génique dans le cadre de la mucoviscidose
Rapidement après la découverte du gène CF, des études de thérapie génique ont été
entreprises avec différents vecteurs (rétrovirus, adénovirus, AAV, lipides cationiques,…) afin
de tester la faisabilité de la thérapie génique dans la mucoviscidose. Johnson et al. ont
transfecté 100 % des cellules d’une lignée cellulaire épithéliale d’origine trachéale humaine
(CFT1) à l’aide d’un rétrovirus contenant l’ADNc normal de CFTR. Les auteurs ont ensuite
mixé les cellules transfectées avec des cellules provenant de la même lignée mais non
transfectées. Par cette méthode, Johnson et al. ont démontré que 6 à 10 % de cellules
transfectées avec l’ADNc de CFTR permettait de restaurer des transports de Cl- dans la lignée
cellulaire CFT1 (Johnson et al. 1992). Cependant, les mêmes auteurs ont suggéré que dans
des cultures primaires de cellules épithéliales nasales CF près de 100 % des cellules
épithéliales CF devaient être corrigées afin d'observer une réduction de l'hyperabsorption de
Na+ caractéristique de la mucoviscidose (Johnson et al. 1995). Zabner et al. ont montré dans
des cultures primaires de cellules épithéliales des voies aériennes que la correction de CFTR,
par transfection avec un adénovirus, dans 20 % des cellules était suffisant pour corriger les
défauts des transports de fluide et d'électrolytes (Zabner et al. 1994). Plus récemment,
Ramalho et al. ont démontré que les patients CF avec les mutations ∆F508/3272-26A>G
possèdent 5 % de l'ARNm de CFTR par rapport aux personnes non CF (Ramalho et al. 2002).
Les auteurs ont suggéré que ce pourcentage pourrait être suffisant pour diminuer la sévérité de
la maladie, en raison du fait que chez ces patients la plupart des symptômes cliniques, dont les
fonctions pulmonaires, étaient moins sévères que chez les patients CF avec 2 mutations
sévères.
Ces études rapportent donc des résultats incomplets et discordants mais suggèrent
cependant qu'un faible niveau d’expression dans l’épithélium des voies aériennes de CFTR
186
pourrait être suffisant afin de corriger les transports de Cl- AMPc-dépendant ; elles suggèrent
également qu'un pourcentage plus important pourrait être nécessaire afin de corriger
l'hyperabsorption de Na+. Le but de notre étude a été de déterminer si 10 % de cellules non-
CF peuvent restaurer les transports de Na+ et de Cl- dans des cultures primaires humaines CF
provenant principalement de patients homozygotes pour la mutation ∆F508. Afin de tester
cette hypothèse, nous avons préparé 3 types de cultures primaires de cellules épithéliales
bronchiques humaines : 100 % CF, 100 % non-CF et 90 % CF et 10 % non CF (le dernier
type de culture sera désigné par la suite « co-cultures »). Nous avons ensuite mesuré les
variables bioélectriques de base (ddp, Isc et Rt) ainsi que les réactions à l'amiloride et à la
forskoline pour chaque type de cultures en chambres dites de Ussing. De plus, plusieurs
études ayant démontré un niveau d'interleukine 8 (IL-8) constitutionnellement plus élevé dans
les voies aériennes CF par rapport aux voies aériennes non CF (Bonfield et al. 1995 ; Tabary
et al. 2000), nous avons également dosé cette cytokine dans le surnageant des trois types de
préparations afin d’observer si d’autres fonctions épithéliales pouvaient être normalisées par
la présence d’un faible pourcentage de cellules de phénotype non-CF.
187
7.2 Matériels et méthodes
7.2.1 Echantillons
Cf chapitre 6.2.1
7.2.2 Cultures cellulaires
Cf chapitre 6.2.2
7.2.2.1 Co-cultures
Les co-cultures n'ont pu être réalisées que lorsque que nous avons reçu deux
prélèvements (un mucoviscidosique et un non mucoviscidosique) dans un laps de temps
relativement court (de 24h à 48h). Les cellules épithéliales bronchiques CF et non CF ont été
isolées comme décrit précédemment (cf. 6.2.2.1.2). Les cellules ont été ensuite comptées sur
une lame de Malassez : 10µl du culot cellulaire ont été dilués 100 ou 200 fois selon la densité
cellulaire, dans du milieu de culture; puis 15µl de ce mélange ont été déposés sur la lame de
Malassez. Après le comptage des cellules mucoviscidosiques et non mucoviscidosiques,
celles-ci ont été mélangées dans un tube Eppendorf selon les proportions voulues (tableau 13).
