Tierärztliche Hochschule Hannover · Knorpelgewebe aufweisen (FOSSUM 2007). Biomechanische Eigenschaften Die Zusammensetzung und Anordnung der EZM verleiht dem hyalinen Knorpel seine

Tierärztliche Hochschule Hannover

Chondrogene Differenzierung mesenchymaler

Knochenmarkstammzellen mittels bioaktiver

Poly-ε-caprolactone Scaffolds

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades

einer Doktorin der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Svenja Paul

Bad Oldesloe

Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr, Klinik für

Heimtiere, Reptilien, Zier- und Wildvögel

Prof.Dr. med. Martin Russlies, Universitätsklinikum

Schleswig-Holstein, Campus Lübeck

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Stadler

Tag der mündlichen Prüfung: 10.03.2011

Schreiben ist leicht, man muss nur die

falschen Wörter weglassen.

Samuel Langhorne Clemens (1835-1910)

besser bekannt unter seinem Pseudonym

Mark Twain

Meiner Tochter Hannah

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ........................................................................................... 1

1.1 Hyaliner Gelenkknorpel ............................................................................. 1

1.2 Knorpeldefekte ........................................................................................... 4

1.2.1 Osteochondrosis dissecans beim Hund ................................................ 6

1.3 Therapieoptionen ....................................................................................... 7

1.4 Knorpel Tissue Engineering .................................................................... 10

1.4.1 Mesenchymale Stammzellen .............................................................. 10

1.4.2 Scaffolds ............................................................................................. 12

1.4.3 Poly-ε-caprolactone ............................................................................. 14

1.5 Schlussfolgerung und Aufgabenstellung .............................................. 18

2 Material und Methoden ................................................................... 20

2.1 Allgemeine Lösungen .............................................................................. 20

2.2 Primäre Zellkultur ..................................................................................... 21

2.2.1 Kulturmedien ....................................................................................... 21

2.2.2 Zellisolierung ....................................................................................... 23

2.2.3 Zellpassage ......................................................................................... 23

2.2.4 Zellzählung .......................................................................................... 24

2.2.5 Kryokonservierung .............................................................................. 24

2.3 Durchflusszytometrie ............................................................................... 24

2.4 Differenzierung primärer Zellen .............................................................. 26

2.4.1 Adipogene Differenzierung .................................................................. 27

2.4.2 Osteogene Differenzierung ................................................................. 27

2.4.3 Chondrogene Differenzierung ............................................................. 27

2.5 Histologie .................................................................................................. 27

2.5.1 Sudan III Färbung ............................................................................... 28

2.5.2 Alkalische Phosphatase ...................................................................... 28

2.5.3 Alzianblau Färbung ............................................................................. 29

2.5.4 Kollagen Typ II Färbung ...................................................................... 29

2.6 Genexpression ......................................................................................... 30

2.6.1 Isolierung von RNA ............................................................................. 30

2.6.2 Reverse Transkription ......................................................................... 31

2.6.3 Polymerase Kettenreaktion ................................................................. 32

2.6.4 Gelelektrophorese und Densitometrie ................................................. 34

2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds ................................................................ 35

2.7.1 Scaffoldherstellung .............................................................................. 35

2.7.2 Scaffoldaugmentation ......................................................................... 36

2.7.3 Scaffoldcharakterisierung .................................................................... 36

2.7.4 Zellversuch .......................................................................................... 38

2.7.5 Realtime PCR ..................................................................................... 40

2.7.6 DNA-Quantifizierung ........................................................................... 43

2.7.7 Statistische Auswertung ...................................................................... 45

3 Ergebnisse ....................................................................................... 45

3.1 Mesenchymale Stammzellen ................................................................... 45

3.1.1 Morphologie und Zellkultur .................................................................. 45

3.2 Differenzierung primärer Zellen .............................................................. 48

3.2.1 Histologischer Nachweis der Differenzierungsfähigkeit ....................... 48

3.2.2 Genexpression .................................................................................... 50


3.3.1 Rasterelektronenmikroskopie .............................................................. 53

3.3.2 Migrationspotential .............................................................................. 54

3.3.3 Release von TGF-β 1 .......................................................................... 55

3.3.4 Histologie ............................................................................................ 56

3.3.5 DNA-Quantifizierung ........................................................................... 57

3.3.6 Realtime PCR ..................................................................................... 58

3.3.7 PCR .................................................................................................... 60

4 Diskussion ....................................................................................... 63

4.1 Mesenchymale Stammzellen ................................................................... 63


4.3 Einfluss der Faserstärke .......................................................................... 65

4.4 Einfluss der Wachstumsfaktoren ............................................................ 66

4.4.1 Einfluss von TGF-β1 ........................................................................... 66

4.4.2 Einfluss von HA ................................................................................... 67

4.5 Integration der Wachstumsfaktoren ....................................................... 68

4.6 Expression osteogener Marker ............................................................... 69

4.7 Schlussfolgerung ..................................................................................... 70

5 Zusammenfassung .......................................................................... 72

6 Summary .......................................................................................... 75

7 Anhang ............................................................................................. 77

7.1 Verbrauchsmaterialien ............................................................................. 77

7.2 Geräte ........................................................................................................ 77

7.3 Software .................................................................................................... 79

7.4 Reagenzien ............................................................................................... 79

7.5 Kits ............................................................................................................ 83

8 Literaturverzeichnis ........................................................................ 84

Abkürzungen:

ACT autologe Chondrozytentransplantation

AK Antikörper

AP2/FABP fatty acid binding protein

BSA Bovines Serumalbumin

CCI characterised chondrocyte implantation

CD Cluster of differentiation

DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindol

ddH2O Deionisiertes Wasser

DEPC-H2O RNase- und DNase freies Wasser

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzym linked Assay

ESC embryonale Stammzelle

EZM Extrazelluläre Matrix

FACS Fluorescence activated cell sorting

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FKS Fetales Kälberserum

GAG Glycosaminoglycane

HA Hyaluronsäure

Kb Kilobase

LAP Latency-associated peptide

mAK monoklonaler Antikörper

MFX Mikrofrakturierung

MMB Micromassbody

MMP Metalloproteinase

MSC Mesenchymale Stammzelle

Mw Molekulargewicht

MW Mediumwechsel

OAT autologe osteochondrale Transplantation

OCD Osteochondrosis dissecans

PBS Phosphate Buffered Saline

PCL Poly-ε-caprolactone

PCR Polymerase Kettenreaktion

PDLLA Poly-D,L-lactic acid

PE Phycoerthrin

PG Proteoglycan

PGA Polyglycolic acid

PLA Poly lactic acid

PLGA Poly(D,L-lactic-co-glycolic-acid)

PLLA Poly-L-lactic acid

PPARγ Peroxisome proliferator-activated

receptor γ

REM Rasterelektronenmikroskop

Rpm Rounds per minute

RT Reverse Transkription

RTemp Raumtemperatur

Rt-PCR Realtime PCR

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TCP Tricalcium Phosphat

TGF Transforming Growth Factor

1

1 Einleitung

1.1 Hyaliner Gelenkknorpel

Es können drei verschiedene Arten von Knorpelgewebe unterschieden werden:

Faserknorpel, elastischer Knorpel und hyaliner Knorpel. Schwerpunkt der

vorliegenden Arbeit ist die Regeneration hyalinen Knorpels im Kontext der

gelenkerhaltenden Chirurgie, daher wird auf die anderen Knorpelarten nicht weiter

eingegangen.

Morphologie und Metabolismus

Gesunder adulter hyaliner Knorpel besteht zu 60-70% aus Wasser und im Vergleich

zu parenchymatösen Organen nur zu ca. 30% aus extrazellulärer Matrix (EZM),

welche sich in etwa zu gleichen Teilen aus Kollagenen und Proteoglykanen (PG)

zusammensetzt. Chondrozyten tragen lediglich zu 1% der Knorpelmasse bei. Etwa

80% des Gesamtkollagens besteht aus Kollagen Typ II. In geringem Umfang

kommen auch Kollagen Typ IX, X und XI vor. Fibrilläres Kollagen Typ I kommt im

Gelenkknorpel nur unter pathobiologischen Bedingungen z.B. im Rahmen

degenerativer Gelenkerkrankungen vor. Die im hyalinen Knorpel enthaltenen

Molekülgruppen der PGs umfassen große aggregierende PGs, wie Aggrecan und

Versican, sowie kleine, leucinreiche PGs, wie Decorin, Biglycan, Fibromodulin und

Lumican. PGs erfüllen eine Vielzahl von biologischen Funktionen, wie

Matrixorganisation, Zelladhäsion, Lubrikation, Ionenfiltration, sowie Wachstum und

Wachstumsfaktorregulierung. Viele dieser Funktionen variieren in Abhängigkeit von

ihrer Lage und Struktur (anatomische Lage, Alter, biomechanischer Stress).

Innerhalb der Knorpelzonen variiert die Zusammensetzung, Organisation und

Funktion der PGs. Bereiche, die ständigem Druck ausgesetzt sind, beinhalten hohe

Aggrecankonzentrationen, während in Bereichen mit dynamischer Belastung weniger

Aggrecan zu finden ist (BUCKWALTER et al. 2005). PGs bestehen aus einem

zentralen Protein (Kernprotein), an das viele Glycosaminoglycan-Seitenketten

kovalent gebunden sind. Glycosaminoglykane (GAG) bestehen aus langen

unverzweigten Polysacchariden mit sich wiederholenden Disacchharideinheiten. Im

2 1 Einleitung

Gelenkknorpel kommen überwiegend Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat,

Keratansulfat, Dermatansulfat und Heparansulfat vor. Die negative Ladung der

GAGs gewährleistet die Elastizität, Formstabilität und Nutrition des hyalinen

Knorpels, sowie die Regulation von Wassergehalt und Elektrolytkonzentration

(Donnan-Effekt) (SCHAGEMANN et al. 2008).

