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TTHHÈÈSSEE
En vue de l'obtention du
DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Microbiologie Cellulaire
JURY
Dr Catherine JESSUS (Rapporteur) Pr Philippe SANSONETTI (Rapporteur) Pr Bernard DUCOMMUN (Examinateur)
Dr Olivier MARCHES (Examinateur) Pr Eric OSWALD (Directeur de thèse)
Dr Frédéric TAIEB (Co-directeur de thèse)
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse
Unité de recherche : UMR1225 INRA-ENVT Directeur(s) de Thèse : Eric OSWALD et Frédéric TAIEB Rapporteurs : Catherine JESSUS et Philippe SANSONETTI
Présentée et soutenue par SAMBA LOUAKA Ascel Regis Le 28 Octobre 2009
Titre : Détermination de la voie de signalisation cellulaire eucaryote détournée par la
protéine bactérienne Cif
2
Remerciements
Mes remerciements vont à tous les membres du jury pour avoir accepté de juger mon
travail de thèse. Docteur Catherine JESSUS et Professeur Philippe SANSONETTI, soyez
remerciés pour votre investissement en tant que rapporteur. Je tiens à remercier le professeur
Bernard DUCOMMUN pour sa disponibilité et son écoute. Merci également au Docteur Olivier
MARCHES pour avoir accepté d’examiner mon travail.
Toute mon affection à l’équipe de Pathogénie Moléculaire et Cellulaire des Infections à
Escherichia coli. Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Eric OSWALD qui dirige
cette équipe et qui m’a accueilli dans son laboratoire. Merci pour l’attention portée à mon travail
et pour le soutien tant sur le plan personnel que professionnel. J’exprime toute ma gratitude à
Frédéric TAIEB, pour sa confiance, son aide et sa disponibilité qui m’ont permis d’arriver là où je
suis. Je lui souhaite beaucoup de bonheur avec sa grande famille. Je n’oublierai jamais ce que
m’ont apporté mes co-directeurs de thèse. Je leur souhaite beaucoup de réussite dans leurs
entreprises.
A Michèle, ma seconde mère. Que puis-je t’offrir pour te remercier ? Ton nom aura toujours une
place particulière dans mon cœur. Le bébé a grandi Claude. Merci d’avoir usé tes oreilles à
écouter les plaintes du petit Régis. Sans oublier Marie, Marie-Paule, Daniel, Monique, Hubert et
Claude. Merci pour l’accueil et la gentillesse. Ma profonde admiration et mon grand respect à
Jean-Phi. Merci pour la science partagée, c’est un plaisir. Maiwenn, merci pour tout on n’oublie
pas les stats.
A la salle des cadres jetables (stagiaires, thésards et post-doc). Pendant quatre ans, j’ai passé les
deux tiers de ma vie dans cette salle. Aux formidables occupants, présents et partis, Greg, Gabriel,
Delphine, Ingrid (alias Ingrit), Olivier, Rika, Meredith, Lucile, Olga, Ali, Estelle, Bastien et
Mehdi. Contemplez le bonheur autour de vous, je vous souhaite de le vivre. Dans quelques
années, j’espère vous voir au CONGO, mon très beau pays natal. Gab, Ingrit et Greg, je vous
transmets mes sentiments les meilleurs pour vos petites familles. Je remercie les secrétaires
(Laurence, Corinne, Michèle et mes chaleureuses embrassades à Marie). Je n’oublie pas Cécile et
Christian. Merci pour votre gentillesse.
A ma chère Emilie, merci d’avoir été toujours là. A toute la famille BOLOKO qui m’a accueilli
comme un enfant perdu. Mes pensées vont aussi aux SITA qui m’ont assisté et soutenu.
Je ne pourrai terminer sans penser à ma chère Laurence. Merci pour ton soutien, ta présence et ton
amour. Je pense également à mon père, à Laurina, Marietta et Price. Leur absence sera comblée
par mes sentiments pour eux.
3
Femme noire, femme africaine,
ô toi, ma mère, merci ; merci pour tout ce que tu fais pour moi, ton fils,
si loin, si près de toi !
(CAMARA LAYE, L’enfant noir)
Pour toi maman…
4
Table des matières
Remerciements 2
Table des matières 4
Liste des abréviations 8
Liste des figures 11
Avant propos 12
Publications 13
1ère partie : Synthèse bibliographique 14
I - Introduction générale sur la bactérie Escherichia coli 15
II- Cif est un effecteur des Escherichia coli entéropathogènes (EPEC) 17
II.1 Les EPEC 17
II.2 Le système de sécrétion de type III et l’induction des lésions d’A/E 18
II.3 Cif est un effecteur bactérien, non codé par le LEE, qui modifie la
physiologie de la cellule hôte 20
II.3.1 Découverte de Cif 20
II.3.2 Cif est un effecteur du SST3 21
II.3.3 Les effets de Cif sur les cellules eucaryotes 22
III. Les protéines Cifs constituent une large famille d’effecteurs
de bactéries pathogènes et/ou symbiotiques 23
III.1 Les espèces bactériennes portant une protéine hétérologue de Cif 23
III.2 Les protéines hétérologues de Cif 24
III.3 Les protéines Cifs sont des membres divergents de la superfamille
des cystéines protéases et acétyl-transférases 26
III.4 Les protéines Cifs bloquent la transition G2/M indépendamment
des modifications du cytosquelette 28
III.4.1 Les protéines Cifs modulent le cycle cellulaire et le
cytosquelette des cellules hôtes 28
5
III.4.2 L’arrêt du cycle cellulaire provoqué par les protéines
Cifs ne résulte pas des modifications du cytosquelette 28
IV- Cif est une Cyclomoduline 30
IV.1 Le cycle cellulaire eucaryote 30
IV.1.1 Introduction 30
IV.1.2 Les complexes CDK/Cyclines 30
IV.1.3 Régulation du cycle cellulaire par les complexes
CDK/Cyclines 31
IV.1.4 Le complexe CDK1/Cycline B1 ou l’ inducteur universel
de mitoses 32
IV.1.5 Les inhibiteurs des complexes CDK/Cyclines 32
IV.1.6 Les points de Contrôle 33
IV.1.7 La dérégulation des points de Contrôle 35
IV.2 La mort cellulaire 35
IV.2.1 Description de quelques mécanismes de mort cellulaire 36
IV.2.2 L’apoptose 37
IV.2.3 Liens entre les différents types de mort cellulaire 39
IV.3 Les bactéries sont des micro-organismes pirates 40
IV.3.1 Les Cyclomodulines 41
IV.3.2 Les cyclomodulines forment une famille qui continue de
s’agrandir 42
IV.3.3 Le rôle des cyclomodulines 42
V. Revue bibliographique 44
2ème partie : Résultats 56
I – Objectifs de thèse 57
II- Article 1 : Escherichia coli cyclomodulin Cif induces G2 arrest
of the host cell cycle without activation of the DNA-damage
checkpoint-signaling pathway 58
6
III- Article 2: Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell
cycle by stabilizing the cyclin-dependent kinase inhibitors p21waf1
and p27kip1 72
IV- Article 3: The EPEC effector Cif induces delayed apoptosis
in epithelial cells 87
3ème partie: Discussion et perspectives 110
I- Bilan des résultats 111
II- Le mode d’action de Cif 111
II.1 Le processus d’ubiquitinylation et son détournement
Par les bactéries 111
II.2 La stabilisation des CKIs par Cif 112
II.2.1 Le Mécanisme 112
II.2.2 La cible de Cif 113
II.3 Les conséquences de l’inhibition de la dégradation des
protéines induite par Cif 114
II.3.1 La re-réplication de l’ADN 114
II.3.2 Cif et les autres effecteurs 115
II.3.3 Pistes restant à explorer 115
III- Le rôle de Cif 116
III.1 Les lésions d’A/E et la mort de l’hôte 116
III.2 La colonisation de l’épithélium intestinal 117
III.2.1 L’effet anti-prolifératif de Cif 117
III.2.2 Le rôle des CKIs 117
III.2.3 Le cytosquelette 118
III.2.4 Cif et la symbiose 119
III.2.5 Les cyclomodulines et le cancer 119
7
IV- Conclusion 121
IV.1 Originalité du mode d’action de Cif 121
IV.2 Cif, un outil pour explorer le cycle cellulaire 121
IV.3 Une étude du rôle de Cif in vivo s’impose 122
4ème partie : Références bibliographiques 123
5ème partie : Annexes 140
Article : Cycle Inhibiting Factors (CIFs) are a growing family of
functional cyclomodulins present in invertebrate and mammal
bacterial pathogens 141
8
Liste des abréviations
Les termes en anglais sont entourés de guillemets
A/E : Attachement/effacement
ADNc : Acide Désoxyribonucléique complémentaire
ADNr : Acide Désoxyribonucléique ribosomique
APC : « Anaphase promoting complex »
Arp2/3 : « Actin-related protein 2/3 »
ATM : « Ataxia telangiectasia mutated »
ATP : Adénosine triphosphate
ATR : « ATM and Rad3 related »
AvrPphB : « Avirulence Pseudomonas syringae pv. phaseolicola B »
BFP : « Bundle-forming pilus »
BRCA1 : « Breast cancer associated gene 1 »
BrdU : Bromo-désoxy-Uridine
CAD : « Caspase-activated deoxyribonuclease »
CagA : « Cytotoxin-associated antigen A »
Cdc25 : « Cell division cycle 25»
CDK : « Cyclin-dependent Kinase »
CDT : « Cytolethal distending toxin »
Cdt1 : « Chromatin licensing and DNA replication factor 1 »
Chk : « Checkpoint kinase »
Cif : « Cycle inhibiting factor »
Cip1 : « CDK-interacting protein-1 »
CKI : Inhibiteurs de CDK
CNF : « Cytotoxic necrotizing factor »
CRL : « Cullin-ring ubiquitin ligases »
DAEC : E. coli à adhésion diffuse
DDB1 : « DNA damage-binding protein 1 »
DNT : « Dermonecrotic toxin »
Eae : Intimine (EPEC attachement/effacement)
EAF : Facteur d’adhésion des EPEC
9
EAggEC : E. coli entéroaggrégatives
EHEC : E. coli entérohémorragiques
EIEC : E. coli entéroinvasives
EPEC : E. coli entéropathogéniques
ERO : Espèces réactives de l’oxygène
EspJ : EPEC secreted protein J
ETEC : E. coli entérotoxigéniques
ExPEC : E. coli pathogène extra-intestinale
FADD : « Fas-associated death domain »
FAS : « Fluorescence actin staining »
FIP : « Fusobacterial immunosuppressive protein »
IAP : « Inhibitor of apoptosis protein
IEC-6 : « Intestinal epithelial cells-6 »
INK4 : Inhibiteurs de CDK4
IpaB : « Invasion plasmid antigen B »
IVOC : « in vitro human intestinal organ culture »
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert
Kip : « Kinase inhibitor protein »
LEE : Locus d’effacement des entérocytes
Mad2: « Mitotic arrest deficient 2 »
Map : « mitochondrial associated protein »
MAPKK : « Mitogen-activated protein kinase kinase »
Nck : « Non-catalytic region of tyrosine kinase »
N-WASP : « neural Wiskott-Aldrich-syndrome protein »
PAI : « Pathogenicity island »
PARP : « Poly(ADP-ribose) polymerase »
PCNA : « Proliferating cell nuclear antigen »
PMT : « Pasteurella multocida toxin »
Rb : Rétinoblastome
SCF : « Skp1/Cullin1/F-box »
SiRNA : « Small interfering RNA »
SST : signal de sécrétion et de translocation
SST3 : Système de sécrétion de type III
Tir : récepteur transloqué de l’intimine
10
TNFR : Tumor necrosis factor receptor
TRADD : « TNFR-associated death domain »
VacA : « Vacuolating cytotoxin »
Waf1 : « Wild-type p53 activated fragment-1 »
XIAP : « X chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein»
11
Liste des figures
Figure 1 : Potentiel génomique d’E. coli 15
Figure 2 : Contribution des éléments génétiques mobiles dans l’évolution
d’une E.coli commensale vers un caractère pathogène 16
Figure 3 : Les lésions d’attachement et d’effacement induites par les EPEC 17
Figure 4 : Représentation schématique de l’appareil de sécrétion de type III
des EPEC 18
Figure 5 : La protéine Cif modifie la physiologie des cellules eucaryotes 22
Figure 6 : Alignement et comparaison de séquences entre CifEc, CifYp, CifBp,
CifPl, CifPa et GOS_5485515 25
Figure 7 : Structures cristallisées des protéines Cifs provenant de E. coli
(forme tronquée), B. pseudomallei et P. luminescens 26
Figure 8A : Les principales phases du cycle cellulaire des eucaryotes supérieurs 30
Figure 8B : Régulation de la transition G1/S 33
Figure 9A : Vue générale et simplifiée des différentes issues possibles après
l’activation d’un point de contrôle en réponse aux dommages à l’ADN 34
Figure 9B : Le point de contrôle du cycle cellulaire à la transition G1/S 35
Figure 10 : Schéma du mécanisme d’apoptose avec quelques substrats
des caspases exécutrices 38
Figure 11 : Les cyclomodulines et le cycle cellulaire 41
Figure 12 : Les protéines bactériennes qui interfèrent avec le système
d’ubiquitinylation 112
Figure 13 : Mode d'action hypothétique de Cif sur les cellules HeLa 115
Figure 14 : Rôle hypothétique de Cif in vivo 117
12
Avant propos
Cette thèse a été réalisée dans l’équipe de « Pathogénie Moléculaire et Cellulaire des
infections à Escherichia coli », faisant partie de l’Unité Mixte de Recherche (UMR) 1225
INRA-ENVT. Notre laboratoire a développé une approche multidisciplinaire comprenant la
microbiologie et la biologie cellulaire pour étudier les interactions entre les souches
pathogènes d’E. coli et les cellules eucaryotes hôtes. Ainsi, suite aux nombreuses études
portant sur les toxines bactériennes, l’équipe a défini le concept de « Cyclomoduline » qui est
une famille de toxines et d’effecteurs bactériens affectant le cycle cellulaire eucaryote.
Les travaux présentés ici sont consacrés à l’étude d’une cyclomoduline appelée Cif pour
Cycle inhibiting factor, capable de bloquer la prolifération des cellules infectées.
A l’inverse des cyclomodulines étudiées au laboratoire comme CDT ou la Colibactine, qui
provoquent des cassures doubles brins de l’ADN, à mon arrivée au laboratoire, les
mécanismes impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire associé à Cif n’étaient pas identifiés.
Mon travail de thèse a donc consisté à mettre en lumière la signalisation cellulaire utilisée par
la toxine Cif pour modifier la physiologie des cellules eucaryotes.
Nous avons choisi de présenter cette thèse sur articles. Nous avons fait précéder ces articles
par une synthèse bibliographique. Celle-ci fait l’état des connaissances concernant la protéine
Cif, les organismes portant le gène cif, ainsi qu’un rappel du cycle cellulaire eucaryote. La
synthèse bibliographique se conclut par une revue sur la protéine Cif que nous venons de
publier très récemment. Après la présentation des articles, je discuterai les différents résultats
et exposerai différentes hypothèses quant au rôle de Cif dans la pathogénie des bactéries.
13
Publications
- Taieb, F., Nougayrede, J.P., Watrin, C., Samba-Louaka, A. and Oswald, E. (2006)
Escherichia coli cyclomodulin Cif induces G2 arrest of the host cell cycle without
activation of the DNA-damage checkpoint-signalling pathway. Cell Microbiol. 8:
1910-1921.
- Samba-Louaka, A., Nougayrede, J.P., Watrin, C., Jubelin, G., Oswald, E. and Taieb,
F. (2008) Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell cycle by stabilizing the
cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27. Cell Microbiol. 10: 2496-2508.
- Jubelin, G., Chavez, C.V., Taieb, F., Banfield, M.J., Samba-Louaka, A., Nobe, R., et
al (2009) Cycle inhibiting factors (CIFs) are a growing family of functional
cyclomodulins present in invertebrate and mammal bacterial pathogens. PLoS ONE. 4:
e4855.
- Samba-Louaka, A., Taieb, F., Nougayrède, J.-P. and Oswald, E. (2009) Cif type III
effector protein: a smart hijacker of the host cell cycle. future microbiology. Vol 4 (7),
867-877.
- Samba-Louaka, A., Nougayrède, J-P., Watrin, C., Oswald, E. and Taieb, F. (2009)
The EPEC effector Cif induces delayed apoptosis in epithelial cells. Infection and
immunity, sous presse.
14
1ère partie : Synthèse bibliographique
15
I- Introduction générale sur la bactérie Escherichia coli
C’est en 1885 que le pédiatre allemand Theodor Escherich décrivit la morphologie et
les propriétés d’une bactérie “Bacterium coli commune” qu’il isola des selles de nourrissons
(Escherich, 1885). Nommée plus tard “Escherichia coli”, en hommage à son découvreur, E.
coli est un bacille à Gram négatif de la famille des Entérobactéries. Elle colonise le tractus
intestinal des animaux à sang chaud et constitue l’espèce bactérienne dominante de la
microflore anaérobie facultative de l’intestin. Chez l’homme, la colonisation du tractus
intestinal par E. coli se passe quelques heures après la naissance et sa niche écologique est la
surface luminale du colon. E. coli fait ainsi partie du microbiote intestinal, véritable
écosystème composé de plus de 5600 taxons différents (classification basée sur le
pyroséquençage des ADNr 16s) (Dethlefsen et al., 2008). Si nous hébergeons ces populations
bactériennes, en échange (symbiose), celles-ci nous assurent des fonctions indispensables,
comme la modulation permanente du système immunitaire, la régulation de la prise de poids,
la dégradation des aliments non digestibles, la synthèse de certaines vitamines et la protection
vis-à-vis la plupart des infections pathogènes. De plus, le microbiote participe au
développement, à la différenciation et à l’homéostasie des muqueuses. L’implication possible
du microbiote est maintenant clairement proposée dans l’étiologie du cancer sporadique du
côlon (Macdonald and Monteleone, 2005; Hooper et al., 2002; Berg, 1996).
Dans les conditions physiologiques normales, E. coli est donc une bactérie commensale.
Cependant, la nature inoffensive d’E. coli peut être remise en cause dans de nombreuses
situations comme en présence de brèches dans l’épithélium intestinal ou en cas d’immuno-
dépression. De plus, certaines souches d’E. coli peuvent occuper des niches écologiques
autres que l’intestin. C’est ainsi que certaines bactéries E. coli peuvent survivre dans le tractus
urinaire. Ces souches se sont dotées d’un système d’adhésion efficace constitué de nombreux
pili ainsi que d’un système de captation du fer important constitué de sidérophores, crucial
pour survivre dans cet environnement (Wiles et al., 2008). La capacité de s’adapter à de
nouvelles niches écologiques est donc conférée par l’acquisition de gènes spécifiques. Il est
édifiant de constater que si la taille du génome de la souche K12 (isolat MG1655 ; souche de
laboratoire) d’origine intestinale est de 4,64 millions de paires de bases (Blattner et al., 1997),
celle de la souche CFT073, provenant du tractus urinaire, est de 5,23 millions de paires de
bases (Welch et al., 2002). D’autre part, une récente étude sur 20 souches d’E. coli a montré
Figure 1 : Potentiel génomique d’E. coli. Diagramme représentant le pan-génome (violet),
le contenu moyen d’un génome (jaune) ainsi que le core génome (rouge) pour les souches
d’E. coli séquencées (Touchon et al., 2009). Figure d’après Hendrickson, 2009.
16
que le core génome (ensemble de gènes communs) n’est composé que d’environ 2000 gènes
(représentant 40% du génome de chaque bactérie) sur les 18000 gènes du pan-génome
(totalité des gènes des souches utilisées) (Touchon et al., 2009; Welch et al., 2002). Cette
différence entre le core génome et le pan-génome souligne la prodigieuse plasticité du
génome de cette espèce qui, loin d’être confinée dans un rôle uniquement commensal, peut lui
conférer un pouvoir pathogène (figure 1). Cette pathogénicité s’explique par la capacité d’E.
coli à acquérir par transfert horizontal des gènes codant pour des facteurs dits de virulence et à
les transmettre à la descendance. Ces gènes sont portés par des éléments génétiques mobiles
comme des transposons, des plasmides ou des bactériophages (figure 2) (Kaper et al., 2004).
Les bactéries peuvent également faire acquisition d’îlots génomiques pouvant aller jusqu’à
200 kb et portant plusieurs gènes de virulence appelés îlot de pathogénicité (Hacker et al.,
1997).
Les E. coli pathogènes sont impliquées dans les infections intestinales et extra-intestinales
(figure 1). Étant donné la diversité des souches pathogènes rencontrées, celles-ci ont été
classées en pathovars, groupement de souches pathogènes d’une même espèce classée en
fonction de symptômes et de caractéristiques pathogéniques propres qui dépendent des
différents facteurs de virulence exprimés par la bactérie. On distingue des pathovars
intestinaux (responsables d’infections intestinales telles que les diarrhées) et extra-intestinaux
(à l’origine d’infections extra-intestinales telles que les infections urinaires et les méningites).
Les principaux pathovars intestinaux sont les ETEC (E. coli entérotoxigéniques) à l’origine de
diarrhées aqueuses aiguës du voyageur ou « turista » ; les EAggEC (E. coli
entéroaggrégatives) qui provoquent des diarrhées persistantes avec présence de mucus; les
EIEC (E. coli entéroinvasives) qui provoquent des diarrhées aqueuses et des symptômes de
dysenterie (fièvre, douleurs abdominales, diarrhée avec du sang et du mucus); les EHEC (E.
coli entérohémorragiques) qui sont responsables de diarrhées et de colites hémorragiques avec
de graves complications pouvant déboucher sur un syndrome hémolytique et urémique
(anémie, diminution du taux de plaquettes sanguines, insuffisance rénale) et les EPEC (E. coli
entéropathogéniques) à l’origine de diarrhées aqueuses aiguës ou persistantes (Nataro and
Kaper, 1998; Giron et al., 1991b).
Dans le chapitre suivant, nous nous intéresserons au pathovar des EPEC dans lequel la
protéine Cif a été identifiée pour la première fois.
Figure 2 : Contribution des éléments génétiques mobiles dans l’évolution d’une E. coli
commensale vers un caractère pathogène. De nombreux facteurs de virulence sont codés
par les éléments génétiques mobiles tels que des transposons (l’enterotoxine ST) ; des
plasmides (l’enterotoxine LT), des bactériophages (la toxine Shiga) ou des îlots de
pathogénicité (PAI, pathogenicity island) comme le LEE (locus d’effacement des
entérocytes). Figure de Kaper et al., 2004.
17
II- Cif est un effecteur des Escherichia coli entéropathogènes
(EPEC)
II.1 Les EPEC
Les EPEC furent les premières souches d’E. coli pathogènes à être incriminées comme
étant la cause des diarrhées infantiles dans les années 1940 et 1950 (Chen and Frankel, 2005).
Elles provoquent des diarrhées aiguës accompagnées de fièvres, de malaises et de
vomissements (Levine, 1987). De nos jours, les diarrhées à EPEC sévissent principalement
dans les pays en voie de développement et ces pathogènes posent un véritable problème de
santé publique car le taux de mortalité chez les jeunes enfants peut s’élever jusqu’à 30%
(Senerwa et al., 1989). Par ailleurs, l’Organisation Mondiale de la Santé rapporte que la
survenue de maladies diarrhéiques chez l’enfant peut avoir des conséquences à long terme se
reportant chez l’adulte par un affaiblissement de la santé et de la productivité.
La caractéristique principale des EPEC est leur capacité à induire des lésions
histopathologiques intestinales dites « lésions d’attachement et d’effacement ou A/E»
(Knutton et al., 1987; Staley et al., 1969). Ces lésions se caractérisent par un attachement des
bactéries sur la membrane des entérocyes et par une destruction des microvillosités
(effacement de la bordure en brosse) (figure 3). Les lésions A/E sont associées à un
réarrangement du cytosquelette de la cellule infectée. En effet, le réseau d’actine polymérisée
est réorganisé pour permettre la formation d’un piédestal (structure pouvant s’allonger jusqu’à
10 m ressemblant à un pseudopode) (Knutton et al., 1989). La présence du piédestal assure
un attachement très intime de la bactérie à la cellule hôte (figure 3).
L’interaction des EPEC avec les cellules en culture donne lieu à deux phénotypes d’adhésion.
Les bactéries peuvent occuper toute la surface cellulaire (adhésion diffuse) ou se restreindre à
quelques zones (adhésion localisée) (Scaletsky et al., 1984). Cette différence du profil
d’adhésion dépend de la présence du plasmide EAF. Ce dernier code pour un pili, le BFP
(bundle-forming pilus), qui participe à l’adhésion des EPEC à la cellule épithéliale et permet
la formation de micro-colonies bactériennes (Giron et al., 1991a). Ces micro-colonies sont à
l’origine de l’adhésion localisée. Les EPEC portant le plasmide EAF sont des EPEC
« typiques » et celles ne le portant pas sont dites « atypiques ».
Figure 3 : Les lésions d’attachement et d’effacement induites par les EPEC. Ces photos
de microscopie électronique illustrent les points caractéristiques de cette lésion, à savoir
l’attachement intime des bactéries sur les cellules (A) grâce à la destruction localisée des
microvillosités (B et C) et la formation d’un piédestal (D) Photos d’après (Frankel et al.,
1998) (A-C) et (Rosenshine et al., 1996) (D).
D
A B
C
EPEC
18
II.2 Le système de sécrétion de type III et l’induction des lésions d’A/E
Les gènes nécessaires à l’établissement des lésions A/E se trouvent sur un îlot génomique
de pathogénicité de 35 kb appelé LEE (Locus d’Effacement des Entérocytes) (McDaniel and
Kaper, 1997; McDaniel et al., 1995). Ainsi, les deux pathovars de E. coli (EPEC et EHEC) ou
les souches de Citrobacter rodentium (pathogène murin) capables d’induire les lésions d’A/E
ont acquis un LEE (Deng et al., 2001). Le LEE code pour approximativement 41 protéines
qui permettent l’assemblage du système de sécrétion de type III (SST3) (figure 4), l’injection
des protéines impliquées dans l’attachement intime de la bactérie, l’effacement des
microvillosités et la dérégulation des fonctions des cellules cibles (Garmendia et al., 2005).
Le SST3 est un appareil qui permet aux bactéries Gram négatives de sécréter et d’injecter des
protéines directement dans le cytosol des cellules eucaryotes (Hueck, 1998). Ainsi, les EPEC
se servent très efficacement et très habilement du SST3 pour, entre autres, mettre en place
leur attachement à la cellule eucaryote. Pour cela, le LEE code pour les protéines Tir
(récepteur transloqué de l’intimine) et intimine (ou eae, EPEC attachement/effacement). La
protéine Tir est injectée, via le SST3, dans le cytosol de la cellule cible. Il est fascinant de
constater que Tir s’insère ensuite dans la membrane plasmique et sert de récepteur à
l’intimine (une adhésine des EPEC) (Kenny and Finlay, 1997). L’interaction entre Tir et
intimine est essentielle à l’établissement d’un piédestal (Kenny and Finlay, 1997; Rosenshine
et al., 1996). En effet, le domaine intra-cellulaire de la protéine Tir est phosphorylé sur un
résidu tyrosine (Y474) (Rosenshine et al., 1992). Cette phosphorylation permet de fixer la
protéine adaptatrice Nck qui est nécessaire au recrutement des protéines N-WASP (neural
Wiskott-Aldrich-syndrome protein) et Arp2/3 (Actin-related protein) qui participent à la
nucléation et à la polymérisation de l’actine (Gruenheid et al., 2001; Kalman et al., 1999). De
plus, de nombreuses protéines cytosquelettiques sont recrutées au niveau du domaine intra-
cellulaire de Tir permettant l’émission du piédestal (Goosney et al., 2001).
Les piédestaux concentrent de nombreux filaments d’actine. In vitro, les piédestaux peuvent
être révélés par la phalloidine couplée à la fluoresceine. Cette caractéristique est utilisée dans
un test appelé FAS (Fluorescence actin staining) pour révéler la présence d’un piédestal sur
une cellule eucaryote (Knutton et al., 1989).
Outre les protéines Tir et intimine, d’autres effecteurs codés par le LEE participent à
l’établissement des lésions d’A/E. Nous entendons par le terme « effecteur », toutes
Figure 4 : Représentation schématique de l’appareil de sécrétion de type III des EPEC.
Le corps basal du SST3 est composé d’une sécrétine (protéine qui forme un large canal dans
la membrane externe) EscC, des protéines de membrane interne EscR, EscS, EscT, EscU et
EscV et la lipoprotéine EscJ qui connecte les structures en anneau de la membrane interne et
externe. EscF constitue la structure ressemblant à une aiguille alors que les sous-unités EspA
polymérisent pour former le filament EspA. Les protéines EspB et EspD forment le pore de
translocation dans la membrane plasmique de la cellule hôte connectant la bactérie et la
cellule eucaryote. L’ATPase cytoplasmique EscN fournit l’énergie au système en réalisant
l’hydrolyse des molécules d’ATP en ADP. SepD et SepL sont des composés cytoplasmiques
du SST3. Les effecteurs Tir et Map se fixent aux protéines chaperons CesT qui se lient à
EscN et assurent la translocation des deux effecteurs par le SST3 (Garmendia et al., 2005).
Membrane bactérienne externe
Membrane bactérienne interne
Espace périplasmique
Dimère CesT
~ 10 nm
~ 260 nm
~ 50 nm
~ 10 nm
~ 10 nm
~ 7 nm
Membrane plasmique de la cellule hôte
19
molécules bactériennes, codées ou non par le LEE, introduites à l’intérieur des cellules
eucaryotes par le SST3. Chez les EHEC par exemple, la protéine Tir transloquée dans la
cellule eucaryote ne peut être phosphorylée sur le résidu Y474 (DeVinney et al., 1999). La
protéine Tir des EHEC ne peut donc pas interagir avec la protéine adaptatrice eucaryote Nck
pour recruter les protéines N-WASP. Pour y remédier, les EHEC utilisent un effecteur codé
par un prophage, la protéine TccP (Tir-cytoskeleton coupling protein) ou EspFu qui s’associe
à Tir et lie les protéines N-WASP. C’est ainsi qu’indépendamment de la protéine Nck, les
EHEC polymérisent l’actine et initient la formation du piédestal (Campellone et al., 2004;
Garmendia et al., 2004). Certaines souches d’EPEC utilisent les deux systèmes (Nck et Tccp)
pour remodeler le réseau d’actine (Whale et al., 2006). Deux autres effecteurs, Map
(mitochondrial associated protein) et EspH (EPEC secreted protein H) sont impliqués dans la
balance entre l’apparition de filopodes et l’émergence du piédestal. Au début de l’interaction
entre la bactérie et la cellule eucaryote, Map induit la formation de structures ressemblant à
des filopodes sur le site de l’infection. Une fois l’interaction Tir-intimine réalisée, Tir réprime
l’effet de Map et permet la mise en place du piédestal (Kenny et al., 2002). De même
l’effecteur EspH réprime la formation de filopodes, permettant ainsi l’émergence du piédestal
sur des cellules HeLa (Tu et al., 2003). Toutefois, les lésions d’A/E ne sont pas les seuls
effets provoqués par les EPEC. En effet, ces pathogènes peuvent injecter plusieurs dizaines
d’effecteurs par le SST3 pour moduler des fonctions cellulaires eucaryotes aussi diverses que
la perméabilité des jonctions serrées, le potentiel membranaire mitochondrial, la régulation
des microtubules, les fonctions de l’appareil de Golgi ou l’apoptose (Garmendia et al., 2005).
Parmi ces différents effecteurs, on trouve la protéine Cif à laquelle s’est intéressé notre
laboratoire.
20
II.3 Cif est un effecteur bactérien, non codé par le LEE, qui modifie la
physiologie de la cellule hôte
II.3.1 Découverte de Cif
Si la première observation d’un phénotype appelé effet cytopathique associé à certaines
souches d’EPEC remonte à 1997 (De Rycke et al., 1997), ce n’est qu’en 2003 que le
laboratoire a identifié et caractérisé le premier effecteur des EPEC non codé par le LEE
responsable de ce phénotype. Il s’agit d’une protéine de 282 acides aminés appelée Cif (cycle
inhibiting factor) (Marches et al., 2003). Le gène cif est localisé sur un prophage de type
lambda qui est inductible. Ce prophage se trouve dans la plupart des cas sur le chromosome
au niveau des sites d’insertion (att) des phages lambda entre les gènes ybhC et ybhB
(Loukiadis et al., 2008; Marches et al., 2003). Il existe une stricte association entre le gène cif
et celui de l’intimine (eae) ; ce qui évoque une co-sélection positive du prophage portant le
gène cif avec le LEE (Iguchi et al., 2009; Loukiadis et al., 2008; Asakura et al., 2007;
Marches et al., 2003). Par ailleurs, la congruence des arbres phylogénétiques entre un gène du
prophage portant cif et un gène de ménage des EPEC suggère que le prophage portant le gène
cif aurait été acquis tôt dans l’évolution des EPEC (Loukiadis et al., 2008).
Le gène cif n’est présent que dans deux pathovars d’E. coli ; les EPEC et les EHEC. Dans une
étude récente, le pourcentage de souches pathogènes d’EPEC et d’EHEC portant le gène cif
s’élevait à 71%. Toutefois, parmi les souches d’EPEC portant cif, seules 34% induisent un
phénotype associé à Cif (Loukiadis et al., 2008). En effet, dans la majorité des souches y
compris dans la souche E2348/69 (souche humaine de référence des EPEC), le gène cif est
muté et sous forme de pseudogène (Loukiadis et al., 2008; Marches et al., 2003). Dans les
EHEC, seul le pseudogène de cif a été identifié et aucun phénotype lié à Cif n’a été mis en
évidence dans ces souches. Le fond génétique des bactéries doit certainement influencer
l’acquisition, le maintien ou l’expression du gène cif.
Au laboratoire, nous travaillons avec deux souches d’EPEC qui expriment une protéine Cif
fonctionnelle ; une souche isolée du lapin) appelée E22 (O103 :H2), responsable de diarrhées
profuses et aqueuses associées à une forte morbidité et mortalité chez les lapereaux (Leroy et
al., 1994; Pohl et al., 1993) et une souche pathogène humaine appelée B171-8 (O111 : H-) qui
a donné des diarrhées très sévères au cours d’une étude sur des volontaires humains (Bieber et
al., 1998). La comparaison du gène cif dans les deux souches montre une différence d’un seul
21
nucléotide qui provoque la substitution d’un acide aminé (P8L) sans que cela n’affecte
l’activité de la protéine (Taieb et al., 2006). Bien qu’étant des EPEC, ces deux souches sont
très différentes au niveau génétique. En effet, ces souches ont été séquencées et la souche
B171-8 est une EPEC typique alors que la souche E22 est atypique. Par ailleurs, la souche
B171-8 code pour au moins 24 effecteurs alors que la souche E22 code pour au moins 40
effecteurs (Iguchi et al., 2009; Rasko et al., 2008).
II.3.2 Cif est un effecteur du SST3
Dans le chapitre précédent, j’indique que la présence du gène cif dans les EPEC est
associée à celle du LEE. Il est intéressant de noter que toute mutation des composants du
SST3 abolit la capacité des souches bactériennes à induire les lésions d’A/E et le phénotype
provoqué par la protéine Cif (décrit plus loin) (Nougayrede et al., 2001; Nougayrede et al.,
1999; De Rycke et al., 1997). Ce résultat s’explique par le fait que la protéine Cif est injectée
dans la cellule cible à travers le SST3 (Marches et al., 2003). L’injection des effecteurs du
SST3 est un processus régulé et coordonné voire hiérarchisé, non seulement par leur
concentration intra-bacterienne et par l’attachement des bactéries à la cellule hôte, mais aussi
grâce à l’interaction de certains effecteurs avec une protéine chaperon (Mills et al., 2008;
Wang et al., 2008a; Woestyn et al., 1996; Menard et al., 1994). Ainsi, il existe des protéines
chaperons pour les effecteurs d’EPEC comme Tir (Creasey et al., 2003; Abe et al., 1999) et
Map (Creasey et al., 2003). Cependant, concernant la protéine Cif, aucune protéine chaperon
n’a été mise en évidence pour permettre sa stabilité, sa sécrétion et sa translocation par le
SST3 (Charpentier and Oswald, 2004).
Pour étudier la translocation de Cif dans les cellules eucaryotes, le laboratoire a mis au point
un test utilisant un système rapporteur dans lequel une fusion traductionnelle est réalisée entre
la protéine d’intérêt et la protéine TEM-1 -lactamase. En présence d’un substrat, CCF2/AM,
qui émet une fluorescence verte lorsqu’il est intact ou bleue lorsqu’il est clivé par la -
lactamase, il est possible de suivre la translocation cellulaire d’une protéine.(Charpentier and
Oswald, 2004). Cette technique a permis de déterminer la séquence d’acides aminés
permettant l’adressage et la translocation de Cif via le SST3, le signal de sécrétion et de
translocation (SST), qui est composé des 20 premiers acides aminés. Par ailleurs, ce SST peut
22
être échangé avec le SST d’autres effecteurs comme celui de Tir sans que cela n’affecte son
activité (Charpentier and Oswald, 2004). A l’inverse, le SST de Cif peut être fusionné à des
protéines pour permettre leur injection au travers de la seringue moléculaire. Le SST de Cif,
par exemple, a été fusionné à la sous-unité active de la toxine CDT (CdtB). Pour être introduit
dans la cellule, CdtB nécessite les sous-unités A et C. Le fait que la fusion de la sous-unité B
et du SST de Cif provoque des effets décrit pour CDT montre que la protéine de fusion a bien
été injectée dans la cellule (Taieb et al., 2006). De même, le SST de Cif peut également servir
de contrôle positif dans des expériences visant à vérifier la translocation d’un nouvel effecteur
par le SST3 (Dahan et al., 2005). Comme tous les effecteurs du SST3, Cif est donc une
protéine modulaire avec un domaine N-terminal nécessaire à la translocation par le SST3 et
un domaine C-terminal portant l’activité de la protéine.
II.3.3 Les effets de Cif sur les cellules eucaryotes
Le laboratoire a développé un test d’interaction qui consiste à mettre les bactéries et
les cellules eucaryotes en contact pendant un temps court (de 30 min à 4 h). Les bactéries sont
éliminées par rinçage puis par un traitement antibiotique. Cette technique permet de suivre un
phénotype à long terme (jusqu’à 72 h typiquement). Ainsi, il fut observé, trois jours après
l’interaction bactéries-cellules, que l’infection des cellules HeLa avec certaines souches
d’EPEC altère le cytosquelette des cellules eucaryotes. Cela se caractérise par l’apparition de
nombreuses fibres de stress, de plaques d’adhésions focale et par l’augmentation de la taille
du noyau et des cellules d’environ 2,5 fois (figure 5A) (Marches et al., 2003; Nougayrede et
al., 2001; De Rycke et al., 1997). D’autre part, on remarque l’absence de figure de mitose et
un arrêt de la prolifération des cellules eucaryotes (figure 5B) (Marches et al., 2003;
Nougayrede et al., 2001). Ces effets sur les cellules HeLa sont nommés « effets
cytopathiques ». Ces derniers ne sont pas observés dans les souches mutées pour le SST3 ou
délétées pour le gène cif. L’induction des effets cytopathiques résulte de la translocation de
Cif dans la cellule infectée (Marches et al., 2003; Nougayrede et al., 2001). Purifiée puis
lipofectée dans les cellules HeLa, Cif est capable d’induire ces effets cytopathiques
démontrant que son action ne nécessite pas de co-facteurs bactériens (Taieb et al., 2006). Les
mêmes effets sont obtenus suite à la transfection du gène cif dans les cellules HeLa
confirmant que Cif est suffisant pour modifier la physiologie des cellules cibles (Jubelin et al.,
2009).
Actine
Vinculine
ADN
Tubuline
Figure 5: La protéine Cif modifie la physiologie des cellules eucaryotes. (A) A gauche, les
cellules ont été infectées avec une EPEC E22 qui produit Cif. Les cellules et les noyaux
(ADN coloré au DAPI en bleu) augmentent en taille. Les fibres de stress (actine en rouge) et
les plaques d’adhésion focales se multiplient. Les plaques d’adhésion focales sont de larges
complexes protéiques par lesquelles la cellule est connectée à la matrice extra-cellulaire. La
vinculine (en vert) fait partie de ces complexes protéiques. A droite, les cellules infectées avec
la souche mutée pour le gène cif (E22 cif ::TN) présente un phénotype semblable à des
cellules non infectées. (B) A l’inverse des cellules infectées avec la souche mutée pour le
gène cif, les cellules en contact avec l’EPEC E22 ne présentent aucune figure de mitose
(flèches blanches). Cif empêche la prolifération des cellules eucaryotes (Marches et al.,
2003).
A
B
E22 E22 cif :: TN
E22 E22 cif :: TN
23
III- Les protéines Cifs constituent une large famille
d’effecteurs de bactéries pathogènes et/ou symbiotiques
III.1 Les espèces bactériennes portant une protéine hétérologue de Cif
La protéine Cif a été initialement identifiée et caractérisée chez les EPEC. Si elle ne
possède aucune homologie avec des protéines de fonctions connues, Cif présente des
similarités de séquence avec des protéines codées par les génomes de quatre autres espèces
bactériennes Yersinia pseudotuberculosis, Photorhabdus luminescens et Photorhabdus
asymbiotica et Burkholderia pseudomallei (Jubelin et al., 2009; Yao et al., 2009; Marches et
al., 2003).
Y. pseudotuberculosis est une bactérie qui est répandue dans l’environnement (le sol par
exemple) qui affecte l’homme, et les animaux (Wren, 2003; Naktin and Beavis, 1999;
Attwood et al., 1987). Après l’ingestion de la bactérie via l’eau ou les aliments, la bactérie se
retrouve dans l’intestin grêle, traverse l’épithélium intestinal à l’intérieur des cellules M des
plaques de Peyer pour migrer vers les nœuds lymphatiques mésentériques. La bactérie peut
être présente également dans le foie et la rate. La multiplication du pathogène est suivie d’une
inflammation qui donne lieu à des symptômes associés à une gastro-entérite, des crampes
abdominales, des fièvres, des nausées et des vomissements (Wren, 2003).
P. luminescens et P. asymbiotica sont deux bactéries qui se distinguent de B. pseudomallei et
de Y. pseudotuberculosis par le fait qu’elles peuvent être symbiotiques et pathogènes. En
effet, la bactérie P. luminescens colonise l’intestin de nématodes juvéniles entomopathogènes
(pathogènes pour l’insecte). La bactérie et le nématode sont en symbiose. Le nématode
pénètre dans des larves d’insectes et relargue P. luminescens. Cette dernière y prolifère et tue
l’insecte. Le cadavre de l’insecte permet la nutrition, la croissance et la prolifération des
nématodes. La bactérie s’associe de nouveau avec des nématodes juvéniles et le cycle
recommence (Ciche and Ensign, 2003; Forst et al., 1997). Des travaux en cours démontrent
que la protéine hétérologue de Cif chez P. luminescens est produite par la bactérie à l’intérieur
de son hôte (nématode) (Chavez et al., communication personnelle). Quant à P. asymbiotica,
elle entre également en symbiose avec un nématode (Gerrard et al., 2006). Cependant, P.
asymbiotica est un pathogène humain qui provoque des abcès localisés au niveau des tissus.
Les infections à P. asymbiotica ont été décrites en Amérique du Nord et en Australie.
(Weissfeld et al., 2005). La transmission de la bactérie du nématode à l’homme reste à établir.
24
Les espèces bactériennes portant une protéine hétérologue de Cif et citées ci-dessus
appartiennent à la classe des -protéobactéries et à la famille des Enterobacteriaceae.
Toutefois, une autre protéine hétérologue de Cif a également été trouvée chez B.
pseudomallei. Cette bactérie de la classe des -protéobactéries (famille des Burkholderiaceae)
est présente dans le sol (boue et sédiments) et dans les eaux (eaux stagnantes des rizières, des
berges). Bien que la température optimale de croissance soit comprise entre 37 et 39°C, B.
pseudomallei peut vivre en dehors des régions tropicales et résiste bien au froid. Elle est donc
présente à l’état endémique dans le sud-est asiatique, le nord de l’Australie, l’Inde, l’Iran,
l’Afrique et l’Amérique. B. pseudomallei est l’agent causal de la mélioïdose. Cette maladie
endémique du Sud-est asiatique et du nord de l’Australie touche les hommes et les animaux.
La mélioïdose entraîne de nombreux symptômes allant de la séroconversion asymptomatique
à des symptômes cliniques apparents (pneumonie aiguë et chronique, infections du foie, de la
rate et du rein, septicémie pouvant entraîner un choc septique). Les deux principaux modes de
contamination sont l’infection de plaies souillées par de la terre et l’inhalation de poussières
contaminées. (http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/bb/pseudomallei.html) (Cheng and Currie,
2005).
III.2 Les protéines hétérologues de Cif
Cif partage jusqu’à 72% de similarité de séquence avec la protéine Ypk1971 présente
dans la souche YPIII de Yersinia pseudotuberculosis. Le pourcentage de similarité entre CifEc
et les protéines des trois autres espèces bactériennes se situe aux alentours de 40 et 50%
(tableau 1). Pour distinguer Cif de ses hétérologues, la protéine Cif identifiée chez les EPEC
sera nommée CifEc. Les protéines Ypk1971 (Y. pseudotuberculosis), Bpss1385 (B.
pseudomallei), Plu2515 (P. luminescens) et Pha4011 (P. asymbiotica) seront nommées
respectivement CifYp, CifBp, CifPl et CifPa. Il faut noter également que CifEc partage une
similarité de séquence avec une hypothétique protéine tronquée obtenue par traduction d’un
fragment d’ADN isolé dans la mer des Sargasses (GOS5485515) (tableau 1).
25
Tableau 1 : Pourcentage d’identité et de similarité des différents hétérologues de Cif (Jubelin
et al., 2009).
La figure 6 représente les séquences d’acides aminés alignées des différents Cifs. Ces
dernières possèdent plusieurs résidus conservés après la région N-terminale. L’absence de
conservation de séquence dans la région N-terminale est en accord avec l’hypothétique
fonction de cette région qui servirait de séquence de translocation pour le SST3 des
différentes espèces bactériennes. A ce jour, aucune donnée n’indique que CifYp, CifBp, CifPl et
CifPa sont des effecteurs du SST3, mais il est frappant de remarquer que toutes les espèces
portant un hétérologue de Cif, possèdent au moins un SST3 (Davis and Mecsas, 2007;
Brugirard-Ricaud et al., 2004; Winstanley et al., 1999). A l’instar de CifEc, le domaine N-
terminal de CifBp n’est pas nécessaire à l’activité de la protéine (Yao et al., 2009). De plus, le
fait que CifBp soit capable d’être injectée dans une cellule eucaryote à travers le SST3 d’une
EPEC suggère que la translocation des différents Cifs via le SST3 des bactéries respectives
est envisageable (Jubelin et al., 2009). L’absence de similarité de la région N-terminale (SST)
n’est pas surprenante puisqu’il n’existe pas de séquence consensus d’adressage au SST3 y
compris au sein d’une même bactérie (Ramamurthi and Schneewind, 2003). De récentes
publications ont présenté des méthodes de prédiction pour identifier les SST des effecteurs
(Arnold et al., 2009; Samudrala et al., 2009). Ces programmes prennent en compte de
multiples facteurs comme les propriétés physico-chimiques des séquences en N-terminale, la
composition en acides aminés ainsi que la fréquence de chaque résidu et le contenu G+C. La
nature de cette séquence SST consensus fait encore débat. Selon le programme
(http://www.chlamydiaedb.org), seuls CifEc et CifBp seraient des effecteurs sécrétés par le
SST3.
Identit� (%) Similarit� (%)
CifEc E. coli - -
CifYp (Ypk1971) Y. pseudotuberculosis 56 72
CifBp (Bpss1385) B. pseudomallei 26 45
CifPl (Plu2515) P. luminescens 23 42
CifPa (Pha4011) P. asymbiotica 26 46
GOS5485515 n/a 51 66
Par rapport ˆ Cif de E. coliProt�ines Origine bact�rienne
Figure 6 : Alignement et comparaison de séquences entre CifEc, CifYp, CifBp, CifPl, CifPa
et GOS_5485515 (protéine potentielle tronquée identifiée dans le métagénome isolé dans la
mer des Sargasses). Les résidus fortement conservés sont surlignés en rouge et les acides
aminés conservés à plus de 60 et 80% sont respectivement surlignés en jaune et en orange.
Les étoiles bleues indiquent les résidus C, H et Q de la triade catalytique (chapitre suivant)
(Jubelin et al., 2009).
26
III.3 Les protéines Cifs sont des membres divergents de la
superfamille des cystéines protéases et acétyl-transférases
Récemment, les protéines CifEc, CifBp et CifPl ont été cristallisées. Malgré le faible
pourcentage d’identité entre les différentes Cifs, celles-ci présentent une structure semblable
qui peut être divisée en deux parties ; une extension N-terminale composée d’hélices et un
noyau glomérulaire composé de feuillets et en C-terminal (figure 7). A l’inverse des deux
autres Cifs, la structure cristallisée de CifEc est partielle (acides aminés 100-282). Toutes les
protéines Cifs peuvent présenter des formes dimériques. Cependant, en condition de salinité
physiologique ces molécules sont sous forme monomérique. Toutes les molécules Cifs sont
fonctionnelles. En effet, tous les hétérologues de Cif lipofectés sur les cellules HeLa
reproduisent les effets cytopathiques caractéristiques de CifEc (activation des fibres de stress et
arrêt du cycle cellulaire) (Jubelin et al., 2009). La conservation d’une protéine fonctionnelle à
travers des espèces bactériennes phylogénétiquement très éloignées et pathogènes pour des
hôtes allant des mammifères aux insectes est sans doute unique et remarquable.
