Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
N° d'ordre : 97 ISAL0129 Année1997
THESE
Présentée devantL'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Pour obtenirLE GRADE DE DOCTEUR
Spécialité BIOCHIMIE
parAlexia ZAKAROFF, épouse GIRARD
DEA de Biochimie
REGULATIONS CROISEES ENTRE SIGNALISATION LIPIDIQUE ETSIGNALISATION DÉPENDANT DES NUCLÉOTIDES CYCLIQUES
DANS L'ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE :RÔLE DE L'ACIDE PHOSPHATIDIQUE.
Soutenue le 19 Décembre 1997 devant la commission d'examen
Jury : Mme le Dr. B. GENY (Rapporteur)M. le Pr. M. LAGARDEM. le Dr. G. NEMOZMme le Dr. A.F. PRIGENTM. le Dr. J.S. SAULNIER-BLACHEM. le Dr. C. SETTE (Rapporteur)
Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Biochimie et Pharmacologie de l'INSA de LYON
2
3
4
5
6
A mes parents,Votre affection, vos conseils et votre soutien moral et financier ont contribué à
l'aboutissement de ce travail, ainsi qu'à ce que je suis aujourd'hui.
A Frédéric,avec tout mon Amour.
A Stéphanie et Claire,avec ma plus grande tendresse.
A tous ceux qui me sont chers.
7
Les recherches qui font l'objet de ce mémoire ont été effectuées dans le laboratoire de
Biochimie et Pharmacologie de l'INSA de Lyon, Unité INSERM 352, dirigé par Monsieur le
Professeur Michel Lagarde. Qu'il trouve ici l'expression de ma reconnaissance pour la
confiance qu'il m'a accordée en m'accueillant dans son laboratoire, pour ses suggestions et ses
critiques éclairées, ainsi que pour l'intérêt qu'il a porté à ce travail.
Un grand merci à Madame Annie-France Prigent pour la qualité de son
encadrement. Ses compétences scientifiques, mais aussi ses qualités humaines ont été des
éléments précieux pour l'avancement de ce travail. Je lui suis reconnaissante pour sa patience,
ses encouragements, sa sympathie, sa disponibilité à tout moment, et pour avoir su m'orienter
et me conseiller dans mes travaux.
Je tiens à remercier Madame le Docteur Blandine Geny pour avoir bien voulu juger
ce travail en tant que rapporteur. Qu'elle veuille bien trouver ici l'expression de ma
considération.
Desidero ringraziare sentimentate il Professore Claudio Sette per la sua cortesia
dimostrata negli esaminare l'allegata tesi e di essersi reso disponibile come membro della
commissione giudicante. Distinti saluti.
Monsieur le Docteur Jean-Sébastien Saulnier-Blache a bien voulu participer au jury
de cette thèse. Je suis très honorée de sa présence, et je lui adresse mes remerciements les plus
sincères.
Mes remerciements vont également à Monsieur le Docteur Georges Némoz qui m'a
fait bénéficier de ses connaissances et conseils avisés, et a accepté de participer au jury de
cette thèse.
Merci beaucoup, Nadia, pour ton aide technique lors de mon arrivée au laboratoire. Tu
m'as transmis une grande partie de ton savoir, et j'ai eu énormément de plaisir à travailler avec
toi.
8
Encore merci à Olga et aux Madeleine"s" pour leur sympathie et leurs
encouragements tout au long de ce travail.
Je salue les Lipha's Girls pour leur humour et leur bonne humeur.
Un grand merci à Mathias pour les "Western-Blot" et toute mon amitié pour le reste.
Mes vifs remerciements à Mademoiselle Laurence Lopez pour l'efficacité et la
gentillesse dont elle a fait preuve lors de la saisie et la mise en page de ce mémoire.
Enfin, je ne saurais oublier tout le personnel et mes camarades de laboratoire, pour
l'aide précieuse et constante que j'ai pu trouver auprès d'eux.
9
Le travail présenté dans ce mémoire a fait l'objet de publications parues, soumises ou
en préparation. Certains résultats ont également été présentés lors de congrès scientifiques. En
voici les références :
Publications scientifiques :
A. Zakaroff-Girard , M. Gilbert, M. Lagarde and A.F. Prigent. Tyrosine phosphorylations
and G proteins are involved in the triggering of a PLD pathway by 12(S)-HETE in activated
human mononuclear cells. En préparation.
A. Zakaroff , S. El Bawab, G. Nemoz, M. Lagarde and A. F. Prigent. Phosphatidic acid and
cyclic nucleotide phosphodiesterase activity relationships in control and activated human
peripheral blood mononuclear cells. En révision, J. Cell. Physiol.
A. Zakaroff , N. Meskini, C. Joulain, G. Némoz, M. Lagarde and A.F. Prigent. 12(S)-HETE
primes a phospholipase D pathway in activated human mononuclear cells.
Frontiers in Bioactives Lipids, Ed Vanderhoek, Plenum Press, New-York, 291-297 (1996).
N. Meskini, A. Zakaroff, C. Joulain, G. Némoz, M. Lagarde and A.F. Prigent. Triggering of a
phospholipase D pathway upon mitogenic stimulation of human peripheral mononuclear cells
enriched with 12-(S)-hydroxyicosatetraenoic acid. Eur. J. Biochem. 233, 907-915 (1995)
Participation à des congrès :
A. Gysembergh, J. Loufoua, A. Zakaroff-Girard , A.F. Prigent, Y. Minaire, M. Lagarde and
M. Ovize. Stimulation of PLD alters diacylglycerol production and preconditions the rabbit
heart. 70th scientific sessions of the American Heart Association. Orlando, 9-12 Novembre
1997.
S. Bechoua, A. Zakaroff-Girard , M. Dubois, G. Némoz, M. Lagarde et A.F. Prigent. Les
acides docosahexaénoïque et 12-hydrxyeicosatétraénoïque stimulent la PLD lymphocytaire
avec des effets opposés sur le taux d'acide phosphatidique. Congrès du GERLI, Paris, 11 & 12
Septembre 1997.
10
M. Lagarde, C. Calzada, A. Zakaroff , N. Meskini, A. F. Prigent and E. Vericel. Biological
relevance of the lipoxygenase pathway for platelets and lymphocytes functions.International
conference on lipoxygenases and their products : biological functions, Malte, 21-24 Mai 1997.
A. Gysembergh, A. Zakaroff , A.F. Prigent, Y. Minaire, X. André-Fouët, M. Lagarde, M.
Ovize. Enhanced production of Diacylglycerol, the natural activator of protein kinase C, in the
preconditioned rabbit heart. 69th scientific sessions of the American Heart Association,
Nouvelle Orléans, 10-13 Novembre 1996.
A. Zakaroff , N. Meskini, C. Joulain, G. Nemoz, M. Lagarde and A.F. Prigent. 12-(S)-HETE
primes a phospholipase D in activated human lymphocytes. 13ème Congrès du Groupe de
Réflexion sur la Recherche Cardiovasculaire (GRRC), Lyon, 2 & 3 Avril 1996.
11
SOMMAIRE
SOMMAIRE p.11
LISTE DES ABREVIATIONS p. 19
INTRODUCTION p. 20
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES p. 24
I- Le système immunitaire. p. 25
II- L'activation lymphocytaire. p. 27
II-1 La transmission du signal. p. 27
a) Les phosphorylations-déphosphorylations de tyrosine.
b) L'hydrolyse des phosphatidylinositols par la PLCγ1.
c) Le rôle du calcium dans la transmission du signal.
d) Les protéines kinases C.
e) La voie p21-ras/MAP-kinase.
II-2 Le rôle des nucléotides cycliques. p. 36
a) Implication de l'AMPc dans l'activation lymphocytaire.
b) Implication du GMPc dans l'activation lymphocytaire.
III- Voies de formation et effets cellulaires de l'acide phosphatidique. p. 42
III-1 Les voies de formation du PA. p. 42
12
a) La voie PLC-DAG-Kinase.
Les phospholipases C.
Les DAG-kinases et les Phosphatidate phosphohydrolases.
b) La voie PLD.
Régulation de la PLD par la PKC.
Régulation de la PLD par les ions calcium.
Régulation de la PLD par ARF.
Régulation de la PLD par les protéines Rho.
Régulation de la PLD par le PIP2.
Régulation de la PLD par les tyrosine-kinases solubles.
III-2 Le rôle physiologique du PA. p. 56
a) Le PA et les flux de calcium.
b) Le PA et les Phospholipases C.
c) Le PA et les Protéines Kinases C.
d) Le PA et la voie MAP-Kinase.
e) Le PA et les kinases lipidiques.
f) Le PA et la NADPH oxydase des neutrophiles.
g) Le PA et la prolifération induite par des facteurs de croissance.
h) Existe-t-il un récepteur pour le PA?
IV- Les phosphodiestérases des nucléotides cycliques (PDEs). p. 65
IV-1 Les différentes familles de PDE. p. 67
a) La PDE de type 1 stimulée par le complexe calcium/calmoduline.
b) La PDE de type 2 stimulée par le GMPc.
c) La PDE de type 3 inhibée par le GMPc.
d) La PDE de type 4 spécifique de l'AMPc.
e) La PDE de type 5 spécifique du GMPc.
f) La PDE de type 6 des photorécepteurs spécifique du GMPc.
g) La PDE de type 7 spécifique de l'AMPc et insensible au Rolipram.
IV-2 Les PDEs dans les cellules lymphoïdes. p. 72
IV-3 Rôle des acides gras sur l'activité PDE. p. 73
V- Altérations du système immunitaire au cours du vieillissement et p. 75
péroxydation lipidique : implication du 12-HETE.
13
V-1 La réponse immune et le vieillissement. p. 75
V-2 Vieillissement et peroxydation lipidique. p. 76
V-3 Le 12-HETE. p. 77
a) Le 12-HETE et les voies de signalisation.
Le calcium.
Les protéines kinases C.
b) Le 12-HETE et la réponse immune.
OBJECTIFS DU TRAVAIL EXPERIMENTAL p. 82
MATERIELS & METHODES p. 84
I- Produits. p. 85
I-1 Produits inertes. p. 85
I-2 Produits radioactifs. p. 86
II- Appareils. p. 87
METHODES p. 88
I- Préparation cellulaires. p. 88
I-1 Préparation des cellules mononucléées humaines du sang périphérique. p. 88
I-2 Activation mitogénique des cellules mononucléées. p. 90
I-3 Lyse des cellules. p. 90
a) Lyse des cellules en vue du dosage d'activité phosphodiestérase.
b) Lyse des cellules en vue du "western-blotting".
II- Méthodes biochimiques. p. 91
II-1 Dosages des protéines. p. 91
a) Dosages des protéines dans les expérience de dosage d'activité PDE.
b) Dosages des protéines en vue des expériences de "western-blotting".
14
II-2 Mesure de l'activité phosphodiestérase des nucléotides cycliques p. 92
(E.C.3.1.4.17).
a) Principe du dosage.
b) Protocole de dosage.
II-3 Dosage de l'AMPc. p. 92
II-4 Mesure des tyrosine phosphorylations par "western-blotting". p. 93
a) Electrophorèse et transfert.
b) Immunodetection.
c) Quantification des protéines.
III- Tests de prolifération. p. 94
IV- Marquage et stimulation des cellules. p. 94
IV- 1 Marquage des cellules. p. 94
IV- 2 Stimulation mitogénique. p. 95
V- Analyses lipidiques. p. 95
V-1 Extraction lipidique. p. 95
V-2 Mise au point d'un système de séparation du PA fiable en vue de p. 95
la quantification par analyse d'image.
V-3 Séparation du phosphatidylalcool. p. 97
VI- Etude de l'effet du 12(S)-HETE sur la production de PA par p. 99
les cellules mononucléées humaines.
VI-1 Influence du 12(S)-HETE sur la production de PA par les PBMC p. 99
marquées au [3H]-AA et stimulées ou non par la Con A.
VI-2 Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par p. 99
les cellules mononucléées enrichies en [3H]-12(S)-HETE et stimulées
ou non par la Con A.
15
VI-3 Analyse de la composition en acides gras du PA par chromatographie p. 99
en phase gazeuse sur colonne capillaire (CPG).
VI-4 Effets du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans les PBMC p. 100
activées ou on par la Con A.
VI-5 Etudes des sites de liaison spécifique du 12(S)-HETE sur les lymphocytes p. 100
T purifiés.
a) Principe.
b) Préparation des lymphocytes T purifiés.
c) Protocole.
RESULTATS p. 102
Chapitre I : p. 103
Production et voies de synthèse de l'acide phosphatidique dans les
cellules mononucléées stimulées par la concanavaline A (Con A).
I- Effets de la Concanavaline A (Con A) sur la synthèse de PA et de p. 104
DAG par les cellules prémarquées à l'acide arachidonique tritié.
I-1 Marquage des cellules mononucléées au repos par une dose traceuse p. 104
d'acide arachidonique tritié.
I-2 Variations de la production de PA et de DAG radiomarqués en fonction p. 104
de la durée de stimulation des cellules mononucléées humaines par la Con A.
II- Effet de la Con A sur la synthèse de PA en masse dans les cellules p. 104
mononucléées humaines.
III- Recherche d'une voie PLD dans la production de PA induite par la p. 108
Con A dans les cellules mononucléées humaines.
III-1 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou p. 108
en présence d'éthanol dans les cellules prémarquées à l'acide arachidonique.
III-2 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PEt-[3H]-arachidonate. p. 110
III-3 Marquage des cellules mononucléées au repos par de l'acide oléïque tritié. p. 112
16
III-4 Effet de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou en présence d'éthanol p. 112
dans les cellules mononucléées humaines prémarquées à l'acide oléïque tritié.
III-5 Effet de la Con A et du TPA sur la production de PEt-[3H]-oléate. p. 114
IV- Implication d'une voie PI-PLC/DAG-Kinase dans la production de p. 114
PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées humaines.
IV-1 Effet du R59022 sur la synthèse de PA induite par la Con A dans les p. 116
cellules mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.
IV-2 Effet de la génistéine sur la synthèse de PA induite par la Con A dans p. 117
les cellules mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.
VIII- Discussion. p. 118
Chapitre II : p. 120
Corrélations entre la production d'acide phosphatidique et
les activités phosphodiestérases des nucléotides cycliques
dans les cellules mononucléées humaines témoins ou activées
I- Synthèse d'acide phosphatidique (PA) dans les cellules p. 121
mononucléées stimulées par les différents agonistes.
II- Effet de la stimulation des cellules mononucléées par les trois p. 121
agonistes sur leurs activités phosphodiestérases des nucléotides
cycliques.
III- Corrélations entre la quantité de PA et l'activité PDE dans les p. 124
cellules mononucléées témoins et activées.
IV- Effet de l'éthanol sur la production de PA et la stimulation des p. 124
activités PDE induites par le TPA.
V- Effet inhibiteur dose-dépendant du composé R59022 sur la production p.126
de PA et la stimulation des activités PDE induites par la Con A.
VI- Effet du composé R59022 sur la prolifération des cellules p. 126
mononucléées humanies induite par la Con A.
17
VII- Variations des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées en p. 130
fonction de la durée de stimulation par l'OKT3 ou la Con A.
VIII- Etude pharmacologique des isoformes de PDE stimulées par p. 133
les différents agonistes dans les cellules mononucléées.
VIII- Discussion. p. 135
Chapitre III : p. 139
Modulation de la production d'acide phosphatidique par l'acide
12(S)-hydroxyeicosatétraènoïque (12(S)-HETE).
I- Effet du 12(S)-HETE sur la production de DAG et de PA par p. 140
les cellules mononucléées humaines stimulées ou non par la Con A.
II- Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par p. 141
les cellules mononucléées marquées au [3H]-12(S)-HETE, en présence
ou non de Con A.
III- Composition en acides gras du PA produit par les cellules p. 144
mononucléées enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées
par la Con A.
IV- Implication d'une voie phospholipase D dans la production de PA p. 146
induite par le 12(S)-HETE.
V- Effet de différents inhibiteurs sur la production de p. 149
phosphatidylbutanol par les cellules mononucléées enrichies ou non
en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A en présence de butanol-1.
V-1 Effet de la Calphostine C. p. 149
V-2 Effet de la Génistéine. p. 149
VI- Effets du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans p. 152
les cellules mononucléées humaines activées par la Con A.
18
VII- Effet de la suramine sur la production de PA induite par la Con A p. 156
dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE.
VIII- Mise en évidence de sites de liaison du 12(S)-HETE sur les p. 158
cellules mononucléées ou les lymphocytes T humains purifiés.
VIII-1 Etude de la fixation spécifique du 12(S)-HETE tritié en fonction du p. 158
temps sur les cellules mononucléées humaines.
VIII-2 Etude de la fixation du 12(S)-HETE tritié en fonction du nombre p. 161
de cellules.
VIII-3 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux cellules p. 161
mononucléées humaines.
VIII-4 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes T p. 161
humains purifiés.
VIII-5 Comparaison des courbes de déplacement du 12(S)-HETE tritié par p.164
du 12(S)-HETE non marqué et par d'autres acides gras ou lipides dans les
lymphocytes T humains purifiés.
VIII- Etude des caractéristiques des sites de liaison au 12(S)-HETE dans les p. 166
lymphocytes T purifiés.
a) Effet du GTPγS sur la liaison du 12(S)-HETE aux membranes de
lymphocytes T humains purifiés.
b) Effet de la toxine pertussique (PTX) sur la liaison du 12(S)-HETE
aux
lymphocytes T humains purifiés.
c) Effet de la suramine sur la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes
T
humains purifiés.
IX- Discussionp. 170
CONCLUSION ET PERSPECTIVES p. 174
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES p. 178
19
LISTE DES ABREVIATIONS
AA acide 5,8,11,14-eicosatétraènoïque ou acide arachidoniqueADN acide désoxyribonucléiqueADNc ADN complémentaireAMPc 3',5'-adénosine monophosphate cycliqueARN acide ribonucléiqueARNmARN messagerBHT butyl-hydroxy-toluèneBSA sérum albumine bovineCaM calmodulineCCM chromatographie sur couche minceCMH complexe majeur d'histocompatibilitéCon A concanavaline ACPG chromatographie en phase gazeuseDAG diacylglycérolDGK diacylglycérol kinaseEDTA acide éthylènediamine tétraacétiqueEGTA acide éthylèneglycol tétraacétiqueGMPc 3',5'-guanosine monophosphate cycliqueHEPES acide hydroxy-2-éthyl-4-pipérazinyl-1,2-éthane-sulfoniqueHETE acide hydroxyeicosatétraènoïqueHPETE acide hydroperoxyeicosatétraènoïqueIL interleukineIP3 inositol trisphosphateNADPH dihydrodicotinamide adénine dinucléotide phosphateNO monoxyde d'azotePA acide phosphatidiquePAP phosphatidate phosphohydrolasePBMC cellules mononucléées du sang périphériquePBS phosphate buffer salinePC phosphatidylcholinePDE phosphodiestérase de nucléotides cycliquesPE phosphatidyléthanolaminePG prostaglandinePI phosphatidylinositolPIP2 phosphatidylinositol biphosphatePKA protéine kinase AMPc-dépendantePKC protéine kinase CPKG protéine kinase GMPc-dépendantePL phospholipidePLA2 phospholipase A2PLC phospholipase CPLD phospholipase DPMSF fluorure d'acide phénylméthylsulfoniquePRP plasma riche en plaquettesPS phosphatidylsérinePTK protéine tyrosine kinase
20
TCR récepteur à l'antigène de la cellule TTPA tétradécanoyl-12, acétate-13 phorbolTRIS tris (hydroxyméthyl)-amino-méthane
21
II NNTTRROODDUUCCTTII OONN
22
Le système immunitaire est conçu pour fournir à l'organisme un mécanisme
dynamique et flexible permettant de répondre spécifiquement à des variétés d'antigènes qui
menacent l'intégrité et l'homéostasie de l'organisme. Le fonctionnement correct du système
immunitaire est le résultat d'une communication synergique entre les différentes populations
et sous-populations immunitaires. La production de nombreuses cytokines et les interactions
cellulaires assurent la coordination de ces réponses, les lymphocytes T auxiliaires jouant un
rôle clé dans cette partition.
L'activation des lymphocytes est initiée par l'association d'un agent antigénique ou
mitogénique avec son récepteur spécifique. Une série complexe de signaux biochimiques est
alors transmise vers le cytoplasme et le noyau, déclenchant ainsi la réponse cellulaire
appropriée.
L'interaction de l'antigène avec son récepteur spécifique (TCR : T cell antigen-
receptor) sur la membrane des lymphocytes T conduit à l'activation d'une phospholipase C(PLC) qui hydrolyse le phosphatidylinositol-4, 5-diphosphate (PIP2) pour donner du
diacylglycérol (DAG) et de l'inositoltriphosphate (IP3), deux seconds messagers
intracellulaires. En effet, le DAG active la protéine kinase C (PKC) et l'IP3 permet la
libération du calcium (Ca2+) à partir des réserves intracellulaires. Le DAG peut ensuite être
phosphorylé par une DAG-kinase pour conduire à la formation d'acide phosphatidique (PA).
Plusieurs travaux récents montrent par ailleurs une hausse rapide du taux
intracellulaire d'acide phosphatidique au cours de l'activation lymphocytaire (Bismuth et al.,
1988; Pelassy et al., 1991; Marcoz et al., 1993a) et son implication dans diverses voies de
signalisation. Ainsi, le rôle potentiel de ce composé comme second messager de différentes
hormones (Putney et al., 1980) ou cytokines (Cano et al., 1992) semble de plus en plus étayé
et des arguments expérimentaux de plus en plus nombreux confirment l'effet mitogène de
l'acide phosphatidique dans de nombreux types cellulaires.
Un autre facteur régulateur est souvent mis en cause dans le contrôle de la prolifération
cellulaire : il s'agit de l'adénosine 3'-, 5'-monophosphate cyclique (AMPc) qui est maintenant
reconnu comme un signal inhibiteur de la réponse lymphoproliférative (Hadden et Coffey,
1982; Kammer, 1988). Le taux intracellulaire d'AMPc est contrôlé en partie par la
phosphodiestérase des nucléotides cycliques (PDE) qui met fin à son activité biologique.
Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que l'activation de lymphocytes murins
23
ou humains induit une hausse substantielle et rapide de l'activité d'une isoforme particulière
de PDE (type 4) prépondérante dans les cellules lymphoïdes, cette stimulation contribuant
vraisemblablement à maintenir un taux faible d'AMPc lors des étapes précoces de l'activation.
Il a été montré, d'autre part, que l'activation de la PDE est postérieure à la hausse de PA. En
outre, le PA est capable de stimuler, in vitro, l'activité de cette même isoforme de PDE,
sensible à la Concanavaline A (Con A), mimant ainsi l'effet des mitogènes. Ces résultats ont
conduit à l'hypothèse d'un lien probable entre la hausse précoce de PA induite par les
mitogènes et la hausse d'activité PDE qui lui fait suite.
Différentes voies de synthèse du PA ont été décrites dans la littérature pour divers
types de cellules. Elles impliquent :
-- soit la phosphorylation de 1,2-sn-DAG par une DAG-kinase,
-- soit l'hydrolyse de phospholipides, en particulier la phosphatidylcholine (PC) ou la
phosphatidyléthanolamine (PE) par une phospholipase D (PLD),
-- soit l'acylation de lyso-PA par une acyltransférase spécifique.
L'importance relative des divers mécanismes est très différente d'un type cellulaire à l'autre et
diffère également en fonction de la nature du mitogène utilisé. S'il est bien admis maintenant
que la synthèse de PA est stimulée lors de l'activation mitogénique, une controverse demeure
concernant les voies de synthèse plus particulièrement impliquées lors de la mitogenèse.
Notre premier objectif a été de rechercher la (ou les) voie(s) de signalisation
conduisant à la production de PA dans les cellules mononucléées humaines stimulées par la
Con A. La mise au point d'un système de séparation et de quantification fiable des
phospholipides, à la fois en pourcentage de radioactivité et en masse, nous a permis d'aboutir
à plusieurs résultats importants. Ainsi, l'utilisation de différents marqueurs radioactifs et de
divers inhibiteurs (inhibiteur de DAG-kinase, inhibiteurs de tyrosine-kinase, inhibiteur de
PLD) nous a permis d'étudier dans de bonnes conditions les diverses voies de synthèse du PA
dans les cellules mononucléées humaines lors de l'activation mitogénique(Chapitre I ). Outre
la Con A, d'autres stimuli, en particulier un anticorps monoclonal dirigé contre le complexe
CD3 du TCR, l'OKT3, et l'ester de phorbol TPA, ont également été utilisés pour augmenter le
taux de PA intracellulaire (Chapitre II ).
L'équipe ayant déjà démontré, lors d'études in vitro, que le PA est capable de stimuler
l'activité PDE, nous avons décidé d'étudier parallèlement sur des lymphocytes en culture à la
fois la production de PA induite par les différents stimuli (Con A, TPA, OKT3), l'activité
PDE et les taux de nucléotides cycliques, en particulier l'AMPc (Chapitre II ).
L'intérêt de ce travail est de démontrer une augmentation du taux intracellulaire de PA et une
stimulation d'activité PDE dans une même population cellulaire sous l'influence d'un
mitogène donné, l'établissement d'une corrélation positive entre ces deux paramètres
24
constituant un argument fort en faveur du rôle physiologique du PA dans le contrôle de la
mitogenèse via l'activation de la PDE.
L'autre partie de ce travail a consisté à étudier cette relation PA-PDE dans un modèle
expérimental mimant une situation physiologique particulière, le vieillissement. Il s'agit de
cellules mononucléées humaines enrichies en 12(S)-HETE, dérivé monohydroxylé issu de
l'acide arachidonique par la voie 12-lipoxygénasique.
En effet, il a été montré que la production de 12(S)-HETE augmente avec l'âge dans
les cellules mononucléées périphériques humaines (Meskini et al., 1993) et que cette
production accrue de 12(S)-HETE s'accompagne d'une diminution importante de l'activité
PDE dans ces cellules comparativement aux cellules de témoins jeunes (Meskini et al., 1990).
Or, la réponse lymphoproliférative (Nagel et al., 1988) et les activités PDE (Meskini et al.,
1990) sont fortement diminuées chez les personnes âgées. Notre équipe a également montré
que l'activation par la Con A de PDE dans des cellules de témoins jeunes est diminuée par le
12(S)-HETE (Joulain, 1994). De plus, le 12(S)-HETE exogène inhibe la réponse proliférative
aux mitogènes des cellules mononucléées en culture (Joulain et al., 1995). Ce composé est
également connu pour son rôle inhibiteur de la DAG-kinase dans les cellules endothéliales
(Friedlander et al., 1990), ce qui pourrait induire une diminution de la production de PA à
partir du DAG.
Tous ces résultats suggèrent que chez les personnes âgées, le maintien d'un taux basal
élevé de 12(S)-HETE pourrait conduire à une diminution du taux de PA synthétisé et il nous a
semblé pertinent de déterminer si l'effet inhibiteur de PDE du 12(S)-HETE pouvait être
transmis par une diminution de la production de PA (Chapitre III ). D'autre part, le 12-HETE
en s'estérifiant dans les phospholipides membranaires pourrait conduire à la formation de
seconds messagers modifiés, et en particulier des PA modifiés, incapables d'assurer une
transmission correcte des signaux d'activation.
La dernière étape de ce travail a été consacrée à l'étude des mécanismes impliqués
dans l'effet du 12-HETE sur la production de PA dans les lymphocytes stimulés par la Con A.
Nous avons tenté de déterminer si le 12-HETE agissait de manière extracellulaire ou
intracellulaire. En effet, le 12-HETE estérifié dans les membranes cellulaires est relargué dans
le milieu extracellulaire lors de l'activation par la Con A. Ainsi, un mode d'action par
l'intermédiaire d'un récepteur membranaire serait envisageable. Des expériences de "binding"
utilisant du [3H]-12-HETE comme ligand et de compétition par différents agonistes ont
permis de déterminer s'il existait des sites spécifiques de liaison au 12(S)-HETE à la surface
des lymphocytes et d'en préciser leur nature. Enfin, l'utilisation de divers inhibiteurs
(inhibiteurs de tyrosine-kinase, inhibiteurs de PKC) semble indiquer que cet effet pourrait
impliquer des phosphorylations de résidus tyrosines. Nous avons donc recherché quelles
protéines pouvaient être tyrosine-phosphorylées au cours de ce phénomène par l'utilisation
d'anticorps spécifiques anti-phosphotyrosine.
25
RRAAPPPPEELLSSBBII BBLLII OOGGRRAAPPHHII QQUUEESS
26
I- Le système immunitaire.
La défense des organismes supérieurs contre des agents étrangers (virus, bactéries,
champignons) est assurée par leur système immunitaire. Le rôle du système immunitaire est
d'assurer une surveillance étroite et permanente des organismes et de palier sélectivement à
leur invasion par des agents pathogènes.
Les cellules du système immunitaire permettent donc à l'organisme des vertébrés de
reconnaître une invasion d'antigènes, et la réponse immunitaire qui en résulte est d'une
remarquable spécificité. Il existe deux classes de lymphocytes ayant un rôle dans la
reconnaissance d'antigènes spécifiques : la première est celle des lymphocytes T, la seconde
celle des lymphocytes B. Les lymphocytes B interviennent dans les réponses immunitaires de
type humoral, qui impliquent la production d'anticorps circulant dans le sang et se liant
spécifiquement à l'antigène étranger qui les a induits.
Les lymphocytes T sont responsables de l'immunité à médiation cellulaire. Celle-ci implique
la production de cellules spécialisées qui réagissent principalement avec les antigènes fixés à
la surface des cellules hôtes, soit en tuant la cellule hôte si l'antigène est un virus infectant,
soit en induisant d'autres cellules telles que les macrophages pour détruire l'antigène.
Les lymphocytes B et T circulent dans le sang et la lymphe, et sont concentrés dans les
principaux organes lymphatiques (ganglions lymphatiques et rate). Les lymphocytes ont une
durée de vie assez longue : chez l'homme, ils peuvent rester des années sans se diviser, mais
en réponse à un antigène, les lymphocytes grossissent considérablement, se divisent
rapidement et sécrètent un grand nombre de protéines contribuant à l'élimination de
l'organisme envahisseur ou des substances étrangères.
L'antigène est présenté aux cellules T sous la forme d'un peptide lié au complexe majeur
d'histocompatibilité (MHC) de classe I ou II, et provoque une réponse qui implique une
interaction coopérative entre le complexe récepteur des cellules T/CD3 (complexe TCR/CD3)
et les molécules accessoires CD4/CD8 et CD28 ( Figure 1). Le complexe TCR/CD3 est
composé du récepteur hétérodimérique de reconnaissance de l'antigène TCRα/β, des chaînes
CD3 γ, δ, ε et des homo et hétérodimères de la famille ζ (Figure 2). Les domaines
27
28
cytoplasmiques de ces protéines (CD3 et ζ) ont des séquences consensus appelées ITAM
(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif). Ces motifs possèdent des résidus
tyrosines qui, lorsqu'ils sont phosphorylés, constituent des sites de fixation de protéines
contenant des domaines SH2 (src homology domain).
Les molécules accessoires CD4 et CD8 se lient aux régions non polymorphes des MHC de
classe II et I, respectivement, alors que le CD28 reçoit un second signal délivré par l'antigène
B7 des cellules B ou des macrophages (cellules présentatrices de l'antigène ou APC).
Ainsi, l'interaction du TCR avec son ligand provoque une activation cellulaire du lymphocyte
qui se traduit par la production de médiateurs biochimiques intracellulaires appelés "seconds
messagers".
II- L'activation lymphocytaire.
II-1. La transmission du signal.
Au cours du processus d'activation, il existe des réponses précoces se produisant en
quelques minutes ou quelques heures après l'initiation de la transduction du signal, alors que
d'autres réponses peuvent se produire des jours après la stimulation. Durant la phase précoce
de l'activation, les lymphocytes T subissent d'énormes modifications biochimiques telles que
des phosphorylations-déphosphorylations de protéines, des variations de la membrane
lipidique, des flux d'ions, des altérations du taux des nucléotides cycliques, des variations de
synthèse d'ARN ainsi que des variations de synthèse protéique.
La réponse cellulaire plus tardive, telle que la prolifération, résulte généralement d'une
cascade complexe d'événements tels que l'activation de gènes. Ce signal permet aux cellules T
de progresser dans le cycle cellulaire et d'entrer en phase S, caractérisée par une synthèse
d'ADN et la réplication des chromosomes. Ce stade nécessite une interaction directe ou
indirecte avec les cellules accessoires (monocytes, macrophages) qui produisent l'interleukine
1 (IL1). L'IL1 stimule les lymphocytes à produire de l'IL2. La réplication des cellules T fait
suite à l'interaction de l'IL2 avec son récepteur. Il semble que les divisions successives ne
nécessitent pas une ré-exposition aux mitogènes, mais plutôt la présence d'IL2.
a) Les phosphorylations-déphosphorylations de tyrosine.
L'un des événements les plus précoces associé à la transduction du signal par le TCR
est la phosphorylation sur des résidus tyrosine de protéines cellulaires telles que la
phospholipase Cγ1 ou PLCγ1 (June et al.,1990 ; Weiss et al.,1991).
29
30
Ainsi, des inhibiteurs de protéines tyrosine-kinase (PTKs) peuvent inhiber presque en totalité
les événements associés à la stimulation du TCR (June et al., 1990 ; Mustelin et al.,1990).
Cependant, le TCR n'a pas d'activité tyrosine-kinase intrinsèque, et il semble donc qu'il régule
les réponses cellulaires en modulant les activités de différentes protéines tyrosine-kinases.
Quatre familles de PTKs cytoplasmiques sont impliquées dans la transduction du signal par le
TCR : Src, Csk, Tec et Syk (Figure 3).
Les PTKs de la famille Src impliquées dans l'activation sont Lck et Fyn. Des études
génétiques ont démontré que Lck et Fyn sont essentielles pour l'initiation de la transduction
du signal par le TCR et jouent aussi un rôle important dans le développement des cellules T
(Howe et Weiss, 1995; van Oers et al., 1996 a). De plus, des études avec des souris déficientes
en Lck ou Fyn ont suggéré que Lck joue un rôle plus important que Fyn dans la
phosphorylation des ITAMs (van Oers et al., 1996b).
La protéine Csk régule négativement les PTKs de la famille Src et inhibe donc la transduction
du signal. Cette protéine Csk phosphoryle une tyrosine en position C-terminale de Lck et Fyn,
ce qui les maintient à l'état inactivé. La déphosphorylation de la tyrosine carboxy-terminale
effectuée par la protéine tyrosine phosphatase CD45 permet ainsi l'activation de Lck et Fyn
(Weiss et Littman, 1994) (Figure 4).
La PTK de la famille Tec préférentiellement exprimée dans les cellules T est Itk. Des études
récentes sur des souris déficientes en Itk ont permis de mettre en évidence l'implication de
cette PTK dans la signalisation par le TCR, mais le mécanisme de cette régulation n'a pas
encore été élucidé (Liao et Littman, 1995).
Enfin, les PTKs de la famille Syk sont Syk et ZAP-70 (ζ-associated protein-70). La PTK Syk
n'est pas impliquée dans la signalisation par le TCR, mais elle est essentielle dans la
signalisation par le récepteur des lymphocytes B et le développement des cellules B (Cheng et
al.,1995; Mallick-Wood et al.,1996). Par contre, le rôle essentiel de ZAP-70 dans la
signalisation par le TCR et le développement des cellules T a été démontré grâce à des études
à la fois sur des personnes souffrant d'un syndrôme d'immunodéficience résultant de
mutations de ZAP-70 et sur des souris déficientes en ZAP-70 (Gelfand et al.,1995; Negishi et
al.,1995). D'autres études ont permis de démontrer qu'après leur phosphorylation par Lck et
Fyn , les ITAMs se lient avec ZAP-70 par des interactions de haute affinité (Osman et al.,
1995), ce qui permet ainsi la tyrosine phosphorylation de ZAP-70 et son activation par Lck et
Fyn (Iwashima et al., 1994).
Il existe donc des relations complexes entre les différentes protéines tyrosine-kinases et
protéines tyrosine-phosphatases qui sont présentes dans les lymphocytes T, et ces interactions
sont très importantes pour permettre au TCR d'initier les événements de la transmission du
signal.
31
32
b)L'hydrolyse des phosphatidylinositols par la PLCγ1.
Les activités tyrosine-kinases induites par le TCR conduisent donc à la
phosphorylation de nombreuses protéines cellulaires, en particulier la phospholipase Cγ1 ou
PLCγ1 (June et al.,1990 ; Weiss et al.,1991).
La phosphorylation de cette enzyme sur des résidus tyrosine est responsable de son activationcatalytique, qui induit l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) et conduit
ainsi à la formation d'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) et de diacylglycérol (DAG), deux
seconds messagers intracellulaires (Figure 5). En effet, l'IP3 permet la libération du calcium à
partir des réserves intracellulaires (Berridge,1984), alors que le DAG stimule une protéine
kinase C ou PKC (Nishizuka,1986). De plus, il a été décrit que la libération de ces seconds
messagers persiste durant tout le temps de la stimulation (Weiss et al., 1987).
c) Le rôle du calcium dans la transmission du signal.
Le calcium contenu dans les réserves intracellulaires est relargué dans le cytosol quand
l'inositol1,4,5-trisphosphate se lie à ses récepteurs (Berridge, 1993). Cette libération du calcium à
partir des réserves intracellulaires est suivie d'entrée du calcium extracellulaire dans la cellule grâce
aux canaux calciques, et cette phase d'augmentation prolongée du taux de calcium semble être
indispensable au franchissement des étapes ultérieures de l'activation des lymphocytes, notamment la
stimulation de l'expression des gènes de l'interleukine 2 (Figure 5). En effet, il est généralement
admis que l'induction de la prolifération lymphocytaire par des mitogènes requiert la présence de
calcium. Ainsi, la chélation des ions Ca2+ par l'EGTA bloque la synthèse d'ARN et d'ADN induite
par la lectine mitogénique Concanavaline A ou Con A (Hadden, 1988).
Enfin, le calcium est cofacteur de plusieurs enzymes, dont la PKC et la PLC (Clapham, 1995), et il est
d'autre part nécessaire à la production de lymphokines. En activant la calcineurine, une phosphatase
Ca2+/calmoduline-dépendante, il induit la déphosphorylation du facteur de transcription cytosolique
NF-ATc (Nuclear Factor of Activated T cells) et sa translocation au noyau où il se complexe avec un
autre facteur de transcription (AP-1) , et permet ainsi l'expression des gènes de lymphokines, en
particulier celui de l'interleukine 2.
d) Les protéines kinases C.
Le diacylglycérol (DAG), formé par hydrolyse du PIP2, conduit à l'activation de
protéines kinases C ou PKC (Nishizuka, 1986).
Les protéines kinases C sont des sérine/thréonine protéines kinases. Les esters de phorbol,
agents promoteurs de tumeurs, peuvent se substituer au DAG pour activer les PKC, mais
contrairement au DAG, les esters de phorbol ne sont pas métabolisés rapidement dans
33
34
l'organisme et induisent donc une activation prolongée de la PKC. Cette propriété des esters
de phorbol a été largement utilisée dans le but d'étudier les propriétés de la PKC.
Les kinases de la famille des PKC sont des polypeptides comprenant une partie N-terminale
régulatrice et une partie C-terminale catalytique.
Quatre domaines bien conservés ont été décrits (Nishizuka, 1995) (Figure 6) :
- le domaine C1, riche en cystéines, responsable de la liaison du DAG ou des esters de
phorbol. Ce domaine est précédé par une séquence inhibitrice appelée "pseudosubstrat".
- le domaine C2 contient le site de reconnaissance des lipides et dans certaines
isoformes, le site de liaison du calcium.
- les domaines C3 et C4 forment les sites de liaison de l'ATP et du substrat et
constituent la partie catalytique de l'enzyme.
Le mécanisme d'activation de la PKC implique sa liaison à la membrane, suivie d'une
protéolyse qui permet de séparer les deux parties de l'enzyme. La partie catalytique est ainsi
libérée du pseudosubstrat et devient active.
A ce jour, plus de 10 isoformes de PKC ont été identifiées, et classées en trois groupes selon
leur structure et leur régulation par des cofacteurs tels que les ions Ca2+, les esters de phorbol
ou la phosphatidylsérine (Nishizuka,1995).
Les isoformes α, βI, βII et γ appartiennent au premier groupe ayant été découvert et le plus
étudié : celui des PKC conventionnelles. Ces isoformes se distinguent de celles des autres
familles par le fait que leur activité est régulée par le Ca2+ au niveau du site C2.
L'autre groupe assez bien caractérisé est celui des nouvelles PKC, qui comprend les isoformes
δ, ε, η, θ, µ. Ces enzymes ressemblent beaucoup par leur structure aux PKC conventionnelles,
mis à part que leur site C2 ne contient pas de site de liaison au Ca2+.
Les dernières isoformes connues (ζ et λ) font partie de la famille des PKC atypiques, car leur
structure diffère beaucoup de celle des autres familles (Fig. 3). De plus, elles ne répondent ni
aux esters de phorbol, ni au DAG, mais il a été décrit que la PKC-ζ pourrait être activée par
l'acide phosphatidique (Limatola et al., 1994).
Enfin, une dernière sérine/thréonine protéine kinase appelée PKD a été recemment identifiée.
Elle semble être activée par le DAG ou les esters de phorbol, mais n'a pas du tout la même
structure que les autres PKC (Valverde et al., 1994; Van Lint, 1995).
De nombreuses études visant à déterminer la spécificité des PKC par rapport au substrat ont
permis de révéler des mécanismes plus complexes que ceux attendus. Kikkawa et Nishizuka
(1986) ont pu découvrir un grand nombre de substrats physiologiques, qui peuvent être
répartis en trois grandes classes :
- les protéines impliquées dans la transduction du signal (EGF, T cell receptor, Ras,
GAP),
35
- les protéines impliquées dans des voies métaboliques (pompes, canaux),
- les protéines impliquées dans la régulation de l'expression des gènes (facteurs de
transcription).
D'autre part, l'un des substrats les plus important des PKC est la protéine MARCKS
(Myristoylated, Alanine-Rich C Kinase Substrate) qui est phosphorylée lors de l'activation de
macrophages ou au cours de la mitogenèse (Hartwig et al., 1992).
Les isoformes de PKC sont distibuées de manière différentielle à l'intérieur d'une même
cellule, ainsi que d'un tissu à un autre (Dekker et Parker, 1994). De plus, d'autres études ont
montré que l'âge pouvait influencer l'expression de certaines isoformes de PKC (Whisler et
al., 1995).
Dans les cellules T, les isoformes α, βI, δ, ε, ζ et η sont exprimées (Lucas et al., 1990; Mischak
et al., 1993 a et b). On retrouve en particulier l'isoforme β, ce qui suggère qu'elle pourrait
jouer un rôle préférentiel dans l'activation des cellules T (Murray et al., 1993; Tsutsumi et al.,
1993).
En fait, il existe une activation des PKC en deux temps dans les cellules T : tout d'abord, une
activation de la PKC-α en une dizaine de minutes après la stimulation, suivie d'une activation
soutenue de la PKC-β (Szamel et Resch, 1995).
Plusieurs hypothèses sur le mode d'activation des cellules T par les PKC ont été émises. Tout
d'abord, la PKC serait capable d'activer le facteur de transcription AP-1, en phosphorylant c-
fos et en déphosphorylant c-jun (Karin, 1992; Meek et Street, 1992). D'autre part, la PKC
pourrait activer NF-ΚB, un autre facteur de transcription, en phosphorylant la protéine
inhibitrice I-ΚB qui forme un complexe inactivé avec NF-ΚB (Shirakawa et Mizel, 1989;
Ghosh et Baltimore, 1990; Link et al., 1992). Ainsi, les PKC seraient impliquées dans la
transcription des gènes de l'IL-2 et de son récepteur, par deux voies distinctes (AP-1 et NF-
ΚB), mettant probablement en jeu deux isoformes différentes.
Deux autres protéines cibles pourraient être impliquées dans l'activation des cellules T par la
PKC. En effet, une augmentation significative de la protéine p21-ras sous sa forme active liée
au GTP est observée au cours de l'activation, ce qui indique une diminution de l'activité de la
protéine GAP (GTPase Activating Protein) probablement due à une phosphorylation par la
PKC (Downward et al. 1990). Enfin, les études de Bruder et al. (1992) semblent indiquer que
la Ser/Threonine kinase c-raf kinase pourrait être impliquée avec une ou plusieurs PKC dans
une cascade complexe de kinases conduisant à l'activation des cellules T.
36
37
e) La voie p21-ras/MAP-kinase.
Les protéines Ras sont des protéines de 21 KDa qui se lient au GTP et ont une activité
GTPasique. Un grand nombre de stimuli extracellulaires, tels que les facteurs de croissance,
les lymphokines, les antigènes ou les mitogènes peuvent induire l'activation des protéines Ras,
qui passent alors d'un état lié au GDP à un état lié au GTP. Il existe plusieurs mécanismes qui
permettent de transformer Ras en sa forme active liée au GTP. Ainsi, l'activation du récepteur
des cellules T peut réguler les activités Ras par des interactions avec des facteurs d'échanges
des nucléotides guanyliques (Sos et Vav) et avec des protéines GAP (GTPases Activating
Proteins) (Amrein et al., 1992,1994 ; Gulbins et al., 1993, 1994).
Un lien direct entre le TCR et Ras, impliquant deux protéines adaptatrices Shc et Grb2 et le
facteur d'échange des nucléotides guanyliques Sos a été identifié (Ravichandran, 1993). Après
activation du TCR, les séquences ITAM du TCRζ sont phosphorylées et constituent un point
d'ancrage pour les domaines SH2 de la protéine Shc. Cette protéine Shc est alors
phosphorylée et peut donc interagir avec les domaines SH2 de Grb2, qui contient également
deux domaines SH3 qui se lient aux séquences riches en proline de l'extremité C-terminale de
Sos. Enfin, Sos peut se lier à Ras et l'activer. Une sérine/thréonine kinase codée par le
protooncogène Raf-1 va alors être activée par Ras et être transloquée à la membrane. Les
substrats de la protéine Raf sont deux protéines kinases appelées Mek 1 et Mek 2 (MAP-
Kinase Kinases 1 et 2), qui activent les MAP-Kinases (Mitogen-Activated Protein Kinases) ou
Erk 1 et Erk 2 , en les phosphorylant sur des résidus tyrosine ou thréonine (Burgering et Bos,
1995 ; Pastor et al., 1995).
Les signaux transmis par cette voie des MAP-Kinases modulent l'expression d'un grand
nombre de gènes en stimulant ou en inhibant des facteurs de transcription tels que Fos, Jun ou
NF-ΚB (Karin et Smeal, 1992). Ainsi, l'activation de Ras a pu être corrélée avec l'activation de
la transcription du gène de l'IL2.
II-2. Le rôle des nucléotides cycliques.
La plupart des fonctions cellulaires sont régulées par des variations des taux de
nucléotides cycliques, AMPc (Adénosine MonoPhosphate cyclique ) et GMPc (Guanosine
MonoPhosphate cyclique).
Ainsi, les variations des taux de nucléotides cycliques dans les lymphocytes T ont fait l'objet
de nombreuses études, tout comme leur rôle dans la régulation de la croissance, la
différentiation et la fonction des cellules lymphoides (Parker et al., 1974 ; Coffey et al., 1978 ;
Hadden et Coffey, 1982 ; Kammer, 1988 ; Hadden, 1988).
L'observation d'une augmentation rapide et transitoire d'AMPc et de GMPc durant l'initiation
38
de l'activation des lymphocytes suggère que ces deux nucléotides cycliques pourraient être
impliqués dans la transmission du signal d'activation lymphocytaire.
a) Implication de l'AMPc dans l'activation lymphocytaire.
Le rôle de l'AMPc dans l'activation mitogénique a été très étudié. Ainsi, après
stimulation mitogénique, à la fois une augmentation et une diminution des taux d'AMPc ont
été observées (Wang et al, 1978). D'autre part, une augmentation des taux d'AMPc a été
décrite après stimulation des cellules T par un anticorps anti-CD3 (Ledbetter et al, 1986).
Cet effet pourrait représenter l'activation d'un mécanisme de rétrocontrôle négatif, largement
étudié dans des cellules T ou des lignées cellulaires. En effet, un taux élevé d'AMPc semble
inhiber la réponse lymphoproliférative en supprimant la production d'IL2 (Novogrodsky et al.,
1983) et des études plus récentes ont montré que l'AMPc aurait un effet inhibiteur sur la
transcription des gènes de l'IL2 (Anastassiou et al., 1992). Les auteurs ont proposé trois stades
d'inhibition : le premier au niveau membranaire illustré par la tyrosine phosphorylation d'une
protéine pp100, encore non identifiée, le second au niveau cytoplasmique se traduisant par
une diminution de la demi-vie de l'ARNm de l'IL2, et enfin le troisième au niveau nucléaire
impliquant une inhibition des sites de fixation des facteurs de transcription. D'autres auteurs
ont analysé les effets de concentrations croissantes d'AMPc sur l'activation du facteurs de
transcription NF-kB dans des cellules de Jurkat activées par l'ester de phorbol TPA en
présence de ionophore calcique (A23187), et ont décrit que l'AMPc augmentait la liaison de
l'ADN à NF-kB et la phosphorylation d'une sous-unité de NF-kB (Lahdenpohja et al., 1996).
Ces résultats montrent que l'AMPc serait capable de réguler l'expression des gènes dépendants
de NF-kB en modifiant la composition et l'activité des sous-unités de NF-kB.
D'autres auteurs pensent que l'AMPc serait capable de bloquer la progression et non
l'initiation de la prolifération des cellules T (Lingk et al., 1990). Enfin, Lerner et al. (1988) ont
décrit que les variations des taux d'AMPc pouvaient réguler les taux d'inositolphosphate et de
Ca2+, deux composés essentiels dans la phase précoce de la réponse mitogénique.
Le mode d'action de l'AMPc reste cependant très controversé, même si les protéines kinases
AMPc-dépendantes (PKA) semblent souvent impliquées dans ce phénomène. Les
lymphocytes humains ont deux isoformes de PKA : la PKA de type I, cytosolique et la PKA
de type II, associée à la membrane plasmique. Skälhegg et al. (1994) ont décrit que
l'activation de la PKA de type I par l'AMPc pourrait conduire à sa translocation vers la
membrane plasmique à proximité du complexe TCR/CD3. Ainsi, l'AMPc, par une
phosphorylation PKA-dépendante du complexe TCR/CD3 ou de ses protéines associées,
serait capable d'inhiber la prolifération stimulée par un antigène.
Cependant, le groupe de Kammer a récemment réfuté cette hypothèse, en supposant que la
39
PKA de type I (et non celle de type II) serait rapidement activée après fixation d' un antigène
sur le récepteur des cellules T et activation d'une voie intracellulaire comprenant CD45
phosphatase/PTK/PI/Ca2+/PKC (Laxminarayana et al., 1993, 1996). Ainsi, l'activation des
cellules T impliquerait une rapide activation de la PKA de type I et d'autres protéines
associées à la membrane.
D'autre part, l'hypothèse d'un effet positif indirect de l'AMPc a été décrite par Chakkalath et
al. (1992). Les résultats de leurs travaux indiquent que l'AMPc peut jouer un rôle de
régulation positive dans la prolifération des cellules T stimulées par le TPA, mais de manière
indirecte grâce à des facteurs qui sont secrétés par des monocytes prétraités au dibutyrylAMPc
et qui permettent une augmentation de la production d'IL2 dans les cellules T.
D'autre part, Bauman et al. (1994) ont montré que lorsque les cellules T étaient stimulées par
la PGE2 ou l'isoprotérénol, les deux isoformes de PKA étaient activées, la PGE2 induisant
l'utilisation à parts égales de PKA de type I et de type II, et l'isoprotérénol stimulant deux fois
plus la PKA I que la PKA II. Les cinétiques d'activation des PKA par les deux agonistes sont
identiques, mais l'effet de la PGE2 est plus important. Parallèlement, la PGE2 est plus
immunosuppressive. Là encore, ces résultats suggèrent que les différences d'activité PKA et
de concentration d'AMPc sont des éléments importants de la régulation de la réponse
lymphoproliférative.
Dans les fibroblastes, d'autres auteurs ont décrit une interaction entre la voie de l'AMPc/PKA
et la voie Ras/MAP-Kinase. En effet, dans ces cellules, l'élévation du taux intracellulaire
d'AMPc inhibe l'activité MAP-Kinase stimulée par des facteurs de croissance (Cook et
McCormick, 1993 ; Hordijk et al., 1994). En fait, il a été montré que l'élévation des taux
d'AMPc n'affecte pas la stimulation de Ras, mais inhibe l'activation de Raf, MEK et MAP-
Kinase (Burgering et al., 1993). De plus, d'autres auteurs ont montré qu'il existait une baisse
de son affinité pour Ras (Wu et al., 1993). Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de
Raf, et la baisse d'affinité entre Raf et Ras qui en résulte pourraient être un des mécanismes
expliquant l'effet antiprolifératif de l'AMPc.
Récemment, dans des lymphocytes , les travaux de Tamir et al. (1996) ont montré que l'effet
négatif de l'AMPc sur l'activation cellulaire pouvait également être associée à une diminution
des activités MAP-Kinases.
b) Implication du GMPc dans l'activation lymphocytaire.
Le rôle central du GMPc est connu dans de nombreuses voies de signalisation (Figure 8),
mais reste cependant assez controversé. De nombreuses études ont rapporté que la PHA
(Phytohemagglutinine) et la Con A induisent une augmentation précoce de GMPc dans les
lymphocytes au cours des 30 premières minutes d'activation, suivie d'un retour au taux basal après 60
minutes (Coffey et al., 1978; Hadden et Coffey, 1982). D'autres études ont montré que des agents qui
augmentent le GMPc comme la thymosine (Hadden, 1988), la thymopoietine
40
kinaseprotein
Agonists Cytokines Agonists ANP/BNP CNP STa/Guanylin ?
Ca+ transcrip.Factors Ca+
inducible
I II III
NO
Other Targets
Iconstitutive
IIinducible
NO Synthase Heme oxygenase
constitutive particulate
GC-S α1−3
β1−3
GC-A GC-B GC-C retGC
particulate guanylyl cyclase
soluble guanylyl cyclase
cGMP
cAMP
cGMP-gated
channels
cGMP-inhibited cGMP-stimulated cGMP-dependent cAMP-dependent cAMP-PDE cAMP-PDE Iα, β, ΙΙ
kinase Iα, β, ΙΙαβ
ion flux increased cAMP decreased cAMP protein proteinresponse response phosphorylation phosphorylation
CO
protein
Figure 8 : Voies de transduction du signal conduisant à la synthèse de GMPc et ses effets sur
la réponse cellulaire (d'après Schmidt et al., 1993).
41
(Baker et al., 1988), le LAF (Lymphocyte Activating Factor) ou le monoxyde d'azote NO
(Garbers, 1989; Schmidt et al., 1993) modulent la prolifération lymphocytaire induite par les
mitogènes.
Certains auteurs décrivent le GMPc comme un signal positif de la lymphoprolifération
(Coffey et al., 1978). Ces auteurs ont montré (Hadden et Coffey, 1982) que dans de nombreux
cas d'immunodéficience associée à l'âge ou au cancer, la hausse de GMPc induite par le
mitogène est réduite parallèlement à une réponse lymphoproliférative faible. L'utilisation
d'inhibiteurs de PDE a permis de mettre en évidence que cette augmentation du taux de GMPc
résulterait d'une augmentation de sa synthèse, plutôt que d'une diminution de son métabolisme
(Whitfield et al., 1974). Deviller et al. (1975) sont les premiers à avoir montré que la PHA
active la guanylate cyclase (GC) dans les lymphocytes intacts après deux minutes de
stimulation. Les premières variations d'activité de la GC sont observées d'abord au niveau
membranaire puis ensuite au niveau cytosolique (Coffey et Hadden, 1983; Hadden, 1988).