Hyaliner Knorpel kann histologisch in vier Zonen mit einer jeweils charakteristischen

Zellmorphologie und -Verteilung sowie EZM Zusammensetzung und -Orientierung

unterteilt werden, was maßgeblich Einfluss auf die biomechanischen und

metabolischen Eigenschaften hat. Die oberflächliche Tangentialzone ist dünn,

beinhaltet eine Vielzahl von Chondrozyten, die spindelförmig abgeflacht sind und

eine parallele Anordnung zur Gelenkfläche aufweisen. Die Kollagenfibrillen verlaufen

tangential zur Oberfläche und sind trajektoriell ausgerichtet. Der Gehalt an PGs ist,

abgesehen von der PG-reichen perizellulären Matrix, gering. In der darunter

liegenden Übergangszone liegen die hier eher sphärischen Chondrozyten nicht mehr

so dicht nebeneinander, und ihre Ausrichtung ist weniger streng. Auch die

Kollagenfibrillen sind eher zufällig angeordnet. In der dritten Zone, der sog.

Radialzone, ist die Zelldichte am geringsten und der Kollagenfibrillendurchmesser

am höchsten. Sowohl die Zellen als auch die Fibrillen sind radiär zur

Gelenkoberfläche ausgerichtet. Die vierte Zone ist die Übergangszone von

Gelenkknorpel zum subchondralen, trabekulären Knochen. Die Kollagenfibrillen sind

in dieser sog. Mineralisierungszone verankert. Zwischen Radialzone und

Mineralisierungszone liegt eine Grenzlinie, die als „tide mark“ bezeichnet wird

(STASHAK 2002; ERGGELET 2004).

1.1 Hyaliner Gelenkknorpel 3

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Zonengliederung von adultem hyalinem Knorpel. modifiziert nach (STASHAK 2002)

Adulter hyaliner Knorpel ist weder vaskularisiert noch innerviert oder lymphatisch

versorgt. Die Versorgung mit Nährstoffen und der Abtransport metabolischer

Endprodukte erfolgt über die Synovialflüssigkeit mittels Diffusion und

elektrostatischer Kräfte (Donnan-Effekt; s.o.). Im Gegensatz hierzu wird juveniler

Gelenkknorpel noch durch Blutgefäße des subchondralen Knochens versorgt, da

noch keine Abgrenzung durch die Mineralisierungszone vorhanden ist. Die Synthese,

aber v.a. die den biomechanischen Anforderungen angepassten, wenn auch

limitierten Umbauvorgänge der EZM, erfolgen durch die Chondrozyten, die eine hohe

Differenzierung sowie Spezialisierung auf die bradytrophen Bedingungen im

Knorpelgewebe aufweisen (FOSSUM 2007).

Biomechanische Eigenschaften

Die Zusammensetzung und Anordnung der EZM verleiht dem hyalinen Knorpel seine

einzigartigen biomechanischen Eigenschaften. Hyaliner Knorpel ist viskoelastisch

und formstabil. Beide Eigenschaften werden durch die negativ geladenen GAGs

4 1 Einleitung

vermittelt. Diese binden Wasser und erzeugen so eine gelartige Konsistenz. Wird

nun auf den Knorpel Druck ausgeübt, so wird das Gewebe zu einem gewissen Grad

komprimiert. Dabei nähern sich die Anionen einander an. Bei Entlastung kommt es

zur elektrostatischen Abstoßung der Anionen, und der Knorpel kehrt in seinen

Ausgangszustand zurück. Impulsartige Intervallbelastungen können hierbei besser

toleriert werden als Dauerbelastungen.

Durch die unterschiedliche Ausrichtung der Kollagenfibrillen ist eine hohe

Widerstandsfähigkeit gegenüber Zug- und Scherkräften vorhanden (KEMPSON et al.

1970; KUETTNER et al. 1989), die am höchsten ist, wenn die Fibrillen parallel zur

Zugrichtung angeordnet sind. Wird Druck auf die Gelenkoberfläche ausgeübt, wirken

die Zug- und Scherkräfte innerhalb der Knorpelzonen in unterschiedliche Richtungen.

Ein weiterer für die biomechanischen Funktionen des Gelenkknorpels wichtiger

Faktor ist die Knorpeldicke, bei der es innerhalb eines Gelenks, interindividuell und

artspezifisch, zu erheblichen Variationen kommen kann (FRANZ et al. 2001). Der

charakteristische Aufbau des Gelenkknorpels bleibt hierbei aber immer konstant

(FRITZ et al. 2003).

1.2 Knorpeldefekte

Die häufigsten Ursachen für Knorpeldefekte sind (Mikro)-Traumata,

Gelenkfehlstellungen und –instabilitäten, ein unphysiologisches Gelenkspiel i.S.e.

Teilkongruenz, was zu einer Punktbelastung führt, oder Ultrakongruenz, was zu

erhöhtem Abrieb führt, fokale aseptische Nekrosen, wie die Osteochondrosis

dissecans (OCD), degenerative Erkrankungen, wie die Arthrose,

Autoimmunerkrankungen, wie die rheumatoide Arthritis, metabolische Erkrankungen,

wie Gichtarthritis und Chondrocalcinose oder septische Arthritiden. Als Kofaktoren

sind Adipositas und chronische Fehl- und Überbelastung zu nennen. Die Rolle

genetischer Faktoren ist schlussendlich nicht geklärt (ERGGELET 2004).

Unterschieden werden akute von chronischen Läsionen. Zur Bestimmung des

Ausmaßes der Schädigung hat sich die Klassifikation nach Outerbridge

1.2 Knorpeldefekte 5

(OUTERBRIDGE 1961) etabliert und bewährt (siehe Abbildung 1.2). Auch wenn die

Klassifizierung aus der Humanmedizin stammt, kann sie auf die Tiermedizin

übertragen werden (UHL et al. 2005; BURGER et al. 2007; BADLANI et al. 2008).

Abbildung 1.2: schematische Darstellung der vier Schweregrade von Knorpelschäden, klassifiziert nach Outerbridge. (A) Knorpelödem, (B) Fibrillation, (C) Ulceration, (D) Knochenglatze. Modifiziert nach Menke (1997).

Die Fähigkeit, auf biomechanische Anforderungen mit Umbauvorgängen zu

reagieren, ist limitiert. So kann es im Rahmen einer übermäßigen Druckbelastung

zum Zerreißen des Kollagennetzwerkes kommen (FOSSUM 2007). Die

Knorpelmatrix wird brüchig und zugänglich für inflammatorische Zytokine und

Metalloproteinasen (MMP) (STASHAK 2002). Diese bauen die hyaline EZM

ungeordnet ab und setzen eine degenerative Kaskade in Gang, was schlussendlich

zur Folge hat, dass der Anteil an Kollagen Typ II, PGs und Wasser ab-, und der

Anteil an Kollagen Typ I zunimmt. Die intrinsischen Heilungsmechanismen sind

darüber hinaus insuffizient. Erkranktes oder verloren gegangenes Knorpelgewebe

wird allenfalls durch biomechanisch und metabolisch inkompetentes Narbengewebe

ersetzt. Neben Schmerzen und Einschränkungen der Mobilität prädisponiert ein

arrodierter Knorpel zur Entstehung einer verfrüht einsetzenden sekundären Arthrose

6 1 Einleitung

(FRISBIE et al. 2009). Dies macht deutlich, warum eine primäre Sanierung der

Läsion auch im Sinne einer präventiven Maßnahme absolut indiziert ist, wobei

weiterhin kontrovers diskutiert wird, ob nur symptomatische oder auch

asymptomatische Defekte, also Zufallsbefunde, behandelt werden müssen

(BHOSALE u. RICHARDSON 2008; SALZMANN et al. 2010).

1.2.1 Osteochondrosis dissecans beim Hund

Bei der OCD handelt es sich um einen pathologischen Prozess im wachsenden

Knorpel, der sich als Störung der enchondralen Ossifikation manifestiert. Die

Ätiologie ist ungeklärt. Als Ursache werden eine genetische Disposition (SLATER et

al. 1991; MONTGOMERY et al. 1994; WEINSTEIN et al. 1995), eine durch Haltung

und Fütterung (hoher Proteingehalt, Imbalanz der Versorgung mit Kalzium, Phosphat

und Vitamin D) induzierte Wachstumsintensität (ZENTEK u. NOLTE 1995;

RICHARDSON u. ZENTEK 1998), (Mikro-)Traumata (FOX u. WALKER 1993;

EKMAN u. CARLSON 1998) und eine hormonelle Imbalanz (FOX u. WALKER 1993)

diskutiert. Betroffen sind vor allem große, schnell wachsende Hunderassen

(LAFOND et al. 2002). Eine retrospektive Untersuchung an 108 Hunden zeigte, dass

die Schulter das am häufigsten betroffene Gelenk ist (59%), gefolgt von Ellbogen-

(18%), Sprung- (15%) und Kniegelenk (8%) (HORST 2000). Auch MONTGOMERY

et al. (1994) stellten eine Prävalenz von Schulter- (71%), Ellbogen- (11%), Sprung-

(9%) und Kniegelenk (4%) fest. Die Veränderungen können ein- oder beidseitig

auftreten, selten sind mehr als zwei Gelenke bei einem Tier betroffen. Rüden sind

häufiger betroffen als Hündinnen (SMITH 1991). Innerhalb der Gelenke gibt es eine

Prädisposition für stärker belastete Bereiche. Dies sind konvexe Gelenkflächen, auf

die besonders hohe Druckbelastung und Schiebebewegungen wirken (GRÜNBAUM

u. PAATSAMA 1986).

Bei der Pathogenese der OCD kommt es zu einer Verzögerung der enchondralen

Ossifikation aufgrund einer anormalen Maturierung der Chondrozyten. Das

Knorpelwachstum setzt sich fort und es kommt zu einer herdförmigen

Dickenzunahme des Gelenkknorpels. Wird eine kritische Schichtdicke überschritten,

kommt es zu einer Unterversorgung und somit zur Nekrose tieferliegender Zellen.

1.3 Therapieoptionen 7

Die verdickten Bereiche sind mechanisch weniger stark belastbar und es kann zu

Degeneration und Nekrose kommen. Unter Belastung können sich Risse unter den

verdickten Knorpelbezirken bilden und es kommt zu einer Ablösung der

Knorpelschuppe (NIEMAND 2006). Durch die Risse tritt die Synovia in Kontakt mit

dem subchondralen Knochen und es entsteht eine entzündliche Reaktion, die mit

Schmerzen einhergeht (FOX u. WALKER 1993). Löst sich die Knorpelschuppe

vollständig, entsteht ein freier Gelenkkörper (Corpus liberum), der in der Regel zu

einer Lahmheit führt.