Au niveau structural, la protéine la plus proche des molécules Cifs est AvrPphB de
Pseudomonas syringea (Hsu et al., 2008). CifEc partage également une homologie structurale
avec un autre effecteur bactérien, la N-acétyltransférase arylamine de Salmonella enterica. La
protéine AvrPphB appartient à la famille des cystéines protéases dont l’activité dépend d’un
site catalytique composé des résidus cystéine, histidine et aspartate/asparagine (Shao et al.,
2002). L’alignement structural du noyau glomérulaire de CifEc avec d’autres membres de la
famille des cystéines protéases et des acétyltransférases révèle que le site actif de CifEc est
composé de la Cystéine 109, de l’Histidine 165 et de la Glutamine 185 (Hsu et al., 2008). Les
différents hétérologues de CifEc présentent une triade catalytique identique. Chez CifBp, la
triade est composée des résidus Cys 156, His 211 et Gln 231 tandis que chez CifPl on retrouve
les résidus Cys 123, His 181 et Gln 200 (figure 6) (Crow et al., 2009; Yao et al., 2009). La
présence des résidus Glutamines à la place des résidus Aspartate ou Asparagine, normalement
présents et conservés dans les autres enzymes, est nécessaire pour avoir une bonne
superposition de la triade catalytique des Cifs avec celle des autres membres de la
superfamille des cystéines protéases, acétyltransférases et transglutaminases. Cette différence
de composition de la triade catalytique suggère que Cif est un membre divergent de cette
superfamille enzymatique. Comme Chez AvrPphB, le résidu Cys se trouve sur une hélice
Figure 7: Structures cristallisées des protéines Cifs de E. coli (forme tronquée), B.
pseudomallei et P. luminescens. La partie supérieure montre des diagrammes en ruban. Les
hélices et les feuillets sont respectivement colorés en bleu et rouge. Les acides aminés de
la triade catalytique sont sous forme de bâtonnets. Le site catalytique est agrandi dans le carré
gauche. La partie inférieure représente les surfaces des différents monomères de Cif. Le site
catalytique est obstrué par une boucle en violet et le résidu cystéine du site catalytique est en
vert. Le résidu aspartate qui fournit la charge négative près de la cystéine active est en bleu
ciel (Samba-Louaka et al., 2009).
27
en N-terminale et les résidus His et Gln sur un feuillet (figure 7) (Hsu et al., 2008).
L’activité de Cif dépend de cette triade. En effet, la mutation des résidus de la triade
catalytique inhibe (pour les résidus Cys et His) ou réduit (pour le résidu Gln) les effets de
CifEc (Hsu et al., 2008). Par ailleurs, le résidu Asp (187 chez CifEc), qui est conservé dans tous
les Cifs, confère une charge négative près du site catalytique (figures 6 et 7). Cette charge
négative est essentielle à l’activité des Cifs puisque sa mutation entraîne une inactivation de
Cif (Yao et al., 2009).
A ce jour, l’activité de Cif reste à déterminer. En effet, malgré une homologie avec les
cystéines protéases de type papaïne, aucune activité protéolytique in vitro n’a été associée aux
différents Cifs (Yao et al., 2009; Hsu et al., 2008). Le site catalytique des protéines Cifs est
partiellement obstrué par une boucle qui n’est pas présente sur les cystéines protéases (figure
7). Cette obstruction partielle ainsi que la charge négative près du site catalytique pourraient
conférer une certaine spécificité pour le substrat. Cependant, la délétion de cette boucle ne
permet pas le clivage de la caséine, substrat classique des cystéines protéases (Hsu et al.,
2008). Plus surprenant encore, Yao et al. ont montré que l’inhibiteur E64, qui se fixe
irréversiblement sur la cystéine du site catalytique des cystéines protéases, se fixe
spécifiquement sur la cystéine de la triade catalytique de Cif (Yao et al., 2009; Hsu et al.,
2008). Or le traîtement de Cif par E-64 ou son utilisation sous forme diffusible (E64-d) sur les
cellules infectées n’empêche pas les effets de Cif (Hsu et al., 2008) alors que la mutation de
cette même cystéine abolit l’activité de Cif. Ce résultat paradoxal n’a pas encore pu être
éclairci. Par ailleurs, il existe des enzymes portant à la fois une activité cystéine protéase et
acétyltransférase. C’est le cas de l’effecteur YopJ de Yersinia qui déubiquitine (phénomène
détaillé dans la discussion) IB grâce à son activité cystéine protéase et acétyle une MAPK
(mitogen-activated protein kinase) Kinase 6 (MAPKK6) (Mukherjee et al., 2006; Zhou et al.,
2005). On ne peut exclure que Cif possède une activité acétyltransférase ou transglutaminase.
28
III.4 Les protéines Cifs bloquent la transition G2/M indépendamment
des modifications du cytosquelette
III.4.1 Les protéines Cifs modulent le cycle cellulaire et le cytosquelette des
cellules hôtes
Les cellules qui ont été exposées à CifEc se caractérisent par une apparition de nombreuses
fibres de stress, de plaques d’adhésion focale et un arrêt de la prolifération cellulaire qui se
manifeste par une absence de mitose (Marches et al., 2003). Ces cellules sont arrêtées en
phase G2 (Taieb et al., 2006; Marches et al., 2003; Nougayrede et al., 2001). L’inhibition de
l’entrée en mitose se caractérise au niveau moléculaire par une accumulation de la forme
phosphorylée (sur Tyr 15) et inactive de l’inducteur de mitose CDK1, et au niveau cellulaire
par une majorité de cellules avec 4N quantité d’ADN (Taieb et al., 2006; Marches et al.,
2003; Nougayrede et al., 2001). Par ailleurs, 72 h après l’infection, des cellules HeLa avec 8N
quantité d’ADN sont observées en présence de CifEc (Nougayrede et al., 2001). Le chapitre
suivant évoquera plus en détail le rôle de la protéine CDK1 ainsi que la notion de quantité
d’ADN.
La translocation ou l’expression des différents hétérologues de Cif dans les cellules HeLa
provoque des effets identiques à ceux induits par CifEc. On assiste à une présence importante
de fibres de stress ainsi qu’un arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M. Ces deux effets
dépendent de la triade catalytique des différents Cifs (Jubelin et al., 2009). Ainsi, les protéines
Cifs forment une famille d’effecteurs bactériens capables d’arrêter la prolifération cellulaire
qui s’étend des bactéries pathogènes aux symbiontes de nématodes (Jubelin et al., 2009).
III.4.2 L’arrêt du cycle cellulaire provoqué par les protéines Cifs ne résulte
pas des modifications du cytosquelette
L’arrêt de la prolifération cellulaire induit par les protéines Cifs n’est pas la conséquence
des modifications visibles du cytosquelette. D’abord, chronologiquement, Cif bloque la
prolifération des cellules dans les 24 h alors qu’il faut attendre 3 jours pour observer les
modifications du cytosquelette. Ensuite, l’apparition des fibres de stress et des plaques
d’adhésion focale résulte de l’activation des protéines eucaryotes Rho (Ridley and Hall,
29
1992). L’inhibition des protéines RhoA, B et C par la toxine DC3B (l’exoenzyme C3 produite
par Clostridium botulinum fusionnée au fragment B de la toxine diphtérique) ou par
l’exotoxine EDIN (epidermal cell differentiation inhibitor produite par Staphylococcus
aureus) ne suffisent pas à lever l’arrêt de la prolifération cellulaire induite par Cif
(Nougayrede et al., 2001). Enfin, les modifications du cytosquelette observées sont restreintes
aux cellules HeLa car les IEC-6 (cellules intestinales non-transformées) ou les Caco-2
(cellules de colon transformées issues d’un carcinome, non différenciées), ne montrent pas
d’induction de fibres de stress ou de plaques d’adhésion focale (Taieb et al., 2006).
A l’inverse des effets sur le cytosquelette, toutes les lignées cellulaires testées (Caco-2, HeLa,
HCT116, 293T) ou les cellules IEC-6 infectées avec une EPEC qui exprime Cif présentent le
même phénotype; elles ne prolifèrent pas (Yao et al., 2009; Samba-Louaka et al., 2008; Taieb
et al., 2006; Marches et al., 2003; Nougayrede et al., 2001). La capacité de Cif à arrêter le
cycle cellulaire eucaryote constitue le phénotype majeur des protéines Cifs. En d’autres
termes, « le cycle cellulaire des cellules eucaryotes exposées à Cif est bloqué ». Cette
propriété permet de définir les protéines Cifs comme faisant partie d’une famille de molécules
bactériennes appelée « Cyclomodulines ».
30
IV- Cif est une Cyclomoduline
Avant d’évoquer la notion de cyclomoduline, je commencerai par faire un rappel de quelques
notions fondamentales du cycle et de la mort des cellules eucaryotes.
IV.1 Le cycle cellulaire eucaryote
IV.1.1 Introduction
Le cycle cellulaire est un processus complexe et très régulé qui permet la duplication
d’une cellule « mère » en deux cellules « filles » identiques à la cellule mère. Lorsqu’elles ne
se divisent pas, les cellules sont dites quiescentes ou en phase G0. En présence de signaux
mitogènes, les cellules eucaryotes débutent un cycle cellulaire qui comprend quatre phases
essentielles: la phase G1 pendant laquelle les cellules passent le point de restriction qui est un
point de non-retour à partir duquel la progression dans le cycle ne dépend plus de signaux
mitogènes ; la phase S pendant laquelle s’opère la duplication du génome ; la phase G2 qui
prépare les cellules à la mitose et la phase M (ou mitose) caractérisée par la répartition du
contenu cellulaire et du matériel génétique dans deux cellules filles. Il est possible de
déterminer les phases dans lesquelles se trouvent les cellules en analysant leur contenu en
ADN par cytométrie en flux. Les cellules en phase G1 possèdent 2n quantité d’ADN alors que
celles en phase G2 et au début de la mitose disposent de 4n quantité d’ADN (figure 8A).
IV.1.2 Les complexes CDK/Cyclines
Les protéines essentielles à la progression du cycle cellulaire sont les kinases CDKs
(Cyclin-dependent Kinases) (figure 8A). Trois niveaux de régulation de ces protéines ont été
décrits : l’association avec une sous-unité activatrice, la cycline ; un profil de phosphorylation
faisant intervenir des phosphorylations activatrices et inhibitrices et enfin la fixation
d’inhibiteurs des CDKs, les protéines CKIs. Chez les eucaryotes supérieurs, les CDKs sont
actives uniquement sous forme de complexe avec des unités régulatrices spécifiques dont le
Figure 8A: Les principales phases du cycle cellulaire des eucaryotes supérieurs. La
progression à l’intérieur ou entre les phases est régulée par l’activité des kinases CDKs. Trois
niveaux de régulation des CDKs ont été décrits : l’association à la cycline, un profil de
phosphorylation faisant intervenir des phosphorylations activatrices et inhibitrices et enfin la
fixation d’inhibiteurs des CDKs. La figure ci-dessus représente deux niveaux d’activation des
CDKs : la fixation aux cyclines et la phosphorylation par la CAK. Ce schéma est inspiré de
(Malumbres and Barbacid, 2005).
31
niveau varie en fonction des différentes phases du cycle cellulaire; les Cyclines (Grana and
Reddy, 1995; Gautier et al., 1990; Draetta et al., 1989; Meijer et al., 1989). Les cyclines D
sont exprimées lors des phases G1 et sont dégradées en phase S par le protéasome après leur
ubiquitinylation (Diehl et al., 1997). Les cyclines qui interviennent dans la mitose (A et B)
s’accumulent durant les phases G1, S et G2 et sont dégradées en mitose (King et al., 1995;
Glotzer et al., 1991). Il existe de nombreuses CDKs mais seules 4 (CDK1, 2, 4 et 6) ont un
rôle clairement défini dans la régulation du cycle cellulaire.
IV.1.3 Régulation du cycle cellulaire par les complexes CDK/Cyclines
La CDK4 et la CDK6 se fixent aux cyclines D1, D2 et D3 pour assurer le déroulement de
la phase G1 (Sherr, 1993). Schématiquement, les signaux mitogènes induisent la synthèse des
cyclines de type D qui s’associent aux CDK4 et 6 et permettent leur translocation dans le
noyau. Les complexes CDK4,6/Cyclines D phosphorylent des protéines telles que le
rétinoblastome (Rb), les protéines p107 et p130. Ces trois protéines, appelées « pocket
proteins », s’associent et inhibent l’activité des facteurs de transcription de la famille E2F. La
phosphorylation des complexes Rb/E2F conduit à la libération des facteurs E2F (Dyson,
1998; Nevins, 1998). Parmi les gènes régulés par les facteurs E2F, on trouve la cycline E qui
s’associe avec la CDK2.
Le complexe CDK2/Cycline E formé phosphoryle des sites additionnels de Rb (rétrocontrôle
positif) pour permettre la libération complète des facteurs E2F qui induisent la transcription
d’autres gènes nécessaires à la phase S telle que la cycline A (Pagano et al., 1992; Zindy et
al., 1992; Girard et al., 1991). Le complexe CDK2/Cycline E assure donc la transition G1/S
(Strausfeld et al., 1996; Ohtsubo et al., 1995) tandis que le complexe CDK2-cycline A est
nécessaire pour la réplication (Pagano et al., 1992).
La kinase CDK1 peut s’associer aux cyclines A et B et phosphoryle plus de 70 protéines dont
celles intervenant dans sa propre régulation, dans la réplication de l’ADN ou dans la mitose
(avec l’assemblage du fuseau mitotique ou même la séparation d’organites telle que le
centrosome) (Malumbres and Barbacid, 2005; Ubersax et al., 2003). Dans le chapitre qui suit,
j’évoquerai la transition G2/M qui est assurée par le complexe CDK1/Cycline B1 (Arellano
and Moreno, 1997; King et al., 1994; Nurse, 1990).
32
IV.1.4 Le complexe CDK1/Cycline B1 ou l’inducteur universel de mitoses
Durant la phase G2 les cellules synthétisent les cyclines B qui forment des complexes avec
CDK1. Cette dernière subit une phosphorylation sur la thréonine 161 par le complexe CAK
(composé de la CDK7/Cycline H). Cette phosphorylation induit un changement de
conformation qui facilite la fixation des cyclines (Larochelle et al., 2007; Sutton and Freiman,
1997; Jeffrey et al., 1995). Les complexes CDK1/Cycline B1 sont maintenus sous une forme
inactive via les phosphorylations de la tyrosine 15 et de la thréonine 14 de CDK1 par les
kinases Wee1 d’une part et Myt1 d’autre part (Booher et al., 1997; Liu et al., 1997; Parker et
al., 1992; Parker and Piwnica-Worms, 1992). Lorsque la cellule est prête à entrer en phase M,
les résidus Tyr15 et Thr14 sont déphosphorylés par les phosphatases Cdc25s ce qui rend le
complexe actif (Draetta and Eckstein, 1997). Dans les cellules de mammifères, il existe trois
isoformes de phosphatases Cdc25s : A, B et C. Toutes les isoformes jouent un rôle essentiel et
surtout coopèrent pour assurer la déphosphorylation des CDKs ainsi que les transitions G1/S
et G2/M (Boutros et al., 2006). Une fois activé, le complexe CDK1/Cycline B1 peut interagir
et phosphoryler ses nombreux substrats (tels que les lamines, Wee1, Cdc25, les condensines,
la kinésine Eg5 nécessaire à l’assemblage du fuseau mitotique, etc.) pour assurer la transition
entre la phase G2 et la mitose (Blangy et al., 1995; Hoffmann et al., 1993; Courvalin et al.,
1992; Heald and McKeon, 1990).
La protéine CDK1 peut exécuter tous les évènements nécessaires à la progression du cycle.
En effet, il existe des phénomènes de compensation entre les molécules de CDK et également
entre les cyclines. Les cellules peuvent proliférer en absence de la cycline E, des CDK2, 4 et
6. De plus, la kinase CDK1 est capable de se fixer aux Cyclines D et E et de phosphoryler le
Rb. Toutefois, l’activité de la protéine CDK1 ne peut être compensée (Santamaria et al.,
2007; Geng et al., 2003).
IV.1.5 Les inhibiteurs des complexes CDK/Cyclines
Le troisième niveau de régulation des complexes CDK/Cyclines consiste à fixer des
inhibiteurs de CDK (CKI). Deux familles de CKI ont été identifiées ; les protéines INK4
(inhibiteurs de CDK4) et les protéines Cip/kip. La famille des INK4 comprend les protéines
33
p15 (INK4b), p16 (INK4a), p18 (INK4c) et p19 (INK4d) qui se fixent exclusivement aux
CDK4 et 6. Ces INK4 forment des complexes stables avec les CDKs, empêchant leur
association avec les cyclines D (Carnero and Hannon, 1998). La seconde famille
d’inhibiteurs, les protéines Cip/kip, ont un mode et un spectre d’action différent en inhibant
l’activité des complexes CDK/cyclines (Niculescu et al., 1998; Dimri et al., 1995; Harper et
al., 1995; Polyak et al., 1994). Cette famille comprend les protéines p21 (waf1, Cip1), p27
(kip1, Cip2) et p57 (kip2). p21 se distingue des autres CKIs par sa capacité à fixer et inhiber
PCNA (proliferating cell nuclear antigen) nécessaire à la réplication de l’ADN (Cayrol et al.,
1998; Waga et al., 1994). Lorsque le niveau de p21 et de p27 est élevé, celles-ci fonctionnent
comme des inhibiteurs du complexe CDK2/Cycline E. En effet, la fixation de p27, par
exemple, au site catalytique d’un complexe CDK/Cycline empêche la fixation de l’ATP
(Pavletich, 1999; Russo et al., 1996). Le complexe CDK2/Cycline E étant essentiel à la
transition G1/S, il s’en suit un arrêt du cycle cellulaire (Toyoshima and Hunter, 1994). Pour
réguler l’activité du complexe CDK2/Cycline E par les protéines Cips, la cellule a mis en
place un système original. Les protéines p21 et p27 peuvent se fixer à la fois aux cyclines et
aux CDKs. Ainsi, à un faible niveau, les CKIs facilitent l’interaction CDK/Cyclines et donc
permettent la progression du cycle cellulaire (Sherr and Roberts, 1999; LaBaer et al., 1997).
Lorsque le niveau des protéines Cips nécessaire pour assembler les complexes
CDK2/Cyclines E est atteint, le reste des molécules Cips est titré par le complexe
CDK4/Cycline D. Par ailleurs, les protéines p21 et p27 sont phosphorylées par CDK2/Cycline
E. Ces phosphorylations sont suivies de leur dégradation par le protéasome après avoir été
ubiquitinylées (Bornstein et al., 2003; Sheaff, 1997; Vlach et al., 1997) (figure 8B).
IV.1.6 Les points de Contrôle
Pendant le cycle cellulaire, l’ADN et les organelles nécessitent d’être parfaitement
dupliqués et correctement répartis dans les deux cellules filles. La coordination et le bon
déroulement de tous ces phénomènes sont assurés par l’existence de points de contrôle
(Checkpoints) aux points critiques du cycle cellulaire ; lors des transitions G1/S, G2/M,
métaphase/anaphase et durant la phase S. Comme dans toutes les voies qui permettent la
transduction des signaux, les points de contrôle peuvent être divisés en quatre niveaux de
régulation formés des protéines senseurs, des protéines médiatrices, des protéines
transductrices et des protéines effectrices (Sancar et al., 2004; Zhou and Elledge, 2000). Le
Figure 8B : Régulation de la transition G1/S. Les signaux mitogènes induisent l’assemblage
du complexe CDK4/Cycline D et d’une protéine Cip ou kip. La séquestration des protéines
Cip/Kip diminue le niveau de ces inhibiteurs ce qui facilite l’activation du complexe
CDK2/Cycline E. Les CDK4 et 2 contribuent séquentiellement à la phosphorylation du
rétinoblastome (RB), bloquant sa capacité à réprimer les facteurs de transcription de la famille
E2F. Il s’en suit une activation de la transcription des gènes requis pour l’entrée en phase S.
D’autre part, le complexe CDK2/Cycline E phosphoryle et provoque la dégradation de p27.
La dégradation des protéines Cip/Kip et l’induction des Cyclines par les facteurs de
transcription E2F marquent le point de départ d’un cycle cellulaire qui ne dépend plus des
signaux mitogènes (rectangle à fond gris-bleu). Ce schéma a été inspiré de (Sherr and
Roberts, 1999).
34
dommage est détecté par les protéines senseurs qui sont activées lors de dommages
cellulaires. Elles permettent le recrutement des protéines médiatrices qui activent les protéines
transductrices. Ces dernières agissent sur les protéines effectrices permettant l’arrêt du cycle
cellulaire et la mise en place des systèmes de réparation (figure 9A). Ainsi, lorsqu’il y a des
dommages à l’ADN, des problèmes de progression des fourches de réplication de l’ADN, de
ségrégation des chromosomes ou de réorganisation de certaines organelles, la cellule active
des voies de signalisation qui permettent d’arrêter la progression du cycle cellulaire (Kondylis
et al., 2007; Crosnier et al., 2006; Sancar et al., 2004; Nyberg et al., 2002). Ces pauses
permettent à la cellule de réparer le dommage avant d’avancer ou d’aborder la phase suivante.
Si les dommages sont irréversibles, les voies activées par les points de contrôle permettent
aussi d’activer la mort cellulaire par apoptose (figure 9A) (Zhou and Elledge, 2000). Le rôle
ultime des points de contrôle est donc de veiller à l’intégrité de la cellule. Pour illustrer la
mécanique mise en place par les points de contrôle, prenons l’exemple des cellules en phase
G1 dont l’ADN a subit des cassures double-brins (figure 9B). Afin d’éviter une entrée en
phase S et la duplication d’ADN endommagé, la cellule active le point de contrôle en G1/S.
Lors de dommages à l’ADN, la protéine senseur activée est ATM (ataxia telangiectasia
mutated). Une mutation du gène atm entraîne de graves pathologies comme l’ataxie
telangectasia (Shiloh, 1997). La protéine ATM s’active par autophosphorylation et
phosphoryle de nombreux substrats dont les protéines p53 et Chk2 (Checkpoint kinase 2) et
l’histone H2AX (Bakkenist and Kastan, 2003; Falck et al., 2001). Les protéines médiatrices
(comme BRCA1 ; breast cancer associated gene 1) interviennent également puisqu’elles
interagissent avec les protéines senseurs (ATM) et transductrices (Chk2). La phosphorylation
des protéines p53 et Chk2 active deux mécanismes qui seront l’initiation et le maintien de
l’arrêt G1/S (figure 9B). En effet, la protéine Chk2 phosphorylée induit à son tour une
phosphorylation de la phosphatase Cdc25A (protéine effectrice) qui est ensuite exclue du
noyau, séquestrée dans le cytoplasme par les protéines de la famille 14-3-3 puis dégradée
(Chen et al., 2003; Falck et al., 2001; Molinari et al., 2000). L’absence de Cdc25A induit une
accumulation de la forme phosphorylée (par la protéine Wee1) et inactive de CDK2 qui ne
peut provoquer l’entrée en phase S (Wu et al., 2001). Pour maintenir cet arrêt, la protéine p53
phosphorylée par ATM est stabilisée, maintenue dans le noyau (Zhang and Xiong, 2001;
Banin et al., 1998). La protéine p53 peut alors induire la transcription du gène de p21 (Zhang
and Xiong, 2001; Gartel and Tyner, 1999; Banin et al., 1998). La protéine p21, inhibitrice des
complexes CDKs/Cyclines et de PCNA nécessaire aussi à la réplication, permet la
Figure 9A : Vue générale et simplifiée des différentes issues possibles après l’activation
d’un point de contrôle en réponse aux dommages à l’ADN ou à un stress réplicatif. Les
flèches indiquent une activation alors que les traits perpendiculaires montrent une activité
inhibitrice. La présence de dommages à l’ADN ou de stress durant la réplication empêche la
transition entre les phases du cycle cellulaire (Stop). Cet arrêt du cycle cellulaire permet la
transcription de nombreux gènes et la mise en place des systèmes de réparation. L’incapacité
à réparer les lésions provoque l’apoptose des cellules (Zhou and Elledge, 2000).
35
maintenance de l’inhibition de la transition G1/S (figure 9B) (Cayrol et al., 1998; Waga et al.,
1994).
En dehors des situations de stress cellulaires, ces points de contrôle assurent également une
une synchronisation et une inter-dépendance entre les différentes phases du cycle. Par
exemple, la cellule n’engage pas de mitose si la synthèse de l’ADN n’est pas réalisée
(Hartwell and Weinert, 1989).
IV.1.7 La dérégulation des points de Contrôle
A l’échelle d’un organisme, la dérégulation d’une protéine faisant partie des points de
contrôle peut avoir des conséquences catastrophiques. C’est par exemple le cas avec la
protéine ATM qui a été présentée précédemment. Si nous élargissons le propos à une autre
protéine comme BRCA1, des mutations perte-de-fonction provoquent de nombreux effets tels
qu’une réparation des dommages à l’ADN et un point de contrôle en G2/M défaillants, un
point de contrôle en mitose défectueux à l’origine de dommages chromosomiques et
d’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes). La délétion du gène de BRCA1 est à
l’origine d’une instabilité génomique qui augmente le risque de développer un cancer (Deng,
2006). Les femmes portant une mutation du gène brca1 possèdent un risque de développer un
cancer du sein compris entre 50 et 80% à l’âge de 70 ans (Bieber et al., 1998; Struewing et
al., 1997; Ford et al., 1995). Un autre gène qui est inactivé dans plus de la moitié des cas des
cancers, est la protéine p53. La dérégulation de l’activité de p53 (ou son absence) résulte en
une instabilité génomique propice à l’émergence de tumeurs (Xu, 2008).
IV.2 La mort cellulaire
Dans ce chapitre, je présenterai assez brièvement les différents types de mort cellulaire
eucaryote. Je mettrai l’accent sur l’apoptose car j’ai mis en évidence une nouvelle action de
Cif sur ce phénomène.
Figure 9B : Le point de contrôle du cycle cellulaire à la transition G1/S. Les dommages à
l’ADN sont détectés par la protéine ATM s’il s’agit de cassures double-brins de l’ADN ou par
ATR, Rad17-RFC et le complexe 9-1-1 pour tout autre dommage. Les protéines ATM/ATR
phosphorylent Rad17, Rad9, p53 et les kinases Chk1/Chk2 qui phosphorylent à leur tour la
phosphatase Cdc25A. Cette dernière est exclue du noyau et dégradée suite à une
ubiquitinylation. Phosphorylée et inactive, Cdk2 s’accumule et ne peut phosphoryler la
protéine Cdc45 pour initier la réplication. Le maintien de l’arrêt G1/S est orchestré par la
protéine p53 qui est phosphorylée sur sa sérine 15 par ATM/ATR et sur sa sérine 20 par
Chk1/Chk2. La protéine p53 phosphorylée induit la transcription du gène p21 et la protéine
p21 inhibe le complexe CDK4/Cycline D, empêchant la phosphorylation du Rb qui est
nécessaire pour la libération des facteurs de transcription E2F et la transcription des gènes
impliqués dans la phase S. p21 se fixe et inhibe également le complexe CDK2/Cycline E pour
assurer le maintien de l’arrêt en G1/S (Sancar et al., 2004).
36
IV.2.1 Description de quelques mécanismes de mort cellulaire
Chez les eucaryotes supérieurs, le processus de mort cellulaire n’est pas uniforme. De
nombreux types de mort cellulaire ont été décrit comme l’apoptose, la pyroptose, l’oncose
(processus qui dans sa phase finale est appelé nécrose), la mort en mitose (appelée mitose
catastrophe) et l’autophagie (Labbe and Saleh, 2008; Blank and Shiloh, 2007; Fink and
Cookson, 2005).
L’autophagie est un phénomène qui se produit dans tous les types cellulaires. Celle-ci se
caractérise par une dégradation du matériel cytosolique par des enzymes lysosomales au sein
d’une vacuole à double membrane appelée « autophagosome » (Klionsky and Emr, 2000). Ce
mécanisme d’autophagie permet de renouveler les organelles et le contenu cytoplasmique.
L’autophagie peut survenir dans des situations de carence en nutriments lorsque la cellule a
besoin de générer des nutriments et de l’énergie. Toutefois, un excès d’autophagie peut
entraîner la mort de la cellule appelée mort cellulaire de type II (Blank and Shiloh, 2007;
Levine and Yuan, 2005; Schwartz et al., 1993).
L’oncose est une mort cellulaire caractérisée par un gonflement de la cellule, une déplétion en
ATP et une augmentation de la perméabilité membranaire avec rupture de la membrane
(Majno and Joris, 1995). Il a longtemps été pensé que l’oncose est une mort accidentelle et
passive mais il semblerait que des processus enzymatiques telle que la polymérase PARP1
(poly(ADP-ribose) polymerase) soient impliqués (Sun et al., 2006). En effet, en présence
d’une destruction massive de l’ADN, l’activité excessive de la PARP, pour réparer l’ADN,
provoque une déplétion de son substrat NAD (nicotinamide adénine dinucléotide). La
synthèse de la NAD est coûteuse en ATP et la perte d’énergie est à l’origine de l’oncose
(Walisser and Thies, 1999; Berger, 1985). Cette mort est hautement inflammatoire et l’on
parle de nécrose dans le langage courant.
La mitose catastrophe est une mort cellulaire qui intervient lors d’une mitose aberrante à la
suite de dommages cellulaires tels qu’une duplication anormale des centrosomes, des
perturbations du fuseau mitotique ou de sévères dommages à l’ADN. Cette mort cellulaire se
produit entre la métaphase et l’anaphase. Elle est contrôlée par de nombreuses protéines qui
régulent le cycle cellulaire (comme la protéine CDK1) et interviennent dans les points de
contrôle du cycle cellulaire (comme la protéine p53) ou dans l’apoptose (comme la caspase-2)
(Castedo and Kroemer, 2004; Castedo et al., 2004). Le phénotype des cellules en mitose
catastrophe serait entre celui de la sénescence et l’apoptose (Blank and Shiloh, 2007; Eom et
al., 2005). Les cellules en sénescence se caractérisent par plus grande taille, un aspect aplati,
37
un raccourcissement des télomères, une accumulation des anomalies du caryotype et
l’expression d’une -galactosidase fréquemment utilisée comme marqueur de sénescence
(Dimri et al., 1995).
Les deux types de morts cellulaires restants, la pyroptose et l’apoptose, font intervenir une
famille de cystéines protéases appelées caspases. Ces protéines sont produites sous forme de
zymogènes (pro-caspases). Elles sont activées par clivage et clivent leurs substrats à travers la
protéolyse de résidus aspartate au sein de motifs spécifiques pour chaque caspase (Cohen,
1997). La pyroptose est une mort cellulaire qui dépend de la caspase-1 (ou ICE ; interleukin
(IL)-1b converting enzyme) (Cookson and Brennan, 2001). Cette dernière clive et donc active
des cytokines pro-inflammatoires telles que la pro-IL-1(Fantuzzi and Dinarello, 1999).
L’activité de la caspase-1 peut être induite par des agents infectieux comme la bactérie
Shigella flexneri mais peut également être impliquée dans la genèse de certaines maladies
comme les maladies inflammatoires de l’intestin ou les maladies neurodégénératives
(Bergsbaken et al., 2009; Hilbi et al., 1998; Hilbi et al., 1997). Cependant, la caspase-1 joue
un rôle dans la résistance aux infections. Il a été montré que, comparées aux animaux
sauvages, les souris déficientes pour la caspase-1 sont plus sensibles aux infections comme la
salmonellose (Lara-Tejero et al., 2006; Raupach et al., 2006). La pyroptose se caractérise par
une rupture rapide de la membrane plasmique avec relargage du contenu pro-inflammatoire
intracellulaire. Pour expliquer cette lyse de la cellule, il a été suggéré que les pores formés à la
surface des cellules en pyroptose laissent passer des ions ; ce qui perturbe le gradient ionique
de la cellule. Il en résulte une augmentation de la pression osmotique entraînant une entrée
d’eau et une lyse osmotique. Les cellules en pyroptose présentent également un noyau
condensé et une fragmentation de l’ADN chromosomal. Comme l’oncose, la pyroptose est
une mort inflammatoire.
IV.2.2 L’apoptose
L’apoptose est une mort cellulaire non inflammatoire bien définie morphologiquement
et biochimiquement. Au niveau morphologique, les cellules apoptotiques se caractérisent par
des repliements de la membrane plasmique (ressemblant à des ampoules), une réduction du
volume cellulaire, une condensation de la chromatine et une fragmentation du noyau. La
fragmentation de la cellule provoque la formation de corps apoptotiques qui seront ensuite
38
absorbés par des phagocytes. Il n’y a donc pas de relargage du contenu cellulaire, ce qui
explique l’absence d’inflammation lors de l’apoptose (Elmore, 2007). Au niveau
biochimique, l’apoptose se caractérise par des réactions en cascade dans lesquelles des
caspases clivent et activent d’autres caspases (figure 10). Ainsi, les caspases participant à
l’apoptose ont été regroupées en 2 classes. Les caspases initiatrices (2, 8, 9, 10) qui initient la
cascade et les effectrices (3, 6, 7) qui sont à l’origine des changements morphologiques. Les
autres caspases (-1, -4, -5 et -11) qui induisent une inflammation (inflammatory caspases) ne
participent pas à l’apoptose (Creagh et al., 2003). Les signaux provoquant l’apoptose peuvent
être extra-cellulaires. Les ligands se fixent sur des récepteurs de mort (comme le récepteur du
TNF, TNFR-1) qui activent une voie de signalisation faisant intervenir les caspases-2, -8 ou -
10 (figure 10). Il existe une seconde voie endogène pouvant induire l’apoptose qui met en jeu
la mitochondrie. La voie mitochondriale est activée lors de stress tels que les dommages à
l’ADN. En effet, la présence de dommages à l’ADN provoque une stabilisation de p53 (voir
chapitre sur le cycle cellulaire). Lorsque les dommages sont irréparables, la même protéine
p53 induit la transcription de nombreux gènes pro-apoptotiques tel que bax, puma et noxa
(Murray-Zmijewski et al., 2008). Les protéines Bax, Puma et Noxa font partie de la famille
des protéines Bcl-2. Lors de l’apoptose, la protéine Bax est transloquée et insérée dans la
membrane externe de la mitochondrie où elle s’oligomérise et forme un pore. Cet effet de Bax
est contrecarré par d’autres protéines de la famille Bcl-2 qui inhibent l’apoptose (comme la
protéine Bcl-2 par exemple). Pour favoriser l’induction de l’apoptose, d’autres protéines de la
famille Bcl-2 (telles que Puma et Noxa) fixent les protéines Bcl-2 anti-apoptotiques. Les
protéines pro-apoptotiques telles que Bax libérées vont exercer leur effet sur la membrane
mitochondriale (Youle and Strasser, 2008). La présence de pores dans la membrane externe
libère, dans l’espace cytosolique, de nombreuses protéines pro-apoptotiques situées dans
l’espace inter-membranaire de la mitochondrie parmi lesquelles le cytochrome C et la
protéine Smac/Diablo (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000; Li et al., 1997a). Il se forme
alors un complexe appelé apoptosome composé de la procaspase-9, la protéine Apaf-1
(apoptotic protease activation factor-1) oligomérisée et du cytochrome C (Hill et al., 2004;
Chinnaiyan, 1999; Li et al., 1997b). La caspase-9 ainsi activée peut ensuite provoquer
l’activation des caspases effectrices. Quant à la protéine Smac (second mitochondrial
activator of caspases) qui est également appelée Diablo (direct IAP binding protein with low
pH), elle potentialise l’activation des caspases en fixant et en bloquant l’activité des protéines
IAPs (Inhibitor of apoptosis proteins). La plus connue des protéines IAPs est la protéine
XIAP (X chromosome-linked inhibitor of apoptosis proteins) qui se fixe et inhibe l’activité
Figure 10 : Schéma du mécanisme d’apoptose avec quelques substrats des caspases
exécutrices. Comme mentionné dans le texte, il existe deux voies (extrinsèques et
intrinsèques ou mitochondriales) à l’origine de l’apoptose. Les substrats clivés par les
caspases exécutrices sont des composants du cytosquelette (lamine A, actine, gelsoline et
fodrine) et des molécules participant à la stabilité génomiques (PARP et ICAD). Le cyto c
correspond au cytochrome C. Les molécules FADD (Fas-Associated Death Domain) et
TRADD (TNFR-Associated Death Domain) sont des protéines adaptatrices qui font le lien
entre le récepteur activé (par les molécules Fas ou TNF) et les procaspases initiatrices (2, 8 et
10) (Fan et al., 2005).
Apoptose
rétrécissement de la cellule repliements de la membrane Fragmentation de l’ADN
Lamine A, Actine, Gelsoline, Fodrine ICAD/CAD
Réparation de l’ADN
MitochondrieStress cellulaire
signal de
Récepteur
39
des caspases-3, -7 et -9 (Deveraux et al., 1998; Deveraux et al., 1997). L’induction de
l’apoptose par un signal extra-cellulaire peut également activer la voie mitochondriale
(Elmore, 2007). Toutefois, les deux voies d’apoptose (extrinsèque et mitochondriale)
concourrent en un point, l’activation des caspases effectrices dont la caspase-3. Cette dernière
clive des substrats comme l’inhibiteur de la CAD (Caspase-activated deoxyribonuclease) ou
ICAD, ce qui libère la CAD qui migre dans le noyau pour dégrader l’ADN chromosomal
(Sakahira et al., 1998). Les autres substrats de la caspase-3 sont la gelsoline, la fodrine et la
lamine A. La gelsoline clivée, ne nécessite plus d’ions Ca2+ pour dissocier les filaments
d’actine. La fodrine est un composant du cytosquelette sous-jacent à la membrane plasmique
tandis que la lamine A est un composant de l’enveloppe nucléaire (Herceg and Wang, 2001;
Sun et al., 1999; Sakahira et al., 1998; Kothakota et al., 1997; Rao et al., 1996; Martin et al.,
1995a; Oberhammer et al., 1994). Le clivage de la gelsoline et de la fodrine participe à la
destructuration du cytosquelette. Ceci provoque ces repliements de la membrane plasmique
ressemblant à des ampoules (figure 10). Contrairement à ce qui se passe lors de l’oncose, la
PARP qui participe à la réparation des dommages à l’ADN, est clivée par la caspase-3 lors de
l’apoptose. Malgré les dommages importants de l’ADN, l’inactivation de la PARP préserve le
niveau intra-cellulaire d’ATP nécessaire à la réalisation de l’apoptose (Walisser and Thies,
1999).
IV.2.3 Liens entre les différents types de mort cellulaire
Il existe de nombreux liens entre les différents types de mort cellulaire. Par exemple, de
nombreux signaux pro-apoptotiques sont à l’origine d’une mort cellulaire par autophagie. Il
existerait une interdépendance entre l’autophagie et l’apoptose et, suivant les conditions, les
cellules pourraient mourir par l’une ou l’autre des morts (Levine and Yuan, 2005). C’est le
cas par exemple des cellules neuronales qui, en condition pro-apoptotique mais traitées avec
un inhibiteur d’apoptose, meurent par autophagie (Xue et al., 1999).
Durant l’apoptose, la membrane plasmique est intacte mais il se produit une redistribution de
la phosphatidylserine du feuillet interne au feuillet externe de la membrane plasmique. La
phosphatidylserine exposée est reconnue par les macrophages qui phagocytent les cellules
apoptotiques (Fadok et al., 2000; Martin et al., 1995b; Fadok et al., 1992). Toutefois, si la
cellule en apoptose n’est pas phagocytée, de nombreuses réactions intra-cellulaires se
produisent comme un dysfonctionnement de la mitochondrie et une production importante
40
d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). De plus, une activation importante des enzymes
comme les calpaines induit une déplétion en ATP et provoquent une rupture de la membrane
lysosomale. Comme cela est observé lors de l’oncose, ces cellules précédemment en apoptose
gonflent, subissent une déplétion en ATP et augmente la perméabilité de leur membrane qui
se rompt. Cet évènement tardif de l’apoptose porte le terme de « nécrose secondaire » et peut
être observé notamment lors de l’étude expérimentale de phénomènes d’apoptose in vitro
(Silva et al., 2008).
La survenue de l’oncose associée à un autre type de mort cellulaire n’est pas spécifique à
l’apoptose. Par exemple, la « pyronécrose » (oncose avec libération de l’interleukine 1-
mature) a été décrite pour des macrophages infectés, in vitro, par une quantité importante de
bactéries Shigella flexneri (Fernandez-Prada et al., 1997).
Il existe également un lien entre la pyroptose et l’autophagie. Il a été suggéré par exemple que
lors d’une contamination limitée, les macrophages se débarrasseraient des pathogènes par
autophagie. Toutefois, lorsque l’autophagie ne suffit pas à circonscrire l’infection, les
macrophages activeraient un programme de mort par pyroptose (Swanson and Molofsky,
2005).
IV.3 Les bactéries sont des micro-organismes pirates
Afin d’assurer leur survie, les bactéries ont appris à réguler les fonctions cellulaires
eucaryotes. Ainsi, au travers de leurs toxines ou effecteurs, les bactéries modulent le
cytosquelette, le trafic intracellulaire, les systèmes de dégradation et la mort cellulaire.
Comme nous venons de le développer, le contrôle du cycle ainsi que de la mort cellulaire est
crucial pour la physiologie d’un organisme. Les travaux pionniers réalisés dans notre équipe
ont révélé qu’à l’instar des virus, de plus en plus d’effecteurs bactériens sont capables de
contrôler la prolifération des cellules hôtes (Chaurushiya and Weitzman, 2009; Nougayrede et
al., 2005; Oswald et al., 2005). Le laboratoire a donc proposé le terme de « Cyclomoduline »
pour décrire ces molécules bactériennes capables de réguler le cycle cellulaire eucaryote.
41
IV.3.1 Les Cyclomodulines
On distingue deux types de cyclomodulines, les activatrices et les inhibitrices
(Nougayrede et al., 2005; Oswald et al., 2005). Les cyclomodulines activatrices stimulent la
prolifération des cellules. A l’inverse, les cyclomodulines inhibitrices empêche toute
progression du cycle cellulaire (figure 11).
Suivant leur mode d’action, les cyclomodulines peuvent être regroupées en deux classes : les
génotoxines et les molécules qui détournent les signalisations cellulaires.
La toxine CDT (Cytolethal Distending Toxin) est la génotoxine la plus étudiée. Celle-ci fut la
première toxine bactérienne identifiée capable de bloquer le cycle cellulaire à la transition
G2/M (Peres et al., 1997). En effet, CDT possède un site actif de type « DNase-like » et
provoque des cassures double-brins de l’ADN eucaryote détectées par la phosphorylation de
l’histone H2AX, marqueur spécifique et sensible de ce type de lésion (Li et al., 2002;
Rogakou et al., 1998). La présence de dommages à l’ADN entraîne l’activation d’une voie de
signalisation cellulaire qui se manifeste par l’auto-phosphorylation (activation) de la PI3
kinase ATM qui phosphoryle H2AX et active la Checkpoint kinase 2 (Chk2). Activée Chk2
phosphoryle les phosphatases Cdc25 qui sont ensuite séquestrées dans le cytoplasme par les
protéines de la famille 14-3-3. Les Cdc25s ne peuvent plus déphosphoryler le complexe
inducteur de mitose CDK1/Cycline B qui reste inactif. Cela se traduit par un arrêt du cycle
cellulaire à la transition G2/M (figure 11) (Whitehouse et al., 1998; Comayras et al., 1997).
L’activation des points de contrôle permet aux cellules d’arrêter la progression du cycle
cellulaire et de réparer les dommages ou les anomalies. Cependant, dans le cas de CDT, les
dommages peuvent être irréparables et entraîner les cellules vers une mort par apoptose
(Shenker et al., 2006; Bielaszewska et al., 2005; Ohara et al., 2004; Gelfanova et al., 1999).
Après avoir travaillé sur CDT, l’équipe étudie une autre cyclomoduline produite par des E.
coli pathogènes extra-intestinales (ExPEC) appelée Colibactine. Cette dernière serait un
peptide-polykétide qui, comme CDT, arrête le cycle cellulaire à la transition G2/M en
provoquant des cassures double-brins de l’ADN (figure 11) (Nougayrede et al., 2006).
Le second mode d’action des cyclomodulines consiste non plus à activer une voie de
signalisation (comme les génotoxines) mais plutôt à la pirater. Comme CDT, l’effecteur IpaB
arrête le cycle cellulaire à la transition G2/M (figure 11). Toutefois, le mécanisme utilisé par
les deux cyclomodulines est différent. En effet, la protéine IpaB interagit avec une protéine
eucaryote, Mad2L2. Cette dernière inhibe l’activité ubiquitine ligase du complexe APCcdh1
(anaphase promoting complex). Le complexe APC est impliqué dans l’ubiquitinylation de
Figure 11: Les cyclomodulines (molécules en rose) et le cycle cellulaire. Les
cyclomodulines inhibitrices bloquent la progression du cycle cellulaire en plusieurs phases.
Cif (E. coli, B. pseudomallei, P. luminescens, P. asymbiotica, Y. pseudotuberculosis), IpaB
(Shigella flexneri, dysentariae et sonnei), CopN (Chlamydia pneumoniae), les ERO (espèces
réactives de l’oxygène) (Enterococcus faecalis), la Colibactine (E. coli,Citrobacter koseri,
Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae) et CDT (produit par de nombreuses espèces
bactériennes dont E. coli, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, et Helicobacter hepaticus)
arrêtent le cycle à la transition G2/M. D’autres cyclomodulines inhibitrices agissent en phase
G1. C’est le cas de VacA (Helicobacter pylori), FIP (Fusobacterium nucleatum) ainsi que la
Subtilase (E. coli) et la Mycolactone (Mycobacterium ulcerans). Les cyclomodulines
activatrices (CagA (Helicobacter pylori), PMT (Pasteurella multocida), DNT (genre
Bordetella) et CNF (E. coli et Y. pseudotuberculosis)) favorisent la progression du cycle
cellulaire via l’entrée des cellules en phase S. Cette figure est inspirée de Nougayrede et al.,
2005 et Oswald et al., 2005.
42
nombreux régulateurs du cycle cellulaire en mitose (Acquaviva and Pines, 2006). Ainsi, IpaB
empêche l’inhibition du complexe APCCdh1 par Mad2L2 et donc diminue la demi-vie des
substrats du complexe APCcdh1 tel que Plk1 et la cycline B1. La dégradation incontrôlée de
ces substrats provoque l’arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M (Iwai et al., 2007).
A l’instar de CDT et de IpaB, la protéine Cif arrête la progression du cycle cellulaire à la
transition G2/M et peut donc être classée en tant que cyclomoduline inhibitrice (Marches et
al., 2003). Le premier article présenté dans la partie « Résultats », permet de distinguer lequel
des deux modes d’action décrits précédemment est utilisé par la cyclomoduline Cif.
IV.3.2 Les cyclomodulines forment une famille qui continue de s’agrandir
La figure 11 présente une liste non exhaustive des différentes cyclomodulines. En
effet, de nombreuses molécules bactériennes peuvent être ajoutées à cette liste. C’est le cas de
la toxine B de Clostridium difficile qui retarde la transition G2/M (Ando et al., 2007) ou de la
toxine epsilon de Clostridium perfringens qui provoque une accumulation des cellules en
phase S (Borrmann et al., 2001). Le développement des tests d’interaction entre les bactéries
et les cellules eucaryotes montre que de nombreuses bactéries sont capables de réguler le
cycle cellulaire eucaryote au travers de molécules qui restent à déterminer. C’est, par
exemple, le cas de Chlamydia trachomatis qui ralentit la prolifération cellulaire en réduisant
le niveau de la protéine CDK1 et en clivant la cycline B1 (Balsara et al., 2006) ou de
Neisseria gonorrhoeae qui provoque un arrêt des cellules en phase G1 en diminuant le niveau
des Cyclines D1 et E (Jones et al., 2007).
IV.3.3 Rôle des cyclomodulines
L’existence de cyclomodulines chez de nombreuses entérobactéries pathogènes (mais aussi
commensales) suggère qu’elles confèrent un avantage sélectif aux bactéries qui les
produisent. Nous faisons l’hypothèse que cet avantage serait lié à la modulation de la
prolifération des cellules immunitaires et/ou à la multiplication cellulaire des tissus comme
l’épithélium intestinal, où la réponse proliférative est essentielle.