Le mélange cellulaire a ensuite été ensemencé comme décrit ci-dessus (cf. 6.2.2.1.3).
188
Cultures CF Co-cultures Cultures non-CF
Cellules
mucoviscidosiques (en %) 100 90 0
Cellules de phénotype
normal (en %) 0 10 100
Tableau 13 : Différentes concentrations de cellules utilisées pour la réalisation des co-cultures.
7.2.3 Evaluation de la prolifération cellulaire durant le temps
de culture
La prolifération cellulaire a été étudiée dans les trois types de préparations cellulaires
par immunomarquage (Ki67) à J0, J3, J5, J6, J10 après l'ensemencement. Les prélèvements
ont été inclus en bloc de paraffine puis coupés en sections de 4 µm d'épaisseur à l'aide d'un
microtome. Ces sections ont été placées sur des lames Super Frost Plus (CML, Nemours,
France), laissées une nuit à 37 °C dans une chambre humide, puis les sections ont été
déparaffinées par immersion dans une série de bains d'alcool. L'activité des peroxydases
endogènes a été réduite par un double chauffage à 95 °C pendant 40 min dans un tampon de
citrate (10 mM) de pH 6. L'activité des peroxydases endogènes a ensuite été bloquée par une
incubation de 10 min dans un bain d'H2O2 à 3 % à température ambiante (TA). Les sections
ont été incubées avec l'anticorps dirigé contre la protéine Ki67 à TA pendant 30 min (dilution
1/50ème). Le marquage a été révélé à l'aide de la méthode HRP (horseradish peroxydase)-
labeled polymer utilisant le kit LSAB2 (DakoCytomation, Trappes, France). Les sections ont
189
été colorées avec le 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride contenant 3% H2O2 dans un
tampon Tris puis légèrement contre-colorées à l’hémalun de Mayer. Après déshydratation par
immersion dans une série de bains d'alcool et de toluène, les sections ont été montées
automatiquement (RCM 90, Tech Inter, Maurepas, France).
Pour l'évaluation du marquage, les cellules ont été considérées comme positives
lorsqu'un marquage nucléaire distinct a été observé. Les lames ont été évaluées par 3
observateurs indépendants qui ont compté au moins 200 cellules sur différentes parties des
lames. Les résultats correspondent à la moyenne des 3 observateurs. Le niveau d'expression
du Ki67 correspond au ratio du nombre de cellules marquées positivement sur le nombre total
de cellules comptées.
7.2.4 Evaluation de l'apoptose au cours du temps de culture
La méthode TUNEL (« terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end
labelling ») a été réalisée à l'aide du kit Apo-Tag-Plus peroxidase in situ apoptosis detection
kit (S7101, Abcys, Paris, France) sur les 3 types de préparations cellulaires. Les cultures ont
été incluses dans un bloc de paraffine puis coupées en sections de 4 µm d'épaisseur à l'aide
d'un microtome. Ces sections ont été déparaffinées puis pré-traitées avec de la protéinase K
(20 µg/ml) pendant 15 min à TA. Après rinçage à l'eau distillée, l'activité peroxydase
endogène a été bloquée par incubation de 5 min dans H2O2 (3 %) pendant 5 min à TA. Après
rinçage, les préparations ont été incubées pendant 1 heure dans une chambre humide à 37°C
dans une solution contenant l’enzyme « terminal deoxytransferase » (TdT). Les sections ont
ensuite été rincées dans une solution « stop », bloquant ainsi la réaction, pendant 10 min à
190
TA, puis incubées avec le conjugué anti-digoxigénine pendant 30 min dans une chambre
humide à TA. La réaction a été révélée par exposition au diaminobenzidine (DAB). Les
sections ont ensuite été contre-colorées au vert de méthyle puis montées sur lames
automatiquement avant observation en microscopie optique.
Les contrôles négatifs ont été effectués en omettant de mettre l’enzyme TdT. Les
contrôles positifs ont été réalisés en exposant préalablement les sections à la DNase I (Sigma,
St Quentin-Fallavier, France) comme indiqué par le fabricant. Nous avons également utilisé la
lame témoin positif contenue dans le kit.