1.3 Therapieoptionen

Entscheidend für die Wahl des Therapieverfahrens ist die exakte Klassifizierung der

Läsion. Maßgeblich sind Defektlokalisation, Ausdehnung und Tiefe, sowie der Erhalt

einer Defektschulter. Darüber hinaus müssen die Ätiologie und das Alter des

Defekts, sowie das anvisierte Therapieziel des zu behandelnden Individuums mit in

die Indikationsstellung einbezogen werden. Zudem müssen Begleitschäden, wie eine

Gelenkinstabilität oder mechanische Fehlstellung, zuvor oder in gleicher Sitzung

saniert werden. Es folgt entsprechend des Arbeitskontextes eine kurze Darstellung

derzeit angewandter regenerativer Therapieoptionen zur Behandlung akuter, fokaler

Gelenkknorpeldefekte, die zum Ziel haben, den Defekt (i) zu glätten und zu

stabilisieren (palliativ), (ii) mit einem Ersatzgewebe (reparativ) oder (iii) hyalinartigem

Knorpel (regenerativ) aufzufüllen (COLE et al. 2009). Kontrovers wird diskutiert, ob

auch Läsionen als Folge degenerativer oder entzündlicher Erkrankungen für

reparative und regenerative Techniken zugänglich sind. Konservative Maßnahmen,

wie Physiotherapie inkl. Stoßwellentherapie, Elektrotherapie, pulsierende

Signaltherapie, Ultraschall und Magnetfeldtherapie, orthopädische Hilfsmittel (z.B.

Spezialbeschlag bei Pferden), topische oder oral applizierte Analgesie und

Antiphlogese mit NSAIDs, intraartikuläre Injektionen von Glycocorticoiden oder

Viskosupplementen (Hyaluronsäure), deren Wirkungsnachweis teilweise nicht belegt

ist (Nahrungsergänzungsmittel), haben ihren Platz in der symptomatisch supportiven

sowie palliativen Therapie. Osteochondrale Transplantate und nicht resorbierbare

8 1 Einleitung

Implantate fallen aus dem Fokus der vorliegenden Arbeit. Innovative Strategien

umfassen z.B. eine Therapie mit autologem konditioniertem Serum zur Reduzierung

des Entzündungsfaktors Interleukin-1 (FRISBIE et al. 2007).

Débridement und Lavage

Débridement und Lavage können Teil einer der anderen chirurgischen Maßnahmen

sein, oder als alleinige Therapie bei Knorpeldefekten Grad I-II nach Outerbridge bzw.

palliativ zum Einsatz kommen. Arthroskopisch werden instabile oder freie

Knorpelfragmente entfernt und die Knorpeloberfläche stabilisiert und geglättet.

Anschließend erfolgt eine Lavage, bei der Debris und inflammatorische Mediatoren

aus dem Gelenk entfernt werden (COLE et al. 2009).

Mikrofrakturierung

Die Mikrofrakturierung (MFX) ist eine knochenmarkstimulierende Technik, die zur

Behandlung kleiner (< 4 cm²) Gelenkknorpeldefekte Grad III-IV nach Outerbridge

beim Mensch als auch bei Wirbeltieren geeignet ist. Zunächst wird der Defekt bis auf

den subchondralen Knochen kürettiert, welcher anschließend punktuell

durchbrochen wird. Durch die auf diese Weise erzeugte Blutung werden pluripotente

Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in den Defekt geschwemmt und durch das

sich bildende Blutgerinnsel lokal gebunden. Auch wenn sich weitläufig der Terminus

„hyalinartig“ durchgesetzt hat kommt es lediglich zur Ausbildung eines Faserknorpels

bzw. Narbengewebes von minderwertiger Qualität. Obgleich in vitro gezeigt werden

konnte, dass die eingeschwemmten Zellen zu Chondrozyten differenzieren können

(KRAMER et al. 2006), bestehen weiter Unklarheiten darüber, ob diese auch in vivo

am Heilungsprozess teilnehmen (GRANDE et al. 1999). KNUTSEN et al. (2007)

zeigten jedoch in ihrer prospektiven, randomisiert kontrollierten Studie, dass die MFX

nach vier Jahren keineswegs der autologen Chondrozytentransplantation (ACT) bzgl.

klinischem Outcome und histologischem Ergebnis unterlegen ist. Zudem ist die MFX

eine one step procedure mit deutlich geringerer intraoperativer Komorbidität und

postoperativer Komplikationsrate (ZANTOP u. PETERSEN 2009; GILLE et al. 2010).

Die MFX, wie auch die ACT, kann mit unterschiedlichen Matrizes aus z.B. tierischem

Kollagen, Hyaluronsäure oder synthetischen Polymeren kombiniert werden, die eine

1.3 Therapieoptionen 9

mechanische Stabilisierung, eine dreidimensionale Zellanordnung und

Immobilisierung sowie eine chondrogene Differenzierung einwandernder Zellen

bewirken sollen, was die Anwendbarkeit potentiell auch auf größere und instabile

Defekte ausdehnt (STEINWACHS et al. 2008).

Autologe Chondrozytentransplantation

Die ACT kann primär zur Behandlung ausgedehnter (> 4 cm²) Gelenkknorpeldefekte

Grad III-IV nach Outerbridge oder als Reserveverfahren nach Versagen anderer

vorheriger Therapiemaßnahmen durchgeführt werden (COLE et al. 2009). Es sind

zwei chirurgische Eingriffe notwendig. Zuerst erfolgt eine arthroskopische

Klassifizierung, in deren Rahmen auch eine Knorpelbiopsie aus einem nicht

belasteten Gelenkareal entnommen wird. Im Labor werden die gewonnenen

Chondrozyten aus der EZM isoliert, in vitro amplifiziert und ggf. charakterisiert

(Characterized Chondrocyte Implantation). Bei dem zweiten Eingriff, ca. sechs

Wochen später, werden die Zellen in den wie für die MFX präparierten und entweder

mit einem autologen Periostlappen (1. Generation) oder einer künstlichen Membran

(2. und 3. Generation) gedeckten Defekt injiziert. Vorteil der neueren Generation der

ACT ist, dass das Auftreten von mit der periostgedeckten ACT assoziierten

Komplikationen wie Arthrofibrose, Periosthyperthrophie und Lappendelamination

deutlich reduziert zu sein scheint (BEHRENS et al. 2006). Die ACT der 4. Generation

inkapsuliert die Chondrozyten in gelartigen Implantaten oder verwendet anstatt

isolierter Zellen ganze Knorpelgewebsfragmente. Auch bzgl. der ACT besteht

weiterhin Uneinigkeit darüber, ob die implantierten autologen Chondrozyten de facto

am Heilungsprozess teilnehmen, oder ob Chondrozyten aus dem umgebenden

gesunden Knorpel und /oder pluripotente Vorläuferzellen aus dem Knochenmark und

Periostlappen einwandern. Dennoch deuten einige Publikationen an, dass den

implantierten Chondrozyten, deren Charakterisierung und Entnahmestelle durchaus

eine wichtige Rolle zukommt (SCHAGEMANN et al. 2009). Auch wenn die ACT die

Entstehung eines hyalinartigen Ersatzgewebes begünstigt, so wird diese Technik

doch durch die Komorbidität an Periost- und Knorpelentnahmestelle, die

Notwendigkeit von zwei Eingriffen, die teils fragwürdige Qualitätssicherung der

10 1 Einleitung

Zellkultur, das protrahierte Rehabilitationsprotokoll und nicht zuletzt durch die hohen

Kosten limitiert.

1.4 Knorpel Tissue Engineering

Tissue Engineering ist eine zentrale Technologie der regenerativen Medizin. Hierbei

wird versucht, durch Zell- und Gewebekultur in vitro oder in vivo Gewebeverbände

und/oder vollständige Organe herzustellen, um diese dann autolog, allogen oder

xenogen zwecks Defektrekonstruktion zu transplantieren. Knorpel Tissue

Engineering bedient sich üblicherweise vier wesentlicher Elemente:

ein Scaffold als dreidimensionales strukturelles Gerüst

vitale Zellen, wobei sich je nach Anwendung pluripotente Vorläuferzellen,

ausdifferenzierte primäre Zellen oder Gewebe eignen.

ein Kulturmedium oder –organismus

und bei Bedarf der Induktion mittels Wachstumsfaktoren oder Komponenten

der genuinen EZM

1.4.1 Mesenchymale Stammzellen

Neben ausdifferenzierten, primären Chondrozyten kommen für das Tissue

Engineering auch pluripotente Vorläuferzellen mesenchymaler Zelllinien in Betracht,

die u.a. im Knochenmark zu finden sind. Diese pluripotenten Vorläuferzellen wurden

bereits in der Arbeitsgruppe um FRIEDENSTEIN et al. (1970; 1976) Anfang der

1970er als adhärent wachsende Zellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung in

verschiedene mesenchymale Zelllinien beschrieben. Anfang der neunziger Jahre

prägte CAPLAN (1991) den Begriff der mesenchymalen Stammzelle (MSC). Diese

fibroblastoiden Zellen mit einem pluripotenten Differenzierungspotenzial kommen in

verschiedenen Geweben, wie z.B. Knochenmark (CAPLAN 1991; PITTENGER et al.

1999; JIANG et al. 2002a), Fettgewebe (ZUK et al. 2001; JEON et al. 2008),

Nabelschnurblut (BIEBACK et al. 2004; J. W. KIM et al. 2004), peripherem Blut

(KUZNETSOV et al. 2001), Muskulatur (ALESSANDRI et al. 2004), Haut (LERMEN

1.4 Knorpel Tissue Engineering 11

et al. 2010) und Skelettmuskel (JIANG et al. 2002b) vor. Bisherige Untersuchungen

zeigen, dass die Anreicherung von MSCs aus verschiedenen Gewebetypen sehr

heterogene Ergebnisse liefert und diese bezüglich ihres Stammzellpotentials

erheblichen Schwankungen unterliegen (WAGNER u. HO 2007). Daher sind

Bezeichnungen wie mesenchymale Stromazellen, multipotente mesenchymale

Stromazellen oder mesenchymale Progenitorzellen u.a. üblich. Alle Bezeichnungen

beziehen sich auf dieselbe Population plastikadhärenter Zellen.