Dans un contexte d’anses ligaturées, l’effet cyclomoduline a été rapporté in vivo pour
l’effecteur, IpaB de Shigella. L’épithélium intestinal est un tissu qui se renouvelle rapidement,
43
en moins de dix jours. Ce « turn-over » important est un moyen de défense qui permet à
l’organisme de se débarrasser des pathogènes infectant ce tissu (Cliffe et al., 2005). Iwai et al.
suggèrent que IpaB inhiberait la prolifération des cellules de l’épithélium intestinal pour
éviter l’exfoliation des cellules infectées et donc prolonger la colonisation bactérienne (Iwai et
al., 2007). De même, la cyclomoduline CagA d’ Helicobacter pylori empêcherait le
renouvellement de l’épithélium gastrique via un effet anti-apoptotique. L’autre cyclomoduline
dont l’effet a été étudié in vivo est CDT. La souche de Helicobacter hepaticus mutée pour la
sous-unité active de CDT induit une inflammation moins importante du caecum et du colon
comparé à la souche parentale (Shen et al., 2009; Young et al., 2004). CDT joue également
un rôle dans la persistance de la bactérie dans l’organisme. De plus, CDT altère la réponse
immunitaire des souris IL10-/- entraînant une inflammation du colon (Pratt et al., 2006). Lors
d’infections chroniques, le rôle de CDT a été mis en évidence dans la colonisation bactérienne
et dans l’inflammation de l’estomac, de l’intestin et du foie (Ge et al., 2008).
Il est incontestable que les futures études portant sur le rôle des cyclomodulines in vivo
contribueront à comprendre les différentes stratégies bactériennes mises en place pour
coloniser efficacement leur hôte.
44
V- Revue bibliographique
Une partie de ma synthèse bibliographique sur Cif et de mes résultats obtenus au cours de
ma thèse sont en cours de publication sous forme de revue ci-joint.
Cif type III effector protein: a smart hijacker of the host cell cycle
Ascel Samba-Louaka, Frédéric Taieb, Jean-Philippe Nougayrède et Eric Oswald.
Future Microbiology (2009), Vol 4 (7), 867-877.
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2ème partie : Résultats
57
I- Objectifs de thèse
A mon arrivée au laboratoire, les effets cytopathiques (cytosquelette et cycle cellulaire)
induits par Cif avaient été décrits. Au niveau du cycle cellulaire, il fut établi que
l’accumulation des cellules en phase G2 induite par Cif est associée à l’accumulation de la
forme inactive de CDK1. Toutefois, la voie de signalisation cellulaire induite par Cif pour
activer le point de contrôle en G2/M restait inconnue. Là résidait l’objet de mon projet qui
consistait à mettre en lumière la voie de signalisation eucaryote piratée par Cif.
Dans cette partie « Résultats », je dévoilerai les deux grands axes du travail que j’ai réalisé.
Premièrement, j’ai étudié deux voies de signalisation cellulaire pouvant conduire à
l’inhibition de l’activité de CDK1 à savoir la présence de dommages à l’ADN (article 1) ou la
participation des CKIs (article 2). La présence de lésions sur l’ADN et l’activation de cette
voie ont été explorées car ce type de dommage induit une cascade de signalisation qui
aboutirait à l’arrêt en phase G2 (Sancar et al., 2004). Une fois cette hypothèse écartée,
pourquoi s’intéresser aux CKIs alors que la protéine CDK1 est maintenue inactive par une
phosphorylation inhibitrice ? Pour deux raisons principales : tout d’abord parce que pour être
totalement active, la kinase CDK1 active une boucle d’autoamplification se traduisant par des
rétrocontrôles positifs et négatifs envers respectivement ses activateurs (les phosphatases
Cdc25s) et ses inhibiteurs (les kinase Myt1 et Wee1) (Lindqvist et al., 2009). En se fixant aux
CDKs et en inhibant leur activité, les CKIs pourraient empêcher la mise en place de ces
boucles de rétrocontrôle et donc expliquer le maintien de la forme phosphorylée et inactive de
CDK1 en présence de Cif. La deuxième raison résulte de la constatation que Cif inhibe non
seulement la transition G2/M mais aussi la transition G1/S. Le contrôle de ces deux transitions
fait intervenir des protéines communes parmi lesquelles les CKIs. Le second axe de mon
travail a consisté à caractériser un nouvel effet de Cif sur les cellules eucaryotes qu’est
l’apoptose (article 3). A travers ces trois articles, nous verrons que Cif met en lumière un
nouveau mécanisme de contrôle du cycle cellulaire eucaryote par les bactéries. Il nous
apparaîtra également que l’effet cyclomoduline de Cif ne pourrait être qu’une étape
intermédiaire dans l’établissement de l’apoptose.
58
II- Article 1 :
Escherichia coli cyclomodulin Cif induces G2 arrest of the host cell cycle without
activation of the DNA-damage checkpoint-signaling pathway.
Frédéric Taieb, Jean-Philippe Nougayrède, Claude Watrin, Ascel Samba-Louaka et Eric
Oswald.
Cellular Microbiology (2006), Vol 8 (12), p1910 – 1921.
Dans cet article, nous avons étudié la voie de signalisation cellulaire activée suite à des
dommages sur l’ADN en présence de Cif. En effet, dans de nombreuses situations,
l’activation du point de contrôle en G2/M fait suite à ce type de dommages. Comme la
protéine Cif, la cyclomoduline CDT provoque un arrêt du cycle cellulaire en G2/M ainsi
qu’une apparition de fibres de stress. Or CDT possède une activité DNase et induit des
cassures double-brins de l’ADN eucaryote (Frisan et al., 2003). Cette similitude dans les
effets entre Cif et CDT nous a conduits à explorer la possibilité que Cif provoque des
dommages au niveau de l’ADN des cellules infectées.
Tout d’abord, nous avons montré que la protéine Cif était présente et fonctionnelle dans des
souches d’EPEC d’origine humaine et animale, B171 et E22 respectivement. Nous avons
également prouvé que Cif est nécessaire mais aussi suffisant pour induire les effets
cytopathiques sur la cellule eucaryote.
Pour étudier les effets des cyclomodulines sur les cellules eucaryotes, nous avons développé
une technique de microbiologie cellulaire qui est utilisée dans les 3 articles présentés.
Brièvement, les cellules eucaryotes sont co-cultivées en présence de la souche bactérienne
d’intérêt pendant 2 heures. La bactérie est alors éliminée par lavages et les cellules sont
incubées en présence d’une haute concentration d’antibiotique jusqu’à l’analyse. Cette
technique nous permet d’observer des effets tardifs jusqu’à 72h après infection alors que les
analyses « classiques » développées par d’autres laboratoires se limitent généralement à des
effets immédiats (quelques heures après infection).
Les cellules HeLa sont le modèle cellulaire utilisé au laboratoire pour étudier les effets de
Cif. Cependant, les entérocytes sont la cible physiologique des EPEC. Nous avons donc
vérifié l’effet de Cif sur une lignée cellulaire humaine provenant d’un carcinome du colon
(Caco-2) ainsi que sur des cellules non-transformées de rat venant de l’intestin grêle (IEC-6).
59
Dans les deux cas, nous obtenons un arrêt du cycle cellulaire et une accumulation de phospho-
CDK1. Toutefois, contrairement aux cellules HeLa, aucune modification du cytosquelette
n’est observée sur les cellules Caco-2 et IEC-6. Ces résultats confirment que l’arrêt du cycle
cellulaire ne résulte pas de l’activation des fibres de stress et des plaques d’adhésion focale.
Contrairement à CDT, Cif ne provoque pas de dommages au niveau de l’ADN eucaryote. En
effet, nous n’observons aucune activation (phosphorylation) de l’histone H2AX, témoin des
cassures double-brins de l’ADN (Rogakou et al., 1998). De même, les protéines « senseurs »
ATM et ATR (ATM and Rad3 related) qui détectent les dommages et activent les voies de
signalisations en aval, ne sont pas activées par Cif.
Les bactéries, par l’intermédiaire de leurs cyclomodulines, ont formidablement appris à
détourner les voies de signalisation de la cellule à leur profit. Pour activer le point de contrôle
en G2/M, Cif pouvait détourner un des composants de la signalisation en aval des protéines
ATM et ATR sans pour autant interférer avec l’ADN. Nous avons vérifié cette hypothèse et
aucune molécule de la voie de signalisation faisant suite à des dommages à l’ADN ne semble
être piratée. En effet, l’utilisation de la caféine et de UCN-01, respectivement inhibiteurs
pharmacologiques des kinases ATM/ATR et des protéines Chks, ne restaure pas l’entrée en
mitose. De plus, les protéines Chks ne sont pas activées et le niveau ainsi que la localisation
des phosphatases Cdc25s ne sont pas modifiés en présence de Cif. La phosphorylation
inhibitrice de CDK1 se maintient y compris en présence des Cdc25s nucléaires.
Si l’infection des cellules eucaryotes avec une EPEC qui exprime Cif n’active pas la voie de
réponse aux dommages à l’ADN, elle ne la bloque pas non plus. En effet, nous avons montré
que le traitement par la toxine CDT des cellules infectées avec une EPEC qui exprime Cif
active la voie de réponse aux dommages à l’ADN.
Cif met donc en jeu un mécanisme original qui empêche l’activation de CDK1 sans passer par
la voie de réponse aux dommages à l’ADN.
Cellular Microbiology (2006)
8
(12), 1910–1921 doi:10.1111/j.1462-5822.2006.00757.xFirst published online 11 July 2006
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing LtdNo claim to original French government works
Blackwell Publishing Ltd
Oxford, UK
CMICellular Microbiology1462-5814Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd; No claim to original French government works
???2006
8
1219101921
Original Article
Bacterial effector Cif
interferes with the host cell cycleF. Taieb et al.
Received 3 January, 2006; revised 25 May, 2006; accepted 29 May,2006. *For correspondence. E-mail [email protected]; Tel. (
+
33)5 61 19 32 86; Fax (
+
33) 5 61 19 39 75.
Escherichia coli
cyclomodulin Cif induces G
2
arrest of the host cell cycle without activation of the DNA-damage checkpoint-signalling pathway
Frédéric Taieb,* Jean-Philippe Nougayrède, Claude Watrin, Ascel Samba-Louaka and Eric Oswald
UMR 1225, IHAP, INRA-ENVT, 23 Chemin des Capelles, BP 87614, 31000 Toulouse, France.
Summary
The cycle inhibiting factor (Cif) belongs to a family ofbacterial toxins and effector proteins, the cyclomod-ulins, that deregulate the host cell cycle. Uponinjection into HeLa cells by the enteropathogenic
Escherichia coli
(EPEC) type III secretion system, Cifinduces a cytopathic effect characterized by therecruitment of focal adhesion plates and the forma-tion of stress fibres, an irreversible cell cycle arrestat the G
2
/M transition, and sustained inhibitory phos-phorylation of mitosis inducer, CDK1. Here, we reportthat the reference typical EPEC strain B171 producesa functional Cif and that lipid-mediated delivery ofpurified Cif into HeLa cells induces cell cycle arrestand actin stress fibres, implying that Cif is necessaryand sufficient for these effects. EPEC infection ofintestinal epithelial cells (Caco-2, IEC-6) also inducescell cycle arrest and CDK1 inhibition. The effect of Cifis strikingly similar to that of cytolethal distendingtoxin (CDT), which inhibits the G
2
/M transition byactivating the DNA-damage checkpoint pathway.However, in contrast to CDT, Cif does not cause phos-phorylation of histone H2AX, which is associated withDNA double-stranded breaks. Following EPEC infec-tion, the checkpoint effectors ATM/ATR, Chk1 andChk2 are not activated, the levels of the CDK-activat-ing phosphatases Cdc25B and Cdc25C are notaffected, and Cdc25C is not sequestered in host cellcytoplasm. Hence, Cif activates a DNA damage-inde-pendent signalling pathway that leads to inhibition ofthe G
2
/M transition.
Introduction
Pathogenic bacteria produce toxins and effectors that
affect host cell functions for their own benefit. These vir-ulence factors usually aim at key cellular processes andaccumulating evidence indicates that host cell multiplica-tion is one of the targets of the survival schemes of micro-bial pathogens. Therefore, a new classification of bacterialeffectors, based on their ability to modulate the hostcell cycle, has emerged under the term cyclomodulin(Nougayrede
et al
., 2005; Oswald
et al
., 2005).One archetypical cyclomodulin is the cytolethal distend-
ing toxin (CDT). This tripartite holotoxin induces cell dis-tension, arrest of proliferation and eventually cell death inepithelial cell lines (Johnson and Lior, 1988a,b). Numer-ous studies have revealed the mode of action of CDT (DeRycke and Oswald, 2001; Lara-Tejero and Galan, 2002;Ohara
et al
., 2004). Translocation of the CdtB catalyticsubunit into the host cell relies on the CdtA and C sub-units. Once in the cytoplasm, CdtB reaches the nucleusand inflicts DNA damage. CdtB is structurally similar toDNaseI, and its activity depends on the presence of aphosphodiesterase consensus sequence. DNA damagetriggers the activation of a stress-signalling pathway, theG
2
/M checkpoint, and activates the proximal checkpointsignalling protein, the kinase Ataxia telangiectasiamutated (ATM). This phosphoinositide-3-kinase-relatedkinase (PIKK) phosphorylates and activates the check-point kinase Chk2, which, in turn, phosphorylates thephosphatase Cdc25C. Phosphorylated Cdc25C binds to14-3-3 protein, preventing the phosphatase from activat-ing the eukaryotic inducer of mitosis, the CDK1–cyclin Bcomplex. In CDT-treated cells, CDK1 is maintained in itsinactive phosphorylated form and the cells are preventedfrom entering into M phase, and thus accumulate in G
2
.We have recently identified another cyclomodulin,
called ‘cycle inhibiting factor’ (Cif), that is produced bycertain enteropathogenic
Escherichia coli
(EPEC) strains(Nougayrede
et al
., 1999; 2001; Marches
et al
., 2003).EPEC is the causative agent of infectious diarrhoea inanimals and humans, and constitutes an important healththreat for the paediatric population in developing countries(Nataro and Kaper, 1998). The
cif
gene is located on aprophage integrated in the bacterial chromosome(Marches
et al
., 2003). Cif belongs to a repertoire of effec-tor proteins that use the type III secretion system (T3SS)encoded by the locus of enterocyte effacement for deliveryinto host cells (Charpentier and Oswald, 2004; Dean
Bacterial effector Cif interferes with the host cell cycle
1911
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd,
Cellular Microbiology
,
8
, 1910–1921No claim to original French government works
et al
., 2005). Infection of HeLa cells with the Cif-producingrabbit EPEC strain E22 triggers a specific cytopathic effect(CPE). This CPE is characterized by the progressive for-mation of actin stress fibres through the recruitment offocal adhesions and by the inhibition of the G
2
/M transi-tion, resulting in the accumulation of cells with 4N DNAcontent. Seventy-two hours after infection, rereplicationoccurs, leading to a subpopulation with 8N DNA content.As is the case for CDT, Cif-induced cytostatic activityresults from inhibitory phosphorylation of CDK1(Comayras
et al
., 1997; Nougayrede
et al
., 1999; 2001;Marches
et al
., 2003). The cell cycle inhibition induced byCif is not a consequence of cytoskeleton alterations,because inhibition of the formation of stress fibres by Rhoinhibitors does not prevent accumulation of G
2
-arrestedcells (Nougayrede
et al
., 2001).In contrast to CDT, the Cif pathway leading to cell cycle
inhibition remains to be elucidated. In the present study,we first show that a reference human EPEC strain pro-duces a functional Cif protein, and that Cif is sufficient toinduce the CPE. We also show that the cytostatic activityis independent of cell type, as transformed (HeLa, Caco-2) and untransformed (IEC-6) cells exhibited inhibition ofthe G
2
/M transition. We demonstrate that Cif is not agenotoxic effector nor does it activate transducers of theDNA-damage checkpoint, suggesting that Cif activates aunique PIKK-independent pathway leading to inactivationof CDK1 and inhibition of the G
2
/M transition.
Results
Both reference animal and human EPEC strains express a functional Cif protein
Cif was originally cloned from the rabbit EPEC strain E22(Marches
et al
., 2003). The prototype human typicalEPEC strain B171-8 induced severe diarrhoea in a humanvolunteer study (Bieber
et al
., 1998), and polymerasechain reaction (PCR) screening revealed that this strain ispositive for the presence of
cif
(data not shown). Sequenc-ing showed that E22 and B171-8
cif
open reading frames(ORFs) are identical except for a single nucleotide result-ing in an amino acid substitution (P8L). B171-8 infectioninduced a phenotype similar to that induced by E22: B171-8-infected HeLa cells exhibited a progressive enlargementand actin stress fibre formation, and accumulated with 4NDNA content. Seventy-two hours after infection with eitherE22 or B171-8, a fraction of the cells was able to reinitiateDNA synthesis without division, leading to a subpopula-tion with 8N DNA content (Fig. 1A). Stress fibre formationand cell cycle inhibition were abrogated following infectionwith
cif
-deleted mutants of E22 or B171-8. Complemen-tation of both
cif
mutants with a plasmid encoding eitherCif counterpart restored the CPE effect (Fig. 1A and data
not shown). To examine the cell cycle distribution ofinfected cells, the mitosis inducer, the CDK1–cyclin Bcomplex, was analysed by Western blotting with antibod-ies directed against phospho-CDK1 (Y15), the inactiveform of CDK1. CDK1 was strongly phosphorylated 16 hafter infection with E22 or B171-8, but not with the B171-8
cif
mutant (Fig. 1B), showing that cells with 4N DNAcontent resulted from inhibition of the G
2
/M transition. Weconclude that typical human EPEC strain B171-8expresses a functional Cif protein and induces stress fibreformation and G
2
arrest.
Cif is sufficient to induce stress fibres and G
2
arrest
We previously demonstrated that the
cif
gene and T3SSare necessary for stress fibre formation and G
2
arrest(Marches
et al
., 2003). However, there was no definitivedemonstration whether Cif alone is sufficient to inducethese effects. To investigate this possibility, we examinedthe effect of purified Cif. As expected for a T3SS-depen-dent effector, addition of purified Cif to the culture mediumdid not modify the cell cycle distribution or induce actinstress fibres (Fig. 2). To bypass the T3SS requirement,we used a lipid-based protein delivery system (Zelphati
et al
., 2001) (BioPORTER
®
, Gene Therapy Systems).Purified Cif or PBS were mixed with BioPORTER(BioPORTER
+
Cif and BioPORTER
+
PBS, respectively)and applied to HeLa cells. BioPORTER
+
PBS did notaffect the morphology or cell cycle distribution. In contrast,BioPORTER
+
Cif resulted in dramatic enlargement of thecells and formation of actin stress fibres (Fig. 2). Thiseffect was accompanied by a significant increase in thepopulation of cells with 4N DNA content (G
2
-arrested).However, this increase was not as great as that inducedby Cif producing (Cif
+
) EPEC infection (44% withBioPORTER
+
Cif and 71% following EPEC infection)(Fig. 2). Consistent with this result, microscopic examina-tion of BioPORTER
+
Cif-treated cells showed that about35–50% of the cells did not exhibit morphological alter-ations and that some cells were still dividing (not shown).Control experiments with fluorescein-labelled IgG showedan efficiency of about 50% for BioPORTER delivery.Therefore, the lower percentage seen with BioPORTER
+
Cif as compared with Cif
+
EPEC infection is very likelydue to the limited efficiency of delivery. We conclude thatCif does not rely on EPEC cofactors (except T3SS) for itsactivity and that, once in the host cell, Cif is sufficient toinduce stress fibre formation and G
2
arrest.
Cell cycle arrest of intestinal epithelial cells following Cif
+
EPEC infection
Because,
in vivo,
EPEC aim primarily at gut enterocytes,we examined the response of intestinal cell lines to Cif
+
1912
F. Taieb
et al.
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd,
Cellular Microbiology
,
8
, 1910–1921No claim to original French government works
Fig. 1.
Cif produced by typical EPEC strain B171-8 induces stress fibre formation, cell cycle arrest and inhibitory phosphorylation of CDK1 in HeLa cells.A. Cells were exposed 2 h to wild-type rabbit EPEC strain E22, human typical EPEC strain B171-8, or
cif
mutant (B171
Δ
cif
), and further incubated for 72 h. Upper panels: F-actin was labelled with phalloidin-rhodamine (red) and DNA with DAPI (blue). Bars represent 20
μ
m. Lower panels: Cell cycle distribution was analysed by flow cytometry.B. G
1
/S synchronized HeLa cells were infected as in A and further incubated for 16 h. Total proteins were probed with anti-pCDK1 (pY15) and anti-actin antibodies.
Fig. 2.
The purified Cif protein, in combination with a lipid delivery agent, is sufficient to reproduce the cytopathic effect triggered by Cif
+
EPEC infection. HeLa cells were exposed 4 h to purified Cif alone (2.5
μ
g ml
−
1
), PBS mixed with lipid delivery agent BioPORTER (BioPORTER
+
PBS), purified Cif (2.5
μ
g ml
−
1
final) mixed with BioPORTER (BioPORTER
+
Cif) or infected with Cif
+
EPEC. Upper panels: F-actin was labelled with phalloidin-rhodamine (red) and DNA was stained with DAPI (blue). Bars represent 20
μ
m. Lower panels: Cell cycle distribution was analysed by flow cytometry. Percentages of 2N and 4N populations are indicated.
Bacterial effector Cif interferes with the host cell cycle
1913
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd,
Cellular Microbiology
,
8
, 1910–1921No claim to original French government works
EPEC infection. Human colon carcinoma cells (Caco-2)and untransformed cells from rat small intestine (IEC-6)were treated with purified CDT or infected with a
cif
mutantor Cif
+
EPEC. Microscopic examination of these cells 72 hafter infection with Cif
+
EPEC did not reveal formation ofstress fibres comparable to that observed in infected HeLacells (not shown), however, we did not observe any divid-ing cells. This difference in the response to EPEC infectionbetween intestinal (Caco-2 and IEC-6) and HeLa cellsconfirms the previous demonstration that cytoskeletonalteration and cytostatic activity are uncoupled (Nou-gayrede
et al
., 2001). Cell cycle analysis showed that bothIEC-6 and Caco-2 cells accumulated with 4N DNA contentfollowing Cif
+
EPEC infection or CDT treatment, whereascells infected with the
cif
mutant strain had a cell cycledistribution similar to that of uninfected cells (Fig. 3A anddata not shown). To investigate whether the cell cycle wasblocked in G2, we analysed the phosphorylation status ofCDK1 in the presence of nocodazole, which arrests cellsin late mitosis. As expected, untreated cells exhibited ahigh level of phosphorylated CDK1 (first lanes, Fig. 3B),whereas in the presence of nocodazole, uninfected and
cif
mutant infected cells entered into and accumulated inM phase, and exhibited the activated/dephosphorylatedform of CDK1. In contrast, CDT-treated and Cif
+
EPEC-induced cell cycle arrests correlated with high levels ofCDK1 Y15 phosphorylation, indicating that these cells
were prevented from entering into mitosis and thus wereblocked in G
2
(Fig. 3B). We conclude that in intestinal hostcells Cif induces inhibition of the G
2
/M transition as it doesin HeLa cells.
Cif does not induce DNA double-strand breaks
Both Cif and CDT induce inhibitory phosphorylation ofCDK1, resulting in inhibition of entry into mitosis and accu-mulation of cells in G
2
. Therefore, it is tempting to hypoth-esize that Cif hijacks a cellular regulatory pathway and,as does CDT, activates the DNA-damage checkpoint toinduce cell cycle arrest at G
2
(Sert
et al
., 1999; Cortes-Bratti
et al
., 2001; Hassane
et al
., 2001; Li
et al
., 2002;Frisan
et al
., 2003). To test whether Cif causes DNA dam-age, we monitored the phosphorylation of histone H2AX(
γ
-H2AX), a sensitive marker of DNA double-strandbreaks (DSBs) (Rogakou
et al
., 1998). HeLa cells wereinfected with Cif
+
EPEC, or as controls, cells were treatedwith purified CDT to induce DNA DSBs or treated withinactive CDT mutated on the critical phosphodiesterasemotif (CDTm). Phosphorylated H2AX was visualized 24 hfollowing infection/treatment by indirect immunofluores-cence using antibodies against
γ
-H2AX. Consistent withthe described mode of action of CDT (Elwell and Dreyfus,2000; Lara-Tejero and Galan, 2000; Frisan
et al
., 2003),a strong nuclear signal was detected in CDT-treated cells,
Fig. 3.
Cif
+
EPEC induces cell cycle arrest at the G
2
/M transition in intestinal cell lines.A. Colon cancer Caco-2 cells (upper panels) and untransformed intestinal IEC-6 cells (lower panels) were exposed 2 h to
cif
mutant EPEC (EPEC
Δ
cif
), Cif
+
EPEC or treated with CDT and further incubated for 24 h. Cell cycle distri-bution was analysed by flow cytometry.B. Cells were left untreated (mock) or treated as in A and incubated 16 h with nocodazole as indicated. Total proteins were probed with anti-pCDK1 (pY15) and anti-actin antibodies.
1914
F. Taieb
et al.
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd,
Cellular Microbiology
,
8
, 1910–1921No claim to original French government works
indicating occurrence of DSBs, whereas CDTm did notinduce a specific nuclear signal (Fig. 4A). Cif
+
EPEC-infected cells exhibited a background fluorescence thatwas not confined to nuclei, indicating that Cif does notinduce H2AX phosphorylation (Fig. 4A). The level of
γ
-H2AX was also monitored by western-blotting analysis ofnuclear extracts 8 and 16 h following infection/treatment.Positive signals were detected in cells treated with CDTor with etoposide (an inhibitor of topoisomerase), both ofwhich induce DSBs (Fig. 4B). Because phosphorylationof H2AX might result from apoptosis, the level of cleavedcaspase-3, a form observed following staurosporine-induced apoptosis (Fig. 4B, last lane) was also monitored(King
et al., 1998). The absence of a cleaved caspase-3signal associated with any treatment except staurospo-rine, demonstrates that treated/infected cells did notundergo significant apoptosis and therefore that the γ-H2AX signal resulted specifically from DNA injury. In con-trast to etoposide and CDT treatments, EPEC strains didnot induce the phosphorylation of H2AX at 8 and 16 hfollowing infection (Fig. 4B). Furthermore, no γ-H2AX sig-nal could be detected at 4 h or up to 3 days after infection(not shown). These results clearly indicate that the cellcycle arrest induced by Cif+ strains does not originatefrom DSBs.
Cif-induced cytostatic activity occurs through an ATM/ATR-independent pathway
We next investigated whether Cif could activate theupstream effectors of the G2 checkpoint, the kinases ATMand ATR, which control the signalling cascade resulting incell cycle arrest (reviewed in (McGowan and Russell,2004)). We first studied the activation of ATM by monitor-ing its autophosphorylation on S1981 using antibodiesagainst phospho-ATM (pATM) (Bakkenist and Kastan,2003). Cells were infected as before with Cif+ or cif mutantEPEC or treated with CDT, CDTm, etoposide or stauro-sporine as controls. ATM phosphorylation occurred inCDT-, etoposide- and staurosporine-treated cells, corre-lating with positive signals for γ-H2AX (Fig. 4B). In con-trast, no activation of ATM could be detected followinginfection with EPEC (Fig. 4B). To confirm this result andto test the possibility that the effects of Cif might resultfrom activation of ATR, we next used caffeine, an ATM/ATR inhibitor (Sarkaria et al., 1999; Zhou et al., 2000). Toexamine the ability of caffeine to alleviate the G2 blockinduced by CDT, etoposide and Cif, HeLa cells weresynchronized in G1/S, infected/treated as before, then caf-feine was added. Twenty-four hours following treatment,mitotic cells were detected by flow cytometry using amonoclonal antibody directed against mitotic phosphop-roteins (MPM-2) to discriminate mitotic from G2 cells in the4N population (Landberg and Roos, 1992; Sert et al.,
1999). The subset of cells in M phase (4N, MPM-2-positive) appears in the upper right quadrant in Fig. 4C.The percentage of mitotic cells from three independentexperiments is summarized in Fig. 4D. As previouslyreported (Sert et al., 1999), caffeine partially reversed theblock observed with CDT and etoposide, resulting in pro-gression of the cells into mitosis (1.6–11.3% with caffeineand 2.1–7.7% with caffeine respectively). Although Cif+EPEC-infected cells accumulated with 4N DNA content,caffeine treatment did not induce M-phase entry, becausethe MPM-2-positive cell population did not increase sig-nificantly (1.3% to 1.7% with caffeine). Cells were furtherexamined with a marker of cell division (CellTrace CFSE),and flow cytometry analysis confirmed that no cell divisionoccurred in Cif+ EPEC-infected, caffeine-treated cells(data not shown). Taken together, these results demon-strate that inhibition of ATM/ATR does not affect Cif-induced G2 arrest. We conclude that the Cif signallingpathway is ATM/ATR-independent.
EPEC infection does not inhibit DNA damage or checkpoint signalling pathway
Because DNA damage or proximal G2/M-checkpoint acti-vation was not observed following EPEC infection, onecould hypothesize that bacterial adherence, injection ofT3SS-dependent effectors or Cif itself might mask DNAdamage or interfere with the checkpoint signalling path-way. To test these hypotheses, we first constructed arecombinant CdtB subunit to be delivered into host cellsby the EPEC T3SS. The Cif N-terminal sequence signalfor its translocation by the T3SS (amino acids 1–20) wasfused to the sequence of mature CdtB or CdtBm (aminoacids 18–273) (Charpentier and Oswald, 2004). The cifmutant EPEC strains hosting vectors encoding Cif (pEL3),CdtB or CdtBm fused to the N-terminal part of Cif (pNCif-CdtB and pNCif-CdtBm, respectively) were used to infectHeLa cells. CDT and etoposide treatments were used aspositive controls for DNA damage and activation of the G2/M checkpoint. Sixteen hours after infection with the cifmutant EPEC strain containing pNCif-CdtB plasmid,Western blot analysis showed that ATM and H2AX werephosphorylated (Fig. 5A). In contrast, neither strain con-taining pEL3 nor control pNCif-CdtBm induced H2AXphosphorylation or activation of ATM (Fig. 5A). BothpNCif-CdtB and pEL3-transformed cif mutants inducedcell enlargement and inhibited mitosis (Fig. 5B and notshown). The ability of the T3SS-injected CdtB subunit toreproduce cellular checkpoint responses, as does purifiedCDT, indicates that EPEC infection does not interfere withthe DNA-damage response pathway. Therefore, theabsence of Cif-induced DNA damage and the proximalcheckpoint response can not be attributed to EPEC infec-tion or to T3SS effectors. In addition, we also checked
Bacterial effector Cif interferes with the host cell cycle 1915
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1910–1921No claim to original French government works
Fig. 4. Cif does not induce detectable DNA damage and does not induce activation of the kinases ATM/ATR.A. HeLa cells were exposed to mutated CDT (CDTm), CDT or infected 2 h with EPEC, incubated for 16 h then stained with DAPI (blue, upper panels) or with anti-γ-H2AX followed by FITC-conjugated secondary antibodies (green, lower panels). Bars represent 20 μm.B. HeLa cells were exposed to CDT, CDTm, etoposide (etopo) staurosporine (stauro) or infected 2 h with EPEC or cif mutant (EPECΔcif) and collected 8 and 16 h later. Nuclear proteins (γ-H2AX) or total proteins (pATM, cleaved caspase-3, actin) were probed with the indicated antibodies.C. G1/S synchronized HeLa cells were exposed to CDT, left untreated (mock) or infected 2 h with Cif+ EPEC then treated or not with the ATM/ATR inhibitor caffeine. After 24 h incubation, cells were harvested and subjected to flow cytometry bivariate analysis for DNA content and MPM2 staining. Mitotic cells are quantified in the upper right quadrant.D. Quantification of mitotic cells (4N and MPM-2-positive) as described above from three independent experiments in HeLa cells treated with CDT, etoposide or infected with Cif+ EPEC or cif mutant (EPECΔcif) and incubated with (shaded boxes) or without (white boxes) caffeine.
1916 F. Taieb et al.
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1910–1921No claim to original French government works
whether Cif itself could inhibit the DNA-damage response.Cells were infected with Cif+ EPEC and further incubatedwith purified CDT. Cells were harvested 24 h followingtreatment and analysed for activation of ATM (Fig. 5C).Because ATM was activated in both control and EPEC-infected cells in the presence of CDT, this result demon-strates that Cif does not alter the proximal checkpointsignal induced by CDT.
Checkpoint protein kinases are not involved in the Cif-induced cell cycle arrest
We next investigated whether Cif could activate the down-stream effectors of the G2 checkpoint, the protein kinasesChk1 and Chk2 (Zhou and Elledge, 2000; McGowan andRussell, 2004). Because the activation of Chk1/2 involvesphosphorylation of several serine or threonine residues(Kastan and Lim, 2000; Traven and Heierhorst, 2005), wefirst investigated the phosphorylation status of Chk pro-teins following Cif+ EPEC infection or CDT treatment.Both Chk1 and Chk2 were phosphorylated in response toCDT treatment but not following Cif+ EPEC infection(Fig. 6A). In order to confirm that the Cif-induced inhibitionof the cell cycle does not rely on Chk activation, we treatedCif- or CDT-arrested cells with UCN-01, a pharmacologi-cal inhibitor of Chk1/2 (Graves et al., 2000; Yu et al.,2002). Inhibition of both kinases with UCN-01 abolishedthe CDT-induced G2/M arrest, because a significant num-ber of drug-treated cells re-entered M phase (Fig. 6B). Incontrast, cells arrested with 4N DNA content followinginfection with Cif+ EPEC did not enter mitosis upon UCN-01 addition because the MPM-2-positive cell populationdid not increase significantly, indicating that the G2 blockwas not alleviated in the absence of Chk1/2 activities(Fig. 6B). These results indicate that Chk1/2 are not impli-cated in the inhibition of the G2/M transition by Cif.
Cif-induced CDK1 inhibition is independent of the level and subcellular localization of Cdc25
Because CDK1 inhibitory Y15 phosphorylation is impli-cated in the G2/M arrest induced by Cif (Figs 1B and 3B),we next tested whether the CDK1-activating phos-phatases Cdc25B and C are altered in Cif-arrested cells(Donzelli and Draetta, 2003). We first conducted a West-ern blot analysis to determine the levels of Cdc25B andC. The levels of both phosphatases were unaffected fol-lowing EPEC infection or CDT treatment (Fig. 7A). Wenext monitored the subcellular localization of Cdc25C.Consistent with previous results (Alby et al., 2001), treat-ment of cells with CDT induced sequestration of Cdc25Cin the cytoplasm, preventing dephosphorylation/activationof nuclear CDK1 and entry into mitosis. In contrast, in cellsinfected with Cif+ EPEC Cdc25C was localized in bothcytoplasmic and nuclear compartments (Fig. 7B). Theseobservations suggest that, in contrast to CDT, Cif-inducedinhibitory phosphorylation of CDK1 does not result fromcytoplasmic retention of Cdc25C or from degradation ofCdc25B and C.
Discussion
Cif, expressed by both rabbit EPEC strain E22 and humantypical EPEC strain B171-8, belongs to the family ofcyclomodulins that modulate host cellular proliferation(Marches et al., 2003; Nougayrede et al., 2005). Inhibitorycyclomodulins slow or stop cell division and accumulatingevidence suggests that they subvert host checkpoint path-ways that are activated at G1/S, S, G2/M or metaphase/anaphase transitions in response to stress or injury thatendangers cell integrity (Zhou and Elledge, 2000; Nou-gayrede et al., 2005; Oswald et al., 2005). The inhibitorycyclomodulin CDT induces DSBs and activates the
Fig. 5. EPEC infection does not prevent DNA damage and signalling induced by T3SS-injected CdtB or purified CDT.A. HeLa cells were infected 2 h with EPEC cif mutant (EPECΔcif) transformed or not (–) with plasmids encoding Cif (pEL3), recombinant CdtB (pNCif-CdtB) or recombinant inactive CdtBm (pNCif-CdtBm). Control cells were treated with CDT or etoposide (etopo). Sixteen hours later, nuclear proteins (γ-H2AX) or total proteins (pATM, actin) were probed with the indicated antibodies.B. HeLa cells were infected 2 h with cif mutant EPEC transformed or not with plasmids encod-ing Cif (pEL3) or recombinant CdtB (pNCif-CdtB), incubated for 72 h then stained with Giemsa. Bars represent 20 μm.C. Cells were left uninfected (mock), infected 2 h with Cif+ EPEC or cif mutant and treated for 2 h (+) or not (–) with purified CDT. After 24 h incubation, total proteins were probed with anti-pATM antibodies.
Bacterial effector Cif interferes with the host cell cycle 1917
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1910–1921No claim to original French government works
Fig. 6. The effect of Cif is independent of the Chk1/2 pathway.A. G1/S synchronized HeLa cells were left untreated (mock), infected 2 h with Cif+ EPEC or cif mutant or treated with CDT and collected 24 h later. Total proteins were probed with the indicated antibodies.B. Cells were treated as in A and incubated or not for 8 h with the Chk1/2 inhibitor UCN-01 before harvesting. Cells were subjected to flow cytometry bivariate analysis for DNA content and MPM2 staining. Percentages of mitotic cells (upper right quadrant) are indicated.
Fig. 7. Cif does not alter Cdc25B/C levels and does not inhibit Cdc25C nuclear translocation.A. G1/S synchronized HeLa cells were left untreated (mock), infected 2 h with Cif+ EPEC or cif mutant, or treated with CDT and collected 24 h later. Total proteins were probed with the indicated antibodies.B. Cells were treated as in A, incubated 26 h, then Cdc25C subcel-lular localization was visualized by indirect immunofluorescence and confocal microscopy. Bars represent 50 μm.
1918 F. Taieb et al.
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1910–1921No claim to original French government works
DNA-damage checkpoint, an essential process thatensures the survival of organisms that depend on theaccurate transmission of genetic information from one cellto its daughter cells. This cascade stops the cell cycle atthe G2/M transition (reviewed in (De Rycke and Oswald,2001; Lara-Tejero and Galan, 2002; Ohara et al., 2004)).As with CDT, Cif leads to the accumulation of G2-arrestedcells and maintains CDK1 in its inactive form. In addition,both Cif and CDT induce Rho-mediated polymerization ofactin stress fibres in HeLa cells (Nougayrede et al., 2001;Frisan et al., 2003; Marches et al., 2003). Both CdtB andCif need to reach the host cytoplasm to induce theseeffects (Lee et al., 2003; Charpentier and Oswald, 2004;Guerra et al., 2005). In the present work, we show that,once injected into the host cytoplasm by the T3SS, as forCif, recombinant CdtB activates the checkpoint signallingcascade that leads to G2 arrest. These common featuresbetween the two cyclomodulins are provocative and sug-gest that Cif, like CDT, could activate the DNA-damagecheckpoint. Therefore, we investigated effect of Cif on theDNA-damage checkpoint pathway, using CDT as a posi-tive control. Analysis of the localization and the level of γ-H2AX indicated that Cif does not induce detectable DSBs(Rogakou et al., 1998; Rothkamm and Lobrich, 2003).Consistent with these results, activation of the upstreamcheckpoint-signalling molecule ATM was triggered byCDT but not following infection with Cif+ EPEC, suggest-ing that Cif does not alter chromatin integrity (McGowanand Russell, 2004). Further evidence that Cif does notdamage DNA is the fact that inhibition of the proximalenzymes implicated in the DNA-damage checkpointresponse, ATM and ATR (Blasina et al., 1999; Sarkariaet al., 1999) did not change the cell cycle distribution ofCif+ EPEC-infected cells. This experiment also showedthat Cif did not activate these transducers in a DNA dam-age-independent manner. This indicates that, in contrastto CDT (this work and (Sert et al., 1999)), ATM/ATR PIKKsare not implicated in the Cif-induced cell cycle arrest.Moreover, infection with Cif+ EPEC did not inhibit theDNA-damage checkpoint induced by CDT treatment, sug-gesting that Cif does not interfere, directly or indirectly,with the activity of PIKK molecules. We next investigatedthe downstream target of PIKKs, the kinases Chk1 and 2.Inactivation of these two kinases did not alleviate Cif-induced inhibition of mitosis. Therefore, Cif induces aunique signalling cascade, independent of the ATM/ATR-Chk1/2 checkpoint pathway, that leads to cell cycle arrest.
Because accumulation of G2 cells correlates with theinactivation of CDK1, we checked the status of the CDK-activating phosphatases Cdc25B and Cdc25C. The levelsof Cdc25B/C and localization of Cdc25C were not affectedby Cif. Interestingly, despite the presence of nuclearCdc25C, Cif+ EPEC-infected cells exhibited a high levelof phosphorylated CDK1. This apparent contradiction
might be explained by the fact that regulation of Cdc25phosphatases occurs at many levels. Indeed, Cdc25Cactivation correlates with its hyperphosphorylation, whichis triggered by its own target, the CDK1–cyclin B complex,in a positive feedback loop, and Cdc25B is also activatedthrough phosphorylation, possibly by Aurora-A (Donzelliand Draetta, 2003; Dutertre et al., 2004; Cazales et al.,2005). Therefore, Cdc25B/C could be inhibited by phos-phorylation/dephosphorylation at multiple critical regula-tory residues in EPEC-infected cells. More generally, anymechanism that interferes with the auto-amplification loopof CDK1 might be also considered. Another plausibleexplanation might be that the Cdc25 phophatases areprevented from physically interacting with and activatingCDK1. Consistent with this hypothesis, association ofCDK1 with p13suc1 beads is modified in Cif+ EPEC-infected cells (Nougayrede et al., 2001), suggesting thataffinity of CDK towards its regulators could be altered.
Cif appears to be a unique example of a G2-checkpointinducer, independent of DNA damage, in metazoan cells.Interestingly, this cytostatic activity appears to be indepen-dent of p53 as, not only transformed HeLa and Caco-2cells, but also untransformed, p53-positive, IEC-6 cells arearrested at the G2/M transition.
Attempts to identify host cellular target(s) of Cif arecurrently underway in our laboratory. Future studies todetermine how Cif hijacks cellular biochemical pathwaysleading to G2 arrest are of general relevance not only forfull understanding of EPEC pathogenesis but also forinsight into the basic biology of the control of the cell cycleand the G2/M checkpoint. Future studies will rely on in vivomodels to achieve full understanding of the roles of cyclo-modulins in microbial pathogenesis, carcinogenesis, com-mensalism and symbiosis.
Experimental procedures
Cell lines, bacterial strains and plasmids
Homo sapiens HeLa (ATCC CCL-2) and Caco-2 (ATCC HTB-37)cells were maintained by serial passage in Dulbecco’s ModifiedEagle medium (DMEM glutamax, Gibco), supplemented with 10–20% foetal calf serum (FCS),-non-essential amino acids (Gibco)and 50 μg ml−1 gentamicin at 37°C in a 5% CO2 atmosphere.Rattus norvegicus small intestine normal epithelial cells IEC-6(ATCC CRL-1592) were grown in the above medium supple-mented with bovine insulin (0.1 units ml−1; Sigma).
Human typical EPEC O111 strain B171-8 was kindly providedby Dr Toru Tobe. Rabbit EPEC strain E22 and the mutantE22cif::frt were previously described (Marches et al., 2003). Themutant strain B171cif::frt was obtained according to the proce-dure described by (Datsenko and Wanner, 2000) using previouslydescribed mutagenic primers (Marches et al., 2003).
Plasmid pEL3 was constructed by cloning the cif gene intopBRSK vector (XbaI–BamHI) under the control of the IPTG-inducible Plac promoter (Marches et al., 2000). Mutated CdtB
Bacterial effector Cif interferes with the host cell cycle 1919
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(CdtBm) was obtained by a site-directed mutation in the CdtBphosphodiesterase motif (H153A). Plasmids pNCif-CdtB andpNCif-CdtBm were constructed by ligating the DNA encodingaminoacids 18–273 of CdtB and CdtBm (mature proteins) intothe NcoI–XbaI digested plasmid pCX351 (Charpentier andOswald, 2004). The resulting constructs encode the first N-terminal 20 aminoacids of Cif fused to mature CdtB or matureCdtBm under the control of IPTG-inducible Ptrc promoter.
Purification of CDT
Cytolethal distending toxin and CDTm were produced from E. coliDH5α hosting recombinant plasmid pGEM-T (Promega) encod-ing the three CDT-I ORFs cdtA, cdtC and wild-type or mutatedcdtB. Bacteria were grown aerobically for 48 h at 37°C in Tryp-case Soy Broth (Biomerieux). The culture supernatants wereprecipitated successively with 50% and 30% ammonium sul-phate, and the precipitated proteins were dissolved and dialysedagainst 0.025 M Tris buffer (pH 8.5). The proteins were furtherpurified by anion exchange (DEAE Trisacryl plus-M; Sigma)followed by hydrophobic (HiTrap Phenyl Sepharose HP;Amersham) column chromatography, using an ÄKTA FPLC(Amersham).
Infections and cell treatments
For infection experiments, bacteria were cultured overnight inLuria–Bertani (LB) broth then subcultured 1:20 in interactionmedium (DMEM with 25 mM Hepes and 5% FCS) for 2 h at 37°C.Mammalian cells were washed in Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS), the cell culture medium was changed to interactionmedium and the cells were infected with a multiplicity of infection(moi) of 50:1. After 2 h of infection, the cells were washed inHBSS then cultivated for the indicated times in complete mediumsupplemented with 200 μg ml−1 of gentamicin. To synchronizecells HeLa in G1/S, the double thymidine block method was usedas described (Sert et al., 1999). When needed, cells were treatedfor 4 h with etoposide (40 μM; Sigma) or staurosporine (0.5 μM;Upstate), or for 16 h with nocodazole (100 nM; Sigma). PurifiedCDT and CDTm were used at 45 ng ml−1. Caffeine (1.5 mM;Sigma) and UCN-01 (100 nM; a kind gift of B. Ducommun) treat-ments were performed immediately following infection or 8 h priorto harvesting the cells respectively.
Purification of Cif and lipid delivery into cultured cells
The cif gene was cloned into the pET28a vector (Novagen) toencode a 6 × His–Cif fusion protein and transformed into E. coliBL21-CodonPlus®(DE3)-RIPL strain (Stratagene). The bacteriawere grown in LB to an OD600 of 0.5 then induced with 0.5 mMIPTG for 3 h at 37°C. Purification of native Cif was achieved byNi-NTA chromatography as described (Qiagen). Following dialy-sis against PBS, 40 μl of purified Cif (250 μg ml−1) was added toone BioPORTER® tube (Gene Therapy System) and resus-pended in 500 μl of DMEM. For controls, PBS was added toBioPORTER, or BioPORTER was omitted. The samples werediluted fourfold in cell culture medium without FCS and incubatedfor 4 h with the cells before addition of FCS (10% final concen-tration). After 24 h, the medium was replaced by fresh completemedium.
Microscopy and cell cycle analysis
For study of morphology and visualization of the cytoskeleton,cells cultured in chamber slides (Labteks, Becton Dickinson)were fixed for 15 min in 4% formaldehyde then stained withGiemsa (Sigma), or permeabilized then incubated withrhodamine-phalloidin (Molecular Probes) to stain F-actin and withDAPI (Sigma) to stain DNA. For immunofluorescent detection ofphosphorylated H2AX, cells were fixed with 95% methanol, 5%acetic acid, blocked in PBS, 0.1% Tween20, 3% BSA and incu-bated with anti-phospho-H2AX antibodies (2 μg ml−1, Upstate)followed by FITC-conjugated secondary antibodies (Zymed).Images were acquired with a Leica DMRB fluorescence micro-scope equipped with a Leica DFC300FX digital camera. Condi-tions for black level and gain were established by using controlcells and the settings were maintained for the other samples.Immunofluorescent vizualization of Cdc25C was performed asdescribed elsewhere (Alby et al., 2001). Single-slice images wereacquired with an Olympus IX70 confocal microscope and Fluo-view FV500 software. The confocal aperture was set for a z-axisthickness of 0.6 μm.
MPM2 staining and cell cycle distribution analysis were per-formed using a FACScalibur flow cytometer as described else-where (Sert et al., 1999).
Western blot analysis
For Western blot analysis of nuclear proteins, 8 × 106 cells werelysed in 10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA,0.1 mM EGTA, protease inhibitor cocktail (Complete, Roche).After 10 min at 0°C IGEPAL (0.5%, Sigma) was added, the sam-ples were vortexed for 10 s then centrifuged for 5 min at 100× g.The pellets were resuspended in 300 μl of 80 mM β-glycerophos-phate pH 6.8, 1 mM DTT, 10 μg ml−1 RNase, 10 units ml−1 DNase(Sigma) and incubated at 37°C for 30 min before addition of 5×Laemli loading buffer and heating for 5 min at 100°C.
For Western blot analysis of total proteins, 4–8 × 105 HeLacells were lysed in 50–100 μl of 1× Laemli loading buffer, soni-cated for 5 s to shear DNA, then boiled for 5 min. Proteins wereseparated on 4–12% or 3–8% NuPage gradient gels (Invitrogen)and transferred to PVDF membranes. The membranes wereblocked in 10 mM Tris pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20(TBST), 10% non-fat dry milk, then probed with primary antibody(1:1000) in TBST, 5% non-fat dry milk. Primary antibodieswere: anti-phospho-H2AX (γ-H2AX) (Upstate), anti-actin (ICN),anti-phospho-CDK1 (pY15, Cell Signalling Technology), anti-phospho-ATM (pS1981, Cell Signalling Technology), anti-Cdc25B (Santa Cruz), anti-Cdc25C (Santa Cruz), anti-phospho-Chk1/2 (sampler kit, Cell Signalling Technology) and anti-cleaved-(activated) caspase-3 (Cell Signalling Technology). Afterwashing, bound antibodies were visualized with the appropriatehorseradish peroxidase-conjugated secondary antibody followedby chemiluminescence. Loading of nuclear proteins was normal-ized by quantification of histone proteins visualized by Coo-massie blue staining of the gel. Loading of total proteins wasnormalized using the actin Western blots.