Les inhibiteurs de phospholipase, de lipoxygénase et non de cyclooxygénase inhibent
parallèlement l'activation de la GC induite par les mitogènes et la prolifération. Plusieurs
produits de la voie des lipoxygénases ont pu être impliqués dans l'activation de la GC. Ainsi,
certains auteurs ont montré que les 5-, 11- et 12-HETEs, produits d'oxydation de l'acide
arachidonique, ainsi que leurs précurseurs (HPETEs) stimulent la GC dans les lymphocytes
activés (Goldberg et al., 1978; Coffey et al., 1981). Par contre, le 15-HETE inhibe l'activation
de la GC induite par le 5-HETE (Gualde et al., 1985).
Ces observation confirment le rôle important de la voie de la lipoxygénase dans l'activation de
la GC.
Par contre, d'autres auteurs ont montré que l'addition de GMPc ou de ses analogues ne modifie pas la
prolifération des lymphocytes T purifiés (Knudsen et al., 1987).
Après stimulation des lymphocytes par du nitroprussiate de sodium (SNP), donneur de monoxyde
d'azote NO, Atkinson et al. (1978) et Kaever et al. (1985 ; 1990) ont observé une augmentation
importante du taux de GMPc mais sans effet sur l'activation des lymphocytes du sang périphérique
humain induite par la Con A.
Haslam et al. (1980) ont montré que le GMPc est un messager intracellulaire négatif, inhibant le
"turnover" des phosphoinositides dans les plaquettes.
En outre, Merryman et al. (1993) ont étudié le rôle du NO et de son dérivé stable le S-nitrosothiol
(SNO-GSH) sur la réponse des lymphocytes T activés. Ils ont montré que seul le dérivé stable du NO
(t1/2>2 heures) inhibe la synthèse d'ADN indépendamment de la production d'IL2, mais en
association avec une accumulation de GMPc par un mécanisme NO-dépendant.
Les macrophages régulent les fonctions lymphocytaires par deux voies opposées. Une première voie
impliquée dans la potentialisation de la réponse immune des lymphocytes T, met en jeu leur
42
PALysoPA DAG PIP2
PC/PE
Lyso PA Acyltransférase
PAP
DAG-Kinase
PLC
PLCPLD
Figure 9 : Les voies de formation du PA.
43
capacité de présentation de l'antigène et de sécrétion de médiateurs solubles. L'autre voie,
suppressive met en jeu le relargage de peroxyde d'hydrogène, de prostaglandines et d'autres
médiateurs suppresseurs.
Le monoxyde d'azote (NO) libéré par les macrophages activés montre des effets antimicrobiens,
contribue à l'activité cytotoxique des macrophages contre les cellules tumorales et supprime la
prolifération des lymphocytes en réponse à la Con A (Granger et al., 1988; Stuehr et Nathan, 1989;
Isobe et Nakashima, 1993). L'hypothèse selon laquelle la régulation négative de la prolifération
lymphocytaire par les macrophages serait dépendante de l'arginine a été étayée par les travaux de
Hoffman et al. (1990) et de Mills (1991) montrant qu'un inhibiteur compétitif de la NO-synthase (le
NMMA, NG monométhyl-Larginine) stimulait la prolifération des lymphocytes. Les mécanismes
biochimiques d'action de NO ne sont pas encore bien compris. Etant capable de diffuser à travers la
membrane cellulaire, le NO provenant des macrophages peut directement activer la GC soluble des
lymphocytes et augmenter le taux de GMPc. Enfin, le GMPc peut potentialiser l'effet des agents qui
augmentent l'AMPc comme la PGI2 par l'inhibition de certaines phosphodiestérases (Maurice et al.,
1990 et 1991). Le NO exercerait son effet inhibiteur de l'agrégation plaquettaire et de relaxation du
muscle lisse, en amplifiant les hausses d'AMPc via l'inhibition des PDE GMPc inhibables.
III- Voies de formation et effets cellulaires de l'acide phosphatidique (PA).
Plusieurs travaux récents ont montré une hausse rapide du taux intracellulaire d'acide
phosphatidique (PA) au cours de l'activation lymphocytaire (Pelassy et al., 1991; Bismuth et al.,
1988; Marcoz et al., 1993a). L'acide phosphatidique est un lipide quantitativement mineur, surtout
connu comme intermédiaire commun à la synthèse des autres phospholipides et des triacylglycérols.
Cependant, le rôle potentiel du PA comme second messager de différentes hormones ou facteurs de
croissance semble de plus en plus solidement étayé.
III-1. Les voies de formation du PA.
Le PA qui se forme pendant l'activation peut être issu d'une ou plusieurs voies de
signalisation dans la cellule. Trois voies principales ont été décrites : (Figure 9)
- l'hydrolyse par des phospholipases C (PLC) spécifiques de certains phospholipides comme
la phosphatidylcholine (PC) ou les phosphatidylinositols (PI) conduisant à la formation de
diacylglycérol (DAG), qui est phosphorylé par la suite par une DAG-Kinase pour donner du PA
(Aussel et al., 1992)
- L'hydrolyse par une phospholipase D (PLD) de phosphatidylcholine (PC) ou
phosphatidyléthanolamine (PE) pour donner directement du PA (Bocckino et al., 1987)
44
45
- l'acylation par une lysophosphatidate acyltransférase d'un pool de lysophosphatidate
(lysoPA) déjà présent dans la cellules, ou formé très rapidement à partir de la glycolyse par
l'intermédiaire de dihydroxyacétone phosphate (Bursten et al., 1991; Rossi et al., 1991).
L'importance relative des divers mécanismes connus est très différente d'un type cellulaire à
l'autre et diffère également en fonction du mitogène utilisé.
a) La voie PLC-DAG-Kinase.
Les Phospholipases C.
L'hydrolyse du phosphatidylinositolbisphosphate (PIP2) par la PLC survient
généralement en réponse à une stimulation de la cellule par un récepteur membranaire. Elle
conduit à la formation d'inositoltrisphosphate (IP3) et de diacylglycérol (DAG), deux seconds
messagers intracellulaires. En effet, l'IP3 et le DAG augmentent respectivement la
concentration intracellulaire en Ca2+ et l'activité de la PKC.
Comme c'est le cas pour beaucoup de protéines importantes dans la transduction du signal, il
existe plusieurs familles de PLC. Ainsi, plusieurs isoformes de PLC ont été isolées et clonées
à partir d'un grand nombre de tissus de mammifères (Majerus, 1992). Elles ont pu être
classées en trois familles : les PLC β, PLCγ et PLC δ, chaque famille contenant plusieurs
isoformes (Lee et Rhee, 1995) (Figure 10). Il existe d'autres types de PLC, par exemple la
PLCα, mais qui n'ont pas encore été clonés. Seules deux régions de forte homologie sont
présentes dans les trois types β, γ et δ : les régions X et Y, qui contiennent entre 170 et 260
acides aminés, et semblent constituer le domaine catalytique. Toutes les isoformes de PLC de
mammifères possèdent une région N-terminale d'environ 300 acides aminés qui précède la
région X. Les PLC β et PLC δ ont une petite séquence de 50 à 70 acides aminés qui sépare les
régions X et Y, alors que les PLCγ ont une longue séquence d'environ 400 acides aminés qui
contient les domaines SH ou Src Homology (deux domaines SH2 et un domaine SH3). Enfin,
toutes les isoformes contiennent un domaine PH (Pleckstrin Homology) du côté N-terminal,
avant la région X.
Il existe deux mécanismes différents permettant d'activer les PLC : soit une tyrosine
phosphorylation pour les PLCγ, soit par couplage à des protéines G telle que Gp pour la
PLCβ. Le mode d'activation de la PLCδ n'est pas encore connu (Rhee et Choi, 1992). Sa
structure a été étudiée récemment par cristallographie (Essen et al., 1996) et les résultats
suggèrent que cette protéine s'attache à la membrane et que son action sur les
phosphoinositides nécessite du Ca2+.
46
Dans les lymphocytes, les isoformes γ1, γ2 et β sont présentes. Le mécanisme d'activation de la PLC
dans les cellules T a été sujet de nombreuses controverses, et la question de l'implication des
protéines G ou des tyrosines kinases dans ce mécanisme a été beaucoup étudiée (Harnett et Righley,
1992). En effet, alors qu'il apparait évident que l'activation des PLC dans les cellules B est médiée par
une protéine G, il n'en est pas de même dans les cellules T. Malgré des résultats très clairs sur
l'existence d'une voie des inositolphosphates régulée par des protéines G dans les lymphocytes T
(Harnett et Klaus, 1988; Graves et Cantrell, 1991), il n'est absolument pas démontré que cette voie
soit couplée au récepteur des cellules T.
Récemment, Stanners et al. (1995) ont observé une association entre la chaine ε du CD3 et la protéine
Gqα/11, et cette association pourrait conduire à la stimulation de la PLCβ. Les auteurs suggèrent une
régulation réciproque entre tyrosine-kinases et protéines G dans les cellules T.
Cependant, l'isoforme de PLC qui participe majoritairement aux événements précoces de l'activation
lymphocytaire est la PLCγ1. Cette isoforme, grâce à ses groupements SH2, SH3 et PH est activée par
tyrosine phosphorylation (June et al., 1990; Mustelin et al., 1990; Weiss, 1991).
D'autres études ont montré l'existence de PLC qui ne sont pas spécifiques des
phosphatidylinositols. Exton (1990) a décrit l'existence d'une PLC qui hydrolyse la
phosphatidylcholine (PC). Contrairement à l'activation de la PI-PLC, l'activation de la PC-PLC est
prolongée, ce qui permet d'avoir une production de DAG de longue durée et par conséquent une
activation prolongée de la PKC (Exton, 1994). Cependant, cette PC-PLC a été peu étudiée. On sait
qu'elle peut être activée par l'IL1 dans les lymphocytes (Rosoff et al., 1988), par l'angiotensine II dans
des fibroblastes transfectés avec le récepteur de l'angiotensine II (Wen et al., 1995) et par l'IL4 dans
les cellules monocytaires U937 (Ho et al., 1994). Enfin, certains auteurs ont décrit que cette enzyme
pourrait jouer un rôle dans l'apoptose. En effet, il a été décrit que les céramides sont impliqués dans
l'apoptose (Hannun et Obeid, 1995) et la PC-PLC participerait à la production de ces molécules en
activant des sphingomyélinases, en réponse au TNF (Schütze et al., 1992) ou via le récepteur
Fas/APO1 (Cifone et al., 1995). Le couplage entre la PC-PLC et les récepteurs serait assuré par des
protéines G.
Les DAG-Kinases et les Phosphatidate phosphohydrolases.
Le DAG occupe un rôle central dans la biosynthèse des lipides, ainsi que dans la transmission
du signal en activant les PKC. Les taux intracellulaires de DAG sont régulés à la fois par sa synthèse
et par sa dégradation. En particulier, une des voies de dégradation du DAG est sa conversion en acide
phosphatidique. Cette réaction est catalysée par la DAG-Kinase et utilise l'ATP comme donneur du
groupement phosphate (Kanoh et al., 1990). Cette conversion enzymatique est supposée être un
mécanisme important permettant d'atténuer l'activation de la
47
48
PKC en diminuant les taux intracellulaires de DAG. Cependant, cette hypothèse est nuancée
par le fait que l'acide phosphatidique est lui-même décrit comme un mitogène (Moolenar et
al., 1986). Un autre rôle de la conversion par la DAG-Kinase pourrait être de resynthétiser du
phosphatidylinositol riche en acide arachidonique (Holub et Kuksis, 1978), et récemment une
DAG-Kinase spécifique des espèces contenant de l'acide arachidonique a pu être identifiée
(Walsh et al., 1995). D'autres auteurs ont décrit l'implication de la DAG-Kinase dans la
régulation de la synthèse de l'IL2 dans les cellules de Jurkat (Aussel at al., 1992) ou dans la
réponse proliférative des lymphocytes stimulés par l'IL2 (Mérida et al., 1993; Flores et al.,
1996). Cette enzyme a également été impliquée dans la réponse des cellules NIH3T3 à l'EGF
(Montgomery et al., 1997) ou la réponse des cellules T à la sphingosine (Yamada et al., 1993).
La première isoforme de DAG-Kinase qui a été caractérisée au niveau moléculaire est la
DAG-Kinase α. Cette isoforme a une masse moléculaire de 80 kDa et a été isolée et clonée à
partir de tissus de porc (Sakane et al., 1990) ou de tissus humains (Schaap et al., 1990). Elle
est surtout présente dans les lymphocytes et les oligodendrocytes (Goto et al., 1992).
L'ADNc d'une seconde isoforme, la DAG-Kinase β, a été isolé de cerveau de rat et code pour
une protéine d'environ 90 kDa qui est majoritairement trouvée dans le cerveau (Goto et
Kondo, 1993).
Kai et al. (1994) ont isolé l'ADNc de la DAG-Kinase γ et ont trouvé qu'il était surtout exprimé
dans la rétine. Un ADNc similaire est également très exprimé dans les cellules cérébrales
(Goto et al., 1994).
Récemment, une DAG-Kinase ζ a été identifiée (Bunting et al., 1996) dans les cellules
endothéliales humaines, et retrouvée surtout dans le cerveau et les muscles.
Enfin, plusieurs équipes ont décrit l'existence d'une DAG-Kinase appelée par certains DAG-
Kinase ε et qui serait spécifique des espèces contenant de l'acide arachidonique (MacDonald
et al., 1988a et b; Walsh et al., 1994; Tang et al., 1996).
Quatre régions assez bien conservées ont été décrites (Fig. 11) comprenant un domaine
catalytique avec un site de liaison à l'ATP, une région riche en cystéines (zinc-finger) et un
site de fixation du Ca2+ (EF-hand). Cependant, les isoformes ζ et ε ne contiennent pas ces
domaines.
Enfin, plusieurs inhibiteurs de ces enzymes dont le dioctanoyléthylène glycol, le 1-
monooleylglycérol (Bishop et al., 1986) et le composé R59022 sont maintenant disponibles;
le composé R59022 est un inhibiteur de la DAG-Kinase de 80 Kda très utilisé (de Chaffoy de
Courcelles et al., 1985). Certaines études montrent que la DAG-Kinase est régulée par la PKC
(Van Blitterswijk et al., 1991; Schaap et al., 1993), et par phosphorylation de résidus tyrosines
(Schaap et al., 1993).
49
Contrairement à la DAG-Kinase, la phosphatidate phosphohydrolase (PAP) prolonge
la production du DAG, et ainsi l'activation de la PKC. En effet, plusieurs équipes ont montré
que le DAG formé lors de l'activation cellulaire provient de deux sources. Un premier pic
fugace correspond à des DAG provenant de l'hydrolyse du PIP2 par la PLC, alors que le
deuxième pic prolongé dans le temps correspond à des DAG issus des PC par action
séquentielle d'une PLD et d'une PA hydrolase (Exton, 1990; Billah et Anthès, 1990).
Le rôle de la PAP a été clairement démontré par Bursten et al. (1991). En effet, dans les
cellules mésangiales humaines stimulées par l'IL1, l'activation d'une lyso-PA acyl transférase
et d'une protéine G sensible à la toxine pertussique conduirait à l'activation d'une PAP. Dans
ce type cellulaire, le PA serait ainsi un intermédiare important au cours de l'activation par
l'IL1.
Enfin, la PAP est également impliquée dans la régulation de la synthèse des glycérolipides
(Smith et al., 1967).
Les activités PAP de différents tissus ont été caractérisées et il a été proposé qu'il existait deux
isoformes pouvant être distinguées par leur distribution cellulaire, leur dépendance vis à vis
des ions Mg2+, leur inhibition par le NaF, le N-éthylmaléimide (NEM) ou la chaleur (Jamal et
al., 1991; Walton et Possmayer, 1989; Day et Yeaman, 1992; Aridor-Piterman et al., 1992). Il
a été proposé que l'activité PAP associée à la membrane est insensible au NEM et
indépendante du Mg2+ et prend part à la transduction du signal intracellulaire, alors que
l'activité PAP qui dépend du Mg2+ est trouvée dans le cytosol ou le réticulum endoplasmique,
est inhibée par le NEM et est impliquée dans la synthèse des glycérolipides (Jamal et al.,
1991). Enfin, une activité cytosolique sensible au NEM a été identifiée dans les neutrophiles
humains (Truett et al., 1992).
b) La voie PLD.
La phospholipase D (PLD) est une enzyme distribuée largement dans les cellules de
mammifères. Son substrat le plus courant est la phosphatidylcholine (PC), qui est hydrolysée
en PA et choline, mais la PLD hydrolyse également la phosphatidyléthanolamine (PE) et le
phosphatidylinositol (PI) dans certains organismes ou tissus. Enfin, cette enzyme catalyse
aussi une réaction de transphosphatidylation, qui permet en présence d'alcool primaire dans le
milieu de former du phosphatidylalcool aux dépens du PA. Cette réaction est spécifique de la
PLD et permet ainsi de quantifier son activité dans les cellules.
La PLD a été purifiée à partir de plusieurs sources et a été clonée à partir de bactéries, de
levures, de plantes et de tissus de mammifères (Morris et al., 1996).
Certaines séquences des différentes PLD connues sont bien conservées d'une isoforme à
l'autre (Figure 12) et elles représentent probablement le site catalytique de l'enzyme.
50
51
La première PLD de mammifère qui a été clonée (hPLD1a) compte 1072 acides aminés et a
une masse moléculaire de 124 kDa (Hammond et al., 1995). Cette PLD est spécifique de PC.
Un variant plus petit de cette isoforme, comptant 1034 acides aminés (hPLD1b) a été identifié
et a les mêmes propriétés que hPLD1a (Hammond et al., 1997). Enfin, une autre PLD (PLD2)
qui contient 932 acides aminés et a 51% d'homologie de séquence avec hPLD1a a été clonée
(Colley et al., 1997).
D'autres PLD ont été identifiées dans des tissus humains et des cellules de gliomes C6
(Ribbes et al., 1996; Yoshimura et al., 1996), et leur séquence indique des ressemblances,
mais pas en totalité, avec hPLD1. Okamura et Yamashita (1994) ont purifié à partir de
poumon de porc une autre PLD spécifique de PC, d'une masse moléculaire d'environ 190 kDa
et avec un pH optimum de 6,6. Une autre PLD a été isolée de membrane de cerveau de porc
par Brown et al. (1995). Elle a une masse moléculaire de 95 kDa et est stimulée par PIP2 et
les petites protéines G : ARF et Rho A. D'autres PLD ont été purifiées et diffèrent par leur pH
optimum, leur réponse au Ca2+, au PIP2, à l'oléate ou aux détergents.
Des études de la localisation intracellulaire des PLD ont montré que l'enzyme est assez
souvent présente dans les membranes mais est également retrouvée dans le Golgi ou le noyau
(Ktistakis et al., 1995, 1996; Whatmore et al., 1996, Balboa et Insel, 1995). Il existe une
activité significative dans le cytosol, mais pas dans les mitochondries. Dans le foie, l'isoforme
membranaire répond plus à Rho A qu'à ARF, et l'inverse est vraie dans les autres fractions
subcellulaires. Des études de PLD dans les fibroblastes indiquent que la PLD2 se situe surtout
dans la membrane plasmique, alors que la PLD1 est retrouvée dans le réticulum
endoplasmique, le Golgi et les endosomes.
Pertile et al. (1995) ont montré que le PIP2 est important pour l'activation de la PLD dans des
cellules intactes, mais il n'est pas évident que les taux physiologiques de PIP2 et PIP3
puissent contrôler l'enzyme in vivo. Cependant, des études sur des PLD purifiées et clonées
montrent que PIP2 et PIP3 activent directement l'enzyme alors que l'oléate serait inhibiteur
(Hammond et al., 1997).
Dans des membranes de cerveau de rat solubilisées avec des détergents, deux pics d'activité
PLD apparaissent et ont été recemment identifiés : l'un activé par l'oléate qui ne dépend ni
d'ARF ni du GTPγS, et l'autre dépendant de l'ARF. Ces deux enzymes montrent des besoins
en co-facteurs différents, ce qui indique que ces enzymes sont contrôlées de manière
différente. Ainsi, l'activité PLD qui dépend de l'ARF a également besoin de PIP2, ce qui n'est
pas le cas de l'activité stimulée par l'oléate (Massenburgh et al., 1994).
Un grand nombre d'agonistes sont connus comme activateurs de la PLD, et parmi ceux-ci plusieurs
agissent par des récepteurs couplés à des protéines G hétérotrimériques Gq ou Gi. C'est pourquoi il
semble maintenant assez évident qu'un signal provenant de l'activation de ces protéines G doit être
transmis à la PLD. D'autre part, certains autres agonistes sont des facteurs de croissance qui agissent
via des récepteurs couplés à des protéines tyrosine-kinases, et il est
52
Agoniste
Récepteur à 7 domaines
transmembranaires
Gq/Gi
PKC
Rho/ARF
PLD
Facteurs de croissance
Récepteur du facteur
de croissance
Autophosphorylation
PI/PLC
PKC
Rho
PLD
Figure 13 : Mécanismes supposés d'activation de la PLD (d'après Exton, 1997).
53
donc aussi possible que le signal d'activation soit transmis à la PLD grâce à des
phosphorylations de résidus tyrosines. En fait, ces résultats indiquent que la PKC serait
impliquée dans la transmission du signal à la PLD, puisque un grand nombre de récepteurs
couplés à des protéines G ou à des protéines tyrosines kinases sont capables d'induire une
hydrolyse significative du PIP2 et ainsi une activation de la PKC. Cependant, il semble
également que l'activation de la PKC ne puisse pas expliquer entièrement l'effet de ces
agonistes sur la PLD, et il doit donc exister d'autres mécanismes d'activation de cette enzyme.
Régulation de la PLD par la PKC.
Il existe de plus en plus de preuves que la PLD est régulée par la PKC. En effet, des
études utilisant les esters de phorbol ou des inhibiteurs de PKC ou bien mettant en jeu une
down-régulation de la PKC, des sur-expressions ou délétions de certaines isoformes de PKC
ont conduit à ce résultat (Pai et al., 1987, 1991; Eldar et al., 1993; Balboa et al., 1994).
D'autre part, les études de Yeo et al.(1994) et de Lee et al. (1994) ont montré que l'hydrolyse
du PI par la PLC était nécessaire à l'activation de la PLD. Plusieurs mécanismes ont été
imaginés et sont illustrés en Fig. 9.
Le mécanisme le plus direct de contrôle de la PLD par la PKC serait une phosphorylation de
l'enzyme. Cependant, les études qui se sont interessées au effets directs de la PKC sur la PLD
ont montré que l'activation n'implique pas l'ATP (Conricode et al., 1992, 1994; Singer et al,
1996; Hammond et al., 1997). En particulier, des études avec une PLD recombinante
exprimée dans des cellules Sf9 indiquent que les PKC α et β peuvent directement activer la
PLD d'une manière independante de l'ATP (Hammond et al., 1997), les autres isoformes étant
inactives (Conricode et al., 1994). L'interaction n'est pas affectée par la staurosporine (un
inhibiteur de PKC) et implique le domaine régulateur de la PKC (Singer et al., 1996).
Néanmoins, même si la régulation de la PLD par la PKC implique des interactions protéines-
protéines, un mécanisme supplémentaire dépendant de phosphorylations n'est pas à exclure in
vivo. En effet, des études utilisant des inhibiteurs de PKC qui interfèrent avec la liaison de
l'ATP (Exton, 1997) ou encore des études sur les effets de l'ATP en système acellulaire
(Lopez et al., 1995) semblent indiquer qu'une partie du mécanisme serait dépendant de
phosphorylations. On peut également penser que la PKC pourrait agir in vivo en
phosphorylant d'autres protéines impliquées dans la régulation de la PLD ou en altérant la
réponse de la PLD à de telles protéines. Ainsi, on peut noter qu'il existe une synergie entre les
effets les protéines Rho A, ARF et la PKC pour activer la PLD.
Enfin, au contrairement aux autres isoformes de PLD, la PLD2 possède une activité basale
élevée, à la fois in vitro et in vivo (Colley et al., 1997). Elle peut être stimulée par le PIP2,
mais ne répond ni à la PKC, ni à ARF, ni à Rho A.
54
Régulation de la PLD par les ions Ca2+.
Des études avec le ionophore calcique A23187 et la ionomycine indiquent qu'une
augmentation du calcium intracellulaire peut activer la PLD (Bocckino et Exton, 1996). La
chélation du Ca2+ par l'EGTA provoque une inhibition de l'activation de la PLD par les
agonistes se liant à des récepteurs couplés aux protéines G (Balboa et al., 1994; Halenda et
Rehm, 1990; Huang et al., 1991; Wu et al., 1992). Il est difficile de savoir si ces résultats
impliquent le calcium dans l'effet de la PKC sur la PLD ou bien si le calcium joue un autre
rôle dans l'activation de la PLD. Des études sur les effets directs du calcium sur des
préparations partiellement purifiées de PLD montrent généralement une stimulation, mais les
concentrations utilisées sont très variables et les fortes concentrations ont même un effet
inhibiteur (Bocckino et Exton, 1996; Brown et al., 1995; Okamura et Yamashita, 1994;
Siddiqi et al., 1995). Ainsi, l'hypothèse d'un contrôle direct de l'activité PLD par le calcium
n'est pas vraiment démontrée.
Régulation de la PLD par ARF.
L'ARF (ADP-Ribosylation Factor) est décrit comme un facteur participant à laribosylation de la protéine Gsα induite par la toxine cholérique (Lopez et al., 1995). On sait
également maintenant qu'il joue un rôle dans le traffic vésiculaire au niveau du Golgi. Ainsi, il
est impliqué dans la fusion de vésicules et d'endosomes et dans l'assemblage de membranes
nucléaires (Moss et Vaughan, 1995).
L'hypothèse de l'effet d'un facteur cytosolique sur l'activation de la PLD provient d'études en
système acellulaire dans lesquelles le cytosol était nécessaire à l'activation de la PLD par le
GTPγS dans des membranes de neutrophiles ou de cellules HL60 (Olson et al., 1991; Anthès
et al., 1991). L'activation de la PLD par ARF a été décrite par le groupe de Strenweiss et
Cockcroft (Brown et al., 1993; Cockcroft et al., 1994). L'enzyme est stimulée par ARF1,
ARF3, ARF5 et ARF6, c'est à dire toutes les classes d'ARF, et les ARF myristoylés sont plus
efficaces que les ARF non-myristoylés (Brown et al., 1995; Massenburg et al., 1994). Des
études avec une PLD recombinante exprimée dans les cellules Sf9 montrent que l'enzyme est
fortement stimulée par ARF (Hammond et al., 1997). D'autres groupes ont indiqué que
certains facteurs cytosoliques augmentaient nettement l'effet d'ARF sur la PLD, et deux de ces
facteurs ont pu être identifiés : l'un est la PKCα (Singer et al., 1996) et l'autre pourrait être la
calmoduline (Takahashi et al., 1996), mais la nature des autres facteurs reste à déterminer
(Shimooku et al., 1996; Singer et al., 1995). Deux groupes ont cependant identifié une
protéine de 50kDa, dont la structure reste inconnue et on ne sait pas si elle agit sur ARF ou
sur la PLD (Lambeth et al., 1995; Bourgoin et al., 1995).
55
L'activité PLD est élevée dans le Golgi et répond à l'ARF (Liscovitch et Chalifa-Capsi, 1996;
Provost et al., 1996; Ktistakis et al., 1995). De plus, la stimulation peut être inhibée par la
brefeldin A, qui est un inhibiteur de l'ARF. Ainsi, Ktistakis et al.(1996) ont décrit que la PLD
activée par l'ARF devait jouer un rôle important dans la régulation du transport vésiculaire du
Golgi.
Cependant, il existe peu d'expériences qui démontrent un effet de l'ARF sur la régulation de
l'activité PLD in vivo. Dans les cellules HEK qui expriment un récepteur muscarinique M3, la
brefeldin A empêche la stimulation de la PLD induite par le carbachol (Rumenapp et al.,
1995) et dans ces cellules, une perméabilisation provoque une libération d'ARF cytosolique,
qui peut être inhibée par addition de GTPγS durant la perméabilisation ou par un prétraitement
au carbachol, car ces deux traitements induisent une translocation d'ARF vers la membrane.
Enfin, l'activation de cellules HL60 avec le fMLP induit une augmentation de la quantité
d'ARF associé à la membrane et une stimulation de la PLD (Houle et al., 1995). Ces résultats
indiquent donc que la stimulation de la PLD par ces agonistes serait médiée par une
translocation d'ARF à la membrane.
Régulation de la PLD par les protéines Rho.
La famille des protéines Rho régule beaucoup d'activités cellulaires, et en particulier
celles impliquant l'actine du cytosquelette. Le groupe de Bowman et al. (1993) a été le
premier à mettre en évidence un régulation de la PLD par les protéines de la famille Rho. Ces
auteurs ont montré que l'effet activateur du GTPγS sur la PLD dans des membranes de
neutrophiles est inhibé par RhoGDI, une protéine qui empêche la dissociation du GDP des
protéines Rho et bloque ainsi leur activation. Il a ensuite été montré, dans des études utilisant
des membranes de foie de rat, de cellules HL60 ou bien de neutrophiles, que Rho A était la
protéine de la famille Rho la plus active sur la PLD (Malcolm et al., 1994; Siddiqi et al.,
1995; Kwak et al., 1995). De plus Rho A stimule aussi la PLD dans des fractions d'autres
cellules ou dans des préparations d'enzyme partiellement purifiées (Provost et al., 1996;
Balboa et Insel, 1995; Singer et al., 1995; Shimooku et al., 1996; Kuribara et al., 1995). Enfin,
des études avec l'enzyme recombinante exprimée dans les cellules Sf9 indiquent que Rho A
interagit directement avec la PLD, et que d'autres membres de la famille des protéines Rho,
tels que Rac et Cdc42 sont aussi actifs (Hammond et al., 1997). De plus, une combinaison des
trois protéines n'active pas plus la PLD qu'une protéine seule, ce qui suggère qu'elles peuvent
interagir avec la PLD sur le même site. Ce résultat est étonnant car les protéines de la famille
Rho ont des effets cellulaires différents, et leur action similaire sur l'activation de la PLD est
inattendue.
De plus, une combinaison de Rho A et ARF résulte en une activation synergique de la PLD
(Hammond et al., 1997; Singer et al., 1996; Kwak et al., 1995; Ohguchi et al., 1996). Cela
56
suggère la présence de sites actifs séparés mais interagissant entre eux pour l'activation de la
PLD par Rho A et ARF.
Enfin, comme pour l'ARF, certaines études montrent que l'effet de Rho A sur la PLD est
augmenté par des facteurs cytosoliques (Shimooku et al., 1996; Kwak et al., 1995) et par la
PKCα (Hammond et al., 1997; Singer et al., 1996; Kwak et al., 1995; Ohguchi et al., 1996).
Cependant les travaux de Vinggard et al. (1997) montrent qu'après une purification partielle,
la PLD de placenta humain perd sa réponse à Rho A mais conserve son activation par ARF. Il
semble donc que les mécanismes d'activation de la PLD par ARF et Rho A soient différents,
mais cela n'a pas encore été prouvé.
D'autres études ont montré que le traitement de fibroblastes Swiss 3T3 par le Lyso PA ou
l'endothélin-1 provoque une rapide translocation de Rho A du cytosol vers la membrane
(Fleming et al. 1996).
Beaucoup de toxines bactériennes qui inactivent les protéines Rho ont été utilisées pour
montrer l'implication de Rho A dans l'activation de la PLD in vivo. Ainsi, l'exoenzyme C3 de
Clostridium Botulinum qui ADP-ribosyle Rho A bloque l'activation de la PLD induite par le
LysoPA dans les fibroblastes de rat (Malcolm et al., 1996). De la même manière, la toxine B
issue de Clostridium Difficile glucosyle et inactive les protéines Rho, et bloque l'activation dela PLD par le carbachol dans des cellules intactes ou par le GTPγS ou AlF4- dans des cellules
perméabilisées (Schmidt et al., 1996a).
Enfin, certaines études suggèrent un couplage entre l'activation de la voie Raf/MAP-kinase et
l'activation de Rho et Rac1 (Khosravi-Far et al., 1995; Prendergast et al., 1995; Qiu et al.,
1995), mais le mécanisme de ce couplage n'est pas encore bien compris. Grb2, molécule
adaptatrice entre Sos et Ras, pourrait être impliquée dans ce phénomène (Matuoka et al.,
1993)
Cependant, même si ces observations suggèrent fortement que Rho A est impliqué dans la
stimulation de la PLD par différents agonistes, il faut également tenir compte du fait que Rho
A peut également réguler la synthèse de PIP2 par son effet sur la PI-4-P 5-Kinase (Chong et
al., 1994) et que les changements d'activité PLD peuvent être dus à des variations des taux de
PIP2 (Schmidt et al., 1996b).
Régulation de la PLD par le PIP2.
Brown et al.(1993) ont été les premiers à suggérer que la PLD pouvait être stimulée
par le PIP2, et beaucoup d'autres études ont confirmé cet effet du PIP2. En fait, on suppose
que le PIP2 est un co-facteur et qu'il est nécessaire aux effets stimulateurs de la PKC et des
petites protéines G ARF et Rho A sur la PLD (Brown et al., 1993, 1995; Massenburg et al.,
57
1994; Kuribara et al., 1995; Ohguchi et al., 1996).
Dans les cellules U937 perméabilisées, l'activation de la PLD induite par le GTPγS est
potentialisée par MgATP, qui maintient les taux de PIP2 et PIP élevés dans les cellules
(Pertile et al., 1995). De plus, lorsque les taux de PIP2 et de PIP sont diminués par des
inhibiteurs de PI-4-Kinase, on note une diminution de l'activation de la PLD par le GTPγS.
Une inhibition similaire de la PLD est observée avec la néomycine, qui se lie aux
phosphoinositides (Liscovitch et al., 1994). Toutes ces expériences sont donc en faveur d'une
dépendence de l'activité PLD vis à vis du PIP2.
Régulation de la PLD par les tyrosine-kinases solubles.
Des facteurs de croissance dont le récepteur possède un activité tyrosine-kinase
intrinsèque sont capables d'activer la PLD. De même, des récepteurs ne possédant pas
d'activité tyrosine-kinase intrinsèque, mais étant couplés à des protéines tyrosine-kinases
solubles, comme le TCR, peuvent également conduire à l'activation de la PLD (Dinh et
Kennerly, 1991; Stewart et al., 1991). Ainsi, certains travaux montrent une activation de la
PLD dans des cellules transformées par V-Src (Song et al., 1991) et Jiang et al.(1995) ont
montré que Ras était impliqué dans l'activation de la PLD. Enfin, l'augmentation de la
phosphorylation non récepteur-dépendante de protéines sur des résidus tyrosines a été
associée à une activation de PLD (Bourgoin et Grinstein, 1992).
D'autre part, certains auteurs supposent que des tyrosine-kinases peuvent jouer un rôle dans la
stimulation de la PLD par des agonistes couplés à des protéines G. Dubyak et al. (1993) et
Kusner et al. (1993) ont observé que l'ATP augmente de manière importante la stimulation de
l'activité PLD dans les cellules U937 perméabilisées stimulées par le GTPγS. De plus, cet
effet est reproduit par le vanadate, qui est un inhibiteur de protéine tyrosine-phosphatase, ou
bien peut être bloqué par des inhibiteurs de tyrosine-kinases (Martinson et al., 1994; Uings et
al., 1992; Wilkes et al., 1993; Brisco et al., 1995). Cependant, les doses d'inhibiteurs utilisées
dans ces études sont souvent fortes et donc, leur spécificité d'action n'est pas garantie. De
plus, une de ces études montre que l'inhibition de la PLD n'est pas corrélée avec celle des
phosphorylations de tyrosines (Martinson et al., 1994).
De la même manière, l'implication exacte des tyrosine-kinases dans l'activation de la PLD par
Rho A n'est pas encore bien définie, malgré quelques études démontrant ce phénomène
(Nobes et Hall, 1995; Rankin et al., 1994; Ridley et Hall, 1992; Seckl et al., 1995).
III-2. Le rôle physiologique du PA.
Le premier effet reconnu de l'acide phosphatidique (PA) est sa capacité à induire des
flux de calcium, en particulier en tant que ionophore calcique. Par la suite, de nombreux
arguments ont conduit à l'hypothèse d'un rôle de second messager pour le PA (Salmon et
58
Honeyman,1980; Putney et al., 1980). Dans de nombreuses études visant à déterminer les
effets du PA, les auteurs ont examiné l'effet de PA exogène ou de PA produit in situ par une
PLD bactérienne. Ces études ont montré que le PA intervient dans la régulation de la synthèse
d'ADN (Moolenaar et al., 1986; Siegmann, 1987), la production d'Il2 (Cano et al., 1992),
l'induction de l'ARNm de proto-oncogènes et facteurs de croissances (Moolenaar et al., 1986;
Siegmann, 1987; Knauss et al., 1990), l'activation de la NADPH oxydase des neutrophiles
(Perry et al., 1993), la mobilisation du calcium intracellulaire et l'entrée du calcium
extracellulaire (Salmon et Honeyman, 1980; Putney et al., 1980), l'inhibition de la formation
d'AMPc (Murayama et Ui, 1987), la transition de la phase G2 à la mitose dans les cellules
A431 (Kaszkin et al., 1992) et la phosphorylation de diverses protéines cellulaires (Bocckino
et al., 1991; Siddiqui et Yang, 1995). Enfin, le PA exerce probablement un grand nombre
d'effets sur la réponse cellulaire en activant certaines isoformes de PKC (Nishizuka, 1986).
a) Le PA et les flux de calcium.
Le PA peut induire des entrées de calcium dans de nombreux tissus ou cellules,
incluant les plaquettes (Ikeda et al., 1979; Imai et al., 1982), les glandes parotides (Weiss et
al., 1982), les hépatocytes (Barritt et al., 1981; Osugi et al., 1984), les terminaisons nerveuses
(Harris et al., 1981) et l'épithélium (Lee et al., 1989). Putney et al. (1980) ont également
étudié le rôle de ionophore calcique du PA. Cependant, les théories attribuant au PA endogène
un rôle de ionophore calcique ont été réfutées par Holmes et Yoss (1983) qui ont démontré
que les effets du PA sur le transport du calcium dans des liposomes étaient dus à la présence
d'acides gras oxydés contaminants et que du PA fraîchement préparé est inactif.
D'autres études montrent cependant une augmentation parallèle des taux endogènes de PA et
de l'entrée de calcium après stimulation des cellules (Somermeyer et al., 1983). Dans les
neutrophiles, le PA synthétisé dans la membrane après activation d'une PLD serait
responsable des transports de calcium à travers la membrane (English et al., 1991). De même,
Kisel et al. (1984) ont montré que la stimulation des cellules endocrines par des hormones
doit impliquer une augmentation du taux de PA endogène suivie d'une entrée de calcium
extracellulaire. Enfin, Ohata et al. (1990 et 1991) ont suggéré que la production de PA
contribue à la contraction des muscles lisses induite par un agoniste en stimulant l'entrée du
calcium à partir de sources extracellulaires.
D'autres part, plusieurs rapports décrivent un effet du PA sur la mobilisation du
calcium intracellulaire, et en particulier dans la libération du calcium à partir des stocks
intracellulaires.
Moolenaar et al. (1986) ont essayé de corréler l'augmentation du taux de calcium
intracellulaire induite par le PA à son effet mitogénique, apprécié notamment par la synthèse
d'ADN et l'expression de certains proto-oncogènes. Ils ont montré que l'augmentation du
59
calcium intracellulaire ne résultait pas d'une entrée du cation mais de sa libération à partir des
réserves intracellulaires. Ils ont conclu que, contrairement à un ionophore, le PA exerçait son
effet en stimulant d'autres réponses cellulaires, par exemple l'hydrolyse des phosphoinositides,
qui permettaient la formation de seconds messagers libérant le calcium. Par la suite, ces
auteurs ont montré que le lyso-PA était l'élément contaminant responsable des réponses
cellulaires observées (van Corven et al., 1989; Jalink et al., 1990). De plus, le lyso-PA est
maintenant largement décrit lui-même comme un second messager, qui agirait via un
récepteur couplé à une protéine G (Jalink et al., 1994).D'autres études ont cependant montré un effet du PA sur l'hydrolyse du PIP2 et la formation
d'IP3 (Dunlop et Larkins, 1989). Dans des cellules parathyroidiennes (Mac Ghee et Shoback,
1990) et dans des ostéoblastes (Kawase et Suzuki, 1988 et 1990), cet effet est associé à une
augmentation transitoire du calcium libre intracellulaire. Ces réponses, qui résultent
apparement d'une activation de la PLC par le PA, sont associées à une prolifération des
cellules.
Enfin, dans les cellules de Jurkat, Breittmayer et al. (1991) ont décrit un pool intracellulaire de
calcium sélectivement mobilisé par le PA. Ainsi, le PA pourrait activer d'autres voies
responsables d'une mobilisation du calcium d'une manière indépendante de la production
d'IP3.
b) Le PA et les Phospholipases C.
Dans les plaquettes humaines, Jackowski et Rock (1989) ont montré que le PA active
une phosphatidylinositol 4,5-bisphophate Phospholipase C (PI-PLC) associée à la membrane.
Dans cette même étude, les auteurs ont montré que le DAG et les acides gras n'ont pas d'effet
sur la PLC. En plus de son effet direct, le PA potentialise la stimulation de la PLC par l'alpha-
thrombine ou les nucléotides guanyliques. Jones et Carpenter (1993) ont étudié l'activation par
le PA de la PLCγ1 native ou phosphorylée sur des résidus tyrosine et ont montré une fixation
directe du PA sur l'enzyme, l'activation résultant des modifications allostériques induites par
cette fixation. Jacob et al. (1993) ont étudié l'activation par le PA de la PLC de la membrane
plasmique d'oocytes de Xenopus laevis et ont montré que l'activité de cette enzyme était
multipliée par deux en présence de PA. Enfin, dans les cardiomyocytes, le PA se fixe avec
une haute affinité sur la PLCδ1, une isoforme majoritaire dans ces cellules (Henry et al.,
1995). Cette fixation est spécifique du PA et provoque une augmentation de l'activité del'enzyme ex vivo, mesurée par la formation d'IP3.
c) Le PA et les Protéines Kinases C.
Beaucoup d'études se sont interessées à l'effet du PA sur les protéines kinases C. Ainsi,
Epand et Stafford (1990) et Senisterra et al. (1993) ont montré que le PA peut remplacer la
60
phosphatidylsérine pour activer la PKC. Stasek et al. (1993) ont également étudié l'effet du
PA sur la PKC de cellules endothéliales et ont montré que l'activation de l'enzyme n'était pas
due à des contaminations par du DAG, ni à une formation de DAG par la PA-
phosphohydrolase. Leur résultats indiquent que le PA et le DAG activent la PKC par des
mécanismes différents qui doivent être impliqués dans les réponses des cellules à différents
stimuli.
Bocckino et al. (1991) ont identifié une protéine kinase dont l'activité est dépendante du
calcium et activable par le PA dans le coeur, la rate, le cerveau, le poumon et le testicule de
rat. Cette protéine cytosolique phosphoryle des protéines différentes de celles phosphorylées
par la PKC. Kahn et al. (1994) ont aussi décrit une nouvelle PKC, indépendante du calcium et
activée par le PA dans des extraits plaquettaires. Ils ont suggéré que cette enzyme était un
membre de la famille des protéines kinases dépendantes des phospholipides, et qu'elle devait
jouer un rôle très important dans la transmission des effets du PA, et même dans la
mitogenèse.
Plusieurs équipes se sont interessées au problème de la spécificité du PA vis à vis des
différentes isoformes de PKC. Limatola et al. (1994) ont testé les effets du PA sur plusieurs
isoformes de PKC en système acellulaire. Leur étude montre que le PA active trois isoformes
de PKC ( les isoformes α, ε et ζ) quand il est ajouté au cytosol de cellules surexprimant toutes
les formes de PKC. Dans les cellules surexprimant la PKCα, le PA est aussi efficace que le
DAG/PS et induit le même profil de protéines phosphorylées. En absence de calcium, la
PKCζ insensible au DAG est cependant activée par le PA; par contre, l'activation des autres
isoformes dépend du calcium. Ainsi, le PA pourrait être un activateur important de la PKCζ
dans des cellules où le calcium est à son taux basal.
Deux équipes (Senisterra et al., 1993; Henry at al., 1995) ont montré que l'activation de la
PKC et de la PLC par le PA ont les mêmes exigences en ions calcium en fonction du pH,
l'effet du PA sous forme dianionique (pH=7,4) ne nécessitant pas de calcium, alors que la
présence de cations Ca2+ est importante pour une activation maximale lorsque le PA est sous
forme monoanionique. Ainsi, l'activation par le PA de ces deux enzymes pourrait se faire par
un même mécanisme ou impliquer des sites communs.
d) Le PA et la voie MAP-Kinase.
Ghosh et al. (1996) ont récemment décrit que le PA se lie à Raf-1 kinase, une
sérine/thréonine kinase activée dans beaucoup de cellules par des facteurs de croissance. Des
études in vitro ont montré une fixation de haute affinité du PA sur le côté C-terminal (acides
aminés 398 à 423 de la kinase Raf-1 humaine). De plus, cette fixation du PA induit la
translocation de l'enzyme à la membrane. De cette manière, Raf-1 pourrait initier la
61
prolifération cellulaire, en activant MEK, l'enzyme qui catalyse la phosphorylation et
l'activation de la MAP-Kinase.
Siddiqi et Yang (1995) ont montré que l'interleukine 11 induisait la production de PA par la
voie PLD et activait la MAP-Kinase dans les cellules 3T3-L1 de souris. En effet,
l'accumulation de PA induite par un inhibiteur de phosphatidate phosphohydrolase comme le
NaF ou par addition de PA exogène augmente spécifiquement la phosphorylation sur des
tyrosines de deux protéines de 44 et 47 kDa, immunoprécipitables par des anticorps
monoclonaux anti-MAP-Kinase et augmente l'activité MAP-Kinase de ces cellules.
Des études plus anciennes montrent que le PA est capable d'inhiber la protéine GAP (GTPase
Activating Protein) qui active l'hydrolyse du GTP lié à Ras en GDP, ce qui permet le retour à
une forme inactive de Ras (Tsai et al., 1989). D'autre part, cette équipe a montré que le PA
augmente l'activité d'une protéine non-identifiée (GTPase inhibiting protein) qui
contrebalance l'effet de la GAP (Tsai et al., 1990). L'effet combiné du PA sur ces deux
protéines tend à augmenter la durée de vie de la forme active de Ras liée au GTP dans la
cellule, et à prolonger ainsi son activité biologique.
e) Le PA et les kinases lipidiques.
Il a été décrit que le PA pouvait activer la PI-4-phosphate-5-kinase (PI-5-kinase) (Moritz et
al., 1992). Cette enzyme conduisant au PIP2, substrat de la voie PLC, peut donc permettre la
régénération du PIP2 hydrolysé. Cet effet a été observé à la fois avec du PA exogène et avec du PA
généré de manière endogène. Récemment, Jenkins et al. (1994) ont étudié l'influence du PA sur des
isoformes particulières de PI-5-kinase. Ils ont montré que le PA stimule aussi bien l'activité de la PI-
5-kinase de type I purifiée à partir de membranes d'érythrocytes que celle de deux isoformes
immunoréactives de type I de cerveau de rat. Dans les mêmes conditions, le PA a peu d'effet sur
l'isoforme de type II.
Par contre, le PA inhibe la PI-3-kinase, qui conduit à la formation de phosphoinositides phosphorylés
en position 3 du cycle inositol, notamment le PI-3,4,5-P3, avec un IC50 de 10 à 20 µM (Lauener et
al., 1995). Ils supposent qu'il pourrait exister un mécanisme de régulation croisée entre la voie PLD
produisant le PA et la voie de la PI-3-kinase. Ainsi, la cytotoxicité de certains lipides pourrait être due
à leur coupure par une PLD, conduisant à la formation de PA suivie de l'inhibition de la PI-3-Kinase.
f) Le PA et la NADPH oxydase des neutrophiles.
Au cours d'une infection ou d'une inflammation, les cellules phagocytaires comme les
neutrophiles engendrent une explosion respiratoire (respiratory burst) résultant en la production de
dérivés oxygénés (anion superoxyde O2-) toxiques pour les agents infectieux. L'enzyme responsable
62
de cette activité est la NADPH oxydase. Cette enzyme est inactive dans les cellules à l'état basal, mais
elle est essentielle pour une défense adéquate. Son absence ou son défaut d'activation dans certaines
maladies chroniques peut conduire les patients à de sévères infections traitées à vie.
Son mécanisme d'activation a été très étudié et les résultats montrent qu'il s'agit d'un processus
dynamique qui résulte de l'interaction de plusieurs composés cytosoliques avec l'enzyme inactive liée
à la membrane. Cette interaction pourrait être induite par le PA. Bellavite et al. (1988) ont montré que
le PA pouvait remplacer à la fois les acides gras et le cytosol pour stimuler l'enzyme dans des
membranes de neutrophiles de porc. Agwu et al. (1991) ont démontré que le PA était un réel, mais
faible, activateur de la NADPH oxydase de neutrophiles humains quand il était apporté avec le
cytosol. Des études plus récentes du groupe de McPhail ont décrit que cette propriété était largement
augmentée en présence de faibles concentrations de diglycérides (Qualliotine-Mann et al., 1993;
McPhail et al., 1995; Waite et al., 1997). Ainsi, le PA généré par activation de la PLD au cours de la
stimulation des neutrophiles, en présence de DAG généré par la PA-phosphatase, doit jouer un rôle
important dans la stimulation de la NADPH oxydase cellulaire. Ces auteurs ont montré que
l'activation induite par le PA en présence de DAG met probablement en jeu des activités protéines
kinases. Ainsi, une protéine kinase stimulée par le PA serait impliquée dans l'activation de la NADPH
oxydase en système acellulaire. Cette protéine kinase aurait une masse de 125kDa et serait différente
des protéines kinases activées par les acides gras (protine kinase N), de la PKC, de la protéine kinase
activée par p21 et enfin des MAP-kinases. Elle phosphoryle un certain nombre de protéines
cellulaires, et en particulier p47-phox, une phosphoprotéine faisant partie du complexe de la NADPH
oxydase. En effet, la phosphorylation de p47-phox précède l'activation de la NADPH oxydase et est
nettement réduite par des inhibiteurs de protéines kinases.
Un autre composé cytosolique semble être impliqué dans l'activation de la NADPH oxydase. Il s'agit
de la petite protéine G, Rac2 (Knaus et al., 1991). Cette protéine est active sous sa forme liée au GTP
et dans les neutrophiles au repos, elle reste exclusivement dans le cytosol où elle forme un complexe
avec la protéine GDI (GDP dissociation inhibitor) (Chuang et al., 1993). Quand les cellules sont
activées, le complexe est détruit, ce qui permet à Rac2 d'être transloquée à la membrane et de
participer à l'activation de la NADPH oxydase. Comme l'acide arachidonique, le PA est capable de
détruire le complexe Rac-GDI, ce qui pourrait expliquer son rôle dans l'activation de la NADPH
oxydase. Cependant, d'autres études seront nécessaires pour confirmer cette hypothèse, d'autant plus
que la signification physiologique de l'activation de cette enzyme par le PA en comparaison avec
d'autres stimuli n'est pas très claire. Malgré tout, si la dissociation du complexe Rac-GDI par le PA
est vraiment impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase, alors peut-être que ce type de
mécanisme pourrait expliquer les effets de second messager du PA dans d'autres systèmes.
g) Le PA et la prolifération induite par des facteurs de croissance.
63
Le PA apporté de manière exogène peut exercer un effet mitogénique dans différents types de
cellules, en particulier les fibroblastes (Siegmann, 1987; Pearce et al., 1994; Krabak et Hui, 1991;
Knauss et al., 1990; Wood et al., 1993; Bashir et al., 1992). Les effets du PA exogène ont attribués
par certains auteurs au lyso-PA contaminant les PA commerciaux. Cependant, le PA endogène a été
impliqué dans la réponse proliférative à certains agonistes, tel que l'EGF (Kaszkin et al., 1992), le
PDGF (Knauss et al., 1990; Fukami et Takenawa, 1992), l'interleukine 2 (Cano et al., 1992; Merida et
al., 1993), l'interleukine 1 (Bursten et Harris, 1994; Bursten et al., 1994) et l'interleukine 11 (Siddiqi
et Yang, 1995). De plus, le PA transmet apparemment les effets mitogéniques de la sphingosine et de
la sphingosine-1-phosphate (Spiegel, 1993; Zhang et al., 1990).
Des travaux de notre équipe ont montré que la lectine mitogénique Concanavaline A (Con A)
induisait dans les thymocytes de rat une augmentation des taux de PA qui précédait la prolifération
(Marcoz et al., 1993a). Notre équipe a aussi montré que le PA active in vitro une enzyme qui dégrade
spécifiquement l'AMPc (PDE 4) purifiée par HPLC à partir de thymocytes de rats (Savany et al.,
1996). Cette activation de la PDE4 augmente la Vmax de l'enzyme sans affecter son Km (Marcoz et
al., 1993a). Némoz et al. (1996) ont montré une activation par le PA des isoformes recombinantes de
PDE4 obtenues par transfection de cellules d'insectes ou de mammifères. En outre, ces études
montrent que le PA stimule uniquement l'activité des isoformes ayant une extrémité N-terminale
longue (partie régulatrice de l'enzyme). Outre cette particularité vis à vis des isoformes de PDE,
l'activation par le PA semble dépendre également de la composition en acides gras des espèces
moléculaires de PA (El Bawab et al., 1997). De plus, nous avons également pu établir dans des
cellules mononuclées humaines une corrélation entre la production de PA et l'activation des PDE par
différents agonistes (présent travail). Une activation de la PDE AMPc-spécifique a également été
observée par un autre groupe (Di Santo et al., 1995).
D'autres études ont montré une inhibition par le PA de l'accumulation de l'AMPc induite par la PGE1
dans des fibroblastes WI38 (Proll et al., 1985), par la PGE2 ou la forskoline dans les fibroblastes 3T3
(Wang et al., 1994), en inhibant l'adénylyl cyclase. Murayama et Ui (1987) ont montré que seuls les
PA contenant des acides gras insaturés étaient capables d'inhiber cette enzyme dans les fibroblastes
3T3. Par contre, l'effet inhibiteur du PA n'étant pas retrouvé dans les plaquettes, ces auteurs ont
proposé l'hypothèse d'une spécificité cellulaire pour l'inhibition de l'adénylyl cyclase par le PA.
La diminution des taux d'AMPc qui résulte de l'effet du PA sur ces enzymes pourrait être un des
éléments permettant un déroulement optimal de la réponse proliférative.
Siddiqi et Yang (1995) ont associé la prolifération induite par les facteurs de croissance à une
activation de la MAP-Kinase dépendante du PA, par un mécanisme qui résulterait de l'induction de la
tyrosine kinase, MEK. Dans ce système, le lyso-PA est sans effet. Ainsi, une tyrosine kinase
dépendant des phospholipides pourrait médier certains des effets de second messager du PA.