Als minimales Charakteristikum für MSCs wird Plastikadhärenz, die

Zelldifferenzierung entlang adipogener, osteogener und chondrogener Zelllinien

(siehe Abbildung 1.1) unter in vitro Bedingungen sowie Präsenz und Absenz

spezifischer Oberflächenantikörper beschrieben (DOMINICI et al. 2006). Laut

CAPLAN (1994) ist auch eine Differenzierung in andere mesenchymale Zellen, wie

z.B. Muskeln, Sehnen und Bänder, Markstroma und Nervengewebe möglich.

Abbildung 1.3: Differenzierungspotential pluripotenter Vorläuferzellen (MSC) (modifiziert nach http://www.sigmaaldrich.com/life-science/stem-cell-biology/mesenchymal-stem-cells.html, 15.04.2010)

Die Expression bestimmter Oberflächenmarker ist spezifisch für jede Spezies und Art

(DOMINICI et al. 2006). Da es sich bei unseren Spenderzellen um humane Zellen

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/stem-cell-biology/mesenchymal-stem-cells.html

12 1 Einleitung

handelt wurden hierfür spezifische Oberflächenmarker untersucht (PITTENGER et al.

1999).

MSCs wurden bereits aus zahlreichen Tierarten isoliert und klassifiziert, wie u.a.

Maus (JIANG et al. 2002b), Ratte (M. S. KIM et al. 2006; ISHIKAWA et al. 2007),

Kaninchen (GRIGOLO et al. 2009), Schwein (ZENG et al. 2006) und Schaf

(MCCARTY et al. 2009) sowie Rind (BOSNAKOVSKI et al. 2006), Ziege

(VERTENTEN et al. 2009), Hund (S. J. KIM et al. 2009) und Pferd (HEGEWALD et

al. 2004; VIDAL et al. 2008).

Die Vorteile der Verwendung von MSCs liegen in einer reduzierten Immunreaktion

(HORWITZ et al. 1999; AGGARWAL u. PITTENGER 2005), einer Resistenz

gegenüber niedrigen Sauerstoffkonzentrationen (GRIFFITH u. NAUGHTON 2002),

schneller Proliferation und einem hohen Differenzierungspotential unter dem Einfluss

von Wachstumsfaktoren (MEHLHORN et al. 2007; BASMANAV et al. 2008). Es liegt

auch keine Limitierung der Gesamtzellzahl vor, wie dies der Fall bei Chondrozyten

wäre, bedingt durch das begrenzte Entnahme- und Expansionsvermögen (CHAO et

al. 2007). Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Notwendigkeit von nur einem

chirurgischen Eingriff, sowie die Schonung des intakten Knorpelgewebes.

Ein weiterer potentieller Zelltyp für das Knorpel Tissue Engineering sind embryonale

Stammzellen (ESCs), die jedoch momentan keine klinische Relevanz besitzen.

1.4.2 Scaffolds

Scaffolds bieten den Zellen ein dreidimensionales Milieu, welches idealerweise der

der genuinen Knorpelmatrix ähnelt (biomimetische Scaffolds) und chondrogenes und

chondroinduktives Potential besitzt (bioaktive Scaffolds). Scaffolds sollten nicht nur

Zelladhärenz, sondern auch deren Rekrutierung ermöglichen (GETGOOD et al.

2009). So müssen Scaffolds biokompatibel und biodegradierbar sein, wobei die

Zersetzungskinetik des Materials und die Geweberegeneration idealerweise

synchronisiert sind. Grundsätzlich können die in Tabelle 1.1 beschriebenen

Materialien unterschieden werden.


Tabelle 1.1: Für Knorpel Tissue Engineering verwendete Materialien.

Scaffoldmaterialien Beispiele

Natürliche Polymere tierischen oder

pflanzlichen Ursprungs

Kollagen, Fibrin, Alginat, Chitosan

Resorbierbare oder stabile synthetische

Polymere

poly-α-hydroxyester wie PLA, PGA und

PLGA, polyethylenglycol (PEG), poly-ε-

caprolactone (PCL)

Resorbierbare oder stabile anorganische

Substanzen

Metall, Keramik

Kompositmaterialien aus natürlichen und

/oder synthetischen Polymeren

PCL/Hyaluronsäure, PCL/Collagen

Die strukturelle Beschaffenheit des Scaffolds entscheidet maßgeblich über die

Qualität des einwachsenden Gewebes. Sowohl Geometrie, Porengröße,

Faserstärke, Oberflächenstruktur, Elastizität und Härte können Adhäsion,

Differenzierung und Matrixexpression beeinflussen (ENGLER et al. 2006; O'SHEA u.

MIAO 2008). Hierbei spielen die Verbindungen der Zelle zur EZM bzw. artifiziellen

Scaffoldstruktur, die u.a. durch transmembrane Integrine vermittelt werden, eine

wichtige Rolle. Sie dienen nicht nur der Zelladhäsion, sondern fungieren auch als

Signalüberträger zwischen Zelle und EZM und beeinflussen auf diese Weise die

zelluläre Aktivität (RIVELINE et al. 2001; CAVALCANTI-ADAM et al. 2007; EVANS u.

CALDERWOOD 2007). So steht die EZM in direktem Kontakt mit dem Zytoskelett

(CHASTAIN et al. 2006).

Während der Zellverteilung und Bewegung ist die Aktinpolymerisation für die

Ausbildung von frühen Zellkontakten zur EZM verantwortlich (POLLARD u. BORISY

2003). Auf die Chondrogenese haben Integrine einen entscheidenden Einfluss

14 1 Einleitung

(IVKOVIC et al. 2003). Es konnte gezeigt werden, dass Chondrozyten an Kollagen

Typ I und IV, sowie Thrombospondin, Vitronectin, Fibronectin, Laminin und

Fibrinogen mittels RGD-Sequenz adhärieren (KORTESMAA et al. 2000).

Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Scaffolds ist die Möglichkeit

Wachstumsfaktoren gezielt einzusetzen zur Förderung der Differenzierung.

1.4.3 Poly-ε-caprolactone

Poly-ε-caprolactone (PCL) ist ein semikristalliner, synthetischer biokompatibler und

biologisch abbaubarer poly-α-hydroxy Polyester (CAUSA et al. 2006) mit einem

Molekulargewicht von 80,000 Mw, einer Glasumwandlungstemperatur von -60 °C und

einem Schmelzpunkt bei 58-60 °C (SHOR et al. 2007).

1.4: Sekundärstruktur des Poly-ε-caprolactone

PCL erfüllt die für erfolgreiches Knorpel Tissue Engineering im Bereich

osteochondraler Defekte geforderten Materialeigenschaften, wie Biokompatibilität,

Biodegradierbarkeit, strukturelle Stabilität, Osteo- und Chondroinduktion, sowie

Sterilisierbarkeit und Lagerbarkeit (CAO et al. 2003). Studien haben mehrfach die

Kompatibilität von PCL-Scaffolds unterschiedlicher Zusammensetzung, Struktur und

Geometrie mit Chondrozyten, MSCs sowie Kokulturen gezeigt und weisen in

Kombination mit entsprechenden Wachtsumsfaktoren und Nährmedien eine

potentielle Osteo- und Chondroinduktivität nach (CAO et al. 2003; ENDRES et al.

2003; LI et al. 2003; LI et al. 2005b). Die Verbindung zwischen Zellen und PCL wird

u.a. durch die Integrine Vitronectin und Fibronectin vermittelt (CHASTAIN et al.


2006). PCL wird in vivo, aber auch in vitro, langsamer mittels Hydrolyse abgebaut als

andere poly(α-hydroxy-ester), wie z.B. poly-L-lactic acid (PLLA) und polyglycolic acid

(PGA) (ENGELBERG u. KOHN 1991) und kommt so z.B. auch für die Regeneration

instabiler Läsionen, ossärer Defekte wie auch für eine Langzeit-Medikamenten-

Zufuhr in Frage (ENDRES et al. 2003; LI et al. 2003).

PCL-Scaffolds sind trotz initial hoher struktureller Integrität elastischer als z.B.

Scaffolds aus PLGA, so dass auch der Kontraktion, die fibroblastoide Zellen, zu

denen die MSCs zählen, ausüben, standgehalten werden kann. Zudem können PCL-

Scaffolds mit Wachstumsfaktoren und/oder Makromolekülen der hyalinen EZM

kombiniert werden, wodurch Zellrekrutierung, -adhärenz, -differenzierung wie ebenso

eine gewebespezifische Matrixsynthese optimiert und gesteigert werden kann. Ein

weiterer Vorteil ist die gute Verfügbarkeit und der Preisvorteil gegenüber anderen

Polymeren (WILLIAMS et al. 2005).

Verarbeitungstechniken

Mit Hilfe verschiedener Techniken wie z.B. Rapid Prototyping, Fused Deposition

Modeling oder Elektrospinning ist es möglich eine fast unbegrenzte, individuelle

Form- und Strukturvariabilität der Scaffolds zu erzeugen.

Das Elektrospinning ermöglicht die Herstellung einer nicht gewebten, zufällig

angeordneten, dreidimensionalen Matrix mit einem Faserdurchmesser im Nano- und

Mikrometerbereich. Eine flüssige Polymerlösung, z.B. PCL, befindet sich in einer

Glasspritze und wird durch eine Metallkanüle kontinuierlich und mit einer bestimmten

Flussrate, bis sich ein Polymertropfen bildet, extrudiert. Die Metallkanüle und somit

auch das Polymer wird dann einer modifizierbaren elektrischen Spannung

ausgesetzt. Übersteigt die elektrische Spannung die Oberflächenspannung des

Tropfens, so formt sich ein feiner Strahl aus Polymerfasern, die auf einer ebenfalls

geladenen Kollektionsplatte aufgefangen werden. Durch Modulation der Flussrate,

der Polymerzusammensetzung und der angelegten Spannung kann der

Faserdurchmesser variiert werden. Durch e.g. Veränderungen der Variablen nimmt

die Oberflächenspannung des Strahls entweder zu oder ab, was zu einer Verengung

16 1 Einleitung

oder Erweiterung des Strahls und somit Formierung von Nano- oder Mikrofasern

führt.

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung des Elektrospinnings. (A) Glasspritze mit PCL-Lösung, (B) Stromversorgung, (C) Nanofaserstrahl, (D) Copper Kollektionsplatte. Modifiziert nach Li et al. (2002).