Acknowledgements
We thank Dr Toru Tobe for providing EPEC strain B171-8, DrBernard Ducommun for helpful discussions and for providing
1920 F. Taieb et al.
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1910–1921No claim to original French government works
UCN-01, Dr Xavier Charpentier for suggestions about the cloningstrategy, Dr Estelle Loukiadis for providing pEL3, and EleanorErikson for a critical reading of the manuscript. This work wassupported by EU Grant QLK2-CT-2002-00944, a grant from laLigue Nationale Contre le Cancer and Grant ANR-05-MIIM-009from the Agence Nationale de la Recherche.
References
Alby, F., Mazars, R., de Rycke, J., Guillou, E., Baldin, V.,Darbon, J.M., and Ducommun, B. (2001) Study of the cyto-lethal distending toxin (CDT)-activated cell cycle check-point. Involvement of the CHK2 kinase. FEBS Lett 491:261–265.
Bakkenist, C.J., and Kastan, M.B. (2003) DNA damage acti-vates ATM through intermolecular autophosphorylationand dimer dissociation. Nature 421: 499–506.
Bieber, D., Ramer, S.W., Wu, C.Y., Murray, W.J., Tobe, T.,Fernandez, R., and Schoolnik, G.K. (1998) Type IV pili,transient bacterial aggregates, and virulence of entero-pathogenic Escherichia coli. Science 280: 2114–2118.
Blasina, A., Price, B.D., Turenne, G.A., and McGowan, C.H.(1999) Caffeine inhibits the checkpoint kinase ATM. CurrBiol 9: 1135–1138.
Cazales, M., Schmitt, E., Montembault, E., Dozier, C., Pri-gent, C., and Ducommun, B. (2005) CDC25B phosphory-lation by Aurora-A occurs at the G2/M transition and isinhibited by DNA damage. Cell Cycle 4: 1233–1238.
Charpentier, X., and Oswald, E. (2004) Identification of thesecretion and translocation domain of the enteropatho-genic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif,using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-basedreporter. J Bacteriol 186: 5486–5495.
Comayras, C., Tasca, C., Peres, S.Y., Ducommun, B.,Oswald, E., and De Rycke, J. (1997) Escherichia coli cyto-lethal distending toxin blocks the HeLa cell cycle at the G2/M transition by preventing cdc2 protein kinase dephospho-rylation and activation. Infect Immun 65: 5088–5095.
Cortes-Bratti, X., Karlsson, C., Lagergard, T., Thelestam, M.,and Frisan, T. (2001) The Haemophilus ducreyi cytolethaldistending toxin induces cell cycle arrest and apoptosis viathe DNA damage checkpoint pathways. J Biol Chem 276:5296–5302.
Datsenko, K.A., and Wanner, B.L. (2000) One-step inactiva-tion of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 usingPCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640–6645.
De Rycke, J., and Oswald, E. (2001) Cytolethal distendingtoxin (CDT): a bacterial weapon to control host cell prolif-eration? FEMS Microbiol Lett 203: 141–148.
Dean, P., Maresca, M., and Kenny, B. (2005) EPEC’s weap-ons of mass subversion. Curr Opin Microbiol 8: 28–34.
Donzelli, M., and Draetta, G.F. (2003) Regulating mammaliancheckpoints through Cdc25 inactivation. EMBO Rep 4:671–677.
Dutertre, S., Cazales, M., Quaranta, M., Froment, C., Trabut,V., Dozier, C., et al. (2004) Phosphorylation of CDC25B byAurora-A at the centrosome contributes to the G2-M tran-sition. J Cell Sci 117: 2523–2531.
Elwell, C.A., and Dreyfus, L.A. (2000) DNase I homologousresidues in CdtB are critical for cytolethal distending toxin-mediated cell cycle arrest. Mol Microbiol 37: 952–963.
Frisan, T., Cortes-Bratti, X., Chaves-Olarte, E., Stenerlow, B.,and Thelestam, M. (2003) The Haemophilus ducreyi cyto-
lethal distending toxin induces DNA double-strand breaksand promotes ATM-dependent activation of RhoA. CellMicrobiol 5: 695–707.
Graves, P.R., Yu, L., Schwarz, J.K., Gales, J., Sausville, E.A.,O’Connor, P.M., and Piwnica-Worms, H. (2000) The Chk1protein kinase and the Cdc25C regulatory pathways aretargets of the anticancer agent UCN-01. J Biol Chem 275:5600–5605.
Guerra, L., Teter, K., Lilley, B.N., Stenerlow, B., Holmes,R.K., Ploegh, H.L., et al. (2005) Cellular internalization ofcytolethal distending toxin: a new end to a known pathway.Cell Microbiol 7: 921–934.
Hassane, D.C., Lee, R.B., Mendenhall, M.D., and Pickett,C.L. (2001) Cytolethal distending toxin demonstrates geno-toxic activity in a yeast model. Infect Immun 69: 5752–5759.
Johnson, W.M., and Lior, H. (1988a) A new heat-labile cyto-lethal distending toxin (CLDT) produced by Escherichia coliisolates from clinical material. Microb Pathog 4: 103–113.
Johnson, W.M., and Lior, H. (1988b) A new heat-labile cyto-lethal distending toxin (CLDT) produced by Campylobacterspp. Microb Pathog 4: 115–126.
Kastan, M.B., and Lim, D.S. (2000) The many substrates andfunctions of ATM. Nat Rev Mol Cell Biol 1: 179–186.
King, D., Pringle, J.H., Hutchinson, M., and Cohen, G.M.(1998) Processing/activation of caspases-3 and -7 and -8but not caspase-2, in the induction of apoptosis in B-chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia 12: 1553–1560.
Landberg, G., and Roos, G. (1992) Flow cytometric analysisof proliferation associated nuclear antigens using washlessstaining of unfixed cells. Cytometry 13: 230–240.
Lara-Tejero, M., and Galan, J.E. (2000) A bacterial toxin thatcontrols cell cycle progression as a deoxyribonuclease I-like protein. Science 290: 354–357.
Lara-Tejero, M., and Galan, J.E. (2002) Cytolethal distendingtoxin: limited damage as a strategy to modulate cellularfunctions. Trends Microbiol 10: 147–152.
Lee, R.B., Hassane, D.C., Cottle, D.L., and Pickett, C.L.(2003) Interactions of Campylobacter jejuni cytolethal dis-tending toxin subunits CdtA and CdtC with HeLa cells.Infect Immun 71: 4883–4890.
Li, L., Sharipo, A., Chaves-Olarte, E., Masucci, M.G., Lev-itsky, V., Thelestam, M., and Frisan, T. (2002) The Hae-mophilus ducreyi cytolethal distending toxin activatessensors of DNA damage and repair complexes in prolifer-ating and non-proliferating cells. Cell Microbiol 4: 87–99.
McGowan, C.H., and Russell, P. (2004) The DNA damageresponse: sensing and signaling. Curr Opin Cell Biol 16:629–633.
Marches, O., Nougayrede, J.P., Boullier, S., Mainil, J., Char-lier, G., Raymond, I., et al. (2000) Role of tir and intimin inthe virulence of rabbit enteropathogenic Escherichia coliserotype O103: H2. Infect Immun 68: 2171–2182.
Marches, O., Ledger, T.N., Boury, M., Ohara, M., Tu, X.,Goffaux, F., et al. (2003) Enteropathogenic and entero-haemorrhagic Escherichia coli deliver a novel effectorcalled Cif, which blocks cell cycle G2/M transition. MolMicrobiol 50: 1553–1567.
Nataro, J.P., and Kaper, J.B. (1998) Diarrheagenic Escheri-chia coli. Clin Microbiol Rev 11: 142–201.
Nougayrede, J.P., Marches, O., Boury, M., Mainil, J., Char-lier, G., Pohl, P., et al. (1999) The long-term cytoskeletalrearrangement induced by rabbit enteropathogenic
Bacterial effector Cif interferes with the host cell cycle 1921
Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1910–1921No claim to original French government works
Escherichia coli is Esp dependent but intimin independent.Mol Microbiol 31: 19–30.
Nougayrede, J.P., Boury, M., Tasca, C., Marches, O., Milon,A., Oswald, E., and De Rycke, J. (2001) Type III secretion-dependent cell cycle block caused in HeLa cells by entero-pathogenic Escherichia coli O103. Infect Immun 69: 6785–6795.
Nougayrede, J.P., Taieb, F., De Rycke, J., and Oswald, E.(2005) Cyclomodulins: bacterial effectors that modulate theeukaryotic cell cycle. Trends Microbiol 13: 103–110.
Ohara, M., Oswald, E., and Sugai, M. (2004) Cytolethal dis-tending toxin: a bacterial bullet targeted to nucleus. J Bio-chem (Tokyo) 136: 409–413.
Oswald, E., Nougayrede, J.P., Taieb, F., and Sugai, M.(2005) Bacterial toxins that modulate host cell-cycle pro-gression. Curr Opin Microbiol 8: 83–91.
Rogakou, E.P., Pilch, D.R., Orr, A.H., Ivanova, V.S., andBonner, W.M. (1998) DNA double-stranded breaks inducehistone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem273: 5858–5868.
Rothkamm, K., and Lobrich, M. (2003) Evidence for a lack ofDNA double-strand break repair in human cells exposed tovery low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci USA 100: 5057–5062.
Sarkaria, J.N., Busby, E.C., Tibbetts, R.S., Roos, P., Taya,Y., Karnitz, L.M., and Abraham, R.T. (1999) Inhibition ofATM and ATR kinase activities by the radiosensitizingagent, caffeine. Cancer Res 59: 4375–4382.
Sert, V., Cans, C., Tasca, C., Bret-Bennis, L., Oswald, E.,Ducommun, B., and De Rycke, J. (1999) The bacterialcytolethal distending toxin (CDT) triggers a G2 cell cyclecheckpoint in mammalian cells without preliminaryinduction of DNA strand breaks. Oncogene 18: 6296–6304.
Traven, A., and Heierhorst, J. (2005) SQ/TQ cluster domains:concentrated ATM/ATR kinase phosphorylation siteregions in DNA-damage-response proteins. Bioessays 27:397–407.
Yu, Q., La Rose, J., Zhang, H., Takemura, H., Kohn, K.W.,and Pommier, Y. (2002) UCN-01 inhibits p53 up-regulationand abrogates gamma-radiation-induced G(2)-M check-point independently of p53 by targeting both of the check-point kinases, Chk2 and Chk1. Cancer Res 62: 5743–5748.
Zelphati, O., Wang, Y., Kitada, S., Reed, J.C., Felgner, P.L.,and Corbeil, J. (2001) Intracellular delivery of proteins witha new lipid-mediated delivery system. J Biol Chem 276:35103–35110.
Zhou, B.B., and Elledge, S.J. (2000) The DNA damageresponse: putting checkpoints in perspective. Nature 408:433–439.
Zhou, B.B., Chaturvedi, P., Spring, K., Scott, S.P., Johanson,R.A., Mishra, R., et al. (2000) Caffeine abolishes the mam-malian G(2) /M DNA damage checkpoint by inhibitingataxia-telangiectasia-mutated kinase activity. J Biol Chem275: 10342–10348.
72
III- Article 2 :
Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell cycle by stabilizing the cyclin-dependent
kinase inhibitors p21waf1 and p27kip1.
Ascel Samba-Louaka, Jean-Philippe Nougayrède, Claude Watrin, Grégory Jubelin, Eric
Oswald et Frédéric Taieb.
Cellular Microbiology (2008), Vol 10 (12), p2496 – 2508.
Dans cet article, nous nous intéressons aux effets de Cif sur deux inhibiteurs de CDKs,
p21 et p27. L’intérêt pour ces deux protéines découle d’un cheminement qui a commencé par
l’analyse du cycle cellulaire après une infection par une EPEC qui exprime Cif sur des
cellules asynchrones. En présence de Cif, le pourcentage des cellules avec 4n quantité d’ADN
(en G2) est plus élevé par rapport aux cellules infectées avec une souche délétée pour le gène
cif. Toutefois, la présence de Cif n’ empêche pas l’apparition d’une population cellulaire avec
2n quantité d’ADN (en phase G1). En considérant que Cif arrête le cycle cellulaire à la
transition G2/M, deux hypothèses peuvent expliquer la persistance de cellules en phase G1.
Première hypothèse, certaines cellules sont insensibles (ou échappent) à l’arrêt du cycle
cellulaire en G2/M et passent en phase G1. Cette hypothèse se heurte au fait qu’aucune figure
en mitose n’est observée sur des cellules infectées par une EPEC exprimant Cif. Dans la
seconde hypothèse, les cellules avec 2n quantité d’ADN sont bloquées en phase G1. Pour
tester cette hypothèse, nous avons travaillé sur des cellules synchronisées. En présence d’un
excès de thymidine, les cellules s’arrêtent à la transition G1/S. Les cellules infectées avec une
EPEC exprimant Cif juste après le relâchement de ce blocage en G1/S, présentent une très
forte majorité de cellules bloquées en phase G2 24 h après l’infection. Toutefois, si nous
synchronisons les cellules en mitose avec du nocodazole (poison mitotique) et que nous
infectons ces cellules 4h après le relâchement (les cellules sont en début de phase G1), nous
obtenons une population cellulaire majoritairement en phase G1. Cette fois également, deux
possibilités s’offraient à nous pour expliquer ce résultat. Soit les cellules sont insensibles à
l’effet de Cif lorsqu’elles sont infectées en phase G1, soit les cellules ne peuvent entrer en
phase S. Nous avons testé ces deux hypothèses en incubant les cellules infectées avec un
analogue de la thymidine (le bromo-désoxy-uridine ou BrdU). Les cellules qui incorporent le
BrdU synthétisent l’ADN donc prolifèrent. Dans notre cas, la présence de Cif empêche toute
73
incorporation du BrdU démontrant que les cellules en phase G1 sont arrêtées et ne cyclent pas.
Ainsi, nous avons montré qu’en fonction de la phase dans laquelle se trouvent les cellules lors
de l’infection, Cif peut induire un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 et/ou en phase G2.
Bien que ce double arrêt puisse résulter de 2 mécanismes indépendants, ce résultat laisse
suggérer que les mécanismes cellulaires mis en jeu par Cif pour arrêter le cycle cellulaire sont
communs aux phases G1 et G2. Les éléments communs à ces deux phases sont les complexes
CDK/Cyclines avec leurs activateurs (les phosphatases Cdc25s) et leurs inhibiteurs (les
CKIs).
Dans l’article précédent, nous avons démontré que le maintien de la forme phosphorylée de
CDK1, en présence de Cif, ne résulte pas d’une dérégulation des Cdc25s. L’étude s’est donc
portée sur la CKI p21waf1/Cip1 qui est connue pour induire des arrêts du cycle cellulaire à la fois
en G1/S et en G2/M (Cayrol et al., 1998; Niculescu et al., 1998). Cif induit une accumulation
de la protéine p21 dans les cellules eucaryotes dès 4 h avec un maximum à 16 h post-
infection. L’accumulation de p21 est observée dans toutes les lignées cellulaires testées et
l’activité du site catalytique de Cif est nécessaire pour ce phénotype. Cette augmentation du
niveau de p21 se fait indépendamment de son principal activateur transcriptionnel ; la
protéine p53 (Gartel and Tyner, 1999). Nos résultats montrent que Cif n’active pas la
transcription de p21 mais stabilise partiellement la protéine en inhibant sa dégradation par la
voie du protéasome. En effet, en présence de Cif et de la cycloheximide qui inhibe la synthèse
de novo des protéines, nous avons observé une augmentation de la demi-vie de p21. De plus,
l’utilisation d’un inhibiteur du protéasome (la Lactacystine) en présence de Cif n’induit pas
d’effet synergique ou additif quant à l’accumulation de p21 ; ce qui suggère que Cif pourrait
inhiber la dégradation de p21 par la même voie décrite pour la Lactacystine. Par ailleurs, une
autre CKI, la protéine p27kip1, semble également stabilisée par la protéine Cif. Toutefois,
l’absence de p21 ne lève pas l’arrêt du cycle cellulaire provoqué par Cif. De même, une sous-
régulation de p21, de p27 et même de Wee1 (l’inhibiteur de CDK1) par SiRNA (Small
interfering RNA) ne suffit pas à lever les différents arrêts du cycle cellulaire. Il est
vraisemblable que ces deux CKIs participent à l’arrêt du cycle cellulaire par inhibition des
complexes CDK-cyclines nécessaires aux transitions G1/S et G2/M mais que d’autres
protéines sont également impliquées dans cet effet anti-prolifératif de Cif.
Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell cycleby stabilizing the cyclin-dependent kinase inhibitorsp21waf1 and p27kip1
Ascel Samba-Louaka,1,2 Jean-Philippe Nougayrède,1,2
Claude Watrin,1,2 Grégory Jubelin,1,2 Eric Oswald1,2
and Frédéric Taieb1,2*1INRA, UMR 1225, F-31076 Toulouse, France.2Université de Toulouse, ENVT, UMR 1225, F-31076Toulouse, France.
Summary
The cycle inhibiting factor (Cif) is a cyclomodulin pro-duced by enteropathogenic and enterohemorrhagicEscherichia coli. Upon injection into the host cell bythe bacterial type III secretion system, Cif inhibits theG2/M transition via sustained inhibition of the mitosisinducer CDK1 independently of the DNA damageresponse. In this study, we show that Cif induces notonly G2, but also G1 cell cycle arrest depending on thestage of cells in the cell cycle during the infection.In various cell lines including differentiated anduntransformed enterocytes, the cell cycle arrestsare correlated with the accumulation of the cyclin-dependent kinase inhibitors p21waf1/cip1 and p27kip1.Cif-induced cyclin-dependent kinase inhibitor accu-mulation is independent of the p53 pathway butoccurs through inhibition of their proteasome-mediated degradation. Our results provide a directlink between the mode of action of Cif and the hostcell cycle control.
Introduction
Pathogenic bacteria have evolved sophisticated arsenalsof virulence factors to subvert eukaryotic host functions totheir own benefit. Among these effectors, the cyclomodu-lins are a class of microbial toxins that hijack a fundamen-tal host cell process: the cell cycle (Nougayrede et al.,2005; Oswald et al., 2005). The cycle inhibiting factor (Cif)of enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichiacoli (EPEC and EHEC) is one of these cyclomodulins. Cif
is injected into host cells via EPEC/EHEC specializedsyringe, the type III secretion system (T3SS) (Marcheset al., 2003; Charpentier and Oswald, 2004). Upon injec-tion into the host cell, Cif induces a cell cycle arrest in theG2 phase and a reorganization of the actin network(Marches et al., 2003), but the cell cycle inhibition is not aconsequence of cytoskeleton alterations (Nougayredeet al., 2001) and formation of stress fibers is not observedwith all cell lines (Taieb et al., 2006). Cif is composed ofa C-terminal effector domain and an exchangeableN-terminal translocation signal (Charpentier and Oswald,2004). The crystal structure of Cif was recently solved,revealing it to be a divergent member of the superfamily ofenzymes including cysteine proteases and acetyltrans-ferases that share a common catalytic domain involved inCif cytostatic activity (Y. Hsu et al., submitted).
The G2 phase cell cycle arrest induced by Cif resultsfrom maintenance of the cyclin-dependent kinase 1(CDK1), the key regulator of entry in mitosis, in a tyrosine-15-phosphorylated inactive state (Nougayrede et al.,2001; Marches et al., 2003; Taieb et al., 2006). The effectof Cif is strikingly similar to that of other cyclomodulinssuch as cytolethal distending toxin and Colibactin, whichinduce host DNA damage resulting in the activation of theDNA damage checkpoint pathway and inhibition of theG2/M transition (Peres et al., 1997; Zhou and Elledge,2000; Nougayrede et al., 2006). However, in contrast tothese DNA-damaging toxins, Cif-induced sustained phos-phorylation of CDK1 does not result from the activation ofthe DNA damage response and Cif does not cause phos-phorylation of histone H2AX, which is associated withDNA double-stranded break (Taieb et al., 2006). Hence,Cif does not insult host DNA but activates anotherpathway, yet unrevealed, leading to cell cycle arrest.
In the present study, we show that Cif blocks the cellcycle not only in G2 but also in G1. Cell cycle arrestscorrelated with the accumulation of cyclin-dependentkinase inhibitors (CKI) p21waf1/cip1 and p27kip1. We demon-strate that Cif increases these CKIs’ stability by blockingtheir proteasome-dependent degradation pathway. Ourresults provide a potential link between the mode ofaction of Cif and ubiquitination or degradation mach-ineries involved in the control of eukaryotic cell cycleprogression.
Received 15 April, 2008; revised 4 August, 2008; accepted 5 August,2008. *For correspondence. E-mail [email protected]; Tel. (+33)561 19 32 86; Fax (+33) 561 19 39 75.
Cellular Microbiology (2008) 10(12), 2496–2508 doi:10.1111/j.1462-5822.2008.01224.xFirst published online 8 September 2008
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Results
Cif induces cell cycle arrest in G1 and G2 phases
We have previously shown that asynchronous or G1/Ssynchronized cells infected with wild-type EPEC strainsproducing Cif (EPECwt) are blocked in G2 phase (Marcheset al., 2003; Taieb et al., 2006). However, a substantialproportion of cells with a 2n DNA content (G1 phase) wasalways present in the cells infected with EPECwt (Fig. 1A).To clarify the presence of this population, we synchronizedHeLa cells in mitosis using nocodazole. Four hours after
nocodazole release (early G1 phase), the cells wereinfected with EPECwt or a Cif-deleted mutant (EPECDCif).Interestingly, 24 h after infection with EPECwt, most of thecells were in G1 (Fig. 1A). A kinetic analysis of the cell cycleprogression following infection during the early G1 phaseindicated that, in contrast to EPECDCif-infected cells thatentered S and G2 phases at 16 h and 20 h respectively,EPECwt-infected cells did not cycle and remained blockedin G1 (Fig. 1B). To confirm this arrest, the cells wereinfected in early G1 phase and then incubated 22 h withBrdU. As shown in Fig. 1C, EPECDCif-infected cells
Fig. 1. Cif induces host cell cycle arrest in both G1 and G2.A. Asynchronous, G1/S or early G1 synchronized HeLa cells (see Experimental procedures) were exposed for 2 h to wild-type EPEC (EPECwt)or a Cif-deleted mutant EPEC (EPECDCif), washed and further incubated with antibiotics for 24 h. Cellular DNA was stained with propidiumiodide and cell cycle distribution was analysed by flow cytometry.B. HeLa cells were synchronized in early G1 then exposed for 2 h to EPECwt or EPECDCif. The cell cycle distribution was analysed at theonset of infection (0 h) and 16–24 h after exposure to bacteria.C. HeLa cells were synchronized and exposed to EPEC as in (B) then incubated with BrdU for 22 h. BrdU incorporation in DNA-synthesizingcells was analysed by using FITC-conjugated anti-BrdU antibodies and flow cytometry.
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entered S phase as demonstrated by a massive BrdUincorporation. In contrast, no incorporation of BrdU wasobserved in EPECwt-infected cells (Fig. 1C). Takentogether, these results demonstrate that Cif inhibits both Sand M phase entries leading to G1 and G2 cell cycle arrestrespectively.
Cif induces accumulation of the CKI p21waf1/cip1
G1 to S and G2 to M cell cycle transitions are mediated byactivation of members of the CDK family. CDKs are knownto be inhibited by binding to the cyclin kinase inhibitorp21waf1/cip1 (hereafter referred as p21) (Harper et al.,1995). To explore the involvement of p21 in Cif-inducedcell cycle arrest, we monitored p21 levels in cells infectedwith EPECwt or EPECDCif. In HeLa cells infected withEPECDCif, p21 was barely detectable. On the other hand,EPECwt infection induced a detectable increase in thelevel of p21 as soon as 4 h after the infection and reacheda maximum at 16–24 h (Fig. 2A). We next examined theamount of p21 in human enterocyte cell lines (Caco-2,HCT116 and DLD-1), untransformed cells from rat smallintestine (IEC-6), and a fibroblast-like cell line frommonkey kidney (Cos-7) that were infected with EPECwt orEPECDCif. Injection of Cif was associated with increasedlevels of p21 in all the cell lines tested (Fig. 2B). Althoughthe main transcriptional activator of the p21 gene is thep53 protein (el-Deiry et al., 1993), the accumulation ofp21 was observed in both p53-positive and p53-negativecell lines. Notably, p53-positive wild-type HCT116 andknocked-out p53–/– HCT116 cells showed increasedlevels of p21 following EPECwt infection (Fig. 2B). HenceCif induces accumulation of the p21 protein regardless ofthe status of p53. In addition, although p21 level isnaturally increased during Caco-2 differentiation due togene activation (Gartel et al., 2000), infection withEPECwt led to further accumulation of p21, suggestingthat Cif operates on a transcription-independent pathway(Fig. 2B).
The accumulation of p21 protein in cells is dependenton Cif catalytic domain
Crystal structure of Cif suggests that the catalytic domainof this effector protein could be a divergent member of thesuperfamily of enzymes including cysteine proteases,transglutaminases and acetyltransferases (Y. Hsu et al.,
Fig. 2. Cif induces accumulation of p21 protein in variouseukaryotic cells.A. HeLa cells were exposed (at -2 h) for 2 h to wild-type (EPECwt)or a Cif-deleted mutant EPEC (EPECDCif) and further incubated upto 24 h. Cell protein extracts were probed with anti-p21 andanti-actin antibodies.B. Indicated cell lines were exposed for 2 h to EPECwt (+) orEPECDCif mutant (–) and further incubated 24 h. Cell proteinextracts were probed with anti-p21 and anti-actin antibodies.HCT116 p53–/– is a HCT116 wild-type isogenic cell line mutatedfor both allele of p53.C. HeLa cells were exposed for 2 h to EPECwt, EPECDCif orEPECDCif complemented with plasmids coding for wild-type Cif(pCifwt) protein or Cif C109A mutant. Twenty-four hours followingexposure, cell extracts were probed with anti-p21 and anti-actinantibodies.
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submitted). To examine the role of the Cif catalytic domainin Cif-induced p21 accumulation, HeLa cells were infectedwith EPECDCif overexpressing wild-type Cif (wt) or Cifmutated for the critical cysteine residue of the catalyticdomain (C109A). EPECwt and EPECDCif strains wereused as controls and the cell cycle was analysed 24 hafter infection. Whereas cells infected with EPECDCifexpressing Cifwt were blocked at the G2/M phase transi-tion, the cell cycle was unaffected following infection withEPECDCif mutant expressing CifC109A (data not shown).Consistent with the effect on the cell cycle, Western blotanalysis showed an increase of p21 level with EPECoverexpressing Cifwt, EPECwt and no accumulation withEPEC overexpressing CifC109A (Fig. 2C). We conclude thatCif catalytic domain is required for the accumulation ofp21. The CifC109A mutant form of Cif was hereafter used asan inactive control for Cifwt.
The accumulation of p21 induced by Cif is independentof p21 synthesis
To address the mechanism by which Cif induced p21accumulation, we examined the level of p21 mRNA 4 hafter the infection of HeLa cells with EPEC expressingCifwt or CifC109A. Apicidin, a transcriptional activator of p21(Han et al., 2000), was used as a positive control. Nodifference in p21 mRNA levels was observed between thecells exposed to EPEC expressing Cifwt or CifC109A. Theselevels were comparable with those observed in controlcells whereas apicidin induced an approximately fivefoldp21 mRNA increase (Fig. 3A).
To confirm that Cif does not induce p21 synthesis ineukaryotic cells, HeLa cells were treated with lactacystinthat was shown to block proteasome-mediated degrada-tion of p21 (Blagosklonny et al., 1996). We reasoned thata variation of p21 level in cells treated with lactacystinwould reflect a modification of p21 synthesis as p21 de-gradation was inhibited. The expected cumulative effecton p21 level in cells treated with both the transcriptionalactivator apicidin and the proteasome inhibitor lactacystinwas not observed in cells treated with lactacystin andinfected with EPEC expressing Cifwt (Fig. 3B). This resultconfirmed that, in contrast to apicidin, Cif does not inducethe synthesis of p21 at either transcriptional or transla-tional level.
Cif blocks p21 protein degradation through inhibition ofthe proteasome pathway
We next determined whether the Cif-induced increasedamount of p21 was due to the stabilization of the protein.As the level of expression of endogenous p21 is very lowin HeLa cells, we used a DLD-1 cell line that contains
an inducible gene for HA-tagged p21. p21-HA is con-stitutively expressed in absence of tetracycline (Tet-offsystem) (Cayrol and Ducommun, 1998). In tetracycline-free medium, DLD-1 p21-HA-expressing cells wereinfected with EPEC expressing Cifwt or CifC109A. Proteinsamples were collected 8 h after infection and probed forthe expression of p21-HA. As expected, cell treatmentwith the transcriptional activator apicidin led to an accu-mulation of endogenous p21 but did not change the levelof p21-HA, of which expression is constitutive (Fig. 4A). Incontrast, infection with EPEC expressing Cifwt resulted inaccumulation of both endogenous and HA-labelled p21proteins (Fig. 4A and B). A similar p21 level pattern wasobtained in cells treated with the proteasome inhibitorlactacystin suggesting that Cif could also modulate thedegradation of p21.
To further study Cif-induced stabilization of p21, DLD-1p21-HA-expressing cells were infected then treated withcycloheximide (CHX) to inhibit de novo synthesis of p21-HA. The turnover of p21-HA protein was analysed byWestern blot hourly till 4 h after CHX addition. Degrada-
Fig. 3. Cif does not induce p21 synthesis.A. Real-time PCR for p21 mRNA extracted 4 h after infection withEPECDCif + pCifwt or EPECDCif + pCif C109A or 16 h followingtreatment with apicidin. Expression levels were normalized tocyclophilin A level and are presented as levels relative to thecontrol (non-infected cells). Experiments were performed threetimes for each condition and error bars represent standard errors ofthe mean.B. Infected and non-infected (control) cells were treated (+) or not(–) with lactacystin (LC) and proteins were extracted 16 h afterinfection and probed with anti-p21 and anti-actin antibodies.
Cif stabilizes host CDK inhibitors 2499
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tion of p21-HA in cells infected with EPEC expressing Cifwt
was slower compared with that in cells infected withEPEC expressing CifC109A (Fig. 4C and D). Moreover,p21-HA protein was stabilized 2 h after CHX treatment(Fig. 4D). These results indicate that Cif slowed down thedegradation of p21-HA through its partial stabilization.
We next examined the levels of p21-HA upon infectionand treatment with different proteasome inhibitors. Weused lactacystin that inhibits preferentially chymotrypsinand trypsin activities (Fenteany et al., 1995) and MG132,a broader inhibitor that blocks chymotryspin and caspase-
like activities. DLD-1 p21-HA-expressing cells wereinfected with EPEC expressing Cifwt or CifC109A and thentreated with lactacystin or MG132 in the presence of CHX.The levels of p21-HA were quantified 4 h after treatment.As shown in Fig. 4E, the levels of p21-HA were similar inlactacystin-treated cells infected with EPEC expressingCifC109A or Cifwt. Moreover, there was no significant differ-ence of p21-HA amounts in cells infected with EPECexpressing Cifwt whether treated with lactacystin or not,suggesting the absence of synergistic effect of Cif andlactacystin. Interestingly, the amount of p21-HA in cells
Fig. 4. Cif stabilizes the p21 protein.A. DLD-1 cells expressing p21-HA (-8 h) were left untreated (mock), infected for 2 h with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A, treated withapicidin or lactacystin. After 8 h cells were lysed and protein extracts were probed with anti-HA, anti-p21 and anti-actin antibodies.B. Chemiluminescence signals shown in (A) from three independent experiments were quantified and expressed as average percentagerelative to the level of p21-HA at -8 h.C. DLD-1 cells expressing p21-HA (-2 h) were infected 2 h with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. After infection (0 h), cells were treatedwith 40 mg ml-1 CHX. p21-HA and actin levels were monitored at the indicated times.D. Chemiluminescence signals shown in (C) from three independent experiments were quantified. The average percentages for each timepoint are relative to 0 h.E. DLD-1 cells were infected with EPECDCif + pCifwt (open bars) or +pCif C109A (black bars) and treated with DMSO, lactacystin or MG132for 2 h. Then, cells were treated with 40 mg ml-1 CHX (with DMSO, lactacystin or MG132) for 4 h. Levels of p21-HA were assessed byimmunoblotting with anti-HA antibody. The error bars in (B), (D) and (E) represent the standard errors of the mean from independentexperiments.
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treated with MG132 was substantially higher than that incells treated with lactacystin or in cells infected with EPECexpressing Cifwt (Fig. 4E). As MG132 inhibits not only theproteasome activity (Lee and Goldberg, 1998; Steinhilbet al., 2001), this divergence suggests that p21 could bedegraded partly by another MG132-dependent pathway.Existence of such activity in DLD-1 cells is consistent withthe early reduction of p21-HA level following CHX treat-ment in cells infected with EPECDCif expressing Cifwt
(Fig. 4C and D). Therefore, Cif could be as specific aslactacystin and induces p21 stabilization through inhibi-tion of the proteasome pathway.
Prevention of p21 accumulation is not sufficient toresume cell cycle progression
Increase of p21 expression leads to the cell cycle arrest inboth G1 and G2 (Cayrol et al., 1998; Niculescu et al.,1998). To examine the implication of Cif-induced accumu-lation of p21 in the cell cycle arrest, we used small inter-fering RNA (siRNA) to knock down p21 expression. HeLacells were transfected with control or p21 siRNAs theninfected with EPECDCif expressing Cifwt or CifC109A andfurther incubated with BrdU to monitor S-phase entry.Cells transfected with p21 siRNA and infected withEPECDCif expressing Cifwt harboured a strongly reducedlevel of p21 as compared with non-silenced cells(Fig. 5A), but did not incorporate BrdU (Fig. 5B). Thisresult indicated that p21 knock-down did not overcomethe Cif-induced G1 arrest.
We next investigated the role of p21 in the inhibition ofthe G2/M transition induced by Cif. HCT116wt andisogenic HCT116 p21–/– cells (Waldman et al., 1995)were synchronized in G1/S and infected with EPECDCifexpressing Cifwt or CifC109A. A ‘nocodazole trap’ assay wasused to quantify cells that entered in mitosis (see Experi-mental procedures). As expected, G1/S-synchronizedcells infected with EPECDCif expressing CifC109A accumu-lated in mitosis in presence of nocodazole, and followinginfection with EPEC expressing Cifwt, HCT116wt cells didnot enter mitosis (Fig. 5C). However, despite absence of
Fig. 5. The accumulation of p21 is dispensable for cell cycle arrest.A. HeLa cells were transfected or not with control or p21 siRNA.Forty-eight hours after transfection, the cells were infected 2 h withEPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. Cell protein extracts wereprobed with anti-p21 and anti-actin antibodies 24 h after infection.B. HeLa cells were transfected with control or p21 siRNA andinfected with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. Sixteen hoursafter infection, cells were incubated with BrdU for 5 h and BrdUincorporation was analysed by flow cytometry. Percentages ofBrdU-positive cells are indicated.C. Wild-type and p21–/– HCT116 cells were synchronized in G1/Sand infected with indicated EPEC strains and further incubated withnocodazole. Percentages of mitotic cells were determined byDNA/MPM-2 staining and flow cytometry (see Fig. 6C andExperimental procedures).
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p21, Cif-induced G2 arrest was maintained in HCT116p21–/– cells as demonstrated by absence of mitotic cells(Fig. 5C). Taken together, these experiments indicatedthat knock-down/out of p21 is not sufficient to overcomethe Cif-induced cell cycle arrest and that Cif was inter-fering with other actor(s) to inhibit the G2/M and G1/Stransitions.
Cif does not modulate the expression of Wee1
As p21 accumulation was dispensable for cell cycle inhi-bition, we next investigated other regulators of the CDK–cyclin complexes that could be involved in the Cifcytostatic effect. We first examined the expression of thekinase Wee1 that prevents entry in mitosis by phospho-rylating CDK1 (Watanabe et al., 1995). We infected HeLacells synchronized at the G1/S transition and monitoredthe levels of Wee1. As shown in Fig. 6A, Wee1 accumu-lated until 8 h and decreased after 10 h when cellsentered into M phase. The early increase in Wee1 levelwas similar in the presence of CifC109A or wild-type Cif(Fig. 6A), suggesting that Wee1 did not participate in theCif-induced G2 phase arrest. As Wee1 is destabilized byCDK1 activation in a positive feedback loop (Muelleret al., 1995; Watanabe et al., 2004; 2005), Wee1 sus-tained level observed after 8 h in Cifwt-infected cells(Fig. 6A) was likely a consequence of CDK1 inhibition. Toconfirm that Wee1 was dispensable for cell cycle arrestinduced by Cif, we used siRNA to knock down Wee1expression and performed the nocodazole trap assay tomonitor M-phase entry. Even though expression of Wee1was effectively silenced (Fig. 6B), infection with EPECexpressing Cifwt resulted in a G2 arrest as Wee1 siRNA-transfected cells did not entered mitosis in presence of Cif(Fig. 6C). This experiment confirmed that Wee1 stabiliza-tion was not the initial event leading to Cif-induced inhibi-tion of mitosis entry.
Cif induces accumulation of the CKI p27kip1
We next examined the level of p27kip1 (hereafter referredas p27). This CKI binds and inhibits G1-specific CDKcomplexes and is involved in G1/S progression (Polyaket al., 1994; Koff and Polyak, 1995). Western blot analysisshowed that p27 accumulated in the presence of Cifwt inHeLa cells (Fig. 7A). Increase of the p27 level upon Cifwt
injection was also observed in Caco-2, IEC-6 and HCT116cell lines (Fig. 7B and not shown). MG132 treatment didnot increase further the level of p27 (Fig. 7A), suggestingthat Cif slowed down the turnover of p27, as for p21,through inhibition of the ubiquitin/proteasome pathway. Ithas been shown that phosphorylation of p27 at T187 byCDK2 is essential for triggering substrate ubiquitinationand degradation. As the p27 accumulation could result
Fig. 6. Cif effect on accumulation of Wee1 protein.A. HeLa cells were synchronized in G1/S and infected for 2 h withEPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. Cell protein extracts wereprobed with anti-Wee1 and anti-actin antibodies at indicatedtime (h).B. HeLa cells were transfected with control or Wee1 siRNA andinfected for 2 h with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A 48 h later.Seventy-two hours after transfection, cell protein extracts wereprobed with indicated antibodies.C. Control (left panels) and Wee1 (right panels) siRNA-transfectedHeLa cells were synchronized at the G1/S transition and infectedfor 2 h with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. Cells were thentreated with nocodazole for 16 h and collected for flow cytometryanalysis. Results are presented as density plots and mitotic cells(MPM2-positive cells at 4N DNA content) are indicated by circles.
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from inhibition of CDK2 by Cif-induced increase of p21,we examined the level of p27 in HCT116 wild-type andp21–/– cell lines. As shown in Fig. 7B, the accumulationof p27 was comparable in both p21–/– and wild-typeisogenic HCT116 cells, indicating that p27 stabilization isindependent of p21.
To assess the involvement of p27 in the Cif-induced cellcycle arrest, we used siRNA to knock down p27 expres-sion (Fig. 8A). Control and p27 siRNA-transfected cellswere further infected with EPEC expressing Cifwt or CifC109A
and monitored for BrdU incorporation. As illustrated inFig. 8B, p27 downregulation did not restore S-phase entryupon Cifwt injection. As independent downregulation ofeach CKI did not overcome cell cycle arrests, we per-formed double siRNA transfection experiments to knockdown both p21 and p27 (Fig. 8C). Cells that were treatedwith both p21 and p27 siRNAs did not overcome theCif-induced G1/S transition arrest as EPEC-infected cellsdid not enter in S phase in the presence of Cif (Fig. 8D).
Discussion
G1/S, G2/M and metaphase/anaphase transitions are thethree checkpoints that ensure correct and faithful eukar-yotic cell division. We have previously reported that Cif, abacterial cyclomodulin, inhibits cell cycle progression atthe G2/M transition (Marches et al., 2003; Nougayredeet al., 2005). In the present study, we demonstrate that Cifalso induces cell cycle arrest at the G1/S transition. Wefound that activation of the G1/S and G2/M checkpoints byCif was correlated with the accumulation of two CKIs: p21and p27. The increase of p27 was also not a consequenceof p21 stabilization and the increase of p21 was indepen-dent of p53, which is the main transcriptional activator of
p21. Our results suggest that Cif reduced the rate of p21and p27 proteasome-dependent degradation withoutaffecting their synthesis. However, downregulation of p27or p21 did not overcome the cell cycle arrests induced byCif. These results suggest that Cif targets a more generalprocess that modulates the stability of different proteinsimplicated in various pathways controlling cell cycleprogression.
Several viral or bacterial effectors have been shownto induce accumulation of p21. The human immuno-deficiency virus protein Vpr (He et al., 1995; Re et al.,1995; Azuma et al., 2006) activates p21 transcription(Chowdhury et al., 2003; Amini et al., 2004) and anotherviral protein, Tax, from human T-cell lymphotropic virustype 1, was shown to transactivate the p21 promoter (deLa Fuente et al., 2000). Other bacterial toxins have beenfound to induce p21 gene expression: the cyclomodulincytolethal distending toxin, the Clostridium difficile toxin A(Kim et al., 2005b) and CagA effector from Helicobacterpylori (Yokoyama et al., 2005). It is noteworthy that Cifdiffers from above toxins in that Cif-induced accumulationof p21 does not involve transcription mechanism but actson a pathway controlling protein stability. To our knowl-edge, except adenovirus E1A oncoprotein that elevatesthe level of p27 (Alevizopoulos et al., 1998), p27 accumu-lation seems to be an almost unique feature of Cif. Nobacterial protein has been reported to modulate theexpression of p27.
Bacterial interference with the stability of host proteinsis a strategy exploited by many pathogens. As ubiquitina-tion is the main post-translational modification that regu-lates proteasome-mediated degradation of protein, thispathway is hijacked by several toxins and effectors(Rytkonen and Holden, 2007). Yersinia YopJ, a T3SS
Fig. 7. Cif stabilizes the p27 protein.A. HeLa cells were infected for 2 h with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A in the presence of MG132 as indicated. Cell protein extracts wereprobed with anti-p27 and anti-actin antibodies at indicated time.B. Wild-type and p21–/– HCT116 cells were infected for 2 h with EPECDCif + pCifwt. Cell protein extracts were probed with anti-p27 andanti-actin antibodies at indicated time. Indicated times (h) are relative to the end of infection.
Cif stabilizes host CDK inhibitors 2503
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effector that have been shown to be a cysteine proteaseand acetyltransferase, stabilizes IkBa in an ubiquitin-dependent manner (Zhou et al., 2005). Shigella flexneriT3SS effector OspG interacts with E2 ubiquitin-conjugating enzyme and blocks TNFa-induced IkBa de-gradation (Kim et al., 2005a). T3SS effector SseL fromSalmonella exerts a cytotoxic effect on macrophages viaa deubiquitinating activity (Rytkonen et al., 2007). Theplant pathogen Pseudomonas syringae T3SS effectorAvrPtoB inhibits host programmed cell death and exhibitsan E3 ubiquitin ligase activity (Abramovitch et al., 2006). Asimilar strategy might be employed by Cif to block the hostcell cycle, via inhibition of the ubiquitin/proteasome-mediated degradation of CKIs. Our ongoing work isdirected at determining the precise mechanism underlyingCif-mediated stabilization of CKIs.
As p21 and p27 are also implicated in the control of cellfate such as cell cycle exit, differentiation, carcinogenesisand survival (Evers, 1999; Dulic et al., 2000; Hsieh et al.,2000; Gartel and Tyner, 2002; Philipp-Staheli et al.,2004; Heron-Milhavet et al., 2006), alteration of CKIslevel and/or activity can alter apoptosis control and cellrenewal. Thus, similar to IpaB from Shigella (Iwai et al.,2007), Cif could prolong bacterial attachment and localpersistence by slowing down crypt–villus cell renewal. Inintestinal differentiated enterocytes, accumulation of p21could inhibit apoptosis and epithelial shedding and thusincrease bacterial colonization. In addition, as elevatedlevels of p21 and 27 are associated to differentiation ofintestinal cells from the crypt to the top of the villus (Tianand Quaroni, 1999), Cif could also directly facilitate thecolonization of the gut by EPEC as adhesion of EPEC invitro has been shown to be function of the epithelial celldifferentiation (Gabastou et al., 1995).
If the role of Cif as a virulence factor remains to beelucidated, chronic infection or asymptomatic colonizationwith bacteria that perturb cell-signalling processes and
Fig. 8. Downregulation of p27 and p21-p27 does not restoreS-phase entry.A. HeLa cells were transfected with control or p27 siRNA.Forty-eight hours after transfection, cells were infected 2 h withEPECDCif +pCifwt or +pCif C109A. Cell protein extracts wereprobed with anti-p27 and anti-actin antibodies 24 h after infection.B. HeLa cells were transfected with control or p27 siRNA andinfected with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. Sixteen hoursafter infection, cells were incubated with BrdU for 4 h and BrdUincorporation was analysed by flow cytometry.C. HeLa cells were transfected with control or p27 and p21 siRNAthen infected 2 h with EPECDCif + pCifwt or +pCif C109A. Cellprotein extracts were probed with anti-p27, anti-p21 and anti-actinantibodies 24 h after infection.D. Cells treated as in (C) were left untreated for 16 h after infectionand then incubated for 4 h with BrdU. BrdU incorporation wasanalysed by flow cytometry. Experiments were performed five timesand average percentages of BrdU-positive cells ! standard errorsof the mean are shown.
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modulate proliferation are likely to contribute positively ornegatively to cell transformation that encourages tumourinitiation or progression (Nougayrede et al., 2005; Oswaldet al., 2005; Gartel, 2006). Undoubtedly, cyclomodulinssuch as Cif will also prove useful to those who want todissect pathways involved in the control of mammaliancell cycle.
Experimental procedures
Cell lines, bacterial strains and plasmids
Homo sapiens HeLa (ATCC CCL-2), Caco-2 (ATCC HTB-37) andCercopithecus aethiops Cos-7 (ATCC CRL-1651) cell lines weremaintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEMGlutaMax, Invitrogen) supplemented with 10% fetal calf serum(FCS) and 80 mg ml-1 gentamicin at 37°C in a 5% CO2
atmosphere. Undifferentiated Caco-2 cells were non-confluentgrowing cells. For differentiation, Caco-2 cells were cultured2–3 weeks until dome formation. H. sapiens DLD-1 cells stablyexpressing 3¥HA-tagged, wild-type p21 (Cayrol and Ducommun,1998), a generous gift from Dr. Bernard Ducommun, were grownin the above medium supplemented with tetracycline (2 mg ml-1;Sigma). Rattus norvegicus IEC-6 (CRL-1592) were grown in theabove medium supplemented with bovine insulin (0.1 units ml-1;Sigma). H. sapiens HCT116 (ATCC CCL-247), HCT116 p21–/–and HCT116 p53–/– (Bunz et al., 1998) (kindly provided by Dr.Bert Volgestein) were maintained in Mc Coy’s 5A Medium (Invit-rogen) supplemented with 10% FCS and 80 mg ml-1 gentamicin.
The EPEC strains used in this study were rabbit EPEC O103strain E22 and human typical EPEC O111 strain B171-8. Themutant strains E22cif::frt and B171cif::frt were previouslydescribed (Marches et al., 2003; Taieb et al., 2006).
Plasmid pEL3 (pCifwt) was previously described (Taieb et al.,2006). To construct plasmids pCifC109A expressing Cif cysteinepoint mutant C109A, mutagenesis of cif was performed byreverse PCR with pCifwt as a template and by using phosphory-lated primers containing the desired mutation. C109A residuesubstitution was verified by DNA sequencing.
Infection and cell treatments
For infection experiments, bacteria were cultured overnight in LBmedium. Then, bacteria were subcultured 1:20 in interactionmedium (DMEM with 25 mM Hepes and 5% FCS) for 2 h at 37°Cwith shaking (240 r.p.m.). Eukaryotic cell were washed and theculture medium was replaced by interaction medium and cellswere infected for 2 h with a multiplicity of infection of 50:1. Afterinfection, cells were washed in Hank’s balanced salt solution thencultivated for the indicated times in cell culture medium supple-mented with 200 mg ml-1 gentamicin.
For synchronization in G1/S phase, HeLa cells were arrestedwith 2 mM thymidine (Sigma) for 18 h, washed and cultured innormal medium for 9 h and incubated again with 2 mM thymidinefor 16 h. HCT116 cells were synchronized in G1/S with 2 mMhydroxyurea for 19 h.
For early G1 phase synchronization, HeLa cells were arrestedin mitosis in presence of 100 nM nocodazole (Sigma) for 22 h.Cells were exposed to bacteria 4 h after release in nocodazole-free medium.
For the ‘nocodazole trap’ assay, cells were synchronized inG1/S with hydroxyurea or thymidine and infected as describedabove. Four hours after infection, cells were further incubated for16 h in presence of nocodazole before FACS analysis.