Pour l'évaluation du marquage, les cellules ont été considérées comme positives
lorsqu'un marquage nucléaire distinct et intense a été observé. Les lames ont été évaluées par
3 observateurs indépendants et les résultats correspondent à la moyenne de ces 3 observateurs.
Les résultats sont exprimés en fonction du nombre de cellules marquées par rapport au
nombre total de cellules comptées.
7.2.5 Mesure des propriétés bioélectriques des cultures
primaires bronchiques dans les chambres de Ussing
Cf chapitre 6.2.3.1, 6.2.3.2 et 6.2.3.3
191
7.2.3.4 Protocoles
Les cultures confluentes ont été montées en chambre de Ussing comme décrit
précédemment. Après stabilisation du système et mesure des variables bioélectriques de base
(ddp, Isc et Rt), les drogues amiloride (10-5M en apical), forskoline (10-5M en apical et en
basolatéral) ont été ajoutées séquentiellement.
7.2.6 Dosage des cytokines IL-8 dans le surnageant des
cultures (kit ELISA)
Deux cent cinquante µL de milieu de culture ont été déposés pendant 24h à la face
apicale des 3 types de culture primaire à confluence. Les surnageants ont été récupérés et
stockés à -20°C pour un dosage ultérieur de la cytokine IL-8. La détermination de la
concentration en IL-8 a été réalisée à l’aide d'un kit ELISA (R&D System, Lille, France) en
suivant les recommandations du fabricant. La limite de détection de ce kit est 3,5 pg/ml.
192
7.3 Résultats
7.3.1 Caractéristiques des prélèvements
Les caractéristiques des patients CF et non-CF sont indiquées dans le tableau 14.
n Moyenne d’âge (moyenne ± SE
ans)
Sexe (homme/femme)
Mutations
Patients CF 5 27,4 ± 2,6 5h
4 homozygotes ∆F508, 1
hétérozygote ∆F508/XX
Patients non-CF 4 62,3 ± 3,1 4h
Tableau 14 : Caractéristiques des patients inclus dans cette étude (n = nombre de patients).
7.3.2 Evaluation de la prolifération cellulaire durant le temps
de culture (Ki67)
Les pourcentages des cellules marquées dans les cultures 100 % CF, 100 % non-CF et
dans les co-cultures sont indiqués dans le tableau 15.
193
J0 J3 J5 J6 J10
Cultures 100 %
CF (n=5) 3,0 ± 0,9 0 0,3 ± 0,3 0 0,7 ± 0,7
Cultures 100 %
non-CF (n=9) 5,2 ± 1,0 0,1 ± 0,1 2,1 ± 0,8 3,8 ± 0,8 2,4 ± 1,3
Co-cultures 3,2 ± 0,2
(n=3)
0
(n=3)
0,4 ± 0,3
(n=6)
3,4 ± 1,6
(n=6)
0,3 ± 0,3
(n=6)
Tableau 15 : Résultats de l'évaluation de la prolifération cellulaire par immunomarquage (Ki67) dans les 3 types de préparations cellulaires (100 % CF, 100 % non-CF et co-cultures) au cours de leur temps de culture. Les résultats présentés dans ce tableau correspondent à la moyenne des résultats obtenus par chacun des 3 observateurs pour chaque type de préparations cellulaires et pour chaque date de prélèvement (moyenne ± SEM).
7.3.3 Evaluation de l'apoptose au cours du temps de culture
par la méthode « TUNEL »
Les pourcentages des cellules marquées dans les cultures 100 % CF, 100 % non-CF et
dans les co-cultures sont indiqués dans le tableau 16.
194
J0 J3 J5 J6 J10
Cultures 100 % CF
(n = 6) 2,1 ± 0,8 3,0 ± 0,8 2,0 ± 1,5 2,0 ± 0,5 6,5 ± 1,5
Cultures 100 %
non-CF (n = 8) 2,6 ± 0,7 2,4 ± 0,5 2,4 ± 0,7 2,3 ± 1,0 1,8 ± 0,4
Co-cultures (n = 6) 2,8 ± 1,6 3,0 ± 0,5 1,5 ± 0,5 3,1 ± 1,5 0
Tableau 16 : Résultats de l'évaluation de l'apoptose par la méthode TUNEL dans les 3 types de préparations cellulaires (100 % CF, 100 % non-CF et co-cultures) au cours de leur temps de culture. Les résultats présentés dans ce tableau correspondent à la moyenne des résultats obtenus par chacun des 3 observateurs pour chaque type de préparations cellulaires et pour chaque date de prélèvement (moyenne ± SEM).