Faserstärke

Die Herstellung von Fasern unterschiedlicher Stärke im Nano- bis Mikrometerbereich

ist insofern relevant, als dass es Ziel des Scaffoldings ist, ein biomimetisches, als ein

der genuinen Struktur ähnelndes, Konstrukt zu erzeugen, da gezeigt werden konnte,

dass Zellen grundsätzlich die Interaktion mit Nanostrukturen präferieren

(CAVALCANTI-ADAM et al. 2007; CHRISTENSON et al. 2007). So lassen sich mit

dem Elektrospinning Nanofasern herstellen, die einen Durchmesser haben, der

vergleichbar mit dem der Kollagen Typ II Fasern des hyalinen Knorpels ist (LI et al.

2002). Nanofasern haben eine erhöhte Anzahl an Atomen und Kristallen an ihrer

Oberfläche und weisen eine höhere Proteinadsorption aus z.B. Körperflüssigkeiten

auf (CHRISTENSON et al. 2007). Das Verhältnis zwischen Fläche und Volumen ist

größer als bei vergleichbaren Mikrobiomaterialien. So konnten LI et al. (2002; 2006b)

konsequenterweise zeigen, dass nanofibröse Scaffolds chondroprotektiv und

zelladhäsiv wirken und die Expression knorpelspezifischer Moleküle begünstigen,


wohingegen mikrofibröse Scaffolds zu einer Dedifferenzierung von Chondrozyten

führten.

Wachstumsfaktoren

Wachstumsfaktoren im Allgemeinen werden mit Scaffolds kombiniert, um Einfluss

auf Zellrekrutierung, -adhäsion und –differenzierung sowie deren gewebespezifische

Matrixsynthese zu nehmen. Dies ist insbesondere im Falle synthetischer Scaffolds

notwendig, da diese in der Regel, im Gegensatz zu Scaffolds aus Polymeren

natürlichen Ursprungs, keine intrinsische Bioaktivität aufweisen. Geeignete

Kandidaten zur Optimierung der chondrogenen Eigenschaften synthetischer

Scaffolds sind u.a. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) und Hyaluronsäure (HA).

TGF-β1 ist die häufigste Isoform des TGF-β und ubiquitär im Gelenkknorpel

vorhanden (GETGOOD et al. 2009). TGF-β1 wird in einer inaktiven Form sezerniert

und ist initial an ein latency-associated peptide (LAP) gebunden. Bevor es an seinen

Zielrezeptor binden und seine Wirkung entfalten kann, muss es vom LAP

dissoziieren. TGF-β1 kommt eine wichtige Rolle im Wachstum und der

Differenzierung von hyalinem Knorpel zu. Es reguliert zeit- und

konzentrationsabhängig u.a. die Zellproliferation und -differenzierung von

Chondroblasten und MSCs, sowie den EZM Metabolismus (LEE et al. 2004b;

DEFAIL et al. 2006). Darüber hinaus wurde ein inhibierender Effekt auf MMPs

beschrieben (ULRICH-VINTHER et al. 2005). Negative Effekte, wie Fibrose und

Entstehung von Osteophyten, treten erst bei höheren Dosierungen auf (GETGOOD

et al. 2009).

Innerhalb des hyalinen Knorpels ist die Hyaluronsäure (HA) das zentrale

Glycosaminoglycan (GAG). Im Gegensatz zu den anderen GAGs beinhaltet es keine

Sulfatgruppe und scheint nicht kovalent an Proteine zu binden. Trotz der fehlenden

kovalenten Bindung zu Proteinen ist es essentiell für aggregierende Proteoglykane

(PG) wie Aggrecan (SCHAGEMANN et al. 2008). HA bindet u.a. an den Zell-

Oberflächenrezeptor CD44 und unterstützt somit Zelldifferenzierung, -metabolismus

und -matrixsynthese (KNUDSON u. KNUDSON 2001; SCHAGEMANN et al. 2008).

Sie hat einen chondroprotektiven Effekt und wirkt unterstützend auf die chondrogene

18 1 Einleitung

Differenzierung von MSCs (MORELAND 2003; ERGGELET et al. 2007). Wie bereits

TGF-β1 wird auch HA ein inhibierender Effekt auf MMPs zugeschrieben (SASAKI et

al. 2004).

1.5 Schlussfolgerung und Aufgabenstellung

Fokale Gelenkknorpeldefekte heilen nicht und werden durch ein morphologisch,

metabolisch und biomechanisch inkompetentes Narbengewebe ersetzt. Dies führt

initial zu chronischen Schmerzen, Lahmheit und Einbußen bzgl. Leistungsfähigkeit

von z.B. Sportpferden. Zudem prädisponieren unbehandelte Knorpeldefekte zu

einem frühzeitig einsetzenden Verschleiß, der in letzter Konsequenz sogar die

Euthanasie des betroffenen Tieres zur Folge haben kann. Konservative Maßnahmen

haben allenfalls symptomatischen Charakter. Aber auch die etablierten regenerativen

Behandlungsstrategien, wie die MFX und ACT samt Modifikationen mit den

unterschiedlichsten Matrices, ermöglichen allenfalls die Regeneration eines

hyalinartigen Ersatzgewebes mit ungewisser Haltbarkeit und Funktion. Dennoch gibt

es Hinweise darauf, dass den MSCs, die per knochenmarkstimulierender Technik,

wie z.B. der MFX, in den Defekt eingeschwemmt werden, eine wesentliche Rolle im

Rahmen des Regenerationsprozesses zukommt (KNUTSEN et al. 2007; GILLE et al.

2010). Die größte Hürde stellt jedoch die gezielte Zellrekrutierung und -

Immobilisierung im Defekt, sowie je nach Lage im Defekt die chondrogene oder

osteogene Differenzierung samt gewebespezifischer Matrixsynthese dar.

Vor diesem Hintergrund war es Ziel der vorliegenden Arbeit, ein biomimetisches und

bioaktives Scaffold zu entwickeln, zu charakterisieren und zu erproben, welches

durch seine ultrastrukturelle Beschaffenheit, sowie molekulare Zusammensetzung in

der Lage ist, Vorläuferzellen zu rekrutieren und sie zur Adhäsion, chondrogenen

Differenzierung und knorpelspezifischen Matrixsynthese anzuregen. Dies würde die

dauerhafte Applikation externer chemischer (Wachstumsfaktoren) und/oder

biomechanischer Stimuli, wie üblicherweise propagiert und praktiziert, überflüssig

und die Initiierung knorpelspezifischer Regenerationsprozesse möglich machen.

1.5 Schlussfolgerung und Aufgabenstellung 19

Die Herstellung biomimetischer, also nano- und mikrofibröser Scaffolds aus PCL

erfolgte per Elektrospinning. Da synthetische Materialien per se keine intrinsische

Bioaktivität aufweisen, wurden die Scaffolds mit HA oder HA und TGF-β1

augmentiert. Die Charakterisierung der unterschiedlichen Scaffolds erfolgte mittels

REM und Lichtmikroskopie. Zudem wurde die chemotaktische Wirkung der

Wachstumsfaktoren (Migrationsassay) sowie deren Release (ELISA) untersucht. Die

Scaffolds wurden dann mit MSCs aus humanem Knochenmark besiedelt und unter

Standardbedingungen und ohne Zugabe weiterer Induktionsfaktoren in vitro kultiviert.

Die potentiell durch die Scaffolds induzierte Differenzierung und Proliferationsrate der

Zellen wurde per PCR, rtPCR und Picogreen Assay analysiert.

20 2 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Allgemeine Lösungen

Phosphate Buffered Saline (PBS) 10x Lösung (steril), pH 7,2

Folgende Substanzen wurden in deionisiertem Wasser (ddH2O) gelöst:

1,37 M NaCl

26,9 mM KaCl

0,1 M Na2HPO4 x 2H2O

17,6 mM KH2PO4

Einzelansätze wurden auf die 1x Konzentration in ddH2O verdünnt und anschließend

autoklaviert.

TRIS-Borat-EDTA-Puffer (TBE) 10x Lösung, pH 8,3

Folgende Substanzen wurden in Aqua dest. Gelöst:

1 M TRIS Ultra Pure

864 mM Borsäure

20 mM EDTA

Einzelansätze wurden auf die 1x Konzentration in ddH2O verdünnt.

FACS-Puffer (fluorescence activated cell sorting)

Folgende Substanzen wurden in PBS gelöst:

1% Bovines Serum Albumin

0,1% NaN3

Alzianblau Färbelösung

Folgende Substanzen wurden in 3% Essigsäure gelöst:

NaCl 4,5 g

MgCl2 6x H2O 6,4 g

Alcianblau 8 GX 0,25 g

Den Ansatz auf einen pH von 1,5 einstellen, filtrieren und dunkel lagern.

2.2 Primäre Zellkultur 21

Sudan III Färbelösung

0,03 g Sudan III

10 ml 70% Ethanol

BJ-Puffer (5x)

15% Ficoll

1% Bromphenolblau

4 M LiCl

500 mM EDTA

Die Substanzen wurden in ddH2O gelöst und anschließend steril filtriert.

2.2 Primäre Zellkultur

Zur Zellamplifizierung und -kultivierung wurden die Zelllinien sowie die

Differenzierungsansätze grundsätzlich in Brutschränken unter Standardbedingungen

bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 inkubiert. Alle verwendeten Materialien,

Medien und Reagenzien wurden vor dem Einsatz sterilisiert, autoklaviert oder

sterilfiltriert. Arbeiten mit Zellen und Zelllinien erfolgten unter einer sterilen Werkbank.

Die Zellen wurden auf Gewebekulturplastik- oder Glasoberflächen kultiviert. Der

Mediumwechsel (MW) fand alle 3-4 Tage statt.

2.2.1 Kulturmedien

Für die Zellkultur und spezifische Differenzierungen wurden die folgenden Medien

verwendet.