The siRNA duplexes for p21 (CDKN1A Validated Stealth RNAi)and control duplexes (Stealth RNAi Negative Control MediumGC) were purchased from Invitrogen. Human Wee1 (GAGGCUGGAUGGAUGCAUU), human p27 (GCACUGCAGAGACAUGGAA and GGUUGCAUACUGAGCCAAG, which were used incombination to achieve efficient knock-down) and control siRNAduplexes containing symmetric 2-uracil 3′ overhangs weresynthesized by Eurogentec. One hundred pmols of siRNA wastransfected in 106 HeLa cells by electroporation with aGenePulser XCell apparatus (Bio-Rad) following the supplier’srecommendations.
When needed, cells were treated with 40 mg ml-1 CHX, 10 mMMG132, 10 mM lactacystin or 2 mM apicidin, all obtained fromSigma.
Real-time PCR
Total RNA was extracted using Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad). First-strand cDNA was synthesized from 500 ng RNA usingiScript cDNA synthesis Kit (Bio-Rad). Real-time PCR was per-formed on one-tenth cDNA product of the reaction volume (20 ml)as recommended by the supplier. Four hundred nM for eachprimer was combined with Power SYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems). Thermocycling conditions were as follows:1 cycle at 50°C for 2 min and 95°C for 10 min. Then, 40 cycles at95°C for 15 s and 60°C for 1 min. Gene expression values werenormalized against Cyclophilin A and were calculated based onthe comparative DCT method (Pfaffl, 2001). Primers selectedwere: p21waf1/Cip1, forward 5′-ACCCTAGTTCTACCTCAGGC-3′;reverse 5′-AAGATCTACTCCCCCATCAT-3′; Cyclophilin A,forward 5′-CCCACCGTGTTCTTCGACAT-3′; reverse 5′-TGCTGTCTTTGGGACCTTGTCT-3′.
Flow cytometry analyses
For BrdU staining, cells were treated for 22 h with 5 mg ml-1 BrdU(Sigma). Cells were collected by trypsination and fixed for 24 h at-20°C in 90% methanol, 10% phosphate-buffered saline (PBS).Cells were pelleted at 500 g for 5 min, then treated for 10 min onice with 1 ml of 0.1 M HCl, 0.5% Triton X-100. Five millilitres ofwater was added, the cells were pelleted, re-suspended in 2 mlwater and boiled for 10 min, then placed on ice for 10 min. Cellswere washed in PBS, 0.5% Triton X-100 and re-suspendedin PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20 solution containing FITC-conjugated anti-BrdU antibodies (5 mg ml-1; Pharmingen). Cellswere re-suspended in 400 ml of PBS, 1% BSA, 0.05% Tween20and analysed.
For DNA content analyses, cells were trypsinized, re-suspended in PBS and fixed in 70% ethanol overnight at -20°C.Cells were washed and re-suspended in PBS containing15 mg ml-1 propidium iodide and 100 mg ml-1 RNase A. MPM2staining was performed as described elsewhere (Sert et al., 1999).
Flow cytometry analyses were performed on a FACScaliburflow cytometer (Becton Dickinson), using the red (630 nm) laserfor DNA quantification and green (530 nm) laser for MPM2 andBrdU quantification. Data were analysed using FlowJo software
Cif stabilizes host CDK inhibitors 2505
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(Tree Star). Percentage of G1, S and G2 populations were calcu-lated using the Watson-pragmatic and the Dean-Jett-Fox models;Percentage of mitotic cell was calculated by quadrant method as4N DNA content and MPM-2-positive cells.
Western blot analyses
For Western blot analyses, 6 ¥ 105 cells were lysed in 80 ml of 2¥Laemmli loading buffer, sonicated for 2 s to shear DNA and thenboiled for 5 min. For kinetic experiments, cells were lysed usingMammalian Protein Extraction Reagent (Pierce) and proteinswere quantified using the Bradford method. Protein sampleswere resolved on 4–12% NuPage gradient gels (Invitrogen) andblotted on PVDF membranes. Membranes were blocked in TBST(10 mM Tris pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) 10% non-fatdry milk, then probed with primary antibody (0.5 mg ml-1) in TBST5% non-fat dry milk. Primary antibodies were: anti-actin (ICN),anti-p21, anti-p27 (Santa Cruz Biotechnology), anti-Wee1 (CellSignaling Technology), anti-HA (Upstate). Bound antibodies werevisualized with horseradish peroxidase-conjugated secondaryantibody. Acquisitions were performed with a Molecular ImagerChemiDoc XRS System (Bio-Rad). Proteins were quantified withQuantity One software (Bio-Rad) and normalized with actin level.
Acknowledgements
We are grateful to Prof. B. Ducommun (Université Paul Sabatier,Toulouse, France) for helpful discussions and for providing uswith DLD-1 cell lines and to Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins,University School of Medicine, Baltimore, USA) for kindly provid-ing us with HCT116 cell lines. We thank Dr. M. Gallois for sug-gestions on real-time PCR. A.S.L. is the recipient of a fellowshipfrom the French ministry of research. G.J. and this work weresupported by a grant ‘Microbiologie-Immunologie’ from theAgence Nationale pour la Recherche and by a grant from theLigue Nationale Contre le Cancer.
References
Abramovitch, R.B., Janjusevic, R., Stebbins, C.E., andMartin, G.B. (2006) Type III effector AvrPtoB requires intrin-sic E3 ubiquitin ligase activity to suppress plant cell deathand immunity. Proc Natl Acad Sci USA 103: 2851–2856.
Alevizopoulos, K., Catarin, B., Vlach, J., and Amati, B. (1998)A novel function of adenovirus E1A is required to overcomegrowth arrest by the CDK2 inhibitor p27 (Kip1). EMBO J17: 5987–5997.
Amini, S., Saunders, M., Kelley, K., Khalili, K., and Sawaya,B.E. (2004) Interplay between HIV-1 Vpr and Sp1 modu-lates p21 (WAF1) gene expression in human astrocytes.J Biol Chem 279: 46046–46056.
Azuma, A., Matsuo, A., Suzuki, T., Kurosawa, T., Zhang, X.,and Aida, Y. (2006) Human immunodeficiency virus type 1Vpr induces cell cycle arrest at the G(1) phase and apop-tosis via disruption of mitochondrial function in rodent cells.Microbes Infect 8: 670–679.
Blagosklonny, M.V., Wu, G.S., Omura, S., and el-Deiry, W.S.(1996) Proteasome-dependent regulation of p21WAF1/CIP1 expression. Biochem Biophys Res Commun 227:564–569.
Bunz, F., Dutriaux, A., Lengauer, C., Waldman, T., Zhou, S.,Brown, J.P., et al. (1998) Requirement for p53 and p21 tosustain G2 arrest after DNA damage. Science 282: 1497–1501.
Cayrol, C., and Ducommun, B. (1998) Interaction with cyclin-dependent kinases and PCNA modulates proteasome-dependent degradation of p21. Oncogene 17: 2437–2444.
Cayrol, C., Knibiehler, M., and Ducommun, B. (1998) p21binding to PCNA causes G1 and G2 cell cycle arrest inp53-deficient cells. Oncogene 16: 311–320.
Charpentier, X., and Oswald, E. (2004) Identification of thesecretion and translocation domain of the enteropatho-genic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif,using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-basedreporter. J Bacteriol 186: 5486–5495.
Chowdhury, I.H., Wang, X.F., Landau, N.R., Robb, M.L.,Polonis, V.R., Birx, D.L., and Kim, J.H. (2003) HIV-1 Vpractivates cell cycle inhibitor p21/Waf1/Cip1: a potentialmechanism of G2/M cell cycle arrest. Virology 305: 371–377.
el-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E., Levy, D.B.,Parsons, R., Trent, J.M., et al. (1993) WAF1, a potentialmediator of p53 tumor suppression. Cell 75: 817–825.
Dulic, V., Beney, G.E., Frebourg, G., Drullinger, L.F., andStein, G.H. (2000) Uncoupling between phenotypic senes-cence and cell cycle arrest in aging p21-deficient fibro-blasts. Mol Cell Biol 20: 6741–6754.
Evers, B.M. (1999) Intestinal cell differentiation: cellularmechanisms and the search for the perfect model focuson ‘involvement of p21 (WAF1/Cip1) and p27 (Kip1) inintestinal epithelial cell differentiation’. Am J Physiol 276:C1243–C1244.
Fenteany, G., Standaert, R.F., Lane, W.S., Choi, S., Corey,E.J., and Schreiber, S.L. (1995) Inhibition of proteasomeactivities and subunit-specific amino-terminal threoninemodification by lactacystin. Science 268: 726–731.
de La Fuente, C., Santiago, F., Chong, S.Y., Deng, L.,Mayhood, T., Fu, P., et al. (2000) Overexpression ofp21(waf1) in human T-cell lymphotropic virus type1-infected cells and its association with cyclin A/cdk2.J Virol 74: 7270–7283.
Gabastou, J.M., Kerneis, S., Bernet-Camard, M.F., Barbat,A., Coconnier, M.H., Kaper, J.B., and Servin, A.L. (1995)Two stages of enteropathogenic Escherichia coli intestinalpathogenicity are up and down-regulated by the epithelialcell differentiation. Differentiation 59: 127–134.
Gartel, A.L. (2006) Is p21 an oncogene? Mol Cancer Ther 5:1385–1386.
Gartel, A.L., and Tyner, A.L. (2002) The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in apoptosis. Mol CancerTher 1: 639–649.
Gartel, A.L., Goufman, E., Najmabadi, F., and Tyner, A.L.(2000) Sp1 and Sp3 activate p21 (WAF1/CIP1) gene tran-scription in the Caco-2 colon adenocarcinoma cell line.Oncogene 19: 5182–5188.
Han, J.W., Ahn, S.H., Park, S.H., Wang, S.Y., Bae, G.U.,Seo, D.W., et al. (2000) Apicidin, a histone deacetylaseinhibitor, inhibits proliferation of tumor cells via inductionof p21WAF1/Cip1 and gelsolin. Cancer Res 60: 6068–6074.
Harper, J.W., Elledge, S.J., Keyomarsi, K., Dynlacht, B., Tsai,
2506 A. Samba-Louaka et al.
© 2008 The AuthorsJournal compilation © 2008 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 10, 2496–2508
L.H., Zhang, P., et al. (1995) Inhibition of cyclin-dependentkinases by p21. Mol Biol Cell 6: 387–400.
He, J., Choe, S., Walker, R., Di Marzio, P., Morgan, D.O., andLandau, N.R. (1995) Human immunodeficiency virus type1 viral protein R (Vpr) arrests cells in the G2 phase of thecell cycle by inhibiting p34cdc2 activity. J Virol 69: 6705–6711.
Heron-Milhavet, L., Franckhauser, C., Rana, V., Berthenet,C., Fisher, D., Hemmings, B.A., et al. (2006) Only Akt1is required for proliferation, while Akt2 promotes cell cycleexit through p21 binding. Mol Cell Biol 26: 8267–8280.
Hsieh, F.F., Barnett, L.A., Green, W.F., Freedman, K., Matus-hansky, I., Skoultchi, A.I., and Kelley, L.L. (2000) Cell cycleexit during terminal erythroid differentiation is associatedwith accumulation of p27 (Kip1) and inactivation of cdk2kinase. Blood 96: 2746–2754.
Iwai, H., Kim, M., Yoshikawa, Y., Ashida, H., Ogawa, M.,Fujita, Y., et al. (2007) A bacterial effector targets Mad2L2,an APC inhibitor, to modulate host cell cycling. Cell 130:611–623.
Kim, D.W., Lenzen, G., Page, A.L., Legrain, P., Sansonetti,P.J., and Parsot, C. (2005a) The Shigella flexneri effectorOspG interferes with innate immune responses by target-ing ubiquitin-conjugating enzymes. Proc Natl Acad SciUSA 102: 14046–14051.
Kim, H., Kokkotou, E., Na, X., Rhee, S.H., Moyer, M.P.,Pothoulakis, C., and Lamont, J.T. (2005b) Clostridiumdifficile toxin A-induced colonocyte apoptosis involvesp53-dependent p21 (WAF1/CIP1) induction via p38mitogen-activated protein kinase. Gastroenterology 129:1875–1888.
Koff, A., and Polyak, K. (1995) p27KIP1, an inhibitor ofcyclin-dependent kinases. Prog Cell Cycle Res 1: 141–147.
Lee, D.H., and Goldberg, A.L. (1998) Proteasome inhibitors:valuable new tools for cell biologists. Trends Cell Biol 8:397–403.
Marches, O., Ledger, T.N., Boury, M., Ohara, M., Tu, X.,Goffaux, F., et al. (2003) Enteropathogenic and entero-haemorrhagic Escherichia coli deliver a novel effectorcalled Cif, which blocks cell cycle G2/M transition. MolMicrobiol 50: 1553–1567.
Mueller, P.R., Coleman, T.R., and Dunphy, W.G. (1995) Cellcycle regulation of a Xenopus Wee1-like kinase. Mol BiolCell 6: 119–134.
Niculescu, A.B., 3rd, Chen, X., Smeets, M., Hengst, L.,Prives, C., and Reed, S.I. (1998) Effects of p21 (Cip1/Waf1) at both the G1/S and the G2/M cell cycle transitions:pRb is a critical determinant in blocking DNA replicationand in preventing endoreduplication. Mol Cell Biol 18: 629–643.
Nougayrede, J.P., Boury, M., Tasca, C., Marches, O., Milon,A., Oswald, E., and De Rycke, J. (2001) Type III secretion-dependent cell cycle block caused in HeLa cells byenteropathogenic Escherichia coli O103. Infect Immun 69:6785–6795.
Nougayrede, J.P., Taieb, F., De Rycke, J., and Oswald, E.(2005) Cyclomodulins: bacterial effectors that modulatethe eukaryotic cell cycle. Trends Microbiol 13: 103–110.
Nougayrede, J.P., Homburg, S., Taieb, F., Boury, M., Brzusz-kiewicz, E., Gottschalk, G., et al. (2006) Escherichia coli
induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells.Science 313: 848–851.
Oswald, E., Nougayrede, J.P., Taieb, F., and Sugai, M.(2005) Bacterial toxins that modulate host cell-cycle pro-gression. Curr Opin Microbiol 8: 83–91.
Peres, S.Y., Marches, O., Daigle, F., Nougayrede, J.P.,Herault, F., Tasca, C., et al. (1997) A new cytolethal dis-tending toxin (CDT) from Escherichia coli producing CNF2blocks HeLa cell division in G2/M phase. Mol Microbiol 24:1095–1107.
Pfaffl, M.W. (2001) A new mathematical model for relativequantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29:e45.
Philipp-Staheli, J., Kim, K.H., Liggitt, D., Gurley, K.E.,Longton, G., and Kemp, C.J. (2004) Distinct roles for p53,27Kip1, and p21Cip1 during tumor development. Onco-gene 23: 905–913.
Polyak, K., Kato, J.Y., Solomon, M.J., Sherr, C.J., Massague,J., Roberts, J.M., and Koff, A. (1994) p27Kip1, a cyclin-Cdkinhibitor, links transforming growth factor-beta and contactinhibition to cell cycle arrest. Genes Dev 8: 9–22.
Re, F., Braaten, D., Franke, E.K., and Luban, J. (1995)Human immunodeficiency virus type 1 Vpr arrests the cellcycle in G2 by inhibiting the activation of p34cdc2-cyclin B.J Virol 69: 6859–6864.
Rytkonen, A., and Holden, D.W. (2007) Bacterial interferenceof ubiquitination and deubiquitination. Cell Host Microbe 1:13–22.
Rytkonen, A., Poh, J., Garmendia, J., Boyle, C., Thompson,A., Liu, M., et al. (2007) SseL, a Salmonella deubiquitinaserequired for macrophage killing and virulence. Proc NatlAcad Sci USA 104: 3502–3507.
Sert, V., Cans, C., Tasca, C., Bret-Bennis, L., Oswald, E.,Ducommun, B., and De Rycke, J. (1999) The bacterialcytolethal distending toxin (CDT) triggers a G2 cell cyclecheckpoint in mammalian cells without preliminary induc-tion of DNA strand breaks. Oncogene 18: 6296–6304.
Steinhilb, M.L., Turner, R.S., and Gaut, J.R. (2001) The pro-tease inhibitor, MG132, blocks maturation of the amyloidprecursor protein Swedish mutant preventing cleavage bybeta-Secretase. J Biol Chem 276: 4476–4484.
Taieb, F., Nougayrede, J.P., Watrin, C., Samba-Louaka, A.,and Oswald, E. (2006) Escherichia coli cyclomodulin Cifinduces G arrest of the host cell cycle without activationof the DNA-damage checkpoint-signalling pathway. CellMicrobiol 8: 1910–1921.
Tian, J.Q., and Quaroni, A. (1999) Involvement of p21(WAF1/Cip1) and p27 (Kip1) in intestinal epithelial cell dif-ferentiation. Am J Physiol 276: C1245–C1258.
Waldman, T., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1995) p21 isnecessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancercells. Cancer Res 55: 5187–5190.
Watanabe, N., Broome, M., and Hunter, T. (1995) Regulationof the human WEE1Hu CDK tyrosine 15-kinase during thecell cycle. EMBO J 14: 1878–1891.
Watanabe, N., Arai, H., Nishihara, Y., Taniguchi, M., Hunter,T., and Osada, H. (2004) M-phase kinases inducephospho-dependent ubiquitination of somatic Wee1 bySCFbeta-TrCP. Proc Natl Acad Sci USA 101: 4419–4424.
Watanabe, N., Arai, H., Iwasaki, J., Shiina, M., Ogata, K.,Hunter, T., and Osada, H. (2005) Cyclin-dependent kinase
Cif stabilizes host CDK inhibitors 2507
© 2008 The AuthorsJournal compilation © 2008 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 10, 2496–2508
(CDK) phosphorylation destabilizes somatic Wee1 via mul-tiple pathways. Proc Natl Acad Sci USA 102: 11663–11668.
Yokoyama, K., Higashi, H., Ishikawa, S., Fujii, Y., Kondo, S.,Kato, H., et al. (2005) Functional antagonism betweenHelicobacter pylori CagA and vacuolating toxin VacA incontrol of the NFAT signaling pathway in gastric epithelialcells. Proc Natl Acad Sci USA 102: 9661–9666.
Zhou, B.B., and Elledge, S.J. (2000) The DNA damageresponse: putting checkpoints in perspective. Nature 408:433–439.
Zhou, H., Monack, D.M., Kayagaki, N., Wertz, I., Yin, J., Wolf,B., and Dixit, V.M. (2005) Yersinia virulence factor YopJacts as a deubiquitinase to inhibit NF-kappa B activation.J Exp Med 202: 1327–1332.
2508 A. Samba-Louaka et al.
© 2008 The AuthorsJournal compilation © 2008 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 10, 2496–2508
87
IV- Article 3 :
The EPEC effector Cif induces delayed apoptosis in epithelial cells
Ascel Samba-Louaka, Jean-Philippe Nougayrède, Claude Watrin, Eric Oswald et Frédéric
Taieb.
Infection and immunity (2009), sous presse.
A travers les deux premiers articles, nous avons cherché à déterminer le mode d’action
de Cif pour arrêter la progression du cycle cellulaire. Ce troisième article met en évidence un
nouveau phénotype cellulaire provoqué par Cif. Il s’agit de la mort cellulaire.
Les effets provoqués par Cif sont irréversibles. En effet, après l’arrêt du cycle cellulaire, Cif
se caractérise par une induction importante de la mort cellulaire notamment dans les cellules
épithéliales non transformées. Pour cette étude nous avons choisi d’utiliser des cellules issues
de cryptes intestinales. En effet, même si ce modèle ne peut être comparé à un modèle in vivo,
ce type cellulaire représente un contexte plus proche du site de colonisation des EPEC.
L’étude des différents marqueurs tels que la fixation à l’annexine V, l’activation des caspases
ou le clivage de la caspase-3 nous indique une mort par apoptose. Sur les cellules utilisées
(IEC-6), la mort intervient à 48 h post infection c’est à dire 24 h après l’arrêt du cycle
cellulaire (Taieb et al., 2006). Comme pour l’effet cytostatique, Cif a besoin de son site
catalytique pour provoquer cette apoptose tardive. De même, la présence de cofacteurs
bactériens n’est pas nécessaire pour l’effet pro-apoptotique de Cif.
La survenue de l’apoptose après l’arrêt du cycle cellulaire est également observée dans les
cellules HeLa. Toutefois, il existe une différence de cinétique dans la survenue de l’apoptose.
S’il suffit de deux jours pour observer la mort des cellules IEC-6, il faut attendre deux jours
de plus pour les cellules HeLa. Cette différence pourrait résulter du statut de la protéine p53
qui à la fois arrête le cycle via la transcription de p21 et induit l’apoptose par la transcription
des gènes pro-apoptiques comme bax, puma et noxa (Murray-Zmijewski et al., 2008). Dans
les cellules HeLa, la protéine E6 codée par un papillomavirus fixe et ubiquitine la protéine
p53 qui est donc rapidement dégradée (Scheffner et al., 1990). Ainsi, la signalisation induite
par p53 est déficiente dans ces cellules. Le fait que certaines protéines pro-apoptotiques (dont
la transcription dépend de p53) ne soient pas induites dans les cellules HeLa contribuerait à
retarder la survenue de l’apoptose.
88
Ce résultat laisse entrevoir la possibilité selon laquelle l’effet cyclomoduline de Cif ne
pourrait être qu’une étape intermédiaire dans la mise en place de l’apoptose. D’autre part,
l’induction de l’apoptose en cas d’incapacité à réparer des dommages cellulaires, pourrait
représenter une nouvelle propriété des cyclomodulines. Au delà d’un simple effet pro- ou
anti- prolifératif, Cif dévoile un rôle plus complexe des cyclomodulines selon le type
cellulaire et le contexte génétique étudié. Cette étude permet donc de proposer un autre rôle
potentiel de Cif dans la pathogénie des EPEC ou des autres espèces bactériennes.
1
The EPEC effector Cif induces delayed apoptosis in epithelial cells 1
2
3
Ascel Samba-Louaka,1,2
Jean-Philippe Nougayrède, 1,2
Claude Watrin, 1,2
Eric Oswald, 1,2
and 4
Frédéric Taieb1,2
* 5
6 1INRA, UMR1225, F-31076 Toulouse, France 7
2Université de Toulouse, ENVT, UMR 1225, F-31076 Toulouse, France 8
9
* Corresponding author: E-mail: [email protected] 10
11
12
13
Abstract 14
The cycle inhibiting factor (Cif) belongs to a family of bacterial toxins, the cyclomodulins, 15
which modulate the host cell cycle. Upon injection into the host cell by the type III secretion 16
system of enteropathogenic Escherichia coli, Cif induces both G2 and G1 cell cycle arrests. 17
The cell cycle arrests correlate with the accumulation of p21waf1
and p27kip1
proteins that 18
inhibit CDK-cyclin complexes whose activation is required for G1/S and G2/M transitions. 19
Increase of p21 and p27 levels is independent of p53 transcriptional induction and results 20
from protein stabilization through inhibition of the ubiquitin/proteasome degradation 21
pathway. In this study, we show that Cif does not only induce cell cycle arrest but eventually 22
provokes a delayed cell death. Indeed, 48 hours after infection with EPEC expressing Cif, 23
cultured IEC-6 intestinal cells were positive with the extra-cellular binding of annexin V, 24
exhibited a high level of the cleaved caspase-3 and lactate dehydrogenase release, indicating 25
evidence of apoptosis. Cif was necessary and sufficient for inducing this late apoptosis and 26
the cysteine residue of the catalytic site was required for Cif activity. These results highlight a 27
more complex role of Cif than previously thought as a cyclomodulin but also as an apoptosis 28
inducer. 29
Copyright © 2009, American Society for Microbiology and/or the Listed Authors/Institutions. All Rights Reserved.Infect. Immun. doi:10.1128/IAI.00860-09 IAI Accepts, published online ahead of print on 28 September 2009
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Introduction 30
31
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) constitutes a major cause of severe infant 32
diarrhoea in developing countries (25). Infection of intestinal epithelial cells with EPEC 33
produces a characteristic histopathological feature known as “attaching and effacing” (A/E) 34
lesion. This lesion is characterized by intimate bacterial attachment, formation of an actin-rich 35
pedestal structure and localized destruction of the brush border microvilli (15, 16). This 36
bacterial attachment is detected in vitro through the use of the fluorescent actin-staining 37
(FAS) test (15). The genes required for the formation of the A/E lesions are clustered on the 38
pathogenic island named the locus of enterocyte effacement (LEE), which codes for a type III 39
secretion system (T3SS), a molecular syringe that allows translocation into the host cell up to 40
40 effector proteins that subvert eukaryotic cellular pathways for pathogen benefit (20, 21). 41
The LEE does not encode all genes necessary for the EPEC virulence. Indeed, the cycle 42
inhibiting factor, Cif, belongs to a repertoire of proteins that use the T3SS to be injected into 43
the host cell (19). The cif gene is located on a lambdoid prophage found in the chromosome 44
of some EPEC and EHEC strains (18, 19). The protein Cif is composed of an exchangeable 45
N-terminal domain that is necessary for its secretion and translocation through the T3SS (2). 46
Cif displays substantial structural and functional homology with four putative proteins found 47
in pathogenic and symbiotic bacteria. The crystal structure of different homologs of Cif and 48
the presence of a conserved catalytic triad (Cys109-His165-Gln185) suggest that Cif belongs 49
to a superfamily of cysteine proteases, transglutaminases and acetyltransferases (5, 12, 13, 50
35). Upon translocation in HeLa cell, Cif triggers a cytopathic effect characterized by stress 51
fibers and focal adhesions formation and cell cycle arrest at both G1/S and G2/M transitions 52
depending on the stage of cells in the cell cycle during the infection (19, 26, 32). The 53
cytostatic effect induced by Cif is independent of the cell type and p53 status (34) and is 54
correlated with stabilization of p21waf1
and p27kip1
proteins that regulate the host cell cycle 55
(32). Any mutation of the residues of the catalytic triad abrogates the Cif-associated 56
cytopathic effect and suppresses p21 and p27 accumulations confirming that the activity of 57
Cif is dependent on the intact enzymatic site of the protein (13, 15, 34). 58
In the present study, we investigated the fate of untransformed intestinal epithelial (IEC-6) 59
cells exposed to Cif protein beyond cell cycle arrest. We demonstrated that Cif induced a cell 60
death corresponding to apoptosis. This effect was a late event and needed a functional 61
catalytic site of Cif. The cytopathic effect of Cif in vitro could consist of two steps; cell cycle 62
arrest and eventually cell death. 63
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Materials and methods 64
Cell lines, bacterial strains and plasmids 65
Small intestine epithelial cells from Rattus norvegicus IEC-6 (CRL-1592) were maintained in 66
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM GlutaMax, Invitrogen) supplemented with 67
10% fetal bovine serum (FBS), 80 µg ml-1
gentamicin and bovine insulin (0.1 units ml-1
; 68
Sigma) at 37°C in 5% CO2 atmosphere. 69
The EPEC strains used were rabbit EPEC O103 strain E22 and human EPEC O111 strain 70
B171-8. The mutant strains E22cif::frt (E22∆Cif) and B171cif::frt (B171∆Cif) were 71
previously described (19, 32, 34). 72
Plasmids pEL3 (pCifwt) and pGJ715 (pCifC109A) were previously described (32). 73
74
Infection and cell treatments 75
For infection experiments, bacterial strains were cultured overnight in Luria-Bertani (LB) 76
broth then diluted 1:20 in DMEM supplemented with 25mM Hepes and 5% FBS for 2 h at 77
37°C. IEC-6 cells were washed 3 times in Hank’s balanced salt solution (HBSS; Invitrogen) 78
and infected for 2 h in DMEM supplemented with 25mM Hepes and 5% FBS medium with a 79
multiplicity of infection (MOI) of 50 bacteria per cells. After infection, cells were washed 3 80
times in HBSS and incubated in the growth medium supplemented with 200 µg mL-1
81
gentamicin. 82
For BioPORTER
assays (Genlantis), 80 µl (250 µg mL-1
) of purified Cif (or PBS for 83
negative control) was added to one BioPORTER tube and resuspended in 920 µL of DMEM. 84
The samples were added to the cells for 4 h before being replaced by fresh growth medium. 85
86
Immunofluorescence microscopy 87
Cells cultured in chamber slides (Labteks, Becton Dickinson) were fixed with 3.6% 88
formaldehyde for 15 minutes at room temperature and were permeabilized for 5 minutes in 89
PBS with 0.1% Triton X-100. Then, cells were incubated with rhodamine-phalloidin 90
(Molecular Probes) to stain F-actin and with DAPI (Sigma) to stain DNA. Images were 91
acquired with a DMRB fluorescence microscope equipped with a DFC300FX digital camera 92
(Leica). 93
94
Lactate dehydrogenase (LDH) release assay 95
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Twenty-four, fourty-eight and seventy-two hours after infection, the supernatant medium 96
from infected cells was collected and the LDH released was measured with the Cytotoxicity 97
Detection Kit Plus
(LDH) from Roche. Absorbances at 492 nm and 690 nm were measured in a 98
microplate reader (TECAN Infinite M200). The number of cells was evaluated by manual 99
counting under microscope. We made a ratio between raw data of absorbance and cell number 100
to integrate effect of the cell number on the level of LDH released. 101
102
Assay for quantification of exposure of phosphatidylserine on the outer leaflet 103
Cells were treated with annexin V conjugated to FITC (fluorescein-isothiocyanate) according 104
manufacturer’s recommendations (Annexin V-FITC; Miltenyi Biotec). Briefly, 106 cells were 105
washed with the binding buffer by centrifugation at 300 g for 10 minutes. Ten µl of Annexin 106
V-FITC was added in 100 µl of cell suspension for 15 minutes at room temperature. Cells 107
were washed again and incubated with 0.5 µg of propidium iodide (PI). Acquisitions were 108
performed on a FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson) and data were analyzed 109
using FlowJo software (Tree Star). Cells with intact membrane do not incorporate PI. Cells in 110
late apoptosis or necrosis lost membrane integrity and retained both annexin V and PI; viable 111
cells were negative for both staining and early apoptotic cells were positive for annexin V and 112
negative for PI staining. 113
114
Assessment of caspases activation into IEC-6 cells 115
We evaluate caspase activation in cells with a kit (CaspaTagTM
Pan-caspase In situ Assay kit, 116
Fluorescein; Chemicon international), which uses peptide inhibitor of caspase that produces a 117
green fluorescence. IEC-6 cells were infected or not (control) for 2h with wild-type EPEC 118
E22 strain (EPECwt), deleted for the cif gene (EPEC ∆Cif) or complemented with plasmid 119
coding for Cif (EPEC ∆Cif +pCifwt). According to manufacturer’s recommendations, cells 120
were treated with the FLICA (Fluorochrome Inhibitors of Caspases) reagent for 1 h at 37°C 121
under 5% CO2. After 4 washes, cells were re-suspended in washing buffer and measurements 122
performed on a FACScalibur flow cytometer (Becton Dickinson) and data were analyzed 123
using FlowJo software (Tree Star). 124
125
Western blot analysis 126
For western blot analyses, approximatively 6x105 cells were lysed in 80 µl of Laemmli 127
loading buffer (Bio-rad), sonicated for 2 seconds to shear DNA and then boiled for 5 minutes. 128
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Proteins were resolved on 4-12% NuPage gradient gels (Invitrogen) and transferred to PVDF 129
membranes. The membranes were saturated in TBST (10mM Tris pH 7.8, 150mM NaCl, 130
0.1% Tween20) 10% non-fat dry milk then probed with primary antibodies in TBST, 5% non-131
fat dry milk. Primary antibodies were: anti-actin (ICN), anti- cleaved caspase-3 (Cell 132
signalling Technology), anti-p21 (Santa Cruz Biotechnology). Bound antibodies were 133
visualized with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. Acquisitions were 134
performed with a molecular imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad). 135
136
Statistical analysis 137
Analyses were made using a two-way ANOVA with Bonferroni post-test (GraphPad Prism 138
IV software). Statistical significance was established at p < 0.05. 139
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Results 140
141
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adhere to IEC-6 cells and form A/E lesions 142
Prior to study the effects of EPEC infection on intestinal IEC-6 cells, we have assessed the 143
potential of EPEC to induce a fluorescence actin staining (FAS) effect that testifies for the 144
presence of a functional T3SS and effective bacterial adhesion. Cells infected with the wild-145
type EPEC displayed spots of fluorescence of actin that correspond to attachment of bacteria 146
to the cells (15). This phenotype does not depend on the cif gene since its mutation does not 147
impair the ability of bacteria to adhere on cells (data not shown). As expected, the strain 148
mutated in escN gene (type III secretion deficient) were unable to induce such a pattern of 149
actin condensation (data not shown). 150
151
EPEC strains expressing Cif induce a delayed cell death of host cells 152
Our previous work demonstrated that infection of cells with bacteria expressing Cif leads to 153
cell cycle arrests (19, 32). In order to evaluate the outcome of arrested cells, we examined 154
their viability through the release of the lactate dehydrogenase (LDH). The LDH is released 155
from dying cells in the cell medium. As shown in figure 1, non-infected (control) cells 156
released a basal level of LDH after 24h that could result from cell death at confluence. In 157
contrast, we have observed a high level of release of LDH with cells infected with EPECwt. 158
This effect was more pronounced 48h and 72h after infection. The protein Cif was 159
specifically implicated in induction of the cell death since its deletion (EPEC∆Cif) suppressed 160
the LDH release. Cell death was restored by complementation with cif-encoding plasmid 161
(EPEC∆Cif+pCifwt). However, complementation with a plasmid encoding for Cif mutated on 162
its catalytic cysteine (EPEC∆Cif+pCifC109A) does not provoke the LDH release as observed 163
with Cifwt (figure 1). This result shows that Cif requires an intact catalytic site to induce a 164
delayed cell death on IEC-6 cells. 165
166
EPEC strains expressing Cif induced apoptosis of IEC-6 cells 167
The release of LDH by IEC-6 cells following infection could result from oncosis (necrosis) or 168
secondary necrosis (a process that occurs in vitro in which late stage apoptotic cells that failed 169
to be engulfed by phagocytes undergo necrosis) (33). In order to assess the type of cell death 170
induced by Cif, we used FLICA to quantify apoptosis through detection of activated caspases. 171
As in control cells, infection by EPEC∆Cif leaded to a percentage of cells with activated 172
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caspases of about 5%. However, EPECwt infection induced a substantial increase of caspase-173
activated cells that reached a maximum at 48h. The complemented strain induced a similar 174
increase, strengthening the role of Cif in caspase activation (Table 1). As with LDH, the level 175
of activation of caspases was more pronounced 48h after infection. 176
We further analyzed the accumulation of cleaved caspase-3 that is characteristic of apoptotic 177
cells (17). Infection with EPEC expressing wild-type Cif leaded to accumulation of cleaved 178
caspase-3. This accumulation correlated with the Cif-dependent increase of the level of 179
p21waf1
(figure 2A) (32). Twenty-four hours after infection, the level of cleaved caspase-3 in 180
cells infected with EPECwt was weaker than in EPEC∆Cif+pCifwt probably reflecting a dose-181
effect of Cif as pCifwt is a multicopy plasmid. In both cases, a maximum level of cleaved 182
caspase-3 was reached 48h after infection. The apoptosis observed was not restricted to the 183
rabbit EPEC E22 strain. We also observed accumulation of cleaved caspase-3 with the typical 184
human EPEC strain B171-8 (figure 2B). In contrast to the infection with the E22 strain, a high 185
accumulation of cleaved caspase-3 was obtained as soon as 24h after infection with B171wt. 186
Another feature of apoptosis is phosphatidylserine exposure on the outer leaflet of the plasma 187
membrane. As described in figure 3A, early apoptotic cells are positive for annexin V (that 188
binds phosphatidylserine) and negative for propidium iodide staining (indicating that the 189
plasma membrane is not breached). The percentage of apoptotic cells obtained with E22∆Cif 190
was similar to control cells and increased when infection was done with the wild-type strain. 191
This effect was more pronounced with E22∆Cif+pCifwt and reached a maximum 48h post-192
infection (figure 3B). Infection with EPEC B171 strains also led to a significantly higher 193
percentage of apoptotic cells when the bacteria expressed Cifwt compared to B171∆Cif and 194
B171∆Cif+ pCifC109A at 24h, 48h and 72h following infection (figure 3C). However, several 195
differences were observed between the two EPEC strains. B171∆Cif but not E22∆Cif, 196
induced a significantly higher phosphatidylserine exposure compared to control cells 197
indicating a Cif-independent pro-apoptotic activity in B171. Over-expression of Cif by 198
B171∆Cif+pCifwt induced the highest percentage of cells with phosphatidylserine exposed at 199
24 h and further decreased at 48 h and 72 h after infection (figure 3C). Thus, the kinetic of 200
apoptosis was different between cells infected by E22 or B171. Such differences could be 201
partially explained by the different set of effectors expressed by these two EPEC strains. 202
203
Cif is sufficient to induce apoptosis of IEC-6 cells 204
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It was reported that different EPEC proteins could modulate cell death such as the Bundle-205
Forming Pili in B171 strain (1) or EspF effector (4). To ensure that Cif alone was able to 206
induce apoptosis, we delivered His-tag purified Cif or Cif C109A into cells through a lipid-207
based protein delivery system (BioPORTER®
) (34). The activity of Cif was confirmed by 208
accumulation of p21waf1
protein (figure 4). Cif induced an accumulation of cleaved caspase-3 209
48h after-infection. This effect was dependent on Cif catalytic domain since the level of 210
cleaved caspase-3 induced by Cif C109A was weaker than with wild-type Cif (figure 4). The 211
moderate increase of cleaved caspase-3 levels observed in non-treated cells and in those 212
treated with BioPORTER+PBS or BioPORTER+Cif C109A was likely due to cell 213
confluence. Together, these results demonstrate that Cif does not rely on EPEC cofactors to 214
induce a delayed apoptosis. 215
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Discussion 216
217
The EPEC effector Cif induces cell cycle arrest at both G1/S and G2/M of host cells (19, 32). 218
Thus, Cif is an inhibitory cyclomodulin, the growing family of bacterial effectors and toxins 219
that modulate the eukaryotic cell cycle (28, 29). This cytostatic effect is correlated with 220
stabilization of p21waf1
and p27kip1
cell cycle inhibitors (32). Since the arrest of cell 221
proliferation by Cif is irreversible, we investigated the fate of cells exposed to Cif. We found 222
that, in addition to its inhibitory cyclomodulin activity, Cif induced a cell death of host cells 223
characterized by activation of caspases, accumulation of cleaved caspase-3, exposure of the 224
phosphatidylserine on the outer leaflet and LDH release. These features were consistent with 225
apoptosis and occurred two days after infection. Previous studies on Cif were mostly 226
performed using the handy HeLa cell model and showed that Cif induces cell cycle arrest and 227
re-replication up to 72 h after infection. However, cell death was also evident in HeLa cells 228
after 72 h post-infection (data not shown). Here, we used intestinal epithelial IEC-6 cells that 229
are more relevant to the natural niche of EPEC infection. In contrast to HeLa cells, this non-230
transformed cell line is p53 positive. Since p53 is implicated in apoptosis pathway (22), the 231
difference of kinetic of cell death between these two cell lines is very likely dependent of the 232
genetic background of IEC-6 and HeLa cells, concerning at least p53. The effect of Cif could 233
consist in stopping the cell cycle before killing the host cell. This kind of effect is reminiscent 234
of the DNA damage response. This checkpoint activation leads to cell cycle arrest to allow 235
repairs of injury and if damages persist, cells undergo a cell death process by activation of 236
pro-apoptotic genes (23, 31). However, neither DNA damage nor the activation of the DNA 237
damage response were detected in cells in contact with Cif (34). Both cell cycle arrest and 238
apoptosis could also result from inhibition of proteosomal degradation pathway. Indeed, the 239
proteasome inhibitor Lactacystin induces cell cycle arrest at both G1/S and G2/M and 240
apoptosis of treated cells (7-9, 14). Since we found that Cif modulates protein stability 241
through inhibition of the ubiquitin/proteasome pathway as specifically as Lactacystin (32), 242
such Cif-subverted pathway is likely to eventually lead IEC-6 to cell death. 243
The induction of apoptosis by EspF of EPEC on epithelial cells, early after infection, has been 244
reported (3, 4, 27). This effect was independent from Cif since the EPEC reference strain 245
E2348/69 possesses a mutated cif gene (19). In contrast to Cif, the effect of EspF on apoptosis 246
occurs just after infection and persists till 6 h post-infection. Also, Crane et al. found that all 247
cells transfected with espF were killed after 48 h (4). However, infection of untransformed 248
IEC-6 cells could induce a different response compared to HeLa or T84 cell lines. Indeed, 249
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Nagai et al. observed that, in contrast to HeLa cells, the LDH assay conducted on T84 cell 250
monolayer gives no significant differences in the cytotoxicity induced by EPECwt and ∆espF 251
(24). 252
Another EPEC feature implicated in apoptosis of host cells rely on the presence of BFP 253
(bundle-forming pilus). As with EspF, BFP induced an early cell death as soon as 5 h post-254
infection (1). In our study, we observed a different response in induction of 255
phosphatidylserine exposure when we infected cells with atypical E22 (bfp-negative) and 256
typical B171-8 (bfp-positive) EPEC strains (figure 3C). The presence of BFP could have led 257
to the high annexin V staining (phosphatidylserine exposure) observed 24 h after-infection 258
with B171 strain regardless of the presence of Cif (figure 3C). However, the effect of Cif on 259
the induction of apoptosis was still observed within this bfp-positive bacterial strain. 260
Moreover, since delivery of purified Cif into the host cell by BioPORTER was able to induce 261
cleavage of caspase 3 (figure 4), we demonstrated that Cif alone was sufficient to induce 262
apoptosis, independently of EspF, BFP or other bacterial factors. 263
The role of induction of apoptosis remains difficult to understand in EPEC pathogenesis. A 264
recent study reported that induction of caspases was dispensable to increase paracellular 265
permeability in vivo (10). Another study reveals the ability of the EspF effector produced by 266
Citrobacter rodentium to induce cell death of intestinal cells in mice that correlates with high 267
mortality compared to EspF mutant (24). Our future work will evaluate the induction of 268
apoptosis by Cif in vivo. Indeed, expression of Cif or its mode of action could be influenced 269
by the presence of other effectors (6). The induction of p21waf1
by Cif in vivo must also be 270
studied. During the renewal of intestinal epithelium, cells migrate to lumen by proliferating, 271
differentiating before being extruded after apoptosis (30). Several data report that p21waf1
272
could induce or inhibit apoptosis (11). Thus, through p21waf1
Cif could inhibit cell turnover of 273
the intestinal epithelium by preventing proliferation and/or by inducing apoptosis and thus 274
favours bacterial colonization. If the role of Cif in bacterial virulence remains to be 275
understood, this study highlights a new facet of the cyclomodulin properties as apoptosis 276
inducer. 277
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Acknowledgements 278
279
Ascel SAMBA-LOUAKA was the recipient of a fellowship from the French ministry of 280
research. Work done in the authors laboratory was supported by a grant from the Agence 281
Nationale pour la Recherche (ANR-05-MIIM-009). We thank Dr. Maiwenn Olier-Pierre for 282
her help in statistical analysis. 283
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References 284 285
1. Abul-Milh, M., Y. Wu, B. Lau, C. A. Lingwood, and D. Barnett Foster. 2001. 286
Induction of epithelial cell death including apoptosis by enteropathogenic Escherichia 287
coli expressing bundle-forming pili. Infect Immun 69:7356-7364. 288
2. Charpentier, X., and E. Oswald. 2004. Identification of the secretion and 289
translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli 290
effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J 291
Bacteriol 186:5486-5495. 292
3. Crane, J. K., S. Majumdar, and D. F. Pickhardt, 3rd. 1999. Host cell death due to 293
enteropathogenic Escherichia coli has features of apoptosis. Infect Immun 67:2575-294
2584. 295
4. Crane, J. K., B. P. McNamara, and M. S. Donnenberg. 2001. Role of EspF in host 296
cell death induced by enteropathogenic Escherichia coli. Cell Microbiol 3:197-211. 297
5. Crow, A., P. R. Race, G. Jubelin, C. V. Chavez, J. M. Escoubas, E. Oswald, and 298
M. J. Banfield. 2009. Crystal structures of Cif from bacterial pathogens 299
Photorhabdus luminescens and Burkholderia pseudomallei. PLoS ONE. 300
6. Dean, P., and B. Kenny. 2009. The effector repertoire of enteropathogenic E. coli: 301
ganging up on the host cell. Curr Opin Microbiol 12:101-109. 302
7. Delic, J., P. Masdehors, S. Omura, J. M. Cosset, J. Dumont, J. L. Binet, and H. 303
Magdelenat. 1998. The proteasome inhibitor lactacystin induces apoptosis and 304
sensitizes chemo- and radioresistant human chronic lymphocytic leukaemia 305
lymphocytes to TNF-alpha-initiated apoptosis. Br J Cancer 77:1103-1107. 306
8. Fenteany, G., and S. L. Schreiber. 1998. Lactacystin, proteasome function, and cell 307
fate. J Biol Chem 273:8545-8548. 308
9. Fenteany, G., R. F. Standaert, G. A. Reichard, E. J. Corey, and S. L. Schreiber. 309
1994. A beta-lactone related to lactacystin induces neurite outgrowth in a 310
neuroblastoma cell line and inhibits cell cycle progression in an osteosarcoma cell 311
line. Proc Natl Acad Sci U S A 91:3358-3362. 312
10. Flynn, A. N., and A. G. Buret. 2008. Caspases-3, -8, and -9 are required for 313
induction of epithelial cell apoptosis by enteropathogenic E. coli but are dispensable 314
for increased paracellular permeability. Microb Pathog 44:311-319. 315
11. Gartel, A. L., and A. L. Tyner. 2002. The role of the cyclin-dependent kinase 316
inhibitor p21 in apoptosis. Mol Cancer Ther 1:639-649. 317
12. Hsu, Y., G. Jubelin, F. Taieb, J. P. Nougayrede, E. Oswald, and C. E. Stebbins. 318
2008. Structure of the cyclomodulin Cif from pathogenic Escherichia coli. J Mol Biol 319
384:465-477. 320
13. Jubelin, G., C. V. Chavez, F. Taieb, M. J. Banfield, A. Samba-Louaka, R. Nobe, 321
J. P. Nougayrede, R. Zumbihl, A. Givaudan, J. M. Escoubas, and E. Oswald. 322 2009. Cycle inhibiting factors (CIFs) are a growing family of functional 323
cyclomodulins present in invertebrate and mammal bacterial pathogens. PLoS ONE 324
4:e4855. 325
14. Katagiri, M., M. Hayashi, K. Matsuzaki, H. Tanaka, and S. Omura. 1995. The 326
neuritogenesis inducer lactacystin arrests cell cycle at both G0/G1 and G2 phases in 327
neuro 2a cells. J Antibiot (Tokyo) 48:344-346. 328
15. Knutton, S., T. Baldwin, P. H. Williams, and A. S. McNeish. 1989. Actin 329
accumulation at sites of bacterial adhesion to tissue culture cells: basis of a new 330
diagnostic test for enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. Infect 331
Immun 57:1290-1298. 332
at INR
A on O
ctober 9, 2009 iai.asm
.orgD
ownloaded from
13
16. Knutton, S., D. R. Lloyd, and A. S. McNeish. 1987. Adhesion of enteropathogenic 333
Escherichia coli to human intestinal enterocytes and cultured human intestinal 334
mucosa. Infect Immun 55:69-77. 335
17. Labbe, K., and M. Saleh. 2008. Cell death in the host response to infection. Cell 336
Death Differ 15:1339-1349. 337
18. Loukiadis, E., R. Nobe, S. Herold, C. Tramuta, Y. Ogura, T. Ooka, S. Morabito, 338
M. Kerouredan, H. Brugere, H. Schmidt, T. Hayashi, and E. Oswald. 2008. 339
Distribution, functional expression, and genetic organization of Cif, a phage-encoded 340
type III-secreted effector from enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia 341
coli. J Bacteriol 190:275-285. 342
19. Marches, O., T. N. Ledger, M. Boury, M. Ohara, X. Tu, F. Goffaux, J. Mainil, I. 343
Rosenshine, M. Sugai, J. De Rycke, and E. Oswald. 2003. Enteropathogenic and 344
enterohaemorrhagic Escherichia coli deliver a novel effector called Cif, which blocks 345
cell cycle G2/M transition. Mol Microbiol 50:1553-1567. 346
20. McDaniel, T. K., K. G. Jarvis, M. S. Donnenberg, and J. B. Kaper. 1995. A 347
genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial 348
pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A 92:1664-1668. 349
21. McDaniel, T. K., and J. B. Kaper. 1997. A cloned pathogenicity island from 350
enteropathogenic Escherichia coli confers the attaching and effacing phenotype on E. 351
coli K-12. Mol Microbiol 23:399-407. 352
22. Meulmeester, E., and A. G. Jochemsen. 2008. p53: a guide to apoptosis. Curr 353
Cancer Drug Targets 8:87-97. 354
23. Murray-Zmijewski, F., E. A. Slee, and X. Lu. 2008. A complex barcode underlies 355
the heterogeneous response of p53 to stress. Nat Rev Mol Cell Biol 9:702-712. 356
24. Nagai, T., A. Abe, and C. Sasakawa. 2005. Targeting of enteropathogenic 357
Escherichia coli EspF to host mitochondria is essential for bacterial pathogenesis: 358
critical role of the 16th leucine residue in EspF. J Biol Chem 280:2998-3011. 359
25. Nataro, J. P., and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol 360
Rev 11:142-201. 361
26. Nougayrede, J. P., M. Boury, C. Tasca, O. Marches, A. Milon, E. Oswald, and J. 362
De Rycke. 2001. Type III secretion-dependent cell cycle block caused in HeLa cells 363
by enteropathogenic Escherichia coli O103. Infect Immun 69:6785-6795. 364
27. Nougayrede, J. P., and M. S. Donnenberg. 2004. Enteropathogenic Escherichia coli 365
EspF is targeted to mitochondria and is required to initiate the mitochondrial death 366
pathway. Cell Microbiol 6:1097-1111. 367
28. Nougayrede, J. P., F. Taieb, J. De Rycke, and E. Oswald. 2005. Cyclomodulins: 368
bacterial effectors that modulate the eukaryotic cell cycle. Trends Microbiol 13:103-369
110. 370
29. Oswald, E., J. P. Nougayrede, F. Taieb, and M. Sugai. 2005. Bacterial toxins that 371
modulate host cell-cycle progression. Curr Opin Microbiol 8:83-91. 372
30. Potten, C. S. 1998. Stem cells in gastrointestinal epithelium: numbers, characteristics 373
and death. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 353:821-830. 374
31. Riley, T., E. Sontag, P. Chen, and A. Levine. 2008. Transcriptional control of 375
human p53-regulated genes. Nat Rev Mol Cell Biol 9:402-412. 376
32. Samba-Louaka, A., J. P. Nougayrede, C. Watrin, G. Jubelin, E. Oswald, and F. 377
Taieb. 2008. Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell cycle by stabilizing the 378
cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27. Cell Microbiol 10:2496-2508. 379
33. Silva, M. T., A. do Vale, and N. M. dos Santos. 2008. Secondary necrosis in 380
multicellular animals: an outcome of apoptosis with pathogenic implications. 381
Apoptosis 13:463-482. 382
at INR
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14
34. Taieb, F., J. P. Nougayrede, C. Watrin, A. Samba-Louaka, and E. Oswald. 2006. 383
Escherichia coli cyclomodulin Cif induces G2 arrest of the host cell cycle without 384
activation of the DNA-damage checkpoint-signalling pathway. Cell Microbiol 8:1910-385
1921. 386
35. Yao, Q., J. Cui, Y. Zhu, G. Wang, L. Hu, C. Long, R. Cao, X. Liu, N. Huang, S. 387
Chen, L. Liu, and F. Shao. 2009. A bacterial type III effector family uses the papain-388
like hydrolytic activity to arrest the host cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A 389
106:3716-3721. 390
391
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Figure legends 392
393
Figure 1: EPEC E22 strains expressing Cif induces the death of IEC-6 cells. Cells were 394
infected for 2h with EPEC wt, EPEC ∆Cif or EPEC ∆Cif complemented with plasmids 395
coding for wild-type Cif (pCifwt) or Cif C109A mutant (pCifC109A). Twenty-four, fourty-396
eight and seventy-two hours after infection, the culture supernatants were collected to 397
measure the LDH activity. Graphed data represent the means + standard errors of the mean 398
from three independent experiments. Data are significantly different (*: P < 0.05), (**: P < 399
0.001) compared with Control for each time point. 400
401
Figure 2: EPEC strains induce accumulation of cleaved caspase-3 in IEC-6 cells. (A) IEC-6 402
cells were infected 2h with EPEC E22 wild-type strain (E22wt), Cif-deleted mutant 403
(E22∆Cif) or E22∆Cif complemented with plasmids coding for wild-type Cif (pCif wt) or Cif 404
C109A mutant. After indicated times, cell extracts were probed with anti-p21, anti- cleaved 405
caspase-3 and anti-actin antibodies. (B) The same experiment was done with EPEC B171-8 406
wild-type strain (B171wt), Cif-deleted mutant (B171∆Cif) or B171∆Cif complemented with 407
plasmids coding for wild-type Cif (pCif wt) or Cif C109A mutant. 408
409
Figure 3: Cif induces exposure of phosphatidylserine on infected IEC-6 cells. (A) IEC-6 cells 410
were infected with EPEC B171∆Cif strain. Twenty four hours after infection, 411
phosphatidylserine exposure were analysed by flow cytometry as described in Material and 412
Methods. Viable, dead and apoptotic cell populations are indicated. (B) Cells were infected or 413
not (control) with indicated EPEC E22 strains and incubated for 24h, 48h and 72h. 414
Percentages of apoptotic cells (lower right quadrant in A) were measured. The experiment 415
was performed twice with similar results, only one experiment is shown. (C) Cells were 416
infected with the indicated EPEC B171 strains. The experiment was performed three times 417
and the results are shown as mean +/- standard errors of the mean. *: p < 0.05, **: p< 0.01, 418
***: p < 0.001. 419
420
Figure 4: Purified Cif induces apoptosis in IEC6 cells. IEC6 cells were left untreated (cont) 421
or were incubated with bioPORTER® + PBS, + H6-Cifwt or +H6-Cif C109A for 24h and 422
48h and cellular extracts were probed with indicated antibodies. p21 and cleaved-caspase 3 423
levels were quantified by densitometry with Quantity One software (Bio-Rad) and normalized 424
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with actin level. Relative levels of p21 and cleaved-caspase are shown as fold increase 425
compared to control cells at 24 hr. 426
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427
Table1: Percentage of positive cells for activation of caspases (see materials and methods) 428
429
Time
Conditions 24h 48h 72h
Control 5.0 5.9 5.4
EPEC wt 11.3 18.3 14.7
EPEC ∆Cif 5.0 8.6 6.5
EPEC ∆Cif+pCifwt 10.5 18.9 13.6
430
431
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3ème partie : Discussion et perspectives
111
I- Bilan des résultats
Le phénotype principal associé à la protéine Cif est sa capacité à arrêter la progression
du cycle cellulaire des cellules hôtes aux transitions G1/S et G2/M. Nous avons démontré que
Cif induit la stabilisation de deux CKIs p21 et p27. Ces deux protéines empêcheraient la
progression du cycle cellulaire à travers leur activité inhibitrice des complexes
CDKs/Cyclines. Toutefois, nos résultats suggèrent que d’autres acteurs du cycle cellulaire
pourraient être dérégulés par la toxine Cif. Nous avons également démontré qu’en plus de son
activité cyclomoduline, Cif induit l’apoptose des cellules cibles. Ainsi, l’arrêt du cycle
cellulaire ne serait qu’une étape vers la mort de la cellule. Dans les paragraphes suivants, je
discuterai principalement du mode d’action de Cif et de son rôle in vivo.