Cependant, aucune tyrosine kinase dépendante du PA n'a jamais été identifiée en système acellulaire,
64
et le PA pourrait exercer son influence en un autre point de la transduction du signal. Par exemple,
l'activation de la MAP-Kinase pourrait résulter de l'activation de Raf1 par le PA.
Enfin, le récepteur de l'EGF est autophosphorylé sous sa forme active, et il est connu que sa
déphosphorylation par des protéines tyrosine phosphatases permet une régulation négative de ses
fonctions. Tomic et al. (1995) ont montré qu'un traitement des cellules A431 par le PA induit une
activité de déphosphorylation et diminue ainsi les phosphorylations du récepteur de l'EGF. Cet effet
serait du à une interaction du PA avec les protéines tyrosines phosphatases, qui les ferait passer d'un
état inactivé à un état activé, en libérant leur domaine SH2.
h) Existe-t-il un récepteur pour le PA?
Il est possible que certaines réponses induite par le PA résultent de sa liaison à un récepteur.
Plusieurs groupes se sont intéressés à cette possibilité, mais aucun n'a pu montrer réellement une
liaison spécifique du PA aux membranes cellulaires. Par exemple, Murayama et Ui (1987) ont conclu
que des recepteurs membranaires étaient impliqués dans l'inhibition de l'adénylyl cyclase et
l'hydrolyse de phospholipides induites par le PA dans les fibroblastes. Cette hypothèse était étayée
par le fait qu'un prétraitement des cellules avec la toxine cholérique ou la toxine pertussique inhibait
les effets du PA, ce qui indiquait que l'activation était induite par la liaison du PA à un récepteur
couplé à un protéine G.
Pearce et al. (1994) ont suggéré que l'hydrolyse des phosphoinositides et la mitogénèse induites par le
PA dans les astrocytes découleraient de liaison du PA à un récepteur spécifique. D'autres auteurs
pensent que la polymérisation des filaments d'actine dans les fibroblastes pourrait résulter d'une
fixation spécifique du PA sur son récepteur (Ha et Exton, 1993). De plus, Ryder et al. (1993) ont
observé que le turnover des phosphoinositides stimulé par le PA est inhibé par un prétraitement des
cellules avec la toxine pertussique, ce qui est en faveur de l'hypothèse d'une réponse transmise par un
récepteur couplé à une protéine G.
Dans une autre étude, il a été montré qu'à la fois le dioléoyl-PA et le lyso-PA pouvaient induire des
dépolarisations dépendantes du calcium dans les oocytes de Xenopus laevi (Ferguson et Hanley,
1992). De telles réponses n'ont pas pu être obtenues par injection intracellulaire de l'agoniste, ce qui
indique l'intervention d'un récepteur à la surface des cellules. De plus, les réponses des oocytes au PA
se font de la même manière que celles induites par l'activation de récepteurs couplés à des protéines G
pour l'hydrolyse des phosphoinositides. Ces auteurs emettent l'hypothèse que ces cellules doivent
communiquer entre elles par l'activation de récepteurs du PA. Des études supplémentaires sont
nécessaires pour déterminer l'importance de ce système agoniste-récepteur dans d'autres types
cellulaires.
65
Familles de PDE Substrat(s) Modulateursintracellulaires
Inhibiteurs
PDE1 AMPc et GMPc Ca2+/CaMPhosphorylation
IBMX
PDE2 AMPc et GMPc GMPc (+) EHNA
PDE3 AMPc et GMPc GMPc (-)Phosphorylation
FenoximoneMilrinone
PDE4 AMPc PhosphorylationAMPc
RO 20-1724Rolipram
PDE5 GMPc Phosphorylation ZaprinastDipyridamole
PDE6 GMPc Transducine --
PDE7 AMPc ? ?
Tableau 1 : Familles de PDE, spécificité du substrat et des inhibiteurs, régulations.
66
IV- Les phosphodiestérases des nucléotides cycliques (PDEs).
L'AMPc et le GMPc sont des seconds messagers intracellulaires importants,
responsables de réponses biologiques générées par un grand nombre de signaux
extracellulaires. Les concentrations cellulaires de ces nucléotides cycliques sont déterminées
par un équilibre entre leur synthèse et leur dégradation. La régulation de la synthèse des
nucléotides cycliques par les adénylyl et guanylyl cyclases est bien connue maintenant, et la
plupart des étapes de ce mécanisme ont été élucidées. Par contre, le rôle de la dégradation des
nucléotides cycliques par les phosphodiestérases (PDEs) au cours de la stimulation est
nettement moins compris.
Peu de temps après la découverte et la caractérisation de l'AMPc, une PDE supposée ubiquitaire a été
partiellement purifiée par Butcher et Sutherland (1962). Dans les années 1970, la diversité des PDEs a
été reconnue quand Thomson et Appleman (1971) ont séparé et partiellement purifié dans des tissus
variés, différents types de PDEs, ayant des affinités variables pour le GMPc et l'AMPc, ainsi que des
propriétés physiologiques différentes. Depuis, les résultats d'isolement, purification et séquençages
directs de PDEs, ainsi que les techniques de clonage moléculaire ont permis de démontrer clairement
que les PDEs formaient un groupe de plusieurs isoformes appartenant à sept familles distinctes
(Tableau 1). Les sept familles (PDE1 à PDE7) diffèrent par leur séquence primaire d'acides aminés,
leur affinité pour le GMPc et l'AMPc, leur réponse à différents effecteurs, leur sensibilité à des
inhibiteurs spécifiques et leur mécanisme de régulation biologique (Tableau 1). Des études de clonage
moléculaire ont révélé qu'un même gène pouvait conduire à plusieurs isoformes par usage de
promoteurs différents ou par épissage variable des ARNm.
Toutes les PDEs de mammifères présentent une structure commune : un domaine conservé d'environ
270 acides aminés (25 à 40% d'homologie entre les différentes familles et 70-80% dans une même
famille) en général dans la région C-terminale et des régions N-terminales divergentes (Figure 14)
(Charbonneau, 1990).
Diverses études ont permis de montrer que le domaine conservé de la partie C-terminale correspond
au domaine catalytique (Stroop et al., 1989; Stroop et Beavo, 1992; Novack et al., 1991; Meacci et
al., 1992; Jin et al., 1992). Il contient d'une part des éléments spécifiques à chaque famille, qui
déterminent leur affinité pour les substrats ou leur sensibilité aux inhibiteurs, et d'autre part des
éléments de structure communs, en particulier deux séquences consensus de liaison au Zinc riches en
histidines (Francis et al., 1994).
La région N-terminale contient des séquences qui interviennent probablement dans la régulation
particulière de chaque famille de PDE. Ainsi, dans la famille des PDE de type 1, cette région contient
les sites de liaison du complexe Ca2+/CaM et les sites de phosphorylation par une kinase dépendante
de la CaM ou une kinase A. Dans la famille des PDE de type 2, elle
67
H2N COOH
Domaine régulateur Domaine catalytique
Ca2+/CaM GMPc
AMPc et /ou GMPc
Figure 14 : Structure générale des PDEs.
68
comprend le site non-catalytique de liaison du GMPc alors que dans la famille des PDE de
type 3, des domaines hydrophobes de liaison à la membrane ou des sites de phosphorylation
par des kinases sensibles à l'insuline ou des kinases A ont été décrits dans cette région. Des
sites de phosphorylation par des kinases A ont également été trouvés dans cette région dans la
famille des PDE de type 4. Enfin, dans les familles de PDE des types 5 et 6, cette région N-
terminale contient des sites non catalytiques de liaison du GMPc et des sites de
phosphorylation par des kinases G.
IV-1. Les différentes familles de PDE.
a) La PDE de type 1 stimulée par le complexe Calcium/calmoduline (Ca2+/CaM).
Les PDEs de la famille 1 comprennent au moins quatre sous-familles différentes qui
peuvent être activées par le complexe Ca2+/CaM et inhibées par phosphorylation. La plupart
des isoformes ont plus d'affinité pour le GMPc que pour l'AMPc.
Trois gènes de PDE1 sont connus : les gènes A (avec deux variants 1A1 et 1A2), B (un seul
variant) et C (avec cinq variants PDE1C1 à PDE1C5). La PDE1B a la même affinité pour le
complexe Ca2+/CaM que la PDE1A2. L'isoforme B peut être phosphorylée par une protéine
kinase dépendante de la CaM, alors que la PDE1A est substrat de la PKA. La PDE1A1
(59kDa) trouvée dans le coeur de boeuf et la PDE1A2 (61kDa) trouvée dans le cerveau de
boeuf, ont la même séquence primaire, sauf pour les 18 acides aminés N-terminaux. Cette
différence affecte beaucoup la capacité des isoformes à être activées par le calcium. En effet,
la PDE1A1 a une affinité 10 fois plus élevée que la PDE1A2 pour le calcium (Novack et al.,
1991).
Récemment, des expériences de délétions sur l'ADNc de la PDE1A2 ont permis de démontrer
l'existence de deux sites de liaison à la calmoduline séparés par 90 acides aminés (Sonnenburg
et al., 1995). Ces expériences ont également révélé l'existence d'une région inhibitrice située
entre les deux domaines de liaison à la CaM et qui fonctionne en absence de Ca2+ et de CaM.
Récemment, deux rapports sont parus au sujet du clonage et de la caractérisation de la
PDE1C. Deux formes humaines (1C1 et 1C3) avec des extrémités C-terminales différentes
ont été isolées (Loughney et al., 1996). Le gène complet de la PDE1C1 code pour une
protéine de 709 acides aminés et celui de la PDE1C3 pour une protéine de 634 acides aminés.
Une forte expression de ces isoformes est retrouvée dans le cerveau et le coeur humain. Une
protéine tronquée qui commence à la Met-150 de la PDE1C3 a été exprimée dans des levures
et a été caractérisée.
Un autre variant du gène C , le variant PDE1C2 a été cloné à partir d'épithélium olfactif de rat
(Yan et al., 1995). Les paramètres cinétiques de cette isoforme sont proches de ceux des
autres PDE1C qui ont un Km d'environ 1 µM. L'ARNm codant pour cette protéine est
fortement exprimé dans les tissus olfactifs, et il n'a pas été détecté dans les autres tissus testés.
69
Une forte expression de cette isoforme semble donc nécessaire à la signalisation olfactive.
Enfin, d'autres variants de PDE1C, les PDE1C1, 1C4 et 1C5 ont été identifiés dans les tissus
de souris. Ils ont les mêmes propriétés cinétiques, mais répondent différemment à la
stimulation par le Ca2+ (Yan et al., 1996).
Il est important de noter que les variants de PDE1C sont différents des autres PDE1 au point
de vue cinétique. En effet, ils ont une forte affinité à la fois pour l'AMPc et le GMPc, alors
que les PDE1A et PDE1B hydrolysent préférentiellement le GMPc à des concentrations
physiologiques. Cette propriété pourrait permettre la détection de nouvelles isoformes de
PDE1C dans d'autres tissus.
b) La PDE de type 2 stimulée par le GMPc.
A présent, deux isoformes de PDE stimulées par le GMPc et issues d'un même gène
ont été décrites (PDE2A1 et PDE2A2) (Yang et al., 1994). Cette enzyme est présente à la fois
sous forme soluble et sous forme liée à la membrane, et les proprités cinétiques des deux
formes sont vraiment similaires. La région N terminale de ces enzymes contient un site
allostérique de liaison du GMPc, qui peut donc agir comme un effecteur. Ainsi, les deux
isoformes peuvent hydrolyser l'AMPc et le GMPc avec des cinétiques coopératives, et le
GMPc augmente l'hydrolyse de l'AMPc. Le rôle physiologique des PDE2 est donc, en
présence d'un taux élevé de GMPc, de diminuer le taux d'AMPc. Il est possible que de
nouvelles formes de PDE2 soient trouvées.
Un seul inhibiteur spécifique de la PDE2 a été décrit : il s'agit de l'érythro-9-(2-hydroxy-3-
nonyl)adénine (EHNA). Des travaux récents commentent les effets physiologiques de cet
inhibiteur. Ainsi, il est connu que l'AMPc stimule l'entrée de calcium dans les cardiomyocytes
de grenouille. Le GMPc, qui active la PDE2 dans ce type cellulaire, a un effet inhibiteur surles flux de calcium stimulés par l'AMPc. L'EHNA, avec une IC50 de 3 µM, inverse cet effet
inhibiteur du GMPc. Cette dose correspond à l'inhibition spécifique de la PDE2 dans ces
préparations (Mery et al., 1995).
c) La PDE de type 3 inhibée par le GMPc.
La PDE3 a une forte affinité (Km inférieur au µM) à la fois pour l'AMPc et le GMPc,
mais la Vmax d'hydrolyse de l'AMPc est très supérieure à celle d'hydrolyse du GMPc. De
plus, de faibles concentrations de GMPc peuvent inhiber l'hydrolyse de l'AMPc par cette
enzyme. Deux gènes A et B ont été clonés à partir de banques d'ADNc de tissu adipeux de rat
et de coeur humain ( Meacci et al., 1992; Taira et al., 1993). La PDE3A et la PDE3B
possèdent la même extrémité C-terminale mais diffèrent par leur région N-terminale. Le
domaine N-terminal paraît être hydrophobe et serait responsable de l'association de l'enzyme
70
avec la membrane. Enfin, l'activité de ces isoformes peut être régulée par phosphorylation-
déphosphorylation.
Un autre ADNc codant pour une protéine de 658 acides aminés a été isolé récemment d'une
banque d'ADNc de placenta humain (Kasuya et al., 1995). Ainsi, en plus du transcrit de 7,5 kb
du tissu cardiaque humain, un transcrit de 4,4 kb a été identifié dans le placenta humain et les
cellules HeLa. Ce nouveau transcrit pourrait être le résultat d'une transcription à partir d'un
promoteur différent.
L'existence de promoteurs différents et les mécanismes d'épissage variable conduisent à des
protéines différentes exprimées de façon spécifique en fonction du tissu ou de la cellule. Une
expression différente des gènes A et B a été montrée par hybrydation in situ au cours du
développement embryonnaire et postnatal du rat (Reinhardt et al., 1995). En effet, la PDE3B
est fortement exprimée dans les adipocytes durant l'embryogénèse et dans les spermatocytes
chez le rat adulte et peu exprimée dans le foie au cours du développement. L'ARNm de la
PDE3A est abondant dans le muscle lisse et le muscle cardiaque. Il est détecté dans le
myocarde dès le début de la différenciation des myocytes et durant tout le stade adulte.
Contrairement à la PDE2, cette famille compte beaucoup d'inhibiteurs spécifiques
(Manganiello et al., 1995), tels que la milrinone et l'enoximone, qui peuvent stimuler la
contractilité du myocarde et relaxer le muscle lisse vasculaire. Le fait que les différents
variants de PDE3 aient un profil d'expression différent pourrait rendre plus facile l'étude de
l'effet physiologique de chaque isozyme.
d) La PDE de type 4 spécifique de l'AMPC.
Les enzymes de cette famille ont une très haute affinité pour l'AMPc et pratiquement
aucune activité avec le GMPc comme substrat. Une caractéristique commune à toutes les
isoformes de cette famille est leur sensibilité à l'inhibition par le Rolipram. Quatre gènes
différents de PDE4 (PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D) ont été identifiés dans des tissus de
rat (Colicelli et al., 1989; Swinnen et al., 1989a et 1989b; Davis et al., 1989), puis la présence
de quatre gènes a également été confirmée chez l'homme (Bolger et al., 1993). Les techniques
de biologie moléculaire ont montré une homologie presque parfaite entre des isoformes de
PDE humaine et de rat (98,2% d'homologie entre la PDE4D3 humaine et celle de rat),
indiquant une grande conservation des gènes de PDE au cours de l'évolution et le rôle crucial
de ces enzymes dans la cellule. Enfin, chacun de ces gènes code pour plusieurs transcrits, ce
qui rend la famille des PDE4 particulièrement complexe.
La diversité de structure des différentes isoformes de cette famille se situe au niveau N-
terminal. Elles se répartissent en 2 groupes : le premier correspondant à des variants longs
possède une séquence peptidique complète du côté N-terminal, alors que le deuxième groupe
71
correspondant à des variants courts possède une séquence tronquée du coté N-terminal.
La première enzyme de cette famille à avoir été clonée est la PDE4A1 (Davis et al., 1989).
L'enzyme recombinante ou l'enzyme native (79 kDa) de cervelet sont toutes les deux liées à la
membrane et on pense qu'elles contiennent une région parmi les 25 acides aminés N-
terminaux qui serait responsable de l'association à la membrane. Un autre clone de taille plus
importante, la PDE4A5 (109 kDa) a été identifiée et caractérisée dans le cerveau (McPhee et
al., 1995). Cette isoforme a un domaine N-terminal unique de 256 acides aminés. De telles
différences dans la région N-terminale, qui résultent de l'épissage variable d'un même gène
induisent des changements importants dans la localisation subcellulaire. La PDE4A1 est
trouvée exclusivement dans les fractions particulaires, alors que la PDE4A5 est détectée dans
les fractions cytosoliques et membranaires de cerveau. Ni des fortes concentrations salines, ni
des détergents tels que le triton X-100 ne sont capables de détacher l'enzyme de la membrane.
La PDE4A1 et la PDE4A5 sont trouvées dans des parties différentes du cerveau de rat : les
deux sont fortement exprimées dans le cortex, l'hypothalamus et le striatum. Par contre, on ne
trouve pas de PDE4A5 dans le cervelet alors que des faibles quantités de PDE4A1 peuvent y
être détectées.
Récemment, une nouveau transcrit provenant d'un ARNm ayant subi un autre épissage et issu
d'un locus de PDE4A de rat a été identifié et nommé PDE4A8 (Bolger et al., 1996). La
structure de cette isoforme est différente de celle de la PDE4A1 ou de la PDE4A5 à cause
d'une variation d'épissage à son extrémité 5'. Quand elle est exprimée dans les cellules COS,
cette protéine de 763 acides aminés est présente aussi bien dans le cytosol que dans les
membranes, ce qui ressemble à la distribution cellulaire de la PDE4A5. De plus, la PDE4A8 a
une autre propriété en commun avec la PDE4A5 : toutes les deux ont une Vmax qui est 3 à 5
fois plus faible que celle de la PDE4A1. Cependant, la PDE4A8 a un profil d'expression
unique, puisqu'elle est retrouvée dans les testicules et pas du tout dans les tissus où les
PDE4A1 et PDE4A5 sont exprimées.
L'identification des isoformes de PDE4 exprimées dans certains types de cellules a permis
d'étudier les différences fonctionnelles entre les membres de cette famille. L'expression
simultanée des quatre gènes de PDE4 a été démontrée par hybridation in situ dans les
testicules de rat (Morena et al., 1995). Les PDE4A et 4C sont trouvées préferentiellement
dans les cellules germinales aux stades méiotique et post-méoitique de la différentiation, alors
que les PDE4B et 4D sont trouvées surtout dans les cellules de Sertoli. Il a été montré que le
taux de PDE4D variait selon les différentes sections des tubes séminifères. De telles
fluctuations de la PDE4D dans les tubes séminifères correspondent probablement à des
fluctuations dans la réponse à la FSH des cellules de Sertoli. Cependant, la signification
72
fonctionnelle de l'expression différentielle des gènes de PDE4 reste à déterminer.
e) La PDE de type 5 spécifique du GMPc.
La PDE5 a une grande affinité pour le GMPc comparativement à son affinité pour
l'AMPc, et possède des sites non catalytiques de liaison du GMPc. Cette enzyme est fortement
exprimée dans les tissus pulmonaires, le muscle lisse vasculaire et les plaquettes. Cependant,
malgré le fait qu'une activité PDE5 soit retrouvée dans un grand nombre de tissus, une seule
isoforme, la PDE5A, a été isolée et clonée (McAllister-Lucas et al., 1993). La séquence de la
région catalytique ressemble davantage à celle de la PDE des photorécepteurs (PDE6) qu'à
celle des autres PDEs. La partie N-terminale contient deux domaines répétitifs, qui ont une
séquence d'acides aminés comparable à celle des domaines non catalytiques de liaison du
GMPc présents dans les PDE2 et PDE6. Des études sur la cinétique de dissociation du GMPc
de ces sites de fixation suggèrent qu'il existe probablement plus d'un site de liaison du GMPc.
Plus récemment, deux sites de liaison du GMPc ont été localisés dans un région conservée
proche de l'extrémité N-terminale (McAllister-Lucas et al., 1995). Par des analyses de
mutation ponctuelle, il a été déterminé que les résidus acide aspartique sont importants dans
chacun des deux sites.
f) La PDE de type 6 des photorécepteurs spécifique du GMPc.
Le rôle fonctionnel des PDEs des photorécepteurs dans la phototransduction est
maintenant bien établi : la PDE6 est un effecteur critique dans le processus de
phototransduction, comparable à l'adénylyl cyclase dans la transduction du signal induite par
un récepteur. La PDE des batonnets est un tetramère (αβγ2), qui contient deux sous-unités
catalytiques (αβ) et deux sous-unités inhibitrices (γ). Cette enzyme est maintenue à l'état
inactivé (dans le noir) par l'interaction entre les sous-unités inhibitrices γ et les sous-unités
catalytiques αβ. La PDE des cônes est un homodimère de deux sous-unités identiques α'
(PDE6C) (Li et al., 1990). Récemment, un ADNc humain codant pour la sous-unité α' des
cônes a été isolé (Viczian et al., 1995). Une identité de séquence de 89 et 78% a été montrée
entre la PDE de cônes humaine et les PDEs de cônes de boeuf et de poulet, respectivement.
g) La PDE de type 7 spécifique de l'AMPc et insensible au rolipram.
Cette enzyme (PDE7A1) a d'abord été clonée à partir d'une banque d'ADNc humain, et
plus tard la présence de formes natives a été détectée dans plusieurs tissus et en particulier
dans le muscle squelettique (Michaeli et al., 1993). Une PDE7 recombinante montre une très
forte affinité pour l'AMPc (environ 0,2 µM), mais n'est pas inhibée par les inhibiteurs de
73
PDE4 (tel que le rolipram) ou le GMPc ou les inhibiteurs de PDE3 comme la milrinone.
IV-2 Les PDEs dans les cellules lymphoïdes.
En 1972 déjà, Lagarde et Colobert avaient détecté une activité phosphodiestérasique
dans des lymphocytes de sang périphérique humain et avaient étudié les propriétés cinétiques
et l'affinité pour les substrats de ces PDEs.
Une forte activité PDE est généralement associée à une croissance rapide dans des lignées de
cellules lymphoïdes humaines ou dans des cellules leucémiques (Epstein et al., 1977;
Thompson et al., 1976; Epstein et Hachisu, 1984). L'équipe d'Epstein a également montré que
l'activitée PDE lymphocytaire est augmentée de 5 à 10 après 24-48H de stimulation avec la
phytohémagglutinine (PHA). Takemoto et al. (1979) ont montré que la prolifération de
lymphocytes humains de sang périphérique en réponse à la Con A est associée à un
changement d'activité AMPc-PDE, qui devient plus active et moins sensible à l'inhibition par
le GMPc. Ce processus d'induction semble recquérir une élévation du GMPc, mais ce GMPc
agirait probablement sur les étapes précoces de la synthèse protéique plutôt qu'à travers une
interaction directe avec l'enzyme. En outre, l'augmentation de l'activité PDE suit en parallèle
l'augmentation d'incorporation de thymidine tritiée, et les doses optimales pour la hausse
d'activité PDE sont aussi optimales pour l'incorporation de thymidine tritiée. De plus, le
cycloheximide empêche l'élévation de l'activité PDE et l'incorporation de thymidine tritiée, ce
qui prouve qu'une synthèse protéique de novo est nécessaire à la hausse d'activité PDE
observée.
Inversement, en cas de réponse immunitaire diminuée, l'activité PDE est faible. Ainsi, d'après
des résultats de notre équipe, les cellules mononucléées de patients atteints de sarcoïdose
possèdent une activité PDE réduite de moitié par rapport à celle des cellules de témoins sains
(Némoz et al., 1993). Meskini et al. (1990) ont trouvé une activité PDE significativement
diminuée dans les PBMC de personnes âgées par rapport à des cellules de témoins jeunes.
Cette observation peut être liée au déclin des défenses immunitaires qui accompagne le
vieillissement.
Dans les lymphocytes, toutes les familles de PDE ne sont pas représentées.
En effet, la PDE1 n'existe pas dans les cellules T normales au repos (Epstein et al., 1987;
Valette et al., 1990, Marcoz et al., 1993 a et b; Robicsek et al., 1989 et 1991). Cependant,
certains auteurs ont montré une activité PDE de type 1, la PDE1B1, dans des lignées
leucémiques et pensent que cette enzyme serait impliquée dans l'apoptose (Jiang et al., 1996).
Les données de la littérature concernant la présence de PDE2 dans les lymphocytes sont
74
contradictoires. Epstein et al. (1977), Azhaeva et al. (1987) et Robicsek et al. (1989) n'ont pas
mis en évidence de forme stimulable par le GMPc dans des lymphocytes purifiés et
fractionnés. De nombreux travaux antérieurs ont pourtant identifié cette isoforme dant des
thymocytes de rat (Francks et Macmanus, 1971) et dans des lymphocytes humains (Hait et
Weiss, 1979). Notre équipe a montré l'existence de cette forme de PDE GMPc-stimulable
dans les thymocytes de rat (Valette et al., 1990; Marcoz et al., 1993b), mais pas dans les
PBMC (Meskini, 1992). Récemment, Michie et al. (1996) ont décrit qu'en présence de faible
concentrations de GMPc (10 µM), l'activité PDE2 constitue la majorité de l'activité PDE de
thymocytes murins (environ 80%).
Les autres familles de PDEs ont été décrites dans les cellules lymphoïdes.
La PDE3 a été identifiée par plusieurs équipes dans des lymphocytes de sang périphérique
humain (Takemoto et al., 1978 et 1979; Epstein et Hachisu, 1984; Robicsek et al., 1991;
Ichimura et Kase, 1993; Tenor et al., 1995). Notre équipe a montré l'existence de cette forme
dans le coeur de rat (Dubois et al., 1990), les thymocytes de rat (Valette et al., 1990, Marcoz
et al., 1993 a et b) et les lymphocytes humains (Meskini, 1992). Marcoz et al. (1993 b) ont
montré que l'association d'un inhibiteur de PDE3 comme la milrinone et d'un inhibiteur de
PDE4 comme le rolipram ont un effet synergique sur l'accumulation d'AMPc et sur
l'inhibition de la prolifération de thymocytes de rat. Des résultats similaires ont également été
obtenus avec l'association d'inhibiteurs de PDE4 et de PDE5 comme le M&B22948. En
inhibant la PDE5, le M&B22948 induit une augmentation du taux de GMPc intracellulaire qui
en retour inhibe l'hydrolyse de l'AMPc par la PDE3. D'autre part, Ichimura et Kase (1993) ont
identifié une nouvelle isozyme de PDE dans les cellules T et plus récemment, d'autres auteurs
ont montré que cette nouvelle isoforme est probablement la PDE7A1 (Bloom et Beavo, 1996).
Enfin, Giembycz et al. (1996) ont montré que la fraction particulaire de lymphocytes CD4+ et
CD8+ contient majoritairement de la PDE3, alors que la fraction cytosolique est plus riche en
PDE4 (65%) et contient également de la PDE7. Les isoformes de PDE4 présentes dans les
lymphocytes T de sang périphérique humain ont été analysées (Némoz et al., 1996). En
utilisant un anticorps anti-PDE4, ces auteurs ont montré que la PDE4A5 est l'isoforme
majoritaire exprimée dans ces cellules. Lorsqu'un anticorps sélectif, anti-PDE4D est utilisé,
deux isoformes, la PDE4D1 et la PDE4D2 sont détectées. Par contre, bien que l'ARNm de la
PDE4D3 soit exprimé dans ces cellules, la protéine correspondante n'est pas détectable.
IV-3 Rôle des acides gras sur l'activité PDE.
En 1983, Coquil avait observé une inhibition de la PDE5 du poumon de rat et une
stimulation de la PDE1 du cerveau de rat par des acides gras insaturés (18:1n-9, 18:2n-6,
20:4n-6). La puissance de l'inhibition augmente avec le nombre de doubles liaisons sur la
chaîne carbonée. Les acides gras saturés (14:0, 16:0, 18:0 et 20:0) ne modifient pas l'activité
75
PDE5 et activent fortement la PDE1. Les esters méthyliques de ces acides gras ne modifient
pas l'activité phosphodiestérasique. Yamamoto et al.(1984) et Laychock (1989) ont montré
que les acides gras saturés n'ont pas d'effet sur la PDE2 du foie de veau alors que les acides
gras polyinsaturés sont plutôt inhibiteurs. Par contre, un effet activateur a été observé en
présence d'acides myristoléïque et palmitoléïque.
Parallèlement, Dubois et al. (1993) ont montré que les acides gras polyinsaturés sont des
inhibiteurs plus puissants que les acides gras saturés quelle que soit l'isoforme considérée dans
le cytosol de coeur de rat : PDE1, 2, 3, 4. La PDE2 semble l'isoforme la plus sensible aux
effets inhibiteurs des acides gras polyinsaturés testés.
Dans le cadre d'une étude nutritionnelle, Valette et al. (1991) ont observé que la
phosphodiestérase de thymocytes de rats nourris avec des régimes riches en huiles de poisson
(acides gras n-3) répond moins bien à l'activation par la Con A.
Dans notre équipe, Marcoz et al. (1993a) ont étudié les effets de l'acide phosphatidique et de
l'acide arachidonique sur les cinq isoformes de PDE présentes dans les thymocytes de rat.
Parmi les 5 pics d'activité PDE présents, seuls deux correspondant à des PDE4 sont sensibles
au PA à des concentrations physiologiques. L'acide phosphatidique active significativement la
PDE4, rolipram sensible, alors que l'acide arachidonique est un inhibiteur puissant de toutes
les isoformes de PDE sauf de la PDE4. Enfin, le dérivé 5-hydroxylé de l'acide arachidonique
(5-HETE) est faiblement activateur des PDEs 2 et 4.
D'autres travaux de notre équipe ont permis de montrer que le dérivé 12-hydroxylé de l'acide
arachidonique (12-HETE) avait également un effet sur les activités phosphodiestérasiques des
PBMC. En effet, le 12-HETE augmente les activités AMPc-PDE et GMPc-PDE dans les
cellules mononucléées humaines de sang périphérique (Joulain, 1994).
Des études plus récentes de Savany et al. (1996) ont montré que les effets du PA sur les
activités PDEs dépendent de sa composition en espèces moléculaires. Ainsi, le pic 3 (PDE4)
est activé par le PA, avec une efficacité variable en fonction de la composition et du degré
d'insaturation du phospholipide. Le pic 2 (PDE4 également) est inhibé seulement par des PA
contenant des acides gras saturés. D'autre part, El Bawab et al.(1997) ont étudié les effets de
différentes espèces moléculaires de PA sur l'activité d'une isoforme recombinante, la
PDE4A5. Tout d'abord, leurs résultats montrent que le PA extrait de cellules stimulées par la
Con A est plus activateur que le PA extrait de cellules non stimulées. De plus, l'analyse des
espèces moléculaires de PA extrait de cellules stimulées ou non par la Con A révèle une
augmentation significative de l'espèce 18:0/20:4 et une diminution significative des autres
espèces moléculaires, en particulier celles contenant du palmitate, au cours de l'activation.
Enfin, les espèces contenant des acides gras insaturés sont activatrices alors que celles
contenant deux acides gras saturés n'ont pas d'effet sur l'activité de l'enzyme. En utilisant des
isoformes de PDE4 recombinantes provenant de trois gènes différents (PDE4A, PDE4B et
PDE4D), Némoz et al. (1997) ont étudié la structure des PDEs activées par le PA et ont
cherché quel(s) mécanisme(s) pouvai(en)t intervenir dans cette activation. Les variants
76
"longs" exprimés à partir de chaque gène (PDE4A5, PDE4B1 et PDE4D3) sont activés par le
PA, alors que les variants "courts" (PDE4A1, PDE4B2, PDE4D1 et PDE4D2) ne le sont pas.
La phosphatidylsérine est un activateur aussi efficace que le PA, mais pas la
phosphatidylcholine, ce qui indique que seuls les phospholipides anioniques sont activateurs.
Le PA augmente la Vmax de l'enzyme sans affecter le Km et induit également des
changements dans les besoins en Mg2+ pour l'hydrolyse. Le demi-effet stimulateur du PA est
obtenu avec une dose de 10 µg/ml. Enfin, le mécanisme de la stimulation par le PA n'implique
pas une phosphorylation, et plusieurs observations indiquent qu'il existe une interaction
directe entre la protéine et le PA.
V- Altérations du système immunitaire au cours du vieillissement et peroxydation
lipidique : implication du 12-HETE.
V-1. La réponse immune et le vieillissement.
De nombreuses études ont montré que le vieillissement est accompagné d'une
altération de la régulation du système immunitaire (Makinodan et Day, 1980). Ainsi, le déclin
progressif des fonctions immunes dû à l'âge peut être relié à l'apparition de rhumatismes ou de
maladies infectieuses ou malignes (Solana et al., 1991).
Bien que tous les types cellulaires du système immunitaire soient affectés par l'âge, l'altération
majeure se produit dans les lymphocytes T (Makinodan et Day, 1980). La dimunition de la
réponse immunitaire des lymphocytes du sang périphérique n'est pas due à un changement ni
du nombre, ni de la composition des sous-populations lymphocytaires chez les sujets âgés par
rapport aux sujets jeunes (Nagel et al., 1981; Grossman et al., 1989).
Parmi tous les changements fonctionnels liés à l'âge, la diminution de la réponse proliférative
des lymphocytes humains ou de rongeurs à des lectines végétales ou des mitogènes a été bien
caractérisée (Gillis et al., 1981; Nagel et al., 1989; Khansari et al., 1991). Cette réponse
mitogénique diminuée pourrait provenir de la baisse de la production de l'IL2 ou de la
diminution d'expression du récepteur à l'IL2 observées dans ces cellules, altérations
accompagnées par une diminution de l'expression des ARNm correspondants (Nagel et al.,
1988). Cependant, la plupart des expériences réalisées in vivo ou in vitro ont montré que
l'addition d'IL2 exogène ne restaure que partiellement la réponse proliférative des cellules
aussi bien chez l'animal que chez l'homme âgés (Gillis et al., 1981; Rabinovitch et al., 1982).
Orson et al. (1989) ont montré que les lymphocytes de personnes âgées libèrent des quantités
importantes de récepteurs à l'IL2 solubles dans l'environnement extracellulaire sans l'exprimer
à la surface cellulaire. Ils supposent que, chez les sujets âgés, le récepteur à l'IL2 subirait une
transformation l'empêchant de s'exprimer à la surface des cellules.
77
D'autres études suggèrent que l'augmentation de la sensibilité aux prostaglandines (PGs)
sécrétées par les macrophages peut contribuer à affaiblir la réactivité des cellules T avec l'âge
(Goldwin et Messner, 1979). Cependant, Larson (1980), confirmant cette augmentation de la
sensibilité aux PGs avec l'âge a montré qu'une simple supplémentation en indométhacine
(inhibiteur de la PG-synthase) ne restaure pas la réponse proliférative des cellules T stimulées
par la Con A ou par des antigènes. De plus, des populations de cellules T purifiées
(dépourvues de macrophages et donc de PGs) montrent encore une réponse proliférative
diminuée avec l'âge (Grossman et al., 1989).
En outre, parmi les diverses hypothèses émises au cours des dernières décennies, en matière
de vieillissement, celles impliquant la peroxydation lipidique semblent jouer un rôle
fondamental.
V-2. Vieillissement et peroxydation lipidique.
Une diminution des défenses antioxydantes conduisant à une augmentation des
dommages peroxydatifs a été décrite dans de nombreux tissus animaux (Cand et Verdetti,
1989).
L'oxygénation des acides gras polyinsaturés conduit aux peroxydes d'acides gras qui sont les
produits primaires de la peroxydation lipidique. Deux modes de peroxydation lipidique,
enzymatique ou non, peuvent être définis selon le type d'oxygénation réalisé sur l'acide gras
insaturé, en particulier l'acide arachidonique. La cyclooxygénase catalyse une double
dioxygénation de l'acide arachidonique en endoperoxydes (PGG2 et PGH2), précurseurs des
prostaglandines et du thromboxane. Les lipoxygénases catalysent une monooxygénation de
l'acide arachidonique en hydroperoxydes (HPETEs) qui sont réduits par la suite en dérivés
hydroxylés (HETEs). Ces deux voies d'oxygénation enzymatiques sont responsables de la
peroxydation lipidique spécifique. La peroxydation non-enzymatique des acides gras
polyinsaturés est induite par des radicaux libres dérivés de l'oxygène qui attaquent les
phospholipides membranaires.
Le stress oxydant est responsable de l'altération d'un certain nombre de réponses immunes, en
particulier la différenciation des cellules souches (Fishman et al., 1981), la synthèse d'ARN
(Post et al., 1985), la production d'IL2 (Post et al., 1985) et la synthèse d'ADN (Freed et al.,
1987). Duncan et Lawrence (1990) ont rapporté que des lymphocytes ayant subi un stress
oxydant restent en phase G0/G1 durant une stimulation mitogénique.
L'organisme possède des systèmes de protection capables de neutraliser les radicaux
peroxyles. Ainsi, il est bien connu que le glutathion protège les cellules contre les dommages
oxydatifs (Nathan et al., 1981). De plus, il existe des enzymes permettant de neutraliser les
peroxydes : la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase (GSH-Px),
la glutathion transférase. Les cellules possèdent aussi des systèmes non-enzymatiques appelés
piégeurs de radicaux libres qui sont principalement la vitamine E, la vitamine C et le carotène.
78
Cependant, chez les sujets âgés, le taux de ces enzymes est diminué (Courtière et al., 1989),
ce qui conduit à une accumulation des radicaux libres et des peroxydes, et provoque une
attaque des membranes cellulaires par oxydation des phospholipides.
Parallèlement à l'hyperactivité plaquettaire observée avec l'âge, de nombreux marqueurs de
peroxydation lipidique tel que le MDA (malondialdehyde) sont augmentés dans les plaquettes
de personnes âgées comparativement à celles de témoins jeunes (Véricel et al., 1992). En
outre, une réduction significative des systèmes de protection (Vitamines E et GSH-Px) est
observée dans les plaquettes de personnes âgées (Véricel et al., 1992). De plus, Véricel et al.
(1988) avait rapporté une augmentation du métabolisme oxygéné de l'acide arachidonique
endogène dans des plaquettes stimulées ou non par la thrombine, en particulier la production
de 12-HETE. Ainsi, l'accumulation de peroxydes dépendants des lipoxygénases dans le
microenvironnement des cellules immunitaires pourrait constituer un facteur de
dysfonctionnement majeur des réponses immunes.
V-3. Le 12-HETE.
Les produits monohydroxylés de la lipoxygénase étaient initialement considérés
comme des produits inertes de détoxification du métabolisme de l'acide arachidonique. Il
existe maintenant de nombreuses preuves que les HETEs jouent un rôle dans la modulation
des sécrétions hormonales, de la réponse immune ou inflammatoire, de certaines voies
enzymatiques et de la croissance cellulaire (Spector et al., 1988).
Le 12-HETE est le dérivé hydroxylé synthétisé majoritairement dans les macrophages activés
et les plaquettes (Rabinovitch et al., 1981; Hamberg et Samuelsson, 1974) (Figure 15). Des
études plus récentes ont montré une production de 12-HETE dans les cellules tumorales
(Ruzicka et al., 1983). Dans les cellules tumorales, le 12-HETE semble induire un
réarrangement rapide des microfilaments et une phosphorylation des protéines associées aux
cytosquelette (Taylor et al., 1990).
Les fonctions physiologiques du 12-HETE ne sont pas bien caractérisées, mais beaucoup de
résultats indiquent qu'il pourrait être impliqué dans un grand nombre d'activités biologiques
telles que la stimulation de la sécrétion d'insuline par le tissu pancréatique, la suppression de
la production de rénine, le chimiotactisme des leucocytes et des macrophages durant
l'inflammation (Spector et al., 1988). Le 12-HETE semble également réduire la biosynthèse
de prostacycline par les cellules endothéliales vasculaires (Hadjiagapiou et Spector, 1986), et
joue un rôle central dans l'activation et l'agrégation plaquettaire (Sekiya et al., 1994). Plus
récemment, le 12-HETE est décrit comme le métabolite de l'acide arachidonique
majoritairement présent dans le sang menstruel (Hofer et al., 1993) et le tissu intrautérin
(Wetzka et al., 1993), mais la signification physiologique de cette découverte n'est pas claire.
79
80
a) Le 12-HETE et les voies de signalisation.
Plusieurs travaux impliquent le 12-HETE dans la régulation de certaines voies de
signalisation.
Le calcium.
Stern et al. (1993) ont étudié le rôle du 12-HETE dans le signal calcique induit par
l'angiotensine II dans les cellules glomérulaires de rat. L'addition de 12-HETE à ces cellules
induit une hausse du taux de calcium dose-dépendante qui est maintenue au delà de 15
minutes. Yoshino et al. (1994) ont montré dans les neutrophiles humains, que le 12-HETE
augmente rapidement le taux de calcium intracellulaire à partir du pool intracellulaire sensible
à l'IP3. Les effets du 12-HETE sur le taux de calcium intracellulaire sont atténués par la
nifédipine, antagoniste des canaux calciques lents, mais maintenus dans un milieu sans
calcium, ce qui suggère une mobilisation des stocks intracellulaires. La baïcaléine et le
BW755C, inhibiteurs de la 12-lipoxygénase, inhibent l'effet de l'angiotensine II sur le taux de
calcium intracellulaire. Cet effet est rétabli par addition de 12-HETE exogène. Ces résultats
suggèrent donc que l'activation de la voie lipoxygénase dans le glomérule surrénalien de rat
contribue aux changements de flux calciques intracellulaires. Enfin, très récemment, Reynaud
et al. (1997) ont montré que le 12-HETE synthétisé dans les plaquettes peut agir de manière
transcellulaire pour stimuler la libération du calcium intracellulaire dans les neutrophiles.
Les protéines kinases C.
De nombreuses données expérimentales suggèrent que le 12-HETE est une molécule
cruciale dans la signalisation intracellulaire conduisant à l'activation de la PKC, et impliquée
dans le mécanisme d'action de nombreux facteurs de croissance comme les cytokines, le
PDGF et l'EGF. Honn et al. (1994) ont montré que le 12-HETE augmente le potentiel
métastasique de cellules tumorales et l'adhésion des cellules tumorales à la paroi vasculaire,
phase importante de la métastase. Ils ont montré par la suite que le 12-HETE exerce ses effets
via l'activation de la PKC. Des observations expérimentales antérieures avaient montré que le
12-HETE mime l'effet de l'ester de phorbol (TPA) en augmentant l'expression des récepteurs
d'intégrines et de molécules d'adhésion (Grossi et al., 1989). Des résultats obtenus dans des
cellules de carcinome (W256) de rat montrent que le 12-HETE induit une augmentation de
100% de l'activité PKC associée à la membrane. De plus, la "down-régulation" de la PKC par
un traitement prolongé par le TPA abolit l'augmentation de l'adhésion des cellules W256 à
l'endothélium induite par le 12-HETE (Honn et Tang, 1992). Liu et al. (1995) ont également
montré que le 12-HETE provoque une translocation de la PKCα vers la membrane plasmique
et les plaques d'adhésion focales, conduisant ainsi à une augmentation de l'adhésion des
cellules de mélanome (B16a) à la fibronectine. En outre, de nombreux effets biologiques du
81
12-HETE peuvent être annulés par des inhibiteurs sélectifs de la PKC (Timar et al., 1992; Liu
et al., 1994). Hagerman et al. (1993) ont montré que le 15-HETE comme le 12-HETE, active
la PKC.
Le mécanisme par lequel le 12-HETE active la PKC n'est pas bien défini. Il semble que dans
différents types cellulaires, le 12-HETE induise préférentiellement une augmentation de la
translocation de l'isoforme α de PKC et pas celle de l'isoforme δ, du cytosol vers la membrane
plasmique. D'autres études réalisées en présence de BAPTA, un chélateur de calcium
intracellulaire, suggèrent que l'isoforme de PKC activée par le 12-HETE est dépendante du
calcium (Liu et al., 1994). Des études plus récentes suggèrent un mécanisme d'action du 12-
HETE médié par un récepteur (Liu et al. 1995). Ces auteurs ont montré que le 12-HETE
augmente rapidement les taux intracellulaires de DAG et d'IP3 dans les cellules B16a. De
plus, les effets du 12-HETE sur l'adhésion des cellules B16a à la fibronectine sont sensibles
aux inhibiteurs de PLC ou à la toxine pertussique. Enfin, des expériences de "binding" ont
permis de détecter un site de liaison de haute affinité (Kd=1nM) pour le 12-HETE sur ces
cellules. Ces résultats indiquent que la régulation de la PKCα par le 12-HETE pourrait
impliquer un récepteur couplé à une protéine G et l'hydrolyse des PIs par la PLC. D'autres
équipes ont également décrit l'existence de récepteurs au 12-HETE, par exemple dans les
kératinocytes avec un Kd d'environ 3-4 nM (Arenberger et al., 1993) ou dans les cellules de
carcinome avec un Kd de 0,4 nM (Herbertsson et Hammarstrom,1991) ou enfin dans des
cellules basophiles leucémiques, mais avec une plus faible affinité, Kd=500nM environ (Kang
et Vanderhoek, 1995).
Une autre possibilité expliquant l'accumulation de DAG après traitement par le 12-HETE est
l'inhibition de l'activité DAG-kinase. Ainsi, Setty et al. (1987) ont rapporté que dans les
cellules endothéliales d'aorte bovine, le 12- et le 15-HETE inhibent l'activité DAG-kinase et
induisent une accumulation de DAG.
Probablement, les deux mécanismes (activation de la PLC et inhibition de la DAG-kinase)
existent dans ces cellules provoquant éventuellement une augmentation de DAG puis une
activation spécifique de certaines isoformes de PKC.
b) Le 12-HETE et la réponse immune.
Les effets du 12-HETE observés dans différents types de cellules lymphoïdes sont
assez variés.
La mitogénèse induite par la PHA dans des splénocytes de souris et mesurée par incorporation
de thymidine tritié, est largement inhibée par des concentrations micromolaires de 12-HETE
(Low et al., 1984). Le traitement des PBMC avec du 12-HETE résulte également en uneinhibition dose-dépendante de la prolifération des lymphocytes, avec un IC50 de 10 µM
(Hadjiagapiou et al., 1992) à 20µM (Joulain et al., 1995). Enfin, un effet antimitogénique du
82
12-HETE a été démontré par Werner et al. (1985) dans des cellules de neuroblastome.
Les travaux de notre équipe ont également montré une quantité accrue de 12-HETE dans les
PBMC de sujets âgés par rapport aux PBMC de témoins jeunes (Meskini et al., 1993), ce qui
nous a amené à proposer l'hypothèse selon laquelle la production accrue de 12-HETE dans les
cellules de personnes âgées pourrait être responsable de la diminution de la réponse immune
accompagnant le vieillissement.
Le mécanisme par lequel le 12-HETE affecte les fonctions lymphocytaires n'est pas bien
élucidé. Plusieurs hypothèses peuvent être proposées :
Tout d'abord, ce composé est connu pour inhiber la DAG-kinase dans les cellules
endothéliales (Friedlander et al., 1990), ce qui pourrait induire une diminution de la
production de PA à partir du DAG. Ainsi, chez les personnes agées, le maintien d'un taux
élevé de 12-HETE pourrait conduire à une diminution du taux de PA synthétisé.
D'autre part, Joulain et al. (1995) ont montré que le 12-HETE pouvait s'estérifier dans les
phospholipides membranaires des PBMC. Il pourrait alors conduire à la formation de seconds
messagers modifiés, et en particulier des PA modifiés, incapables d'assurer une transmission
correcte des signaux d'activation.
Enfin, sous stimulation mitogénique par la Con A, les cellules mononuclées préchargées avec
du 12-HETE, relarguent du 12-HETE non modifié à partir des phosphatidylinositols (Joulain
et al., 1995). Ce résultat suggère que sous stimulation mitogénique, le 12-HETE, après sa
libération à l'extérieur de la cellule, pourrait aller agir sur un récepteur extracellulaire et altérer
la transmission du signal mitogénique de façon paracrine.
83
OOBBJJEECCTTII FFSSDDUU
TTRRAAVVAAII LLEEXXPPEERRII MMEENNTTAALL
84
De l'acide phosphatidique (PA) est produit normalement dans les cellules lymphoïdes
sous stimulation mitogénique, et ce composé est largement décrit comme un second messager
intracellulaire. Cependant, son effet sur ses différentes cibles dépend en grande partie de sa
composition en acides gras, qui dépend elle-même du compartiment phospholipidique dont il
est issu. Par ailleurs, les travaux antérieurs de notre équipe ont montré que le PA est capable
de stimuler in vitro l'activité de certaines isoformes de phosphodiestérases des nucléotides
cycliques. Enfin, une hausse d'activité PDE est observée dans les cellules mononucléées
humaines stimulées par la lectine mitogénique Concanavaline A (Con A). Cependant, aucune
corrélation n'a jamais été établie entre la hausse de la synthèse de PA et la hausse d'activité
PDE dans une même population cellulaire provenant d'un même donneur. L'un des objectifs
du travail expérimental de cette thèse a donc consisté à étudier l'effet de l'acide
phosphatidique sur les activités phosphodiestérases des nucléotides cycliques dans les cellules
mononucléées humaines. Ce travail comporte deux volets, qui seront détaillés dans les
chapitres I et II.
Chapitre I : "Production et voies de synthèse de l'acide phosphatidique dans les
cellules mononucléées humaines stimulées par la Concanavaline A."
Dans cette partie du travail, nous avons cherché à répondre aux questions suivantes :
---> Quelles sont les variations du taux de PA intracellulaire au cours des premières
minutes de l'activation mitogénique?
---> Quelle est ou quelles sont les voies de formation du PA stimulées par la lectine
mitogénique Con A dans les cellules mononucléées humaines?
Dans le Chapitre II : "Corrélations entre la production d'acide phosphatidique et les
activités phosphodiestérases dans les cellules mononucléées humaines témoins ou activées",
nous avons examiné l'effet de différents mitogènes sur la production de PA, les activités PDE
et les taux d'AMPc dans une même population cellulaire provenant d'un même donneur. Nous
avons cherché à corréler ces paramètres, et déterminé la nature des isoformes de PDE activées
par les différents mitogènes.
La seconde partie de ce travail, présentée dans le Chapitre III a consisté à étudier la modulation de la
synthèse de PA par un acide gras monohydroxylé qui s'accumule dans les cellules mononucléées de
personnes âgées, et qui est considéré par certains aspects comme marqueur du vieillissement. Ayant
démontré que le 12(S)-HETE est capable d'activer une voie de signalisation supplémentaire par
rapport au mitogène seul, voie supplémentaire mettant en jeu l'activation d'une PLD, nous avons
cherché à déterminer les mécanismes impliqués dans cette activation.
85
MMAATTEERRII EELLSS&&
MMEETTHHOODDEESS
86
MATERIELS
I- PRODUITS.
I-1 Produits inertes
Acide 12(S)-hydroxy-5,8,10,14-eicosatétraénoïque (12-HETE) TEBUAcide 15(S)-hydroxy-5,8,11,13-eicosatétraénoïque (15-HETE) TEBUAcide acétique MERCKAcide arachidonique SIGMAAcide éthylène glycol tétraacétique (EGTA) SIGMAAcide éthylène diamine tetraacétique (EDTA) CARLO ERBAAcide formique MERCKAcide N-2-hydroxyéthylpiperazine N'-2-ethane sulforic (HEPES) SIGMAAdénosine 3',5'-monophosphate cyclique, sel de sodium SIGMAAcides phosphatidiques SIGMAAcrylamide/bis acrylamide (30 : 0,8) SIGMAAnticorps anti-phosphotyrosineAnticorps de chèvre anti-IgG de souris couplé à la péroxydase du raifort BIO-RADAzideBio-rad protein assay (réactif de bradford) BIO-RADBleu de Bromophénol SIGMABleu de Coomassie SIGMABleu Trypan SIGMABorohydrure de sodium (NaBH4) SIGMAButyl hydroxytoluène (BHT) SIGMAß mercaptoéthanol FLUKACalphostine C SIGMAConcanavaline A SIGMADextran SIGMAFiltres GF/C WHATMANGénistéine SIGMAGlucose PROLABOGlycine SIGMA
87
Glycérol PROLABOGuanosine 3',5'-monophosphate cyclique, sel de sodium SIGMA
Inhibiteurs de PDE ;Rolipram SCHERING1-méthyl, 3-isobutylxanthine SIGMAMilrinone SIGMAEHNA SIGMA
Kit ECL AMERSHAMMilieux de séparation, de lavage et de culture :
Aprotinine (INIPROL) CHOAY LABORATOIRIESFicoll-Hypaque, milieu de séparation des lymphocytes SIGMAGlutamine, Pénicilline/Streptomycine SIGMAPepstatine SIGMABenzamidine SIGMAPMSF SIGMARPMI 1640 Dutch modification SIGMASérum AB humain INSTITUT JACQUES BOYSérum de veau foetal BIO MEDIA
Nucléotidase 5' (Ophiophagus hannah) SIGMAOrthovanadate de sodium SIGMAPlaques de gel de silice G60, 20 x 20 cm, 0,25mm MERCKPlaques microtiter COSTARRésine AG 1X2, 200-400 mesh BIO-RADR59022 (6-[2-(4-[(4-fluorophenyl)phenylméthylène]-1-piperidinyl]éthyle]-7-méthyle-5H-
thiazolo[3,2-a]pyridine) SIGMASaccharose PROLABOScintillant liquide "Pico-Fluor TM" 15 PACKARDSels (MgCl2, NaOH, NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4....) SIGMASerum almumine fraction V SIGMASolvants organiques SDSStandards lipidiques SIGMAStaurosporine SIGMASuramine SIGMATemed SIGMATétradécanoyl phorbol acétate (TPA) SIGMATris SIGMATriton X-100 SIGMATween 20 SIGMA
I-2 Produits radioactifs
Acide [5,6,8,9,11,12,14,15-3H]arachidonique, activité spécifique 200 Ci/mmoleAMERSHAMAcide [9,10 (n)-3H]-myristique, activité spécifique 54 Ci/mmole AMERSHAMAcide [9,10 (n)-3H]-oleïque, activité spécifique 2-10 Ci/mmole AMERSHAMAcide [glycérol-14C (U)]-phosphatidique, 1-α-dipalmitoyl,
activité spécifique 120 mCi/mmole NEN-RESEARCH PRODUCTS[8-3H]-Adénosine monophosphate 3',5'-cyclique, sel d'ammonium,
88
activité spécifique 20-30 Ci/mmole AMERSHAM[8-3H]-guanosine 3',5'-monophosphate cyclique, sel d'ammonium,
activité spécifique 8-10 Ci/mmole NEN-RESEARCH PRODUCTS[14C (U)]-adénosine, activité spécifique 400-600 mCi/mmole CEA[14C (U)]-guanosine, activité spécifique 400-600 mCi/mmole NEN-RESEARCHPRODUCTS[3H]-12-HETE, activité spécifique : 215Ci/mmole NEN-RESEARCH PRODUCTS[methyl-3H] thymidine , activité spécifique 42 Ci/mmole AMERSHAMKit de dosage RIA [125I] de l'AMPc NEN-RESEARCH PRODUCTS
II- APPAREILS
Appareil de chromatographie en phase gazeuse PERKIN ELMERBalances METTLERCentrifugeuses JOUANCompteur à scintillation liquide PACKARDFACS-Star BECTON DICKINSONLecteur de plaques LB 511 BERTHOLDLecteur de plaques multipuits LASYSTEMS iEMS READER MF (logiciel BIOLISE)Microscope photonique NIKONPotter verre-téflon POLY-LABOSonicateur LABO-MODERNESpectrophotomètre BECKMANStéricult BIOBLOCKSystème d'électrophorèse et de transfert BIO-RADSystème de filtration Cell-Harvester Autowash 2000 DYNATECHSystème d'imagerie assistée par ordinateur VILBER LOURMAT (logiciel Bioprofil)Ultracentrifugeuse KONTRON , rotors KONTRON 45-6
89
METHODES
I- PREPARATIONS CELLULAIRES.