7.3.4 Études en chambres de Ussing
Dix-huit cultures de cellules épithéliales bronchiques CF, 12 cultures de cellules
épithéliales bronchiques non-CF et 20 co-cultures ont été étudiées en chambre de Ussing. Les
variables bioélectriques de base des 3 types de préparations sont indiquées dans le tableau 17.
Variables bioélectriques de base
Type de cultures ddp (mV) Isc (µA/cm2) Rt (Ω.cm2)
Cultures 100 % CF (n = 18)
-4,0 ± 0,4 59,2 ± 5,4 71,8 ± 6,6
Cultures 100 % non-CF (n = 12)
-3,0 ± 0,4 42,8 ± 5,7* 76,6 ± 11,3
Co-cultures (n = 20)
-3,4 ± 0,4 43,5 ± 3,4** 90,5 ± 12,4
Tableau 17 : Variables bioélectriques de base des différents types de cultures. Les variables ddp, Isc et Rt ont été mesurés après la stabilisation des cultures. * signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et cultures 100 % non-CF, ** signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et co-cultures. Un p < 0,05 a été considéré comme significatif (n correspond au nombre de cultures cellulaires, moyenne ± SEM).
195
L’addition d’amiloride à la face apicale des cultures a provoqué une diminution
significative de l’Isc dans les trois types de préparations. Cette diminution est cependant
significativement supérieure dans les cultures 100 % CF par rapport aux cultures 100 % non-
CF (p < 0,05) ainsi que par rapport aux co-cultures (p < 0,05). Nous n’avons pas observé de
différence entre les cultures 100 % non-CF et les co-cultures. En présence d’amiloride,
l’addition de forskoline à la face apicale et à la face basolatérale des cultures a entraîné une
augmentation de l’Isc significativement supérieure à la fois dans les cultures 100 % non-CF et
dans les co-cultures par rapport aux cultures 100 % CF (p < 0,05). Ces résultats sont
regroupés dans le tableau 18. Nous n’avons pas observé de différence significative entre les
cultures 100 % non-CF et les co-cultures.
Amiloride Forskoline
Type de cultures
∆Isc (µA/cm2) ∆Isc (%) ∆Isc (µA/cm2) ∆Isc (%)
100 % CF (n = 18)
-38,1 ± 5,1 -60,5 ± 3,8 0,2 ± 0,1 0,6 ± 0,4
100 % non-CF (n = 12)
-12,7 ± 2,7 * -30,4 ± 4,9* 2,4 ± 0,5 * 8,2 ± 1,5*
Co-cultures (n = 20)
-13,1 ± 1,5 ** -30,5 ± 2,8** 2,2 ± 0,7 ** 6,7 ± 1,9**
Tableau 18 : Effets de l’amiloride et de la forskoline sur l’Isc des 3 types de cultures. * signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et cultures 100 % non-CF, ** signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et co-cultures. Un p < 0,05 a été considéré comme significatif (n rend compte du nombre de culture et les résultats correspondent à la moyenne de ces cultures ± SEM).
196
Variations de l'Isc des différents types de cultures cellulaires en réponse à l'addition d'amiloride et de forskoline
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
∆∆ ∆∆ I
sc (µ
A/c
m2 )
100% CF
Cocultures
100% non CF
Figure 48 : Variations de l’Isc des différents types de cultures cellulaires en réponse à l’addition d’amiloride (10-5M, bain apical) et de forskoline (10-5M, bains apicaux et basolatéraux) (barre : p < 0,05).
Amiloride (10-5M)
Forskoline (10-5M)
197
7.3.5 Dosage de l’IL-8 dans le surnageant des cultures
La concentration moyenne d’IL-8 dans les surnageants des cultures 100 % CF mesurée
était de 26313 ± 3871 pg/ml/cm2 (n = 14). Cette concentration est significativement
supérieure par rapport aux cultures 100 % non-CF (n = 8, 11322 ± 1922 pg/ml/cm2, p < 0,05)
et aux co-cultures (n = 15, 8135 ± 988 pg/ml/cm2, p < 0,05). Nous n’avons pas observé de
différence entre les cultures 100 % non-CF et les co-cultures (figure 49).