II- Le mode d’action de Cif
II.1 Le processus d’ubiquitinylation et son détournement par les
bactéries
L’ubiquitinylation est une modification post-traductionnelle des protéines qui consiste
à ajouter des molécules ubiquitines (polypeptide de 76 acides aminés) sur les résidus lysine
des protéines pour former des chaines d’ubiquitine (polyubiquitinylation). L’ubiquitine fait
intervenir quatre types d’enzyme : la protéine E1 (activatrice de l’ubiquitine), l’enzyme de
conjugaison de l’ubiquitine ou E2, et l’ubiquitine ligase ou E3 qui contient le site de
reconnaissance spécifique du substrat. S’il n’existe que quelques unités d’E1, quelques
dizaines d’E2, il existe par contre des centaines d’E3. Enfin, il existe plusieurs centaines
d’enzymes de déubiquitinylation (DUB) qui permettent d’ôter les molécules d’ubiquitine du
substrat (Wilkinson et al., 2005). L’ubiquitinylation contrôle principalement la protéolyse par
le protéasome mais aussi la localisation, l’adressage ou la conformation des protéines cibles
selon la longueur, la conformation des chaînes d’ubiquitine et les résidus lysine modifiés.
Finement régulée, notamment par l’action de multiples ubiquitines ligases, l’ubiquitinylation
est donc impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que le cycle cellulaire, la
transduction des signaux, la transcription ou la réplication de l’ADN (Petroski and Deshaies,
112
2005). Ainsi, pour moduler les voies de signalisations eucaryotes, les bactéries utilisent
différentes tactiques pour manipuler les voies d’ubiquitinylation ou de déubiquitinylation
(figure 12) (Angot et al., 2007; Rytkonen and Holden, 2007). Par exemple, en cas d’infection
bactérienne, une des réponses de l’hôte passe par la transcription des gènes pro-
inflammatoires médiée par la voie NF-B. Pour que le complexe NF-B (p50/p65) aille dans
le noyau activer les gènes impliqués dans l’inflammation, il faut que la protéine IB soit
phosphorylée, ubiquitinylée et dégradée (Moynagh, 2005). Pour éviter l’activation de cette
voie, les bactéries ont développé différentes parades. Par exemple chez Yersinia, l’effecteur
du SST3 YopJ bloque la dégradation de IB ubiquitinylée à travers une activité
déubiquitinylase (Zhou et al., 2005). Pour empêcher l’ubiquitinylation et donc la dégradation
de la même protéine IB (phosphorylée), Shigella flexneri utilise l’effecteur OspG qui se
fixe à une enzyme de conjugaison de l’ubiquitine (UbcH5 ubiquitinylée) (Kim et al., 2005).
UbcH5 est nécessaire à l’activité de l’ubiquitine ligase SCFTrCP (Skp1/Cullin1/F-box)
responsable de l’ubiquitinylation et donc de la dégradation de IB (Kroll et al., 1999).
La régulation du processus d’ubiquitinylation par Cif a été suggérée car la dégradation des
protéines p21 et de p27 fait intervenir ce mécanisme (Kamura et al., 2004; Bornstein et al.,
2003; Pagano et al., 1995).
II.2 La stabilisation des CKIs par Cif
II.2.1 Le Mécanisme
Tout comme YopJ, de nombreuses cystéines protéases ont une activité
déubiquitinylase (DUB). Les études ayant montrées que la structure de Cif ressemble à celle
des cystéines protéases, une des hypothèses est que Cif agirait comme une DUB pour
stabiliser p21 et p27. Cependant, à ce jour, aucune activité DUB ou cystéine protéase n’a pu
être mise en évidence avec Cif. De plus, l’absence d’efficacité de l’inhibiteur des cystéines
protéases E-64 ne plaide pas en cette faveur.
A défaut de stabiliser les protéines en enlevant les résidus ubiquitines, Cif pourrait, comme
OspG, stabiliser les CKIs en intervenant directement sur l’ajout de ces résidus.
L’identification de la cible de Cif a donc été mise en œuvre pour mettre en lumière le
partenaire cellulaire utilisé par Cif pour stabiliser les CKIs.
Figure 12 : Les protéines bactériennes qui interfèrent avec le système d’ubiquitinylation.
Après être injectés dans la cellule eucaryote, certains effecteurs (en marron) inhibent des
étapes spécifiques de la voie d’ubiquitinylation comme l’inhibition de l’enzyme E2 par OspG
(Shigella flexneri) ou la dé-ubiquitinylation des substrats avec YopJ (Yersinia
pseudotuberculosis), YopP (Yersinia enterocolitica), SseL (Salmonella typhimurium), ElaD
(Escherichia coli), ChlaDub1 et 2 (Chlamydia trachomatis). D’autres effecteurs comme VirF
(Agrobacterium tumefaciens), AvrPtoB (Pseudomonas syringae), GALA (Ralstonia
solanacearum), SpoA (Salmonella typhimurium) et IpaH9.8 (Shigella flexneri) portent une
activité E3 ligase. L’effecteur HopM1 (Pseudomonas syringae) peut également faciliter
l’adressage d’un substrat vers les systèmes E3 ligase. Les protéines bactériennes ExoU
(Pseudomonas aeruginosa), SopB et SopE (Salmonella typhimurium) et YopE (Yersinia
enterocolitica) peuvent être des substrats (cercles marrons). Ce schéma est inspiré de (Angot
et al., 2007; Catic et al., 2007; Rytkonen and Holden, 2007).
113
II.2.2 La cible de Cif
Pour identifier les protéines eucaryotes pouvant interagir avec Cif, des expériences de
double-hybride ont été réalisées sur 3 cribles différents en utilisant Cif sauvage ou le mutant
cystéine (C109A) comme proie et des banques d’ADNc issues de colon humain ou de
placenta. Une protéine a été systématiquement identifiée lors de ces trois cribles, Nedd8.
Cette protéine « ubiquitin-like » se fixe aux protéines des cellules eucaryotes appelées
Cullines ; on parle de neddylation (Hori et al., 1999). Les cullines sont des sous-unités des
complexes CRLs (cullin-ring ubiquitin ligases) dont l’activité ubiquitine ligase est augmentée
par la neddylation des cullines (Petroski and Deshaies, 2005; Ohh et al., 2002). Des résultats
préliminaires obtenus au laboratoire montrent, par immuno-précipitation, l’association entre
Cif et les formes neddylées des Cullines. Des CRLs sont impliquées dans l’ubiquitinylation et
la dégradation des protéines p21 et p27 qui sont justement stabilisées par Cif. Il s’agit des
complexes SCF (Skp1/Cullin-1/F-box)-Skp2 et Culline 4A-DDB1 (Abbas et al., 2008;
Nishitani et al., 2008; Bondar et al., 2006; Higa et al., 2006; Bornstein et al., 2003; Tsvetkov
et al., 1999). Notons que p21 peut être également dégradé par le protéasome sans mettre en
jeu l’ubiquitination (Chen et al., 2004; Touitou et al., 2001; Sheaff et al., 2000) et que p27
peut être ubiquitinylée par le complexe ubiquitine ligase KPC dans le cytoplasme (Kamura et
al., 2004; Hara et al., 2001). L’hypothèse d’un piratage de la régulation des CRLs par Cif
semble d’autant plus intéressante qu’il a été décrit que l’inhibition de l’activité du complexe
Culline 4A-DDB1, par une protéine virale de HIV appelée Vpr, provoque un arrêt du cycle
cellulaire à la transition G2/M (Belzile et al., 2007). Cif pourrait donc se servir de la protéine
Nedd8 pour atteindre et inactiver les CRLs ce qui se traduirait par une stabilisation des
protéines dont la dégradation dépend des CRLs concernés. Une autre possibilité serait que Cif
se fixe aux CRLs puis acétyle les substrats potentiels sur les résidus lysine qui ne pourraient
plus être ubiquitinylés, bloquant leur dégradation par le protéasome. Ce genre de régulation
(acétylation contre ubiquitinylation) a déjà été décrit avec la protéine p21 pour laquelle,
l’acétylation empêche l’ubiquitinylation de la partie N-terminale (Chen et al., 2004). Ce
modèle d’interaction entre Cif et les CRLs expliquerait le maintien de l’arrêt du cycle
cellulaire malgré une sous-régulation de p21 et/ou p27 ou l’utilisation de lignées cellulaires
p21-/-. En fait, le cycle cellulaire resterait bloqué car d’autres protéines régulant le cycle
cellulaire, substrats des CRLs, seraient également stabilisées. Ainsi, le niveau des protéines
114
comme la CKI p57kip2 ou la protéine Gadd45 impliquées dans la régulation du cycle cellulaire
pourrait être vérifié (Kim et al., 2008; Nakano et al., 2005; Leung et al., 2001; Wang et al.,
1999).
II.3 Les conséquences de l’inhibition de la dégradation des protéines induite
par Cif
II.3.1 La re-réplication de l’ADN
Bien que la stabilisation des protéines p21 et p27 participe vraisemblablement à l’arrêt du
cycle cellulaire, nous avons observé l’apparition d’un phénotype particulier aux cellules
HeLa : la re-réplication de l’ADN. En effet, de toutes les lignées cellulaires testées, seules les
cellules HeLa présentent des populations de cellules avec 8N voire 16N quantité d’ADN trois
à quatre jours après l’infection. Dans ces cellules, l’accumulation maximale de p21 en
présence de Cif est obtenue 16 h après l’infection. Cependant deux jours plus tard, le niveau
de p21 est comparable à celui des cellules non-infectées (Samba-Louaka et Taieb, données
non-publiées). Il a été décrit que le déclin de p21 et le maintien de l’arrêt des cellules HeLa en
G2/M provoquent l’émergence d’une population polyploide (Waldman et al., 1996). Ainsi,
cette chute du taux de p21 expliquerait l’apparition de phénomènes de re-réplication de
l’ADN. Dans les cellules IEC-6 et Caco-2, où il n’y a pas de chute du taux de p21, cette
dernière peut lier et inhiber la PCNA nécessaire à l’accomplissement de la phase S et aucune
re-réplication de l’ADN n’est observée (Samba-Louaka et Taieb, données non-publiées).
Parmi les cibles des CRLs, il est intéressant de noter que Cdt1 est un élément important dans
l’activité « licensing factor » (initiation de la réplication de l’ADN) et que sa dégradation joue
un rôle dans la prévention de la re-réplication. Ainsi, l’observation de population de cellules
HeLa avec un contenu en ADN à 8N suggère que, comme dans C. elegans, la stabilisation
potentielle de Cdt1 par Cif induit un découplage de la coordination mitose-réplication (Kim
and Kipreos, 2007; Zhong et al., 2003).
115
II.3.2 Cif et les autres effecteurs
Un des mécanismes de défense des cellules eucaryotes contre les toxines et effecteurs
bactériens est l’utilisation de processus d’ubiquitinylation contre ces produits bactériens
(Ruckdeschel et al., 2006). Au delà de la stabilisation des protéines de la cellule hôte,
l’inhibition des CRLs par Cif pourrait augmenter la demi-vie des autres effecteurs dans la
cellule et donc potentialiser leurs effets (Ruckdeschel et al., 2006). Cette piste est intéressante
et serait, à ma connaissance, le seul exemple d’une modulation de la virulence des autres
effecteurs directement par la prise de contrôle, par une molécule bactérienne, des systèmes de
dégradation de la cellule hôte.
II.3.3 Pistes restant à explorer
La figure 13 résume les différentes hypothèses concernant le mode d’action de Cif. Si
de nombreux points ont été élucidés dans les voies cellulaires détournées par Cif ainsi qu’au
niveau structurel et enzymatique, l’identification du mécanisme par lequel Cif est capable de
moduler la stabilité des CKIs reste toujours une question non résolue. Nous savons qu’il fait
sans doute intervenir la neddylation des cullines mais le lien fonctionnel entre cette
neddylation et la présence d’un site catalytique potentiel cystéine protéase/acetyl
transférase/transglutaminase nécessaire à l’activité de Cif, n’est pas identifié.
Figure 13: Mode d'action hypothétique de Cif sur les cellules HeLa. La protéine Cif est
transloquée dans la cellule eucaryote par le SST3. Cif se lie physiquement aux complexes
CRLs (Cullin Ring Ligases) via la culline neddylée.. Cif empêcherait l'ubiquitinylation du
substrat en modifiant la conformation du complexe, en inhibant l'enzyme E2 (qui porte les
résidus d’ubiquitine (ub)) ou en bloquant le transfert des résidus ub. Cela aurait pour
conséquence d'augmenter la stabilité des substrats concernés comme les protéines p21 et p27.
Ces dernières se fixeraient et inhiberaient l'activité promotrice du cycle cellulaire des
complexes CDKs/Cyclines. Outre l’arrêt du cycle cellulaire, Cif induit la formation de fibres
de stress et des plaques d’adhésion focale ainsi que la re-réplication de l’ADN. Ces
perturbations de la physiologie de la cellule entraînent un clivage de la caspase-3, protéine
exécutrice de l'apoptose.
Les flèches indiquent une activation ; les traits perpendiculaires montrent une inhibition et les
points d’interrogation soulignent les points restant à éclaircir.
116
III- Le rôle de Cif
Depuis l’identification de Cif, la question de son rôle dans la virulence s’est posée. A ce
jour, seules des hypothèses sont émises quant au rôle de Cif dans la pathogénie de la bactérie.
III.1 Les lésions d’A/E et la mort de l’hôte
La délétion du gène cif dans une souche d’EPEC n’empêche pas les lésions d’A/E in
vivo (Marches et al., 2003). Par ailleurs, lors d’infections aiguës des lapereaux par
l’administration orale d’une EPEC, la délétion de Cif n’atténue pas la virulence (diarrhée et
mortalité) de cette bactérie (Marchès et Oswald, données non publiées). Nous ne pouvons
exclure que le type de test utilisé, les conditions et les paramètres choisis ne soient pas
adéquats pour évaluer le rôle de Cif dans la pathogénie des EPEC. En effet, si nous prenons
l’exemple de l’effecteur des EPEC EspF, son absence n’empêche pas la formation des lésions
d’A/E (McNamara and Donnenberg, 1998). Comme Cif, EspF induit l’apoptose des cellules
eucaryotes in vitro (Crane et al., 2001) (Samba-Louaka, publication soumise). Dans un
modèle d’infection de l’intestin in vitro (IVOC, in vitro human intestinal organ culture), une
étude a montré que EspF permet l’élongation des microvillosités qui n’ont pas été effacées par
l’infection (Shaw et al., 2005). Ces microvillosités allongées peuvent être observées sur la
figure 3. Ce type de modèle pourrait permettre d’observer un effet, assez subtil, de Cif dans la
survenue des lésions d’A/E. De même, une infection aiguë et lourde des souris par la bactérie
Citrobacter rodentium (responsables de lésions d’A/E) provoque la mort cellulaire in vivo et
une mortalité plus importante comparé aux souches délétées pour espF ou exprimant une
protéine EspF mutée (Nagai et al., 2005). La virulence des bactéries exprimant Cif pourrait
être testée également dans ce modèle murin. Par ailleurs, les souches délétées pour le gène cif
pourraient mettre en place des mécanismes de compensation des effets de Cif compte tenu de
la redondance, de la multifonctionnalité et de la coordination des effets des différents
effecteurs (Dean and Kenny, 2009; Kenny et al., 2002). Ainsi, compte tenu de la multiplicité
de fonctions et du nombre d’effecteurs qui « arment » une bactérie pathogène, il n’est pas rare
d’observer que la mutation d’un seul facteur de virulence ne conduise pas à une différence de
phénotype en terme de pathogénie (Galan, 2009).
117
III.2 La colonisation de l’épithélium intestinal
III.2.1 L’effet anti-prolifératif de Cif
La première hypothèse d’une participation de Cif dans l’établissement d’une
colonisation bactérienne efficace se fonde sur l’effet cyclomoduline de Cif in vitro. Les EPEC
et les bactéries Y. pseudotuberculosis et Photorhabdus colonisent toutes l’intestin de leur
hôte. L’épithélium intestinal se renouvelle constamment et très rapidement. Chez les
mammifères, 3 à 7 jours suffisent pour renouveler cet épithélium. Schématiquement, au
dessus des cellules souches (qui se trouvent à la base de la crypte intestinale), se trouvent des
cellules progénitrices qui prolifèrent et migrent vers le sommet de la villosité en se
différenciant en 4 lignées cellulaires : les entérocytes, les cellules caliciformes, les cellules
endocrines ou les cellules de Paneth (van der Flier and Clevers, 2009; Crosnier et al., 2006).
Une fois au sommet de la villosité, les cellules intestinales sont éliminées par apoptose. Par ce
mécanisme, l’organe se débarrasse des parasites fixés à ces cellules (Cliffe et al., 2005).
Il a donc été émis l’hypothèse que Cif par son effet antiprolifératif pourrait ralentir le
renouvellement de l’épithélium intestinal (Marches et al., 2003), facilitant la colonisation du
tube digestif par les entérobactéries exprimant Cif (figure 14). Cet effet de blocage du « tapis
roulant » qui permettrait d’augmenter la colonisation bactérienne de l’épithélium intestinal à
travers une cyclomoduline anti-proliférative (IpaB) a déjà été décrit in vivo avec la bactérie
Shigella (Iwai et al., 2007). Une récente étude montrant que les EPEC sont capables d’entrer
dans les cryptes intestinales au contact de cellules prolifératives renforce la nécessité de
vérifier cette hypothèse (Maddocks et al., 2009).
III.2.2 Le rôle des CKIs
Les résultats sur les CKIs offrent de nouvelles perspectives quant à l’effet de Cif. Bien
que l’on ne sache pas exactement comment se passe l’exfoliation des cellules dans le lumen
intestinal, il a été suggéré que les cellules pourraient être exfoliées à la suite d’une apoptose
(Watson and Pritchard, 2000; Hall et al., 1994). La protéine p21, stabilisée par Cif, possède
une activité anti-apoptotique (Abbas and Dutta, 2009; Gartel and Tyner, 2002). En bloquant la
survenue de l’apoptose via p21, Cif pourrait également empêcher le renouvellement de
Figure 14 : Rôle hypothétique de Cif in vivo. La figure montre un épithélium intestinal
simplifié, infecté par des EPEC. Cif pourrait jouer un rôle dans l’établissement d’une
colonisation prolongée des bactéries en inhibant le renouvellement des cellules épithéliales
(par inhibition de la prolifération des cellules progénitrices) ou en facilitant la différenciation
cellulaire. Cif pourrait induire l’apoptose des entérocytes au sommet de la villosité intestinale
ou potentialiser l’apoptose spontanée dans l’épithélium intestinal. L’induction de l’apoptose
pourrait atténuer la virulence de la bactérie mais participer à sa dissémination.
118
l’épithélium intestinal. Ce type d’effet a été suggéré pour la bactérie Helicobacter pylori qui,
au travers de la cyclomoduline CagA, empêcherait le renouvellement de l’épithélium
gastrique et augmenterait sa colonisation en inhibant l’apoptose (Mimuro et al., 2007).
Cependant nos études, au contraire, montrent que Cif induit la mort cellulaire (Samba-
Louaka, publication sous presse) et dans certaines situations, la protéine p21 a été également
décrite comme pro-apoptotique (Abbas and Dutta, 2009; Gartel and Tyner, 2002). L’existence
physiologique de phénomène d’apoptose spontanée au sein des cellules progénitrices (Watson
and Pritchard, 2000) nous amène à suggérer que Cif pourrait amplifier la mortalité de ces
cellules pour ralentir le renouvellement de l’épithélium intestinal.
Un autre processus dans lequel les protéines p21 et p27 jouent un rôle sensible est la
différenciation des cellules intestinales (Stehr et al., 2005; Evers, 1999). Il a été décrit que
l’adhésion des EPEC est plus importante sur des cellules différenciées (Gabastou et al., 1995).
Il n’est pas à exclure que Cif pourrait jouer un rôle sur la différenciation des cellules
intestinales pour optimiser la colonisation bactérienne (figure 14).
III.2.3 Le cytosquelette
La modification du cytosquelette des cellules cibles est une stratégie fréquemment
utilisée par les bactéries. Chez les EPEC, les effecteurs Tir, EspH et TccP/EspFu participent à
la formation des lésions d’A/E (Garmendia et al., 2005), Map, EspF et EspG altèrent les
jonctions serrées (Matsuzawa et al., 2005; Dean and Kenny, 2004; McNamara et al., 2001) et
EspB interagit avec la protéine du cytosquelette -caténine (Kodama et al., 2002). Bien que
l’apparition des fibres de stress et des plaques d’adhésion focale n’ait été observée que sur
cellules HeLa, les modifications du cytosquelette peuvent être l’un des phénotypes induit par
Cif in vivo. Une étude récente suggère que l’effecteur OspE de Shigella flexneri stabilise les
plaques d’adhésion focale pour empêcher le détachement cellulaire et permettre la
colonisation bactérienne in vivo (Kim et al., 2009). L’existence d’un tel mécanisme avec Cif
pourrait également être étudiée.
119
III.2.4 Cif et la symbiose
Il serait également intéressant de vérifier le rôle de Cif dans les phénomènes de
symbiose. En effet, au niveau structural, Cif est proche de la protéine avirulente AvrPphB de
Pseudomonas syringea (Hsu et al., 2008). Les protéines avirulentes (uniquement décrites pour
les bactéries pathogènes de plantes) ont un impact négatif sur le pouvoir pathogène de la
bactérie envers sa cellule cible et jouent donc un rôle important dans la relation hôte - agent
pathogène (White et al., 2000). L’apoptose induite par Cif pourrait empêcher une colonisation
prolongée de l’épithélium intestinal et/ou participer à la dissémination du pathogène. Ainsi,
Cif pourrait faciliter le processus de symbiose chez les espèces Photorhabdus qui sont des
symbiontes de nématodes. Dans le même sens, il a été suggéré que les bactéries
(commensales et pathogènes) maintiennent une tolérance inflammatoire en modulant le
niveau de neddylation de la cullin-1 (Collier-Hyams et al., 2005). Une modulation des CRLs
par Cif pourrait permettre à la bactérie de réguler la réaction immunitaire.
III.2.5 Les cyclomodulines et le Cancer
La participation des bactéries dans la genèse ou la progression de certains cancers est un
thème émergeant depuis que le lien entre l’infection chronique par Helicobacter pylori et les
cancers gastriques a été établi (Lax and Thomas, 2002). La capacité des bactéries à interférer
avec la prolifération cellulaire des tissus hôtes suggère que la présence de ces bactéries dans
le tube digestif représente un risque de développement de tumeurs dont l’impact a pu être
sous-estimé. En effet, la latence entre l’initiation d’un cancer d’origine bactérienne et son
développement, période où cet agent serait à priori éliminé, explique que les études
épidémiologiques n’ont pu révéler cette étiologie. Quelques études suggèrent l’implication
des cyclomodulines dans l’émergence des cancers. Par exemple, la toxine CDT participe à
l’établissement des lésions pré-malignes dans le foie des souris infectées de manière
chronique par la bactérie Helicobacter hepaticus (Ge et al., 2007). D’autre part, l’effecteur
CagA d’Helicobacter pylori participerait au développement d’adéno-carcinomes gastriques
(Hatakeyama and Higashi, 2005). La bactérie Enterococcus faecalis, quant à elle, possède une
rare et remarquable capacité à produire des espèces réactives de l’oxygène (ERO). Ces
dernières bloquent le cycle cellulaire à la transition G2/M et provoquent des dommages à
l’ADN in vitro comme in vivo. Ces ERO induisent une instabilité chromosomique pouvant
120
participer à l’émergence de polypes adénomateux et de cancers colorectaux (Allen et al.,
2008; Wang et al., 2008b; Huycke et al., 2002; Huycke and Moore, 2002). Concernant
certaines ETEC (pathovar de E. coli) qui sécrètent la toxine Sta (heat-stable enterotoxin), une
publication a évoqué l’idée selon laquelle la faible incidence des cancers colorectaux dans les
pays en voie de développement pourrait résulter des effets anti-prolifératifs de Sta (Carrithers,
2003). Au regard des fonctions cellulaires fondamentales (cycle cellulaire, re-réplication de
l’ADN, apoptose, la signalisation des protéines Rho) perturbées par Cif, in vitro, il sera
intéressant, lors d’infections chroniques et persistantes, d’examiner le rôle hypothétique des
EPEC exprimant Cif dans l’induction, la progression ou la protection contre des cancers
colorectaux.
121
IV- Conclusion
IV.1 Originalité du mode d’action de Cif
Même si la détermination des fonctions des effecteurs montre que la subversion des
systèmes d’ubiquitinylation est une stratégie fréquemment employée par les bactéries (figure
12) (Angot et al., 2007; Rytkonen and Holden, 2007), Cif mettrait en œuvre un mécanisme
élaboré et original pour arrêter la prolifération cellulaire. Cette stratégie met en jeu de
nombreux acteurs du cycle cellulaire, de Nedd8 à CDK1 en passant par les CRLs et les CKIs.
De manière intéressante, la dégradation des CKIs par les CRLs est un mécanisme conservé
dans l’évolution de la drosophile à l’homme tout comme Cif est présent dans des pathogènes
d’insecte et de mammifère (Jubelin et al., 2009; Higa et al., 2006).
IV.2 Cif, un outil pour explorer le cycle cellulaire
Nombreux sont les exemples où les bactéries ont su développer ou élaborer des
molécules leur permettant de s’adapter aux hôtes en piratant des fonctions fondamentales de
la cellule infectée. Ainsi ces bactéries qui ont « appris », au cours de l’évolution, notre
biologie cellulaire, offrent des outils pour comprendre et décrypter de nombreuses voies de
signalisation eucaryote. Pour ne citer que quelques exemples, l’utilisation du facteur létal de
l’anthrax qui clive spécifiquement les MAPK Kinases1 et 2, a permis d’analyser les voies de
contrôle de la maturation méiotique de l’ovocyte de xénope (Duesbery and Vande Woude,
1999; Duesbery et al., 1998). Récemment, son utilisation pharmacologique a même été étudié
dans le traitement de tumeur pour combattre l’angiogenèse (Huang et al., 2008). Le rôle des
protéines Rho a pu être étudié grâce à l’exoenzyme C3 de C. botulinum. L’implication des
petites G protéines dans le relâchement de l’arrêt en prophase de l’ovocyte a été mise en
évidence par l’utilisation de la toxine létale de Clostridium sordellii et de la toxine B de
Clostridium difficile, des glucolsyl-transferases qui inhibent spécifiquement certaines
protéines de la famille de Ras, rac et rab (Jessus et al., 1998; Rime et al., 1998). Ainsi, il est
très probable que le décryptage du mécanisme de piratage de Cif permettra de disposer d’un
outil puissant et spécifique pour l’étude du cycle cellulaire.
122
IV.3 Une étude du rôle de Cif in vivo s’impose
La Détermination du rôle de Cif, nous aidera à comprendre pourquoi dans 70% des
souches d’E. coli portant le gène cif, ce dernier est sous forme de pseudogène. Par ailleurs, le
fait que Cif ne soit pas fonctionnel dans toutes les EPEC (et pas du tout dans les EHEC)
illustre la capacité des bactéries à mettre en place des stratégies et des effecteurs différents
pour s’adapter à leur environnement. La mise en place d’études in vivo s’impose pour évaluer
l’impact potentiel de Cif sur la physiologie du tube digestif (les hypothèses sont résumées sur
la figure 14) et son importance parmi les nombreux facteurs de virulence exprimés par les
différentes bactéries. Elucider le rôle de Cif dans la pathogénie bactérienne peut contribuer à
identifier une nouvelle stratégie de colonisation utilisée par les entérobactéries et à évaluer
l’implication des cyclomodulines dans la virulence des bactéries.
123
4ème partie : Références bibliographiques
124
Abbas, T. and Dutta, A. (2009) p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9: 400-414. Abbas, T., Sivaprasad, U., Terai, K., Amador, V., Pagano, M. and Dutta, A. (2008) PCNA-dependent regulation of p21 ubiquitylation and degradation via the CRL4Cdt2 ubiquitin ligase complex. Genes Dev. 22: 2496-2506. Abe, A., de Grado, M., Pfuetzner, R.A., Sanchez-Sanmartin, C., Devinney, R., Puente, J.L., et al (1999) Enteropathogenic Escherichia coli translocated intimin receptor, Tir, requires a specific chaperone for stable secretion. Mol Microbiol. 33: 1162-1175. Acquaviva, C. and Pines, J. (2006) The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119: 2401-2404. Allen, T.D., Moore, D.R., Wang, X., Casu, V., May, R., Lerner, M.R., et al (2008) Dichotomous metabolism of Enterococcus faecalis induced by haematin starvation modulates colonic gene expression. J Med Microbiol. 57: 1193-1204. Ando, Y., Yasuda, S., Oceguera-Yanez, F. and Narumiya, S. (2007) Inactivation of Rho GTPases with Clostridium difficile toxin B impairs centrosomal activation of Aurora-A in G2/M transition of HeLa cells. Mol Biol Cell. 18: 3752-3763. Angot, A., Vergunst, A., Genin, S. and Peeters, N. (2007) Exploitation of eukaryotic ubiquitin signaling pathways by effectors translocated by bacterial type III and type IV secretion systems. PLoS Pathog. 3: e3. Arellano, M. and Moreno, S. (1997) Regulation of CDK/cyclin complexes during the cell cycle. Int J Biochem Cell Biol. 29: 559-573. Arnold, R., Brandmaier, S., Kleine, F., Tischler, P., Heinz, E., Behrens, S., et al (2009) Sequence-based prediction of type III secreted proteins. PLoS Pathog. 5: e1000376. Asakura, M., Hinenoya, A., Alam, M.S., Shima, K., Zahid, S.H., Shi, L., et al (2007) An inducible lambdoid prophage encoding cytolethal distending toxin (Cdt-I) and a type III effector protein in enteropathogenic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 14483-14488. Attwood, S.E., Mealy, K., Cafferkey, M.T., Buckley, T.F., West, A.B., Boyle, N., et al (1987) Yersinia infection and acute abdominal pain. Lancet. 1: 529-533. Bakkenist, C.J. and Kastan, M.B. (2003) DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421: 499-506. Balsara, Z.R., Misaghi, S., Lafave, J.N. and Starnbach, M.N. (2006) Chlamydia trachomatis infection induces cleavage of the mitotic cyclin B1. Infect Immun. 74: 5602-5608. Banin, S., Moyal, L., Shieh, S., Taya, Y., Anderson, C.W., Chessa, L., et al (1998) Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281: 1674-1677. Belzile, J.P., Duisit, G., Rougeau, N., Mercier, J., Finzi, A. and Cohen, E.A. (2007) HIV-1 Vpr-mediated G2 arrest involves the DDB1-CUL4AVPRBP E3 ubiquitin ligase. PLoS Pathog. 3: e85. Berg, R.D. (1996) The indigenous gastrointestinal microflora. Trends Microbiol. 4: 430-435. Berger, N.A. (1985) Poly(ADP-ribose) in the cellular response to DNA damage. Radiat Res. 101: 4-15. Bergsbaken, T., Fink, S.L. and Cookson, B.T. (2009) Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7: 99-109. Bieber, D., Ramer, S.W., Wu, C.Y., Murray, W.J., Tobe, T., Fernandez, R. and Schoolnik, G.K. (1998) Type IV pili, transient bacterial aggregates, and virulence of enteropathogenic Escherichia coli. Science. 280: 2114-2118. Bielaszewska, M., Sinha, B., Kuczius, T. and Karch, H. (2005) Cytolethal distending toxin from Shiga toxin-producing Escherichia coli O157 causes irreversible G2/M arrest, inhibition of proliferation, and death of human endothelial cells. Infect Immun. 73: 552-562.
125
Blangy, A., Lane, H.A., d'Herin, P., Harper, M., Kress, M. and Nigg, E.A. (1995) Phosphorylation by p34cdc2 regulates spindle association of human Eg5, a kinesin-related motor essential for bipolar spindle formation in vivo. Cell. 83: 1159-1169. Blank, M. and Shiloh, Y. (2007) Programs for cell death: apoptosis is only one way to go. Cell Cycle. 6: 686-695. Blattner, F.R., Plunkett, G., 3rd, Bloch, C.A., Perna, N.T., Burland, V., Riley, M., et al (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277: 1453-1474. Bondar, T., Kalinina, A., Khair, L., Kopanja, D., Nag, A., Bagchi, S. and Raychaudhuri, P. (2006) Cul4A and DDB1 associate with Skp2 to target p27Kip1 for proteolysis involving the COP9 signalosome. Mol Cell Biol. 26: 2531-2539. Booher, R.N., Holman, P.S. and Fattaey, A. (1997) Human Myt1 is a cell cycle-regulated kinase that inhibits Cdc2 but not Cdk2 activity. J Biol Chem. 272: 22300-22306. Bornstein, G., Bloom, J., Sitry-Shevah, D., Nakayama, K., Pagano, M. and Hershko, A. (2003) Role of the SCFSkp2 ubiquitin ligase in the degradation of p21Cip1 in S phase. J Biol Chem. 278: 25752-25757. Borrmann, E., Gunther, H. and Kohler, H. (2001) Effect of Clostridium perfringens epsilon toxin on MDCK cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 31: 85-92. Boutros, R., Dozier, C. and Ducommun, B. (2006) The when and wheres of CDC25 phosphatases. Curr Opin Cell Biol. 18: 185-191. Brugirard-Ricaud, K., Givaudan, A., Parkhill, J., Boemare, N., Kunst, F., Zumbihl, R. and Duchaud, E. (2004) Variation in the effectors of the type III secretion system among Photorhabdus species as revealed by genomic analysis. J Bacteriol. 186: 4376-4381. Campellone, K.G., Robbins, D. and Leong, J.M. (2004) EspFU is a translocated EHEC effector that interacts with Tir and N-WASP and promotes Nck-independent actin assembly. Dev Cell. 7: 217-228. Carnero, A. and Hannon, G.J. (1998) The INK4 family of CDK inhibitors. Curr Top Microbiol Immunol. 227: 43-55. Carrithers, S.L. (2003) Diarrhea or colorectal cancer: can bacterial toxins serve as a treatment for colon cancer? Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 3018-3020. Castedo, M. and Kroemer, G. (2004) [Mitotic catastrophe: a special case of apoptosis]. J Soc Biol. 198: 97-103. Castedo, M., Perfettini, J.L., Roumier, T., Andreau, K., Medema, R. and Kroemer, G. (2004) Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene. 23: 2825-2837. Cayrol, C., Knibiehler, M. and Ducommun, B. (1998) p21 binding to PCNA causes G1 and G2 cell cycle arrest in p53-deficient cells. Oncogene. 16: 311-320. Charpentier, X. and Oswald, E. (2004) Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186: 5486-5495. Chaurushiya, M.S. and Weitzman, M.D. (2009) Viral manipulation of DNA repair and cell cycle checkpoints. DNA Repair (Amst). 8: 1166-1176. Chen, H.D. and Frankel, G. (2005) Enteropathogenic Escherichia coli: unravelling pathogenesis. FEMS Microbiol Rev. 29: 83-98. Chen, M.S., Ryan, C.E. and Piwnica-Worms, H. (2003) Chk1 kinase negatively regulates mitotic function of Cdc25A phosphatase through 14-3-3 binding. Mol Cell Biol. 23: 7488-7497. Chen, X., Chi, Y., Bloecher, A., Aebersold, R., Clurman, B.E. and Roberts, J.M. (2004) N-acetylation and ubiquitin-independent proteasomal degradation of p21(Cip1). Mol Cell. 16: 839-847. Cheng, A.C. and Currie, B.J. (2005) Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin Microbiol Rev. 18: 383-416.
126
Chinnaiyan, A.M. (1999) The apoptosome: heart and soul of the cell death machine. Neoplasia. 1: 5-15. Ciche, T.A. and Ensign, J.C. (2003) For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out? Appl Environ Microbiol. 69: 1890-1897. Cliffe, L.J., Humphreys, N.E., Lane, T.E., Potten, C.S., Booth, C. and Grencis, R.K. (2005) Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion. Science. 308: 1463-1465. Cohen, G.M. (1997) Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326 ( Pt 1): 1-16. Collier-Hyams, L.S., Sloane, V., Batten, B.C. and Neish, A.S. (2005) Cutting edge: bacterial modulation of epithelial signaling via changes in neddylation of cullin-1. J Immunol. 175: 4194-4198. Comayras, C., Tasca, C., Peres, S.Y., Ducommun, B., Oswald, E. and De Rycke, J. (1997) Escherichia coli cytolethal distending toxin blocks the HeLa cell cycle at the G2/M transition by preventing cdc2 protein kinase dephosphorylation and activation. Infect Immun. 65: 5088-5095. Cookson, B.T. and Brennan, M.A. (2001) Pro-inflammatory programmed cell death. Trends Microbiol. 9: 113-114. Courvalin, J.C., Segil, N., Blobel, G. and Worman, H.J. (1992) The lamin B receptor of the inner nuclear membrane undergoes mitosis-specific phosphorylation and is a substrate for p34cdc2-type protein kinase. J Biol Chem. 267: 19035-19038. Crane, J.K., McNamara, B.P. and Donnenberg, M.S. (2001) Role of EspF in host cell death induced by enteropathogenic Escherichia coli. Cell Microbiol. 3: 197-211. Creagh, E.M., Conroy, H. and Martin, S.J. (2003) Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193: 10-21. Creasey, E.A., Delahay, R.M., Bishop, A.A., Shaw, R.K., Kenny, B., Knutton, S. and Frankel, G. (2003) CesT is a bivalent enteropathogenic Escherichia coli chaperone required for translocation of both Tir and Map. Mol Microbiol. 47: 209-221. Crosnier, C., Stamataki, D. and Lewis, J. (2006) Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control. Nat Rev Genet. 7: 349-359. Crow, A., Race, P.R., Jubelin, G., Chavez, C.V., Escoubas, J.M., Oswald, E. and Banfield, M.J. (2009) Crystal structures of Cif from bacterial pathogens Photorhabdus luminescens and Burkholderia pseudomallei. PLoS ONE. Dahan, S., Wiles, S., La Ragione, R.M., Best, A., Woodward, M.J., Stevens, M.P., et al (2005) EspJ is a prophage-carried type III effector protein of attaching and effacing pathogens that modulates infection dynamics. Infect Immun. 73: 679-686. Davis, A.J. and Mecsas, J. (2007) Mutations in the Yersinia pseudotuberculosis type III secretion system needle protein, YscF, that specifically abrogate effector translocation into host cells. J Bacteriol. 189: 83-97. De Rycke, J., Comtet, E., Chalareng, C., Boury, M., Tasca, C. and Milon, A. (1997) Enteropathogenic Escherichia coli O103 from rabbit elicits actin stress fibers and focal adhesions in HeLa epithelial cells, cytopathic effects that are linked to an analog of the locus of enterocyte effacement. Infect Immun. 65: 2555-2563. Dean, P. and Kenny, B. (2004) Intestinal barrier dysfunction by enteropathogenic Escherichia coli is mediated by two effector molecules and a bacterial surface protein. Mol Microbiol. 54: 665-675. Dean, P. and Kenny, B. (2009) The effector repertoire of enteropathogenic E. coli: ganging up on the host cell. Curr Opin Microbiol. 12: 101-109. Deng, C.X. (2006) BRCA1: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolution. Nucleic Acids Res. 34: 1416-1426.
127
Deng, W., Li, Y., Vallance, B.A. and Finlay, B.B. (2001) Locus of enterocyte effacement from Citrobacter rodentium: sequence analysis and evidence for horizontal transfer among attaching and effacing pathogens. Infect Immun. 69: 6323-6335. Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M.L. and Relman, D.A. (2008) The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing. PLoS Biol. 6: e280. Deveraux, Q.L., Takahashi, R., Salvesen, G.S. and Reed, J.C. (1997) X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases. Nature. 388: 300-304. Deveraux, Q.L., Roy, N., Stennicke, H.R., Van Arsdale, T., Zhou, Q., Srinivasula, S.M., et al (1998) IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition of distinct caspases. Embo J. 17: 2215-2223. DeVinney, R., Stein, M., Reinscheid, D., Abe, A., Ruschkowski, S. and Finlay, B.B. (1999) Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 produces Tir, which is translocated to the host cell membrane but is not tyrosine phosphorylated. Infect Immun. 67: 2389-2398. Diehl, J.A., Zindy, F. and Sherr, C.J. (1997) Inhibition of cyclin D1 phosphorylation on threonine-286 prevents its rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev. 11: 957-972. Dimri, G.P., Lee, X., Basile, G., Acosta, M., Scott, G., Roskelley, C., et al (1995) A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 9363-9367. Draetta, G. and Eckstein, J. (1997) Cdc25 protein phosphatases in cell proliferation. Biochim Biophys Acta. 1332: M53-63. Draetta, G., Luca, F., Westendorf, J., Brizuela, L., Ruderman, J. and Beach, D. (1989) Cdc2 protein kinase is complexed with both cyclin A and B: evidence for proteolytic inactivation of MPF. Cell. 56: 829-838. Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L. and Wang, X. (2000) Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell. 102: 33-42. Duesbery, N.S. and Vande Woude, G.F. (1999) Anthrax lethal factor causes proteolytic inactivation of mitogen-activated protein kinase kinase. J Appl Microbiol. 87: 289-293. Duesbery, N.S., Webb, C.P., Leppla, S.H., Gordon, V.M., Klimpel, K.R., Copeland, T.D., et al (1998) Proteolytic inactivation of MAP-kinase-kinase by anthrax lethal factor. Science. 280: 734-737. Dyson, N. (1998) The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev. 12: 2245-2262. Elmore, S. (2007) Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 35: 495-516. Eom, Y.W., Kim, M.A., Park, S.S., Goo, M.J., Kwon, H.J., Sohn, S., et al (2005) Two distinct modes of cell death induced by doxorubicin: apoptosis and cell death through mitotic catastrophe accompanied by senescence-like phenotype. Oncogene. 24: 4765-4777. Escherich, T. (1885) Die darmbakterien des neugeborenen und säuglings. Fortschr. Med. 3: 515-522. Evers, B.M. (1999) Intestinal cell differentiation: cellular mechanisms and the search for the perfect model focus on "involvement of p21(WAF1/Cip1) and p27(Kip1) in intestinal epithelial cell differentiation". Am J Physiol. 276: C1243-1244. Fadok, V.A., Voelker, D.R., Campbell, P.A., Cohen, J.J., Bratton, D.L. and Henson, P.M. (1992) Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol. 148: 2207-2216. Fadok, V.A., Bratton, D.L., Rose, D.M., Pearson, A., Ezekewitz, R.A. and Henson, P.M. (2000) A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells. Nature. 405: 85-90.