Kultivierungsmedium

Das humane Knochenmark wurde bei Raumtemperatur (RTemp) in 20 ml sterilem

PBS mit 5000 IE Heparin transportiert. Kultiviert wurden die MSCs in Dulbeccos

Modified Eagles Medium mit 4500 ml/l D-Glucose (DMEM high glucose) mit

folgenden Additiven:

10% FKS


1% MEM Nicht-essentielle Aminosäuren

1% L-Glutamin

1% Penicillin/Streptomycin

1% Sodium Pyruvat

300 µM Vitamin C (steril filtriert)

adipogenes Induktionsmedium

Dem Kultivierungsmedium wurden folgende Zusätze beigefügt:

2 µM Insulin

500 µM IBMX

1 µM Dexamethason

200 µM Indomethacin

adipogenes Erhaltungsmedium


10 µM Insulin

osteogenes Induktionsmedium


0.1 µM Dexamethason

10 M β-Glycerophosphat

chondrogenes Induktionsmedium

DMEM high Glucose wurde ergänzt durch:

1% L-Glutamin

1% Penicillin/Streptomycin

1% Sodium-Pyruvat

1% MEM Nicht-essentielle Aminosäuren

1% ITS+ Premix

0.1 µM Dexamethason

1 mM L-Prolin

2.2 Primäre Zellkultur 23

300 µM Vitamin C

10 ng/ml TGF-β 1

2.2.2 Zellisolierung

Knochenmark wurde aus dem Hüftkopf sowie dem proximalen Femur im Rahmen

von Totalendoprothese-Operationen in der Klinik für Chirurgie des Stütz- und

Bewegungsapparates, Sektion für Orthopädie (Direktor Prof. Russlies) des UK S-H

Campus Lübeck gewonnen. Dabei wurden die von der Universität zu Lübeck

geforderten wissenschaftlichen und ethischen Richtlinien zur Anzeige von

Organentnahmen und Gewebematerial zu wissenschaftlichen Zwecken

(Aktenzeichen: 08-085) beachtet und gewahrt.

Das Probenmaterial wurde in Behältnisse mit 20 ml PBS und 5000 IE Heparin steril

überführt. Anschließend wurde das Material im Labor bei RTemp aufgearbeitet und

ausplattiert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass nicht mehr als 2 h zwischen

Probengewinnung und Ausplattierung lagen. Gröbere Proben wurden auf 6 cm

Gewebekulturplastikschalen ausplattiert und mit Kultivierungsmedium bedeckt. Der

Überstand wurde in ein 50 ml Falkon überführt und 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert.

Das Pellet und der Fettüberstand wurden in Kultivierungsmedium resuspendiert und

auf 6 cm Gewebekulturplastik ausplattiert. Durch mehrmaliges gründliches Spülen

der Schale mit PBS wurden nicht-adhärente Zellen entfernt (erste Selektion).

2.2.3 Zellpassage

Bei einer Konfluenzdichte von 80-90% wurden die Zellen 1:3, bei langsamem

Wachstum 1:2, auf Zellkulturflaschen umgesetzt. Hierfür wurde das Medium

abgesaugt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die

Zellen für 3-5 min bei 37 °C mit Trypsin-EDTA inkubiert. Das Ablösen der Zellen von

der Gewebekulturplastikschale bzw. den Zellkulturflaschen mit Filter wurde unter

dem Lichtmikroskop kontrolliert. Die abgelösten Zellen wurden nun mit 10 ml

Kultivierungsmedium von der Oberfläche gespült und in ein 50 ml Falkon überführt.

Nach einer 5-min Zentrifugation bei 1000 rpm wurde der Überstand abgesaugt und

das Pellet in 10 ml Medium resuspendiert. Nach Zählung (siehe 2.2.4) wurden die


Zellen auf Gewebekulturflaschen ausplattiert, kryokonserviert (siehe 2.2.5),

durchflusszytometrisch analysiert oder für einen Versuch verwendet.

2.2.4 Zellzählung

Mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer wurde die Zellzahl bestimmt. Hierfür wurden 10 µl

resuspendierter Zellen auf die Zählkammer gegeben und unter dem Lichtmikroskop

ausgezählt. Für jede Bestimmung wurden Doppelwerte verwendet. Die genaue

Zellzahl errechnete sich aus folgender Formel:

2.2.5 Kryokonservierung

Zur Kryokonservierung wurden die gezählten Zellen erneut 5 min bei 1000 rpm

zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,5 ml Kultivierungsmedium mit 8%

Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert und in vorgekühlte Kryoröhrchen überführt.

Diese wurden umgehend in einen Kryo-Container verbracht und über Nacht bei

-80 °C gelagert. Anschließend wurden die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff

(-196 °C) zur Langzeitkonservierung überführt.

Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen bei 37 °C aufgetaut und in 15 ml Falkons mit

10 ml 37 °C warmem Kultivierungsmedium überführt und vermischt. Das Falkon

wurde dann 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in

Kultivierungsmedium resuspendiert und auf Gewebekulturflaschen ausplattiert.

2.3 Durchflusszytometrie

Mittels Durchflusszytometrie lässt sich über fluoreszenzaktivierte Antikörper die

Präsentation verschiedener Oberflächenmarker nachweisen. Bestimmte

Oberflächenmarker der Zellen werden durch, an passende Antikörper gebundene,

Fluoreszenzfarbstoffe markiert (siehe Tabelle 2.1). Die gefärbten Zellen befinden

sich in einer wässrigen Lösung. In einem hydrodynamischen System wird ein

2.3 Durchflusszytometrie 25

laminarer Flüssigkeitsstrom erzeugt. Dieser presst die zuvor mit Fluoreszenzfarbstoff

markierten Zellen über ein Schlauchsystem durch einen Messkopf und führt so zu

einer Verengung des Strahls, so dass ein einzelnes Durchtreten der Zellen am

Analysepunkt gewährleistet wird. Hier passieren sie einen Laserstrahl. Trifft das Licht

des Lasers auf eine Zelle wird es gestreut und mittels Detektoren nachgewiesen.

Eine Analyse besteht aus der Summe vieler schnell hintereinander folgender

Einzelmessungen. Die Hintergrundfluoreszenz wird durch unspezifische

Isotypkontrollen gemessen.

Die durchflusszytometrische Untersuchung erfolgte am Modular Flow (DAKO,

Cambridgeshire, UK). Hierbei wurden je Probe 5000-15000 Events gemessen. Die

Messung erfolgte in der dritten bis siebten Passage der Zellen. Je 10 µl der

Antikörper (Ausnahmen: für CD90 nur 5 µl Antikörper und für die Negativkontrolle

kein Antikörper) wurden in separate Eppendorfröhrchen vorgelegt und dunkel bei

4 °C unter Ausschluss von Licht aufbewahrt. Nach Abtrypsinierung der Zellen wurden

sie mit 10% BSA (in PBS) von der Oberfläche gespült und gezählt. Für eine

erfolgreiche Messung war eine Mindestzellzahl von 5x105 notwendig, die in 2 ml 10%

BSA (in PBS) aufgenommen, resuspendiert und je 100 µl der Zellsuspension in die

zuvor vorbereiteten Eppendorfröhrchen überführt wurden. Alle Ansätze wurden gut

durchmischt und 30 min bei 4 °C unter Ausschluss von Licht inkubiert. Nach Zugabe

von 1 ml FACS Puffer und 1 min bei 4000 rpm Zentrifugation wurde der Überstand

verworfen und das Pellet in 600 µl FACS-Puffer resuspendiert. Die Messung erfolgte

unverzüglich. Untersucht wurden Zellen, angefärbt mit Phycoerthrin (PE)

konjugiertem monoklonalen Antikörper (mAK) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC)

konjugiertem mAK, auf die Präsenz bzw. Absenz von in Tabelle 2.1 beschriebenen

Oberflächenmarkern. Es wurde je eine Kontrolle mit PE und FITC gefärbten Zellen

ohne Antikörper gemacht und eine Negativkontrolle ohne Färbung der Zellen. Die

Bearbeitung der Daten erfolgte mit dem Programm Summit 4.3 (DAKO,

Cambridgeshire, UK).


Tabelle 2.1: FACS-Antikörper zum Nachweis von Oberflächenantikörpern zur Klassifizierung der isolierten Zellen aus humanem Knochenmark.

Marker hämatopoetischer Zellen Konjugat Bezeichnung

CD34 PE GP105-120

CD45 FITC Leucocyte common antigen

Marker pluripotenter Zellen Konjugat Bezeichnung

CD13 PE Aminopeptidase N

CD29 PE β1 integrin

CD44 PE GP80-95 (H-CAM)

CD49d PE α4 integrin

CD54 PE Intercellular adhesion molecule-1

CD73 PE Ecto-5‘-nucleotidase

CD90 PE Thy-1 Membrane Glycoprotein

CD106 PE Vascular cell adhesion molecule 1

CD133 PE Prominin-1

CD140b PE Platelet-derived growth factor receptor β

CD166 PE Activated leucocyte cell adhesion molecule

CD271 PE Nerve growth factor

2.4 Differenzierung primärer Zellen

Die isolierten plastikadhärenten Zellen wurden auf ihre Pluripotenz überprüft, indem

sie in die adipogene, chondrogene und osteogene Zellline differenziert wurden. Die

adipogene und osteogene Differenzierung wurde für 21 Tage angesetzt mit

Erntezeitpunkten in uninduziertem Zustand nach 1-2 Tagen, sowie induziert nach 14

und 21 Tagen. Die chondrogene Differenzierung wurde für 28 Tage angesetzt mit

Erntezeitpunkten in uninduziertem Zustand nach 3-5 Tagen und induziert nach 21

und 28 Tagen.

2.5 Histologie 27

2.4.1 Adipogene Differenzierung

Für die adipogene Differenzierung wurden 5000 Zellen/cm² auf 6 cm Petrischalen

und Culture Slides im Monolayer mit Kultivierungsmedium ausplattiert, welches nach

1-2 Tagen gegen adipogenes Induktionsmedium ausgetauscht wurde. Der MW fand

alle 3-4 Tage statt, wobei alternierend adipogenes Induktionsmedium und

Erhaltungsmedium verwendet wurde. Bei jedem MW wurden die Zellen zweimal mit

PBS gewaschen, um Reste des vorigen Mediums zu entfernen. Zellwachstum und –

morphologie wurden lichtmikroskopisch kontrolliert. An den Endpunkten wurde RNA

und Proben für histologische Färbungen gewonnen.

2.4.2 Osteogene Differenzierung

Die osteogene Differenzierung wurde entsprechend der adipogenen angesetzt. Zur

Ausplattierung wurde ebenfalls Kultivierungsmedium verwendet, welches jedoch

nach 1-2 Tagen gegen osteogenes Induktionsmedium ausgetauscht wurde.