I-1 Préparation des cellules mononucléées humaines du sang périphérique (PBMC).
Les cellules mononucléées (lymphocytes et monocytes) sont préparées selon le
protocole décrit sur la figure (Figure 16) à partir de sang veineux prélevé sur anti-coagulant
CPD (CTS de Lyon). Le plasma riche en plaquettes est d'abord éliminé par centrifugation
pendant 20 min à 120 g. Le culot qui en résulte est remis en suspension dans du NaCl/EDTA
0,9%, en présence de dextran 1% final afin d'éliminer les hématies. Après 30 min de repos à
37°C, le surnageant dextran contenant les leucocytes est séparé par centrifugation sur un
gradient de Ficoll Hypaque pendant 15 min à 600 g. Les cellules collectées à l'interface sont
lavées trois fois dans du RPMI 1640 (avec HEPES et bicarbonate) par centrifugation à faible
vitesse (400 g) pour éliminer le maximum de plaquettes contaminantes. Les cellules sont
ensuite resuspendues dans du RPMI 1640 à la concentration désirée (généralement 4 x 107
cellules/ml) et utilisées pour les expériences d'activation mitogénique.
La viabilité cellulaire mesurée par le test d'exclusion au Bleu Trypan est supérieure à 95%.
L'analyse par cytométrie de flux (FACS-Star, Becton Dickinson) des préparations cellulairesmontre que 65-70% des cellules sont des lymphocytes T CD3+ (clone T3, Coulter), 4-6% sont
des lymphocytes B CD19+ (clone B4, Coulter), 15-20% sont des monocytes CD14+ (clone
UCHM-1, Sigma) et 2-4% sont des plaquettes CD41a+ (GP IIb IIIa, clone P2, Immunotech).
Tous les anticorps primaires sont des IgG de souris. L'anticorps secondaire est un anticorps de
chèvre anti-souris conjugué à la fluorescéine (FITC conjugué, Tago Inc.).
90
91
I-2 Activation mitogénique des cellules mononucléées.
Des études cinétiques préliminaires effectuées par l'équipe ont montré que l'effet de la
Concanavaline A (Con A) sur la synthèse de PA est maximal après 5 min d'incubation. Les
cellules sont donc incubées pendant 5 min à 37°C en absence (témoin) ou en présence de Con
A à la concentration de 5 µg/106 cellules. Dans les expériences d'analyses lipidiques, la
réaction d'activation est arrêtée par de l'ethanol puis la suspension cellulaire est acidifiée à pH
3-4 avec de l'HCl 2M. Pour les dosages d'activité PDE, les incubations sont arrêtées dans la
glace et les cellules sont lysées selon le protocole décrit ci-dessous. Dans le cas des dosages
d'AMPc, les essais sont placées à 100°C au bain-marie bouillant pendant 2 min. Enfin, dans le
cas des expériences de "western-blotting", la réaction est arrêtée dans la glace et les cellules
sont lysées selon le protocole ci-dessous.
I-3 Lyses des cellules.
a) Lyse des cellules en vue du dosage d'activité phosphodiestérase.
Les cellules sont lavées avec du tampon Phillips, puis lysées au glycérol selon la
méthode décrite par Caldwell et al. (1988). Cette technique consiste à mettre en suspension les
cellules dans du tampon Phillips (4 x 107 cellules /ml), dont la composition est la suivante :
glucose 86 mM, NaCl 96 mM, EGTA 0,1 mM, EDTA 5 mM, HEPES 20 mM, inhibiteurs de
protéases (PMSF 0,5 mM, pepstatine 2 µg/ml, benzamidine 0,5 mM, aprotinine 200U/ml), à
pH 7,4. Les cellules sont centrifugées par la suite pendant 5 min à 400 g et resuspendues à la
même concentration dans une solution de glycérol à 60% dans le tampon Phillips. Après 10
min de repos à température ambiante, la suspension cellulaire est centrifugée pendant 10 min
à 900 g, puis resuspendue à la même concentration dans un tampon hypotonique, ce qui
provoque l'éclatement des cellules. La composition du tampon de lyse est la suivante : HEPES
20 mM, saccharose 25 mM, EGTA 0,1 mM et inhibiteurs de protéases (PMSF 60 µM,
pepstatine 2 µg/ml et aprotinine 200 U/ml) à pH 7,4. Les échantillons sont stockés à -80°C.
Un tel traitement au glycérol suivi d'un choc osmotique lyse la plus grande partie des cellules.
La viabilité cellulaire vérifiée à l'aide de bleu trypan est toujours inférieure à 6%.
Les cellules lysées sont ensuite homogénéisées dans le tampon de lyse, à l'aide d'un potter
verre-téflon (2 x 20 aller-retours), qui est ensuite rinçé avec un volume de tampon de lyse.
L'homogénat total est ultracentrifugé pendant 20 min à 42000g. Le surnageant est dilué avec
du tampon de dosage d'activité PDE (Tris 40 mM, pH=8) de manière à obtenir l'équivalent de
1,5 x 107 cellules/ml. Le culot est repris dans du tampon Tris 40 mM, pH=8 et réhomogénéisé
au potter verre-téflon (2 x 10 aller-retours). Le potter verre-téflon est rinçé par le même
tampon et les volumes sont ajustés de manière à obtenir l'équivalent de 3 x 107 cellules/ml.
92
b) Lyse des cellules en vue du "western-blotting".
A la fin de l'activation, les cellules sont suspendues (4 x 107 cellules/ml) dans le
tampon de lyse suivant : Tris HCl 20 mM pH 8, NaCl 150 mM, Triton X100 1%, EDTA
2mM, glycérol 10%, orthovanadate 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinine 200 U/ml et leupeptine
10 µg/ml et maintenues pendant 10 min dans un bain de glace . Après centrifugation pendant
25 min à 2000 g, les échantillons sont congelés à -80°C. Après décongélation, le surnageant
est dilué à 3 x 107 cellules/ml avec du tampon de Laëmmli concentré 4 fois (Tris 62,5mM pH
7,8, SDS 8%, saccharose 40%, ß-mercaptoéthanol 20% et du bleu de bromophénol), puis les
protéines sont dosées avant d'effectuer les dépots sur gel d'électrophorèse.
II- METHODES BIOCHIMIQUES.
II-1 Dosages des protéines.
a) Dosages des protéines dans les expériences de dosage d'activité
phosphodiestérase.
Les protéines solubles, membranaires et totales sont dosées selon la méthode de
Bradford (1976). Les échantillons sont soniqués au préalable pendant 30 min. La quantité de
protéines est déterminée par comparaison à une gamme de sérum albumine bovine variant de
0 à 20 µg de protéines. La DO est lue à 595 nm au spectrophotomètre.
b) Dosage des protéines en vue des expériences de "western-blotting".
Les protéines des échantillons contenant le tampon de lyse et le tampon de Laëmmli
sont dosées par la méthode de Schaffner et Weissmann (1973) par comparaison à une gamme
étalon de sérum albumine bovine variant de 0 à 27 µg de protéines. Cette technique consiste à
précipiter l'échantillon par de l'acide trichloroacétique à 60% en présence de SDS. Les
échantillons sont ensuite filtrés sur membrane Millipore et colorés avec une solution à
l'Amidoschwarz (MeOH/Ac.Acétique/H2O (90/20/90, v/v/v), Amidoschwarz 1 mg/ml). Les
membranes sont ensuite rincées dans plusieurs bains successifs de la solution de rinçage :
MeOH/Ac.Acétique/H2O (90/2/8, v/v/v). Après séchage, les dépots colorés sont découpés au
scalpel et placés dans des tubes contenant 1 ml de solution éluante : NaOH 25 mM, EDTA
50 µM dans de l'éthanol à 50% pendant 10 min. La lecture est effectuée à 630 nm au
spectrophotomètre.
93
II-2 Mesure de l'activité phosphodiéstérase des nucléotides cycliques (E.C.3.1.4.17).
a) Principe du dosage.
L'activité phosphodiestérase est déterminée selon la méthode radioisotopique en deux
étapes de Thompson et al. (1979), modifiée par Prigent et al. (1981). Dans une première étape,
la PDE hydrolyse le [8-3H] AMPc ou le [8-3H] GMPc en 5'[8-3H] AMP ou 5'[8-3H] GMP.
Dans une seconde étape, une 5'-nucléotidase (venin de cobra) exogène convertit le 5'-
nucléotide en nucléoside correspondant, [3H] adénosine ou [3H] guanosine. Les substrats et
les produits finaux sont séparés sur une résine anionique (AG 1-X2). Cette résine fixe
sélectivement le nucléotide cyclique qui n'a pas réagi. Après 10 min de centrifugation à 2000
g, la radioactivité de l'adénosine ou de la guanosine se trouvant dans le surnageant est
mesurée. Les rendements sont contrôlés par addition du nucléoside 14C correspondant lors de
la seconde étape. La quantité d'enzyme et le temps d'incubation sont ajustés de telle manière
qu'on ne dépasse pas les 20% d'hydrolyse du substrat afin de travailler dans les conditions de
vitesse initiale.
b) Protocole de dosage.
Le milieu réactionnel (400 µl) contient du Tris-HCl 40 mM à pH 8, du MgCl2 5 mM,
de la BSA 0,5 mg/ml, du 2-mercaptoéthanol 3,75 mM et de l'AMPc [3H] ou du GMPc [3H]
0,25µM (25 nCi) et 100 µl de culot ou de surnageant préparés comme décrit dans le
paragraphe I-3. La réaction enzymatique est arrêtée par dénaturation de l'enzyme à 100°C
dans un bain-marie pendant 1 min. On ajoute 100 µl de venin de cobra (0,6 mg/ml dans l'eau
distillée) contenant de l'adénosine [14C] ou de la guanosine [14C] (environ 3000 cpm/essai)
qui constituent un étalon interne de rendement. Après incubation pendant 10 min à 30°C, 1 ml
de résine activée (AG1-X2) sous forme acétate pour l'AMPc-PDE ou formiate pour la GMPc-
PDE est ajouté. Le mélange est incubé 15 min à 4°C et centrifugé à 2000 g pendant 10 min à
la même température. 400 µl de surnageant sont prélevés et comptés dans 5 ml de liquide
scintillant.
II-3 Dosage de l'AMPc.
Le contenu en AMPc des PBMC humaines a été mesuré par radioimmunoessai (Kit
RIA [125I] de l'AMPc, NEN-Research products). Après la stimulation mitogénique dans des
tubes en verre borosilicaté, les réactions sont arrêtées au bain-marie à 100°C pendant 2 min et
les échantillons sont stockés à -80°C. Les protéines sont séparées par centrifugation à 4500 g
pendant 15 min. Les surnageants sont dilués dans le tampon d'immunoessai et l'AMPc est
94
quantifié selon les recommandations du fabricant. Dans certaines expériences, les cellules ont
été préincubées 30 min en présence de l'inhibiteur de PDE4, rolipram à 100 µM ou 10 min en
présence de l'inhibiteur de DAG-Kinase R59022 à 10 µM, avant l'activation par la Con A.
II-4 Mesure des tyrosine phosphorylations par "western-blotting".
a) Electrophorèse et transfert.
Les protéines totales (10 µg, correspondant à environ 300 000 cellules) sont séparées
par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10%) en milieu dénaturant (SDS-PAGE)
(tableau). La dénaturation s'effectue par chauffage des échantillons contenant le tampon de
Laëmmli à 100°C au bain-marie bouillant pendant 5 min. Les échantillons sont ensuite
déposés dans les puits du gel de concentration (4%).
Les échantillons sont analysés par électrophorèse avec des standards de poids moléculaires,
dans un tampon dénaturant (Tris base 25 mM, Glycine 192 mM, SDS 0,1%) à pH 8,3 pendant
1 heure à 150 volts. Les protéines sont en premier lieu concentrées dans le gel de
concentration, puis elles sont séparées dans le gel de résolution selon leur masse moléculaire,
les protéines les plus petites étant les moins retenues.
Les protéines sont alors transférées électrophorétiquement sur membrane de nitrocellulose. Le
transfert se déroule à 100 volts pendant 1 heure dans un tampon réfrigéré (Tris base 25 mM,
Glycine 192 mM, méthanol 20%) à pH 8,3.
b) Immunodétection.
Toutes les étapes se déroulent dans un tampon salin contenant 0,1 % de Tween-20
(TBS-T : Tris base 20 mM, NaCl 137 mM ajusté à pH 7,6 avec HCl), sous agitation orbitale.
A l'issue du transfert, la membrane est incubée dans du TBS-T contenant 5% de lait écrémé,
soit 3 heures à température ambiante soit une nuit à 4°C. La combinaison de lait écrémé et de
Tween-20 permet de limiter les fixations non-spécifiques. Après lavages, la membrane est
incubée avec l'anticorps spécifique des tyrosines phosphorylées (anti-phosphotyrosinemonoclonal IgG2bk, 100µg/µl, Upstate Biotechnology) dilué à 1/2000, soit pendant 3 heures à
température ambiante soit une nuit à 4°C. La membrane est lavée puis incubée 1 heure en
présence d'un anticorps anti-IgG de souris couplé à la peroxydase du raifort (dilution
1/15000). Immédiatement après lavage, les protéines sont spécifiquement révélées sur un film
par une détection chimioluminescente (détection ECL). Le film est ensuite développé dans un
révélateur, rincé sous un courant d'eau, baigné dans un fixateur, rincé à nouveau puis séché.
c) Quantification des protéines.
Les bandes révélées sur le film sont analysées par densitométrie et quantifiées par un
95
analyseur d'images (logiciel Bioprofil).
III- TEST DE PROLIFERATION.
Les cellules mononucléées purifiées comme décrit précédemment sont resuspendues à
une concentration de 2 x 106 cellules/ml dans du RPMI 1640 (avec HEPES et bicarbonate)
complémenté avec 1% de sérum AB humain, de la glutamine 2 mM, de la streptomycine 100
µg/ml et de la penicilline 100 U/ml. La suspension cellulaire est distribuée dans une plaque 96
puits (microtiter Costar). Chaque puits reçoit 100 µl de suspension cellulaire (soit 200 000
cellules/puits) et 50 µl de Con A à la concentration finale de 5 µg/106 cellules. Les témoins
reçoivent 50 µl de RPMI supplémenté.
Pour l'étude de l'effet du PA ou de certains inhibiteurs sur la prolifération lymphocytaire,
différentes concentrations de PA ou d'inhibiteurs sont ajoutées au milieu de culture sous un
volume de 50 µl par puits en présence ou en absence de Con A.Les cellules sont incubées à 37°C dans une atmospère contenant 5% de CO2 et 95%
d'humidité, pendant 48 heures dans un volume final de 200 µl . Chaque test est réalisé en 8
exemplaires. A la fin de la période d'incubation, 0,5 µCi de thymidine tritiée sont ajoutés dans
chaque puits. Après 18 heures d'incubation, les cellules sont collectées sur des filtres en fibre
de verre, à l'aide d'un "cell-harvester". La quantité de radioactivité incorporée est évaluée par
comptage de la radioactivité adsorbée sur les filtres dans 4,5 ml de liquide scintillant.
IV- MARQUAGE ET STIMULATION DES CELLULES.
IV-1 Marquage des cellules.
La suspension cellulaire (4 x 107 cellules/ml) est incubée soit avec une dose traceuse
d'acide arachidonique tritié (1,5 µCi/ml), soit avec une dose traceuse d'acide oléique tritié (1,5
µCi/ml), soit avec une dose traceuse d'acide myristique tritié (3 µCi/ml) pendant 1 heure à
37°C. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont lavées trois fois dans du milieu frais
afin d'éliminer la radioactivité non incorporée dans les cellules, puis resuspendues à la
concentration finale de 4 x 107 cellules/ml. Le rendement moyen d'incorporation est de 70%
pour l'acide arachidonique et de 30% pour l'acide oléique et l'acide myristique.
Dans les expériences visant à corréler les taux de PA, les activités PDE et les taux d'AMPc, la
suspension cellulaire a été séparée en 3 fractions, et seuls les essais utilisés pour doser le PA
ont été radiomarqués. Les cellules utilisées pour les dosages d'activité PDE et les dosages
96
d'AMPc ont été incubées avec du RPMI seul et lavées 3 fois, de manière à être traitées dans
les mêmes conditions avant l'activation.
IV-2 Stimulation mitogénique.
Les cellules prémarquées sont incubées pendant 5 min à 37°C en absence ou en
présence de Con A (5 µg/106 cellules) ou d'OKT3 (30 ng/ml ou 100 ng/ml) ou pendant 15 min
à 37°C en absence ou en présence de TPA (100 nM).
Dans certaines expériences, les cellules ont été prétraitées en présence de drogues avant la
stimulation. Le R59022, un inhibiteur de DAG-kinase a été utilisé à des concentrations
croissantes allant de 5 à 50 µM pendant 10 min avant l'activation. La génistéine, un inhibiteur
de tyrosine-kinase a été utilisée à des concentrations finales variant de 100 µM à 400 µM
pendant 15 min avant l'activation. Les inhibiteurs de PKC, tels que la staurosporine et la
calphostine C ont été respectivement utilisés à 1 µM et 126 nM pendant 30 min avant la
stimulation mitogénique. Enfin, la suramine, un inhibiteur de l'activité PLD a été utilisé à la
concentration finale de 1 mM pendant 1 heure avant l'activation mitogénique. Dans d'autres
expériences les cellules ont été stimulées par les différents mitogènes en présence d'alcools
(ethanol, butanol-1, butanol-2) à une concentration finale de 1%.
L'incubation des cellules en présence des divers stimuli ou inhibiteurs pendant la période de
temps choisi est arrêtée selon des protocoles différents (voir le paragraphe I-2) en fonction du
dosage envisagé.
V-ANALYSES LIPIDIQUES.
V-1 Extraction lipidique.
Les lipides sont extraits selon la technique décrite par Boukhchache et Lagarde (1982)
à l'aide d'un mélange ethanol/chloroforme (3/6, v/v) contenant du butyl-hydroxytoluène
(BHT, antioxydant) à la concentration finale de 5 x 10-5 M. Un standard interne (acide
phosphatidique marqué au 14C, 1500 cpm/ml de phase aqueuse) est ajouté dans la suspension.
Le mélange est mis à décanter pendant une nuit à 4 °C. Les phases organiques sont évaporées
sous-vide, les résidus secs repris dans un mélange éther/méthanol (9/1, v/v), et stockés à -
20°C jusqu'à l'analyse.
V-2 Mise au point d'un système de séparation du PA fiable en vue de la quantification
97
par analyse d'image.
Les techniques utilisant le marquage des cellules avec des traceurs d'acides gras
permettent d'apprécier les variations du pourcentage d'acide phosphatidique par rapport aux
lipides totaux marqués, mais ne renseignent pas sur la masse réelle de PA intracellulaire. Or,
le PA est un phospholipide minoritaire, donc il était intéressant de mettre au point une
méthode colorimétrique de quantification du PA en masse rapide, facilement utilisable et
suffisamment sensible pour quantifier le PA des lymphocytes.
Un premier système chromatographique utilisant deux migrations successives dans la même
dimension : première migration dans hexane/éther/acide acétique (50/50/1, v/v/v) et une
deuxième migration dans chloroforme/méthanol/acide acétique/eau (60/30/10/1, v/v/v/v) a été
utilisé. Il permettait de séparer le PA des autres phospholipides avec un Rf de 0,9. Une telle
séparation avec un Rf élevé n'est pas fiable sachant qu'une meilleure séparation est
généralement obtenue pour des Rf inférieurs à ou de l'ordre de 0,5. Le PA est quantifié par
une méthode colorimétrique au bleu de Coomassie permettant une large détection aussi bien
des lipides simples que des lipides complexes sur plaques de silice (Nakamura et Handa,
1984). A la fin de la migration, les plaques sont séchées et la radioactivité est mesurée à l'aide
d'un lecteur de plaque (Berthold LB 511). Les plaques sont ensuite colorées au bleu de
Coomassie à 0,03% dans une solution de NaCl (0,9%)-méthanol 20% pendant 20 min, puis
elles sont lavées dans la même solution NaCl (0,9%)-méthanol 20% pendant 10 min.
L'intensité de coloration du spot correspondant au PA est évaluée par rapport à une gamme
étalon de PA standard séparée sur la même plaque, à l'aide d'un analyseur d'image (système
d'imagerie assisté par ordinateur Bioprofil). La quantité de PA mesurée par analyse d'image
après ce type de CCM était de l'ordre de 3 ng/106 cellules (probablement trop faible si l'on
compare aux données de la littérature pour d'autres types cellulaires).
Nous avons alors utilisé la CCM monodimensionnelle décrite par Legrand et al. (1991), qui
permet d'obtenir le PA avec un Rf de 0,45. Avec ce système, la masse de PA est évaluée à 29
ng/106 cellules, une valeur dix fois supérieure à la première mesure. Des analyses
complémentaires nous ont permis de montrer que cette forte valeur de PA est due à une
contamination du spot de PA par d'autres phospholipides.
Le dernier système testé et retenu, suggéré par les travaux de Broekman et al. (1980) présente
l'avantage de séparer les phopholipides en deux dimensions, permettant ainsi une meilleure
purification du PA (Figure 16). La première migration est effectuée dans un système de solvant
basique : chloroforme/méthanol/ammoniaque (65/35/5,5, v/v/v) et la deuxième migration dans la
deuxième dimension est effectuée dans un système de solvant acide :
chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/eau (30/40/10/10/5, v/v/v/v/v). Les différentes classes
de phospholipides (PC, PS, PI, PE) ainsi que le PA sont identifiés par comparaison des Rf à ceux de
standards non marqués, séparés sur la même plaque et révélés à l'iode. Chaque spot est ensuite gratté
et sa radioactivité est mesurée par comptage en scintillation liquide. Les résultats sont exprimés en
98
pourcentage de la radioactivité liée aux PL totaux. Le rendement en PA de ce système d'extraction et
de séparation calculé grâce au comptage en scintillation liquide de la radioactivité 14C est de l'ordre
de 40%. Après coloration au bleu de Coomassie, la quantité moyenne de PA en masse trouvée dans
les cellules témoins est alors de 14,62 ng/106 cellules.
Figure 17 : Chromatogramme type obtenu après coloration au bleu de Coomassie.
Dans le but de tester encore la fiabilité de ce système, nous nous sommes assurés qu'il existait
une relation linéaire entre la quantité de cellules ou le volume d'extrait analysés et la quantité
de PA estimée par l'analyse. Les résultats présentés en Figure 18 montrent qu'une telle relation
existe et ces résultats permettent d'adopter ce dernier système de séparation pour toutes les
analyses ultérieures.
V-3 Séparation du phosphatidylalcool.
Plusieurs système de séparation de phosphatidylalcool ont été décrits dans la
littérature. Nous avons également utilisé une chromatographie bidimensionnelle dans le cas de
cette séparation. La première migration est identique à celle utilisée pour la séparation du PA.
Par contre, la deuxième migration est effectuée dans le système de solvant : éthyl
acétate/isooctane/acide acétique (9/5/2, v/v/v).
99
1008060402000,0
0,5
1,0
1,5
Quantité de cellules (millions)
Qua
ntité
de
PA
dos
ée (
µg)
a
1501005000
1
2
Volume d'extrait lipidique déposé (µl)
Qua
ntité
de
PA
dos
ée (
µg)
b
Figure 18 : Relation entre la quantité de cellules ou le volume d'extrait analysés et la quantité
de PA mesurée.
Des quantités croissantes de cellules ont été incubées dans du RPMI à 37°C pendant 5
minutes (a) ou des volumes croissants provenant de la séparation d'un même extrait lipidique
ont été déposés sur plaque (b), et la quantité de PA formé a été dosée dans les deux cas par la
méthode colorimétrique et l'analyse d'image.
100
VI- ETUDE DE L'EFFET DU 12(S)-HETE SUR LA PRODUCTION DE PA PAR LES
CELLULES MONONUCLEEES HUMAINES.
VI-1 Influence du 12(S)-HETE sur la production de PA par les PBMC marquées au
[3H] AA et stimulées ou non par la Con A.
Les phospholipides des cellules mononucléées sont enrichis en 12(S)-HETE selon le
protocole mis au point dans l'équipe par Joulain et al. (1995). La suspension de cellules
mononucléées à la concentration de 4 x 107 cellules/ml est incubée 3 fois successivement en
présence de 1 µM de 12(S)-HETE non marqué, pendant 30 min à 37°C. Les cellules témoins
sont incubées pendant le même temps en absence de 12(S)-HETE. Les cellules sont ensuite
lavées 2 fois dans du RMPI 1640, puis resuspendues à la concentration finale de 4 x 107
cellules/ml. Le rendement moyen d'incorporation du 12(S)-HETE, déterminé dans des
expériences parallèles utilisant du [3H]-12(S)-HETE, est de 20%. Les cellules sont par la suite
incubées en présence d'une dose traceuse d'acide arachidonique tritié (1,5 µCi/ml) pendant 1
heure à 37°C. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont lavées 3 fois dans du RPMI
1640. Le rendement d'incorporation du [3H]-AA dans ces cellules préalablement chargées en
12(S)-HETE n'est pas différent de celui observé dans les cellules témoins.
L'activation mitogénique des cellules enrichies en 12(S)-HETE est ensuite réalisée comme
décrit dans le paragraphe IV-2.
VI-2 Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par les cellules
mononucléées humaines enrichies en [3H]-12(S)-HETE et stimulées ou non par la Con A.
La suspension de cellules mononucléées (4 x 107 cellules/ml) est incubée 3 fois
successivement en présence de 1 µM de 12(S)-HETE tritié (0,25 µCi/ml, activité spécifique
215 Ci/mmol), pendant 30 min à 37°C. Les cellules témoins sont incubées selon le même
protocole avec de l'acide arachidonique tritié (0,25 µCi/ml). Les cellules sont ensuite lavées 2
fois dans du RPMI 1640, puis resuspendues à la concentration finale de 4 x 107 cellules/ml.
L'activation mitogénique des cellules enrichies en 12(S)-HETE et des cellules témoins est
ensuite réalisée comme décrit dans le paragraphe IV-2.
VI-3 Analyse de la composition en acides gras du PA par chromatographie en phase
gazeuse sur colonne capillaire (CPV).
La composition en acides gras du PA est déterminée après sa séparation sur CCM. Les
zones de gel correspondant au PA sont grattées et récupérées immédiatement dans des tubes à
vis. Les acides gras sont transméthylés selon la technique de Morrisson et Smith (1964).
101
Brièvement, 0,5 ml de mélange toluène/méthanol (20/30, v/v) sont ajoutés à la silice en
présence de 0,5 ml de trifluorure de bore à 10% dans le méthanol (Sigma, B-1252). La
réaction est effectuée dans un bain sec durant 1h30 à 100°C, puis arrêtée après refroidissementpar addition de 1 ml de K2CO3 5% dans l'eau. Les acides gras ainsi méthylés sont extraits
deux fois par 2 ml et 1 ml d'isooctane. Les phases isooctaniques sont combinées, et 5 µl de la
solution d'étalon interne de chromatographie (ester méthylique de l'acide pentadécanoïque,
Sigma P-6250) à 300 µg/ml sont ajoutés à tous les tubes. Les échantillons sont conservés à -
20°C en attendant d'être analysés à l'aide d'un chromatographe PERKIN ELMER qui est
équipé :
- d'un injecteur vaporisateur à température programmable, couplé à un système de
réchauffement et refroidissement par air comprimé. Le système d'injection permet
l'évaporation du solvant (pentane) à 40°C. La température augmente ensuite très rapidement à
230°C, ce qui permet la vaporisation des acides gras dans la colonne.
- d'une colonne SUPELCO SP 2380 (30 m x 0,32 mm), très polaire.
- d'un four, dont le programme de température est le suivant : la température initiale du
four est de 135°C pendant 5 min, puis augmente de 2°C/min jusqu'à 160°C pendant 2 min.
Elle augmente ensuite jusqu'à 205°C à 1,5°C/min. Le gaz vecteur est l'hélium et la pression
utilisée est de 0,8 psi.
- d'un détecteur à ionisation de flamme à 250°C (mélange air et hydrogène)
- d'un ordinateur permettant la programmation et le contrôle de toutes les fonctions
nécessaires à l'analyse (température, pression, etc...), l'impression des profils
chromatographiques et l'intégration des pics correspondants.
VI-4 Effet du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans les PBMC activées
ou non par la Con A.
Les cellules mononucléées à la concentration de 4 x 107 cellules/ml sont prétraitées au
12(S)-HETE comme décrit dans le paragraphe VI-1, mais elles ne sont pas marquées à l'acide
arachidonique tritié. L'activation mitogénique est ensuite effectuée comme décrit dans le
paragraphe IV-2. La réaction d'activation est arrêtée dans la glace et les cellules sont lysées
selon le protocole décrit en I-3-b. Les protéines phosphorylées sont quantifiées par "western-
blotting".
VI-5 Etude des sites de liaison spécifique du 12(S)-HETE sur les lymphocytes T
purifiés.
a) Principe.
Le but est d'examiner en détail l'association du 12(S)-HETE aux lymphocytes T
102
humains purifiés à la température de 4°C. L'exposition de 3 x 106 cellules dans 0,5 ml de
tampon à une gamme de concentrations variables de [3H]-12(S)-HETE à 4°C pendant 3
heures, suivie de l'élimination de la radioactivité non associée aux cellules par une technique
de filtration rapide, permet d'isoler les cellules marquées.
b) Préparation des lymphocytes T purifiés.
Les cellules mononucléées préparées selon le protocole décrit en I-1 sont resuspendues
à la concentration de 1 x 106 cellules/ml dans le milieu de culture suivant : RPMI 1640
contenant 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 100 µg/ml de steptomycine et
100 U/ml de penicilline, et réparties par 50 ml dans des flacons de 75 cm2. Les cellules sontincubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 et 95% d'humidité pendant 72
heures, en absence ou en présence de Con A à 1 µg/ml. A la fin de la période d'incubation, les
cellules mortes sont éliminées par centrifugation sur gradient de Ficoll hypaque à 600 g
pendant 15 min. Les cellules collectées à l'interface sont lavées trois fois dans du tampon PBS(NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4 1,15 mM) à pH 7,0, puis sont
utilisées pour les expériences de liaison.
b) Protocole.
La technique a été mise au point à partir des travaux de Vonakis et Vanderhoek (1992)
concernant l'étude des récepteurs du 15-HETE sur une lignée cellulaire de basophiles PT-18.
Les lymphocytes T purifiés sont resuspendus dans du PBS contenant 11 mM de glucose, à la
concentration de 3 x 106 cellules/250 µl.
La fixation spécifique du 12(S)-HETE est mesurée par filtration rapide sur des filtres en fibre
de verre type GF/C. Le milieu réactionnel contient 200 µl de 12(S)-HETE froid (1 x 10-9 à 10
x 10-6 M) et 50 µl de [3H]-12(S)-HETE (0,26 nM et 0,025 µCi par essai). La réaction est
initiée par addition de la suspension cellulaire (3 x 106 cellules par essai). L'incubation sur
oscillateur dure 3 heures à 4°C. La fixation aspécifique (blancs) est déterminée en présence
d'un excès de 12(S)-HETE froid (3 x 10-6 M ou 10 x 10-6 M, selon les expériences). La
réaction est arrêtée par dilution avec 1 ml de PBS froid et filtrée sous vide sur filtres GF/C.
Pour limiter l'adsorption non spécifique du 12(S)-HETE sur la fibre de verre , les filtres sont
au préalable incubés dans du PBS contenant 1% de PolyEthylèneImine (PEI). Les filtres sont
lavés 3 fois par 3 ml de PBS froid à pH 7,0. Les essais sont réalisés en triple. La radioactivité
du complexe [3H]-12(S)-HETE/récepteur adsorbé sur les filtres est comptée dans 4,5 ml de
liquide scintillant.
103
RREESSUULLTTAATTSS
104
CHAPITRE I
Production et voies de synthèse de l'acide phosphatidique dansles cellules mononucléées humaines stimulées par la
Concanavaline A (Con A).
L'acide phosphatidique, un phospholipide quantitativement mineur dans les cellules,
est l'intermédiaire commun à la synthèse de tous les phospholipides et des triacylglycérols. De
plus, de nombreux arguments suggèrent que ce composé pourrait être un second messager
impliqué dans la mitogénèse. Plusieurs voies de formation de l'acide phosphatidique à partir
de plusieurs compartiments phospholipidiques ont été décrites dans différents types cellulaires
sous l'influence de mitogènes variés, conduisant à la production d'espèces moléculaires de PA
de composition différente déterminée par la composition en acides gras du compartiment
phospholipidique d'origine. De plus, les résultats de la littérature montrent que les effets du
PA sur cibles enzymatiques spécifiques (PKC, PLCg, Raf-1 kinase, GAP) varient en fonction
de l'espèce moléculaire.
L'équipe ayant démontré que l'activation des PDE4 par le PA, in vitro, dépend également de la
nature des espèces moléculaires de PA en présence, il était très important de connaitre la (les)
voies de formation du PA activée(s) in situ par les différents mitogènes, afin de déterminer si
les espèces moléculaires de PA formées physiologiquement lors de la mitogénèse étaient bien
des espèces actives vis-à-vis de la PDE. Cette connaissance était également indispensable
pour moduler les taux de PA intracellulaire par des traitements pharmacologiques spécifiques,
afin d'examiner les conséquences de ces variations sur les activités PDE cellulaires.
105
I- Effets de la Concanavaline A (Con A) sur la synthèse de PA et de DAG par les cellules
prémarquées à l'acide arachidonique tritié.
I-1 Marquage des cellules mononucléées au repos par une dose traceuse d'acide
arachidonique tritié.
Après préincubation des cellules mononucléées pendant 1 heure à 37°C en présence d'une
dose traceuse (7,5 nM) d'acide arachidonique tritié [3H]-AA (1,5 µCi/ml), la majeure partie de la
radioactivité liée aux lipides totaux est retrouvée dans les phospholipides (PL) (70%) et les lipides
neutres (27%).
La répartition de la radioactivité entre les différentes classes de phospholipides et dans les lipides
neutres est indiquée dans le Tableau 2 : 47% de la radioactivité liée aux PL totaux se trouve associée
à la phosphatidylcholine (PC), 36% au phosphatidylinositol et à la phosphatidylsérine (PI/PS) et 18%
à la phosphatidyléthanolamine (PE). Les diacylglycérols (DAG) représentent environ 0,6% de la
radioactivité totale incorporée et l'acide arachidonique non-estérifié est de l'ordre de 0,4%. La
radioactivité incorporée dans le PA est de l'ordre de 0,5-0,8% de la radioactivité totale incorporée
dans les phospholipides.
I-2 Variations de la production de PA et de DAG radiomarqués en fonction de la
durée de stimulation des cellules mononucléées humaines par la Con A.
La stimulation mitogénique des cellules mononucléées humaines (PBMC) préalablement
marquées par de l'acide arachidonique tritié ([3H]-AA) n'induit pas de variation significative de la
production de DAG radiomarqué au cours de la période de temps considérée (0-30 min). Par contre,
la Con A augmente de manière significative la proportion de PA-[3H]-AA (Figure 19a). Cette
augmentation est maximale dès la 5ème minute de stimulation et commence à décliner après 10
minutes. Pendant cette période, la proportion de PA radiomarqué est plus que triplée (basal : 0,61 vs
stimulé : 2,27%) (Figure 19b).
II- Effet de la Con A sur la synthèse de PA en masse dans les cellules mononucléées
humaines.
Dans les cellules mononucléées marquées à l'acide arachidonique tritié, les variations de la
proportion de PA radioactif donnent des indications sur le "turn-over" des espèces moléculaires riches
en acide arachidonique mais ne reflètent pas obligatoirement les variations de la masse totale de PA.
Il était donc important de déterminer si l'augmentation de la proportion de PA radioactif induite par la
Con A s'accompagnait d'une augmentation de la masse totale de PA.
106
Tableau 2 : Répartition de la radioactivité liée à l'acide arachidonique dans les différentesclasses lipidiques des cellules mononucléées humaines.
a) n Pourcentage de laradioactivité liée aux
lipides totauxPhospholipides totaux 15 69,96 ± 3,21
Triglycérides 15 20,16 ± 2,46Lipidesneutres
Esters destérols
15 6,07 ± 0,89
DAG 7 0,63 ± 0,8acide arachidonique libre 15 0,44 ± 0,13
b)n
Pourcentage de laradioactivité liée aux
phospholipidestotaux
PI/PS 11 35,53 ± 3,83PC 11 46,62 ± 2,97PE 11 17,68 ± 3,83PA 10 0,61± 0,05
Les cellules mononucléées ont été marquées par une dose traceuse d'acide arachidoniquetritié pendant 1 heure à 37°C. Après lavages, les lipides ont été extraits et séparés commedécrit dans le chapitre Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de laradioactivité liée aux lipides totaux (a) et en pourcentage de la radioactivité liée auxphospholipides totaux (b) et représentent les moyennes ± SEM de n expériences réalisées avecn donneurs différents. Les lipides mineurs n'étant pas pris en considération, le total deschiffres ans le tableau (a) est inférieur à 100.
107
30201000
1
2
PADAG
Temps (min)
PA
ou
DA
G
(% d
e la
rad
ioac
tivité
liée
aux
lipi
des
tota
ux)
**
a
b
0
1
2
3
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
* *+272%
Con ATémoinFigure 19 : Effet de la Concanavaline A sur la production de DAG et de PA par les cellulesmononucléées marquées à l'acide arachidonique.
Les cellules ont été marquées par du [3H]-AA et stimulées par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant destemps variables allant de 0 à 30 minutes. En (a), les résultats sont exprimés en % de la radioactivité liée auxlipides totaux et représentent les moyennes ± SEM de 4 expériences réalisées avec 4 donneurs différents. Lesrésultats sont soumis à une analyse de variance (ANOVA) et les moyennes obtenues après chaque temps sontcomparées à celle du temps 0 par un test de t protégé (Fisher). * indique une différence significative (p<0,05)par rapport au temps 0. La figure b montre l'augmentation de la proportion de PA radiomarqué après 5 min destimulation par la Con A. Les résultats sont exprimés en % de la radioactivité liée aux phospholipides totaux etreprésentent les moyennes ± SEM de 10 expériences réalisées avec 10 donneurs différents. Les résultats sontanalysés par ANOVA et les moyennes comparées par un test de t protégé (Fisher). ** indique une différencesignificative (p<0,01) par rapport au niveau non stimulé.
108
0
20
40
60
80
PA
form
é (n
g/m
illio
n d
e ce
llule
s)
*+230%
Témoin Con A
Figure 20 : Effet de la Concanavaline A sur la synthèse d'acide phosphatidique en masse.Les cellules ont été stimulées par la Con A (5µg/106cellules) pendant 5 min. Les résultats
sont exprimés en ng de PA formé par 106 cellules (b) et représentent la moyenne ± SEM de10 expériences différentes réalisées avec 10 donneurs différents. Les résultats sont comparéspar analyse de variance (ANOVA STATVIEW II). * indique une différence significative(p<0,01) par rapport au niveau basal (sans Con A).
109
La quantification du PA par colorimétrie et vidéodensitométrie (Fig. 20) indique que la Con A
induit également une augmentation significative de la masse de PA (+230%; basal : 14,62 vs
stimulé : 47,18 ng/106 cellules).
Les résultats de la littérature décrivant deux voies principales de formation du PA sous
stimulation mitogénique (PLD et PI-PLC/DAG-KINASE), nous nous sommes proposés
d'étudier ces deux possibilités. Nous avons tout d'abord recherché la présence éventuelle d'une
activité PLD dans les cellules mononucléées au repos ou stimulées. D'autre part, l'absence
d'effet apparent de la Con A sur la production de DAG-[3H]-AA par les cellules
mononucléées suggérait une phosphorylation rapide du DAG en PA par la DAG-kinase,
comme cela a été décrit pour des lymphocytes murins stimulés par la Con A (Hasegawa-
Sasaki et Sasaki, 1982) ou des cellules de Jurkat stimulées par des anticorps spécifiques et des
lectines (Aussel et al., 1992). Pour vérifier cette hypothèse, nous avons ensuite étudié l'effet
d'un inhibiteur de DAG-kinase sur la production de PA induite par la Con A.
III- Recherche d'une voie PLD dans la production de PA induite par la Con A dans les
cellules mononucléées humaines.
Grâce à sa capacité unique de transphosphatidylation, la PLD conduit à la synthèse de
phosphatidylalcool lorsque les expériences sont réalisées en présence d'alcool primaire, alors qu'en
présence d'eau, il se forme du PA. Par conséquent, une activation de la PLD en présence d'éthanol
conduit à la synthèse de phosphatidyléthanol (PEt), ce qui diminue parallèlement la production de
PA. La comparaison de la production de PA en absence et en présence d'éthanol, et la quantification
du phosphatidyléthanol constituent donc une mesure de l'activité PLD particulièrement fiable. Enfin,
l'utilisation de l'ester de phorbol TPA, activateur reconnu de la PLD dans la plupart des types
cellulaires permettra de tester la présence d'une activité PLD dans ce type de cellules.
Il s'agira ensuite de déterminer si cette voie est mise en jeu lors d'une stimulation par la Con A.
III-1 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou en présence
d'éthanol dans des cellules prémarquées à l'acide arachidonique tritié.
Les résultats obtenus lors de ces expériences sont présentés dans les Figures 21a et 21b.
Plusieurs points importants peuvent être soulignés :
- le TPA augmente la radioactivité liée au PA mais de façon moins importante que la
Con A (+193% vs +342%). Par contre, l'augmentation de PA en masse induite par le TPA est plus
importante que celle induite par la Con A (+1034% vs +285%), et cette différence est significative
(p<0,01);
110
- EtOH
+ EtOH*
*
0
1
2
3
4
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
a
Témoin Con A TPA
0
50
100
150
200 - EtOH
+ EtOH
PA
form
é (n
g/m
illio
n de
cel
lule
s) *
* †
b
Témoin Con A TPA
Figure 21 : Effet du TPA ou de la Con A sur la synthèse de PA en présence ou en absenced'éthanol.
Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence de [3H]-AA comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées soit par 100nM deTPA pendant 10 min soit par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min en présence ou enabsence de 1% d'éthanol. Les cellules témoins sont incubées pendant le même temps dans duRPMI en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les résultats sont exprimés en pourcentagede la radioactivité liée aux phospholipides (a) ou en ng de PA formé par 106 cellules (b) etreprésentent la moyenne de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Lesrésultats sont comparés par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II).* indique une différence significative (p<0,05) par rapport au témoin. † indique une différencesignificative (p<0,05) entre les niveaux stimulés par TPA en présence et absence d'éthanol.
111
- l'éthanol ne semble pas avoir d'effet ni sur la synthèse basale de PA (0,60 vs 0,54%
de la radioactivité liée aux PL totaux; 10,71 vs 10,78 ng/106 cellules) ni sur celle induite par la Con A
(2,67 vs 2,40% de la radioactivité liée aux PL totaux; 41,27 vs 46,31 ng/106 cellules);
- l'éthanol diminue légèrement (-30%) la radioactivité liée au PA lorsque les cellules
sont stimulées par le TPA (1,77 vs 1,20% de la radioactivité liée aux PL totaux) et diminue de
manière significative (-52%) la production de PA en masse (121,38 vs 58,35 ng/106 cellules, p<0,01).
III-2 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PEt radiomarqué à
l'arachidonate.
Afin de démontrer que la diminution de synthèse de PA sous l'effet de l'éthanol dans les
cellules stimulées par le TPA n'est pas due à un effet toxique mais bien à l'activation d'une PLD, nous
avons recherché en parallèle la formation de phosphatidyléthanol (PEt). Les résultats présentés dans
la Figure 22 montrent que :
- l'éthanol n'induit pas de formation de PEt radioactif dans les cellules témoins (0,06
vs 0,06% de la radioactivité liée aux PL totaux) ni dans les cellules stimulées par la Con A (0,09 vs
0,05% de la radioactivité liée aux PL totaux);
- l'éthanol induit une synthèse de PEt radioactif dans les cellules stimulées par le TPA
(0,09 vs 0,47% de la radioactivité des PL totaux).
Ces résultats indiquent qu'il existe bien une activité PLD activable par le TPA dans ce modèle
cellulaire, et suggèrent que l'activation mitogénique par la Con A ne fait pas intervenir cette voie. En
particulier, l'absence d'effet de l'éthanol sur la production de PA en masse induite par la Con A
indique clairement que ce mitogène n'induit pas d'activation massive de la PLD, ce qui n'exclut pas la
contribution limitée d'une activité PLD agissant sur un compartiment particulier de phospholipides.
En effet, chaque classe de phospholipides présente une composition en acides gras particulière, les
phosphoinositides étant beaucoup plus riches en acide arachidonique que les phosphatidylcholines, et
inversement les phosphatidylcholines étant beaucoup plus riches en acide oléïque que les
phosphoinositides. C'est pour cela que la nature de l'acide gras utilisé comme traceur pour le
marquage des cellules a un rôle important, l'acide arachidonique permettant une meilleure estimation
des PA issus des phosphoinositides et l'acide oléïque celle des PA issus des phosphatidylcholines.
Ainsi, grâce à l'utilisation d'acide oléïque tritié pour le marquage des lipides cellulaires, Kazkin et al.
(1992) sont parvenus à démontrer l'existence d'une voie PLD, active sur un pool phospholipidique
riche en oléate, dans une lignée de cellules épithéliales transformées (A431); une telle voie n'était pas
apparente lorsque le traceur radioactif utilisé était l'acide arachidonique. Cela nous a conduit à
prémarquer les cellules mononucléées humaines avec de l'acide oléïque, dans le but de tester
l'hypothèse de l'intervention d'une voie PLD lors de la synthèse de PA induite par la Con A, par une
autre approche.
112
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5 - EtOH
+ EtOH
PE
t (%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
Témoin Con A TPA
Figure 22 : Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PEt radiomarqué à l'arachidonate.Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence de [3H]-
AA comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées soit par 100nM deTPA pendant 10 min soit par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min en présence ou enabsence de 1% d'éthanol. Les cellules témoins sont incubées pendant le même temps dans duRPMI en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les résultats sont exprimés en pourcentagede la radioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expérience.
113
III-3 Marquage des cellules mononucléées au repos par de l'acide oléïque tritié.
Après préincubation des cellules mononucléées pendant une heure à 37°C en présence d'une
dose traceuse (150 nM) d'acide oléïque tritié (1,5 µCi/ml), la majeure partie de la radioactivité totale
est, comme pour le marquage par le [3H]-AA, retrouvée dans les PL et les lipides neutres (60 et 37%
respectivement). La radioactivité liée au DAG représente environ le même pourcentage de la
radioactivité liée aux lipides totaux (0,7%) quel que soit l'acide gras utilisé comme marqueur. Il en est
de même pour le PA estimé après la deuxième migration. Par contre, la répartition de la radioactivité
dans les différentes classes de PL diffère de celle observée en présence d'acide arachidonique
(Tableau 3), ce qui est en bon accord avec les résultats de la littérature (Kazkin et al., 1992). En effet,
67% de cette radioactivité est retrouvée dans les PC, alors que seulement 17% sont trouvés dans
PI/PS, ce qui indique une incorporation préférentielle de l'oléate dans les phosphatidylcholines
Tableau 3 : Répartition de la radioactivité liée à l'acide oléïque dans les différentes classes dephospholipides des cellules mononucléées humaines.
n Pourcentage de laradioactivité liée aux
phospholipidestotaux.
PI/PS 4 16,87 ± 0,67PC 4 66,92 ± 0,86PE 4 15,63 ± 0,54PA 4 0,42 ± 0,06
Les cellules mononucléées ont été marquées par une dose traceuse d'acide oléïque tritié pendant 1heure à 37°C. Après lavages, les lipides ont été extraits et séparés comme décrit dans le chapitreMéthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipidestotaux et représentent les moyennes ± SEM de n expériences réalisées avec n donneurs différents. Leslipides mineurs n'étant pas pris en considération, le total des chiffres ans le tableau (a) est inférieur à100.
III-4 Effet de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou en présence d'éthanol dans les
cellules mononucléées humaines prémarquées à l'acide oléïque tritié.
La stimulation mitogénique des PBMC prémarquées par une dose traceuse d'acide oléïque
augmente la proportion de PA marqué (Figure 23) d'environ +145% (basal : 1,06 vs stimulé : 2,59%
de la radioactivité liée aux PL totaux). Cette augmentation est plus faible que celle observée pour la
masse (+230%, Fig. 20), ce qui indique qu'une partie au moins du PA provient d'un compartiment
phospholipidique non marqué et suggère l'existence de plusieurs voies de synthèse du PA stimulées
par la Con A dans ce type cellulaire. Afin de tester l'activation possible d'une PLD, des expériences
ont été réalisées en présence d'éthanol.
114
0
1
2
3
4
- EtOH
+ EtOH
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
*
†
Témoin Con A
Figure 23 : Effet de l'éthanol sur la proportion de PA radiomarqué à l'oléate dans les cellulesmononucléées au repos ou stimulées par la Con A.
Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acideoléique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées par la ConA (5 µg/106 cellules) pendant 5 min en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les cellulestémoins sont incubées pendant le même temps dans du RPMI en présence ou en absence de1% d'éthanol. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée auxphospholipides et représentent la moyenne de 4 expériences différentes réalisées avec 4donneurs différents. Les moyennes sont comparées par un test de t apparié (STATWORK).*indique une différence significative (p<0,05) par rapport au témoin. † indique une différencesignificative (p<0,05) entre les niveaux stimulés par la Con A en présence et absenced'éthanol.
115
Les résultats présentés dans la Figure 23 indiquent que l'éthanol ne semble pas avoir
d'effet sur la proportion de PA radiomarqué dans les cellules non stimulées (1,06 vs 1,11% de
la radioactivité liée aux PL totaux). Par contre, l'augmentation de la proportion de PA
radioactif induite par la Con A est diminuée significativement par l'éthanol de 20% (2,59 vs
2,00 de la radioactivité liée aux PL totaux, p<0,01).
La synthèse de PA radioactif induite par la Con A étant diminuée par l'éthanol, nous pouvons
penser qu'une voie PLD, active sur un pool phospholipidique riche en oléate, pourrait
intervenir de façon minoritaire lors de la stimulation par la Con A. Afin de vérifier cette
hypothèse, nous avons étudié la formation de PEt, parallèlement à la formation de PA.
III-5 Effet de la Con A et du TPA sur la production de PEt radiomarqué à l'oléate.
Les résultats obtenus au cours de ces expériences montrent que (Figure 24) :
- aucune synthèse de PEt n'est observée dans les cellules témoins (0,07 vs
0,09% de la radioactivité liée aux PL totaux) ou stimulées par la Con A (0,08 vs 0,06% de la
radioactivité liée aux PL totaux);
- une synthèse de PEt radioactif est notée dans les cellules stimulées par le TPA
(0,12 vs 0,24% de la radioactivité des PL totaux).
Bien que l'éthanol diminue légèrement la radioactivité du PA lorsque les cellules marquées à
l'oléate sont stimulées par la Con A, nous n'avons pas pu démontrer la formation de PEt
radiomarqué par l'oléate.
L'ensemble de tous ces résultats suggère que la voie PLD n'est pas stimulée par la Con A ou
que la stimulation (si elle existe) n'est que très marginale. Le PA produit dans les cellules
mononucléées humaines stimulées par la Con A proviendrait donc préférentiellement de
l'hydrolyse des phosphoinositides par une phospholipase C suivie d'une phosphorylation par
une DAG-kinase. C'est dans le but de vérifier cette hypothèse que nous avons effectué les
expériences suivantes.
IV- Implication d'une voie PI-PLC/DAG-kinase dans la production de PA induite par la
Con A dans les cellules mononucléées humaines.
Dans un premier temps, nous avons vérifié l'implication d'une DAG-kinase dans la
formation du PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées humaines. Pour cela,
nous avons utilisé le composé R59022 qui est décrit comme un inhibiteur de DAG-kinase.
116
0,0
0,1
0,2
0,3
- EtOH
+ EtOH
PE
t (%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
Témoin Con A TPA
Figure 24 : Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de Phosphatidyléthanol radiomarquéà l'oléate.
Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acideoléique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées soit par100nM de TPA pendant 10 min soit par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min enprésence ou en absence de 1% d'éthanol. Les cellules témoins sont incubées pendant le mêmetemps dans du RPMI en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les résultats sont exprimésen pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expérience.
117
IV-1 Effet du R59022 sur la synthèse de PA induite par la Con A dans les cellules
mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.
La préincubation des cellules mononucléées avec l'inhibiteur de DAG-kinase, R59022
(100 µM) pendant 10 min diminue la proportion relative de PA radiomarqué et la production
de PA en masse induite par la Con A. Ainsi, alors que la Con A stimule la production de PA
radioactif de 190% dans les cellules non traitées, cette augmentation n'est plus que de 10%
lorsque les cellules ont été prétraitées avec du R59022. L'effet sur l'augmentation de la masse
de PA est moins important (150 vs 46%) et n'est pas significatif (Tableau 4).
Tableau 4 : Diminution de la production de PA induite par la Con A dans les cellulespréincubées en présence du composé R59022.
Pourcentage
d'augmentation par rapport
aux cellules non stimulées
par la Con A
- R59022
Pourcentage
d'augmentation par rapport
aux cellules non stimulées
par la Con A
+ R59022
PA radiomarqué 190±55 10±3 *
PA en masse 150±84 46±24
Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acidearachidonique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite incubées enprésence de 100 µM de R59022 pendant 10 min, puis stimulées par la Con A (5 µg/106
cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'augmentation de laproduction de PA dans les cellules activées par rapport aux cellules témoins et représentent lesmoyennes ± SEM de 4 expériences différentes réalisées avec 4 donneurs différents. Lesmoyennes sont comparées par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II). * indique unedifférence significative par rapport aux cellules non traitées par le R59022 (p<0,05).
Ces résultats suggèrent que la voie PI-PLC est largement impliquée dans la synthèse de PA
stimulée par la Con A. Or, une des toutes premières étapes de la cascade d'activation induite
par les mitogènes comprend l'activation de la PLCγ spécifique de l'hydrolyse du PIP2 par
phosphorylation sur des résidus tyrosines, assurée par des protéines tyrosine kinases
cytosoliques de la famille src. Nous avons donc effectué des expériences en présence d'un
inhibiteur de tyrosine-kinase (la génistéine) dans le but de vérifier l'hypothèse de l'implication
118
de la voie PI-PLC suggérée par nos précédents résultats.
IV-2 Effet de la génistéine sur la synthèse de PA induite par la Con A dans les cellules
mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.
La préincubation des cellules mononucléées avec l'inhibiteur de tyrosine-kinase,
génistéine (400 µM) pendant 10 min diminue la proportion relative de PA radiomarqué et la
production de PA en masse. En effet, alors que Con A stimule la synthèse de PA marqué de
246% dans les cellules non traitées, cette augmentation n'est que de 49% lorsque les cellules
sont prétraitées par la génistéine. De plus, la masse de PA est augmentée de 378% par la Con
A seule, alors qu'elle n'est augmentée que de 117% en présence de génisteine. Ces différences
sont significatives (p<0,05), que ce soit en radioactivité ou en masse (Tableau 5).