128
Falck, J., Mailand, N., Syljuasen, R.G., Bartek, J. and Lukas, J. (2001) The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. Nature. 410: 842-847. Fantuzzi, G. and Dinarello, C.A. (1999) Interleukin-18 and interleukin-1 beta: two cytokine substrates for ICE (caspase-1). J Clin Immunol. 19: 1-11. Fernandez-Prada, C.M., Hoover, D.L., Tall, B.D. and Venkatesan, M.M. (1997) Human monocyte-derived macrophages infected with virulent Shigella flexneri in vitro undergo a rapid cytolytic event similar to oncosis but not apoptosis. Infect Immun. 65: 1486-1496. Fink, S.L. and Cookson, B.T. (2005) Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73: 1907-1916. Ford, D., Easton, D.F. and Peto, J. (1995) Estimates of the gene frequency of BRCA1 and its contribution to breast and ovarian cancer incidence. Am J Hum Genet. 57: 1457-1462. Forst, S., Dowds, B., Boemare, N. and Stackebrandt, E. (1997) Xenorhabdus and Photorhabdus spp.: bugs that kill bugs. Annu Rev Microbiol. 51: 47-72. Frisan, T., Cortes-Bratti, X., Chaves-Olarte, E., Stenerlow, B. and Thelestam, M. (2003) The Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin induces DNA double-strand breaks and promotes ATM-dependent activation of RhoA. Cell Microbiol. 5: 695-707. Gabastou, J.M., Kerneis, S., Bernet-Camard, M.F., Barbat, A., Coconnier, M.H., Kaper, J.B. and Servin, A.L. (1995) Two stages of enteropathogenic Escherichia coli intestinal pathogenicity are up and down-regulated by the epithelial cell differentiation. Differentiation. 59: 127-134. Galan, J.E. (2009) Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5: 571-579. Garmendia, J., Frankel, G. and Crepin, V.F. (2005) Enteropathogenic and Enterohemorrhagic Escherichia coli Infections: Translocation, Translocation, Translocation. Infect Immun. 73: 2573-2585. Garmendia, J., Phillips, A.D., Carlier, M.F., Chong, Y., Schuller, S., Marches, O., et al (2004) TccP is an enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 type III effector protein that couples Tir to the actin-cytoskeleton. Cell Microbiol. 6: 1167-1183. Gartel, A.L. and Tyner, A.L. (1999) Transcriptional regulation of the p21((WAF1/CIP1)) gene. Exp Cell Res. 246: 280-289. Gartel, A.L. and Tyner, A.L. (2002) The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in apoptosis. Mol Cancer Ther. 1: 639-649. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T. and Maller, J.L. (1990) Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60: 487-494. Ge, Z., Schauer, D.B. and Fox, J.G. (2008) In vivo virulence properties of bacterial cytolethal-distending toxin. Cell Microbiol. 10: 1599-1607. Ge, Z., Rogers, A.B., Feng, Y., Lee, A., Xu, S., Taylor, N.S. and Fox, J.G. (2007) Bacterial cytolethal distending toxin promotes the development of dysplasia in a model of microbially induced hepatocarcinogenesis. Cell Microbiol. 9: 2070-2080. Gelfanova, V., Hansen, E.J. and Spinola, S.M. (1999) Cytolethal distending toxin of Haemophilus ducreyi induces apoptotic death of Jurkat T cells. Infect Immun. 67: 6394-6402. Geng, Y., Yu, Q., Sicinska, E., Das, M., Schneider, J.E., Bhattacharya, S., et al (2003) Cyclin E ablation in the mouse. Cell. 114: 431-443. Gerrard, J.G., Joyce, S.A., Clarke, D.J., ffrench-Constant, R.H., Nimmo, G.R., Looke, D.F., et al (2006) Nematode symbiont for Photorhabdus asymbiotica. Emerg Infect Dis. 12: 1562-1564. Girard, F., Strausfeld, U., Fernandez, A. and Lamb, N.J. (1991) Cyclin A is required for the onset of DNA replication in mammalian fibroblasts. Cell. 67: 1169-1179.
129
Giron, J.A., Ho, A.S. and Schoolnik, G.K. (1991a) An inducible bundle-forming pilus of enteropathogenic Escherichia coli. Science. 254: 710-713. Giron, J.A., Jones, T., Millan-Velasco, F., Castro-Munoz, E., Zarate, L., Fry, J., et al (1991b) Diffuse-adhering Escherichia coli (DAEC) as a putative cause of diarrhea in Mayan children in Mexico. J Infect Dis. 163: 507-513. Glotzer, M., Murray, A.W. and Kirschner, M.W. (1991) Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349: 132-138. Goosney, D.L., DeVinney, R. and Finlay, B.B. (2001) Recruitment of cytoskeletal and signaling proteins to enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli pedestals. Infect Immun. 69: 3315-3322. Grana, X. and Reddy, E.P. (1995) Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene. 11: 211-219. Gruenheid, S., DeVinney, R., Bladt, F., Goosney, D., Gelkop, S., Gish, G.D., et al (2001) Enteropathogenic E. coli Tir binds Nck to initiate actin pedestal formation in host cells. Nat Cell Biol. 3: 856-859. Hacker, J., Blum-Oehler, G., Muhldorfer, I. and Tschape, H. (1997) Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol Microbiol. 23: 1089-1097. Hall, P.A., Coates, P.J., Ansari, B. and Hopwood, D. (1994) Regulation of cell number in the mammalian gastrointestinal tract: the importance of apoptosis. J Cell Sci. 107 ( Pt 12): 3569-3577. Hara, T., Kamura, T., Nakayama, K., Oshikawa, K., Hatakeyama, S. and Nakayama, K. (2001) Degradation of p27(Kip1) at the G(0)-G(1) transition mediated by a Skp2-independent ubiquitination pathway. J Biol Chem. 276: 48937-48943. Harper, J.W., Elledge, S.J., Keyomarsi, K., Dynlacht, B., Tsai, L.H., Zhang, P., et al (1995) Inhibition of cyclin-dependent kinases by p21. Mol Biol Cell. 6: 387-400. Hartwell, L.H. and Weinert, T.A. (1989) Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246: 629-634. Hatakeyama, M. and Higashi, H. (2005) Helicobacter pylori CagA: a new paradigm for bacterial carcinogenesis. Cancer Sci. 96: 835-843. Heald, R. and McKeon, F. (1990) Mutations of phosphorylation sites in lamin A that prevent nuclear lamina disassembly in mitosis. Cell. 61: 579-589. Herceg, Z. and Wang, Z.Q. (2001) Functions of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in DNA repair, genomic integrity and cell death. Mutat Res. 477: 97-110. Higa, L.A., Yang, X., Zheng, J., Banks, D., Wu, M., Ghosh, P., et al (2006) Involvement of CUL4 ubiquitin E3 ligases in regulating CDK inhibitors Dacapo/p27Kip1 and cyclin E degradation. Cell Cycle. 5: 71-77. Hilbi, H., Chen, Y., Thirumalai, K. and Zychlinsky, A. (1997) The interleukin 1beta-converting enzyme, caspase 1, is activated during Shigella flexneri-induced apoptosis in human monocyte-derived macrophages. Infect Immun. 65: 5165-5170. Hilbi, H., Moss, J.E., Hersh, D., Chen, Y., Arondel, J., Banerjee, S., et al (1998) Shigella-induced apoptosis is dependent on caspase-1 which binds to IpaB. J Biol Chem. 273: 32895-32900. Hill, M.M., Adrain, C., Duriez, P.J., Creagh, E.M. and Martin, S.J. (2004) Analysis of the composition, assembly kinetics and activity of native Apaf-1 apoptosomes. Embo J. 23: 2134-2145. Hoffmann, I., Clarke, P.R., Marcote, M.J., Karsenti, E. and Draetta, G. (1993) Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2--cyclin B and its involvement in the self-amplification of MPF at mitosis. Embo J. 12: 53-63.
130
Hooper, L.V., Midtvedt, T. and Gordon, J.I. (2002) How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine. Annu Rev Nutr. 22: 283-307. Hori, T., Osaka, F., Chiba, T., Miyamoto, C., Okabayashi, K., Shimbara, N., et al (1999) Covalent modification of all members of human cullin family proteins by NEDD8. Oncogene. 18: 6829-6834. Hsu, Y., Jubelin, G., Taieb, F., Nougayrede, J.P., Oswald, E. and Stebbins, C.E. (2008) Structure of the cyclomodulin Cif from pathogenic Escherichia coli. J Mol Biol. 384: 465-477. Huang, D., Ding, Y., Luo, W.M., Bender, S., Qian, C.N., Kort, E., et al (2008) Inhibition of MAPK kinase signaling pathways suppressed renal cell carcinoma growth and angiogenesis in vivo. Cancer Res. 68: 81-88. Hueck, C.J. (1998) Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol Mol Biol Rev. 62: 379-433. Huycke, M.M. and Moore, D.R. (2002) In vivo production of hydroxyl radical by Enterococcus faecalis colonizing the intestinal tract using aromatic hydroxylation. Free Radic Biol Med. 33: 818-826. Huycke, M.M., Abrams, V. and Moore, D.R. (2002) Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23: 529-536. Iguchi, A., Thomson, N.R., Ogura, Y., Saunders, D., Ooka, T., Henderson, I.R., et al (2009) Complete genome sequence and comparative genome analysis of enteropathogenic Escherichia coli O127:H6 strain E2348/69. J Bacteriol. 191: 347-354. Iwai, H., Kim, M., Yoshikawa, Y., Ashida, H., Ogawa, M., Fujita, Y., et al (2007) A bacterial effector targets Mad2L2, an APC inhibitor, to modulate host cell cycling. Cell. 130: 611-623. Jeffrey, P.D., Russo, A.A., Polyak, K., Gibbs, E., Hurwitz, J., Massague, J. and Pavletich, N.P. (1995) Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA-CDK2 complex. Nature. 376: 313-320. Jessus, C., Rime, H. and Ozon, R. (1998) Ras family proteins: new players involved in the diplotene arrest of Xenopus oocytes. Biol Cell. 90: 573-583. Jones, A., Jonsson, A.B. and Aro, H. (2007) Neisseria gonorrhoeae infection causes a G1 arrest in human epithelial cells. Faseb J. 21: 345-355. Jubelin, G., Chavez, C.V., Taieb, F., Banfield, M.J., Samba-Louaka, A., Nobe, R., et al (2009) Cycle inhibiting factors (CIFs) are a growing family of functional cyclomodulins present in invertebrate and mammal bacterial pathogens. PLoS ONE. 4: e4855. Kalman, D., Weiner, O.D., Goosney, D.L., Sedat, J.W., Finlay, B.B., Abo, A. and Bishop, J.M. (1999) Enteropathogenic E. coli acts through WASP and Arp2/3 complex to form actin pedestals. Nat Cell Biol. 1: 389-391. Kamura, T., Hara, T., Matsumoto, M., Ishida, N., Okumura, F., Hatakeyama, S., et al (2004) Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27(Kip1) at G1 phase. Nat Cell Biol. 6: 1229-1235. Kaper, J.B., Nataro, J.P. and Mobley, H.L. (2004) Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol. 2: 123-140. Kenny, B. and Finlay, B.B. (1997) Intimin-dependent binding of enteropathogenic Escherichia coli to host cells triggers novel signaling events, including tyrosine phosphorylation of phospholipase C-gamma1. Infect Immun. 65: 2528-2536. Kenny, B., Ellis, S., Leard, A.D., Warawa, J., Mellor, H. and Jepson, M.A. (2002) Co-ordinate regulation of distinct host cell signalling pathways by multifunctional enteropathogenic Escherichia coli effector molecules. Mol Microbiol. 44: 1095-1107.
131
Kim, D.W., Lenzen, G., Page, A.L., Legrain, P., Sansonetti, P.J. and Parsot, C. (2005) The Shigella flexneri effector OspG interferes with innate immune responses by targeting ubiquitin-conjugating enzymes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 14046-14051. Kim, M., Nakamoto, T., Nishimori, S., Tanaka, K. and Chiba, T. (2008) A new ubiquitin ligase involved in p57KIP2 proteolysis regulates osteoblast cell differentiation. EMBO Rep. 9: 878-884. Kim, M., Ogawa, M., Fujita, Y., Yoshikawa, Y., Nagai, T., Koyama, T., et al (2009) Bacteria hijack integrin-linked kinase to stabilize focal adhesions and block cell detachment. Nature. 459: 578-582. Kim, Y. and Kipreos, E.T. (2007) Cdt1 degradation to prevent DNA re-replication: conserved and non-conserved pathways. Cell Div. 2: 18. King, R.W., Jackson, P.K. and Kirschner, M.W. (1994) Mitosis in transition. Cell. 79: 563-571. King, R.W., Peters, J.M., Tugendreich, S., Rolfe, M., Hieter, P. and Kirschner, M.W. (1995) A 20S complex containing CDC27 and CDC16 catalyzes the mitosis-specific conjugation of ubiquitin to cyclin B. Cell. 81: 279-288. Klionsky, D.J. and Emr, S.D. (2000) Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. Science. 290: 1717-1721. Knutton, S., Lloyd, D.R. and McNeish, A.S. (1987) Adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to human intestinal enterocytes and cultured human intestinal mucosa. Infect Immun. 55: 69-77. Knutton, S., Baldwin, T., Williams, P.H. and McNeish, A.S. (1989) Actin accumulation at sites of bacterial adhesion to tissue culture cells: basis of a new diagnostic test for enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. Infect Immun. 57: 1290-1298. Kodama, T., Akeda, Y., Kono, G., Takahashi, A., Imura, K., Iida, T. and Honda, T. (2002) The EspB protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli interacts directly with alpha-catenin. Cell Microbiol. 4: 213-222. Kondylis, V., van Nispen tot Pannerden, H.E., Herpers, B., Friggi-Grelin, F. and Rabouille, C. (2007) The golgi comprises a paired stack that is separated at G2 by modulation of the actin cytoskeleton through Abi and Scar/WAVE. Dev Cell. 12: 901-915. Kothakota, S., Azuma, T., Reinhard, C., Klippel, A., Tang, J., Chu, K., et al (1997) Caspase-3-generated fragment of gelsolin: effector of morphological change in apoptosis. Science. 278: 294-298. Kroll, M., Margottin, F., Kohl, A., Renard, P., Durand, H., Concordet, J.P., et al (1999) Inducible degradation of IkappaBalpha by the proteasome requires interaction with the F-box protein h-betaTrCP. J Biol Chem. 274: 7941-7945. LaBaer, J., Garrett, M.D., Stevenson, L.F., Slingerland, J.M., Sandhu, C., Chou, H.S., et al (1997) New functional activities for the p21 family of CDK inhibitors. Genes Dev. 11: 847-862. Labbe, K. and Saleh, M. (2008) Cell death in the host response to infection. Cell Death Differ. 15: 1339-1349. Lara-Tejero, M., Sutterwala, F.S., Ogura, Y., Grant, E.P., Bertin, J., Coyle, A.J., et al (2006) Role of the caspase-1 inflammasome in Salmonella typhimurium pathogenesis. J Exp Med. 203: 1407-1412. Larochelle, S., Merrick, K.A., Terret, M.E., Wohlbold, L., Barboza, N.M., Zhang, C., et al (2007) Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol Cell. 25: 839-850. Lax, A.J. and Thomas, W. (2002) How bacteria could cause cancer: one step at a time. Trends Microbiol. 10: 293-299.
132
Leroy, S.M., Lesage, M.C., Chaslus-Dancla, E. and Lafont, J.P. (1994) Presence of eaeA sequences in pathogenic and nonpathogenic Escherichia coli strains isolated from weaned rabbits. J Med Microbiol. 40: 90-94. Leung, C.H., Lam, W., Zhuang, W.J., Wong, N.S., Yang, M.S. and Fong, W.F. (2001) PKCdelta-dependent deubiquitination and stabilization of Gadd45 in A431 cells overexposed to EGF. Biochem Biophys Res Commun. 285: 283-288. Levine, B. and Yuan, J. (2005) Autophagy in cell death: an innocent convict? J Clin Invest. 115: 2679-2688. Levine, M.M. (1987) Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent. J Infect Dis. 155: 377-389. Li, F., Srinivasan, A., Wang, Y., Armstrong, R.C., Tomaselli, K.J. and Fritz, L.C. (1997a) Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-xL has activity independent of cytochrome c release. J Biol Chem. 272: 30299-30305. Li, L., Sharipo, A., Chaves-Olarte, E., Masucci, M.G., Levitsky, V., Thelestam, M. and Frisan, T. (2002) The Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin activates sensors of DNA damage and repair complexes in proliferating and non-proliferating cells. Cell Microbiol. 4: 87-99. Li, P., Nijhawan, D., Budihardjo, I., Srinivasula, S.M., Ahmad, M., Alnemri, E.S. and Wang, X. (1997b) Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91: 479-489. Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V. and Medema, R.H. (2009) The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J Cell Biol. 185: 193-202. Liu, F., Stanton, J.J., Wu, Z. and Piwnica-Worms, H. (1997) The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17: 571-583. Loukiadis, E., Nobe, R., Herold, S., Tramuta, C., Ogura, Y., Ooka, T., et al (2008) Distribution, functional expression, and genetic organization of Cif, a phage-encoded type III-secreted effector from enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. J Bacteriol. 190: 275-285. Macdonald, T.T. and Monteleone, G. (2005) Immunity, inflammation, and allergy in the gut. Science. 307: 1920-1925. Maddocks, O.D., Short, A.J., Donnenberg, M.S., Bader, S. and Harrison, D.J. (2009) Attaching and effacing Escherichia coli downregulate DNA mismatch repair protein in vitro and are associated with colorectal adenocarcinomas in humans. PLoS One. 4: e5517. Majno, G. and Joris, I. (1995) Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146: 3-15. Malumbres, M. and Barbacid, M. (2005) Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends Biochem Sci. 30: 630-641. Marches, O., Ledger, T.N., Boury, M., Ohara, M., Tu, X., Goffaux, F., et al (2003) Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli deliver a novel effector called Cif, which blocks cell cycle G2/M transition. Mol Microbiol. 50: 1553-1567. Martin, S.J., O'Brien, G.A., Nishioka, W.K., McGahon, A.J., Mahboubi, A., Saido, T.C. and Green, D.R. (1995a) Proteolysis of fodrin (non-erythroid spectrin) during apoptosis. J Biol Chem. 270: 6425-6428. Martin, S.J., Reutelingsperger, C.P., McGahon, A.J., Rader, J.A., van Schie, R.C., LaFace, D.M. and Green, D.R. (1995b) Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J Exp Med. 182: 1545-1556.
133
Matsuzawa, T., Kuwae, A. and Abe, A. (2005) Enteropathogenic Escherichia coli type III effectors EspG and EspG2 alter epithelial paracellular permeability. Infect Immun. 73: 6283-6289. McDaniel, T.K. and Kaper, J.B. (1997) A cloned pathogenicity island from enteropathogenic Escherichia coli confers the attaching and effacing phenotype on E. coli K-12. Mol Microbiol. 23: 399-407. McDaniel, T.K., Jarvis, K.G., Donnenberg, M.S. and Kaper, J.B. (1995) A genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 1664-1668. McNamara, B.P. and Donnenberg, M.S. (1998) A novel proline-rich protein, EspF, is secreted from enteropathogenic Escherichia coli via the type III export pathway. FEMS Microbiol Lett. 166: 71-78. McNamara, B.P., Koutsouris, A., O'Connell, C.B., Nougayrede, J.P., Donnenberg, M.S. and Hecht, G. (2001) Translocated EspF protein from enteropathogenic Escherichia coli disrupts host intestinal barrier function. J Clin Invest. 107: 621-629. Meijer, L., Arion, D., Golsteyn, R., Pines, J., Brizuela, L., Hunt, T. and Beach, D. (1989) Cyclin is a component of the sea urchin egg M-phase specific histone H1 kinase. Embo J. 8: 2275-2282. Menard, R., Sansonetti, P., Parsot, C. and Vasselon, T. (1994) Extracellular association and cytoplasmic partitioning of the IpaB and IpaC invasins of S. flexneri. Cell. 79: 515-525. Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S. and Rosenshine, I. (2008) Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3: 104-113. Mimuro, H., Suzuki, T., Nagai, S., Rieder, G., Suzuki, M., Nagai, T., et al (2007) Helicobacter pylori dampens gut epithelial self-renewal by inhibiting apoptosis, a bacterial strategy to enhance colonization of the stomach. Cell Host Microbe. 2: 250-263. Molinari, M., Mercurio, C., Dominguez, J., Goubin, F. and Draetta, G.F. (2000) Human Cdc25 A inactivation in response to S phase inhibition and its role in preventing premature mitosis. EMBO Rep. 1: 71-79. Moynagh, P.N. (2005) The NF-kappaB pathway. J Cell Sci. 118: 4589-4592. Mukherjee, S., Keitany, G., Li, Y., Wang, Y., Ball, H.L., Goldsmith, E.J. and Orth, K. (2006) Yersinia YopJ acetylates and inhibits kinase activation by blocking phosphorylation. Science. 312: 1211-1214. Murray-Zmijewski, F., Slee, E.A. and Lu, X. (2008) A complex barcode underlies the heterogeneous response of p53 to stress. Nat Rev Mol Cell Biol. 9: 702-712. Nagai, T., Abe, A. and Sasakawa, C. (2005) Targeting of enteropathogenic Escherichia coli EspF to host mitochondria is essential for bacterial pathogenesis: critical role of the 16th leucine residue in EspF. J Biol Chem. 280: 2998-3011. Nakano, N., Urasawa, K., Takagi, Y., Saito, T., Kaneta, S., Ishikawa, S., et al (2005) Downregulation of cyclin-dependent kinase inhibitor; p57(kip2), is involved in the cell cycle progression of vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 338: 1661-1667. Naktin, J. and Beavis, K.G. (1999) Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. Clin Lab Med. 19: 523-536, vi. Nataro, J.P. and Kaper, J.B. (1998) Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11: 142-201. Nevins, J.R. (1998) Toward an understanding of the functional complexity of the E2F and retinoblastoma families. Cell Growth Differ. 9: 585-593. Niculescu, A.B., 3rd, Chen, X., Smeets, M., Hengst, L., Prives, C. and Reed, S.I. (1998) Effects of p21(Cip1/Waf1) at both the G1/S and the G2/M cell cycle transitions: pRb is a
134
critical determinant in blocking DNA replication and in preventing endoreduplication. Mol Cell Biol. 18: 629-643. Nishitani, H., Shiomi, Y., Iida, H., Michishita, M., Takami, T. and Tsurimoto, T. (2008) CDK inhibitor p21 is degraded by a proliferating cell nuclear antigen-coupled Cul4-DDB1Cdt2 pathway during S phase and after UV irradiation. J Biol Chem. 283: 29045-29052. Nougayrede, J.P., Taieb, F., De Rycke, J. and Oswald, E. (2005) Cyclomodulins: bacterial effectors that modulate the eukaryotic cell cycle. Trends Microbiol. 13: 103-110. Nougayrede, J.P., Boury, M., Tasca, C., Marches, O., Milon, A., Oswald, E. and De Rycke, J. (2001) Type III secretion-dependent cell cycle block caused in HeLa cells by enteropathogenic Escherichia coli O103. Infect Immun. 69: 6785-6795. Nougayrede, J.P., Marches, O., Boury, M., Mainil, J., Charlier, G., Pohl, P., et al (1999) The long-term cytoskeletal rearrangement induced by rabbit enteropathogenic Escherichia coli is Esp dependent but intimin independent. Mol Microbiol. 31: 19-30. Nougayrede, J.P., Homburg, S., Taieb, F., Boury, M., Brzuszkiewicz, E., Gottschalk, G., et al (2006) Escherichia coli induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells. Science. 313: 848-851. Nurse, P. (1990) Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature. 344: 503-508. Nyberg, K.A., Michelson, R.J., Putnam, C.W. and Weinert, T.A. (2002) Toward maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints. Annu Rev Genet. 36: 617-656. Oberhammer, F.A., Hochegger, K., Froschl, G., Tiefenbacher, R. and Pavelka, M. (1994) Chromatin condensation during apoptosis is accompanied by degradation of lamin A+B, without enhanced activation of cdc2 kinase. J Cell Biol. 126: 827-837. Ohara, M., Hayashi, T., Kusunoki, Y., Miyauchi, M., Takata, T. and Sugai, M. (2004) Caspase-2 and caspase-7 are involved in cytolethal distending toxin-induced apoptosis in Jurkat and MOLT-4 T-cell lines. Infect Immun. 72: 871-879. Ohh, M., Kim, W.Y., Moslehi, J.J., Chen, Y., Chau, V., Read, M.A. and Kaelin, W.G., Jr. (2002) An intact NEDD8 pathway is required for Cullin-dependent ubiquitylation in mammalian cells. EMBO Rep. 3: 177-182. Ohtsubo, M., Theodoras, A.M., Schumacher, J., Roberts, J.M. and Pagano, M. (1995) Human cyclin E, a nuclear protein essential for the G1-to-S phase transition. Mol Cell Biol. 15: 2612-2624. Oswald, E., Nougayrede, J.P., Taieb, F. and Sugai, M. (2005) Bacterial toxins that modulate host cell-cycle progression. Curr Opin Microbiol. 8: 83-91. Pagano, M., Pepperkok, R., Verde, F., Ansorge, W. and Draetta, G. (1992) Cyclin A is required at two points in the human cell cycle. Embo J. 11: 961-971. Pagano, M., Tam, S.W., Theodoras, A.M., Beer-Romero, P., Del Sal, G., Chau, V., et al (1995) Role of the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Science. 269: 682-685. Parker, L.L. and Piwnica-Worms, H. (1992) Inactivation of the p34cdc2-cyclin B complex by the human WEE1 tyrosine kinase. Science. 257: 1955-1957. Parker, L.L., Atherton-Fessler, S. and Piwnica-Worms, H. (1992) p107wee1 is a dual-specificity kinase that phosphorylates p34cdc2 on tyrosine 15. Proc Natl Acad Sci U S A. 89: 2917-2921. Pavletich, N.P. (1999) Mechanisms of cyclin-dependent kinase regulation: structures of Cdks, their cyclin activators, and Cip and INK4 inhibitors. J Mol Biol. 287: 821-828. Peres, S.Y., Marches, O., Daigle, F., Nougayrede, J.P., Herault, F., Tasca, C., et al (1997) A new cytolethal distending toxin (CDT) from Escherichia coli producing CNF2 blocks HeLa cell division in G2/M phase. Mol Microbiol. 24: 1095-1107.
135
Petroski, M.D. and Deshaies, R.J. (2005) Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 6: 9-20. Pohl, P.H., Peeters, J.E., Jacquemin, E.R., Lintermans, P.F. and Mainil, J.G. (1993) Identification of eae sequences in enteropathogenic Escherichia coli strains from rabbits. Infect Immun. 61: 2203-2206. Polyak, K., Kato, J.Y., Solomon, M.J., Sherr, C.J., Massague, J., Roberts, J.M. and Koff, A. (1994) p27Kip1, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev. 8: 9-22. Pratt, J.S., Sachen, K.L., Wood, H.D., Eaton, K.A. and Young, V.B. (2006) Modulation of host immune responses by the cytolethal distending toxin of Helicobacter hepaticus. Infect Immun. 74: 4496-4504. Ramamurthi, K.S. and Schneewind, O. (2003) Substrate recognition by the Yersinia type III protein secretion machinery. Mol Microbiol. 50: 1095-1102. Rao, L., Perez, D. and White, E. (1996) Lamin proteolysis facilitates nuclear events during apoptosis. J Cell Biol. 135: 1441-1455. Rasko, D.A., Rosovitz, M.J., Myers, G.S., Mongodin, E.F., Fricke, W.F., Gajer, P., et al (2008) The pangenome structure of Escherichia coli: comparative genomic analysis of E. coli commensal and pathogenic isolates. J Bacteriol. 190: 6881-6893. Raupach, B., Peuschel, S.K., Monack, D.M. and Zychlinsky, A. (2006) Caspase-1-mediated activation of interleukin-1beta (IL-1beta) and IL-18 contributes to innate immune defenses against Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Infect Immun. 74: 4922-4926. Ridley, A.J. and Hall, A. (1992) The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70: 389-399. Rime, H., Talbi, N., Popoff, M.R., Suziedelis, K., Jessus, C. and Ozon, R. (1998) Inhibition of small G proteins by clostridium sordellii lethal toxin activates cdc2 and MAP kinase in Xenopus oocytes. Dev Biol. 204: 592-602. Rogakou, E.P., Pilch, D.R., Orr, A.H., Ivanova, V.S. and Bonner, W.M. (1998) DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273: 5858-5868. Rosenshine, I., Donnenberg, M.S., Kaper, J.B. and Finlay, B.B. (1992) Signal transduction between enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and epithelial cells: EPEC induces tyrosine phosphorylation of host cell proteins to initiate cytoskeletal rearrangement and bacterial uptake. Embo J. 11: 3551-3560. Rosenshine, I., Ruschkowski, S., Stein, M., Reinscheid, D.J., Mills, S.D. and Finlay, B.B. (1996) A pathogenic bacterium triggers epithelial signals to form a functional bacterial receptor that mediates actin pseudopod formation. Embo J. 15: 2613-2624. Ruckdeschel, K., Pfaffinger, G., Trulzsch, K., Zenner, G., Richter, K., Heesemann, J. and Aepfelbacher, M. (2006) The proteasome pathway destabilizes Yersinia outer protein E and represses its antihost cell activities. J Immunol. 176: 6093-6102. Russo, A.A., Jeffrey, P.D., Patten, A.K., Massague, J. and Pavletich, N.P. (1996) Crystal structure of the p27Kip1 cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclin A-Cdk2 complex. Nature. 382: 325-331. Rytkonen, A. and Holden, D.W. (2007) Bacterial interference of ubiquitination and deubiquitination. Cell Host Microbe. 1: 13-22. Sakahira, H., Enari, M. and Nagata, S. (1998) Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature. 391: 96-99. Samba-Louaka, A., Nougayrede, J.P., Watrin, C., Jubelin, G., Oswald, E. and Taieb, F. (2008) Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell cycle by stabilizing the cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27. Cell Microbiol. 10: 2496-2508.
136
Samudrala, R., Heffron, F. and McDermott, J.E. (2009) Accurate prediction of secreted substrates and identification of a conserved putative secretion signal for type III secretion systems. PLoS Pathog. 5: e1000375. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L.A., Unsal-Kacmaz, K. and Linn, S. (2004) Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu Rev Biochem. 73: 39-85. Santamaria, D., Barriere, C., Cerqueira, A., Hunt, S., Tardy, C., Newton, K., et al (2007) Cdk1 is sufficient to drive the mammalian cell cycle. Nature. 448: 811-815. Scaletsky, I.C., Silva, M.L. and Trabulsi, L.R. (1984) Distinctive patterns of adherence of enteropathogenic Escherichia coli to HeLa cells. Infect Immun. 45: 534-536. Scheffner, M., Werness, B.A., Huibregtse, J.M., Levine, A.J. and Howley, P.M. (1990) The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell. 63: 1129-1136. Schwartz, L.M., Smith, S.W., Jones, M.E. and Osborne, B.A. (1993) Do all programmed cell deaths occur via apoptosis? Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 980-984. Senerwa, D., Olsvik, O., Mutanda, L.N., Lindqvist, K.J., Gathuma, J.M., Fossum, K. and Wachsmuth, K. (1989) Enteropathogenic Escherichia coli serotype O111:HNT isolated from preterm neonates in Nairobi, Kenya. J Clin Microbiol. 27: 1307-1311. Shao, F., Merritt, P.M., Bao, Z., Innes, R.W. and Dixon, J.E. (2002) A Yersinia effector and a Pseudomonas avirulence protein define a family of cysteine proteases functioning in bacterial pathogenesis. Cell. 109: 575-588. Shaw, R.K., Cleary, J., Murphy, M.S., Frankel, G. and Knutton, S. (2005) Interaction of enteropathogenic Escherichia coli with human intestinal mucosa: role of effector proteins in brush border remodeling and formation of attaching and effacing lesions. Infect Immun. 73: 1243-1251. Sheaff, R.J. (1997) Regulation of mammalian cyclin-dependent kinase 2. Methods Enzymol. 283: 173-193. Sheaff, R.J., Singer, J.D., Swanger, J., Smitherman, M., Roberts, J.M. and Clurman, B.E. (2000) Proteasomal turnover of p21Cip1 does not require p21Cip1 ubiquitination. Mol Cell. 5: 403-410. Shen, Z., Feng, Y., Rogers, A.B., Rickman, B., Whary, M.T., Xu, S., et al (2009) Cytolethal distending toxin promotes Helicobacter cinaedi-associated typhlocolitis in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 77: 2508-2516. Shenker, B.J., Demuth, D.R. and Zekavat, A. (2006) Exposure of lymphocytes to high doses of Actinobacillus actinomycetemcomitans cytolethal distending toxin induces rapid onset of apoptosis-mediated DNA fragmentation. Infect Immun. 74: 2080-2092. Sherr, C.J. (1993) Mammalian G1 cyclins. Cell. 73: 1059-1065. Sherr, C.J. and Roberts, J.M. (1999) CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev. 13: 1501-1512. Shiloh, Y. (1997) Ataxia-telangiectasia and the Nijmegen breakage syndrome: related disorders but genes apart. Annu Rev Genet. 31: 635-662. Silva, M.T., do Vale, A. and dos Santos, N.M. (2008) Secondary necrosis in multicellular animals: an outcome of apoptosis with pathogenic implications. Apoptosis. 13: 463-482. Staley, T.E., Jones, E.W. and Corley, L.D. (1969) Attachment and penetration of Escherichia coli into intestinal epithelium of the ileum in newborn pigs. Am J Pathol. 56: 371-392. Stehr, W., Mercer, T.I., Bernal, N.P., Erwin, C.R. and Warner, B.W. (2005) Opposing roles for p21(waf1/cip1) and p27(kip1) in enterocyte differentiation, proliferation, and migration. Surgery. 138: 187-194.
137
Strausfeld, U.P., Howell, M., Descombes, P., Chevalier, S., Rempel, R.E., Adamczewski, J., et al (1996) Both cyclin A and cyclin E have S-phase promoting (SPF) activity in Xenopus egg extracts. J Cell Sci. 109 ( Pt 6): 1555-1563. Struewing, J.P., Hartge, P., Wacholder, S., Baker, S.M., Berlin, M., McAdams, M., et al (1997) The risk of cancer associated with specific mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews. N Engl J Med. 336: 1401-1408. Sun, H.Q., Yamamoto, M., Mejillano, M. and Yin, H.L. (1999) Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. J Biol Chem. 274: 33179-33182. Sun, X., Li, Y., Li, W., Zhang, B., Wang, A.J., Sun, J., et al (2006) Selective induction of necrotic cell death in cancer cells by beta-lapachone through activation of DNA damage response pathway. Cell Cycle. 5: 2029-2035. Sutton, A. and Freiman, R. (1997) The Cak1p protein kinase is required at G1/S and G2/M in the budding yeast cell cycle. Genetics. 147: 57-71. Swanson, M.S. and Molofsky, A.B. (2005) Autophagy and inflammatory cell death, partners of innate immunity. Autophagy. 1: 174-176. Taieb, F., Nougayrede, J.P., Watrin, C., Samba-Louaka, A. and Oswald, E. (2006) Escherichia coli cyclomodulin Cif induces G2 arrest of the host cell cycle without activation of the DNA-damage checkpoint-signalling pathway. Cell Microbiol. 8: 1910-1921. Touchon, M., Hoede, C., Tenaillon, O., Barbe, V., Baeriswyl, S., Bidet, P., et al (2009) Organised genome dynamics in the Escherichia coli species results in highly diverse adaptive paths. PLoS Genet. 5: e1000344. Touitou, R., Richardson, J., Bose, S., Nakanishi, M., Rivett, J. and Allday, M.J. (2001) A degradation signal located in the C-terminus of p21WAF1/CIP1 is a binding site for the C8 alpha-subunit of the 20S proteasome. Embo J. 20: 2367-2375. Toyoshima, H. and Hunter, T. (1994) p27, a novel inhibitor of G1 cyclin-Cdk protein kinase activity, is related to p21. Cell. 78: 67-74. Tsvetkov, L.M., Yeh, K.H., Lee, S.J., Sun, H. and Zhang, H. (1999) p27(Kip1) ubiquitination and degradation is regulated by the SCF(Skp2) complex through phosphorylated Thr187 in p27. Curr Biol. 9: 661-664. Tu, X., Nisan, I., Yona, C., Hanski, E. and Rosenshine, I. (2003) EspH, a new cytoskeleton-modulating effector of enterohaemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 47: 595-606. Ubersax, J.A., Woodbury, E.L., Quang, P.N., Paraz, M., Blethrow, J.D., Shah, K., et al (2003) Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425: 859-864. van der Flier, L.G. and Clevers, H. (2009) Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71: 241-260. Verhagen, A.M., Ekert, P.G., Pakusch, M., Silke, J., Connolly, L.M., Reid, G.E., et al (2000) Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell. 102: 43-53. Vlach, J., Hennecke, S. and Amati, B. (1997) Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Embo J. 16: 5334-5344. Waga, S., Hannon, G.J., Beach, D. and Stillman, B. (1994) The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA. Nature. 369: 574-578. Waldman, T., Lengauer, C., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. (1996) Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature. 381: 713-716. Walisser, J.A. and Thies, R.L. (1999) Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition in oxidant-stressed endothelial cells prevents oncosis and permits caspase activation and apoptosis. Exp Cell Res. 251: 401-413.
138
Wang, D., Roe, A.J., McAteer, S., Shipston, M.J. and Gally, D.L. (2008a) Hierarchal type III secretion of translocators and effectors from Escherichia coli O157:H7 requires the carboxy terminus of SepL that binds to Tir. Mol Microbiol. 69: 1499-1512. Wang, X., Allen, T.D., May, R.J., Lightfoot, S., Houchen, C.W. and Huycke, M.M. (2008b) Enterococcus faecalis induces aneuploidy and tetraploidy in colonic epithelial cells through a bystander effect. Cancer Res. 68: 9909-9917. Wang, X.W., Zhan, Q., Coursen, J.D., Khan, M.A., Kontny, H.U., Yu, L., et al (1999) GADD45 induction of a G2/M cell cycle checkpoint. Proc Natl Acad Sci U S A. 96: 3706-3711. Watson, A.J. and Pritchard, D.M. (2000) Lessons from genetically engineered animal models. VII. Apoptosis in intestinal epithelium: lessons from transgenic and knockout mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 278: G1-5. Weissfeld, A.S., Halliday, R.J., Simmons, D.E., Trevino, E.A., Vance, P.H., O'Hara, C.M., et al (2005) Photorhabdus asymbiotica, a pathogen emerging on two continents that proves that there is no substitute for a well-trained clinical microbiologist. J Clin Microbiol. 43: 4152-4155. Welch, R.A., Burland, V., Plunkett, G., 3rd, Redford, P., Roesch, P., Rasko, D., et al (2002) Extensive mosaic structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 17020-17024. Whale, A.D., Garmendia, J., Gomes, T.A. and Frankel, G. (2006) A novel category of enteropathogenic Escherichia coli simultaneously utilizes the Nck and TccP pathways to induce actin remodelling. Cell Microbiol. 8: 999-1008. White, F.F., Yang, B. and Johnson, L.B. (2000) Prospects for understanding avirulence gene function. Curr Opin Plant Biol. 3: 291-298. Whitehouse, C.A., Balbo, P.B., Pesci, E.C., Cottle, D.L., Mirabito, P.M. and Pickett, C.L. (1998) Campylobacter jejuni cytolethal distending toxin causes a G2-phase cell cycle block. Infect Immun. 66: 1934-1940. Wiles, T.J., Kulesus, R.R. and Mulvey, M.A. (2008) Origins and virulence mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. Exp Mol Pathol. 85: 11-19. Wilkinson, K.D., Ventii, K.H., Friedrich, K.L. and Mullally, J.E. (2005) The ubiquitin signal: assembly, recognition and termination. Symposium on ubiquitin and signaling. EMBO Rep. 6: 815-820. Winstanley, C., Hales, B.A. and Hart, C.A. (1999) Evidence for the presence in Burkholderia pseudomallei of a type III secretion system-associated gene cluster. J Med Microbiol. 48: 649-656. Woestyn, S., Sory, M.P., Boland, A., Lequenne, O. and Cornelis, G.R. (1996) The cytosolic SycE and SycH chaperones of Yersinia protect the region of YopE and YopH involved in translocation across eukaryotic cell membranes. Mol Microbiol. 20: 1261-1271. Wren, B.W. (2003) The yersiniae--a model genus to study the rapid evolution of bacterial pathogens. Nat Rev Microbiol. 1: 55-64. Wu, C.L., Kirley, S.D., Xiao, H., Chuang, Y., Chung, D.C. and Zukerberg, L.R. (2001) Cables enhances cdk2 tyrosine 15 phosphorylation by Wee1, inhibits cell growth, and is lost in many human colon and squamous cancers. Cancer Res. 61: 7325-7332. Xu, Y. (2008) Induction of genetic instability by gain-of-function p53 cancer mutants. Oncogene. 27: 3501-3507. Xue, L., Fletcher, G.C. and Tolkovsky, A.M. (1999) Autophagy is activated by apoptotic signalling in sympathetic neurons: an alternative mechanism of death execution. Mol Cell Neurosci. 14: 180-198.
139
Yao, Q., Cui, J., Zhu, Y., Wang, G., Hu, L., Long, C., et al (2009) A bacterial type III effector family uses the papain-like hydrolytic activity to arrest the host cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 3716-3721. Youle, R.J. and Strasser, A. (2008) The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 9: 47-59. Young, V.B., Knox, K.A., Pratt, J.S., Cortez, J.S., Mansfield, L.S., Rogers, A.B., et al (2004) In vitro and in vivo characterization of Helicobacter hepaticus cytolethal distending toxin mutants. Infect Immun. 72: 2521-2527. Zhang, Y. and Xiong, Y. (2001) A p53 amino-terminal nuclear export signal inhibited by DNA damage-induced phosphorylation. Science. 292: 1910-1915. Zhong, W., Feng, H., Santiago, F.E. and Kipreos, E.T. (2003) CUL-4 ubiquitin ligase maintains genome stability by restraining DNA-replication licensing. Nature. 423: 885-889. Zhou, B.B. and Elledge, S.J. (2000) The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. Nature. 408: 433-439. Zhou, H., Monack, D.M., Kayagaki, N., Wertz, I., Yin, J., Wolf, B. and Dixit, V.M. (2005) Yersinia virulence factor YopJ acts as a deubiquitinase to inhibit NF-kappa B activation. J Exp Med. 202: 1327-1332. Zindy, F., Lamas, E., Chenivesse, X., Sobczak, J., Wang, J., Fesquet, D., et al (1992) Cyclin A is required in S phase in normal epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 182: 1144-1154.
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5ème partie : Annexes
Cycle Inhibiting Factors (CIFs) Are a Growing Family ofFunctional Cyclomodulins Present in Invertebrate andMammal Bacterial PathogensGregory Jubelin1,2, Carolina Varela Chavez3,4, Frederic Taieb1,2, Mark J. Banfield5, Ascel Samba-
Louaka1,2, Rika Nobe1,2, Jean-Philippe Nougayrede1,2, Robert Zumbihl3,4, Alain Givaudan3,4, Jean-Michel
Escoubas3,4, Eric Oswald1,2*
1 INRA, UMR1225, Toulouse, France, 2Universite de Toulouse, ENVT, UMR 1225, Toulouse, France, 3 INRA, UMR 1133 Laboratoire EMIP, Montpellier, France, 4Universite
Montpellier 2, UMR 1133 Laboratoire EMIP, Montpellier, France, 5Department of Biological Chemistry, John Innes Centre, NR4 7UH, Norwich, United Kingdom
Abstract
The cycle inhibiting factor (Cif) produced by enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli was the firstcyclomodulin to be identified that is injected into host cells via the type III secretion machinery. Cif provokes cytopathiceffects characterized by G1 and G2 cell cycle arrests, accumulation of the cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) p21waf1/cip1 and p27kip1 and formation of actin stress fibres. The X-ray crystal structure of Cif revealed it to be a divergent member ofa superfamily of enzymes including cysteine proteases and acetyltransferases that share a conserved catalytic triad. Here wereport the discovery and characterization of four Cif homologs encoded by different pathogenic or symbiotic bacteriaisolated from vertebrates or invertebrates. Cif homologs from the enterobacteria Yersinia pseudotuberculosis, Photorhabdusluminescens, Photorhabdus asymbiotica and the b-proteobacterium Burkholderia pseudomallei all induce cytopathic effectsidentical to those observed with Cif from pathogenic E. coli. Although these Cif homologs are remarkably divergent inprimary sequence, the catalytic triad is strictly conserved and was shown to be crucial for cell cycle arrest, cytoskeletonreorganization and CKIs accumulation. These results reveal that Cif proteins form a growing family of cyclomodulins inbacteria that interact with very distinct hosts including insects, nematodes and humans.
Citation: Jubelin G, Chavez CV, Taieb F, Banfield MJ, Samba-Louaka A, et al. (2009) Cycle Inhibiting Factors (CIFs) Are a Growing Family of FunctionalCyclomodulins Present in Invertebrate and Mammal Bacterial Pathogens. PLoS ONE 4(3): e4855. doi:10.1371/journal.pone.0004855
Editor: Malcolm James Horsburgh, University of Liverpool, United Kingdom
Received December 30, 2008; Accepted February 16, 2009; Published March 24, 2009
Copyright: ! 2009 Jubelin et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was supported by Grant ANR-05-MIIM-009 from the Agence Nationale de la Recherche and Grant BB/F0087321 from the Biotechnology andBiological Sciences (UK, to MJB). MJB is supported by the Royal Society (UK) through the award of a University Research Fellowship. CVC is supported by a grantfrom INRA and Languedoc-Rousillon region. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of themanuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
Introduction
Pathogenic bacteria have developed sophisticated arsenals ofvirulence factors that hijack eukaryotic host functions to their ownbenefit. One of the pathways targeted by several bacterial effectorsis the eukaryotic cell cycle. These toxins, termed cyclomodulins,can promote cell proliferation or, conversely, inhibit cell growthand modulate differentiation by blocking cell cycle progression[1,2]. The Cycle Inhibiting Factor (Cif) is a cyclomodulin injectedinto eukaryotic cells by the type III secretion system (T3SS) ofenteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli (EPECand EHEC). Cif from pathogenic E. coli triggers an irreversiblecytopathic effect characterized by cell cycle arrests at the G2/Mand G1/S phase transitions and, at least in HeLa cells,reorganization of the actin network [3–6]. In contrast to othercyclomodulins such as the cytolethal distending toxin [7] orcolibactin [8], Cif is not a genotoxin nor an activator of DNA-damage checkpoint pathways that lead to phosphorylation ofcyclin-dependent kinase 1 and consequent G2-arrest [5]. Both G1
and G2 arrests induced by Cif are correlated with theaccumulation of the cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs)
p21waf1/cip1 and p27kip1 (hereafter referred as p21 and p27), whichactively participate in the control of cell cycle progression. Theseaccumulations result from inhibition of their proteasome-mediateddegradation [6].Cif is composed of a C-terminal active domain (residues 21–
282) and an exchangeable N-terminal translocation signal encodedby the first ,20 amino acids [9]. The crystal structure of atruncated form of EPEC Cif (lacking the first 99 amino acids) wasrecently determined. The presence of a conserved catalytic triadcomprising Cys109, His165 and Gln185, revealed that Cif is adivergent member of a superfamily of enzymes that includescysteine proteases, acetyltranferases and transglutaminases [10].The three amino acids that comprise the triad are essential forCif’s ability to induce cytopathic effects in eukaryotic cells asmutation of these residues leads to loss of function [10].In EPEC and EHEC, Cif is not encoded within the locus of
enterocyte effacement (LEE), which includes T3SS machinerygenes and other effectors, but by a temperate lambdoid phage[11]. The cif gene has been widely disseminated by phageconversion within the natural population of E. coli, but positivelyselected within LEE-encoding strains [11]. Since Cif targets the
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cell cycle, a fundamental process conserved in all eukaryotic cells,it is reasonable to speculate that Cif homologs contribute to thepathogenicity of other bacterial species.In the present study, four homologs of Cif have been identified
and characterized in pathogenic or symbiotic bacteria: Burkholderiapseudomallei, Yersinia pseudotuberculosis, Photorhabdus luminescens andPhotorhabdus asymbiotica. The four Cif homologs are functional andinduce cell cycle arrest, p21 and p27 accumulation and actincytoskeleton rearrangement in HeLa cells in an identical mannerto EPEC Cif. The catalytic triad identified in the EPEC Cif crystalstructure is strictly conserved in the homologs (at the sequencelevel) and is involved in their cytopathic activity since mutation ofthe critical cysteine residue leads to loss of function. Therefore, Cifproteins form a conserved family of cyclomodulins present in bothsymbionts and pathogens of vertebrate and invertebrate hosts.