2.4.3 Chondrogene Differenzierung

Für die chondrogene Differenzierung wurden dreidimensionale Micromassbodies

(MMB) hergestellt. 2,0-2,2x105 Zellen wurden in 0,5 ml chondrogenem

Induktionssmedium aufgenommen (Negativkontrolle in Kultivierungsmedium), in

15 ml Falkons überführt und 5 min bei 500 rpm zentrifugiert. Für die RNA-Isolierung

wurden an Tag 3-5 (Negativkontolle), 21 und 28 je 4 MMBs mit PBS gewaschen und

in den Lysis Puffer aus dem Nucleo Spin RNAII Kit überführt. Der Lysis-Puffer wurde

mit 1% β-mercaptoethanol versetzt.

Je ein MMB wurde nach erfolgter Waschung mit PBS für Gefrierschnitte blasenfrei

mit Tissue Tec in einem Cryomold eingebettet und bei -20 °C eingefroren.

2.5 Histologie

Für die histologischen Färbungen wurden auf Culture Slides ausplattierte Zellen der

Differenzierungsversuche verwendet. Die Ernte fand bei der adipogenen und

osteogenen Differenzierung uninduziert an Tag 1-2 statt, induziert an den Tagen 14


und 21. Vor dem Färbeprotokoll wurde das Medium verworfen und zweimal mit PBS

gewaschen.

Für die chondrogene Differenzierung wurden die MMBs uninduziert nach 3-5 Tagen

geerntet und induziert an den Tagen 21 und 28. Die in Tissue Tec eingebetteten

MMBs wurden am Kryotom geschnitten (Histologie: 16 μm Dicke,

Immunhistochemie: 10 μm Dicke) und für 24 h bei RTemp luftgetrocknet.

Nach der Färbung wurden die Schnitte mit Vectashield eingedeckt und bei 4 °C

lichtgeschützt gelagert.

2.5.1 Sudan III Färbung

Zum Nachweis von Adipozyten kann Sudan III, ein in Kohlenwasserstoffen, Ölen,

Fetten und Wachsen löslicher Azofarbstoff, verwendet werden, der intrazelluläre

Lipidvakuolen anfärbt.

500 µl der Färbelösung wurden in jede Kammer des Culture Slides gegeben und

15 min inkubiert. Die Färbung wurde unter dem Lichtmikroskop kontrolliert bevor die

Färbelösung abgesaugt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen wurden. 500 µl

Hämatoxylin wurden in jede Kammer gegeben und 10 sec inkubiert. Zum Bläuen des

Hämatoxylins wurden die Zellen mit H2O gewaschen und mit ddH2O nachgespült.

2.5.2 Alkalische Phosphatase

Charakteristisch für Osteoblasten bzw. eine osteogene Zelldifferenzierung ist die

Expression des Oberflächenenzyms alkalische-Phosphatase, die ein früher Marker

für Osteogenese ist.

Es wurde bei RTemp ein alkalische Phosphatase Kit von Sigma (München,

Germany) verwendet. Zuerst wurde eine Fixierlösung aus 2,5 ml Citratlösung, 6,5 ml

Azeton und 0,8 ml 37% Formaldehyd hergestellt, sowie eine Naphtol-Färbelösung

aus 12,5 µl Sodium Nitrit Lösung und 12,5 µl FRV Alkaline Phosphatase Lösung, die

laut Protokoll nach 2 min Inkubation mit 563 µl ddH2O und 12,5 µl Naphtol AS-BI

Alkaline Lösung vermischt wurde. Für 30 sec wurde die Fixierlösung auf die Zellen

2.5 Histologie 29

gegeben. Nach Inkubation wurden die Zellen dreimalig über mindestens 45 sec mit

ddH2O gewaschen. 500 µl der Naphtol-Färbelösung wurden je Kammer des Culture

Slides hinzugegeben und 15 min unter Lichtausschluss inkubiert. Erneut wurde 2 min

mit ddH2O gewaschen. Zur Anfärbung der Zellkerne wurde 10 sec Hämatoxylin

hinzugegeben, welches mit H2O gebläut und mit ddH2O nachgespült wurde.

2.5.3 Alzianblau Färbung

Alzianblau, ein wasserlöslicher Phthalocyaninfarbstoff, wird zur selektiven

Darstellung saurer Mukosubstanzen, insbesondere knorpelspezifischer PGs genutzt.

16 µm dicken Schnitte wurden zweimal in PBS gewaschen und anschließend 30 min

in 3,7% Formaldehyd fixiert. Die Fixierlösung wurde abgesaugt und die Schnitte

dreimalig in PBS gewaschen. Die Alzianblau-Färbelösung (siehe 2.1) wurde

hinzugegeben und über Nacht bei RTemp inkubiert. Am folgenden Tag wurde diese

abgesaugt und die Schnitte dreimalig mit PBS gewaschen.

2.5.4 Kollagen Typ II Färbung

Das für hyalinen Knorpel charakteristische Kollagen Typ II wurde

immunhistochemisch nachgewiesen. Hierfür wurde ein Anti-Kollagen Typ II

Primärantikörper (II-II6B3, Spendertier: Mus musculus) und ein FITC-konjugierter

Anti-Mouse-IgG Sekundärantikörper verwendet. Die Zellkerne wurden mit

4´,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) angefärbt. Das Absorptionsmaximum von FITC

lag bei 495 nm, das Emissionsmaximum bei 528 nm Wellenlänge. Das

Absorptionsmaximum von DAPI lag bei 358 nm, das Emissionsmaximum bei 461 nm

Wellenlänge. DAPI wurde mit ultraviolettem Licht zu blauer Fluoreszenz und FITC

mit blauem Licht zu grüner Fluoreszenz angeregt.

Die 10 µm dicken Kryoschnitte wurden zweimalig mit PBS gewaschen und 5 min mit

-20 °C kaltem Methanol-Aceton-Gemisch (70% zu 30%) fixiert. Rückstände der

Fixierlösung wurden vollständig entfernt und mit 7,5% BSA-Lösung 30 min bei

RTemp geblockt. Alle folgenden Inkubationsschritte wurden in einer feuchten

Kammer bei RTemp durchgeführt. Nach erneuter Waschung mit PBS wurde der

Primärantikörper 1:50 in PBS für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Schnitte wurden


dreimalig mit PBS gewaschen und mit dem Sekundärantikörper 1:200 in PBS, mit

1:1000 DAPI für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Auswertung erfolgte mittels

Fluoreszenzmikroskopie am Axioplan 2 mit Axiocam MRc5 (Carl Zeiss, Jena,

Germany).

2.6 Genexpression

Während der in vitro Differenzierung wurde die Expression gewebespezifischer

mRNA mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) überprüft. Hierfür musste zunächst

die RNA aus den Zellen isoliert und aufgereinigt werden. Durch eine Reverse

Transkription (RT) wurde die RNA in komplementäre cDNA umgeschrieben.

Anschließend wurde im Verlauf der PCR durch Anlagerung (Annealing)

sequenzspezifischer Primerpaare an die cDNA die Amplifikation des

primerspezifischen Genabschnittes bewirkt. Nach Abschluss der PCR fand eine

Einfärbung mit Ethidiumbromid statt, welches in Nukleinsäuren interkaliert und mittels

ultraviolettem-Licht darstellbar ist. Das PCR-Produkt wurde gelelektrophoretisch

aufgetrennt und unter ultraviolettem-Licht sichtbar gemacht. Die spezifische

Genexpression wurde semiquantitativ bestimmt und statistisch ausgewertet.

2.6.1 Isolierung von RNA

Zur Isolierung der RNA wurde das NucleoSpin®RNA II Kit von Machery-Nagel

(Düren, Germany) verwendet. Nach Entfernen des Mediums und anschließender

dreimaliger Waschung mit PBS wurden 350 µl Guanidinthiozyanat-haltiger Lysis-

Puffer (Puffer RA1) sowie 3,5 µl β-Mercaptoethanol aufgebracht. Die Zellen wurden

mittels Zellschaber vom Plastik abgelöst, in Eppendorfröhrchen überführt und

mechanisch lysiert. Um das Lysat zu reinigen und die Viskosität zu reduzieren,

wurde es auf die im Kit enthaltenen rosa Säulen, mit Auffangröhrchen, gegeben

(NucleoSpin® Filter Säulen). Die Säulen wurden 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.

Um die RNA-Bindungs-Konditionen korrekt einzustellen, wurden die Proben in dem

Auffangröhrchen mit 350 µl 70% Ethanol homogenisiert. Das Lysat-Ethanol-Gemisch

wurde dann auf die im Kit enthaltenen blauen Säulen gegeben (NucleoSpin®RNA II

2.6 Genexpression 31

Säulen) und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert, wobei die RNA von dem Filter

gebunden wurde. Anschließend wurden die Salze mittels Zugabe von 350 µl

Membran Entsalzungspuffer (MDB) und erneuter 1 minütiger Zentrifugation bei

10000 rpm entfernt, wodurch die rDNase-Verdauung effizienter wurde. Um

Verunreinigungen durch DNA an der Membran zu verdauen, wurde ein Gemisch aus

10 µl rDNase und 90 µl Reaktionpuffer für rDNase (Reaktionspuffer für rDNase) je

Probe vorbereitet und hiervon 95 µl auf jede Säule gegeben. Die Säulen wurden bei

RTemp 15 min inkubiert. Um diese Verdauung zu beenden, wurde die

Siliziummembran mit 200 µl Puffer (RA2) gewaschen und 1 min bei 10000 rpm

zentrifugiert. Anschließend erfolgten zwei weitere Waschungsschritte mit 600 µl

Puffer (RA3) und 250 μl Puffer (RA3) mit jeweils einer Zentrifugation bei 1000 rpm für

1 min. Um die Membran nun vollständig zu trocknen, wurde 3 min bei 12000 rpm

zentrifugiert. Die Säulen wurden in nukleasefreie 1,5 ml Eppendorfröhrchen platziert

und in 60 µl RNase-freies H2O eluiert und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Hierbei

wurde die RNA gelöst und mit RNase-freiem H2O in das Eppendorfröhrchen

überführt. Die RNA konnte nun gemessen und weiterverarbeitet werden. Zur

Lagerung wurde sie bei -20 °C eingefroren.