Tableau 5 : Diminution de la production de PA induite par la Con A dans les cellulespréincubées en présence de Génistéine.
Pourcentage
d'augmentation par rapport
aux cellules non stimulées
par la Con A
- Génistéine
Pourcentage d'augmentation
par rapport aux cellules non
stimulées par la Con A
+ Génistéine
PA radiomarqué 246±50 49±42 *
PA en masse 378±87 117±26 *
Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acidearachidonique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite incubées enprésence de 400 µM de Génistéine pendant 10 min, puis stimulées par la Con A (5 µg/106
cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'augmentation de laproduction de PA dans les cellules activées par rapport aux cellules témoins et représentent lesmoyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Lesmoyennes sont comparées par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II). * indique unedifférence significative par rapport aux cellules non traitées par la génistéine (p<0,05).
Ces résultats suggèrent fortement l'implication de tyrosine kinases dans la stimulation de la
synthèse de PA par la Con A et confirment donc notre hypothèse.
119
VIII- Discussion.
Du PA est produit normalement par les cellules lymphoïdes après activation
mitogénique, comme cela a été décrit dans les thymocytes de rat (Marcoz et al., 1993; El
Bawab et al., 1995), ou dans les cellules Jurkat (Aussel et al., 1992; Mollideno et al., 1994).
De plus, de nombreux arguments expérimentaux montrent que le PA est mitogène dans la
plupart des types cellulaires. Ainsi, ce phospholipide semble largement impliqué dans un
certain nombre de voies de signalisation. C'est pourquoi il nous a paru important de
déterminer quelles étaient les voies impliquées dans sa production.
Nous avons mis au point une méhode de dosage du PA mettant en jeu une coloration des
phospholipides sur plaque de silice et une quantification de l'intensité de coloration des spots
de PA par analyse d'image par comparaison à une gamme de PA déposée sur la même plaque.
Cette méthode se montre très sensible puisqu'elle permet de doser des quantités de PA de
l'ordre de 0,1 µg alors que les méthodes colorimétriques classiques (dosage du phosphate
après minéralisation) ne permettent pas de détecter des quantités de phospholipides inférieures
à 20 µg. Elle est fiable et rapide, ce qui permet son utilisation pour la quantification de la
masse de PA en routine.
L'ensemble des résultats présentés dans ce chapitre indique que la synthèse de PA induite par
la Con A dans les cellules mononucléées humaines implique l'activation de la voie PI-
PLC/DAG-kinase, et que cette voie doit être activée par des protéines tyrosine-kinases.
En effet, la proportion de PA marqué induite par la Con A est largement augmentée (+272%)
au cours des premières minutes de la stimulation quand les cellules mononucléées sont
prémarquées avec du [3H]-AA (Figure 20 a et b). Ce résultat est en accord avec les études
d'Hasegawa-Sasaki et Sasaki (1993) dans les lymphocytes murins ou de Marcoz et al. (1993)
dans les thymocytes de rat. Parallèlement, la production de PA en masse est aussi augmentée
(+230%) et cet effet est sensiblement du même ordre que celui observé sur le PA marqué
(Figure 21).
Quand les cellules mononucléées sont prémarquées à l'oléate tritié, la radioactivité incorporée
dans les PC est plus importante que lorsque les cellules sont marquées à l'arachidonate [3H]
(Tableaux 2 et 3). De plus, l'augmentation de la masse de PA induite par la Con A (+272%)
est nettement plus importante que celle observée pour le PA marqué à l'oléate (+145%). Ce
résultat suggère que seule une petite partie du PA synthétisé provient des PC. Cependant, les
PI/PS sont tout de même légèrement marqués quand les cellules sont incubées en présence
120
d'oléate [3H], et nous pouvons donc supposer qu'une partie du PA marqué provient des PI. Le
marquage relativement faible des PI dans le cas où l'oléate est utilisé comme traceur radioactif
pourrait donc expliquer la production relativement plus faible de PA marqué. Enfin, ces
résultats suggèrent également que les espèces moléculaires de PA produites sous stimulation
par la Con A contiennent en majorité de l'acide arachidonique. Un tel résultat a d'ailleurs été
démontré par El Bawab et al.(1995) dans les thymocytes de rat.
Plusieurs résultats expérimentaux indiquent que la stimulation de la production de PA par la Con A
n'implique pas d'activation de PLD. D'une part, l'éthanol n'a pas d'effet significatif sur la synthèse de
PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées marquées au [3H]-AA et a un effet très
marginal dans les cellules marquées au [3H]-oléate (Figures 22 et 24). D'autre part, on n'observe pas
de production de PEt radioactif lorsque les cellules mononucléées sont stimulées par la Con A, quel
que soit le marqueur radioactif utilisé. Au contraire, quand les cellules mononucléées sont incubées
en présence d'éthanol et stimulées par le TPA, la production de PA est significativement diminuée et
on observe une production de PEt radioactif lorsque les cellules sont incubées en présence d'éthanol.
Ces résultats permettent de déduire deux conclusions : (1) une voie PLD existe dans les cellules
mononucléées humaines ; (2) cette voie PLD n'est pas impliquée dans la synthèse de PA induite par la
Con A.
Dans le but de mieux comprendre le mécanisme de la production du PA induite par la Con A, la
stimulation de cellules mononucléées par la Con A a été effectuée en absence ou en présence de
l'inhibiteur de DAG-kinase R59022. Cet inhibiteur a été utilisé par Aussel et al. (1992) dans les
cellules de Jurkat pour montrer l'implication d'une DAG-kinase dans la synthèse du PA. Nos résultats
démontrent que la hausse de PA induite par la Con A est largement diminuée en présence de R59022,
ce qui implique une DAG-kinase dans l'activation mitogénique par la Con A. Ceci est en bon accord
avec les résultats précédents et est en faveur d'une voie PI-PLC/DAG-kinase.
Les expériences réalisées en absence ou en présence de l'inhibiteur de tyrosine-kinase, génistéine,
confirment ces résultats. En effet, l'incubation des cellules mononucléées en présence de Con A et de
génistéine diminue significativement la formation de PA. Ce résultat indique le recrutement de
tyrosine kinases en amont de la production de PA dans la voie de signalisation activée par la Con A,
en bon accord avec le schéma d'activation proposé par Weiss (1993) pour l'activation mitogénique
des lymphocytes.
Cependant, les données de la littérature montrent que la PLD peut être activée par de multiples
mécanismes, impliquant entre autres, des protéines tyrosine-kinases. Ainsi, nos expériences en
présence de génisteine pourraient être compatibles avec l'activation d'une PLD au cours de la
stimulation de la synthèse de PA par la Con A. Mais les effets de l'éthanol sur la production de PA et
l'absence de formation de PEt contredisent cette hypothèse, et indiquent qu'aucune activité PLD n'est
stimulée par la Con A seule.
En conclusion , l'ensemble de nos résultats montre que la production de PA stimulée par la Con A
dans les cellules mononucléées humaines implique la voie Tyr-kinase/PI-PLC/DAG-kinase.
121
CHAPITRE II
Corrélations entre la production d'acide phosphatidique et lesactivités phosphodiestérases dans les cellules mononucléées
humaines témoins ou activées.
Les expériences présentées dans le Chapitre I de ce travail ont permis de démontrer
que l'activation mitogénique des cellules mononucléées humaines conduit à une hausse
précoce de la production d'acide phosphatidique. D'autre part, des résultats antérieurs de
l'équipe avaient montré que la stimulation mitogénique des cellules conduit à une hausse
d'activité PDE maximale après 10 à 30 minutes de stimulation, donc postérieure à
l'augmentation du taux de PA. Enfin, l'équipe avait également démontré que le PA est capable
de stimuler in vitro l'activité de certaines isoformes de PDE (Marcoz et al., 1993a ; Savany et
al., 1995 ; Némoz et al., 1996). L'ensemble de ces données et en particulier, les données
cinétiques relatives aux taux de PA (Figure 19) et aux hausses d'activités PDE (Meskini et al.,
1992) suggéraient un lien de cause à effet entre ces deux événements, sans en apporter la
preuve directe, puisque les résultats avaient été obtenus dans des expériences indépendantes.
Afin de conforter l'hypothèse que la hausse du taux intracellulaire d'acide phosphatidique est
bien responsable de l'activation des PDEs, et que ces événements corrélés constituent une
étape clef de l'activation lymphocytaire, il était important de mesurer, dans la même
population cellulaire provenant d'un même donneur, à la fois les taux de PA, les activités PDE
et les taux de nucléotides cycliques.
122
I- Synthèse d'acide phosphatidique (PA) dans les cellules mononucléées stimulées par
différents agonistes.
Les phospholipides membranaires des PBMC ont été marqués en incubant les cellules en
présence d'une dose traceuse (7,5 nM) d'acide arachidonique tritié (1,5 µCi/ml) pendant 1 heure à
37°C. A la fin de la période d'incubation, les cellules ont été lavées et stimulées soit par la lectine
mitogénique Con A (5 µg/106 cellules) soit par l'anticorps anti-CD3, OKT3 (30 ng/ml) pendant 5
min, soit par l'ester de phorbol TPA (100 nM) pendant 15 min. Comme le montrent les résultats
présentés dans la Figure 25a, les trois agonistes augmentent de manière significative la quantité de
[3H]-AA-PA par rapport au témoin et la Con A et l'OKT3 ont un effet plus important (4,3 fois et 3,1
fois, respectivement) que le TPA (2,9 fois). Au contraire, quand on observe la production de PA en
masse (Figure 25b), les effets des 3 agonistes sont assez différents. Ainsi, le TPA augmente plus la
production de PA en masse (9,2 fois) que la Con A (5,6 fois) ou l'OKT3 (2,9 fois). Ces résultats sont
en accord avec les mécanismes d'action qui ont été décrits pour ces trois agonistes en ce qui concerne
la production de PA. Comme nous l'avons vu dans le Chapitre I, le TPA active une PLD spécifique de
l'hydrolyse des PC, alors que la Con A stimule surtout une voie PI-PLC/DAG-kinase. Un mécanisme
similaire à celui de la Con A a été décrit pour l'anticorps anti-CD3, OKT3 (Aussel et al., 1992). Sur
une partie aliquote de chaque population cellulaire traitée par l'un ou l'autre agoniste, ou non traitée
(témoins) les activités PDE ont été mesurées.
II- Effet de la stimulation des cellules mononucléées par les trois agonistes sur leurs
activités phosphodiestérases des nucléotides cycliques.
L'activation des cellules mononucléées par la Con A (Figure 26) induit une
augmentation plus importante de l'activité GMPc-PDE de l'homogénat total (+98% par
rapport au niveau basal, P=0,004) que de l'activité AMPc-PDE (+33% par rapport au niveau
basal, P=0,021). De plus, la stimulation des deux activités phosphodiestérases est plus
importante dans la fraction cytosolique que dans la fraction particulaire (44 vs 10% pour
l'activité AMPc-PDE et 112 vs 68% pour l'activité GMPc-PDE, respectivement).
Au contraire, l'anticorps anti-CD3 induit un profil d'activation des phosphodiestérases
légèrement différent (Figure 26). En effet, on observe une augmentation faible mais
significative des activités AMPc-PDE (+16%, P=0,002) et GMPc-PDE (+21%, P=0,008) de
l'homogénat total des cellules activées. Cette augmentation reflète celle des activités
enzymatiques particulaires (+35% et +30% pour les activités AMPc-PDE et GMPc-PDE avec
des valeurs de P égales à 0,005 et 0,02, respectivement), alors que les activités de la fraction
cytosolique ne sont presque pas affectées.
123
*
*
*
0
1
Témoin+ TPA+ ConA+ OKT3
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)a
0
20
40
60
80
PA
form
é (n
g/m
illio
n de
cel
lule
s)
b
*
*
*
Figure 25 : Synthèse d'acide phosphatidique dans les cellules mononucléées stimulées par la Con A,l'OKT3 ou le TPA.
Les cellules mononucléées sont incubées pendant 1 heure à 37°C en présence de [3H]-AA (VoirMéthodes) puis sont incubées 5 min en absence (témoin) ou en présence de Con A (5 µg/106 cellules)ou de l'anticorps anti-CD3 (30 ng/ml), ou incubées pendant 15 min en présence de 100nM de TPA.Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides totaux (a) ou enng de PA formé par 106 cellules (b). Ils représentent la moyenne de n expériences différentesréalisées avec n donneurs différents (n=9 pour les cellules témoins ou traitées par le TPA, 6 pour lescellules traitées par la Con A et 5 pour les cellules traitées par l'OKT3). Les moyennes sont comparéspar analyse de variance (ANOVA STATVIEW II) et par le test de Fisher PLSD.* indique une différence significative (p<0,05) par rapport au niveau basal.
124
0
50
100
150
200
250
Act
ivité
PD
E (
% d
u té
moi
n)
+ Con A
AMPc-PDE
*
*
*
*
*
GMPc-PDE0
50
100
150
Act
ivité
PD
E (
% d
u té
moi
n)
+ OKT3
AMPc-PDE
* *
* *
GMPc-PDE
0
50
100
150
200
250
Act
ivité
PD
E (
% d
u té
moi
n)
+ TPA
AMPc-PDE
* *
** *
*
GMPc-PDE
TémoinHomogénat stimulé
Cytosol stimulé
Culot stimulé
Figure 26 : Activités AMPc et GMPc-PDE dans l'homogénat total, les fractions cytosoliqueet particulaire des cellules mononucléées témoins ou traitées par différents agonistes.
Les cellules mononucléées ont été incubées 5 min en absence (témoin) ou en présence deCon A (5 µg/106 cellules) ou de l'anticorps anti-CD3 (30 ng/ml) ou incubées pendant 15 minen présence de TPA (100 nM). A la fin de la période d'incubation, les cellules ont été culotées,lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activités PDE ont été mesurées dans leshomogénats et les fractions cytosoliques et particulaires des cellules témoins ou activées. Pourchaque traitement, les activités PDE sont exprimées en pourcentage par rapport à la valeur dutémoin et représentent les moyennes de n expériences différentes réalisées avec n donneursdifférents (n=9 pour les cellules témoins ou traitées par le TPA, 6 pour les cellules traitées parla Con A et 5 pour les cellules traitées par l'OKT3). Pour l'analyse statistique, les activitésPDE spécifiques moyennes (pmole/min/mg de protéines) ont été comparées par le test de t deStudent apparié.
* indique une différence significative (p<0,05) par rapport au niveau basal.
125
Enfin, l'ester de phorbol TPA a un peu moins d'effet que la Con A et un peu plus que l'OKT3
sur la stimulation des activités phosphodiestérases de l'homogénat total (Figure 26). Tout comme la
Con A, le TPA induit une plus forte augmentation de l'activité GMPc-PDE que de l'activité AMPc-
PDE (+48%, P=0,002 vs +20%, P=0,02, respectivement), mais tout comme l'OKT3, il augmente de
manière plus importante l'activité de la fraction particulaire que celle de la fraction cytosolique.
III- Corrélations entre la quantité de PA et l'activité PDE dans les cellules mononucléées
témoins et activées.
Les activités PDE mesurées dans les différents compartiments cellulaires ont été étudiées en
relation avec la proportion de [3H]-AA-PA et la masse de PA dans les mêmes extraits cellulaires,
indépendemment du traitement utilisé.
Des corrélations linéaires et positives ont pu être établies (Tableau 6) entre l'activité AMPc-PDE de
l'homogénat total ou de la fraction cytosolique et la quantité de PA radiomarqué (P=0,025 et 0,05,
n=31, respectivement), alors que les activités AMPc-PDE ou GMPc-PDE de la fraction membranaire
sont mieux corrélées avec la masse de PA (P=0,001 et 0,002, n=28, respectivement).
Tableau 6 : Corrélations entre les activités AMPc et GMPc-PDE et la masse de PA ou le PAradioactif.
AMPc-PDE
GMPc-PDE
Corrélation entre
Homogénat
Fractionparticulair
e
Fractioncytosoliqu
e
Homogénat
Fractionparticulair
e
Fractioncytosoliqu
eMasse de
PANS P=0,001 NS NS P=0,002 NS
PAradioactif
P=0,025 NS P=0,05 NS NS NS
NS : non significatif
IV- Effet de l'éthanol sur la production de PA et la stimulation des activités PDE
induites par le TPA.
Dans les cellules mononucléées humaines (Chapitre I de ce travail), la synthèse de PA induite
par le TPA est largement diminuée par l'éthanol. Les résultats présentés dans la Figure 27 indiquent
que, en plus de son effet inhibiteur sur la production de PA radioactif et en masse induite par le TPA
(Figures 27a et 27b), l'éthanol supprime totalement la hausse des activités PDE cytosoliques induite
par le TPA (Figure 27c) et réduit de 50% celle de la fraction
126
0,0
0,5
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
a
0
20
40
60
PA
(ng
/mill
ion
de c
ellu
les) b
c
0
10
20
30
40
Act
ivité
PD
E (
pmol
/min
/mg
prot
)
AMPc-PDE GMPc-PDE
Témoin+ TPA+ EtOH+ TPA + EtOH
Figure 27 : Effet de l'éthanol sur la synthèse de PA et l'activation des PDEs induites par leTPA.
Les cellules mononucléées marquées (a et b) ou non (c) à l'acide arachidonique tritié (voirMéthodes) ont été stimulées ou non pendant 15 min par le TPA (100 nM) en absence (témoin,+ TPA) ou en présence d'1% d'éthanol (+EtOH, +TPA +EtOH). En a et b, les lipides ont étéextraits des cellules plus milieu à la fin de la période d'incubation, et ont été séparés sur CCM.En c, les cellules ont été culotées, lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activitésPDE ont été dosées dans les fractions cytosoliques des cellules témoins ou activées. Lesrésultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides (a) ou bienen ng de PA/106 cellules (b) ou en activité PDE spécifique (pmol/min/mg de protéines) (c) etcorrespondent à une expérience effectuée en triple.
127
particulaire (résultats non montrés). Ainsi, lorsque la production de PA est diminuée dans les
cellules, la hausse d'activité PDE l'est également. Ce résultat est en faveur d'une participation
du PA dans l'activation des PDEs qui fait suite à la stimulation mitogénique des cellules
mononucléées humaines.
Dans le but de confirmer encore cette hypothèse, nous avons utilisé une autre méthode, décrite
dans le Chapitre I, permettant de diminuer la production de PA. Les cellules ont été stimulées
par la Con A en présence de l'inhibiteur de DAG-kinase, R59022.
V- Effet inhibiteur dose-dépendant du composé R59022 sur la production de PA et la
stimulation des activités PDE induites par la Con A.
Le prétraitement des cellules mononucléées humaines avec des concentrations
croissantes de l'inhibiteur de DAG-kinase R59022 (5 à 50 µM) diminue de manière dose-
dépendante à la fois la proportion de [3H]-AA-PA et la masse de PA dans les cellules activées
par la Con A (Figures 28a et 28b), ce qui est en accord avec les résultats présentés dans le
Chapitre I du présent travail, et avec ceux de la littérature (Aussel et al., 1992; El Bawab et
al., 1995). A la concentration intermédiaire de 10µM en R59022, l'effet de la Con A sur la
production de PA radioactif et sur la masse de PA est diminué de 30 et 60 % respectivement.
Simultanément, ce composé inhibe également de façon dose-dépendante la hausse des
activités PDE cytosoliques induite par la Con A (Figure 28c). En effet, l'activation de l'AMPc-
PDE cytosolique par la Con A est diminuée de 36, 42 et 80% par des concentrations en
R59022 de 5, 10 et 50µM, repectivement (Fig. 29). Enfin, l'inhibiteur de DAG-kinase
s'oppose de façon similaire à l'effet de la Con A sur les PDEs particulaires (résultats non
montrés).
VI- Effet du composé R59022 sur la prolifération des cellules mononucléées humaines
induite par la Con A.
Dans le but de corréler l'effet du composé R59022 sur la production de PA et les
activités PDE stimulées par la Con A à une réponse fonctionnelle, nous avons étudié l'effet de
ce composé sur la prolifération des cellules induite par la Con A.
D'une manière intéressante, le R59022 à la concentration de 10 µM est capable d'inhiber de
70% la prolifération des cellules mononucléées induite par la Con A, une inhibition totale
étant observée pour une concentration de R59022 de 50 µM (Figure 30).
Tous ces résultats sont en faveur de l'existence d'une corrélation positive entre les taux de PA
et la hausse d'activité PDE. De plus, lorsque la production de PA et les activités PDE sont
128
témoin+ R59022 50µM+ Con A+ Con A + R59022 5µM+ ConA + R59022 10µM+ ConA + R59022 50µM
0
10
20
PA
(ng
/mill
ion
de c
ellu
les)
b
*
*
*
0
1
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
a*
*
*
0
20
40
60
80
Act
ivité
PD
E (
pmol
/min
/mg
prot
) c
AMPc-PDE GMPc-PDE
*
*
**
*
*
Figure 28 : Effet de l'inhibiteur de DAG-kinase R59022 sur la synthèse de PA et l'activationdes PDEs induites par la Con A.
Les cellules mononucléées marquées (a et b) ou non (c) à l'acide arachidonique tritié (voirMéthodes) ont été préincubées pendant 10 min en absence (témoin, + ConA) ou en présencede 5, 10 ou 50 µM de R59022 (+R59022 50 µM, +Con A +R59022 5, 10 et 50 µM), puisstimulées ou non par la Con A (5µg/106 cellules) pendant 5 min. En a et b, les lipides ont étéextraits des cellules plus milieu à la fin de la période d'incubation, et ont été séparés sur CCM.En c, les cellules ont été culotées, lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activitésPDE ont été dosées dans les fractions cytosoliques des cellules témoins ou activées. Lesrésultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides (a) ou bienen ng de PA/106 cellules (b) ou en activité PDE spécifique (pmol/min/mg de protéines) (c) etreprésentent les moyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneursdifférents. * indique une différence significative par rapport au niveau stimulé par la Con A enabsence de R59022 (ANOVA, p<0,05).
129
0
20
40
60
80
100PA radioactifmasse de PAAMPc-PDEGMPc-PDE
[R59022] µM
Act
ivat
ion
rési
duel
le (
Effe
t de
la C
on A
en
abs
ence
de
R59
022
égal
à 1
00)
5 500 10
Figure 29 : Inhibition de l'effet stimulateur de la Con A en fonction de la concentration enR59022.Pour chaque concentration de R59022 utilisée, l'effet de la Con A sur la production de PAradiomarqué, la masse de PA et les activités AMPc et GMPc-PDE est comparé à l'effet de laCon A en absence de R59022 (égal à 100). Les valeurs sont issues de la Figure 28.
130
100806040200
Sans inhibiteur
+ 10 µM R59022
+ 50 µM R59022
Incorporation de [3H]thymidine (dpmx103)
+ ConA Témoin
Figure 30 : Inhibition de la réponse proliférative des cellules mononucléées à la Con A parl'inhibiteur de DAG-kinase R59022.
Les cellules mononucléées ont été cultivées dans du RPMI 1640 + 10% de SVF en absenceou en présence de 10 ou 50 µM de R59022 et en absence (témoin) ou en présence de 5 µg ConA/ml (+Con A). Après 48 heures, la thymidine tritiée est ajoutée et les cellules sont incubéespendant 18 heures avant d'être filtrées. La radioactivité des filtres est mesurée par scintillationliquide. Les résultats sont exprimés en dpm/puits et représentent les moyennes ± SE de 2expériences différentes réalisées avec 2 donneurs différents. Dans chaque expérience, chaquerésultat est la moyenne de six mesures.
131
diminuées dans les cellules mononucléées, la réponse proliférative des cellules est aussi
fortement diminuée. Cet argument est encore en faveur d'une activation des
phosphodiestérases par l'acide phosphatidique dans les cellules mononucléées, activation
conduisant à une diminution du taux intracellulaire d'AMPc, et autorisant une réponse
proliférative optimale. Dans le but de confirmer cette hypothèse, nous avons donc ensuite
étudié les variations des taux d'AMPc en présence de Con A ou d'OKT3.
VII- Variations des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées en fonction de la durée
de la stimulation par l'OKT3 ou la Con A.
Après une augmentation transitoire jusqu'à 15 min, le taux d'AMPc diminue
régulièrement jusqu'à plus de 60 min après la stimulation par la Con A (Figure 31). Dans les
cellules mononucléées au repos, le taux d'AMPc ne varie pas de manière significative au
cours de la période de temps considérée. Quand les cellules sont prétraitées avec 10µM de
R59022 pendant 10 min, puis stimulées par la Con A, l'augmentation initiale du taux d'AMPc
est beaucoup plus soutenue qu'en présence de Con A seule (5,5 vs 2,9 pmol/106 cellules à
15 min), et ne commence à décroître qu'à partir de 20 min de stimulation. De plus, les taux
d'AMPc mesurés dans les cellules prétraitées avec du R59022 sont significativement plus
élevés que ceux mesurés dans les cellules activées par la Con A seule, quel que soit le tempsde stimulation (sauf t0).
D'autre part, lorsque les cellules sont prétraitées avec 100 µM de Rolipram, un inhibiteur
puissant et sélectif des PDE4, pendant 30 min, puis stimulées par la Con A, la diminution du
taux d'AMPc commençant à 15 min n'est plus observée. Ce résultat suggère que la diminution
du taux d'AMPc induite par la Con A à partir de 15 min de stimulation pourrait être due à une
augmentation de son hydrolyse par les AMPc-phosphodiestérases.
Au contraire, dans les cellules mononucléées stimulées par l'OKT3, le taux d'AMPc
commence à diminuer dès le début de l'incubation sans période de latence (Figure 32). Cette
diminution est linéaire en fonction du temps au cours de la période considérée, atteint 20% au
bout de 20 min et 32% à 50 min. Des analyses de regression linéaires montrent une pente
significativement inférieure à zéro, p<0,01.
Ces résultats suggèrent donc que la hausse de PA qui fait suite à l'activation mitogénique des
cellules mononucléées par la Con A ou l'OKT3 pourrait être responsable de l'activation des
PDEs, et ainsi d'une diminution des taux d'AMPc.
132
604020000
2
4
6
8
10
+ ConA+ ConA + R59022+ ConA + Rol
Temps (min)
AM
Pc
(pm
ol/m
illio
n de
cel
lule
s)
** * * * * *
*
Figure 31 : Cinétique de variation des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées stimulées par laCon A seule (+ Con A) ou en présence (+ Con A + Rol) de 100 µM de Rolipram ou en présence (+Con A + R59022) de 10 µM de R59022.
Les cellules mononucléées ont été stimulées par la Con A en absence ou en présence de Rolipram(100 µM) ou de R59022 (10 µM) pendant les périodes de temps indiquées. A la fin de l'incubation, lescellules ont été placées pendant 2 min au bain-marie à 100°C, puis les taux d'AMPc ont été mesuréspar RIA comme décrit dans Méthodes. Les résultats sont exprimés en pmol/106 cellules etreprésentent la moyenne ± SE de 3 à 5 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents.* indique une différence significative par rapport au taux d'AMPc mesuré à 15 min. A chaque temps(sauf t0), le taux d'AMPc mesuré en présence de R59022 est significativement différent de celuimesuré en présence de Con A seule.
133
0,4
0,6
0,8
1
1,2
AM
Pc
(pm
ol/M
illio
n de
cel
lule
s)
0 10 20 30 40 50 60
Temps (min)
Témoin
+ OKT3
Figure 32 : Diminution des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées stimulées parl'OKT3.
Les cellules mononucléées ont été stimulées par l'anticorps anti-CD3 (30ng/ml) pendant lespériodes de temps indiquées. A la fin de l'incubation, les cellules ont été placées pendant 2min au bain-marie à 100°C, puis les taux d'AMPc ont été mesurés par RIA comme décrit dansMéthodes. Les résultats sont exprimés en pmol/106 cellules et représentent la moyenne ± SEde 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Des analyses de regressionlinéaire des valeurs indiquent une pente significativement inférieure à zéro, P<0,01.
134
VIII- Etude pharmacologique des isoformes de PDE stimulées par les différents
agonistes dans les cellules mononucléées.
Les activités AMPc-PDE et GMPc-PDE, mesurées dans les différentes fractions
cellulaires sont la résultante des activités d'une ou plusieurs isoformes fonctionnant
simultanément. Cependant, l'existence d'inhibiteurs extremement puissants et sélectifs de l'une
ou l'autre famille de PDE permet d'envisager des approches pharmacologiques simples pour
répondre aux questions sur l'identité des isoformes de PDE concernées.
Dans le but d'étudier quelles isoformes d'AMPc-PDE sont stimulées par les trois agonistes,
l'activité AMPc-PDE de l'homogénat total de cellules témoins ou stimulées par les différents
agonistes a été testée en présence de concentrations croissantes (10-9 M à 10-4 M) de
l'inhibiteur sélectif de PDE4, Rolipram. Ce composé est connu pour inhiber les PDE4recombinantes avec des IC50 de l'ordre de 10-7 M, une inhibition totale étant toujours obtenue
à la concentration de 10-5 M. Dans l'homogénat des cellules témoins, le Rolipram à la
concentration de 10-5M inhibe l'activité AMPc-PDE de 35% (Tableau 7), ce qui indique que
la PDE4 représente une faible part de l'activité totale d'hydrolyse de l'AMPc dans ces cellules.
Ce résultat est en accord avec ceux décrits par Robicsek et al. (1991) pour les lymphocytes T
et par Erdogan et Houslay (1997) pour les cellules de Jurkat. Comme le montrent les résultats
présentés dans le Tableau 7, la Con A stimule de manière identique l'activité d'hydrolyse de
l'AMPc sensible au Rolipram et celle qui est insensible au Rolipram. Au contraire, l'OKT3
stimule préférentiellement la PDE4 sensible au Rolipram (36 vs 13%), alors que le TPA estplus actif sur l'activité PDE insensible au Rolipram. Cependant, la valeur d'IC50 pour le
Rolipram n'est pas modifiée de manière significative quel que soit le traitement (2,16 ± 0,28 x
10-7 M, n=4).
L'inhibiteur sélectif de PDE2, l'EHNA, n'inhibe que faiblement (15-20%) l'activité AMPc-
PDE des cellules mononucléées, en absence ou en présence de GMPc 10-5 M et quel que soit
l'agoniste utilisé (résultats non montrés). Ces résultats sont en bon accord avec ceux de la
littérature qui montrent que la PDE2 est pratiquement absente des lymphocytes humains ou
des cellules de Jurkat (Erdogan et Houslay, 1997) alors qu'elle est bien présente dans les
thymocytes (Valette et al., 1990; Marcoz et al., 1993 a et b; Michie et al., 1996).
Enfin, l'activité d'hydrolyse du GMPc des homogénats de cellules mononucléées est fortement
inhibée (70-80%) par l'inhibiteur sélectif de PDE5, le M&B 22948. En présence de 10-4 M de
M&B 22948, l'activation de la PDE5 induite par la Con A, l'OKT3 et le TPA est totalement
abolie (résultats non montrés). Ces résultats montrent que la PDE5 assure la quasi totalité de
l'hydrolyse du GMPc dans les cellules mononucléées et qu'elle est la cible principale des trois
agonistes.
135
Tableau 7 : Identification pharmacologique des activités AMPc-PDE stimulées par la Con A,l'OKT3 et le TPA dans les cellules mononucléées humaines.
Traitementcellulaire
Activité AMPc-PDEtotale
(pmol/min/mg prot)
Activité AMPc-PDEinhibée par 10-5M de
rolipram
(pmol/min/mg prot)
Activité AMPc-PDEinsensible à 10-5M de
rolipram
(pmol/min/mg prot)témoin 29,76 ± 1,26 10,32 ± 0,77 19,43 ± 0,57
+ ConA 35,89 ± 1,97(+ 20,6%)
12,68 ± 0,80(+22,9%)
23,22 ± 2,74(+19,5%)
+ OKT3 35,99 ± 1,18(+ 20,9%)
14,04 ± 0,43(+36,0%)
21,94 ± 1,49(+12,9%)
+ TPA 36,98 ± 2,30(+24,3%)
12,72 ± 0,78(+23,2%)
25,29 ± 2,77(+30,2%)
Les cellules mononucléées ont été incubées pendant 5 min en absence (témoin) ou enprésence de Con A (5 µg/106 cellules), ou de l'anticorps anti-CD3 (30 ng/ml), ou incubéespendant 15 min en présence de 100 nM de TPA. A la fin de la période d'incubation, lescellules ont été culotées, lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activités PDE ontété mesurées sur l'homogénat total en utilisant 0,25 µM d'AMPc comme substrat en absenceou en présence de 10-5 M de rolipram. Les résultats sont exprimés en pmol d'AMPchyrdolysées/min/mg de protéines, et représentent les moyennes ± SE de 2 expériencesréalisées en triple. Les valeurs entre parenthèses indiquent le pourcentage d'activation induitpar chaque agoniste.
136
VIII- Discussion.
Dans cette étude, nous avons montré qu'il existe une corrélation étroite entre les taux
de PA et les activités PDE dans les cellules mononucléées humaines. En effet, les trois
agonistes utilisés pour augmenter la production d'arachidonoyl-PA et de PA en masse sont
aussi capables de stimuler les activités AMPc et GMPc-PDE mesurées dans les mêmes
préparations cellulaires. A la fois le PA formé par activation directe de la voie PLD dans les
cellules stimulées par la TPA, et le PA provenant de la voie PI-PLC/DAG-kinase dans les
cellules stimulées par la Con A ou l'anticorps anti-CD3 peuvent être associés à une
augmentation des activités PDE. De plus, les drogues capables de diminuer la synthèse de PA,
telles que l'inhibiteur de DAG-kinase (R59022) dans les cellules stimulées par la Con A ou
l'éthanol dans les cellules stimulées par le TPA suppriment l'activation des PDE dans ces
cellules.
Une activation des PDE est très probablement responsable de la diminution des taux d'AMPc
dans le temps, observée dans les cellules stimulées par la Con A ou l'OKT3. Dans les cellules
activées par la Con A, la hausse transitoire du taux d'AMPc qui atteint son maximum après
15 min est probablement sans relation avec les propriétés mitogéniques de la lectine, comme
cela a été décrit par Kammer (1988), et résulte sûrement d'une augmentation de la synthèse de
l'AMPc induite par des liaisons non spécifiques à des glycoprotéines de surface. Après cette
période de 15 min, le taux d'AMPc diminue régulièrement et atteint une différence
significative à partir de 30 min. Cette durée correspond à l'activation maximale de l'AMPc-
PDE par la Con A observée dans des expériences de cinétique (Meskini et al., 1992). Dautre
part, aucune diminution du taux d'AMPc n'a pu être observée quand les cellules mononucléées
ont été stimulées par la Con A en présence de l'inhibiteur spécifique de PDE4, Rolipram, ce
qui renforce l'hypothèse que l'activation de l'AMPc-PDE joue un rôle crucial dans le maintien
du faible taux d'AMPc nécessaire à la réponse proliférative.
Un autre argument en faveur de cette hypothèse a été obtenu dans les expériences effectuées
en présence de l'inhibiteur de DAG-kinase, R59022. Cet inhibiteur, qui diminue de manière
dose-dépendante la synthèse de PA induite par la Con A, ainsi que l'activation des PDE
(Figures 28 et 29), et qui supprime entièrement la réponse proliférative des cellules
mononucléées à la Con A (Figure 30) est capable d'augmenter le taux intracellulaire d'AMPc.
Contrairement à la Con A, l'anticorps monoclonal anti-CD3 n'induit pas de hausse d'AMPc
intracellulaire, même de manière transitoire, ce qui est en accord avec les observations du
groupe de Kammer (Kammer et al., 1988). Dans les cellules stimulées par l'OKT3, le taux
d'AMPc diminue progressivement au cours du temps en dessous du niveau basal tout au long
de la période considérée. Ces résultats sont en accord avec l'hypothèse que même une
diminution modeste de l'activité AMPc-PDE est suffisante pour assurer une baisse
significative du taux d'AMPc intracellulaire.
137
Même si l'observation d'une augmentation concomitante des taux de PA et des activités PDE
dans les cellules mononucléées n'est pas en soi une preuve suffisante d'une relation de cause à
effet entre ces deux événements, plusieurs arguments étayent l'hypothèse d'un effet direct de
la hausse de PA intracellulaire sur les activités PDE dans les cellules stimulées par la Con A,
l'OKT3 ou le TPA : (1) la hausse de PA et l'activation des PDE se produisent avec des
cinétiques similaires. Dans le Chapitre I, nous avons montré que la synthèse de PA induite par
la Con A est maximale à 5 min, alors que l'activation des PDE se maintient jusqu'à 30 min
avant de décliner (Meskini et al., 1992), (2) des corrélations significatives ont pu être établies
entre d'une part la quantité de PA marqué, qui représente surtout des espèces de PA contenant
de l'acide arachidonique, et l'activité AMPc-PDE cytosolique, et d'autre part entre la masse de
PA et les activités AMPc et GMPc-PDE de la fraction particulaire, (3) quelle que soit la voie
de formation du PA, les drogues capables de bloquer l'augmentation du taux de PA dans les
cellules stimulées sont également capables de prévenir l'activation des PDE.
L'ensemble de ces résultats suggère fortement que le PA est impliqué, directement ou
indirectement, dans la régulation des activités PDE, et que cette régulation des activités PDE
par le PA doit avoir une importance physiologique au cours de l'activation lymphocytaire.
Plusieurs mécanismes peuvent être considérés pour expliquer l'effet stimulateur du PA
sur les activités PDE. Il est connu que l'activité PDE4 spécifique de l'AMPc est assez
abondante dans les cellules mononucléées humaines (Essayan et al., 1994), les lymphocytes T
(Robicsek et al., 1991; Tenor et al., 1995), et dans les cellules de Jurkat (Erdogan et Houslay,
1997). Récemment, Némoz et al. (1996) ont montré la présence de protéines correpondants
aux PDE4D1, PDE4D2 et PDE4A5 par "western-blotting" dans des extraits de PBMC
humaines. D'autre part, il a été montré, en système acellulaire, que le PA pouvait stimuler par
interaction directe la PDE4A5, qui correspond à un variant long exprimé à partir du gène
PDE4A (Némoz et al., 1997). Ainsi, une interaction directe du PA synthétisé en réponse à
l'activation cellulaire, avec l'isorforme de PDE4 sensible au PA pourrait contribuer à
l'augmentation de l'hydrolyse de l'AMPc observée dans les cellules stimulées. De plus, étant
donné que l'activation de la PDE par le PA in vitro est instantanée, notre hypothèse est
compatible avec les cinétiques observées pour les augmentations du taux de PA et d'activité
PDE dans les cellules mononucléées stimulées. Cependant, les expériences que nous avons
effectuées en présence de Rolipram indiquent que la PDE4 n'est pas la seule activité
d'hydrolyse de l'AMPc à être augmentée au cours de l'activation cellulaire. D'autre part,
l'activité GMPc-PDE des cellules activées est également augmentée. Enfin, étant donné que le
PA n'a pas d'effet direct in vitro sur les enzymes appartenant aux autres familles de PDE
(Marcoz et al., 1993; Savany et al., 1996), il paraît assez clair que les activations des PDE
induites par le TPA, la Con A ou l'OKT3 doivent probablement impliquer d'autres
mécanismes, reliés ou non à l'augmentation du taux de PA.
Dans les cellules traitées par la Con A, l'augmentation transitoire du taux d'AMPc qui précède
138
la diminution pourrait être suffisante pour activer une protéine kinase dépendante de l'AMPc
(PKA). Cette enzyme phosphoryle et active les enzymes de la famille des PDE3, ainsi que
certaines isoformes de la famille des PDE4 (Conti et al., 1995). Cependant, l'inhibition
importante par le R59022 de l'activation des PDE par la Con A suggère qu'un tel mécanisme
dépendant de l'AMPc ne peut que contribuer faiblement à l'effet total de la Con A.
Contrairement aux résultats obtenus dans les cellules traitées à la Con A, aucune
augmentation du taux d'AMPc n'a pu être détectée dans les cellules mononucléées traitées à
l'OKT3. Par conséquent, dans les cellules stimulées par l'OKT3, un mécanisme de
phosphorylation dépendant de l'AMPc peut raisonnablement être exclu. D'une manière
intéressante, Michie et al. (1996) ont décrit récemment une augmentation soutenue de
l'activité PDE4 dans des thymocytes de souris stimulés pendant plus de 20 min avec à la fois
un anticorps anti-CD3 et un anticorps anti-TCR. Bien que ces auteurs n'aient pas déterminé
les mécanismes impliqués dans ce phénomène, il est assez tentant de penser que les deux
anticorps ont pu augmenter la production d'acide phosphatidique dans ces cellules.
Il a déjà été décrit que le traitement de cellules intactes ou de tissus par l'ester de phorbol TPA
stimule l'activité PDE. Par exemple, l'addition de 10 µM de TPA à des fractions cytosoliques
préparées à partir de coeurs hypertrophiés de hamster syriens stimule l'activité d'hydrolyse de
l'AMPc dans ces préparations (Lee et al., 1994). D'autres études du même groupe ont montré
que cette stimulation ne concerne que l'enzyme qui dépend du complexe
calcium/calmoduline, la PDE1 (Yu et al., 1996) et implique un mécanisme dépendant de la
PKC (Cai et Lee, 1996). Le traitement de cellules CHO avec le TPA conduit également à une
augmentation transitoire de l'activité PDE1, qui atteint un maximum au bout de 13 heures
avant de diminuer (Spence et al., 1995). D'autre part, dans des cellules transfectée avec la
PKCα, l'activation de la PDE1 est maximale après 1 heure de stimulation par le TPA et est
atténuée par l'actinomycine D, ce qui suggère l'existence d'une régulation dépendante de la
PKC au niveau transcriptionnel. Dans les cellules mononucléées humaines non transformées,
les enzymes de la famille des PDE1 ne sont pas exprimées de manière constitutive, mais
seulement induites par des traitements de longue durée par des mitogènes (Jiang et al., 1996).
En bon accord avec ces données, nous n'avons détecté aucune activité PDE1 quel que soit
l'agoniste utilisé pour stimuler les PBMC au cours de la période de temps étudié (5-15 min).
La plupart des travaux relatifs à l'effet du TPA sur les activités PDE décrivent une activation
des PDE1 par un mécanisme PKC dépendant. Cependant, le TPA est aussi décrit comme un
stimulateur de l'activité PDE4 sensible au Rolipram dans les tubules renaux de rat (Tetsuka et
al., 1995). La question reste posée de savoir si dans les cellules mononucléées humaines
l'activation par le TPA des activités AMPc et GMPc-PDE nécessite l'activation des PKC. Il
est connu que l'isoforme PKCζ ne répond pas au DAG et au esters de phorbol, mais peut être
fortement stimulée par le PA (Limotola et al., 1994). De plus, cette isoforme semble
ubiquitaire (Nishizuka, 1995). Ainsi, le TPA pourrait stimuler les PDE par une activation de
la PKCζ induite par le PA. Quels que soient les mécanismes impliqués, les résultats de notre
139
étude montrent clairement qu'une hausse du taux de PA intracellulaire est nécessaire à
l'activation des PDEs par le TPA puisque cette activation est complètement supprimée en
présence d'éthanol.
L'ensemble de ces résultats montre que l'augmentation de la synthèse de PA dans les cellules
mononucléées s'accompagne d'une activation importante des enzymes hydrolysant l'AMPc et
le GMPc. Bien qu'un effet activateur direct du PA par des interactions lipide-protéine n'ait pu
être démontré que dans le cas de la PDE4, il est clair que dans les cellules mononucléées
humaines, le PA stimule également la PDE3 et la PDE5. Le PA est produit de manière très
précoce au cours de l'activation des lymphocytes, et a des effets mitogéniques propres. Même
si la signification physiologique de la régulation des activités PDE par le PA n'est pas encore
bien comprise, elle semble faire partie d'un mécanisme permettant de maintenir le taux de
nucléotides cycliques en dessous d'un seuil nécessaire à une réponse lymphoproliférative
optimale.
140
CHAPITRE III
Modulation de la production d'acide phosphatidique parl'acide 12(S)-hydroxyeicosatétraénoïque (12(S)-HETE).
Le dernier chapitre de ce travail a consisté à étudier la relation PA-PDE dans un
modèle expérimental mimant une situation physiologique particulière, le vieillissement. Des
travaux antérieurs de notre équipe ont montré que l'activation des PDEs et la prolifération
induites par la Con A dans les cellules mononucléées humaines étaient diminuées avec l'âge.
D'autre part, il est connu qu'un dérivé monohydroxylé issu de l'acide arachidonique par la voie
lipoxygénasique, le 12(S)-HETE, est produit en quantité plus importante dans les cellules
mononucléées de personnes âgées par rapport à celles de témoins jeunes. Par ailleurs, ce
composé inhibe l'activation des PDEs par la Con A et la réponse lymphoproliférative lorsqu'il
est apporté de façon exogène à des cellules de témoins jeunes. De plus, ce composé est décrit
comme un inhibiteur de DAG-kinase dans les cellules endothéliales (Friedlander et al., 1990;
Setty et al., 1987). Tous ces résultats suggèrent que chez les personnes âgées, le maintien d'un
taux basal élevé de 12(S)-HETE pourrait conduire à une diminution du taux de PA synthétisé.
Nous nous sommes donc proposés de déterminer si cette accumulation de 12(S)-HETE dans
les cellules mononucléées pouvait être responsable d'une diminution de la production de PA
par inhibition d'une DAG-kinase ou pouvait conduire à la production d'espèces moléculaires
particulières de PA (contenant du 12(S)-HETE, par exemple) incapables de transmettre
correctement le signal mitogénique.
Des travaux réalisés dans notre équipe ont montré que les cellules mononucléées
humaines peuvent incorporer de façon dose-dépendante du 12(S)-HETE radiomarqué dans
leurs phospholipides, majoritairement dans les phosphatidylcholines (80% de la radioactivité
liée aux lipides totaux). La capture du 12(S)-HETE est rapide, maximale dès la 30ème minute
d'incubation, et la radioactivité liée aux PL reste stable lorsque l'incubation est prolongée
141
jusqu'à 18 heures. D'autre part, la quantité de 12(S)-HETE estérifiée dans les PL peut être
augmentée en incubant les cellules avec plusieurs charges successives de 12(S)-HETE.
Joulain et al. (1995) ont ainsi montré que l'apport de [3H]-12(S)-HETE en trois charges
successives de 1 µM pendant 30 min, permet de multiplier la radioactivité liée aux PL totaux
par 6 et celle liée aux PC par 11, par comparaison aux résultats obtenus après une seule charge
de 1 µM pendant 1 heure. Nous avons donc utilisé ce procédé mis au point dans l'équipe pour
obtenir un enrichissement important des PL en 12(S)-HETE, les cellules témoins subissant le
même cycle d'incubation à 37°C en présence du véhicule.
I- Effet du 12(S)-HETE sur la production de DAG et de PA par les cellules
mononucléées humaines stimulées ou non par la Con A.
Tableau 8 : Effet du 12(S)-HETE sur la production de [3H]-DAG par les cellulesmononucléées humaines stimulées ou on par la Con A.
Production basale de [3H]-
DAG
Production de [3H]-DAG
induite par la Con A
% de la radioactivité liée aux lipides totaux
Cellules non traitées 0,634 ± 0,078 0,600 ± 0,057
Cellules enrichies en
12(S)-HETE
0,614 ± 0,070 0,400 ± 0,043 *
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12-HETE, puisont été marquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes) et incubées en absence ou enprésence de Con A (5 µg/106 cellules ) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés enpourcentage de la radioactivité liée aux lipides totaux et représentent la moyenne ± SEM de 7expériences différentes réalisées avec 7 donneurs différents. Les valeurs ont été comparées partest de t de Student apparié. * indique une différence significative par rapport au témoin nonstimulé par la Con A (p=0,024).
142
Ces résultats sont en désaccord avec l'hypothèse de l'inhibition d'une DAG-kinase par le12(S)-HETE, et montrent au contraire une diminution de la proportion relative de [3H]-DAGdans les cellules mononucléées stimulées par la Con A. Nous avons donc étudié en parallèlel'effet de l'enrichissement en 12(S)-HETE des cellules mononucléées humaines sur laproduction de PA induite ou non par la Con A.
Quand les cellules mononucléées humaines sont enrichies en 12(S)-HETE inerte, puis
marquées par de l'acide arachidonique à dose traceuse, la proportion de PA-[3H]-AA n'est pas
significativement modifiée par rapport aux cellules témoins en absence de Con A. La
radioactivité liée au PA représente 0,61% de la radioactivité liée aux PL totaux dans les
cellules témoins et 0,60% dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE.
En présence de Con A, la production de PA-[3H]-AA est significativement augmentée aussi
bien dans les cellules contrôles que dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE (Figure 33a).
L'effet stimulateur de la Con A sur la production de PA-[3H]-AA observé dans les cellules
traitées par le 12(S)-HETE (+252%) n'est pas significativement différent de celui noté dans
les cellules témoins (+300%).
Par contre, le 12(S)-HETE potentialise la synthèse de PA en masse induite par la Con A de
manière significative (P<0,01) (Figure 33b). En effet, dans les cellules témoins, la Con A
provoque une hausse de la quantité de PA de 258% (basal : 10,4 ± 1,5 vs stimulé : 37,3 ±5,0
ng/106 cellules), alors que dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE l'augmentation due à la
Con A est de 287% (basal : 17,2 ± 3,4 vs stimulé : 66,6 ± 8,8 ng/106 cellules).
La synthèse de PA induite par la Con A est donc significativement plus élevée dans les
cellules enrichies en 12(S)-HETE que dans les cellules témoins (66,6 vs 37,3 ng/106 cellules,
P<0,01).
Ces résultats, en accord avec ceux obtenus dans les expériences étudiant les variations de [3H]-DAG,
confirment que dans ce modèle cellulaire le 12(S)-HETE n'inhibe pas l'activité DAG-kinase. La
hausse du taux de PA observée après stimulation par la Con A des cellules prétraitées au 12(S)-HETE
est en désaccord avec l'hypothèse d'une diminution de la production de PA impliquée dans l'effet
antimitogénique du 12(S)-HETE. Nous avons alors essayé de déterminer si l'enrichissement des
phospholipides cellulaires en 12(S)-HETE pouvait être responsable d'une production d'espèces
moléculaires de PA modifiées, contenant par exemple du 12(S)-HETE.
II- Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par les cellules
mononucléées marquées au [3H]-12(S)-HETE, en présence ou non de Con A.
Après enrichissement des cellules mononucléées humaines en [3H]-12(S)-HETE, une
quantité appréciable de radioactivité se trouve associée au PA (2,66% de la radioactivité liée
aux PL totaux) alors que seulement 0,46% de la radioactivité est liée au PA dans les cellules
143
- ConA
+ ConA
*
*
0
1
2
3
PA
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
+252%
+300%
a
Témoin + 12(S)-HETE 3x1µM
*
0
20
40
60
80
PA
form
é (n
g/m
illio
n de
cel
lule
s)
*
+258%
+287%
†
b
Témoin + 12(S)-HETE 3x1µMFigure 33 : Effet du 12(S)-HETE sur la production d'acide phosphatidique induite par la Con A dansles cellules mononucléées humaines.
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE, puismarquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes) et incubées en absence ou en présence deCon A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage de laradioactivité liée aux phospholipides (a) ou en ng de PA formé/106 cellules (b), et représentent lamoyenne ± SEM de n expériences différentes réalisées avec n donneurs différents (n=14 pour lescellules témoins et 8 pour les cellules traitées). Les valeurs ont été comparées par analyse de variance(ANOVA STATVIEW II) et par le test de t protégé (Fisher).* indique une différence significative par rapport au groupe non stimulé (P<0,01); † indique unedifférence significative par rapport au groupe stimulé par la Con A et non traité par le 12(S)-HETE(P<0,01).
144
0,0
0,1
0,2
0,3
[3H
]12(
S)-
HE
TE
-PA
(pm
ol/m
illio
n de
cel
lule
s)
a
Basal + Con A
Basal + Con A0
20
40
60
80
100
120
140
PA
tota
l (pm
ol/m
illio
n de
cel
lule
s) b
Figure 34 : Formation de [3H]-12(S)-HETE-PA dans les cellules mononucléées marquéesavec du [3H]-12(S)-HETE et stimulées par la Con A.
Les cellules mononucléées ont été marquées par 3 charges successives (30 min) de [3H]-12(S)-HETE 1 µM. Après lavages, les cellules ont été incubées pendant 5 min en absence(basal) ou en présence de Con A (5 µg/106 cellules) (+ Con A). Les résultats sont exprimés enpmol de [3H]-12(S)-HETE-PA synthétisé/106 cellules (a) ou en pmol de PA total/106 cellules(b) et représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences différentes réalisées avec 5 donneursdifférents. Les moyennes ont été comparées par test de t de Student apparié.En (a), P=0,025; en (b), P=0,014.
145
marquées à l'acide arachidonique tritié (Figure 34). Lorsque les cellules mononucléées sont
marquées avec du [3H]-12(S)-HETE, plus de 80% de la radioactivité associée aux
phospholipides est retrouvée sous forme de 12(S)-HETE non modifié (Joulain et al., 1995).
Par conséquent, la radioactivité associée au PA dans nos expériences correspond
probablement à du [3H]-12(S)-HETE non transformé. Etant donnée la radioactivité spécifique
du [3H]-12(S)-HETE, la quantité de PA marqué est évaluée à 0,09 ± 0,03 pmoles/106 cellules
alors que la masse totale de PA représente 22,7 ± 3,0 pmoles/106 cellules. Ainsi, dans les
cellules au repos, le PA contenant du 12(S)-HETE représente environ 0,4% du PA total
(Figure 34). Sous stimulation par la Con A, le PA marqué au [3H]-12(S)-HETE est faiblement
mais significativement augmenté (+54%, P=0,025), alors que la masse totale de PA augmente
de 300% (P=0,014), ce qui fait que le PA contenant du 12(S)-HETE correspond à 0,15% du
PA total. Dans les cellules stimulées par la Con A, la hausse du taux de PA marqué est
accompagnée d'une diminution significative de la radioactivité associée à la fraction PI/PS
(13,6 ± 1,8% dans les cellules contrôles vs 10,7 ± 1,1% dans les cellules activées par la Con
A, P=0,028), alors que celle associée aux PC ne varie pas de manière importante (69,1 ± 3,5%
dans les cellules témoins vs 69,9 ± 3,6% dans les cellules activées par la Con A). Ces résultats
indiquent que les espèces moléculaires de PA contenant du 12(S)-HETE proviennent surtout
du pool des PI sous stimulation par la Con A, et que dans le même temps, la masse de PA
issue d'un pool phospholipidique peu marqué est fortement augmentée. Ces résultats
conduisent à plusieurs conclusions.
Tout d'abord, la proportion relative d'espèces moléculaires de PA contenant du 12(S)-HETE
est plus faible dans les cellules stimulées par la Con A que dans les cellules non stimulées. Ce
résultat indique qu'il n'y a pas d'enrichissement du PA en espèces moléculaires contenant du
12(S)-HETE lors de l'activation par la Con A. Cependant, la composition en espèces
moléculaires du PA synthétisé après enrichissement en 12(S)-HETE et stimulation par la Con
A peut quand même être modifiée par rapport à celle du PA produit sous stimulation par la
Con A dans les cellules non enrichies.
Pour répondre à cette question, nous avons analysé par chromatographie en phase gazeuse la
composition en acides gras des PA isolés à partir de cellules non enrichies en 12(S)-HETE
stimulées ou non par la Con A, et à partir de cellules enrichies en 12(S)-HETE et stimulées.