198
[IL-8] dans les surnageants des cultures 100% CF, co-cultures et 100% non CF
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
[IL
-8]
en p
g/m
l/cm
2 Cultures CF
Co-cultures
Cultures non CF
Figure 49 : Concentrations en IL-8 mesurées dans le surnageant des cultures 100% CF, co-cultures et dans les cultures 100% non-CF (barre : p < 0,05).
199
7.4 Discussion
Dans cette étude, nous avons testé l’hypothèse que la présence de 10% de cellules
exprimant CFTR au sein d’une couche de cellules épithéliales bronchiques CF permettrait de
corriger les anomalies fonctionnelles de cette préparation. Nous avons déterminé les taux de
prolifération et d’apoptose au cours du temps de culture afin de nous assurer, respectivement,
de l’absence de prolifération et d’apoptose préférentielle des cellules non-CF ou CF, dans les
co-cultures. Nous avons ensuite étudié les propriétés électrophysiologiques de ces 3 types de
préparations en chambre de Ussing et mesuré la concentration d’une cytokine l’IL-8,
anormalement élevée dans les préparations CF. Nous avons observé que les transports de Na+
sensibles à l’amiloride, de Cl- dépendants de l’AMPc et que la sécrétion d’IL-8 étaient
normalisés dans les co-cultures.
Les résultats des immuno-marquages (Ki67 et TUNEL) montrent que la prolifération
cellulaire ainsi que le taux d’apoptose sont faibles et similaires dans les trois types de
préparations. On peut donc considérer que les co-cultures conservent leur répartition cellulaire
au moment de leur évaluation fonctionnelle. Nous avons évalué l'expression de la protéine Ki-
67 qui est fortement associée à la prolifération cellulaire (Scholzen et Gerdes 2000). La
présence de la protéine Ki-67 durant toutes le phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2 et
mitose) ainsi que son absence durant la phase G0 en fait un excellent outil permettant de
déterminer les cellules en prolifération au sein d’une population de cellules, y compris les
cellules épithéliales bronchiques. Récemment, des études ont également utilisé cette technique
sur des biopsies bronchiques et ont retrouvé un taux de prolifération d’environ 10%
(Benayoun et al. 2001). Cependant, nous n'avons pas retrouvé d'études portant sur la
200
prolifération cellulaire par immunomarquage de la protéine Ki67 sur des cultures primaires ;
notre étude montre que les cellules épithéliales bronchiques CF et non-CF cultivées en
interface air-liquide, selon nos conditions expérimentales, présentent un faible taux de
prolifération (<10%). Ces résultats sont en accord avec l’étude précitée et le faible taux de
prolifération pourrait être en rapport avec la forte densité cellulaire lors de la mise en culture
et résulter d’une inhibition de contact entre les cellules. Parallèlement à l'étude de la
prolifération cellulaire, nous avons également estimé le taux d'apoptose dans les 3 types de
préparations cellulaires par la méthode dite TUNEL. Dans nos préparations, un faible
pourcentage des cellules entre en apoptose et ce pourcentage est comparable entre les 3 types
de culture primaire. L’ensemble de ces résultats indique que nous avons conservé le
pourcentage initial des cellules CF et non-CF dans les co-cultures au moment de leur
évaluation fonctionnelle.
Les études en chambre de Ussing montrent 1) une différence significative entre les Isc
de base des cultures 100 % CF et les cultures 100 % non-CF ainsi qu’entre les cultures 100 %
CF et les co-cultures ; 2) une différence significative de la variation de l’Isc en réponse à
l’addition d’amiloride et de forskoline entre les cultures 100 % CF et les cultures 100 % non-
CF ainsi qu’entre les cultures 100 % CF et les co-cultures ; 3) qu’il n’existe pas de différence
significative entre les cultures 100 % non-CF et les co-cultures dans les variations de l’Isc
induites par l’amiloride et par la forskoline. Les données électrophysiologiques constituent
une évaluation fonctionnelle du phénotype CF et non-CF en terme de transport ionique. Des
études ont montré que l’Isc de base et les variations de l’Isc sensible à l’amiloride dans les
cultures de cellules épithéliales CF étaient significativement supérieurs par rapport à des
cellules non-CF, les variations de l’Isc induites par la forskoline étaient en revanche
significativement inférieures dans les cellules épithéliales CF (Boucher et al. 1986 ; Knowles
201
et al. 1986). Nos données obtenues en chambres de Ussing concernant les cellules épithéliales
CF et non-CF sont en accord avec ces études. Nos données concernant les co-cultures
indiquent clairement qu’elles se comportent comme des cultures non-CF.