Results
Genes encoding Cif-like proteins are present in thegenomes of Yersinia, Burkholderia and PhotorhabdusspeciesThe cyclomodulin Cif was initially identified and characterized
in pathogenic E. coli (CifEc) [3]. Sequence database searches usingBLAST [12] revealed that CifEc shares similarity with hypotheticalproteins encoded by the genome of four other bacterial species(Table 1). CifEc exhibited a high degree of similarity with Ypk1971(56% identity), a protein encoded by the human pathogen Yersiniapseudotuberculosis strain YPIII [13]. Y. pseudotuberculosis infection inhumans causes gastroenteritis characterized by a self-limitedmesenteric lymphadenitis that mimics appendicitis. CifEc was alsosimilar to a protein encoded by the open reading frame bpss1385from B. pseudomallei strain K96243 (26% identity). B. pseudomallei isthe causative agent of melioidosis, an important cause of sepsis ineast Asia and northern Australia [14]. Putative Cif homologs werealso detected in two Photorhabdus species: P. luminescens, a symbioticbacterium for the soil nematode Heterorhabditis and a pathogen fora broad range of insects [15] and P. asymbiotica, an emerginghuman pathogen [16]. The proteins encoded by plu2515 (P.luminescens) and pha4011 (P. asymbiotica) share 23 and 26% ofidentity with CifEc respectively. Interestingly, these four bacterialspecies in which cifEc-like genes were found all possess at least oneT3SS. Proteins Ypk1971, Bpss1385, Plu2515 and Pha4011 arehereafter referred to as CifYp, CifBp, CifPl and CifPa respectively.Finally, it should also be noted that a truncated putative protein(GOS5485515) obtained from the translation of a DNA fragment
isolated from surface water marine samples [17,18] also showssequence similarity to CifEc.The degree of conservation and the phylogenetic relationship
between Cif homologs were analysed by constructing a multiplesequence alignment and a phylogenetic tree using the Neighbour-Joining method (Fig. 1). CifPl and CifPa clustered together andwere separated from a second group consisting of CifEc and CifYp.CifBp was the most divergent protein, located to a branch betweenthe two groups. This phylogenetic tree matches the acceptedbacterial taxonomy since B. pseudomallei belongs to the b-proteobacteria class whereas all others are enterobacteriacaebelonging to the c-proteobacteria class.
Genes encoding Cif-like proteins are found in highlyrearranged DNA regionsIn E. coli, the cif gene is located on an inducible lambdoid
prophage spread widely amongst EPEC and EHEC strains (Fig. 2)
Table 1. Cif homologs characterization and sequence conservation with CifEc.
Proteins Bacterial origin To Cif from E. coli GC content (%) Accession number
Identity (%) Similarity (%) cif geneswholegenome
CifEc Escherichia coli - - 41 50 AAQ07241
CifYp (Ypk1971) Yersinia pseudotuberculosis 56 72 43 47 ACA68260
CifBp (Bpss1385) Burkholderia pseudomallei 26 45 51 68 CAH38859
CifPl (Plu2515) Photorhabdus luminescens 23 42 33 43 CAE14889
CifPa (Pha4011) Photorhabdus asymbiotica 26 46 30 42 n/a
GOS5485515 n/a 51 66 n/a n/a ECE73989
(compared to the first 159 residues)
doi:10.1371/journal.pone.0004855.t001
Figure 1. Phylogenetic relationship between CifEc, CifYp, CifBp,CifPl and CifPa. A multiple alignment of the protein sequences (seeFig. 3A) was used to obtain the unrooted tree with Phylip’s DrawTreesoftware.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g001
Cif Functional Homologs
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[11]. In Photorhabdus strains, cifPl and cifPa are located downstream ofa region displaying a high degree of similarity to a prophagedescribed in Serratia entomophila (Fig. 2) [19]. This prophage isintegrated 5 to 6 times in the genome of both Photorhabdus species[20] and encodes genes for several putative virulence factors,notably a putative T3SS effector protein homologous to YopT fromYersiniae. This phage has no homology with the lambdoid prophagefound in E. coli isolates but displays some similarity to bacteriocinsand R-type pyocins [21]. In B. pseudomallei strain K96243 (Fig. 2),cifBp is located between two vestigial transposase genes onchromosome II near the hrp cluster, which codes for one of thethree T3SS present in B. pseudomallei [22]. Comparison of sequencedgenomes from different B. pseudomallei strains reveals that theorganization of this locus is highly variable. B. pseudomallei strainsS13 and 9 contain additional genes, encoding putative transposases,which are inserted near cifBp (Fig. 2). In B. pseudomallei strain 1106a,this region is deleted and cifBp is absent. These data suggest that
DNA transposition events could have lead to the heterogeneousdistribution of the cifEc-like gene in B. pseudomallei strains. Among thesequenced strains of Y. pseudotuberculosis, only the strain YPIIIpossesses a gene with similarity to cifEc. Comparison of the geneticenvironment between YPIII and other Y. pseudotuberculosis strainsrevealed that cifYp is positioned within a chromosomal locuspreviously described as the insertion site of ypm, a gene coding fora superantigenic toxin in strain AH [23]. Both ypm and cifYp arelocated downstream of a 26-bp sequence called yrs which ishomologous to dif, a site-specific recombination target used byfilamentous bacteriophages for host chromosome integration.Deletions in the yrs locus occur at a higher frequency comparedto others regions within the chromosome [23]. Genetic instability atthis locus could explain the heterogeneous distribution of both cifYpand ypm genes in the Y. pseudotuberculosis population.In conclusion, each cifEc-like gene is associated either with
mobile genetic elements, such as phages, or is located in region of
Figure 2. Genetic organization of the cif-like genes loci from E. coli strain B171, P. luminescens strain TT01, P. asymbiotica strainATCC43949, B. pseudomallei strains K96243, S13, 9 and 1106a and Y. pseudotuberculosis strains YPIII, AH and 9314/74. Open readingframes (ORFs) are represented by horizontal arrows and designation of first and last ORF from each schematic are indicated. Vertical arrows indicateposition of the yrs sequence (Yersinia recombination site).doi:10.1371/journal.pone.0004855.g002
Cif Functional Homologs
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the genome prone to rearrangements, suggesting acquisition of cifby horizontal gene transfer in all these bacterial species. This is inagreement with the observation that each cifEc-like gene has adifferent GC content compared to that of their cognate hostgenome (Table 1).
Cif proteins share common conserved motifs, including acatalytic triadDatabase searches with the sequence of CifEc or the Cif
homologs (including the truncated protein from the marinemetagenome) reveals no significant matches to well-characterizedproteins or motifs. However, alignment of CifEc and the homologsequences reveals several well conserved positions or regions, mostof which are located to the C-terminal two thirds of the proteins(Fig. 3A). The lack of sequence conservation at the far N-terminus(top panel in Fig. 3A) is consistent with the putative function ofthese regions as a translocation signal for the T3SS, which mayhave different requirements in the different parent organisms. It isnow well established that regions responsible for secretion/translocation and chaperone binding in T3SS effectors are locatedto the N-terminus, but often share no sequence similarity, even foreffector proteins translocated by the same T3SS [24].Sequence alignments of the Cif protein family identified a
conserved cysteine residue. Conservation of cysteine residues oftenimplies biological significance. The recent crystal structure of CifEcrevealed that C109 forms part of a catalytic triad. Further, theother two residues that form this structural motif (H165 and Q185)are also fully conserved in all Cif homologs (Fig 3A). In addition tothe catalytic triad, several other residues are also retained. Theposition of these residues, when mapped onto the structure of CifEc(possible for all but three of the conserved residues which are notpresent in the construct crystallised) reveals they cluster in threeregions (Fig. 3B). The first of these clusters surrounds the active siteand these residues are likely essential for retaining the catalytictriad in a suitable conformation to enable catalysis, or are directlyinvolved in substrate binding (residues with carbon atoms colouredyellow in Fig. 3B). The second cluster (residues with carbon atomscoloured green in Fig. 3B) is somewhat distant from the active siteand it seems likely that this region is important for maintainingstructural integrity, with a potentially important hydrogen bondidentified between the Od1 atom of Asp170 (located at the end ofb-strand 2) and the OH atom of Tyr265 (located at the end of b-strand 4). The importance of the third cluster (of three residues) isless apparent (residues with carbon atoms coloured purple inFig. 3B). This region may be involved in binding substratemolecules, or it may interact with the N-terminal region of CifEcnot present in the crystallised protein. In conclusion, in silicoanalyses of Cif homologs are consistent with a conserved functionfor these proteins, akin to CifEc.
CifBp is injected by the EPEC T3SS and induces cell cyclearrest and stress fibre formation in HeLa cellsAn EPEC strain deleted for its chromosomal cifEc gene (E22Dcif)
has previously been described [3]. To test whether the Cif-likeproteins are functional homologs of CifEc, the E22Dcif strain wascomplemented with a plasmid encoding each of the cifEc-likegenes, and these bacteria were used to infect cultured HeLa cells.Since the whole amino acid sequence of the putative proteinderived from the marine metagenome is not available, thistruncated protein was not included in these assays. Beforephenotypic characterization of cells infected with EPEC producingthe Cif homologs, the translocation efficiency of the proteins bythe EPEC T3SS was monitored using the TEM/CCF2 assay [9].
As expected, the CifEc-TEM fusion protein was properlytranslocated, as demonstrated by detection of intracellular b-lactamase activity (Fig. 4A). TEM activity was also detected in cellsinfected with E22Dcif producing CifBp-TEM, but levels of b-lactamase activity for CifPl-TEM, CifPa-TEM and CifYp-TEMwere similar to the basal level detected with the negative control(TEM alone, Fig. 4A). Since TEM fusion proteins were producedto similar levels in the bacteria (Fig. 4A), absence of intracellularTEM activity likely results from inefficient recognition and/orinjection of CifPl-TEM, CifPa-TEM and CifYp-TEM by the T3SSof EPEC. The lower translocation level of CifBp-TEM comparedto CifEc-TEM probably also reflects a poor recognition of thesecretion/translocation signal (STS) of CifBp by the T3SS fromEPEC. Indeed, when this fusion protein was expressed in an escNmutant (T3SS ATPase defective mutant), b-lactamase activity wasno longer detected in infected cells, confirming that translocationof CifBp-TEM by E22 strain is T3SS-dependent (data not shown).Since CifBp can be injected by the T3SS of E22, the capacity of
the protein to induce cytopathic phenotypes on HeLa cells wasanalysed using the infection model. In contrast to cells infectedwith E22Dcif carrying an empty vector, cells infected with E22Dcifproducing CifBp developed cell distension and actin stress fibresindistinguishable from those induced by a CifEc-expressing strain(Fig. 4B). CifBp also blocked cell cycle progression, as demonstrat-ed by the accumulation of G2 arrested cells containing 4N DNAcontent (Fig. 4B). These phenotypes were not induced when CifBpwas expressed in an escN mutant (data not shown). These dataclearly demonstrate that CifBp is a functional homolog of CifEc.
CifPl, CifPa and CifYp are functional homologs of CifEcAs the EPEC T3SS was not able to translocate CifPl, CifPa and
CifYp into infected cells, the cytopathic activity of these CifEc-likeproteins was investigated using purified recombinant samplescombined with a lipid mediated delivery system (BioPORTER) aspreviously described [5]. The effects of CifBp delivered with thissystem were also investigated. CifBp, CifPl and CifPa were all readilyoverexpressed and purified in a soluble form (see Materials andMethods). However, despite many efforts, it was not possible toobtain a purified soluble form of CifYp at levels necessary for activityassays using the BioPORTER delivery system. As previouslyreported [5], treatment of HeLa cells with BioPORTER mixedwith purified CifEc leads to cell enlargement and formation of actinstress fibres (Fig. 5), identical to the phenotype observed with theinfection model. However, as protein delivery with BioPORTER isnot as efficient as bacterial infection [5], only ,50% of the treatedcells exhibit morphological alterations (not shown). Studies of cellcycle patterns were therefore realized using G1/S synchronized cellsto improve visualization of G2 arrest. In contrast to cells incubatedwith the lipid delivery agent mixed with PBS alone, cells treatedwith BioPORTER+CifEc accumulated in G2 phase (38% of CifEc-treated cells contained 4N DNA-content against 10% for PBS-treated cells). Lipofection of purified CifBp into HeLa cells led toactin stress fibres and cell accumulation in G2 phase (27%) (Fig. 5),confirming the functionality of CifBp observed with the infectionassays. Introduction of purified CifPl or CifPa into HeLa cells withBioPORTER also led to cell enlargement, cytoskeleton alterationand accumulation of cells with 4N DNA content (40 and 25% forCifPl and CifPa respectively versus 10% for PBS treated cells, seeFig. 5). Therefore, CifPl and CifPa are also functional homologs ofCifEc. As these phenotypes are observed with purified proteins, theresults demonstrate that the proteins alone are sufficient to inducethe Cif-associated cytopathic effects.As it was not possible to introduce CifYp into cells using either
the infection or BioPORTER treatments, the function of this
Cif Functional Homologs
PLoS ONE | www.plosone.org 4 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
Figure 3. The three residues of the CifEc catalytic triad are conserved among members of the Cif protein family. (A) ClustalWalignment between CifEc, CifYp, CifBp, CifPl, CifPa and GOS_5485515. Fully conserved residues are indicated by a red background and amino acidsconserved more than 60 or 80% are indicated by a yellow or an orange background respectively. The cysteine, histidine and glutamine residues thatform the catalytic triad of CifEc are indicated with blue stars. (B) Position of the fully conserved residues in the three dimensional structure of CifEc.Side chain carbon atoms of residues comprising the catalytic triad are coloured cyan. The remaining fully conserved residues cluster in three regions,as described in the text. Residues coloured yellow, including glycine positions indicated by spheres, are P107, G110, A113, N159, L163-G164, S186-G189, G191, D200-W201; in green are D170, D172, E264-D266; in purple are K118-L119 and N273.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g003
Cif Functional Homologs
PLoS ONE | www.plosone.org 5 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
Figure 4. CifBp is injected by the EPEC T3SS and induces cell cycle arrest and stress fibre formation in HeLa cells. (A) Translocation ofCifEc-TEM, CifBp-TEM, CifPl-TEM, CifPa-TEM and CifYp-TEM fusions by the T3SS of EPEC strain E22. Hela cells were loaded with CCF2/AM substrate andwere infected for 2 and a half h with E22Dcif hosting plasmids expressing TEM alone or the different Cif-TEM fusions. Upper panel: intracellular b-lactamase activity detected by measuring cleavage of the CCF2/AM, as described in Material and Methods. This ratio represents the relativetranslocation efficiency [9]. Experiments were performed in triplicate and error bars represent standard errors of the mean. Lower panel: synthesis ofTEM fusions proteins were quantified in bacteria just before the translocation assays by western blot with anti-TEM antibodies. (B) G1/S synchronizedHeLa cells were exposed for 90 min to E22Dcif hosting either empty vector or the plasmids expressing CifEc or CifBp, washed and incubated withantibiotic for 20 or 72 h. Upper panels: F-actin was labelled with phalloidin-rhodamine (red) and DNA with DAPI (blue) 72 h post-infection. Barsrepresent 20 mm. Lower panels: cell cycle distribution was analysed by flow cytometry 20 h post-infection. 2N and 4N populations are indicated.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g004
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PLoS ONE | www.plosone.org 6 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
protein was analysed directly by expressing cifYp in HeLa cells.CifYp and CifEc, used as a positive control, were expressed as atranslational fusion with the fluorescent reporter protein GFP,allowing quantification of GFP-Cif expression in transfected cells.GFP alone was also transfected as a negative control. Among theGFP positive population, 96% of cells expressing GFP-CifEc had a2N DNA content whereas the 2N population of cells expressingGFP alone was only 82% (Fig. 6). Consistent with previous studiesdemonstrating that Cif could also induce G1/S arrest [6], thisresult demonstrates that the cell cycle of transfected cellsexpressing GFP-CifEc was blocked in G1 (2N DNA content). Asexpected, the cell cycle arrest was not observed when the criticalcysteine residue from the catalytic triad of CifEc was substituted(Fig. 6). Expression of GFP-CifYp in HeLa cells also led toaccumulation of GFP-positive cells with 2N DNA content (96%against 82% for cells expressing GFP alone), demonstrating thatCifYp induced a cell cycle arrest in G1 phase similarly to CifEc(Fig. 6). This result indicates that Cif from Y. pseudotuberculosis is afunctional homolog of CifEc.
The conserved catalytic triad is critical for the activity ofCif homologsMost of the conserved residues in Cif proteins are clustered in
discrete regions (Fig. 3). The cysteine, histidine and glutamineresidues forming the catalytic triad in CifEc were shown to becritical for activity [10]. To determine whether an equivalentfunctional catalytic site exists in the Cif homologs, the conservedcysteines in CifBp, CifPl and CifPa (C90, C128 and C123respectively) were substituted with a serine residue, and thecorresponding proteins were purified prior to delivery into HeLacells using the BioPORTER system. In contrast to the wild-typeproteins, the cysteine variants did not induce cell enlargement andstress fibre formation (Fig. 7A). Further, analysis of DNA content
revealed that accumulation of G2-arrested cells did not occurwhen cells were treated with the cysteine variants (Fig. 7B).Expression of the cysteine variant from CifYp by transfection inHeLa cells also revealed that the cell cycle was not arrested incontrast to cells producing the wild-type protein (Fig. 6). Theseresults demonstrate that the conserved cysteine residue is criticalfor Cif activity. Also, as the histidine and glutamine residues thatcomplete the triad are also conserved in the sequences of the Cifhomologs, this suggests that catalytic triads also exist in CifBp,CifPl, CifPa and CifYp.
Cif homologs induce p21 and p27 accumulation in cellsIt has recently been shown that the cytopathic activity of CifEc is
correlated to the accumulation of CKIs p21 and p27, twoimportant regulators of cell cycle progression [6]. Since all Cifhomologs appear to share the same catalytic triad and induceidentical cytopathic phenotypes in HeLa cells, we wonder if theycould hijack the same signaling pathways, despite the fact that twoof these proteins are produced by bacteria colonizing insects andnematodes. Western-blot analysis of HeLa cells treated withpurified Cif homologs indicated that levels of p21 and p27 increasein the presence of wild-type CifBp, CifPl and CifPa (Fig. 8). Anintact catalytic triad is integral to this accumulation as CKIs levelswere not affected when cells were treated with the cysteine variants(Fig. 8). This accumulation of p21 and p27 suggests that themolecular mechanisms involved in Cif cytotoxicity on HeLa cellsare identical for CifEc and the Cif homologs.
Discussion
CifEc proteins belong to a family of cyclomodulins that inhibithost cell proliferation by inducing G1/S and G2/M phasetransition blocks [3,6]. In this study, functional homologs of Cif
Figure 5. Lipofection of purified CifBp, CifPl and CifPa proteins into HeLa cells induce cell cycle arrest and stress fibres formationakin to CifEc. G1/S synchronized HeLa cells were treated with purified proteins or PBS in combination with a lipidic delivery agent (BioPORTER).Upper panels: F-actin was stained with phalloidin-rhodamine (red) and DNA with DAPI (blue) 72 h post-treatment. Bars represent 20 mm. Lowerpanels: cell cycle distribution was analysed by flow cytometry 20 h post-treatment. Percentages of cells with 4N DNA content are indicated.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g005
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PLoS ONE | www.plosone.org 7 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
from pathogenic E. coli have been identified in Y. pseudotuberculosis,B. pseudomallei, P. luminescens and P. asymbiotica. These homologspossess the same capacity as CifEc to induce cell cycle arrest, actinstress fibre formation and p21 and p27 CKIs accumulation whenintroduced into HeLa cells, suggesting they target the samesubstrates. Each of the Cif homologs possesses a predicted catalytictriad as identified in the crystal structure of CifEc. This triad isinvolved in the cytotoxic activity of each Cif homolog assubstitution of the conserved cysteine residue in any of theproteins leads to inactivation.In pathogenic E. coli, cif is located on an inducible lambdoıd
prophage that has spread widely within the natural population ofE. coli [11]. Analysis of the genetic locus containing cif in otherbacteria reveals that cif genes from Photorhabdus species are alsolocated downstream of a prophage, while cif from B. pseudomalleiand Y. pseudotuberculosis are inserted in highly rearranged DNAregions leading to heterogeneous distribution within bacterialpopulations. In addition, GC content of cif genes shows substantialdeviation from the general pattern within their respective genome.In light of these data, cif genes are proposed to have been acquiredby horizontal gene transfer and could be defined as xenologsaccording to the nomenclature proposed by Koonin et al. [25].The phylogenetic relationship between the different xenologs is inagreement with the bacterial taxonomy since Cif from B.pseudomallei, the only b-proteobacteria, is the most divergentprotein. This indicates that protein sequence variation is, to someextent, a consequence of speciation events and suggests that cifgenes were probably acquired early during bacterial evolution. AllCif-producing bacteria encode at least one T3SS that could injectthe effector into host cells during infection. It is interesting tospeculate that tight association between horizontally acquired
effectors and the T3SS machinery in bacteria is a consequence ofselective pressure since advantages conferred by effector acquisi-tion will occur only if the recipient organism produces thesecretion/translocation machinery. Such an association hasalready been described in E. coli and Salmonella enterica serovarTyphimurium where phage-encoded T3SS effectors were associ-ated with T3SS producing isolates [11,26].Bacteria habouring the cif gene spend part of their life cycle in
association with eukaryotic organisms. While E. coli, B. pseudomallei,Y. pseudotuberculosis and P. asymbiotica are mammalians pathogens[13,14,16,27], both Photorhabdus species are pathogenic for insectsand symbiotic to nematodes [15,28,29]. Like the Cif proteins,other families of T3SS effectors are produced by bacterialpathogens that target distinct hosts. For example, a number ofproteins belonging to the YopT cysteine protease family have beendescribed in mammalian, insect and plant pathogens [30].Although the overall sequence identity at the amino acid level isnot extensive, every member of the YopT family shows severalinvariant residues including a cysteine, a histidine and an aspartatethat form a putative catalytic triad. Representatives from theYopT-like family interfere with diverse host immune responsesand display protease activity dependent on an intact catalytic triad.YopT, the archetypal member of this family, is the most potentinhibitor of phagocytosis produced by Yersinia [31] and cleavesprenylated GTPases of the Rho family in host cells [32]. Similar toYopT, LopT from P. luminescens is able to release RhoA fromhuman and insect cell membranes [33]. AvrPphB is an avirulenceprotein of the YopT-like family from the plant pathogenPseudomonas syringae that triggers a disease-resistance response in anumber of host plants, including Arabidopsis [30]. Searches of theProtein Data Bank with the structure of CifEc reveal close
Figure 6. Transfection of CifYp induces cell cycle arrest in HeLa cells. HeLa cells were transfected with plasmid expressing GFP, GFP-CifEc orGFP-CifYp (wild-type (WT) or Cys variants (C/A)) fusion proteins. GFP expression and DNA content were analysed by flow cytometry 48 h post-transfection. Data are represented on two dimensional contour plot graphics with DNA content on the X-axis and GFP signal on the Y-axis. Gatescorresponding to the GFP negative and GFP positive populations are indicated. Among the GFP positive populations, percentages of cells with 2N or4N DNA content are indicated within the corresponding quadrants.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g006
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PLoS ONE | www.plosone.org 8 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
structural homology to AvrPphB. Although the residues that formthe catalytic triad in each protein are different (C/H/D forAvrPphB and C/H/Q for Cif), the overall folds and residuescomprising the catalytic triads superimpose well [10].YopJ-like proteins form a second family of T3SS effectors
produced by different animal and plant pathogens that also possessconserved residues forming a predicted catalytic triad, which isrequired for protease activity [34]. YopJ, the archetypal memberof this family, is an essential virulence factor produced by Yersiniawhich blocks MAPK and NFkB pathways resulting in inhibition ofhost immune responses [35,36]. In contrast to members of the Cifprotein family, that induce similar phenotypes in HeLa cells,proteins belonging to the YopT or the YopJ family appear to
generate different responses in eukaryotic cells. For example,AvrA, a Salmonella YopJ-like T3SS effector (56% identity withYopJ), does not induce the same host responses observed for YopJ[37]. Further studies are required to determine whether theconserved cytopathic effects induced by Cif proteins in HeLa cells,notably cell cycle arrest, also occur in their respective host cells (gutenterocytes for intestinal pathogens, insect cells for Photorhabdusspecies, etc).Interestingly, the plant symbiont Rhizobium sp. strain NGR234
produces NopJ, a YopJ-like protein and NopT, a T3SS effectorbelonging to YopT-like family [38–40]. Both cysteine proteaseswere shown to be involved in the host-specific nodulation responseof legumes [38,40]. Symbiotic bacteria deploy somewhat similar
Figure 7. Cysteine residues from predicted catalytic triads are essential for Cif homologs activity. (A) HeLa cells were treated withpurified Cif homologs proteins (wild-type (WT) or cysteine variants (C/S)) in combination with a lipidic delivery agent (BioPORTER). F-actin was stainedwith phalloidin-rhodamine (red) and DNA with DAPI (blue) 72 h post-treatment. Bars represent 20 mm. (B) G1/S synchronized HeLa cells were treatedwith PBS or purified Cif proteins (as indicated), in combination with BioPORTER. The percentages of the populations containing 4N DNA content weredetermined by flow cytometry 20 h post-treatment.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g007
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PLoS ONE | www.plosone.org 9 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
strategies for colonizing host cells as those used by mammalianpathogens. The T3SS is, for example, required for host cell invasionby a variety of symbiotic bacteria [41–43]. As the Cif-producingPhotorhabdus species are not only insect pathogens but also nematodesymbionts, it is tempting to speculate that Cif may also contribute tothe symbiotic process. Further, CdtB, the active monomer of thecyclomodulin CDT, is expressed in Hamiltonella defensa, a symbiontof pea aphids [44]. It maybe that symbionts use cyclomodulins likeCDT and Cif to modulate, rather than globally deregulate, hostsignaling pathways resulting in initiation of symbiosis. Future studieswill rely on further molecular (in vitro) analysis and in vivo models toachieve a full understanding of the roles of Cif in microbialpathogenesis, commensalism and symbiosis.
Materials and Methods
Cell line, bacterial strains and plasmidsHeLa cells (ATCC CCL-2) were cultured in Dulbecco’s modified
Eagle medium (DMEM; Invitrogen) supplemented with 10% foetalcalf serum (FCS; Eurobio) and 80 mg ml21 gentamicin at 37uC in a5%CO2 atmosphere. For synchronization in G1/S phase, HeLa cellswere treated with 2 mM thymidine (Sigma) for 18 h, washed 3 timeswith Hank’s balanced salt solution (HBSS; Invitrogen), incubated innormal medium for 9 h and treated again with 2 mM thymidine for16 h. Bacterial strains and plasmids used in this study are listed inTable 2. Bacteria were cultured in Luria-Bertani (LB) broth or ininteraction medium (DMEM with 25 mM Hepes and 5% FCS).Antibiotics were used at the following final concentrations:chloramphenicol 20 mg ml21 and kanamycin 25 mg ml21.
Construction of plasmids expressing Cif and Cif-TEMproteinsTo construct plasmids suitable for expressing Cif homologs from
B. pseudomallei, Y. pseudotuberculosis, P. luminescens and P. asymbiotica inEPEC, cifBp, cifYp, cifPl and cifPa genes were amplified fromrespective genomic DNA with primers adding a XbaI restrictionsite at the start codon and a BamHI (or XhoI for cifBp) restriction siteafter the stop codon. PCR products were digested and ligated intothe corresponding sites of the pBRSK vector [45]. The resultingplasmids pEL1, pEL2, pEL4 and pEL5 contain, respectively, cifBp,cifPl, cifPa and cifYp genes under the control of a Plac promoter.To create the pKTEM vector necessary to construct TEM
fusions, the multiple cloning site and blaM gene (encoding the b-lactamase TEM-1) were amplified by PCR from pCX340 ([9])
with primers containing XhoI and XbaI restriction sites. The PCRfragment was digested and cloned into the corresponding sites ofpBBR1MCS-2 ([46]). Plasmids encoding translational fusionbetween the different Cif proteins and the b-lactamase TEM-1were obtained by cloning cif genes into the pKTEM vector.Briefly, cifBp, cifPl, cifEc, cifPa and cifYp genes were amplified frompEL1, pEL2, pEL3, pEL4 and pEL5 respectively using primerswith NdeI-EcoRI restriction sites (or XhoI-HindIII for pEL4),digested and cloned into the corresponding sites of pKTEM.The resulting plasmids pGJ719, pGJ720, pGJ626, pGJ721 andpGJ803 encode CifBp-TEM, CifPl-TEM, CifEc-TEM, CifPa-TEMand CifYp-TEM fusion proteins respectively. All the constructswere verified by DNA sequencing (Cogenics, France).
Purification of CifBp, CifPl, CifPa and CifEc proteinsFor production of recombinant protein, the genes encoding
cifBp, cifPl, cifPa and cifYp were cloned into the pET28a vector(Novagen). The resulting constructs encoded proteins with an N-terminal 6xHis tag. Plasmids were named pMB1, pCC1, pCC3and pGJ803 respectively. The plasmid for expression of 6xHis-CifEc has been described elsewhere [5]. Mutations of theconserved cysteine residues were obtained by inverse PCR usingpET28 based constructs as a template and oligonucleotidescontaining specific base changes. All the constructs were verifiedby DNA sequencing (Cogenics, France). After transformation intothe E. coli BL21-CodonPlusH (DE3)-RIPL strain (Stratagene),bacteria were grown in LB to an OD600 nm of ,0.6 then inducedwith 0.5 mM IPTG for 3 h at 37uC. Purification of native proteinswas achieved by Ni-NTA chromatography as recommended bythe manufacturer (Qiagen) and, if necessary, gel filtration. Sampleswere then dialysed against PBS, aliquoted and stored at 280uC.
Construction of plasmids expressing GFP-Cif fusionproteins and transfection assaysPlasmids encoding translational fusions between the fluorescent
reporter protein GFP and CifEc or CifYp were obtained by cloningcif genes (encoding the wild-type or the cysteine variant forms) intothe pTagGFP-C vector (Evrogen). The resulting plasmids wereverified by DNA sequencing (Cogenics, France). Transfections wereperformed in 6-well plates with FuGENE (Roche) according to themanufacturer’s instructions. Two days after transfection, HeLa cellswere exposed to trypsin, washed with ice-cold PBS, fixed for 3 h at4uC in PBS with 1% formaldehyde, permeabilized overnight at 4uCin PBS ethanol 70% and stained with propidium iodide for 30 minat 37uC. Cells were analysed using a FACScalibur flow cytometer(Becton Dickinson) and data from at least 20 000 cells were analysedusing FloJo software v8.5 (Tree Star).
Infection, translocation and BioPORTER assaysFor infection experiments, bacterial strains were cultured
overnight in LB broth then diluted 1:100 in interaction mediumfor 3 h at 37uC in a 5% CO2 atmosphere. HeLa cells were washedwith HBSS and infected for the indicated time in interactionmedium with a multiplicity of infection (MOI) of 100 bacteria percell (except as otherwise noted). After the infection, cells werewashed with HBSS then cultivated for the indicated times inDMEM medium supplemented with 10% FCS and 200 mg ml21
gentamicin.Translocation levels of Cif-TEM fusion proteins were determined
using CCF2/AM (Invitrogen) as a substrate for intracellular TEMenzyme as described previously [9]. Briefly, HeLa cells seeded inblack 96-well plates were loaded for 1 h at 37uCwith 1.7 mMCCF2/AM diluted in DMEM with 2 mM probenecid and then infected for
Figure 8. Cif homologs induce p21 and p27 accumulation incells. HeLa cells were treated with PBS or purified Cif proteins (wild-type (WT) or cysteine variants (C/S) as indicated), in combination withBioPORTER. Cell extracts were probed with anti-p21, anti-p27 and anti-actin antibodies 24 h post-treatment.doi:10.1371/journal.pone.0004855.g008
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2 and a half h with bacteria expressing TEM fusion proteins.Fluorescence was quantified in a microplate reader (TECAN InfiniteM200) with excitation set at 410 nm (9 nm bandwidth) and emissionat 450 nm for blue fluorescence and 520 nm for green fluorescence(20 nm bandwidth). Translocation was expressed as the emissionratio at 450/520 nm. To determine the expression level of TEMfusion proteins in bacteria, bacterial cultures with identical OD600 nm
were pelleted, resuspended in SDS-PAGE sample buffer, boiled for5 min and subjected to western blot analysis with anti-TEM-1antibodies (QED Biosciences).For BioPORTER assays, 80 ml of purified proteins
(250 mg ml21) (or PBS as a negative control) were added to oneBioPORTER tube (Genlantis) and resuspended in 420 or 920 mlof DMEM. The samples were added to the cells grown in BDFalcon culture slides or in 6-well plates and incubated for 4 h.BioPORTER mixes were replaced by fresh complete medium andthe cells were incubated for 16–72 h.
Actin stress fibre and cell cycle analysesFor cell morphology and actin cytoskeleton visualization, cells
were fixed for 15 min in PBS supplemented with 4% formalde-
hyde, permeabilized with 0.1% Triton X-100 and stained withrhodamine-phalloidin (Molecular Probes) and DAPI (Sigma).Images were acquired with a DMRB fluorescence microscopeequipped with a DFC300FX digital camera (Leica). Cell cycledistribution analyses were performed as previously described [47].Briefly, cells were grown on 6-well plates, synchronized in G1/Sphase and infected or treated with BioPORTER. The cells wereexposed to trypsin, washed, fixed with ethanol, stained withpropidium iodide and analyzed by flow cytometry. Percentages ofG2 populations were calculated using the Dean-Jett-Fox modelfrom the FlowJo software (Tree Star).
Western Blot analysesFor Western blot analyses, 66105 cells were lysed in 80 ml of
SDS-PAGE sample buffer, sonicated for 2 s to shear DNA andthen boiled for 5 min. Protein samples were resolved on 4–12%NuPage gradient gels (Invitrogen) and blotted on PVDFmembranes. Membranes were blocked in TBST (10 mM TrispH 7.8, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) 5% non-fat dry milk,then probed with primary antibody (0.5 mg ml21) in TBST 5%non-fat dry milk. Primary antibodies were: anti-actin (ICN), anti-
Table 2. E. coli strains and plasmids used in this study.
Strains and plasmids Genotype or description Reference
strains
E22Dcif Rabbit EPEC Dcif::frt [3]
DH5a Invitrogen
BL21-CodonPlus (DE3) Stratagene
Plasmids
pBRSK Cloning vector derived from pBR328 [45]
pEL1 pBRSK expressing CifBp This study
pEL2 pBRSK expressing CifPl This study
pEL3 pBRSK expressing CifEc [5]
pEL4 pBRSK expressing CifPa This study
pEL5 pBRSK expressing CifYp This study
pBBR1MCS-2 Low-copy cloning vector [46]
pKTEM TEM-1 fusion cloning vector derived from pBBR1MCS-2 This study
pGJ626 pKTEM expressing CifEc-TEM fusion This study
pGJ719 pKTEM expressing CifBp-TEM fusion protein This study
pGJ720 pKTEM expressing CifPl-TEM fusion protein This study
pGJ721 pKTEM expressing CifPa-TEM fusion protein This study
pGJ803 pKTEM expressing CifYp-TEM fusion protein This study
pET28a Protein expression vector Novagen
pMB1 pET28a expressing 6xHis-CifBp fusion protein This study
pMB2 pET28a expressing 6xHis-CifBp C90S fusion protein This study
pCC1 pET28a expressing 6xHis-CifPl fusion protein This study
pCC2 pET28a expressing 6xHis-CifPl C128S fusion protein This study
pCC3 pET28a expressing 6xHis-CifPa fusion protein This study
pCC4 pET28a expressing 6xHis-CifPa C123S fusion protein This study
pTagGFP-C Cloning vector for GFP translational fusion expression Evrogen
pRN1 pTagGFP-C expressing GFP-CifEc WT This study
pRN2 pTagGFP-C expressing GFP-CifEc C109A This study
pGJ808 pTagGFP-C expressing GFP-CifYp WT This study
pGJ809 pTagGFP-C expressing GFP-CifYp C117A This study
doi:10.1371/journal.pone.0004855.t002
Cif Functional Homologs
PLoS ONE | www.plosone.org 11 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
p21 and anti-p27 (Santa Cruz Biotechnology). Bound antibodieswere visualized with horseradish peroxidase-conjugated secondaryantibody. Acquisitions were performed with a Molecular ImagerChemiDoc XRS system (Bio-Rad). Protein levels were quantifiedwith Quantity One Software (Bio-Rad) and normalized with actinlevel.
Bioinformatic analysesThe search for proteins sharing similarity with CifEc was
performed using BLAST on the NCBI server and MaGe systemon the Genoscope server for private access to the genome of P.asymbiotica (Sanger Institute). Genetic organization of the cif-likegenes loci were determined using Artemis software from theSanger Institute and MaGe system. Multiple alignments of Cifsequences were generated with ClustalW and edited using
GeneDoc software. Based on this alignment, the unrootedphylogentic tree was obtained using Phylip’s Draw software.
Acknowledgments
We thank Estelle Loukiadis, Guillaume Sanchez, Paul Race and XavierCharpentier for pilot studies and Mark Stevens for providing genomicDNA from B. pseudomallei.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: GJ FT ASL RN JPN JME EO.Performed the experiments: GJ CVC FT MJB ASL RN. Analyzed thedata: GJ FT ASL RN JPN EO. Contributed reagents/materials/analysistools: GJ EO. Wrote the paper: GJ CVC FT MJB ASL RN JPN RZ AGJME EO.
References
1. Oswald E, Nougayrede JP, Taieb F, Sugai M (2005) Bacterial toxins thatmodulate host cell-cycle progression. Curr Opin Microbiol 8: 83–91.
2. Nougayrede JP, Taieb F, De Rycke J, Oswald E (2005) Cyclomodulins: bacterialeffectors that modulate the eukaryotic cell cycle. Trends Microbiol 13: 103–110.
3. Marches O, Ledger TN, Boury M, Ohara M, Tu X, et al. (2003)Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli deliver a novel effectorcalled Cif, which blocks cell cycle G2/M transition. Mol Microbiol 50:1553–1567.
4. Nougayrede JP, Boury M, Tasca C, Marches O, Milon A, et al. (2001) Type IIIsecretion-dependent cell cycle block caused in HeLa cells by enteropathogenicEscherichia coli O103. Infect Immun 69: 6785–6795.
5. Taieb F, Nougayrede JP, Watrin C, Samba-Louaka A, Oswald E (2006)Escherichia coli cyclomodulin Cif induces G2 arrest of the host cell cycle withoutactivation of the DNA-damage checkpoint-signalling pathway. Cell Microbiol 8:1910–1921.
6. Samba-Louaka A, Nougayrede JP, Watrin C, Jubelin G, Oswald E, et al. (2008)Bacterial cyclomodulin Cif blocks the host cell cycle by stabilizing the cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27. Cell Microbiol 10: 2496–2508.
7. Nesic D, Hsu Y, Stebbins CE (2004) Assembly and function of a bacterialgenotoxin. Nature 429: 429–433.
8. Nougayrede JP, Homburg S, Taieb F, Boury M, Brzuszkiewicz E, et al. (2006)Escherichia coli induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells. Science313: 848–851.
9. Charpentier X, Oswald E (2004) Identification of the secretion and translocationdomain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effectorCif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.J Bacteriol 186: 5486–5495.
10. Hsu Y, Jubelin G, Taieb F, Nougayrede JP, Oswald E, et al. (2008) Structure ofthe cyclomodulin Cif from pathogenic Escherichia coli. J Mol Biol 384: 465–477.
11. Loukiadis E, Nobe R, Herold S, Tramuta C, Ogura Y, et al. (2008) Distribution,functional expression, and genetic organization of Cif, a phage-encoded type III-secreted effector from enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli.J Bacteriol 190: 275–285.
12. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic localalignment search tool. J Mol Biol 215: 403–410.
13. Naktin J, Beavis KG (1999) Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. ClinLab Med 19: 523–536.
14. Wiersinga WJ, van der Poll T, White NJ, Day NP, Peacock SJ (2006)Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat RevMicrobiol 4: 272–282.
15. Boemare NE, Akhurst RJ, Mourant RG (1993) DNA relatedness betweenXenorhabdus spp. (Enterobacteriaceae), symbiotic bacteria of entomopathogenicnematodes, and a proposal to transfer Xenorhabdus luminescens to a new genus,Photorhabdus gen. nov. Int J Syst Bacteriol 43: 249–255.
16. Gerrard J, Waterfield N, Vohra R, ffrench-Constant R (2004) Human infectionwith Photorhabdus asymbiotica: an emerging bacterial pathogen. Microbes Infect 6:229–237.
17. Yooseph S, Sutton G, Rusch DB, Halpern AL, Williamson SJ, et al. (2007) TheSorcerer II global ocean sampling expedition: expanding the universe of proteinfamilies. PLoS Biol 5: e16. doi:10.1371/journal.pbio.0050016.
18. Kannan N, Taylor SS, Zhai Y, Venter JC, Manning G (2007) Structural andfunctional diversity of the microbial kinome. PLoS Biol 5: e17. doi:10.1371/journal.pbio.0050017.
19. Hurst MR, Glare TR, Jackson TA (2004) Cloning Serratia entomophila antifeedinggenes–a putative defective prophage active against the grass grub Costelytrazealandica. J Bacteriol 186: 5116–5128.
20. Duchaud E, Rusniok C, Frangeul L, Buchrieser C, Givaudan A, et al. (2003)The genome sequence of the entomopathogenic bacterium Photorhabdusluminescens. Nat Biotechnol 21: 1307–1313.
21. Hurst MR, Beard SS, Jackson TA, Jones SM (2007) Isolation andcharacterization of the Serratia entomophila antifeeding prophage. FEMSMicrobiol Lett 270: 42–48.
22. Rainbow L, Hart CA, Winstanley C (2002) Distribution of type III secretiongene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. mallei. J MedMicrobiol 51: 374–384.
23. Carnoy C, Floquet S, Marceau M, Sebbane F, Haentjens-Herwegh S, et al.(2002) The superantigen gene ypm is located in an unstable chromosomal locus ofYersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol 184: 4489–4499.
24. Ramamurthi KS, Schneewind O (2003) Substrate recognition by the Yersiniatype III protein secretion machinery. Mol Microbiol 50: 1095–1102.
25. Koonin EV, Makarova KS, Aravind L (2001) Horizontal gene transfer inprokaryotes: quantification and classification. Annu Rev Microbiol 55: 709–742.
26. Ehrbar K, Hardt WD (2005) Bacteriophage-encoded type III effectors inSalmonella enterica subspecies 1 serovar Typhimurium. Infect Genet Evol 5: 1–9.
27. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL (2004) Pathogenic Escherichia coli. Nat RevMicrobiol 2: 123–140.
28. Akhurst RJ, Boemare NE, Janssen PH, Peel MM, Alfredson DA, et al. (2004)Taxonomy of Australian clinical isolates of the genus Photorhabdus and proposalof Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica subsp. nov. and P. asymbiotica subsp.australis subsp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 54: 1301–1310.
29. Gerrard JG, Joyce SA, Clarke DJ, ffrench-Constant RH, Nimmo GR, et al.(2006) Nematode symbiont for Photorhabdus asymbiotica. Emerg Infect Dis 12:1562–1564.
30. Shao F, Merritt PM, Bao Z, Innes RW, Dixon JE (2002) A Yersinia effector and aPseudomonas avirulence protein define a family of cysteine proteases functioning inbacterial pathogenesis. Cell 109: 575–588.
31. Iriarte M, Cornelis GR (1998) YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affectsthe cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29: 915–929.
32. Shao F, Vacratsis PO, Bao Z, Bowers KE, Fierke CA, et al. (2003) Biochemicalcharacterization of the Yersinia YopT protease: cleavage site and recognitionelements in Rho GTPases. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 904–909.
33. Brugirard-Ricaud K, Duchaud E, Givaudan A, Girard PA, Kunst F, et al. (2005)Site-specific antiphagocytic function of the Photorhabdus luminescens type IIIsecretion system during insect colonization. Cell Microbiol 7: 363–371.
34. Orth K (2002) Function of the Yersinia effector YopJ. Curr Opin Microbiol 5:38–43.
35. Schesser K, Spiik AK, Dukuzumuremyi JM, Neurath MF, Pettersson S, et al.(1998) The yopJ locus is required for Yersinia-mediated inhibition of NF-kappaBactivation and cytokine expression: YopJ contains a eukaryotic SH2-like domainthat is essential for its repressive activity. Mol Microbiol 28: 1067–1079.
36. Palmer LE, Hobbie S, Galan JE, Bliska JB (1998) YopJ of Yersinia pseudotuberculosisis required for the inhibition of macrophage TNF-alpha production anddownregulation of the MAP kinases p38 and JNK. Mol Microbiol 27: 953–965.
37. Schesser K, Dukuzumuremyi JM, Cilio C, Borg S, Wallis TS, et al. (2000) TheSalmonella YopJ-homologue AvrA does not possess YopJ-like activity. MicrobPathog 28: 59–70.
38. Kambara K, Ardissone S, Kobayashi H, Saad MM, Schumpp O, et al. (2008)Rhizobia utilize pathogen-like effector proteins during symbiosis. Mol Micro-biol;10.1111/j.1365-2958.2008.06507.
39. Freiberg C, Fellay R, Bairoch A, Broughton WJ, Rosenthal A, et al. (1997)Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. Nature 387:394–401.
40. Dai WJ, Zeng Y, Xie ZP, Staehelin C (2008) Symbiosis-promoting anddeleterious effects of NopT, a novel type 3 effector of Rhizobium sp. strainNGR234. J Bacteriol 190: 5101–5110.
41. Viprey V, Del Greco A, Golinowski W, Broughton WJ, Perret X (1998)Symbiotic implications of type III protein secretion machinery in Rhizobium. MolMicrobiol 28: 1381–1389.
Cif Functional Homologs
PLoS ONE | www.plosone.org 12 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
42. Dale C, Young SA, Haydon DT, Welburn SC (2001) The insect endosymbiontSodalis glossinidius utilizes a type III secretion system for cell invasion. Proc NatlAcad Sci U S A 98: 1883–1888.
43. Dale C, Plague GR, Wang B, Ochman H, Moran NA (2002) Type III secretionsystems and the evolution of mutualistic endosymbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A99: 12397–12402.
44. Moran NA, Degnan PH, Santos SR, Dunbar HE, Ochman H (2005) Theplayers in a mutualistic symbiosis: insects, bacteria, viruses, and virulence genes.Proc Natl Acad Sci U S A 102: 16919–16926.
45. Marches O, Nougayrede JP, Boullier S, Mainil J, Charlier G, et al. (2000) Roleof Tir and Intimin in the virulence of rabbit enteropathogenic Escherichia coliserotype O103:H2. Infect Immun 68: 2171–2182.
46. Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris MA, et al. (1995) Fournew derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes. Gene 166: 175–176.
47. Sert V, Cans C, Tasca C, Bret-Bennis L, Oswald E, et al. (1999) The bacterialcytolethal distending toxin (CDT) triggers a G2 cell cycle checkpoint inmammalian cells without preliminary induction of DNA strand breaks.Oncogene 18: 6296–6304.
Cif Functional Homologs
PLoS ONE | www.plosone.org 13 March 2009 | Volume 4 | Issue 3 | e4855
Détermination de la voie de signalisation cellulaire eucaryote détournée par la protéine bactérienne Cif.
Cif est une protéine produite par certaines souches d’Escherichia coli entéropathogènes
(EPEC). Ces bactéries disposent d’un arsenal d’effecteurs qui sont injectés dans la cellule
hôte par une seringue moléculaire (le système de sécrétion de type III). Cif est l’un de ces
effecteurs qui appartient à la famille des cyclomodulines. Cette dernière est composée de
molécules bactériennes capables de moduler le cycle cellulaire des cellules eucaryotes. Dans
les cellules épithéliales, Cif provoque un arrêt du cycle cellulaire (effet cytostatique) à la
transition G2/M qui est associé à l’accumulation de la forme inactive de CDK1, inducteur
universel de mitose. Cet effet est à l’origine de l’appellation Cif, Cycle inhibiting factor.
J’ai démontré que l’effet cytostatique n’est pas uniquement la conséquence d’un arrêt des
cellules à la transition G2/M. En effet, suivant la phase du cycle cellulaire lors de l’infection
des cellules avec une EPEC qui exprime Cif, la translocation de Cif peut provoquer un arrêt
en G1/S ou en G2/M. Ces arrêts sont associés à la stabilisation de protéines p21waf1 et p27kip1,
qui régulent les complexes CDK/cyclines responsables des transitions des phases G1/S et
G2/M du cycle cellulaire.
Nous avons récemment démontré que des homologues fonctionnels de Cif étaient présents
dans d’autres bactéries tels que Burkholderia pseudomallei, Yersinia pseudotuberculosis,
Photorhabdus asymbiotica (pathogènes humains) et Photorhabdus luminescens (symbiote
d’un nematode pathogène d’insecte). Ces protéines, qui partagent une structure commune et
un même site catalytique, appartiennent à la superfamille des cystéine protéases et acétyl
transférases. Même si le lien entre cette activité enzymatique et l’arrêt du cycle cellulaire reste
à découvrir, on peut néanmoins définir Cif comme une nouvelle famille de protéines partagée
par des souches phylogénétiquement très éloignées, pathogènes d’organismes variés,
d’insectes comme de mammifères.
En plus de son effet cytostatique (arrêt en G1 et G2), Cif induit in vitro la mort des cellules
épithéliales issues de cryptes intestinales. La caractérisation de cette mort tardive (48h après
infection des cellules) révèle qu’elle résulte d’un phénomène d’apoptose. Ces résultats
montrent que l’effet cyclomoduline de Cif est complexe et inclut plusieurs étapes qui
s’intègrent dans un long processus qui se termine par la mort de la cellule cible.