III- Composition en acides gras du PA produit par les cellules mononucléées enrichies
ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A.
Comme notre équipe l'a déjà observé dans les thymocytes de rat (El Bawab et al.,
1995), les acides gras saturés représentent plus de 50% des acides gras totaux du PA présent
dans les cellules non stimulées (Tableau 9).
146
Tableau 9 : Composition en acides gras du PA dans les cellules témoins et dans les cellulesstimulées par la Con A enrichies ou non en 12-HETE.
Quantité dans
Acide grasCellules témoins Cellules non
enrichies en 12(S)-
HETE stimulées par
la Con A
Cellules enrichies en
12(S)-HETE
stimulées par la
Con A
mol/100mol
16:0 29,7 ± 2,0 22,1 ± 1,9 a 27,1± 1,4
18:0 28,9 ± 2,4 35,1 ± 2,5 40,9 ± 3,0 a
18:1(9) 20,9 ± 2,4 17,1 ± 1,6 18,0 ± 3,8
18:2(9,12) 9,4 ± 2,0 9,6 ± 1,8 5,5 ± 0,2
20:4(5,8,11,14) 11,2 ± 1,9 16,2 ± 2,2 8,4 ± 1,5 b
•n-6 20,6 ± 3,5 25,8 ± 3,5 13,9 ± 1,5 b
• sat 58,6 ± 3,8 57,1 ± 3,6 68,0 ± 3,1 c
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12-HETE(1 µM), puis marquées avec de l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes). Après lavages, lescellules ont été incubées en absence ou en présence de Con A (5 µg/106 cellules). Les résultatscorrespondent aux moyennes ± SEM obtenues dans 7 expériences différentes réalisées avec 7donneurs différents. Les valeurs ont été comparées par le test de t de Student apparié.
a Différent par rapport à la valeur obtenue dans les cellules témoins, P•0,02.b Différent par rapport à la valeur obtenue dans les cellules non enrichies en 12-
HETE stimulées par la Con A, P•0,02.c Différent par rapport à la valeur obtenue dans les cellules non enrichies en 12-
HETE stimulées par la Con A, P=0,05.
147
Dans les cellules non-enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A, la quantité relative
d'acide palmitique est diminuée significativement (-26%, P•0,02) alors que les proportions
d'acides stéarique et arachidonique tendent à augmenter (+20 et +44%, respectivement). Dans
les cellules enrichies en 12(S)-HETE, on n'observe pas du tout les mêmes variations de la
composition en acides gras sous stimulation par la Con A. En particulier, la proportion d'acide
palmitique n'est pas diminuée du tout par la Con A, alors qu'une hausse significative de la
proportion d'acide stéarique est observée (+42%, P•0,02). De plus, la quantité relative d'acide
arachidonique n'est plus augmentée par la Con A dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE,
et semble même diminuée. Ainsi, la composition en acides gras du PA synthétisé sous
stimulation par la Con A diffère énormément selon que les cellules ont été enrichies ou non en
12(S)-HETE. Dans les cellules stimulées par la Con A et enrichies en 12(S)-HETE, le PA
contient moins d'acide arachidonique (-48%, P•0,02) et d'acides gras polyinsaturés de la série
n-6 (-45%, P•0,02) que les cellules non enrichies, et plus d'acides gras saturés (+19%,
P•0,05). Ce résultat confirme l'hypothèse de l'activation par le 12(S)-HETE d'une voie de
production du PA autre que celle stimulée par la Con A seule. Nous avons donc étudié la
possibilité de l'implication d'une voie PLD dans ce phénomène.
IV- Implication d'une voie Phospholipase D dans la production de PA induite par le
12(S)-HETE.
Dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE, la hausse de la masse de PA induite par la Con A
est significativement plus importante que dans les cellules non traitées. Ce résultat suggère que le
12(S)-HETE pourrait induire un voie de formation du PA supplémentaire, qui ne serait pas activée
par la Con A seule. Pour tester l'hypothèse de l'activation d'une PLD, la production de PA induite par
la Con A a été évaluée en présence de 1% d'éthanol, dans les cellules enrichies ou non en 12(S)-
HETE, et comparée à celle induite par l'ester de phorbol TPA. Les résultats présentés dans la Figure
35 (a et b), en accord avec ceux du Chapitre I, montrent que, dans les cellules non-enrichies en 12(S)-
HETE, la synthèse de PA induite par la Con A n'est pas altérée par la présence d'éthanol, qu'elle soit
évaluée en % de la radioactivité liée aux phospholipides totaux ou en masse. Au contraire, dans les
cellules enrichies en 12(S)-HETE, la hausse de PA en masse induite par la Con A est
significativement diminuée (-63%) en présence d'éthanol (Figure 35b). Parallèlement, la proportion
de PA marqué à l'acide arachidonique tritié est peu diminuée (-36%, non significatif). Des résultats
similaires sont obtenus quand les cellules sont stimulées avec 100nM de TPA.
Puisque la diminution du taux de PA qui se produit au cours de la réaction de transphosphatidylation
est accompagnée d'une synthèse de phosphatidylalcool, des expériences ont été effectuées dans le but
d'évaluer la production de phosphatidylalcool marqué à l'acide arachidonique tritié à la fois dans les
cellules témoins et les cellules enrichies en 12(S)-HETE
148
+ EtOH
- EtOH
3210PA (% de la radioactivité liée aux PL totaux)
- 30%
- 36%
- 36% aTémoin
Con A
12(S)-HETE
12(S)-HETE + Con A
TPA
140120100806040200
PA formé (ng/million de cellules)
- 52%
- 63%
b
*
*
Témoin
Con A
12(S)-HETE
12(S)-HETE + Con A
TPA
Figure 35 : Effet de l'éthanol sur la production d'acide phosphatidique basale ou induite par unagoniste dans les cellules mononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE.
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE, puismarquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes). Les cellules traitées ou non par le 12(S)-HETE ont été incubées 10 min en absence ou en présence de 1% d'éthanol, puis stimulées ou non parla Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min. Dans les expériences utilisant le TPA, les cellules ont étéstimulées par le TPA (100nM) pendant 15 min en absence ou en présence d'éthanol 1%. Pour tous leséchantillons, la durée totale d'incubation est de 15 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage dela radioactivité liée aux phospholipides (a) ou en ng de PA formé /106 cellules (b) et représentent lesmoyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Les valeurs ontété comparées par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II) et par le test de t protégé (Fisher).* indique une différence significative par rapport à la valeur de l'essai sans éthanol, P<0,01.
149
0
1000
2000
3000
4000
- EtOH
+ EtOH
Pho
spha
tidyl
étha
nol (
dpm
/ess
ai) *
Con A 12(S)-HETE +Con A
a
0
1000
2000- BuOH
+ 1-BuOH
+ 2-BuOH
*
12(S)-HETE+Con A
Pho
spha
tidyl
buta
nol (
dpm
/ess
ai)
b
Figure 36 : Effets d'alcools primaires et secondaire sur la production de phosphatidylalcoolsmarqués à l'acide arachidonique tritié induite par la Con A dans des cellules mononuclééeshumaines enrichies en 12(S)-HETE.
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE,puis marquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes). Les cellules enrichies en12(S)-HETE ont été incubées pendant 10 min en absence ou en présence de 1% d'éthanol (a),de 1% de butanol-1 ou de 1% de butanol-2 (b). Les cellules non enrichies ont été traitées de lamême manière, en absence ou en présence de 1% d'éthanol (a). Les cellules ont ensuité étéstimulées par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés endpm/essai et représentent les moyennes ± SEM de 4 expériences différentes réalisées avec 4donneurs différents. Les valeurs ont été comparées par analyse de variance (ANOVASTATVIEW II) et test-F de Scheffe.* indique une valeur différente par rapport à celle mesurée sans alcool, P<0,01.
150
prémarquées au [3H]-AA. En présence d'alcools primaires, éthanol et butanol-1, une hausse
significative de 2,5-3 fois de la synthèse de phosphatidylalcool est observée dans les cellules
enrichies en 12(S)-HETE alors que le butanol-2 est inefficace. Au contraire, comme nous l'avions
déjà montré dans le chapitre I, il n'y a pas de production de phosphatidyléthanol dans les cellules non
enrichie en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A en présence d'éthanol (Figure 36).
Collectivement, ces résultats suggèrent que la Con A est capable de stimuler une activité PLD dans
les cellules enrichies en 12(S)-HETE, mais pas dans les cellules témoins non traitées.
Les données de la littérature indiquent que la PLD peut être activée par des PKC ou par des protéines
tyrosine-kinases. Nous avons donc étudié l'effet de différents inhibiteurs (inhibiteur de PKC,
inhibiteur de tyrosine-kinase) sur l'activation de la PLD par la Con A en présence de 12(S)-HETE,
dans le but d'identifier un peu plus clairement les mécanismes impliqués.
V- Effet de différents inhibiteurs sur la production de phosphatidylbutanol par les
cellules mononucléées enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A en
présence de butanol-1.
V-I Effet de la Calphostine C.
La Calphostine C est un composé décrit comme un inhibiteur très sélectif d'activité PKC.
L'inhibition se produit par une interaction avec le domaine régulateur, et dépend de la lumière. Il est
connu que la PLD peut être activée par l'intermédiaire de PKC. Nous avons donc étudié l'effet de cet
inhibiteur sur l'activité PLD induite par la Con A en présence de 12(S)-HETE dans les cellules
mononucléées humaines.
Les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE ont été prétraitées pendant 30 min en absence ou
en présence de Calphosptine C (126 nM) puis stimulées par la Con A en présence de butanol-1 à 1%.
Les résultats présentés dans la Figure 37 montrent que la Calphostine C n'a pas d'effet sur la
production de phosphatidylbutanol induite par la Con A dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE.
Ce résultat suggère que le mécanisme par lequel le 12(S)-HETE stimule la PLD en présence de Con
A n'est pas PKC-dépendant.
V-II Effet de la Génistéine.
Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que la génistéine est capable de
diminuer la synthèse de PA induite par la Con A seule, ce qui indiquait l'implication de tyrosine-
kinases en amont de la cascade PLCγ/DAG-Kinase. Lorsque les phospholipides cellulaires sont
enrichis en 12(S)-HETE, la Con A active aussi en parallèle une PLD. Certaines activités PLD étant
régulées par des activités tyrosine-kinases, il nous a semblé intéressant
151
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
- calphostine
+ calphostine
P
hosp
hatid
ylbu
tano
l (
% d
e la
rad
ioac
tivité
liée
aux
pho
spho
lipid
es)
Con A Con A + 12(S)-HETE
Figure 37 : Effet de la Calphostine C sur la production de phosphatidylbutanol dans lescellules mononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A .
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE,puis marquées à l'acide arachidonique tritié pendant 1 heure à 37°C. Après lavages, lescellules témoins et les cellules enrichies en 12(S)-HETE ont été incubées pendant 30 min à37°C en absence ou en présence de 126 nM de calphostine C, puis stimulées par la Con A (5µg/106 cellules) pendant 5 min en présence de butanol-1 à 1%. Les résultats sont exprimés enpourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expériencereprésentative.
152
- génistéine
+ génistéine
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Pho
spha
tidyl
buta
nol
(%
de
la r
adio
activ
ité li
ée a
ux P
L to
taux
)
Con A Con A + 12(S)-HETE
Figure 38 : Effet de la Génistéine sur la production de phosphatidylbutanol dans les cellulesmononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A.
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12-HETE, puismrquées à l'acide arachidonique pendant 1 heure à 37°C. Après lavages, les cellules témoinset les cellules enrichies en 12(S)-HETE ont été incubées pendant 15 min à 37°C en absence ouen présence de 100 µM de génistéine, puis stimulées par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant5 min en présence de butanol-1 à 1%. Les résultats sont exprimés en pourcentage de laradioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expérience représentative.
153
VI- Effets du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans les cellules
mononucléées humaines activées par la Con A.
Nous avons étudié les tyrosine-phosphorylations induites par la Con A en absence ou en
présence de 12(S)-HETE par une technique d'immunodétection avec un anticorps anti-
phosphotyrosine. Pour cela, les cellules mononucléées ont été lysées selon le protocole décrit dans le
chapitre Méthodes, et les protéines présentes dans la fraction cytosolique ont été analysées par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, puis transférées sur membrane
de nitrocellulose (voir Méthodes). Les blots sont révélés à l'aide d'un anticorps anti-phophotyrosine
couplé à une détection ECL.
La quantité de β-actine présente dans chaque échantillon a été évaluée sur la même membrane avec
un anticorps anti-β-actine, de manière a obtenir un standard interne permettant d'estimer la quantité
de protéines présentes dans chaque échantillon. La quantification de la β-actine montre que les
quantités de protéines déposées dans chaque puits ne sont pas identiques. Les résultats ont donc été
normalisés par rapport au signal obtenu pour la β-actine.
La photographie d'un blot représentatif (Figure 39) montre qu'il existe un grand nombre de protéines
phosphorylées sur des résidus tyrosine dans les cellules mononucléées humaines. L'analyse par
vidéodensitométrie des signaux obtenus permet de dégager plusieurs conclusions. Une visualisation
du profil de chaque piste (Figure 40) permet de comparer les profils sans correction par la β-actine, et
d'évaluer les effets des différents traitements. Les résultats présentés dans la Figure 40a montrent que
la Con A induit un grand nombre de tyrosine phosphorylations dans les cellules mononucléées
humaines, et que la génistéine est capable de diminuer ces phosphorylations. D'autre part, les résultats
présentés dans la Figure 40b montrent que, dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE
et stimulées par la Con A, le profil des tyrosine-phosphorylations est qualitativement le même que
celui observé pour la Con A seule, mais beaucoup plus sensible à l'inhibition par la génistéine que
celui induit par la Con A seule. Enfin, la comparaison des profils présentés en Figure 40c montre que
le 12(S)-HETE en présence de Con A induit un peu moins de tyrosine-phosphorylation que la Con A
seule, sauf dans le cas d'un pic correspondant à une protéine de masse moléculaire comprise entre 44
et 50 KDa qui est identique quel que soit le traitement.
154
Figure 39 : Immunodétection des protéines phosphorylées sur des résidus tyrosine aprèstransfert sur membrane de nitrocellulose.
Con
A
+ 1
2HE
TE
Con
A
+ 1
2HE
TE
+ G
en
Tém
oin
67 KDa
56 KDa
40 KDa
Con
A
Con
A
+ G
en
β-actine
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives (30 minutes) de12(S)-HETE (1 µM). Après lavages, les cellules ont été prétraitées pendant 20 min avec lagénistéine (100 µM), puis stimulées par la Con A (5 µg/106 cellules). Les réactions ont étéarrêtées et les cellules ont été lysées comme décrit dans le chapitre Méthodes. Une mêmequantité de protéines (10 µg) a été déposée dans chaque puits, et la séparation a été effectuéesur gel de polyacrylamide (10%) en conditions dénaturantes. Après transfert sur membrane denitrocellulose, les membranes ont été incubées pendant 3 heures en présence d'un anticorpsantiphosphotyrosine (voir Méthodes), puis révélées par l'ECL. Cette photographie représenteles résultats d'une expérience.
155
a) Témoin ----, Con A ---- et Con A + génistéine ----.
b) Témoin ----, Con A + 12HETE ---- et Con A + 12HETE + génistéine ----.
c) Témoin ----, Con A ---- et Con A + 12HETE ----.
Figure 40 : Visualisation des profils obtenus pour chaque piste par vidéodensitométrie.Le film obtenu après révélation ECL de la membrane a été photographié et l’image a été
analysée par vidéodensitométrie (Bioprofil, Vilber Lourmat). Les profils des différentes pistesont été superposés afin de permettre une comparaison des effets des différents traitements.
156
0
100
200
300
400
Tyr
osin
e ph
osph
oryl
atio
n
(
% d
u té
moi
n)
Té
mo
in
Co
n A
Co
n A
+
Ge
n
Co
n A
+
12
(S)-
HE
TE
Co
n A
+
12
(S)-
HE
TE
+
Ge
n
a
44-50 KDa
Tyr
osin
e ph
osph
oryl
atio
n
0
100
200
300
(%
du
tém
oin)
c
56 KDa
Té
mo
in
Co
n A
Co
n A
+
Ge
n
Co
n A
+
12
(S)-
HE
TE
Co
n A
+
12
(S)-
HE
TE
+
Ge
n
0
100
200
300
400
500
600
Tyr
osin
e ph
osph
oryl
atio
n
(
% d
u té
moi
n)
b
67 KDa
Té
mo
in
Co
n A
Co
n A
+
Ge
n
Co
n A
+
12
(S)-
HE
TE
Co
n A
+
12
(S)-
HE
TE
+
Ge
n
Figure 41 : Analyse vidéodensitométrique du blot présenté dans la Figure 38.
Les résultats sont exprimés en pourcentage des tyrosine-phosphorylations du témoin sur la
protéine de 44-50 KDa (a), sur la protéine de 67 KDa (b) et sur la protéine de 56 KDa (c), et
représentent les valeurs d'une expérience.
157
Suite à ces observations, nous avons éffectué l'analyse densitométrique de la bande de poids
moléculaire compris entre 44 et 50 KDa et qui correspond à ce pic. Une analyse
densitométrique de ce signal, ainsi que ceux correspondants à des protéines de masses
moléculaires de 56 et 67 KDa a été effectuée. Les résultats normalisés par rapport à la β-
actine, sont présentés dans la Figure 41. La Con A seule augmente d'environ 3 fois le niveau
de tyrosine phosphorylation d'une protéine de masse moléculaire 44-50 KDa par rapport au
témoin (Fig. 41a). Une nette potentialisation de cet effet est observée en présence de 12(S)-
HETE (x4). Alors que la génistéine n'inhibe que de 25% les tyrosine phosphorylations de
cette protéine induites par la Con A seule, une inhibition substantielle de plus de 50% est
observée en présence de 12(S)-HETE.
La présence de 12(S)-HETE ne modifie pas significativement le niveau des tyrosine
phosphorylations induites par la Con A des protéines de 67 et 56 KDa (Fig. 41 b et c), mais
potentialise fortement l'effet inhibiteur de la génistéine (-18 vs -44% pour la protéine de
67 KDa ; -30 vs -60% pour la protéine de 56 KDa).
L'ensemble de ces résultats suggèrent que l'enrichissement des cellules mononucléées en
12(S)-HETE augmente les phosphorylations des résidus tyrosine induites par la Con A d'une
protéine de masse moléculaire comprise entre 44 et 50 KDa. D'autre part, le 12(S)-HETE
augmente la sensiblité à la génistéine de ces tyrosine-phosphorylations quelle que soit la
protéine étudiée, et cela suggère que les tyrosines kinases impliquées dans la phosphorylation
de résidus tyrosine en absence ou en présence de 12(S)-HETE sont peut-être différentes.
VII- Effet de la suramine sur la production de PA induite par la Con A dans les cellules
mononucléées enrichies ou non en 12(S)-HETE.
Des études antérieures de notre équipe ont montré que la stimulation par la Con A de
cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE induit la libération de 12(S)-HETE dans le
milieu extracellulaire. Nous avons donc émis l'hypothèse que la stimulation par la Con A
pourrait libérer du 12(S)-HETE, qui pourrait activer une voie PLD à partir de sites de liaison
localisés sur la face extracellulaire des membranes plasmiques. La suramine, composé
polyanionique dérivé de l'acide naphtalène-sulphonique, est un inhibiteur connu de la PLD
(Gratas et Powis, 1993). En raison de ses charges négatives, ce composé ne peut pas entrer
dans les cellules et agit de manière extracellulaire. Dans le but de mieux comprendre par quel
mécanisme le 12(S)-HETE stimule la production de PA induite par la Con A, nous avons
mesuré l'accumulation de PA en réponse à la Con A, en absence ou en présence de suramine
(Figure 42). Cette expérience montre que la suramine (1 mM) n'affecte pas la hausse de PA en
masse induite par la Con A dans les cellules témoins, mais diminue beaucoup celle induite
dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE. La suramine semble aussi diminuer le taux
158
0
20
40
60
- Suramine+ Suramine
PA
form
é (n
g/m
illio
n de
cel
lule
s)
*
12(S)-HETE Con A 12(S)-HETE+Con A
Figure 42 : Effets de la Suramine sur la production d'acide phosphatidique induite par la ConA dans les cellules mononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE.
Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE.Après lavages, les cellules témoins et les cellules enrichies en 12(S)-HETE ont été incubéespendant 60 min à 37°C en absence ou en présence de 1mM de suramine, puis stimulées par laCon A (5µg/106 cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en ng de PA formé par106 cellules et représentent les moyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3donneurs différents. Les valeurs ont été comparées par analyse de variance (ANOVASTATVIEW II) et par le test de t protégé (Fisher).* indique une différence par rapport à la quantité mesurée en absence de suramine, p<0,01.
159
basal de PA dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE en absence d'activation par la Con A.
Ces résultats indiquent que l'activation de la PLD par la Con A en présence de 12(S)-HETE
met en jeu des sites extracellulaires qui pourraient être des sites spécifiques de liaison du
12(S)-HETE.
VIII- Mise en évidence de sites de liaison du 12(S)-HETE sur les cellules mononucléées
ou les lymphocytes T humains purifiés.
Suite aux résultats obtenus en présence de suramine, qui ne pénètre pas dans les
cellules, nous avons cherché à étudier la liaison du 12(S)-HETE sur les membranes des
cellules mononucléées. De plus, les résultats antérieurs de notre équipe (Joulain et al., 1995)
montrant que les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE libèrent du 12(S)-HETE
dans le milieu extracellulaire lorsqu'elles sont stimulées par la Con A étaient en faveur de
cette hypothèse. La fixation du 12(S)-HETE tritié sur les cellules mononucléées et les
lymphocytes humains purifiés a été étudiée par une technique de filtration rapide selon la
méthode décrite par Vonakis et Vanderhoek (1992).
Avant d'étudier les caractéristiques de cette fixation, nous avons déterminé la cinétique
d'association du 12(S)-HETE tritié aux cellules, ainsi que le nombre optimal de cellules à
utiliser dans chaque essai.
VIII-1 Etude de la fixation spécifique du 12(S)-HETE tritié en fonction du temps sur
les cellules mononucléées humaines.
Les cellules mononucléées humaines (3,5 x 106 cellules/essai) ont été incubées pendant des
temps variables allant jusqu'à 4 heures 30, à 4°C sous agitation en présence de [3H]-12(S)-HETE
(0,01 µM et 0,025 µCi par essai). La fixation non spécifique a été déterminée en présence d'un large
excès de 12(S)-HETE non marqué (10 µM). La réaction est arrêtée par dilution avec 1 ml de PBS
froid et chaque échantillon est filtré sous vide sur des filtres GF/C. Dans ces conditions d'incubation
(4°C), une quantité substantielle de radioactivité reste associée aux cellules après filtration. Des
études antérieures effectuées dans l'équipe ont montré, après analyse par chromatographie sur couche
mince des extraits lipidiques des cellules fixées sur les filtres, que la majeure partie de la radioactivité
correspond à du 12(S)-HETE non estérifié et non dégradé (70 à 75%). Les résultats présentés dans la
Figure 43 montrent que la fixation du 12(S)-HETE atteint son maximum après 1 heure d'incubation,
puis reste stable tout au long de la période de temps considéré. Nous avons donc effectué toutes les
manipulations suivantes en incubant les cellules pendant 3 heures à 4°C sous agitation. Cette figure
montre également que la fixation non spécifique de 12(S)-HETE sur les membranes cellulaires reste
stable au cours du temps et représente environ 30% de la radioactivité totale fixée.
160
30020010001000
2000
3000
4000
5000
6000Fixation non spécifiqueFixation totale
Temps (min)
dpm
/ess
ai
Figure 43 : Association du 12(S)-HETE tritié aux cellules mononucléées humaines enfonction du temps.
Les cellules mononucléées humaines ont été incubées pendant des temps variables allantjusqu'à 270 min en présence de 12(S)-HETE tritié (0,01 µM et 0,025 µCi par essai). Lafixation non spécifique a été déterminée en présence d'un large excès de 12(S)-HETE nonmarqué. Les réactions ont été arrêtées comme décrit dans Méthodes. Chaque point représentela moyenne ± SEM de 3 déterminations.
161
5432100
1000
2000
3000
4000
5000
fixat
ion
sp
écifi
que
(dp
m/e
ssai
)
Nbre de cellules (x106)
Figure 44 : Fixation spécifique du 12(S)-HETE tritié en fonction du nombre de cellulesmononucléées humaines.
Des quantités croissantes de cellules mononucléées humaines ont été incubées en présencede 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) pendant 3 heures à 4°C sous agitation.La réaction a été arrêtée comme décrit dans Méthodes. La liaison spécifique est analyséecomme décrit dans Méthodes et représente 70% de la fixation totale du [3H]-12(S)-HETE.Chaque point représente la moyenne ± SEM de trois déterminations.
162
VIII-2 Etude de la fixation du 12(S)-HETE tritié en fonction du nombre de cellules.
Des quantités croissantes de cellules mononucléées ont été incubées pendant 3 heures à 4°C
sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai). La fixation non
spécifique a été déterminée en présence d'un large excès de 12(S)-HETE non marqué (3 µM). Les
résultats présentés dans la Figure 44 montrent que la fixation spécifique augmente de manière linéaire
en fonction du nombre de cellules et que 2 à 3 millions de cellules sont nécessaires par essai pour
obtenir une fixation spécifique au moins égale à 3000 dpm. Les manipulations suivantes ont donc été
effectuées en présence de 3 x 106 cellules par essais.
VIII-3 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux cellules mononucléées
humaines.
Les cellules mononucléées (3,4 x 106 cellules par essai) ont été incubées pendant 3 heures à
4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et de
concentrations croissantes de 12-HETE non marqué (0 à 10 µM).
Les résultats présentés dans la Figure 45a montrent que la quantité de 12(S)-HETE fixée de manière
spécifique aux cellules mononucléées augmente en fonction de la concentration de 12(S)-HETE
ajouté jusqu'à 0,5-1 µM. Cette fixation atteint ensuite un léger plateau, ce qui indique un début de
saturation. Entre 1 et 5 µM, la fixation augmente de nouveau, ce qui indique l'existence d'autres sites
de liaison ayant une affinité plus faible pour le 12(S)-HETE.
La représentation de Scatchard (Figure 45b) confirme qu'il existe deux types de sites de forte et faible
affinités pour le 12(S)-HETE sur les cellules mononucléées humaines et permet de calculer un Kd de
"forte affinité" de 312 nM avec un nombre maximal de sites de liaison Bmax de 6,62 pmoles
fixées/106 cellules.
VIII-4 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes T humains
purifiés.
Afin de vérifier que la liaison du 12(S)-HETE que nous avons observée sur les cellules
mononucléées humaines concerne bien les lymphocytes T, nous avons effectué les mêmes
expériences avec des lymphocytes T humains purifiés.
Les lymphocytes T (1,5 à 2 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à 4°C sous
agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et de concentrations
croissantes de 12(S)-HETE non marqué (0 à 10 µM).
Les résultats présentés dans la figure 46a montrent que la liaison du 12(S)-HETE augmente en
fonction de la concentration de 12(S)-HETE ajouté et atteint un plateau à partir de 0,5.
La représentation de Scatchard (Figure 46b) confirme qu'il existe une seule catégorie de sites de
liaison au 12(S)-HETE sur les lymphocytes T purifiés. Cette courbe permet de
163
5000400030002000100000
10
20
30
40
50
[12(S)-HETE] nM
B (
pmol
/ess
ai)
a
504030201000
10
20
30
40
50
60
70
80
B(pmol/essai)
B/F
nM
b
Figure 45 : Courbes de saturation et de Scatchard de la liaison du 12(S)-HETE aux cellulesmononucléées humaines.
Les cellules mononucléées humaines (3,4 x 106 cellules/essai) ont été incubées pendant 3heures à 4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai)et de concentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué.
La courbe (a) représente le nombre de pmoles de 12(S)-HETE fixées en fonction de laconcentration de 12(S)-HETE ajoutée. Chaque point représente la moyenne de 3déterminations.
La courbe de Scatchard (b) représente la moyenne de 3 déterminations.
164
60005000400030002000100000
2
4
6
8
10
[12(S)-HETE] nM
B (
pmol
/ess
ai)
a
1816141210864200
10
20
B (pmol/essai)
B/F
(µM
)
b
Figure 46 : Courbes de saturation et de Scatchard de la liaison du 12(S)-HETE auxlymphocytes T humains purifiés.
Les lymphocytes T purifiés (1,5 à 2 x 106 cellules/essai) ont été incubés pendant 3 heures à4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et deconcentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué.
La courbe (a) représente le nombre de pmoles de 12(S)-HETE fixées en fonction de laconcentration de 12(S)-HETE ajoutée. Chaque point représente la moyenne de 3déterminations.
La courbe de Scatchard (b) représente la moyenne de 3 déterminations.
165
calculer un Kd de 773 nM avec un Bmax de 7,38 pmoles fixées/106 cellules. Cette courbe est
représentative d'une expérience réalisées en triple. Une deuxième expérience a donné desrésultats similaires (Kd = 543 nM ; Bmax = 12,38 pmoles fixées/106 cellules). D'autre part, au
cours de ces expériences, une partie des lymphocytes a été stimulée par de la PHA lors de la
mise en culture (voir Méthodes). Les représentations de Scatchard réalisées à partir des
données obtenues avec ces populations cellulaires stimulées par la PHA permettent decalculer des Kd de 706 nM et 669 nM, avec des Bmax de 21,62 et 13,74 pmoles fixées/106
cellules, respectivement. Nous avons conclu que la PHA n'influençait pas la liaison du 12(S)-
HETE aux lymphocytes T purifiés et les expériences suivantes ont été réalisées avec des
lymphocytes non activés.
D'autre part, les Kd obtenus avec les lymphocytes T purifiés non activés sont comparables à
ceux obtenus avec les cellules mononucléées. De plus, on peut supposer que les sites de très
faible affinité observés avec les cellules mononucléées proviennent probablement d'une autre
population cellulaire que les lymphocytes T.
VIII-5 Comparaison des courbes de déplacement du 12(S)-HETE tritié par du 12(S)-
HETE non marqué et par d'autres acides gras ou lipides dans les lymphocytes T humains
purifiés.
Dans le but d'étudier la spécificité de la liaison du 12(S)-HETE sur les lymphocytes T
humains purifiés, nous avons effectué des expériences de compétition avec d'autres lipides ou
acides gras. Les résultats de ces expériences sont présentés dans la Figure 47. Ils indiquent
que l'acide oléïque (Fig. 47a) n'est pas capable de déplacer le 12(S)-HETE tritié, et que l'acide
arachidonique (Fig. 47b) est un très faible compétiteur. Par contre, le DHA (Fig. 47c) et l'EPA
(Fig. 47d) déplacent le 12(S)-HETE tritié aussi bien que le 12(S)-HETE non marqué. Enfin,
les acides gras hydroxylés, 15-HETE (Fig. 47e) et 13-HODE (Fig. 47f) sont moins efficaces
que le DHA ou l'EPA, mais déplacent cependant assez bien le 12(S)-HETE tritié.
Ces résultats suggèrent que les sites de liaison du 12(S)-HETE ne sont pas spécifiques de ce
composé. Le 12(S)-HETE se lie donc probablement sur des récepteurs spécifiques d'autres
molécules, ce qui expliquerait également l'affinité relativement faible (Kd assez élevé) que
nous avons observée en VIII-3 et VIII-4.
Nous nous sommes ensuite posés la question de savoir sur quel type de récepteur le 12(S)-
HETE pouvait se lier, et nous avons effectué des expériences en présence de différents
inhibiteurs.
166
log [C]
0
20
40
60
80
100
120 12-HETE
15-HETE
Fix
atio
n s
péci
fiqu
e (%
du
tém
oin
)
e
0 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120 12-HETE
Arachidonate
Fix
atio
n sp
éci
fique
(%
du
tém
oin
)
log [C]
b
0 -9 -8 -7 -6 -50
20
40
60
80
100
120 12-HETE
Oléate
log [C]
Fix
atio
n sp
éci
fique
(%
du
tém
oin
)
a
0 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120 12-HETE
EPA
Fix
atio
n sp
écifi
que
(% d
u té
mo
in)
log [C]
d
0 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120 12-HETE
13-HODE
Fix
atio
n sp
écifi
qu
e (%
du
tém
oin
)
log [C]
f
0 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120 12-HETE
DHA
Fixa
tion
sp
écifiq
ue
(%
du
tém
oin
)
log [C]
c
0 -9 -8 -7 -6 -5
Figure 47 : Comparaison entre le déplacement du [3H]-12(S)-HETE tritié par du 12(S)-HETE froid et pard'autres acides gras ou lipides dans des lymphocytes T humains purifiés.
Les lymphocytes T purifiés (3 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à 4°C sous agitationen présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et de 12(S)-HETE froid (0 à 3 µM). Lesmêmes expériences ont été effectuées en remplaçant le 12(S)-HETE froid par différents acides gras ou lipides (0à 3 µM) tel que l'acide oléïque (a), ou l'acide arachidonique (b), ou le DHA (c), ou l'EPA (d), ou le 15(S)-HETE(e), ou le 13-HODE (f). Les réactions ont été arrêtées comme décrit dans Méthodes. La liaison spécifique est
analysée comme décrit dans Méthodes et représente environ 70% de la liaison totale du [3H]-12(S)-HETE.Chaque point représente la moyenne de 2 expériences réalisées en triple.
167
VIII- Etude des caractéristiques des sites de liaison au 12(S)-HETE dans les
lymphocytes T purifiés.
a) Effet du GTPγS sur la liaison du 12(S)-HETE aux membranes de
lymphocytes T humains purifiés.
Dans le but de tester l'implication d'un récepteur agissant par l'intermédiaire de
protéines G hétérotrimériques, nous avons étudié l'effet du GTPγS sur la liaison du 12(S)-
HETE aux lymphocytes T. Le GTPγS, en se liant à une protéine G dissocie les sous-unités α
et βγ de la protéine, ce qui conduit à son activation. La protéine G ainsi activée se dissocie du
récepteur, ce qui diminue l'affinité du récepteur pour son ligand. D'autre part, le GTPγS ne
pénètre pas dans les cellules. C'est pour cette raison que nous avons testé son effet sur des
fractions particulaires.
Les cellules cultivées 3 jours ont été lysées selon le protocole de lyse au glycérol décrit dans
Méthodes. Les membranes (correspondant à 2 x 106 cellules/essai) ont été incubées 3 heures à
4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,58 nM et 0,056 µCi par essai) et de
concentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué, en absence ou en présence de GTPγS
(100 µM). La représentation de Scatchard (Figure 48) obtenue avec les données de cetteexpériences permet de calculer un Kd de 1,09 µM avec un Bmax de 6,37 pmol/106 cellules
pour les membranes incubées en absence de GTPγS. Les résultats d'une autre expérienceréalisée dans les mêmes conditions permettent d'obtenir un Kd de 0,803 µM avec un Bmax de
2,5 pmol/106 cellules. Ces résultats suggèrent que l'affinité du 12(S)-HETE pour les
membranes isolées est plus faible que celle obtenue pour les cellules entières.D'autre part, un Kd de 2,58 µM avec un Bmax de 13,39 pmol/106 cellules peut être calculé
lorsque les membranes sont incubées en présence de GTPγS. Ce résultat montre donc que le
GTPγS diminue l'affinité du 12(S)-HETE pour les membranes isolées. Cela suggère que les
sites de liaison du 12(S)-HETE pourraient être couplés à une protéine G. Nous avons donc
testé ensuite l'effet de la Toxine Pertussique sur la liaison spécifique du 12(S)-HETE aux
lymphocytes T humains purifiés, dans le but d'étayer encore cette hypothèse.
b) Effet de la Toxine Pertussique (PTX) sur la liaison du 12(S)-HETE aux
lymphocytes T humains purifiés.
La toxine pertussique est capable d'activer les protéines G de manière irréversible. La
protéine G ainsi activée se dissocie du récepteur, ce qui diminue l'affinité de ce récepteur pour
son ligand.
Les résultats présentés dans la Figure 49 montrent que la toxine pertussique (5 ng/ml) diminue
nettement la liaison spécifique du 12(S)-HETE, et ce résultat confirme donc l'implication de
sites de liaison couplés à une protéine G dans ce mécanisme.
168
3025201510500
2
4
6
8
10
12
14
sans GTPγS
avec GTPγS
B(pmol/essai)
B/F
µM
Figure 48 : Représentation de Scatchard de la liaison du 12(S)-HETE aux membranes delymphocytes T humains purifiés en absence et en présence de GTPγS.
Les lymphocytes T purifiés ont été lysés selon le protocole au glycérol décrit dansMéthodes. Les membranes (correspondant à 2 x 106 par essai) ont été incubées en présence de12(S)-HETE tritié (0,58 nM et 0,056 µCi par essai) et de concentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué en absence ou en présence de GTPγS (100 µM). Les réactions ont étéarrêtées comme décrit dans Méthodes. Les résultats représentent la moyenne de 3déterminations.
169
0
1000
2000
Fix
atio
n s
péc
ifiqu
e (d
pm/e
ssai
)
12(S)-HETE seul 12(S)-HETE + PTX 5 ng/ml
Figure 49 : Effet de la toxine pertussique sur la fixation spécifique du 12(S)-HETE auxlymphocytes T humains purifiés.
Les lymphocytes T purifiés (2,2 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à4°C sous agitation avec du 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai), en absence ouen présence de Toxine Pertussique à 5 ng/ml. La fixation spécifique a été estimée commedécrit dans Méthodes. Les résultats sont exprimés en dpm/essai et représentent les moyennesde 3 déterminations.
170
0
1000
2000
3000
Fix
atio
n s
péc
ifiqu
e (d
pm/e
ssai
)
*
12(S)-HETE seul 12(S)-HETE + suramine
Figure 50 : Effet de la suramine sur la fixation spécifique du 12(S)-HETE aux lymphocytes Thumains purifiés.
Les lymphocytes T purifiés (3,3 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à4°C sous agitation avec du 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai), en absence ouen présence de Suramine 1 mM. La fixation spécifique a été estimée comme décrit dansMéthodes. Les résultats sont exprimés en dpm/essai et représentent les moyennes de 6déterminations ± SEM. * indique une différence significative (p<0,05) par rapport au niveausans inhibiteur.
171
Enfin, suite aux résultats obtenus en présence de Suramine sur l'activité PLD induite dans les
cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A, il nous a semblé
interessant de déterminer quel était l'effet de la Suramine sur la liaison du 12(S)-HETE aux
lymphocytes T humains purifiés.
c) Effet de la suramine sur la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes T
humains purifiés.
Les lymphocytes T humains purifiés ont été incubés pendant 3 heures à 4°C avec du
12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai). La fixation non spécifique a été
déterminée en présence d'un large excès de 12(S)-HETE non marqué (3 µM). Toutes ces
incubations ont été effectuées en absence ou en présence de suramine à la concentration de 1
mM. Les résultats présentés dans la Figure 50 montrent que la suramine diminue de manière
importante la fixation spécifique du 12(S)-HETE sur les lymphocytes T humains purifiés. Ce
résultat montre que la suramine est capable de déplacer le 12(S)-HETE de ses sites de liaison
spécifiques. Or, la suramine bloque également l'activation de la PLD induite par la Con A en
présence de 12(S)-HETE, ce qui suggère que les sites de liaison du 12(S)-HETE pourraient
être directement ou indirectement couplés à une PLD.
IX- Discussion.
Les résultats présentés dans ce dernier chapitre montrent que le 12(S)-HETE
potentialise la production d'acide phosphatidique induite par la Con A dans les cellules
mononucléées humaines. Ce résultat est inattendu puisque le 12(S)-HETE a été décrit comme
un inhibiteur de DAG-Kinase dans les cellules endothéliales aortiques bovines. La formation
de PA contenant du 12(S)-HETE dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE
constitue un autre résultat important de ce travail. Bien que le 12(S)-HETE soit métabolisé par
peroxydation dans la plupart des cellules qui l'incorporent, la radioactivité associée au PA
dans les cellules mononucléées marquées avec du 12(S)-HETE tritié correspond bien à du
12(S)-HETE non transformé. En effet, des études antérieures de l'équipe ont montré que,
après saponification des lipides de cellules enrichies en 12(S)-HETE tritié et analyses HPLC
des extraits saponifiés, plus de 80% de la radioactivité est retrouvée sous forme de 12(S)-
HETE non modifié. Les données de la littérature décrivent des espèces moléculaires de DAG
contenant du 15-HETE dans des cellules endothéliales d'artère pulmonaire bovine, enrichies
en 15-HETE et stimulées par la bradykinine (Legrand et al., 1991) ou bien des expèces
moléculaires de DAG contenant du 13-HODE dans des cellules de l'épiderme enrichies en 13-
HODE (Cho et Ziboh, 1994). En absence de stimulation mitogénique, le PA contenant du
172
12(S)-HETE ne représente que 0,4% de la masse totale de PA présent dans les cellules
mononucléées humaines. Cette proportion relative est même diminuée dans les cellules
activées par la Con A puisque, dans ces conditions, la masse de PA augmente beaucoup plus
que la proportion de PA marqué au 12(S)-HETE tritié. Cependant, ce résultat ne permet pas
d'exclure que les espèces de PA contenant du 12(S)-HETE puissent jouer un rôle
physiologique important. Le PA contenant du 12(S)-HETE pourrait être synthétisé dans un
compartiment particulier de la membrane lipidique, empêchant le bon déroulement des
événements impliqués dans la transduction du signal mitogénique. Ce phénomène peut avoir
un effet physiologique important dans le contexte de l'immunodéficience liée au
vieillissement, puisqu'il a été démontré que le taux de 12(S)-HETE est significativement plus
élevé dans les cellules mononucléées de personnes âgées que dans celles de témoins jeunes.
Une autre hypothèse permettant d'expliquer l'effet antimitogénique du 12(S)-HETE est la
production d'espèces moléculaires de PA contenant un taux important d'acides gras saturés et
une faible proportion d'acide arachidonique dans les cellules mononucléées enrichies en
12(S)-HETE et stimulées par la Con A, comparativement aux cellules activées par la Con A
seule (Tableau 9). Il a été démontré que l'effet mitogénique du PA probablement de la
longueur et du dégré de saturation des acides gras qui le composent, le PA-1-stéaroyl, 2-
arachidonoyl étant le plus mitogène dans des fibroblastes (van Corven et al., 1992). Nous
avons donc émis l'hypothèse que le 12(S)-HETE favorisait la production d'espèces
moléculaires de PA ayant un faible pouvoir mitogénique, et nous nous sommes proposés de
déterminer et d'étudier par quel mécanisme ce PA pouvait être synthétisé.
Nos résultats suggèrent que, non seulement le 12(S)-HETE ne bloque pas la voie de synthèse
du PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées humaines, mais stimule
probablement une ou plusieurs autres voies de production du PA dans ces cellules. En effet,
les résultats montrés dans le Tableau 8 confirment l'absence d'effet activateur du 12(S)-HETE
sur la DAG-Kinase, puisqu'on observe une diminution de la proportion de DAG tritié dans les
cellules enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A. D'autre part, plusieurs arguments
suggèrent que le 12(S)-HETE stimule une voie PLD dans les cellules mononucléées humaines
activées par la Con A. Tout d'abord, la production de PA en masse induite par la Con A dans
les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE est très nettement diminuée lorsque les
cellules sont stimulées en présence d'éthanol, ce qui suggère l'intervention d'une
transphosphatidylation caractéristique de la PLD. De plus, nos résultats montrent que les
cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A produisent du
phosphatidyléthanol ou du phosphatidylbutanol quand elles sont activées en présence
d'éthanol ou de butanol, respectivement, ce qui n'est pas le cas lorsque les cellules sont
stimulées par la Con A seule en présence d'alcool primaire. Ce dernier résultat confirme les
résultats obtenus dans le chapitre I montrant que, contrairement à l'ester de phorbol TPA, la
Con A seule ne stimule pas d'activité PLD dans les cellules mononucléées humaines.
Nous avons ensuite étudié l'effet de différents inhibiteurs sur la production de
173
phosphatidylbutanol dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées
par la Con A. Nos résultats indiquent que la PLD activée par la Con A dans les cellules
mononucléées humaines enrichies en 12(S)-HETE n'est pas régulée par une PKC. Ceci
suggère que cette activité PLD pourrait être différente de celle activée dans ces mêmes
cellules par l'ester de phorbol TPA, qui est un activateur reconnu de PKC.
Les expériences effectuées en présence de l'inhibiteur de tyrosine-kinase, génistéine, montrent
que l'activité PLD induite par la Con A dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-
HETE pourrait être régulée par des phosphorylations sur des résidus tyrosines.
Nous avons commencé une étude visant à déterminer quelles pouvaient être les protéines
phosphorylées sur des résidus tyrosine au cours de ce phénomène. Nos résultats préliminaires
montrent que la Con A seule induit des phoshorylations de tyrosine sur un grand nombre de
protéines par rapport au cellules témoins, et que la génistéine est capable de diminuer ces
phosphorylations. Les mêmes résultats sont obtenus en présence de 12(S)-HETE. L'analyse
par vidéodensitométrie des profils de chaque piste montre qu'une protéine de masse
moléculaire comprise entre 44 et 50 KDa est davantage tyrosine-phosphorylée dans les
cellules enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A que dans les cellules stimulées
par la Con A seule. Cette protéine sensible à l'effet du 12(S)-HETE pourrait correspondre à
une MAP-Kinase (44KDa) ou à une tyrosine-kinase Csk (50 KDa). Par ailleurs,
l'enrichissement en 12(S)-HETE des cellules mononucléées humaines ne modifie les tyrosine-
phosphorylations des protéines de 56 et 67 KDa (pouvant correspondre aux PTK Lck 56 et
ZAP-70). Par contre, l'effet inhibiteur de la génistéine est plus important dans les cellules
enrichies en 12(S)-HETE que dans les cellules non traitées, quelle que soit la protéine étudiée.
Ce résultat suggère que le 12(S)-HETE pourrait recruter des tyrosine-kinases différentes de
celles stimulées par la Con A seule. Cependant, ce résultat est un résultat préliminaire qui
reste à confirmer.
Un autre résultat étayant l'hypothèse de l'implication d'une PLD dans la production de PA en
masse induite par le 12(S)-HETE en présence de Con A est celui obtenu avec l'inhibiteur de
PLD, suramine. En effet, la suramine n'affecte pas la production de PA en masse induite par la
Con A seule, alors qu'elle inhibe de manière significative celle induite par la Con A dans les
cellules prétraitées par le 12(S)-HETE. Nous avons envisagé deux hypothèses pour expliquer
l'effet de la suramine : (1) soit le 12(S)-HETE estérifié dans les phospholipides membranaires
modifie les caractéristiques des sites de liaison à la Con A, (2) soit le 12(S)-HETE sous forme
libre peut agir lui-même comme un ligand extracellulaire. Des résultats antérieurs de notre
équipe ayant montré que les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE tritié libèrent du
12(S)-HETE dans le milieu extracellulaire lorsqu'elles sont stimulées par la Con A, nous nous
sommes intéressés à la seconde hypothèse. En effet, étant donné que l'activation de la PLD
nécessite la présence à la fois de la Con A et du 12(S)-HETE, la Con A pourrait agir en
mobilisant le 12(S)-HETE stocké dans les phospholipides membranaires et en augmentant le
taux de 12(S)-HETE libre dans le milieu extracellulaire. Les expériences de liaison du 12(S)-
174
HETE tritié ont montré l'existence de deux classes de sites de liaison du 12-HETE sur les
cellules mononucléées humaines avec un Kd pour la fixation de plus forte affinité d'environ300 nM et un Bmax de 6,62 pmoles fixées/106 cellules. Dans les lymphocytes T purifiés, on
ne trouve plus qu'une seule classe de sites de liaison du 12(S)-HETE avec un Kd d'environ550-750 nM et un Bmax d'environ 7 à 10 pmoles fixées/106 cellules. D'autre part, nos
expériences ont montré que l'activation par la PHA des lymphocytes T purifiés n'avait pas
d'influence sur la fixation spécifique du 12(S)-HETE sur les membranes cellulaires. Enfin, les
expériences de compétition effectuées en présence de divers lipides suggèrent que les sites de
liaison du 12(S)-HETE reconnaissent également d'autres acides gras, puique le DHA et l'EPA
sont capables de déplacer le 12(S)-HETE tritié de la même manière que le 12(S)-HETE froid.
Des sites de liaison de forte affinité pour le 12(S)-HETE ont déjà été décrits, par exemple
dans les kératinocytes avec un Kd d'environ 3-4 nM (Arenberger et al., 1993) ou dans les
cellules de carcinome avec un Kd de 0,4 nM (Herbertsson et Hammarstrom,1991). Nos
résultats montrent la présence sur les cellules mononucléées humaines de sites de liaison de
faible affinité, ce qui a aussi été décrit dans des cellules basophiles leucémiques (Kd=500nM
environ) (Kang et Vanderhoek, 1995). La signification physiologique de l'existence de ces
sites de faible affinité reste à démontrer, mais cela pourrait expliquer la nécessité de quantités
micromolaires de 12(S)-HETE pour obtenir un effet antiprolifératif. Enfin, les expériences
réalisées en présence de GTPγS, toxine pertussique et suramine suggèrent l'implication de
sites de liaison couplés à une protéine G dans l'effet du 12(S)-HETE. Des expériences visant à
tester les effets de la toxine pertussique et du GTPγS sur la PLD dans les cellules
mononucléées humaines enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A devraient
permettre de confirmer ce résultat.
L'ensemble des résultats présentés dans ce chapitre suggère que le 12(S)-HETE potentialise la
production de PA en masse induite par la Con A par l'activation d'une PLD. La stimulation de
cette PLD pourrait se produire par l'intermédiaire de sites de liaison du 12(S)-HETE couplé à
une protéine G, suivie de l'activation de protéines tyrosine-kinases. Les espèces moléculaires
de PA produites dans ces conditions contiennent du 12(S)-HETE, et sont plus riches en acides
gras saturés que les espèces moléculaires de PA produites dans les cellules activées par la Con
A seule. De telles modifications dans la composition en acides gras du PA synthétisé dans les
cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A pourraient
expliquer une mauvaise transmission des signaux d'activation.
175
CCOONNCCLLUUSSII OONNEETT
PPEERRSSPPEECCTTII VVEESS
176
L'activation antigénique ou mitogénique des lymphocytes initie une séquence
ordonnée et complexe d'événements extra et intracellulaires, et les mécanismes intracellulaires
responsables de la transduction des signaux activateurs ne sont que partiellement élucidés.
L'étude de ces mécanismes, notamment ceux impliquant des médiateurs lipidiques, du fait de
l'intense métabolisme phospholipidique mis en oeuvre juste après stimulation mitogénique,
sont indispensables à une meilleure compréhension des phénomènes précoces de l'activation
lymphocytaire. D'autre part, il est bien établi maintenant qu'un taux élevé d'AMPc bloque la
réponse proliférative de différents types cellulaires, en particulier le lymphocyte, ce qui
suggère que l'hydrolyse des nucléotides cycliques par les phosphodiestérases (PDE) joue un
rôle capital dans la régulation et le contrôle de la prolifération.
Les travaux antérieurs de notre équipe ont montré que l'activation de lymphocytes murins ou
humains induit une hausse substantielle et rapide d'une isoforme particulière de PDE (type 4)
prépondérante dans les cellules lymphoïdes, cette stimulation contribuant vraisemblablement
à maintenir un taux faible d'AMPc lors des étapes précoces de l'activation. En outre, le PA est
capable de stimuler in vitro l'activité de cette même isoforme, sensible à la Con A, mimant
ainsi l'effet des mitogènes, d'où l'hypothèse d'un lien probable entre la hausse de PA et la
hausse d'activité PDE induites par les mitogènes.
Les résultats présentés dans ce travail ont contribué à étayer plus solidement cette hypothèse.
En effet, nous avons montré que la Con A augmente de manière significative la synthèse de
PA dans les cellules mononucléées dès les 5 premières minutes de stimulation et que cette
production de PA induite par la Con A se fait majoritairement par la voie classique PI-
PLC/DAG-Kinase. Ce résultat est important, car il est connu que cette voie de signalisation
conduit à des PA riches en espèces moléculaires comportant de l'acide arachidonique en
position sn-2. Or, ces PA sont précisément les plus actifs pour activer les PDE4 en système
acellulaire et ils sont connus également pour être beaucoup plus mitogènes que les PA saturés.
Les résultats antérieurs de l'équipe avaient montré une hausse d'activité PDE maximale après
10 à 30 minutes de stimulation par la Con A, et donc postérieure à la hausse de PA, suggérant
que l'augmentation de PA intracellulaire pouvait être directement ou indirectement
responsable de l'activation des PDE par les mitogènes.
Grâce à l'étude, en parallèle, de la production de PA, des activités PDE et des taux d'AMPc
induits par la Con A dans une même population cellulaire provenant d'un même donneur,
177
nous avons pu montrer qu'il existe une corrélation étroite entre les taux de PA et les activités
PDE. A la fois le PA formé par activation directe de la voie PLD dans les cellules stimulées
par le TPA, et le PA provenant de la voie PI-PLC/DAG-Kinase dans les cellules stimulées par
la Con A ou l'OKT3 peuvent être associés à une augmentation des activités PDE. De plus, les
drogues capables de diminuer la synthèse de PA, comme l'inhibiteur de DAG-Kinase R59022,
suppriment l'activation des PDEs dans les cellules, et inhibent également la réponse
proliférative des cellules à la Con A. L'activation précoce des PDEs dans les premières étapes
de la stimulation mitogénique se traduit par une baisse modeste mais significative du taux
intracellulaire global d'AMPc, ce qui n'exclut pas des variations plus importantes dans
certains compartiments subcellulaires. Tous ces résultats suggèrent que le PA est impliqué,
directement ou indirectement dans la régulation des activités PDE et que ce phénomène doit
avoir une importance physiologique au cours de l'activation lymphocytaire.
L'étude pharmacologique des différentes PDEs impliquées dans ce mécanisme a montré que la
PDE4, qui est la seule enzyme activable par le PA en système acellulaire, n'est pas la seule
cible des mitogènes dans la cellule. En effet, nous avons également observé une stimulation
de l'activité AMPc-PDE insensible au Rolipram, correspondant probablement à des PDE3 et
7, et une stimulation de l'hydrolyse du GMPc assurée en totalité par la PDE5 dans ces
cellules. Des études en système acellulaire, en cours dans notre laboratoire, indiquent que
parmi les différentes PDE4, seules les isoformes possédant un domaine supplémentaire du
côté N-terminal sont sensibles à l'effet activateur du PA. Un effet direct du PA par des
interactions lipide-protéine, au niveau d'un site situé dans cette région N-terminale est donc
envisageable. Cependant, le mécanisme de cette activation reste encore à élucider. Des études
de mutagenèse dirigée visant à modifier spécifiquement le domaine N-terminal des PDE4
sensibles au PA devraient apporter des éléments de réponse.
Il est connu que l'activité de la plupart des PDEs, en particulier celle des PDE3, 4 et 5 peut
être modulée par phosphorylation/déphosphorylation. De plus, une isoforme particulière de
PKC, la PKCζ est stimulée préférentiellement par le PA, et ne répond pas au DAG et aux
esters de phorbol. Il serait donc intéressant de tester l'effet sur les activités PDE des différents
agonistes capables d'augmenter le PA, en présence d'inhibiteurs sélectifs des différentes
isoformes de PKC, et en particulier de la PKCζ.