Nous avons observé une concentration en IL-8 significativement supérieure dans les
surnageants provenant des cultures 100 % CF par rapport aux cultures 100 % non-CF ainsi
que par rapport aux co-cultures. Cette étude constitue une évaluation fonctionnelle des
phénotypes CF et non-CF en terme de sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-8. Des
études ont montré que la concentration en IL-8 dans les lavages broncho-alvéolaires de
patients CF était supérieure à celle observée chez des patients non-CF sans en déterminer
précisément l'origine (Bonfield et al. 1995 ; Dosanjh et al. 1998). Comme pour les données
électrophysiologiques, nos résultats indiquent clairement que les co-cultures se comportent
comme des cultures non-CF.
Au total, ces deux types d’évaluations permettent de conclure que 10% de cellules de
phénotypes non-CF serait suffisant pour normaliser les transports de Na+, de Cl- et la sécrétion
d’IL-8 dans les voies aériennes bronchiques humaines. Si ce pourcentage s’avère suffisant,
nous n’excluons pas qu’un pourcentage inférieur pourrait également permettre la restauration
des paramètres que nous avons étudié. Johnson et al. ont démontré que 6 à 10% de cellules
CFT1 corrigées par un ADNc de CFTR normal permettaient restaurer des transports de Cl-
normaux (Johnson et al. 1992). Selon les auteurs, l’hypothèse la plus probable pour expliquer
ces résultats serait le passage des ions Cl- via les jonctions communicantes établies entre les
cellules corrigées et non corrigées adjacentes. Les jonctions communicantes permettent en
effet de laisser passer des ions, ce mécanisme pourrait expliquer comment un faible
pourcentage de cellules non-CF peut normaliser les transports de Cl- dans notre modèle de co-
202
culture. Des études d’expression de protéines ENaC mutées dans l’ovocyte de Xénope ont
suggéré qu’il pouvait exister une interaction de charge entre ENaC et les ions Cl-. Cette
interaction serait susceptible d’inhiber ENaC lors d’une augmentation de la concentration
intracellulaire en ions Cl- et/ou par l’apparition d’une conductance Cl- (Kunzelmann 2003).
L’insertion d’une conductance Cl-, via les cellules de phénotype non-CF, dans les co-cultures
pourrait ainsi participer à la normalisation des transports de Na+. Le facteur de transcription
NF-κB intervient dans la régulation de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la
réponse inflammatoire, comme l’IL-8. Weber et al. ont montré que la perte de la conductance
Cl- dans des lignées cellulaires épithéliales (HTE et HBE) pouvait stimuler l’activation de NF-
κB et entraîner une augmentation de l’expression d’IL-8 (Weber et al. 2001). Dans notre
modèle de co-cultures, la restauration d’une conductance Cl- normale pourrait également
participer à la normalisation de la sécrétion d’IL-8.
En conclusion, nous avons montré que 10 % de cellules épithéliales bronchiques non-
CF permettent de normaliser les courants Na+ amiloride-sensibles et Cl- AMPc-dépendants
ainsi que la sécrétion d’IL-8 dans une culture primaire de cellules épithéliales bronchiques
CF. Les mécanismes qui interviennent dans la "normalisation" des propriétés des cultures
100% CF devront faire l'objet d'études ultérieures. Les résultats que nous avons obtenus
peuvent avoir des implications dans le cadre des thérapies cellulaire ou génique. En effet, ces
résultats suggèrent que le remplacement, par thérapie cellulaire, ou la correction, par thérapie
génique, d’environ 10 % des cellules de l’épithélium de surface bronchiques pourrait
permettre de normaliser les transports d’ions et la sécrétion d’IL-8 dans les voies aériennes
humaines CF.