Un autre résultat important de ce travail concerne l'effet du 12(S)-HETE sur la production de
PA dans les cellules mononucléées au repos ou activées par la Con A. Le 12(S)-HETE ayant
été décrit comme un inhibiteur de DAG-Kinase dans certains types cellulaires, nous avons
émis l'hypothèse qu'un enrichissement en 12(S)-HETE des phospholipides de cellules
mononucléées de témoins jeunes pouvait induire une diminution de la production de PA. Les
résultats obtenus sont en désaccord avec cette hypothèse, puisque nous avons démontré que
l'enrichissement en 12(S)-HETE provoque une augmentation de la synthèse de PA induite par
la Con A, par un mécanisme mettant en jeu l'activation d'une PLD. Nos résultats suggèrent
178
que la PLD activée par le 12(S)-HETE en présence de Con A est probablement différente de
la PLD activable par le TPA, puisque l'inhibiteur de PKC, Calphostine C n'a pas d'effet. Par
contre, cette PLD est sensible à l'inhibiteur de tyrosine-kinase, génistéine. Les expériences de
western-blotting utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine suggèrent que le 12(S)-HETE
pourrait stimuler la tyrosine-phosphorylation d'une protéine particulière de masse moléculaire
44-50 KDa. Des expériences supplémentaires seront nécessaires pour identifier plus
précisément cette protéine. D'après les poids moléculaires estimés, il pourrait s'agir d'une
MAP-Kinase p44 ou d'une tyrosine-kinase particulière, la Csk 50. L'utilisation d'anticorps
spécifiques anti-MAP-Kinase ou anti-Csk 50 devrait permettre d'identifier cette protéine.
D'autre part, il serait très important d'identifier la ou les PLD exprimées dans les cellules
mononucléées humaines, et en particulier de déterminer si la PLD1 est présente dans ces
cellules. En effet, les données de la littérature décrivent que cette isoforme de PLD (type 1)
serait activée à la suite de la translocation vers la membrane des petites protéines G (Rho et/ou
ARF). Ainsi, l'enrichissement des cellules en 12(S)-HETE pourrait induire des modifications
membranaires favorisant la translocation des petites protéines G.
Enfin, les résultats obtenus en présence de suramine suggèrent que le 12(S)-HETE pourrait
agir de manière extracellulaire. Cette hypothèse est en bon accord avec les résultats antérieurs
de l'équipe montrant que du 12(S)-HETE est libéré dans le milieu extracellulaire quand des
cellules préalablement enrichies sont activées par la Con A. Les expériences de liaison du
12(S)-HETE et de compétition que nous avons effectuées sur des cellules mononucléées et
des lymphocytes T humains purifiés ont permis d'établir l'existence de sites de liaison de
faible affinité du 12(S)-HETE sur les cellules. D'autre part, l'étude de cette fixation en
présence toxine pertussique ou de GTPγS suggère que les sites de liaison du 12(S)-HETE
pourraient être couplés à une protéine G. La suramine est connue pour se lier de façon
préférentielle au récepteur du lyso-PA, et il serait possible que le 12(S)-HETE se fixe sur ce
récepteur. Des expériences de compétition en présence de lyso-PA, suivies d'une étude des
effets du 12(S)-HETE sur la production de PA dans des cellules surexprimant le récepteur au
lyso-PA permettraient d'approfondir cette étude sur le mécanisme d'action du 12(S)-HETE.
179
RREEFFEERREENNCCEESSBBII BBLLII OOGGRRAAPPHHII QQUUEESS
180
AGWU, E., PcPHAIL, L.C., SOZZANI, S. et al. Phosphatidic acid as a second messenger
in human polymorphonuclear leukocytes. Effects on activation of NADPH oxidase. J. Clin.
Invest., 1991, Vol. 88, N°2, p. 531-539.
AMREIN, K.E., FLINT, N., PANHOLZER, B. et al. Ras GTPase-activating protein: a
substrate and a potential binding protein of the protein-tyrosine kinase p56lck. Proc. Natl.
Acad. Sci., 1992, Vol. 89, N°8, p. 3343-3346.
AMREIN, K.E., PANHOLZER, B., MOLNOS, J. et al. Mapping of the p56lck-mediated
phosphorylation of GAP and analysis of its influence on p21ras-GTPase activity in vitro.
Biochim. Biophys. Acta, 1994, Vol. 1222, N° 3, p. 441-446.
ANASTASSIOU, E.D., PAGLIOGIANNI, F., BALOW, J.P. et al. Prostaglandin E2 and
odther cyclic AMP-elevating agents modulate Il-2 and IL-2Rα gene expression at multiple
levels. J. Immunol., 1992, Vol. 148, N°9, p. 2845-2852.
ANTHES, J.C., WANG, P., SIEGEL, M.I. et al. Granulocyte phospholipase D is activated
by a guanine nucleotide dependent protein factor. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991,
Vol. 175, N°1, p. 236-243.
ARENBERGER, P., KEMERY. L. and RUZICKA, T. Characterization of high-affinity
12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid (12(S)-HETE) binding sites on normal human
keratinocytes. Epith. Cell. Biol., 1993, Vol. 2, p. 1-6.
ARIDOR-PITERMAN, O., LAVIE, Y. and LISCOVITCH, M. Biomodal distribution of
phosphatidic acid phosphohydrolase in NG-108-15 cells. Modulation by the amphiphilic
lipids oleic acid and sphingosine. Eur. J. Biochem., 1992, Vol. 204, N°2, p. 561-568.
ATKINSON, J.P., KELLY, J.P., WEISS, A. et al. Enhanced intracellular cGMP
concentrations and lectin-induced lymphocyte transformation. J. Immunol., 1978, Vol. 121,
N°6, p. 2282-2291.
AUSSEL, C., PELASSY, C. and BREITTMAYER, J.P. Adiacylglycerol kinase is
involved in the regulation of interleukin-2 synthesis in Jurkat T cells. Cell. Immunol., 1992,
Vol. 139, N°2, p. 333-341.
AZHAEVA, E.V., Jr. SEVERIN, S.E. and KONDRAT'EV, A.D. cGMP-dependent cyclic
181
nucleotide phosphodiesterase from human lymphoid cells. Biokhimiia, 1987, Vol., 52, N°11,
p. 1781-1785.
BAKER, B., VIAMONTES, G., AUDHYA, T. et al. Selected human T cell lines respond to
thymopoietin with intracellular cyclic GMP elevations. Immunopharmacology, 1988, Vol. 16,
N°2, p. 115-122.
BALBOA, M., FIRESTEIN, B.L., GODSON, C. et al. Protein kinase Cα mediates
phospholipase D activation by nucleotides and phorbol ester in madin-darby canine kidney
cells. Stimulation of phospholipase D is independent of activation of polyphosphoinositide-
specific phospholipase C and phospholipase A2. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°14, p.
10511-10516.
BALBOA, M.A. and INSEL, P.A. Nuclear phospholipase D in madin-darby canine kidney
cells. Guanosine 5'-O-(thiotriphosphate)-stimulated activation is mediated by RhoA and is
downstream of protein kinase C. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°50, p. 29843-29847.
BARRITT, G.J., DALTON, K.A. and WHITING, J.A. Evidence that phosphatidic acid
stimulates the uptake of calcium by liver cells but not calcium release from mitochondria.
FEBS. Lett., 1981, Vol. 125, N°2, p. 137-140.
BASHIR, N., KUHEN, K. and TAUB, N. Phospholipids regulate growth and function of
MDCK cells in hormonally defined serum free medium. In vitro. Cell. Dev. Biol., 1992, Vol.
28A, N°9-10, p. 663-668.
BAUMAN, G.P., BARTIK, M.M., BROOKS, W.H. et al. Induction of cAMP-dependent
protein kinase (PKA) activity in T cells after stimulation of the prostaglandin E2 or the beta-
adrenergic receptors; relationship between PKA activity and inhibition of anti-CD3
monoclonal antibody-induced T cell proliferation. Cell. Immunol., 1994, Vol. 158, N°1, p.
182-194.
BELLAVITE, P., CORSO, F., DUSI, S. et al. Activation of NADPH-dependent superoxide
production in plasma membrane extracts of pig neutrophils by phosphatidic acid. J. Biol.
Chem., 1988, Vol. 263, N°17, p. 8210-8214.
BENTLEY, J.K., KADLECEK, A., SHERBERT, C.H. et al. Molecular cloning of cDNA
encoding a "63"-kDa calmodulin-stimulated phosphodiesterase from bovine brain. J. Biol.
Chem., Vol. 267, N°26, p. 18676-18682.
BERRIDGE, M.J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature, 1993, Vol. 361, p.
182
315-325.
BERRIDGE, M.J. Inositol trisphosphate and diacylglycerol as second messengers. Biochem.
J., 1984, Vol. 220, p. 345-360.
BILLAH, M.M. and ANTHES, J.C. The regulation and cellular functions of
phosphatidylcholine hydrolysis. Biochem. J., 1990, Vol. 269, p. 281-291.
BISHOP, W.R., GANONG, B.R. and BELL, R.M. Attenuation of sn-1,2-diacylglycerol
second messengers by diacylglycerol kinase. J. Biol. Chem., 1986, Vol. 261, N°15, p. 6993-
7000.
BISMUTH, G., THEODOROU, I., GOUY, H. et al. Cyclic AMP-mediated alteration of the
CD2 activation process in human T lymphocytes. Preferential inhibition of the
phosphoinositide cycle-related transduction pathway. Eur. J. Immunol., 1988, Vol. 18, p.
1351-1357.
BLOOM, T.J. and BEAVO, J.A. Identification and tissue-specific expression of PDE7
phosphodiesterase splice variants. Proc. Natl. Sci. USA, 1996, Vol. 93, N°24, p. 14188-14192.
BOCCKINO, S.B., and EXTON J.H. Handbook of lipid research. New. York : Plenum,
1996, p. 75-123.
BOCCKINO, S.B., BLACKMORE, P.F., WILSON, P.B. et al. Phosphatidate
accumulation in hormone-treated hepatocytes via a phospholipase D mechanism. J. Biol.
Chem., 1987, Vol. 262, N°31, p. 15309-13315.
BOCCKINO, S.B., WILSON, P.B. and EXTON, J.H. Phosphatidate-dependent protein
phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, Vol. 88, p. 6210-6213.
BOKOCH, G.M. Chemoattractant signaling and leukocyte activation. Blood, 1995, Vol. 86,
N°5, p. 1649-1660.
BOLGER, G., MICHAELI, T., MARTINS, T. et al. A family of human
phosphodiesterases homologous to the dunce learning and memory gene product of
Drosophila melanogaster are potential targets for antidepressant drugs. Mol. Cell. Biol., 1993,
Vol. 13, p. 6558-6571.
BOLGER, G.B., McPHEE, I. and HOUSLAY, M.D. Alternative splicing of cAMP-specific
phosphodiesterase. Characterization of a novel tissue-specific isoform, RNPDE4A8. J. Biol.
183
Chem., 1996, Vol. 271, N°2, p. 1065-1071.
BOUKHCHACHE, D. and LAGARDE, M. Interaction between prostaglandin precursors
during their oxygenation by human platelets. Biochim. Biopphys. Acta, 1982, Vol. 713, p.
386-392.
BOURGOIN, S.and GRINSTEIN, S. Peroxides of vanadate induce activation of
phospholipase D in HL-60 cells. Role of tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 1992, Vol.
267, p. 11908-11916.
BOURGOIN, S., HARBOUR, D. DESMARAIS, Y. et al. Low molecular weight GTP-
binding proteins in HL-60 granulocytes. assessment of the role of ARF and of a 50-kDa
cytosolic protein in phospholipase D activation. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°7, p. 3172-
3178.
BOWMAN, E.P., UHLINGER, D.J. and LAMBETH, J.D. Neutrophil phospholipase D is
activated by a membrane-associated Rho family small molecular weight GTP-binding protein.
J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°29, p. 21509-21512.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, Vol.
72, p. 248-254.
BREITTMAYER, J.P., AUSSEL, C., FARAHIFAR, D. et al. A phosphatidic acid-
sensitive intracellular pool of calcium is released by anti-CD3 in Jurkat T cells. Immunol.,
1991, Vol. 73, p. 134-139.
BRISCOE, C.P., MARTIN, A., CROSS, M. et al. Roles of multiple pathways in regulating
bombesin-stimulated phospholipase D activity in Swiss 3T3 fibroblasts. Biochem. J., 1995,
Vol. 306, N°1, p. 115-122.
BROWN, H.A., GUTOWSKI, S, KAHN, R.A. et al. Partial purification and
characterization of Arf-sensitive phospholipase D from porcine brain. J. Biol. Chem., 1995,
Vol. 270, N°25, p. 14935-14943.
BROWN, H.A., GUTOWSKI, S., MOOMAW, C.R. et al. ADP-ribosylation factor, a small
GTP-dependent regulatory protein stimulates phospholipase D activity. Cell., 1993, Vol. 75,
184
p. 1137-1144.
BRUDER, J.T., HEIDECKER, G. and RAPP, U.R. Serum-, TPA-, and Ras-induced
expression from Ap-1/Ets-driven promoters requires Raf-1 kinase. Genes. Dev., 1992, Vol. 6,
N°4, p. 545-556.
BUNTING, M., TANG, W., ZIMMERMANN, G.A. et al. Molecular cloning and
characterization of a novel human diacylglycerol kinase ξ. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271,
N°17, p. 10230-10236.
BURGENING, B.M. and BOS, J.L. Regulation of Ras-mediated signalling: more than one
way to skin a cat. Trends Biochem. Sci., 1995, Vol. 20, N°1, p. 18-22.
BURGERING, B.M.T., PRONK, G.J., VAN WERREN, P.C. et al. cAMP antagonizes p21
Ras-directed activation of extracellular signal-regulated kinase 2 and phosphorylation of mSos
nucleotide exchange factor. EMBO J., 1993, Vol. 12, N°11, p. 4211-4220.
BURSTEN, S., WEEKS, R., WEST, J. et al. Potential role for phosphatidic acid in
mediating the inflammatory responses to TNFα and IL-1β. Circ. Shock., 1994, Vol. 44, p. 14-
29.
BURSTEN, S.L. and HARRIS, W.E. Interleukin-1 stimulates phosphatidic acid-mediated
phospholipase D activity in human mesangial cells. Am. J. Physiol., 1994, Vol. 266, p.
C1093-C1104.
BURSTEN, S.L., HARRIS, W.E., BOMSZTYK, K. et al. Interleukin-1 rapidly stimulates
lysophosphatidate acyltransferase and phosphatidate phosphohydrolase activities in human
mesangial cells. J. Biol. Chem., 1991, Vol. 266, N°31, p. 20732-20743.
BUTCHER, R.W. and SUTHERLAND, E.W. Adenosine 3', 5'-phosphate in biological
materials. 1. Purification and properties of the cyclic 3',5'-nucleotide phosphodiesterase and
use of this enzyme to characterize adenosine 3', 5'-phosphate in human urine. J. Biol. Chem.,
1962, Vol. 237, p. 1244-1250.
CALDWELL, K.K., NEWELL, M.K., CAMBIER, J.C. et al. Evaluation of methods for
the isolation of plasma membranes disphaying guanosine 5'-triphosphate-dependence for the
regulation of adenylate cyclase activity ; potential application to the study of other guanosine
185
5'-triphosphate-dependent transduction systems. Anal. Biochem., 1988, Vol. 175, p. 177-190.
CAND, F. and VERDETTI, J. Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, and
lipid peroxidation in the major organs of the aging rats. Free Radic. Biol. Med., 1989, Vol. 7,
N°1, p. 59-63.
CANO, E., MUNOZ-FERNANDEZ, M.A. and FRESNO, M. Regulation of interleukin-2
responses by phosphatidic acid. Eur. J. Immunol., 1992, Vol. 22, p. 1883-1889.
CHAKKALATH, H.R. and JUNG, L.K. Augmentation of phorbol ester-induced T cell
proliferation by agents which raise intracellular cyclic adenosine monophosphate. Cell.
Immunol., 1992, Vol. 145, N°2, p. 240-253.
CHARBONNEAU, J. Structure function relationships among cyclic nucleotide
phosphodiesterases. In : Cyclic nucleotide phosphodiesterases, structure, regulation and drug
action. Ed. Beavo, J.A., Houslay M.D., Chichester, UK : John Wiley & Sons, 1990, Vol. 2, p.
267-296.
CHENG, A.M., ROWLEY, B., PAO, W. et al. Syk tyrosine kinase required for mouse
viability and B-cell development. Nature, 1995, Vol. 378, N°6554, p. 303-306.
CHONG, L.D., TRAYNOR-KAPLAN, A., BOKOCH, G.M. et al. The small GTP-binding
protein Rho regulates a phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase in mammalian cells. Cell.,
1994, Vol. 79, N°3, p. 507-513.
CHU, K. and LITTMAN, D.R. Requirement for kinase activity of CD4-associated p56 lck
in antibody-triggered T cell signal transduction. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, p. 24095-
24101.
CHUANG, T-H, BOHL, B.P. and BOKOCH, G.M. Biologically active lipids are regulators
of Rac. GDI complexation. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°35, p. 26206-26211.
CIFONE, M.G., RONCAIOLI, P., DE MARIA, R. et al. Multiple pathways originate at the
Fas/APO-1 (CD95) receptor: sequential involvement of phosphatidylcholine-specific
phospholipase C and acidic sphingomyelinase in the propagation of the apoptotic signal.
EMBO. J., 1995, Vol. 14, N°23, p. 5859-5868.
186
CLAPHAM, D.E. Calcium signaling. Cell., 1995, Vol. 80, p. 259-268.
COFFEY, R.C., HADDEN, E.M. and HADDEN, J.W. Phytohemagglutinin stimulation of
guanylate cyclase in human lymphocytes. J. Biol. Chem., 1981, Vol. 256, N°9, p. 44118-
4424.
COFFEY, R.G. and HADDEN J.W. Phorbol myristate acetate stimulation of lymphocyte
guanylate cyclase and cyclic guanosine 3':5'-monophosphate phosphodiesterase and reduction
of adenylate cyclase. Cancer, Res., 1983, Vol. 43, N°1, p. 150-158.
COFFEY, R.G., HADDEN, E.M., LOPEZ, C. et al. cGMP and calcium in the initiation of
cellular proliferation. Adv. Cyclic. Nucleotide. Res., 1978, Vol. 9, P. 661-676.
COKCROFT, S., THOMAS, G.M.H., FENSOME, A. et al. Phospholipase D: a
downstream effector of ARF in granulocytes. Sciences, 1994, Vol. 263, p. 523-526.
COLICELLI, J., BIRCHMEIR, C., MICHAELI, T. et al. Isolation and characterization of
a mammalian gene encoding a high-affinity cAMP phosphodiesterase. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1989, Vol. 86, p. 3599-3603.
COLLEY, W.C., ALTSHULLER, Y.M., SUE-LING, C.K. Cloning and expression
analysis of murine phospholipase D1. Biochem. J., 1997, Vol. 326, N°3, p. 745-753.
CONRICODE, K.M., BREWER, K.A. and EXTON, J.H. Activation of phospholipase D
by protein kinase C. Evidence for a phosphorylation-independent mechanism. J. Biol. Chem.,
1992, Vol. 267, N°11, p. 7199-7202.
CONRICODE, K.M., SMITH, J.L., BURNS, D.J. et al. Phospholipase D activation in
fibroblast membranes by the alpha and beta isoforms of protein kinase C. FEBS. Lett., 1994,
Vol. 342, N°2, p. 149-153.
COOK S.J. and MC CORMICK F. Inhibition by cAMP of Ras-dependent activation of raf.
Science, 1993, Vol. 262, p. 1069-1072.
COQUIL, J-F. Properties of the cyclic GMP phosphodiesterase from rat lung inhibition by
unsaturated fatty acids. Biochem. Biophys. Acta., 1983, Vol. 743, p. 359-369.
COURTIERE, A., COTTE, J.M., PIGNOL, F. et al. Lipid peroxidation in aged patients.
187
Influence of an antioxidant combination. Therapie, 1989, Vol. 44, N°1, p. 13-17.
DAVIS, R.L., TAKAYASU, H., EBERWINE, M. et al. Cloning and characterization of
mammalian homologs of the drosophila dunce gene. Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, Vol. 86, p.
3604-3608.
DAY, C.P. and YEAMAN, S.J. Physical evidence for the presence of two forms of
phosphatidate phosphohydrolase in rat liver. Biochim. Biophys. Acta., 1992, Vol. 1127, N°1,
p. 87-94.
De CHAFFOY De COURCELLES, D., ROEVENS, P. and Van BELLE, H. R59 022, a
diacylglycerol kinase inhibitor. J. Biol. Chem., 1985, Vol. 260, N°29, p. 15762-15770.
DEKKER, L.V. and PARKER P.J. Protein kinase C - a question of specificity. TIBS, 1994,
Vol. 19, p. 73-77.
DEVILLER, P., CILLE, Y. and BETUEL, H. Guanyl cyclase activity of human blood
lymphocytes. Enzyme, 1975, Vol. 19, N°5-6, p. 300-313.
DINH, T.T. and KENNERLY, D.A. Assessment of receptor-dependent activation of
phophatidylcholine hydrolysis by both phospholipase D and phospholipase C. Cell. Regul.,
1991, Vol. 2, N°4, p. 299-309.
DiSANTO, M.E., GLASER, K.B. and HEASLIP, R.J. Phospholipid regulation of a cyclic
AMP-specific phosphodiesterase (PDE4) from U937 cells. Cell. Signal., 1995, Vol. 7, N°8, p.
827-835.
DOWNWARD, J., GRAVES, J.D., WARNE, P.H.et al. Stimulation of p21 ras upon T-cell
activation. Nature, 1990, Vol. 346, N°6286, p. 719-723.
DUBOIS, D., NEMOZ, G., LAGARDE, M. et al. Phospholipid metabolism modulates
cyclic nucleotide phosphodiesterase activity in rat microsomes. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1990, Vol. 170, N°2, p. 800-809.
DUBOIS, M., PICQ, M., NEMOZ, G. et al. Inhibition of the different phosphodiesterase
isoforms of rat heart cytosol by free fatty acids. J. Cardiovasc. Pharmacol., 1993, Vol. 21,
N°4, p. 522-529.
188
DUBYAK, G.R., SCHOMISCH, S.J., KUSNER, D.J. Phospholipase D activity in
phagocytic leucocytes is synergistically regulated by G-protein-and tyrosine kinase-based
mechanisms. Biochem. J., 1993, Vol. 2292, N°1, p. 121-128.
DUCAN, D.D. and LAWRENCE, D.A. Oxidatively stressed lymphocytes remain in G0/G1a
on mitogenic stimulation. J. Biochem. Toxicol., 1990, Vol. 5, N°4, p. 229-235.
DUNLOP, M.E. and LARKINS, R.G. Effects of phosphatidic acid on islet cell
phosphoinositide hydrolysis, Ca2+, and adenylate cyclase. Diabetes, 1989, Vol. 38, N°9, p.
1187-1192.
EL BAWAB, S., MACOVSCHI, O., SETTE, C. et al. Selective stimulation of a cAMP-
specific phosphodiesterase (PDE4A5) isoform by phosphatidic acid molecular species
endogenously formed in rat thymocytes. Eur. J. Biochem., 1997, Vol. 247, p. 1151-1157.
ELDAR, H., BEN-AV., B., SCHMIDT, U-T. et al. Up-regulation of phospholipase D
activity induced by overexpression of protein kinase C-α. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268,
N°17, p. 12560,12564.
ENGELS, P., SULLIVAN, M., MULLER, T. et al. Molecular cloning and functional
expression in yeast of a human cAMP-specific phosphodiesterase subtype (PDE IV-C). FEBS.
Lett., 1995, Vol. 358, N°3, p. 305-310.
ENGLISH, D., TAYLOR, G. and GARCIA, J.G. Diacylglycerol generation in fluoride-
treated neutrophils; involvement of phospholipase D. Blood, 1991, Vol. 77, N°12, p. 2746-
2756.
EPAND, R.M. and STAFFORD, A.R. Counter-egulatory effects of phosphatidic acid on
protein kinase C activity in the presence of calcium and diolein. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1990, Vol. 171, N°1, p. 487-490.
EPSTEIN, P.M. and HACHISU, R. Cyclic nucleotide phosphodiesterase in normal and
leukemic human lymphocytes and lymphoblasts. Adv. Cycl. Nucleot. Prot., 1984, Vol. 16, p.
303-319.
EPSTEIN, P.M., Jr. MORASKI, S. and HACHISU, R. Identification and characterization
of a Ca2+-calmodulin-sensitive cyclic nucleotide phosphodiesterase in a human
lymphoblastoid cell line. Biochem. J., 1987, Vol. 243, p. 533-539.
189
EPSTEIN, P.M., MILLS, J.S., ROSS, C.P. Increased cyclic nucleotide phosphodiesterase
activity associated with proliferation and cancer in human and murine lymphoid cells.
Cancer. Res., 1977, Vol. 37, N°11, p. 4016-4023.
ESSEN, L-O., PERISIC, O. CHEUNG, R. et al. Crystal structure of a mammalian
phosphoinositide-specific phospholipase Cγ. Nature, 1996, Vol. 380, p. 595-602.
EXTON, J.H. New developments in phospholipase D. J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, N°25,
p. 15579-15582.
EXTON, J.H. Phosphatidylcholine breakdown and signal transduction. Biochim. Biophys.
Acta., Vol. 1212, p. 26-42.
EXTON, J.H. Signaling through phosphatidylcholine breakdown. J. Biol. Chem., 1990, Vol.
265, N°1, p. 1-4.
FERGUSON, J.E. and HANLEY, M.R. Phosphatidic acid and lysophosphatidic acid
stimulate receptor-regulated membrane currents in the Xenopus leavis oocyte. Arch. Biochem.
Biophys., 1992, Vol. 297, N°2, p. 388-392.
FISCHMAN, C.M., UDEY, M.C., KURTZ, M. et al. Inhibition of lectin-induced
lymphocyte activation by 2-cyclohexene-1-one: decreased intracellular glutathione inhibits an
early event in the activation sequence. J. Immunol., 1981, Vol. 127, N°6, p. 2257-2262.
FLEMING, I.N., ELLIOTT, C.M. and EXTON, J.H. Differential translocation of Rho
family GTPases by lysophosphatidic acid, endothelin-1, and platelet-derived growth factor. J.
Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°51, p. 33067-33073.
FLORES, I., CASASECA, T., MARTINEZ-A, C., KANOH, H. et al. Phosphatidic acid
generation through interleukin 2 (IL-2)-induced alpha-diacylglycerol kinase activation is an
essential step in IL-2-mediated lymphocyte proliferation. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271,
N°17, p. 10331-10340.
FRANCIS,S.H, COLBRAN, J.L., MacALLISTER-LUCAS, L.M. et al. Sinc interactions
and conserved motifs of the cGMP-binding cGMP-specific phosphodiesterase suggest that it
is a zinc hydrolase. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°36, p. 2247-22480.
190
FRANKS, D.J., MacMANUS, J.P. and WHITIELD, J.F. The effect of prostaglandins on
cyclic AMP production. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, Vol. 44, N°5, p. 11771183.
FREED, B.M., RAPOPORT, R. and LEMPERT, N. Inhibition of early events in the
human T-lyphocyte response to mitogens and alloantigens by hydrogen peroxide. Arch. Surg.,
1987, Vol. 122, N°1, p. 99-104.
FRIEDLANDER, G., LE GRIMELLEC, C., SRAER, J. et al. 12-HETE modulates Na-
coupled uptakes in proximal tubular cells: role of diacylglycerol kinase inhibition. Am. J.
Physiol., 1990, Vol. 259, N°28, p. F816-F822.
FROELICH, C.J., BURKETT, J.S., GUIFFAUT, S. et al. Phytohemagglutinin induced
proliferation by aged lymphocytes: reduced expression of high affinity interleukin-2 receptors
and interleukin-2 secretion. Life Sciences, 1988, Vol. 43, p. 1583-1590.
FUNKAMI, K. and TAKENAWA, T. Phosphatidic acid that accumulates in platelet-derived
growth factor-stimulated Balb/c 3T3 cells is a potential mitogenic signal. J. Biol. Chem.,
1992, Vol. 267, N°16, p. 10988-10993.
GARBERS, D.L. Guanylate cyclase, a cell surface receptor. J. Biol. Chem., 1989, Vol. 264,
N°16, p. 9103-9106.
GELFAND, E.W., WEINBERG, K., MAZER, B.D. et al. Absence of ZAP-70 prevents
signaling through the antigen receptor on peripheral blood T cells but not on thymocytes. J.
Exp. Med., 1995, Vol. 182, p. 1057-1065.
GHOSH, S. and BALTIMORE, D. Activation in vitro of NF-kappa B by phosphorylation of
its inhibitor I kappa B. Nature, 1990, Vol. 344, N°6267, p. 678-682.
GHOSH, S., STRUM, J.C., SCIORRA, B.A. et al. Raf-1 kinase possesses distinct binding
domains for phosphatidylserine and phosphatidic acid. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°14,
p. 8472-8480.
GIEMBYCZ, M.A., CORRIGAN, C.J., SEYBOLD, J. et al. Identification of cyclic AMP
phosphodiesterases 3, 4 and 7 in human CD4+ and CD8+ T-lymphocytes: role in regulating
proliferation and the biosynthesis of interleukin-2. Br. J. Pharmacol., 1996, Vol. 118, N°8, p.
1945,-1958.
191
GILLIS, S., KOZAK, R., DURANTE, M. et al. Immunological studies of aging. J. Clin.
Invest., 1981, Vol. 67, p. 937-942.
GOLDBERG, N.D., GRAFF, G. HADDOX, M.K. et al. Redox modulation of splenic cell
soluble guanylate cyclase activity: activation by hydrophilic and hydrophobic oxidants
represented by ascorbic and dehydroascorbic acids, fatty acid hydroperoxides, and
prostaglandin endoperoxides. Adv. Cyclic. Nucleotide Res., 1978, Vol. 9, p. 101-130.
GOODWIN, J.S. and MESSNER, R.P. Sensitivity of lymphocytes to prostaglandin E2
increases in subjects over age 70. J. Clin. Invest., 1979, Vol. 64, p. 434-439.
GOTO, K. and KONDO, H. Molecular cloning and expression of a 90-kDa diacylglycerol
kinase that predominantly localizes in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol. 90, p.
7598-7602.
GOTO, K., FUNAYAMA, M. and KONDO, H. Cloning and expression of a cytoskeleton-
associated diacylglycerol kinase that is dominantly expressed in cerebellum. proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1994, Vol. 91, p. 13042-13046.
GOTO, K., WATANABE, M., KONDO, H. Gene cloning, sequence, expression and in situ
localization of 80 kDa diacylglycerol kinase specific to oligodendrocyte of rat brain. Brain.
Res. Mol. Brain. Res., 1992, Vol. 16, p. 75-87.
GRANGER, D.L., HIBBS, J.B. Jr., PERFECT, J.R. et al. Specific amino acid (L-arginine)
requirement for the microbiostatic activity of murine macrophages. J. Clin. Invest., 1988, Vol.
81, N°4, p. 1129-1136.
GRAVES, J.D. and CANTRELL, D.A. An analysis of the role of guanine nucleotide
binding proteins in antigen receptor/CD3 antigen coupling to phospholipase C. J. Immunol.,
1991, Vol. 146, N°7, p. 2102-2107.
GROSMAN, A., LEDBETTER J.A. and RABINOVITCH, P.S. Reduced proliferation in T
lymphocytes in aged humans is predominantly in the CD8+ subset and is unrelated to defects
in transmembrane signaling which are predominalty in the CD4+ subset. Exp. Cell. Res.,
1989, Vol. 180, p. 367-382.
192
GROSSI, I.M., FITZGERALD, L.A., UMBARGER, L.A. et al. Bidirectional control of
membrane expression and/or activation of the tumor cell IRGpIIb/IIIa receptor and tumor cell
adhesion by lipoxygenase products of arachidonic acid and linoleic acid. Cancer Res., 1989,
Vol. 49, N°4, p. 1029-1037.
GUALDE, N., ATLURU, D. and GOODWIN, J.S. Effect of lipoxygenase metabolites of
arachidonic acid on proliferation of human T cells and T cell subsets. J. Immunol., 1985,
Vol.134, N°2, p. 1125-1129.
GULBINS, E., COGGESHALL, K.M., BAIER, G. et al. Tyrosine kinase-stimulated
guanine nucleotide exchange activity of Vav in T cell activation [see comments]. Science,
1993, Vol. 260, N°5109, p. 822-825.
GULBINS, E., COGGESHALL, K.M., LANGLET, C. et al. Activation of Ras in vitro and
in intact fibroblasts by the Vav guanine nucleotide exchange protein. Mol. Cell. Biol., Vol. 14,
N°2, p. 902-913.
HA, K-S. and EXTON, J.H. Differential translocation of protein kinase C isozymes by
thrombin and platelet-derived rowth factor. A possible function for phosphatidylcholine-
derived diacylglycerol. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°14, p. 10535-10539.
HADDEN, J.W. and COFFEY, R.G. Cyclic nucleotides in mitogen-induced lymphocyte
proliferation. Immunol. Today, 1982, Vol. 3, N°11, p. 299-304.
HADDEN, J.W. Transmembrane signals in the activation of T-lymphocytes by lectin
mitogens. Mol. Immunol., 1988, Vol. 25, N°11, p. 1105-1112.
HADDEN, J.W. Transmembrane signals in the activation of T-lymphocytes by lectin
mitogens. Molecular. Immunol., 1988, Vol. 25, N°11, p. 1105-1112.
HADJIAGAPIOU, C. and SPECTOR, A.A. 12-hydroxyeicosatetraenoic acid reduces
prostacyclin production by endothelial cells. Prostaglandins, 1986, Vol. 31, N°6, p. 1135-
1144.
HADJIAGAPIOU, C., TRAVERS, J., FERTEL, R. et al. b-oxidation of 12(S)-dyroxy-
5,8,10,14-eicosatetraenoic acid by MOLT-4 lymphocytes. Arch. Biochem. Biophys., 1992,
Vol. 292, N°1, p. 112-120.
HAGERMAN, R.A., SMITH, T.J. and LOCNISKAR, M.F. Lipoxygenase metabolites
193
activate protein kinase C. FABSEB. J., 1993, Vol. 7, p. A601.
HAIT, W.N. and WEISS, B. Cyclic nucleotide phosphodiesterase of normal and leukemic
lymphocytes. Kinetic properties and selective alteration of the activity of the multiple
molecular forms. Mol. Pharmacol., 1979, Vol. 16, N°3, p. 851-864.
HALENDA, S.P. and REHM, A.G. Evidence for the calcium-dependent activation of
phospholipase D in thrombin-stimulated human erythroleukaemia cells. Biochem. J., 1990,
Vol. 267, N°2, p. 479-483.
HAMBERG, M. and SAMUELSSON, B. Prostaglandin endoperoxides. Novel
transformations of arachidonic acid in human platelets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, Vol.
71, N°9, p. 3400-3404.
HAMMOND, S.M., ALTSHULLER, Y.M., SUNG, T-C et al. Human ADP-ribosylation
factor-activated phosphatidylcholine-specific phospholipase D defines a new and higly
conserved gene family. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°50, p. 29640-29643.
HAMMOND, S.M., JENCO, J.M., NAKASHIMA, S. Characterization of two alternately
spliced forms of phospholipase D1. Activation of the purified enzymes by
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, ADP-ribosylation factor, and RHO family monomeric
GTP-binding proteins and protein kinase C-α. J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, N°6, p. 3860-
3868.
HANNUN, Y.A. and OBEID, L.M. Ceramide : an intracellular signal for apoptosis. TIBS,
1995, Vol. 20, p. 73-77.
HARNETT, M. and RIGLEY, K. The role of G-proteins versus protein tyrosine kinase in
the regulation of lymphocyte activation. Immunol. T., 1992, Vol. 13, N°12, p. 482-486.
HARNETT, M.M. and KLAUSS, G.G. G protein coupling of antigen receptor-stimulated
polyphosphoinositide hydrolysis in B cells. J. Immunol., 1988, Vol. 140, N°9, p. 3135-3139.
HARRIS, R.A., SCHMIDT, J., HITSEMANN, R.J. et al. Phosphatidate as a molecular link
between depolarization and neurothransmitter release in the brain. Science, 1981, Vol. 212,
N°4500, p. 1290-1291.
HARTWIG, J.H., THELEN, M., ROSEN, A. et al. Marcks is an actin filament crosslinking
protein regulated by protein kinase C and calcium-calmodulin. Nature, 1992, Vol. 356, p.
194
618-622.
HASLAM, R.J., SALAMA, S.E., FOX, J.E. et al. Platelets: cellular response mechanism
and their biological significance (Eds Rotman, A., Meyer, F.A., Gither, G., Silderberg, A.)
New York : Wiley, 1980, p. 213-231.
HEADINGS, M. Metabolism of molecular species of diacylglycerophospholipids, Adv.
Lipid. Res., 1978, Vol. 16, p. 1-125.
HENRY, R.A., BOYCE, S.Y., KURZ, T. et al. Stimulation and binding of myocardial
phospholipase C by phosphatidic acid. Am. J. Physiol., 1995, Vol. 38, p. C349-C358.
HERBERTSSON, H. and HAMMARSTROM, S. High-affinity binding sites for 12(S)-
hydroxy-5,8,10,14-eicosatetraenoic acid (12(S)-HETE) in carcinoma cells. FEBS., 1992, Vol.
298, N°2-3, p. 249-252.
HO, J.L., ZHU, B., HE, S. et al. Interleukin 4 receptor signaling in human monocytes and
U937 cells involves the activation of a phosphatidylcholine-specific phospholipase C; a
comparison with chemotactic peptide, FMLP, phospholipase D, and sphingomyelinase. J.
Exp. Med., 1994, Vol. 180, N°4, p. 1457-1469.
HOFER, G., BIEGLMAYER, C., KOPP, B. et al. Measurement of eicosanoids in
menstrual fluid by the combined use of high pressure chromatography and
radioimmunoassay. Prostaglandins, 1993, Vol. 45, N°5, p. 413-426.
HOFFMAN, R.A., LANGREHR, J.M., BILLIAR, T.R. et al. Alloantigen-induced
activation of rat splenocytes is regulated by the oxidative metabolism of L-arginine. J.
Immunol., 1990, Vol. 145, N°7, p. 2220-2226.
HOLMES, R.P. and YOSS, N.L. Failure of phosphatidic acid to translocate Ca2+ across
phosphatidylcholine membranes. Nature, 1983, Vol. 305, N°5935, p. 637-638.
HOLUB, B.J. and KUKSIS, A. Metabolism of molecular species of
diacylglycerolphospholipids. Adv. Lipid. Res., 1978, Vol. 16, p. 1-125.
HONN, K.V. and TANG, D.G. Adhesion molecules and tumor cell interaction with
endothelium and subendothelial matrix. Cancer Metastasis Rev., 1992, Vol. 11, N°3-4, p.
353-375.
195
HONN, K.V., TANG, D.G., GAO, X. et al. 12-lipoxygenases and 12(S)-HETE: role in
cancer metastasis. Cancer Metastasis. Rev., 1994, Vol. 13, p. 365-396.
HORDIJK, P.L., VERLAAN, I., JALINK, K. et al. cAMP abrogates the p21 ras-mitogen-
activated proteinkinase pahway in fibroblasts. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°5, p. 3534-
3538.
HOULE, M.G., KAHN, R.A., NACCACHE, P.H. et al. ADP-ribosylation factor
ranslocation correlates with poteintiation of GTPγS-stimulated phospholipase D activity in
membrane fractions of HL-60 cells. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°39, p. 22795-22800.
HOWE, L.R. and WEISS, A. Multiple kinases mediate T-cell-receptor signaling. Trends
Biochem., 1995, Vol. 20, p. 59-64.
HUANG, C., WYLKE, R.L. and DANIEL, L.W. Phospholipase D hydrolyzes ether-and
ester-linked glycerophospholipids by different pathways in MDCK cells. Biochem. Biophys.
Res. Commun., 1995, Vol. 213, N°3, p. 950-957.
ICHIMURA, M. and KASE, H. A new cyclic nucleotide phosphodiesterase isozyme
expressed in the T-lymphocyte cell lines. Biochem. biophys. Res. Commun., 1993, Vol. 193,
N°3, p. 985-990.
IKEDA, Y., KIKUCHI, M., TOYAMA, K. Ionophoretic activaties of phospholipids on
human platelets. Thromb. Haemost., 1979, Vol. 41, N°4, p. 779-786.
IMAI, A., ISHIZUKA, Y., KAWAI, K. et al. Evidence for coupling of phosphatidic acid
formation and calcium influx in thrombin-activated human platelets. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1982, Vol. 108, N°2, p. 752-759.
ISOBE, K-I. and NAKASHIMA, I. Nitric oxide production from a macrophage cell line:
interaction with autologous and allogeneic lymphocytes. J. Cell. Biochem., 1993, Vol. 53, p.
198-205.
IWASHIMA, M., IRVING, B.A., VAN OERS, N.S. Sequential interactions of the TCR
with two distinct cytoplasmic tyrosine kinases. Science, 1994, Vol. 263, p. 1139-1139.
JACKOWSKI, S. and ROCK, C.O. Stimulation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
phospholipase C activity by phosphatidic acid. Arch. Biochem. Biophys., Vol. 268, p. 516-
524.
196
JACOB, G., ALLENDE, C.C. and ALLENDE, J.E. Characteristics of phospholipase C
present in membranes of Xenopus laevis oocytes. Stimulation by phosphatidic acid. Comp.
Biochem. Physiol., 1993, Vol. 106, N°4, p. 895-900.
JALINK, K., HORDIJK, P.L. and MOOLENAAR, W.H. Growth factor-like effects of
lysophosphatidic acid, a novel lipid mediator. Biochim. Biophys. Acta., 1984, Vol. 1198, p.
185-196.
JALINK, K., VAN CORVEN, E.J. and MOOLENAAR, W.H. Lysophosphatidic acid, but
not phosphatidic acid, is a potent Ca2(+)-mobilizing stimulus for fibroblasts. Evidence for an
extracellular site of action. J. Biol. Chem., 1990, Vol. 265, N°21, p. 12232-12239.
JAMAL, Z., MARTIN, A., GOMEZ-MUNOZ, A. et al. Plasma membrane fractions from
rat liver contain a phosphatidate phosphohydrolase distinct from that in the endoplasmic
reticulum and cytosol. J. Biol. Chem., 1991, Vol. 266, N°5, p.2988-2996.
JENKINS, G.H., FISETTE, P.L. and ANDERSON, R. Type I phosphatidylinositol 4-
phosphate 5-kinase isoforms are specifically stimulated by phosphatidic acid. J. Biol. Chem.,
1994, Vol. 269, N°15, p. 11547-11554.
JIANG, H., LU, Z., LUO, J-Q. et al. Ras mediates the activation of phospholipase D by v-
Src. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°11, p. 6006-6009.
JIANG, X., PASKIND, M. and EPSTEIN, P.M. Inhibition of calmodulin-dependent
phosphodiesterase induces apoptosis in human leukemic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1996, Vol. 93, N°20, p. 11236-11241.
JIN, S.L.C., SWINNEN, J.V. and CONTI, M. Characterization of the structure of a low
Km, rolipram-sensitive cAMP phosphodiesterase. Mapping of the catalytic domain. J. Biol.
Chem., 1992, Vol. 267, N°26, p. 18929-18939.
JONES, G.A. and CARPENTER, G. The regulation of phospholipase C-g 1 by
phosphatidic acid. Assessment of kinetic parameters. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°28, p.
20845-20850.
JOULAIN, C. Influence des modifications de la composition lipidique des membranes sur les
mecanismes regulateurs de la réponse lymphoproliferative. Thès. Doct. : Institut National des
Sciences Appliquées de Lyon et Univ. Lyon I, 1994, 201 p.
197
JOULAIN, C., MESKINI, N., ANKER, G. et al. Esterification of 12(S)-hydroxy-5,8,10,14-
eicosatetraenoic acid into the phospholipids of human peripheral blood mononuclear cells:
inhibition of the proliferative response. J. Cell. Physiol., 1995, Vol. 164, p. 154-163.
JUNE, C.H., FLETCHER, M.C., LEDBETTER J.A. et al. Inhibition of tyrosine
phosphorylation prevents T-cell receptor-mediated signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci.,
1990, Vol. 87, p. 7722-7726.
KAEVER, V. and RESCH K. Role of cyclic nucleotides in lymphocytes activation. Cur.
Topics Membr. Transport., 1990, Vol. 35, p. 375-398.
KAEVER, V., and RESCH, K. Are cyclic nucleotides involved in the initiation of mitogenic
activation of human lymphocytes ? Biochim. Biophys. Acta., 1985, Vol. 846, p. 216-225.
KAI, M., SAKANE, F., IMAI, S-C. et al. Molecular cloning of a diacylglycerol kinase
isozyme predominantly expressed in human retina with a truncated and inactive enzyme
expression in most other human cells. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°28, p. 18492-18498.
KAMMER, G.M. The adenylate cyclase-cAMP-protein kinase A pathway and regulation of
the immune response. Immunol. Today, 1988, Vol. 9, p. 222-229.
KANG, L-T. and VANKERHOREK, J.Y. Characterization of specific subcellular 15-
hydroxyeicosatetraenoic acide (15-HETE) binding sites on rat basophilic leukemia cells.
Biochim. Biophys. Acta., 1995, Vol. 1256, p. 297-304.
KANOH, H., YAMADA, K. and SAKANE, F . Diacylglycerol kinase: a key modulator of
signal transduction ? Trends Biochem. Sci., 1990, Vol. 15, N°2, p. 47-50.
KARIN M. Signal transduction from cell surface to nucleus in development and disease.
FASEB J., 1992, Vol. 6, p. 2581-2590.
KARIN, M. and SMEAL, T. Control of transcirption factors by signal transduction
pathways: the beginning of the end. Trends. Biochem. Sci., 1992, Vol. 17, N°10, p. 418-422.
KASUYA, J., GOKO, H. and FUJITA-YAMAGUCHI, Y. Multiple transcripts for the
human cardiac form of the cGMP-inhibited cAMP phosphodiesterase. J. Biol. Chem., 1995,
Vol. 270, N°24, p. 14305-14312.
KASZKIN, M., RICHARDS, J. and KINZEL, V. Proposed role of phosphatidic acid in the
198
extracellular control of the transition from G2 phase to mitosis excerted by epidermal growth
factor in A431 cells. Cancer. Res., 1992, Vol. 52, p. 5627-5634.
KAWASE, T. and SUZUKI, A. Initial responses of a clonal osteroblast-like cell line, MOB
3-4, to phosphatidic acid in vitro. Bone Miner, 1990, Vol. 10, N°1, p. 61-70.
KAWASE, T. and SUZUKI, A. Phosphatidic acid-induced calcium mobilization in
osteoblasts. J. Biochem., 1988, Vol. 103, p. 581-582.
KHAN, W.A., BLOBE, G.C., RICHARDS, A.L., et al. Identification, partial purification,
and characterization of a novel phospholipid-dependent and fatty-acitvated protein kinase
form human platelets. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°13, p. 9729-9735.
KHANSARI, D.N. and GUSTAD, T. Effects of long-term, low dose growth hormone
therapy on immune function and life expectancy of mice. Mech. Ageing Dev., 1991, Vol. 57,
N°1, p. 87-100.
KHOSRAVI-FAR, R., SOLSKI, P.A., CLARK, G.J. et al. Activation of Rac1, RhoA, and
mitogen-activated protein kinases is required for ras transformation. Mol. Cell. Biol., 1995,
Vol. 15, N°11, p. 6443-6453.
KIESEL, L. and CATT, K.J. Phosphatidic acid and the calcium-dependent actions of
gonadotropin-releasing hormone in pituitary gonadotrophs. Arch. Biochem. Biophys., 1984,
Vol. 231, N°1, p. 202-210.
KIKKAWA, U. and NISHIZUKA, Y. The role of protein kinase C in transmembrane
signalling. Annu. Rev. Cell. Biol., 1986, Vol. 2, p. 149-178.
KNAUS, U.G., HEYWORTH, P.G., EVANTS, T. et al. Regulation of phagocyte oxygen
radical production by the GTP-binding protein Rac 2. Science, 1991, Vol. 254, N°5037, p.
1512-1515.
KNAUSS, T., JAFFER, F.E. and ABBOUD, H.E. Phosphatidic acid modulates DNA
synthesis, phospholipase C, and platelet-derived growth factor mRNAs in cultured mesangial
cells. Role of protein kinase C., J. Biol. Chem., 1990, Vol. 265, N°24, p. 14457-14463.
KNUDSEN, T.E., LARSEN, C.S. and JOHNSEN, H.E. Astudy of cyclic nucleotides as
second messengers after interleukin 2 stimulation of human T lymphocytes. Scand J.
Immunol., 1987, Vol. 25, N°5, p. 527-531.
199
KRABAK, M.J. and HUI, S-W. The mitogenic activities of phosphatidate are acyl-chain-
lengh dependent and calcium independent in C3H/10T1/2 cells. Cell. Regul., 1991, Vol. 2, p.
57-64.
KROLL, M.J., ZAVOICO, G.B. and SCHAFFER, A.I. Second messenger function of
phosphatidic acid in platelet activation. J. Cell. Phys., 1989, Vol. 139, p. 558-564.
KTISTAKIS, N.T., BROWN, H.A., STERNWEIS, P.C. et al. Phospholipase D is present
on Golgi-enriched membranes and its activation by ADP ribosylation factor is sensitive to
brefeldin a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, p. 4952-4956.
KTISTAKIS, N.T., BROWN, HA.A., WATERS, M.G. et al. Evidence that phospholipase
D mediates ADP ribosylation factor-dependent formation of Golgi coated vesicles. J. Cell.
Biol., 1996, Vol. 134, N°2, p. 295-306.
KURIBARA, H., TAGO, K., YOKOZADI, T. et al. Synergistic activation of rat brain
phospholipase D by ADP-ribosylation factor and rhoA p21, and its inhibition by clostridium
botulinim C3 exoenzyme. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, p. 25667-25671.
KUSNER, D.J., SCHOMISCH, S.J. and DUBYAK, G.R. ATP-Iinduced potentiation of G-
protein-dependent phospholipase D activity in a cell-free system from U937 promonocytic
leukocytes. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°27, p. 19973-19982.
KWAK, J.Y., LOPEZ, I., UHLINGER, D.J. et al. RhoA and a cytosolic 50 kDa factor GTP
gamma S-dependent phospholipase D activity in human neutrophil subcellular fractions. J.
Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°45, p.27093-27098.
LAGARDE, A. and COLOBERT, L. Cyclic 3',5'-AMP phosphodiesterase of human blood
lymphocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1972, Vol. 276, N°2, p. 444-453.
LAHDENPOHJA, N. HENTTINEN, T. and HURME, M. Activation of the protein kinase
a increases the DNA-binding and transcriptional activity of c-Rel in T cells. Scand. J.
Immunol., 1996, Vol. 43, N°6, p. 640-645.
LAMBETH, J.D., KWAK, J-Y., BOWMAN, E.P. et al. ADP-ribosylation factor functions
synergistically with a 50-kDa cytosolic factor in cell-free activation of human neutrophil
phospholipase D. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°6, p. 2431-2434.
LAUENER, R., SHEN, Y., DURONIO, V. et al. Selective inhibition of phosphatidylinositol
200
3-kinase by phosphatidic acid and related lipids. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1995, Vol.
215, N°1, p. 8-14.
LAXMINARAYANA, D. and KAMMER, G.M. Activation of type I protein kinase A
during receptor-mediated human T lymphocyte activation. J. Immunol., 1996, Vol. 156, p.
497-506.
LAXMINARAYANA, D., BERRADA, A. and KAMMER, G.M. Early events of human T
lymphocyte activation are associated with type I protein kinase A activity. J. Clin. Invest.,
1993, Vol. 92, p. 2207-2214.
LAYCHOCK, S.G. Coordinate interactions of cyclic nucleotide and phospholipid
metabolizing pathways in calcium-dependent cellular processes. Curr. Top. Cell. Regul.,
1989, Vol. 30, p. 203-242.
LEDBETTER, J.A., PARSONS, M., MARTIN, P.J. et al. Antiobody binding to CD5
(Tp67) and Tp44 T cell surface molecules: effects on cyclic nucleotides, cytoplasmic free
calcium, and cAMP-mediated suppression. J. Immunol., 1986, Vol. 137, N°10, p. 3299-3305.
LEE, C.H., REISINE, T.D. and WAX, M.B. Alterations of intracellular calcium in human
non-pigmented ciliary epithelial cells of the eye. Exp. Eye Res., 1989, Vol. 48, N°6, p. 733-
743.
LEE, S.B. and RHEE, S.G. Significance of PIP2 hydrolysis and regulation of phospholipase
C isozymes. Cell. Biol., 1995, Vol. 7, p. 183-189.
LEE, Y.H., KIM, H;S, PAI, J.K. et al. Activation of phospholipase D induced by platelet-
derived growth factor is dependent upon the level of phospholipase C-gamma1. J. Biol.
Chem., 1994, Vol. 269, p. 26842-26847.
LERNER, A., JACOBSON B. and MILLER R.A. Cyclic AMP concentrations modulate
both calcium flux and hydrolysis of phosphatidylnositol phosphates in mouse T lymphocytes.
J. Immunol., 1988, Vol. 140, N°3, p. 936-940.
LI, T.S., VOLPP, K. and APPLEBURY, M.L. Bovine cone photoreceptor cGMP
phosphodiesterase structure deduced from a cDNA clone. Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 1990,
Vol. 87, N°1, p. 293-297.
LIA, X.C. and LITTMAN, D.R. Altered T cell receptor signaling and disrupted T cell
201
development in mice lacking Itk. Immunity, 1995, Vol. 3, N°6, p. 757-769.
LIMATOLA, C., SCHAAP, D., MOOLENAAR, W.H. et al. Phosphatidic acid activation f
protein kinase C-ζ overexpressed in COS cells: comparison with other protein kinase C
isotypes and other acidic lipids. Biochem. J., 1994, Vol. 304, p. 1001-1008.
LIN, J.V., SINNETT-SMITH, J. and ROZENGURT E. Expression and characterization of
PKD, a phorbol ester and diacylglycerol-stimulated serine proteinkinase. J. Biol. Chem.,
1995, Vol. 270, N°3, p. 1455-1461.
LINGK, D.S., CHAN, M. A. and GELFAND, E.W. Increased cyclic adenosine
monophosphate levels block progression but not initiation of human T cell proliferation. J.
Immunol., 1990, Vol. 145, p. 449-455.
LINK, E., KERR, L.D., SCHRECK, R. et al. Purified I kappa B-beta is inactivated upon
dephosphorylation. J. Biol. Chem., 1992, Vol. 267, n°1, p. 239-246.
LIPKIN, V.M., KHRAMTSOV, N.V., VASILEVSKAYA, I.A. et al. β-subumit of bovine
rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase. Comparison with the phosphodiesterase family.
J. Biol. Chem., 1990, Vol. 265, N°22, p. 12955-12959.
LISCOVITCH, M. and CHALIFA-CASPI, V. Enzymology of mammalian phospholipases
D : in vitro studies. Chem. Physics Lipids, 1996, Vol. 80, p. 37-44.
LISCOVITCH, M., CHALIFA, V., PERTILE, P. et al. Novel function of
phosphatidylinositol 4,5-biphosphate as a cofactor for brain membrane phospholipase D. J.
Biol. Chem., 1994, Vol. 269, p. 21403-21406.
LIU, B., KHAN, W.A., HANNUN, Y.A. et al. 12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid and 13
(S)-hydroxyoctadecadienoic acid regulation of protein kinase C-alpha in melanoma cells: role
of receptor-mediated hydrolysis of inositol phospholipids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995,
Vol. 92, N°20, p. 9323-9327.
LIU, B., TIMAR, J., HOWLETT, J. et al. Lipoxygenase metabolites of arachidonic and
linoleic acids modulate the adhesionof tumor cells to endothelium via regulation of protein
kinase C. Cell. regul., 1991, Vol. 2, N°12, p. 1045-1055.
202
LOPEZ, I., BURNS, D.J. and LAMBETH, J.D. Regulation of phospholipase D by protein
kinase C in human neutrophils. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°33, p. 19465-19472.
LOUGHNEY, K., MARTINS, T.J., HARRIS, E.A.S. et al. Isolation and characterization
of cDNAs correspondinG to two human calcium, calmodulin-regulated, 3'5'-cyclic nucleotide
phosphodiesterases. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°2, p. 796-806.
LOW, C-E., PUPILLO, M.B., BRYANT, R.W. et al. Inhibition of phytohemagglutinin-
induced lymphocyte mitogenesis by lipoxygenase metabolites of arachidonic acid: structure-
activity relationships. J. Lipid Res., 1984, Vol. 25, p. 1090-1095.
LUCAS, S., MARAIS, R., GRAVES, J.D. et al. Heterogeneity of protein kinase C
expression and regulation in T lymphocytes. FEBS Lett., 1990, Vol. 260, p. 53-56.
MacALLISTER-LUCAS, L.M., HAIK, T.L., COLBRAN, J.L. et al. An essential aspartic
acid at each of two allosteric cGMP-binding sites of a cGMP-specific phosphodiesterase. J.
Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°51, p. 30671-30679.
MacALLISTER-LUCAS, L.M., SONNENBURG, W.K., KADLECEK, A. et al. The
structure of a bovine lung cGMP-binding, cGMP-specific phosphodiesterase deduced from a
cDNA clone. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°30, p. 22863-22873.
MacDONALD, M.L., MACK, K.F., RICHARDSON, C.N. et al. Regulation of
diacylglycerol kinase reaction in Swiss 3T3 cells. Increased phosphorylation of endogenous
diacylglycerol and decreased phosphorylation of didecanoylglycerol in response to platelet-
derived growth factor. J. Biol. Chem., 1988, Vol. 263, N°3, p. 1575-1583.
MacDONALD, M.L., MACK, K.F., WILLIAMS, B.W. et al. A membrane-bound
diacylglycerol kinase that selectively phosphorylates arachidonoyl-diacylglycerol. Distinction
from cytosolic diacylglycerol kinase and comparison with the membrane-bound enzyme from
escherichia coli. J. Biol. Chem. 1988, Vol. 263, N°3, p. 1584-1592.
MacGHEE, J.G. and SHOBACK, D.M. Effects of phosphatidic acid on parathyroid
hormone release, intracellular free Ca2+, and inositol phosphates in dispersed bovine
parathyroid cells. Endocrinolog., 1990, Vol., 126, N°2, p. 899-907.
MacPHEE, I., POOLEY, L., LOBBAN, M. et al. Identification, characterization and
203
regional distribution in brain of RPDE-6 (RNPDE4A5), a novel splice variant of the PDE4A
cyclic AMP phosphodiesterase family. Biochem. J., 1995, Vol. 310, p. 965-974.
MAJERUS, P.W. Inositol phosphate biochemistry. Annu. Rev. Biochem., 1992, Vol. 61, p.
225-250.
MAKINODAN, T. and DAY, M.M. Age influence on the immune system. Adv. Immunol.,
1980, Vol. 29, p. 287-330.
MALCOLM, K.C., ELLIOTT, C.M. and EXTON, J.H. Evidence for rho-mediated agoniststimulation of phospholipase D in rat1 fibroblasts. Effects of clostridium botulinum C3
exoenzyme. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°22, p. 13135-13139.
MALCOLM, K.C., ROSS, A.H., QIU, R-G. et al. Activation of rat liver phospholipase D
by the small GTP-binding protein RhoA. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°42, p. 25951-
25954.
MALLICK-WOOD, C.A., PAO, W., CHENG, A.M. et al. Disruption of epithelial gamma
delta T cell repertoires by mutation of the Syk tyrosine kinase. Proc. Natl. Sci., 1996, Vol. 18,
p. 9704-9709.
MANGANIELLO, V.C., TAIRA, M., DEGERMAN, E. et al. Type III cGMP-inhibited
cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDE 3 gene family). Cell. Signalling., 1995, Vol. 7,
N°5, p. 445-455.
MANGER, B., WEISS, A., IMBODEN J. et al. The role of protein kinase C in
transmembrane signaling by the T cell antigen receptor complex. J. Immunol., 1987, Vol. 139,
N°8, p. 2755-2760.
MARCOZ, P., NÉMOZ, G., PRIGENT, A-F. et al. Phosphatidic acid stimulates the
rolipram-sensitive cyclic nucleotide phosphodiesterase from rat thymocytes. Biochem.
Biophys. Acta, 1993, Vol. 1176, p. 129-136.
MARCOZ, P., PRIGENT, A-F., LAGARDE, M. et al. Modulation of rat thymocyte
proliferative response through the inhibition of different cyclic nucleotide phosphodiesterase
isoforms by means of selective inhibitors and cGMP-elevating agents. Mol. Pharmacolog.,
1993, Vol. 44, p. 1027-1035.
MARTINSON, E.A., SCHEIBLE, S. and PRESEK, P. Inhibition of phospholipase D of
204
human platelets by protein tyrosine kinase inhibitors. Cell. Mol. Biol., 1994, Vol. 40, N°5, p.
627-634.
MASSENBURG, D., HAN, J.S., LIYANAGE, M. et al. Activation of rat brain
phospholipase D by ADP-ribosylation factors 1,5, and 6: separation of ADP-ribosylation
factor-dependent and oleate-dependent enzymes. Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 1994, Vol. 91,
N°24, p. 11718-11722.
MATUOKA, K., SHIBASAKI, F., SHIBATA, M. et al. Ash/Grb-2, a SH2/SH3-containing
protein, couples to signaling for mitogenesis and cytoskeletal reorganization by EGF and
PDGF. EMBO J., 1993, Vol. 12, N°9, p. 3467-3473.
MAURICE, D.H. and HASLAM, R.J. Molecular basis of the synergistic inhibition of
platelet function by nitrovasodilators and activators of adenylate cyclase: inhibition of cyclic
AMP breakdown by cyclic GMP. Mol. Pharmacolog., 1990, Vol. 37, p. 671-681.
MAURICE, D.H., GRANKSHAW, D. and HASLAM, R.J. Synergistic actions of
nitrovasodilators and isoprenaline on rat aortic smooth muscle. European. J. Pharmacolog.
1991, Vol. 192, p. 235-242.
McPHAIL, L.C., QUALLIOTINE-MANN, D. and WAITE, K.A. Cell-free activation of
neutrophil NADPH oxidase by a phosphatidic acid-regulated protein kinase. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1995, Vol. 92, N°17, p. 7931-7935.
MEACCI, E., TAIRA, M., MOOS, M.Jr. et al. Molecular coling and expression o fhuman
myocardial cGMP-inhibited cAMP phosphodiesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, Vol.
89, N°9, p. 3721-3725.
MEEK, D.W. and STREET, A.J. Nuclear protein phosphorylation and growth control.
Biochem. J. 1992, Vol. 287, N°1, p. 1-15.
MERIDA, I., WILLIAMSON, P., SMITH, K. et al. The role of diacylglycerol kinase
activation and phosphatidate accumulation in interleukin-2-dependent lymphocyte
proliferation. CNA Cell. Biol., 1993, Vol. 12, N°6, p. 473-479.
MERRYMAN, P.F., CLANCY, R.M., HE, X.Y. et al. Modulation of human cell responses
by nitric oxide and its derivative, s-nbitrosoglutathione. Arthritis Rheumatism., 1993, Vol. 36,
N°10, p. 1414-1422.
205
MERY, P.F., PAVOINE, C., PECKER, F. et al. Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine
inhibits cyclic GMP-stimulated phosphodiesterase in isolated cardiac myocytes. Mol.
Pharmacol., 1995, Vol. 48, N°1, p. 121-130.
MESKINI N . Modulation de la phosphodiestérase des nucléotides cycliques au cours de
l'activation lymphocytaire précoce et du vieillissement. Rôle des interactions cellulaires et
implications des médiateurs lipidiques. Thèse Doc., 1992, Lyon, 199 p.
MESKINI, N., MACOVSCHI, O. and PRIGENT, A.F. Decreased cyclic nucleotide
phosphodiesterase activity in human peripheral blood mononuclear cells from elderly women.
Clinical. Sci., 1990, Vol. 79, p. 467-470.
MESKINI, N., NÉMOZ, G., CHAPUY, P. et al. Glutathione peroxidase activity and
metabolism of arachidonic acid in peripheral blood mononuclear cells from elderly subjects.
Clinical. Sci., 1993, Vol. 85, p. 203-211.
MICHAELI, T., BLOOM, T.J. and MARINTS, T. Isolation and characterization of a
previously undetected human cAMP phosphodiesterase by complementation of cAMP
phosphodiesterase-deficient saccharomyces cervisiae*. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°17,
p. 12925-12932.
MICHIE, A.M., LOBBAN, M. and MULLER, T. Rapid regulation of PDE-4 cyclic AMP
phosphodiesterase activity following ligation of the T cell antigen receptor on thymocytes :
analysis using the selective inhibitors erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-adenine (EHNA) and
rolipram. Cell. Signal., 1996, Vol. 8, N°2, p. 97-110.
MILLS, C.D. Molecular basis of "supressor" macrophages. Arginine metabolism via the
nitric oxide synthetase pathway. J. Immunol., 1991, Vol. 146, N°8, p. 2719-2723.
MISCHAK, H., GOODNIGHT, J., HENDERSON, D.W. et al. Unique expression pattern
of protein kinase c-theta: high mRNA levels in normal mouse testes and in T-lymphocytic
cells and neoplasms. FEBS Lett., 1993, Vol. 326, p. 51-55.
MISCHAK, H., PIERCE, J.H., GOODNIGHT, J. et al. Phorbol ester-induced myeloid
differentiation is mediated by protein kinase C-alpha- and -delta and not by protein kinase C-
beta II, -epsilon, -zeta, and -eta. J. Biol. Chem., Vol. 268, p. 20110-20115.
MONTGOMERY, R.B., MOSCATELLO, D.K., WONG, A.J. et al. Epidermal growth
receptor stimulation of diacylglycerol kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, Vol.
206
232, N°1, p. 111-116.
MOOLENAAR, W.H., KRUIJER, W., TILLY, B.C. et al. Growth factor-like action of
phosphatidic acid. Nature, 1986, Vol. 323, p. 171-176.
MORENA, A.R., BOITANI, C., DE GROSSI, S. et al. Stage and cell-specific expression of
the adenosine 3',5' monophosphate-phosphodiesterase genes in the rat seminiferous
eptithelium. Endocrinology, 1995, Vol. 136, N°2, p. 687-695.
MORITZ, A., DE GRAAN, P.N.E., GISPEN, W.H. et al. Posphatidic acid is a specific
activator of phosphatidylinositol-4-phosphate kinase. J. Biol. Chem., 1992, Vol. 267, N°11, p.
7207-7210.
MORRIS, A.J., ENGEBRECHT, J. and FROHMAN, M.A. Structure and regulation of
phospholipase D. Trends. Pharmacol., 1996, Vol. 17, N°5, p. 182-185.
MORRISSON, W.R. and SMITH, L.M. Preparation of fatty acid methylesters and
dimethylacetals from lipids with boron fluoride methanol. J. Lipid Res., 1964, Vol. 5, p. 600-
608.
MOSS, J. and VAUGHAN, M. Structure and function of ARF proteins: activators of cholera
toxin and critical components of intracellular vesicular transport processes. J. Biol. Chem.,
1995, Vol. 270, N°21, p. 12327-12330.
MURAYAMA, T. and UI, M. Phosphatidic acid may stimulate membrane receptors
mediating adenylate cyclase inhibition and phospholipid breakdown in 3T3 fibroblasts. J.
Biol. Chem., 1987, Vol. 262, N°12, p. 5522-5529.
MURRAY, N.R., BAUMGARDNER, G.P., BURNS, D.J. et al. Protein kinase C isotypes
in human erythroleukemia (K562) cell proliferation and differentiation. evidence that beta II
protein kinase C is required for proliferation. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°1, p. 15847-
15853.
MUSTELIN, T. and BURN, P. Regulation of the src family tyrosine kinases in
lymphocytes. TIBS, 1993, VOL. 18, P. 215-219
MUSTELIN, T., COGGESHALL, K.M., ISAKOV, N. et al. T cell antigen receptor-
mediated activation of phospholipase C requires tyrosine phosphorylation. Science, 1990,
207
Vol. 247, p. 1584-1586.
NAGEL, J.E., CHOPRA, R.K., MacCOY, M.T. et al. Decreased proliferation, interleukin
2 synthesis, and interleukin 2 receptor expression are accompanied by decreased mRNA
expression in phytohemagglutinin-stimulated cells from elderly donors. J. Clin. Invest., 1988,
Vol. 81, N°4, p. 1096-1102.
NAGEL, J.E., CHOPRA, R.K., POWERS, D.C. et al. Effect of age on the human high
affinity interleukin 2 receptor of phytohaemagglutinin stimulated peripheral blood
lymphocytes. Clin. Exp. Immunol., 1989, Vol. 75, N°2, p. 286-291.
NAGEL, J.E., CHREST, F.J. and ADLER, W.H. Enumeration of T lymphocyte subsets by
monoclonal antibodies in young and aged humans. J. Immunol., 1981, Vol. 127, N°5, p. 2086-
2088.
NAKAMURA, K. and HANDA, S. Coomassie brilliant blue staining of lipids on thin-layer
plates. Anal. Biochem., 1984, Vol. 142, p. 406-410.
NATHAN, C.F., ARRICK, B.A., MURRAY, H.W. et al. Tumor cell anti-oxidant defenses.
Inhibition of the glutathione redox cycle enhances macrophage-mediated cytolysis. J. Exp.
Med., 1981, Vol. 153, N°4, p. 766-782.
NEGISHI, I., MOTOYAMA, N., NAKAYAMA, K. et al. Essential role for ZAP-70 in both
positive and negative selection of thymocytes. Nature, 1995, Vol. 6539, p. 435-438.
NÉMOZ, G., PRIGENT, A.F., ALOUI, R. et al. Impaired G-proteins and cyclic nucleotide
phosphodiesterase activity in T-lymphocytes from patients with sarcoidosis. Eur. J. Clin.
Invest., 1993, Vol. 23, N°1, p. 18-27.
NÉMOZ, G., SETTE, C. and CONTI, M. Selective activation of rolipram-sensitive, cAMP-
specific phosphodiesterase isoforms by phosphatidic acid. Mol. Pharmacol., 1997, Vol. 51,
N°2, p. 242-249.
NÉMOZ, G., ZHANG, R. and CONTI, M. Identification of cyclic AMP-phosphodiesterase
variants from the PDE4D gene expressed in human peripheral mononuclear cells. FEBS Lett.,
1996, Vol. 384, N°1, p. 97-102.
NEWTON, A. C. Protein kinase C : structure, function and reguletion. J. Biol. Chem., 1995,
Vol. 270, p. 28495-28498.
208
NISHIZUKA Y. Studies and perspectives of protein kinase C. Science, 1986, Vol. 233, p.
305-312.
NISHIZUKA, Y. Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses.
FASEB J., 1995, Vol. 9, N°4, p. 484-496.
NOBES, C.D. and HALL, A. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of
multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and
filopodia. Cell., 1995, Vol. 81, N°1, p. 53-62.
NOVACK, J.P., CHARBONNEAU, H., BENTLEY, J.K. et al. Sequence comparison of
the 63-, 61-, and 59-kDa calmodulin-dependent cyclic nucleotide phosphodiesterases.
Biochem., 1991, Vol. 30, N°32, p. 7940-7947.
NOVOGROKSKY, A., PATYA, M., RUBIN, A.L. et al. Agents that increase cellular
cAMP inhibit production of interleukin-2, but not its activity. Biochem. Biophys. Res.
Commun, 1983, Vol. 114, N°1, p. 93-98.
OHATA, H. and MOMOSE, K. Phosphatidic acid-induced contraction in guinea-pig taenia
coli. . Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1990, Vol. 68, N°3, p. 329-342.
OHATA, H., NOBE, K. and MOMOSE, K. Role of phosphatidic acid in carbachol-induced
contraction in guinea pig Taenia coli. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1991, Vol.
71, N°1,p. 59-72.
OHGUCHI, K., BANNO, Y., NAKASHIMA, S. et al. Regulation of membrane-bound
phospholipase D by protein kinase C in HL60 cells. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°8, p.
4366-4372.
OKAMURA, S-I. and YAMASHITA, S. Purification and characterization of
phosphatidylcholine phospholipase D from pig lung. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°49, p.
31207-31213.
OLSON, S.C., BOWMAN, E.P. and LAMBETH, J.D. Phospholipase D activation in a
cell-free system from human neutrophils by phorbol 12-myristate 13-acetate and guanosine 5'-
0-(3-thiotriphosphate). Activation is calcium dependent and requires protien factors in both
the plasma membrane and cytosol. J. Biol. Chem., 1991, Vol. 266, N°26, p. 17236-17242.
ORSON, F.M., SAADEH, C.K., LEWIS, D.E. et al. Interleukin-2 receptor expression by T
209
cells in human aging. Cell. Immunol., 1989, Vol. 124, p. 278-291.
OSMAN, N., LUCAS, S.C., TURNER, H. et al. A comparison of the interaction of Shc and
the tyrosine kinase ZAP-70 with the T cell antigen receptor z chain tyrosine-based activation
motif. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°23, p; 13981-13986.
OSUGI, T., UCHIDA, S. and WATANABE, Y. Differences in Ca2+ mobilization induced
by alpha-adrenergic agonist and phosphatidic acid in cultured hepatocyes. Life Sci., 1984,
Vol. 30, N°5, p. 469-475.
PAI, J.K., LIEBL, E.C., TETTENBORN, C.S. et al. 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
activates the synthesis of phosphatidylethanol in animal cells exposed to ethanol.
Carcinogenesis, 1987, Vol. 8, N°1, p. 173-178.
PAI, J.K., PACHTER, J.A., WEINSTEIN, I.B. et al. Overexpression of protein kinase C
beta 1 enhances phospholipase D activity and diacylglycerol formation in phorbol ester-
stimulated rat fibroblasts. Proc. Natl. Sci. USA, 1991, Vol. 88, N°2, p. 598-602.
PARKER, C.W., SULLIVAN, T.J. and WEDNER H.J. Cyclic AMP and the immune
response. Adv. Cyclic. Nucleotide. Res., 1974, Vol. 4, p. 1-79.
PASTOR, M.I., REIF, K. and CANTRELL, D. The regulation and function of p21 Ras
during T-cell activation and growth. Immunol. Today, 1995, Vol. 16, N°3, p. 159-164.
PEARCE, B., JAKOBSON, K., MORROW , C. et al. Phosphatidic acid promotes
phosphoinositide metabolism and DNA synthesis in cultured cortical astrocytes. Neurochem.
Int., 1994, Vol. 24, N°2, p. 165-171.
PELASSY, C., BREITTMAYER, J-P., MARY, D. et al. Inhibition of phosphatidylserine
synthesis by phosphatidic acid in the Jurkat T cell line: Role of calcium ions released from
intracellular stores. J. Lipid. Mediators., 1991, Vol. 4, p. 199-210.
PERRY, D.K., STEVENS, V.L., WILDLANSKI, T.S. et al. A novel ecto-phosphatidic acid
phosphohydrolase activity mediates activation of neutrophil superoxide generation by
exogenous phosphatidic acid. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, p. 25302-25310.
PERTILE, P., LISCOVITCH, M., CHALIFA, B. et al. Phosphatidylinositol 4,5-
bisphosphate synthesis is required for activation of phospholipase D in U937 cells., J. Biol.
210
Chem., 1995, Vol. 270, N°10, p. 5130-5135.
PITTLER, S.J., BAEHR, W., WASMUTH, J.J. et al. Molecular characterization of human
and bovine rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase alpha-subumit and chromosomal
localization of the human gene. Genomics, 1990, Vol. 6, N°2, p. 272-283.
PODZUWEIT, T., NENNSTIEL, P. and MULLER, A. Isozyme selective inhibition of
cGMP-stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase by erythro-9-(2-hydroxy-3-nomyl)
adenine. Cell. Signal., 1995, Vol. 7, N°7, p. 733-738.
POST, G.B., SNYDER, R. and KALF, G.F. Inhibition of RNA synthesis and interleukin-2-
production lymphocytes in vitro by benzene and its metabolites, hydroquinone and p-
benzoquinone. Toxicol. Lett., 1985, Vol. 29, N°2-3, p. 161-167.
PRENDERGAST, G.C., KHOSRAVI-FAR, R. and SOLSKI, P.A. Critical role of Rho in
cell transformation by oncogenic ras. Oncogene, 1995, Vol. 10, N°12, p. 2289-2296.
PRIGENT, A.F., NEMOZ, G., YACHAOUI, Y. et al. Cyclic nucleotide phosphodiesterase
from a particulate fraction of rat heart. Solubilization and characterization of a single
enzymatic form. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981, Vol. 102, p. 355-364.
PROLL, M.A., CLARK, R.B. and BUTCHER, R.W. Phosphatitade and
monooleylphosphatidate inhibition of fibroblast adenylate cyclase is mediated by the
inhibitory coupling protein, Ni. Mol. Pharmacol., 1995, Vol. 28, p. 331-337.
PROVOST, J., FUDGE, J., ISRAELIT, S. et al. Tissue-specific distribution and subcellular
distribution of phospholipase D in rat. evidence for distinct RhoA- and ADP -ribosylation
factor (ARF)-regulated isoenzymes. Biochem. J., 1996, Vol. 319, p. 285-291.
PUTNEY, J.W., WEISS, S.J., VAN DE WALLE, C.M. et al. Is phosphatidic acid a
calcium ionophore under neurohumoral control ? Nature, 1980, Vol. 284, p. 345-347.
QIAN, D. and WEISS, T. T cell antigen receptor signal transduction. Current Opinion Cell
Bioliogy, 1997, Vol. 9, p. 205-212.
QIU, R.G., CHEN, J., Mac CORMICK, F. et al. A role for Rho in ras transformation. Proc.
Natl. Acad. Sci., 1995, Vol. 92, N°25, p. 11781-11785.
QUALLIOTINE-MANN, D. AGWU, D.E., ELLENBURG, M.D. et al. Phosphatidic acid
211
and diacylglycerol synergize in a cell-free system for activation of NADPH oxidase from
human neutrophils. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, N°32, p. 23843-23849.
RABINOVITCH, H., DURAND, J., RIGAUD, M. et al. Transformation of arachidonic acid
into manohydroxy-eicosatetraenoic acids by mouse peritoneal macrophages. Lipids, 1981,
Vol. 16, N°7, p. 518-524.
RANKIN, S., MORII, N., NARUMIYA, S. et al. Botulinum C3 exoenzyme blocks the
tyrosine phosphorylation of p125FAK and paxillin induced by combesin and endothelin.
FEBS Lett., 1994, Vol. 354, N°3, p. 315-319.
RAVISCHANDRAN, K.S., LEE, K.K., SONGYANG, Z. et al. Interaction of Shc with the
zeta chain of the T cell receptor upon T cell activation. Science, 1993, Vol. 262, N°5135, p.
902-905.
REINHARDT, R.R., CHIN, E., ZHOU, J. et al. Distinctive anatomical patterns of gene
expression for cGMP-inhibited cyclic nucleotide phosphodiesterases. J. Clin. Invest., 1995,
Vol. 95, N°4, p. 1528-1538.
REINHOLD, S.L., PRESCOTT, S.M., ZIMMERMAN, G.A. et al. Activation of human
neutrophil phospholipase D by three separable mechanisms. FASEB. J., 1990, Vol. 4, N°2, p.
208-214.
REYNAUD, D. and PACE-ASCIAK, C.R. 12-HETE and 12-HPETE potently stimulate
intracellular release of calcium in intact human neutrophils. Prostagland. Leukot. Ess. Fat.
Acids, 1997, Vol. 56, N°1, p. 9-12.
RHEE, S.G. and CHOI, K.D. Regulation of inositol phospholipid-specific phospholipase C
isozymes. J. Biol. Chem., 1992, Vol. 267, p. 12393-12396.
RIBBES, G., HENRY, J., CARIVEN, C. et al. Expressed sequence Tags identify human
isologs of the ARF-dependent phospholipase D. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1996, Vol.
224, p. 206-211.
RIDLEY, A.J. and HALL, A . The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of
focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell., 1992, Vol. 70, N°3,
p. 389-399.
ROBICSEK, S.A., BLANCHARD, D.K., DJEU, J.Y. et al. Multiple high-affinity cAMP-
phosphodiesterases in human T-lymphocytes. Biochem. Pharmacol., 1991, Vol. 42, N°4, p.
212
869-877.
ROBICSEK, S.A., KRZANOWSKI, J.J., SZENTIVANYI, A. et al. High pressure liquid
chromatography of cyclic nucleotide phosphodiesterase from purified human T-lymphocytes.
Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, Vol. 163, N°1, p. 554-560.
ROSOFF, P.M., SAVAGE, N. and DINARELLO, C.A. Interleukin-1 stimulates
diacylglycerol production in T lymphocytes by a novel mechanism. Cell., 1988, Vol. 54, p.
73-81.
ROSSI, F., GRZESKOWIAK, M., BIANCA, D. et al. De novo synthesis of diacylglycerol
from glucose. A new phatway of signal transduction in human neutrophils stimulated during
phagocytosis of beta-glucan particles. J. Biol. Chem., 1991, Vol. 266, N°13, p. 8034-8038.
RUMENAPP, U., GEISZT, M., WHAN, F. et al. Evidence for ADP-ribosylation-factor-
mediated activation of phospholipase D by m3 muscarinic acetylcholine receptor. Eur. J.
Biochem., 1995, Vol. 234, N°1, p. 240-244.
RUZICKA, T. VITTO, A. and PRINTZ, M.P. Epidermal arachidonate lipoxygenase.
Biochim. Biophys. Acta, 1993, Vol. 751, N°3, p. 369-374.
RYDER, N.S., TALWAR, H.S., REYNOLDS, N.J. et al. Phosphatidic acid and
phospholipase D both stimulate phosphoinositide turnover in cultured human deratinocytes.
Cell. Signal., 1993, Vol. 5, N°6, p. 787-794.
SAKANE, F., YAMADA, K., KANOH, H. et al. Porcine diacylglycerol kinase sequence has
zinc finger and E-F hand motifs. Nature, 1990, Vol. 344, p. 345-348.
SALMON, D.M., and HONEYMANN, T.W. Proposed mechanism of cholinergic action in
smooth muscle. Nature, 1980, Vol. 284, p. 344-345.
SAVANY, A., ABRIAT, C., NEMOZ, G. et al. Activation of a cyclic nucleotide
phosphodiesterase 4 (PDE4) from rat thymocytes by phosphatidic acid. Cell. Signal., 1996,
Vol. 8, N°7, p. 511-516.
SCHAAP, D., DE WIDT, J., VAN DER WAL, J. et al. Purification, cDNA-cloning and
expression of human diacylglycerol kinase. FEBS. Lett., 1990, Vol. 275, p. 151-158.
SCHAFFNER, W. and WEISSMANN, C. A rapid, sensitive, and specific method for the
213
determination of protein in dilute solution. Anal. Biochem., 1973, Vol. 56, p. 502-514.
SCHAPP, D., VAN DER WAL, J., BLITTERSWIJK, W.J. et al. Diacylglycerol kinase is
phosphorylated in vivo upon stimulation of the epidermal growth factor receptor and
serine/threonene kinases, including protein C-ε. Biochem. J., 1993, Vol. 289, p. 875-881.
SCHMIDT, H.H.W., LOHMANN, S.M. and WALTER, U. The nitric oxide and cGMP
signal transduction system: regulation and mechanism of action. Biochim. Biophys. Acta,
1993, Vol. 1178, p. 153-175.
SCHMIDT, M., RUMENAPP, U., BIENEK, C. et al. Inhibition of receptor signaling to
phospholipase D by clostridium difficile toxin B. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°5, p.
2422-2426.
SCHMIDT, M., RUMENAPP, U., NEHLS, C. et al. Restoration of clostridium difficile
toxin-B-inhibited phospholipase D by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Eur. J.
Biochem., 1996, Vol. 240, N°3, p. 707-712.
SCHÜTZE, S., POTTHOFF, K., MACHLEIDT, T. et al. TNF activates NF-κB by
phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced "acidic" sphingomyelin breakdown.
Cell., 1992, Vol. 71, p. 765-776.
SECKL, M.J., MORII, N., NARUMIYA, S. et al. Guanosine 5'-3'-O-(thio)triphosphate
stimulates tyrosine phosphorylation of p125FAK and paxillin in permeabilized swiss 3T3
cells. Role of p21rho. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°12, p. 6984-6990.
SEKIYA, F., TAKAGI, J., USUI, T. et al. 12S-hydroxyeicosatetraenoic acid plays a central
role in the regulation of platelet activation. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1991, Vol. 179,
N°1, p. 345-351.
SENISTERRA, G.A., VAN GORKOM, L.C.M. and EPAND, R.M. Calcium-independent
activation of protein kinase C by the dianionic form of phosphatidic acid. Biochem. Biophys.
Res. Comm., 1993, Vol. 190, N°1, p. 33-36.
SETTY, B.N.Y., GRAEVER, J.E. and STUART, M.J. The mitogenic effect of 15- and 12-
hydroxyeicosatetraenoic acid on endothelial cells may be mediated via diacylglycerol kinase
inhibition. J. Biol. Chem., 1987, Vol. 262, N°36. p. 17613-17622.
214
SHIMOOKU, K., AKISUE, T., HINNAI, H.et al. Reconstitution of GTP-gamma-S-
dependent phospholipase D activity with ARF, RhoA, and a soluble 36-kDa protein. FEBS
Lett., 1996, Vol. 387, N°2-3, p. 141-144.
SHIRAKAWA, F. and MIZEL, S.B. In vitro activation and nuclear translocation of NF-
kappa B catalyzed by cyclic AMP-dependent protein kinase and protein kinase C. Mol. Cell.
Biol., 1989, Vol. 9, p. 2424-2430.
SIDDIQI, A., SMITH, J.L., ROSS, A.H. et al. Regulation of phospholipase D in HL60
cells. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°15, p. 8466-8473.
SIDDIQI, R.A. and YANG, Y-C. Interleukin-11 induces phosphatidic acid formation and
activates map kinase in mouse 3T3-L1 cells. Cell. Signal., 1995, Vol. 7, N°3, p. 247-259.
SIEGMANN, D.W. Stimulation of quiescent 3T3 cells by phosphatidic acid-containing
liposomes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, Vol. 145, N°1, p. 228-233.
SINGER, W.D., BROWN, H.A., BOKOCH, G.M. et al. Resolved phospholipase D activity
is modulated by cytosolic factors other than arf. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°25, p.
14944-14950.
SINGER, W.D., BROWN, H.A.., JIANG, X. et al. Regulation of phospholipase D by
protein kinase C is synergistic with ADP-ribosylation factor and independent of protein
kinase activity. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, N°8, p. 4504-4510.
SKÅLHEGG, B.S., TASKÉN, HANSSON V. et al. Location of cAMP-dependent protein
kinase Type I with the TCR-CD3 complex. Science, 1994, Vol. 263, p. 84-87.
SMITH, M.E., SEDGWICK, B., BRINDLEY, D.N. et al. The role of phosphatidate
phosphohydrolase in glyceride biosyntheis. Eur. J. Biochem., 1967, Vol. 3, N°1, p. 70-77.
SOHNLE, P.G., LARSON, S.E., COLLINS-LECH, C. et al. Failure of lymphokine-
producing lymphocytes from aged humans to undergo activation by recall antigens. J.
Immunol., 1980, Vol. 124, N°5, p. 2169-2174.
SOLANA, R., VILLANUEVA, J.L., PEÑA, J. et al. Cell mediated immunity in ageing.
Comp. Biochem. Physiol., Vol. 99, N°1, 1991, p. 1-4.
SOMERMEYER, M.G., KNAUSS, T.C., WEINBERG, J.M. et al. Charracterization of
ca2+ transport in rat renal brush-border membranes and its modulation by phosphatidic acid.
215
Biochem. J., 1983, Vol. 214, N°1, p. 37-46.
SONG, J., PFEFFER, L.M. and FOSTER, D.A. v-Scr increases diacylglycerol levels via a
type D phospholipase-mediated hydrolysis of phosphatidylcholine. Mol. Cell. Biol., 1991,
Vol. 11, N°10, p. 4903-4908.
SONNENBURG, W.K., SEGER, D., KWAK, K.S. et al. Identification of inhibitory and
calmodulin-binding domains of the PDE1A1 and PDDE1A2 calmodulin-stimulated cyclic
nucleotide phosphodiesterases. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°52, p. 30989-31000.
SPECTOR, A.A., GORDON, J.A. and MOORE, S.A. Hydroxyeicosatetraenoic acids
(HETEs). Prog. Lipid Res., 1988, Vol. 27, p. 271-323.
SPIEGEL, S. Sphingosine and sphingosine 1-phosphate in cellular proliferation: relationship
with protein kinase C and phosphatidic acid. J. Lipid Mediat., 1993, Vol. 8, N°3, p. 169-175.
STANNERS, J., KABOURIDIS, P.S., MacGUIRE, K.L. et al. Interaction between G
proteins and tyrosine kinases upon T cell receptor. CD3-mediated signaling. J. Biol. Chem.,
Vol. 270, p. 30635-30642.
STASEK, J.E. Jr., NATARAJAN, V. and GARCIA, G.N. Phosphatidic acid directly
activates endothelial cell protein kinase C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, Vol. 191,
N°1, p. 134-141.
STERN, N., YANAGAWA, N., SAITO, F. et al. Potential role of 12
hydroxyeicosatetraenoic acid in angiotensin II-induced calcium signal in rat glomerulosa
cells. Endocrinolog., 1993, Vol. 133, N°2, p. 843-847.
STEWART, S.J., CUNNINGHAM, G.R., STRUPP, J.A. et al. Activation of phospholipase
D: a signaling system set in motion by perturbation of the T lymphocyte antigen receptor/CD3
complex. Cell. Regul., 1991, Vol. 2, N°10, p. 841-850.
STROOP S.D., CHARBONNEAU, H. and BEAVO, J.A. Direct photolabeling of the
cGMP-stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase. J. Biol. Chem., 1989, Vol. 264, N°23,
p. 13718-13725.
STROOP, S.D. and BEAVO, J.A. Sequence homology and structure-function studies of the
216
bovine cyclic-GMP-stimulated and retinal phosphodiesterases. Adv. Second. Messenger
Phosphoprotein Res., 1992, Vol. 25, p. 55-71.
STUEHR, D.J. and NATHAN, C.J. Nitric oxide. A macrophage product responsible for
cytostasis and respiratory inhibition in tumor target cells. J. exp. Med., 1989, Vol. 169, N°5,
p. 1543-1555.
SUBRAMANIAM, A., SEHAJPAL, P., MURTHI, V.K. et al. Activation of human T cells
with the physiological regulator of protein kinase C. Cell. Immunol., 1988, Vol. 116, p. 439-
449.
SWINNEN, J.V., JOSEPH, D.R. and CONTI, M. Molecular cloning of rat homologues of
the Drosophila melanogaster dunce cAMP phosphodiesterase : evidence for a family of genes.
Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 1989a, Vol. 86; p. 3604-3608.
SWINNEN, J.V., JOSEPH, D.R. and CONTI, M. The mRNA encoding a high-affinity
cAMP phosphodiesterase is regulated by hormones and cAMP. Proc. Natl. Aca. Sci. USA,
1989b, Vol. 86; p. 8197-8201.
SZAMEL, M. and RESCH, K. T-cell antigen receptor-induced signal-transduction pathways
activition and function of protein kinases C in lymphocytes. Eur. J. Biochem., 1995, Vol. 228,
p. 1-15.
TAIRA, M., HOCKMAN, S.C., CALVO, J.C. et al. Molecular cloning of the rat adipocyte
hormone-sensitive cyclic GMP-inhibited cyclic nucleotide phosphodiesterase. J. Biol. Chem.,
Vol. 268, N°25, p. 18573-18579.
TAKAHASHI, K., TAGO, K., OKANO, H. et al. Augmentation by calmodulin of ADP-
ribosylation factor-stimulated phospholipase D activity in permeabilized rabbit peritoneal
neutrophils. J. Immunol., 1996, Vol. 156, N°3, p. 1229-1234.
TAKEMOTO, D.J., KAPLAN, S.A. and APPLEMAN, M.M. Cyclic guanosine 3', 5'-
monophosphate and phosphodiesterase activity in mitogen- stimulated human lymphocytes.
Biochem. Biophys. Res. Commun, 1979, Vol. 90, N°2, p. 491-497.
TAKEMOTO, D.J., LEE, W-N.P., KAPLAN, S.A. et al. Cyclic AMP phosphodiesterase in
human lymphocytes and lymphoblasts. J. Cycl. Nucl. Res., 1978, Vol. 4, p. 123-132.
TAMIR, A., GRANOT, Y. and ISAKOV, N. Inhibition of T lymphocyte activation by
cAMP is associated with down-regulation of two parallel mitogen-activated protein kinase
217
pathways, the extracellular signal-related kinase and c-Jun N-terminal kinase. J. Immunol.,
1996, Vol. 157, N°4, p. 1514-1522.
TANG, W., BUNTING, M., ZIMMERMAN, G.A. et al. Molecular cloning of a novel
human diacylclycerol kinase higly selective for arachidonate-containing substrates. J. Biol.
Chem., 1996, Vol. 271, N°17, p. 10237-10241.
TAYLOR, J.D., TIMAR, J., RONG, X. et al. 12(S)-HETE induces cytoskeleton
phosphorylation and rearrangement in melanoma cells. In : Eicosanoids and other bioactive
lipids in cancer, inflammation and radiation injury. Ed. Nigam, S., Honn, K.V., Marnett, L.J.
and Walden, T., Boston : Kluver, 1990, p. 635-638.
TENOR, H., STANICIU, L., SCHUDT, C. et al. Cyclic nucleotide phosphodiesterases from
purified human CD4+ and CD8+ lymphocytes. Clin. Exp. Al., 1995, Vol. 25, p. 616-624.
THOMPSON, W.J. and APPLEMAN, M.M. Characterization of cyclic nuleotide
phosphodiesterases of rat tissues. J. Biol. Chem., 1971, Vol. 246, N°10, p. 3145-3150.
THOMPSON, W.J., ROSS, C.P., PLEDGER, W.J. et al. Cyclic adenosine 3':5'-
monophosphate phosphodiesterase. Distinct forms in human lymphocytes and monocytes. J.
Biol. Chem., 1976, Vol. 251, N°16, p. 4922-4929.
THOMPSON, W.J., ROSS, C.P., STRADA, S.J. et al. Comparative analyses of cyclic
adenosine 3':5'-monophosphate phosphodiesterases of human peripheral blood monocytes and
cultured P388D1 cells. Cancer. Res., 1980, Vol. 40, p. 1955-1960.
TIMAR, J., CHEN, Y.Q., LIU, B. et al. The lipoxygenase metabolite 12(S)-HETE promotes
αIIbβ3 integrin-mediated tumor-cell spreading on fibronectin. Int. J. Cancer., 1992, Vol. 52, p.
594-603.
TIMSON GAUEN, L.K., KONG, A.N., SAMELSON, L.E. et al. p59fyn tyrosine kinase
associates with multiple T-cell receptor subunits through its unique amino-terminal domain.
Mol. Cell. Biol., 1992, Vol. 12, p. 5438-5446.
TOMIC, S., GREISER, U., LAMMERS, R. et al. Association of SH2 domain protein
tyrosine phosphatase with the epidermal growth factor receptor in human tumor cells. J. Biol.
Chem., 1995, Vol. 270, N°36, p. 21277-211284.
218
TRUETT, A.P., BOCCKINO, S.B. and MURRAY, J.J. Regulation of phosphatidic acid
phosphohydrolase activity during stimulation of human polymprphonuclear leukocytes.
FASEB. J., 1992, Vol. 6, p. 2720-2725.
TSAI, M.H., YU, C.L. and STACEY, D.W. A cytoplasmic protein inhibits the GTPase
activity of H-Ras in a phospholipid-dependent manner. Science, 1990, Vol. 250, p. 982-985.
TSAI, M.H., YU, C.L., WEI, F.S. et al. The effect of GTpase activating protein upon Ras is
inhibited by mitogenically response lipids. Science, 1989, Vol. 243, p. 522-526.
TSUTSUMI, A., KUBO, M., FUJII, H. et al. Regulation of protein kinase C isoform
proteins in phorbol ester-stimulated Jurkat T lymphoma cells. J. Immunol., 1993, Vol. 150,
N°5, p. 1746-1754.
UINGS, I.J., THOMPSON, N.T., RANDALL, R.W. et al. Tyrosine phosphorylation is
involved in receptor coupling to phospholipase D but not phospholipase C in the human
neutrophil. Biochem. J., 1992, Vol. 281- p. 597-600.
VALETTE, L., CROSET, M., PRIGENT, A-F. et al. Dietary polyunsaturated fatty acids
modulate fatty acid composition and early activation steps of concanavalin A-stimulated rat
thymocytes. J. Nutr., 1991, Vol. 121, p. 1844-1859.
VALETTE, L., PRIGENT A-F., NÉMOZ, G. et al. Concanavalin a stimulates the rolipram-
sensitive isoforms of cyclic nuleotide phosphodiesterase in rat thymic lymphocytes. Biochem.
Biophys. Commun., 1990, Vol. 169, N°3, p. 864-872.
VALVERDE, A.M., SINNETT-SMITH J., LINT, J.V. et al. Molecular cloning and
characterization of protein kinase D: a target for diacylglycerol and phorbol esters with a
distinctive catalytic domain. Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, Vol. 91, p. 8572-8576.
VAN BLITTERSWIJK, W.J., HILKMANN, H.H., DE WIDT, J. et al. Phospholipid
metabolism in brakykinin-stimulated human fibroblasts. Biphasic formation of diacylglycerol
from phosphatidylinositol and phosphatidylcholine, controlled by protein kinase C. J. Biol.
Chem., 1991, Vol. 266, N°16, p. 10337-10343.
VAN OERS, N.S., KILLEEN, N. and WEISS, A. Lck regulates the tyrosine
phosphorylation of the T cell receptor subunits and ZAP-70 in murine thymocytes. J. Exp.
Med., 1983, Vol. 183, N°3, p. 1053-1062.
219
VAN OERS, N.S., LOWIN-KROPT, B., FINLAY, D. et al. Alpha beta T cell development
is abolished in mice lacking both Lck and Fyn protein tyrosine kinase. Immunity, 1996, Vol.
5, N°5, p. 429-436.
VAN OERS, N.S.C., KILLEEN, N. and WEISS, A. ZAP-70 is constitutively associated
with tyrosine-phosphorylated TCRζ in murine thymocytes and lymph node T cells. Immunity,
1994, Vol. 1, p. 675-685.
Van CORVEN, E.J. GROENINK, A., JALINK, K. et al. Lysophosphatidate-induced cell
proliferation; identification and dissection of signaling pathways mediated by G proteins.
Cell., 1989, Vol. 59, N°1, p. 45-54.
VERICEL, E., CROSET, M., SEDIVY, P. et al. Platelets and aging. I-agregation,
arachidonate, metabolism and antioxidant status. Thromb. Res., 1988, Vol. 49, N°3, p. 331-
342.
VERICEL, E., REY, C., CALZADA, C. et al. Age-related changes in arachidonic acid
peroxidation and glutathione-peroxidase acitvity in human platelets. Prostagland., 1992, Vol.
43, N°1, p. 75-85.
VICZIAN, A.S., PIRIEV, N.I. and FARBER, D.B. Isolation and characterization of a
cDNA encoding the alpha'subumit of human cone cGMP-phosphodiesterase. Gene, 1995,
Vol. 166, N°2, p. 205-211.
VINGGAARD, A.M., PROVOST, J.J., EXTON, J.H. et al. Arf and RhoA regulate both
the cytosolic and the membrane-bound phospholipase D from human placenta. Cell. Signal.,
1997, Vol. 9, N°2, p. 189-196.
VONAKIS, B.M. and VANDERHOEK, J.Y. 15-hydroxyeicosatetraenoic acid (15-HETE)
receptors. J. Biol. Chem., 1992, Vol. 267, N°33, p. 23625-23631.
WAITE, K.A., WALLIN, R., QUALLIOTINE-MANN, D. et al. Phosphatidic acid-
mediated phosphorylation of the NADPH oxidase component p47-phox. Evidence that
phosphatidic acid may activate a novel protein kinase. J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, N°24,
p. 15569-155578.
220
WALSH, J.P., SUEN, R. and GOMSET, J.A. Arachidonoyl-diacylglycerol kinase. Specific
in vitro inhibition by polyphosphoinositides suggests a mechanism for regulation of
phosphatidylinositol biosynthesis. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, N°48, p. 28647-28653.
WALSH, J.P., SUEN, R., LEMAITRE, R.N. et al. Arachidonoyl-diacylglycerol kinase
from bovine testis. Purification and properties. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, N°33, p.
21155-21164.
WALTON, P.A. and POSSMAYER, F. The effects of triton X-100 and chlorpromazine on
the Mg2+-dependent and Mg2+-independent phosphatidate phosphohydrolase activities of rat
lung. Biochem. J., 1989, Vol. 261, N°2, p. 673-678.
WANG, D.J., HUANG, N.N., HELLER, E.J. et al. A novel synergistic stimulation of Swiss
3T3 cells by extracellular ATP and mitogens with opposite effects on cAMP levels. J. Biol.
Chem., 1994, Vol. 2269, N°24, p. 16648-16655.
WANG, T., SHEPPARD, J.R. and FOKER, J.E. Rise and fall of cyclic AMP required for
onset of lymphocyte DNA synthesis. Science, 1978, Vol. 201, N°4351, p. 155-157.
WEISS, A. and LITTMAN, D.R. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors,
Cell., 1994, Vol. 76, p. 263-274.
WEISS, A. T lymphocyte activation. Fundamental Immunology, Third Edition. New-York :
Raven Press, 1993, Chapitre 13, p. 467-504.
WEISS, A., KIRETZKY, G., SCHATZMAN, R.C. et al. Functional activation of the T-cell
antigen receptor induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C-γl. Proc. Natl. Acad.
Sci., 1991, Vol. 88, p. 5484-5488.
WEISS, A., SHIELDS, R., NEWTON, M. et al. Ligand-receptor interactions required for
commitment to the activation of the interleukin 2 gene. J. Immunol., 1987, Vol. 138, p. 2169-
2176.
WEISS, S.J., MacKINNEY, J.S. and Jr.PUTNEY, J.W. Regulation of phosphatidate
synthesis by secretagogues in parotid acinar cells. Biochem. J., 1982, Vol. 204, N°2, p. 587-
592.
WEN, Y., CABOT, M.C., CLAUSER, E. et al. Lipid signal transduction pathways in
angiotensin II type 1 receptor-traansfected fibroblasts. Am. J. Physiol., 1995, Vol. 269, p.
221
C435-C422.
WERNER, E.J., WALENGA, R.W., DUBOWY, R.L. et al. Inhibition of human malignant
neuroblastoma cell DNA synthesis by lipoxygenase metabolites of arachidonic acid. Cancer.
Res., 1985, Vol. 45, N°2, p. 561-563.
WETZKA, B., SCHAFER, W., SCHEIBEL, M. et al. Eicosanoid production by
intrauterine tissues before and after labor in short-term tissue culture. Prostaglandins, 1993,
Vol. 45, N°6, p. 571-581.
WHATMORE, J. MORGAN, C.P., CUNNINGHAM, E. et al. ADP-ribosylation factor 1-
regulated phospholipase D activity is localized at the plasma membrane and intracellular
organelles in HL60 cells. Biochem. J., 1996, Vol. 320, N°3, p. 785-794.
WHISLER, R.L., NEWHOUSE, Y.G., GRANTS, I.S. et al. Differential expression of the
α- and β-isoforms of protein kinase C in peripheral blood T and B cells from young and
elderly adults. Mech. Ageing Dev., 1995, Vol. 77, p. 197-211.
WHITFIELD, J.F., MacMANUS, J.P., BOYNTON, A.L. et al. Concanavalin A and the
initiation of thymic lymphoblast DNA synthesis and proliferation by a calcium-dependent
increase cyclic GMP level. J. Cell. Physiol., 1974, Vol. 84, N°3, p. 445-458.
WILKES, L.C., PATEL, V., PURKISS, J.R. et al. Endothelin-1 stimulated phospholipase
D in A10 vascular smooth muscle derived cells is dependent on tyrosine kinase. Evidence for
invlvement in stimulation of mitogenesis. FEBS Lett., 1993, Vol. 322, N°2, p. 147-150.
WOOD, C.A., PADMORE, L. and RADDA, G.K. The effect of phosphatidic acid on the
proliferation of Swiss 3T3 cells. Biochem. Soc. Trans., 1993, Vol. 21, N°4, p. 369S.
WU, H., JAMES-KRACKE, M.R. and HALENDA, S.P. Direct relationship between
intracellular calcium mobilization and phospholipase D activation in prostaglandin E-
stimulated human erythroleukemia cells. Biochem., 1992, Vol. 31, N°13, p. 3370-3377.
WU, J. DENT, P., JELINEK, T. et al. Inhibition of the EGF-activated MPA kinase
signaling pathway by adenosine 3',5'-monophosphate. Science, 1993, Vol. 262, p. 1065-1066.
YAMADA , K., SAKANE, K., IMAI, S. et al. Shingosine activates cellular diacylglycerol
kinase in intact juskat cells, a human T-cell line. Biochim. Bioophys. Actta., 1993, Vol. 1169,
N°3, p. 217-224.
222
YAMAMOTO, T., YAMAMOTO, S., MANGANIELLO, V.C. et al. Effects of fatty acids
on activity of cGMP-stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase from calf liver. Arch.
Biochem. Biophys., 1984, Vol. 229, N°1, p. 81-89.
YAN, C., ZHAO, A.Z., BENTLEY, J.K. et al. Molecular cloning and characterization of a
calmodulin-dependent phosphodiesterase enriched in olfactory sensory neurons. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, p. 9677-9681.
YAN, C., ZHAO, A.Z., BENTLEY, J.K. et al. The calmodulin-dependent
phosphodiesterase gene PDE1C encodes several functionally different splice variants in a
tissue-specific manner. J. Biol.. Chem., 1996, Vol. 271, N°41, p. 25699-255706.
YANG, Q., PASKIND, M., BOLGER, G. et al. A novel cyclic GMP stimulated
phosphodiesterase from rat brain. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, Vol. 205, N°3, p.
1850-1858.
YEO, E-J., KAZLAUSKAS, A. and EXTON, J.H. Activation of phospholipase C-γ is
necessary for stimulation of phospholipase D by platelet-derived growth factor. J. Biol.
Chem., 1994, Vol. 269, N°45, p. 27823-27826.
YOSHIMURA, S., NAKASHIMA, S., OHGUCHI, K. et al. Differential mRNA expression
of phospholipase D (PLD) isozymes during cAMP-induced differentiation in C6 gliooma
cells. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1996, Vol. 225, N°2, p. 494-499.
YOSHINO, H., KITAYAMA, S., MORITA, K. et al. Effect of 12-hydroxyeicosatetraenoic
acid on cytosolic calcium in human neutrophils. J. Lipid. Mediat. Cell. Signal., 1994, Vol. 9,
N°3, p. 225-234.
ZENNER, G., zur HAUSEN, J.D., BURN, P. et al. Towards unraveling the complexity of T
cell signal transduction. Bioessays, 1995, Vol. 17, p. 967-975.
ZHANG, H., DESAI, N.N., MURPHEY, J.M. et al. Increases in phosphatidic acid levels
acompany sphingosine-stimulated proliferation of quiescent swiss 3T3 cells. J. Biol. Chem.,
1990, Vol. 265, p. 21309-21316.
FOLIO ADMINISTRATIF...........................................THESE SOUTENUE DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON. ............. ...................... ................. ...................... ..................... ........ .................... ............ ...........................
NOM : ZAKAROFF epouse GIRARD
(avec precision du nom de jeune fille, le cas echeant)
Prenoms : Alexia
DATE de SOUTENANCE Doc’ll
cLYC
19112197
TITRE : REGULATIONS CROISEES ENTRE SIGNALISATION LIPIDIQUE EISIGNALISATION DEPENDANT DES NUCLEOTIDES CYCLIQUE; fc;A;L’ACTIVATION L Y M P H O C Y T A I R E : ROLE DE ,
PHOSPHATIDIQUE.
NATURE : Doctorat
Formation doctorale : BIOCHIMIE
Numero d’ordre : 97 ISAL
Zote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 I et bis CLASSE :
RESUME : L’activation mitogenique des cellules mononucleees de sang peripherique humain(PBMC) augmente la production d’acide phosphatidique (PA) et stimule l’activite phosphodiesterase(PDE) des nucléotides cycliques. De plus, en systeme acellulaire, le PA stimule directement l’activittPDE. L’effet mitogenique du PA pourrait done etre dQ a une activation des PDE conduisant a unediminution du taux intracellulaire d’AMPc, signal inhibiteur de la lymphoproliferation.
Ce travail montre que la lectine mitogenique Concanavaline A (Con A) augmente significativementla synthese de PA dans les PBMC des 5 min de stimulation, majoritairement par la voie PI-PLC/DAG-Kinase. D’autre part, l’etude en parallele de la production de PA, des activites PDE et des taux d’AMPcinduits par differents mitogenes dans une population cellulaire issue d’un meme donneur montre qu’ilexiste une correlation Ctroite entre les taux de PA et les activites PDE. De plus, les drogues diminuant lasynthese de PA suppriment l’activation des PDE et la reponse proliferative des cellules aux mitogenes.Enfin, les taux d’AMPc sont modestement, mais significativement diminuts en reponse aux mitogenes.
Le lien entre PA et reponse mitogenique a aussi ete etudie dans un modele experimental mimantune situation physiologique particuliere : le vieillissement. 11 s’agit de PBMC enrichies en 12-HETE,derive monohydroxyle issu de l’acide arachidonique par la voie 12-lipoxygenasique, caracterides parune reponse proliferative diminuee. Le 12-HETE &ant d&-it comme un inhibiteur de DAG-Kinase,notre hypothese ttait qu’il pouvait diminuer les taux de PA. Au contraire, nous avons montre unesynthbe accrue de PA, par un mecanisme impliquant l’activation d’une PLD. De plus, cette activation nedepend pas de PKC, met en jeu des tyrosine-phosphorylations, et probablement des sites de liaison du12-HETE de faible affinite, couples B une proteine G.
MOTS-CLES :
Lymphocyte, Acide phosphatidique, Phosphodiesterase, Nucleotide cyclique,
Phospholipase D, 12-HETE.
Laboratoire (s) de recherches : Laboratoire de Biochimie et Pharmacologic , INSERM U352, Bat. 406
20, av. A. Einstein, 69621 VILLEURBANNE CEDEX
Directeur de these : Annie-France PRIGENT
President du jury :
Composition du jury : GENY Blandine - LAGARDE Michel - NEMOZ Georges - PRIGENT
Annie-France - SAULNIER-BLACHE Jean-Sebastien - SETTE Claudio.