203
8 8 8 8 CONCLUSIONSCONCLUSIONSCONCLUSIONSCONCLUSIONS ETETETET PERSPECTIVESPERSPECTIVESPERSPECTIVESPERSPECTIVES
204
La première partie de ce travail avait pour but d’étudier l’expression de CFTR dans les
voies aériennes distales humaines (épithéliums bronchiolaire et alvéolaire). Nous avons
observé que CFTR était exprimé dans les cellules bronchiolaires et dans les pneumocytes de
type I et II. Ces observations concordent avec les données électrophysiologiques obtenues
dans les cellules épithéliales bronchiolaires et alvéolaires. L'importance du marquage de
CFTR dans l’épithélium alvéolaire est une donnée nouvelle dont les implications devraient
faire l’objet de travaux supplémentaires notamment dans le domaine de la mucoviscidose. Le
marquage de CFTR au niveau bronchiolaire, associé aux études électrophysiologiques qui
indiquent d’une part la présence d’une conductance Cl- portée par CFTR dans les cellules
épithéliales bronchiolaires humaines et d’autre part les différences entre les propriétés
électrophysiologiques des voies aériennes proximales et distales humaines, renforcent l’idée
d’adapter les traitements en fonction de l’étage des voies aériennes.
Dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets du NO
sur les transports ioniques transépithéliaux dans les voies aériennes proximales et distales
non-CF et CF. Nos résultats indiquent que le NO inhibe de manière non sélective les
transports ioniques dans les voies aériennes humaines. Ces effets semblent impliquer la voie
du GMPc dans les voies aériennes proximales non-CF. La diminution de la concentration en
NO dans l'air exhalé chez les personnes mucoviscidosiques pourrait ainsi être un facteur
participant à l'aggravation de l'hyperabsorption de Na+. L'effet inhibiteur du NO sur les
transports de Na+ dans les voies aériennes mucoviscidosiques proximales et distales pourrait
en faire un potentiel agent thérapeutique pouvant participer à la normalisation de l'absorption
de Na+. Les effets du NO sur le battement ciliaire dans des cultures primaires de cellules
épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF mériteraient également d'être explorés. La
recherche d'agonistes et d'antagonistes des voies d'actions de cette molécule pourrait
205
permettre d'envisager de nouvelles approches thérapeutiques dans des pathologies comportant
des anomalies des transports d'ions et de fluide comme l'asthme ou la mucoviscidose.
La dernière partie de ce travail avait pour but de déterminer si un faible pourcentage de
cellules épithéliales bronchiques de phénotype non-CF (10%) permettait de normaliser les
propriétés bioélectriques et la sécrétion exagérée d'une cytokine pro-inflammatoire (IL-8)
d’une couche confluente de cellules épithéliales bronchiques CF (co-cultures). Nous avons
observé dans les co-cultures une normalisation de l’absorption de Na+ sensible à l’amiloride,
de la sécrétion de Cl- portée par CFTR mais également de la sécrétion d'IL-8 dans le
surnageant des co-cultures. Ces résultats indiquent que 10% de cellules épithéliales
bronchiques de phénotype non-CF pourrait permettre de normaliser les transports ioniques
transépithéliaux mais également d’autres fonctions épithéliales altérées dans les voies
aériennes mucoviscidosiques. Les cultures primaires que nous avons utilisées dans cette étude
sont principalement constituées de cellules ciliées qui sont les principales cellules exprimant
CFTR in vivo. Ces résultats suggèrent donc que les cellules ciliées pourraient constituer la
cible d’agents pharmacologiques (adresseurs et/ou activateurs de CFTR) ou des thérapies
cellulaire et génique. Des différences entre les voies voies aériennes proximales et distales
ayant été démontrées, notamment au niveau des transports ioniques, la réalisation de co-
cultures de cellules épithéliales bronchiolaires pourra être envisagée afin de déterminer si
dans les voies aériennes distales, la même proportion de cellules corrigées pourrait permettre
de normaliser certaines fonctions épithéliales. Le modèle de co-culture de cellules épithéliales
bronchiques que nous avons établi apparaît comme un outil permettant d’étudier les effets
d’un pourcentage (choisi par l’expérimentateur) de cellules de phénotype non-CF sur les
fonctions épithéliales d’une couche de cellules CF. Ce modèle pourrait permettre l’étude
d’autres fonctions comme la hauteur du liquide périciliaire ou la vitesse du battement ciliaire
206
en conditions de cultures statiques mais l’étude en conditions expérimentales dynamiques
pourra également être envisagée.
207
9 R9 R9 R9 RÉÉÉÉFFFFÉÉÉÉRENCES BIBLIOGRAPHIQRENCES BIBLIOGRAPHIQRENCES BIBLIOGRAPHIQRENCES BIBLIOGRAPHIQUESUESUESUES
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