2.6.2 Reverse Transkription

Für die Reverse Transkription (RT) wurden 500 ng RNA benötigt. Die Messung

erfolgte, im Falle der Differenzierungsversuche, an einem Photometer mit

Einmalküvetten (Photometer Bio Mate 3). Hierfür wurde eine Verdünnung mit RNA

(3 μl) und DEPC-H2O (97 μl) hergestellt. Für die Messung eines Leerwertes wurden

100 µl des DEPC-H2O verwendet. Die Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von

260 nm und 280 nm.

Für die RT wurde das Revert Aid H Minus Frost Strand cDNA Synthesis Kit

(Fermentas, St.Leon, Germany) verwendet. Alle Arbeiten fanden bei 4 °C statt.

500 ng der gewünschten RNA wurden mit DEPC-H2O auf ein einheitliches Volumen

von 11 μl aufgefüllt. Zu jeder Probe wurde 1 µl Oligo(dT)-Primer hinzugegeben. Die

Proben wurden sorgfältig durchmischt, für 5 min bei 65 °C inkubiert und

anschließend auf 4 °C gekühlt. Durch die an den Poly-A-Schwanz der mRNA


bindenden Primer (Oligo(dT)-Primer) kann die im folgenden Schritt hinzugegebene

RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) einen cDNA-Strang

synthetisieren. 8 µl eines Mastermixes, bestehend aus 4 µl 5-reaction-buffer, 1 µl

Ribo Lock RNase, 2 µl dNTP (10mM) und 1 µl Reverse Transkriptase wurden jeder

Probe hinzugefügt und durchmischt. Die Proben wurden 60 min bei 42 °C inkubiert.

Die enzymatische Reaktion wurde durch ein 5-minütiges Aufheizen auf 70 °C

inaktiviert. Die Proben wurden bei -20 °C gelagert oder direkt in einer PCR

verwendet.

2.6.3 Polymerase Kettenreaktion

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) beinhaltet drei sich wiederholende Schritte

(Denaturierung, Annealing und Elongation), die in Abhängigkeit des verwendeten

Primers unterschiedlich häufig wiederholt werden.

Die Proben wurden bei 4 °C verarbeitet. Zu Beginn der PCR wurde ein Mastermix

angesetzt, der je Probe 13,2 μl DEPC-H2O, 2,5 μl Puffer (10x Magnesiumpuffer),

1,8 μl 25 mM MgCl2, 4 μl DNTP (2,5 mM je DNTP), 0,25 μl Taq-Polymerase und je

1,25 μl Primer (vorwärts und rückwärts) enthielt. Je Probe wurden 0,75 μl cDNA

vorgelegt und 24,25 μl Mastermix hinzugegeben. Nach einer gründlichen

Durchmischung wurden die Proben in den Thermozykler gegeben, der entsprechend

des verwendeten Primers programmiert war (siehe Tabelle 2.2). Alle Proben

durchliefen eine zweiminütige Initialisierung bei 95 °C, gefolgt von 40 Sek.

Denaturierung bei 95 °C, 40 Sek. Annealing, wobei die Temperatur hier 5-10 °C

unter dem Schmelzpunkt des Primers lag, und 40 Sek. Elongation bei 72 °C. Im

Anschluss an den letzten Zyklus wurde die DNA für 8 min bei 72 °C inkubiert und

anschließend auf 4 °C abgekühlt. Es folgte die Auftragung auf ein Gel mit

anschließender Gelelektrophorese. Die DNA musste solange bei 4 °C aufbewahrt

werden.

2.6 Genexpression 33

Tabelle 2.2: Primer zur Verwendung bei der PCR. Aufgelistet sind die für das Markergen spezifischen Primer mit den dazugehörigen Sequenzen, Annealingtemperaturen, Zyklenanzahl und Fragmentgröße.

Gen →Forward Primer

←Reverse Primer

Annealing

Temp. °C

Zyklen Länge

(bp)

Ad

ipo

gen

e D

iffe

ren

zie

run

g

aP2 →GCTTTGCCACCAGGAAAGTG

←ATGACGCATTCCACCACCAG

60°C 35 279

PPARγ →AAACTCTGGGAGATTCTCCT

←TCTTGTGAATGGAATGTCTT

56°C 35 247

C/EBP →AGAAAGGGGTGGAAACATAGG

←GAAAGCTGAGGGCAAAGG

58°C 35 685

Oste

og

en

e D

iffe

ren

zie

run

g

Alk. Phosph. →ACCTGGGCATTGGTGTTGT

←GGAGATGGGATGGGTGTCT

58°C 38 146

Osteopontin →CATTCAACTCCTCGCTTTCCAAG

←ACTGATTTTCCCACGGACCT

58°C 35 199

Osterix →GCAAAGCAGGCACAAAG

←AGGGAATGAGTGGGAAAAGG

58°C 38 237

MSX2 →GCTGATGGGGAAAGGGAGA

←CCTCGGTCAAGTCGGAAA

58°C 38 377

RunX2 →GAGGCGGTCAGAGAACAAAC

←ATGGCGGGTAACGATGAA

58°C 38 270


Ch

on

dro

gen

e

Dif

fere

nzie

run

g

Collagen II →ACAGTCTTGCCCCACTTACC

←AGGCTCCCAGAACATCACCT

58°C 35 352

Aggrecan →CGCAGGGATAAAGGACTGAA

←GCCACTGAGTTCCACAGA

58°C 35 441

Sta

nd

ard

Gapdh →CCGCATCTTCTTTTGCGTCGC

←GCAACTGTGAGGAGGGGAGATT

CAG

55°C 30 1100

2.6.4 Gelelektrophorese und Densitometrie

Für die Gelelektrophorese wurde ein 2%-iges Agarose-Gel in 1x TBE-Puffer 20mit

25 ng/ml Ethidiumbromid verwendet. Ethidiumbromid lagert sich in die

doppelsträngige DNA ein und ist durch ultraviolettes Licht sichtbar zu machen. Nach

vollständiger Aushärtung in einer Gelkammer konnte es mit Proben beladen werden.

Die Proben wurden mit BJ-Puffer (siehe 2.1) versetzt (7 μl Probe und 5 μl BJ-Puffer)

und anzentrifugiert. Um einen DNA-Längenstandard für die später sichtbaren

Banden zu haben, wurde eine 1 Kb DNA-Leiter aufgetragen die das

Molekulargewicht der DNA-Fragmente darstellt. 20 μl 1 Kb DNA Leiter wurden in

40 μl BJ-Puffer und 140 μl ddH2O gelöst. Das Agarosegel wurde mit 1x TBE-Puffer

überschichtet. Die Taschen des Gels wurden mit 12 μl Probe-Puffer-Gemisch befüllt.

Von der Leiter wurden ebenfalls 12 μl verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei

100 V in horizontalem Lauf über 45-60 min. Im Anschluss wurde das Gel unter

Anregung mit ultraviolettem Licht fotografiert, wobei die PCR-Produkte durch das

Ethidiumbromid sichtbar wurden. Die Auswertung erfolgte mittels ImageJ Software

(NIH, Bethesda, USA), bei der die Intensität der einzelnen Banden gemessen wird.

Die Intensität der Banden der gewebespezifischen Primer wurde in Relation zur

Intensität der Banden des internen Standards GAPDH gesetzt. Je Bedingung

(adipogene, chondrogene oder osteogene Differenzierung) wurde jeweils der

2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 35

höchste Expressionswert als 100% gewertet. Alle weiteren Messungen wurden auf

diesen Maximalwert bezogen.

2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds

Alle Versuche wurden unter Standardbedingungen (siehe 2.2) inkubiert. Die

Probenentnahmen erfolgten im Anschluss an die Besiedlung an Tag 1-3, 21 und 28.

Je Endpunkt waren drei Scaffolds zur Bestimmung für RNA-Isolierung vorgesehen,

und je ein Scaffold zur Bestimmung des cDNA Gehaltes sowie zur histologischen

und immunhistochemischen Ausgewertung.

2.7.1 Scaffoldherstellung

Nano- und mikrofibröse Scaffolds wurden in Zusammenarbeit mit der Mayo Clinic

College of Medicine, Cartilage and Connective Tissue Research, Rochester-

Minnesota, mittels Elektrospinning Technik hergestellt. Zur Herstellung nanofibröser

Scaffolds wurden 1,05 g 80,000 Mn Poly-ε-caprolacton (PCL) in 0,8 g

N,N-dimethylformamide, 6,0 g Chloroform und 3,2 g Azeton gelöst, 4 h in einem

geschlossenen Behältnis bei RTemp zu einer 10,5 wt%-igen homogenen Lösung

vermischt und anschließend in eine 30 ml Glasspritze blasenfrei aufgezogen. Die

Spritze wurde mit einer 10 cm langen 20-gauge Metallnadel ausgestattet. Die Lösung

wurde einem 30 kV elektrischem Feld ausgesetzt, während sie, bei einer

Durchflussrate von 3,3 ml/h, appliziert wurde. Die elektrostatisch aufgeladenen

Fasern wurden auf einer Glasplatte (Kollektionsplatte) aufgefangen. Der Abstand

zwischen Nadelspitze und der Kollektionsplatte betrug 15 cm.

Im Unterschied zu den nanofibrösen Scaffolds wurde bei den mikrofibrösen Scaffolds

eine 12.5 wt%-ige PCL-Lösung (1,9 g 80,000 Mn PCL gelöst in 15,0 g Chloroform)

verwendet. Zudem wurde ein elektrisches Feld von 12 kV erzeugt bei einer

Durchflussrate von 0,5 ml/h. Der weitere Ablauf entsprach dem der Herstellung der

nanofibrösen Scaffolds.


Die Faserqualität beider Fabrikationsansätze wurde lichtmikroskopisch kontrolliert.

Bei einer Fleecedicke auf der Kollektionsplatte von 1 mm wurde der

Fabrikationsprozess beendet. Aus dem hergestellten Fleece wurden Scheiben mit

einem Durchmesser von 6 mm ausgeschnitten. Zur Sterilisation wurden die Scaffolds

über Nacht mit Ethylenoxid begast.

2.7.2 Scaffoldaugmentation

Zur Herstellung hyaluronsäurehaltiger Scaffolds wurden Scheiben beider

Faserstärken in eine Lösung aus gereinigter 1%-iger Natrium-Hyaluronsäure (Mw:

1,65x106 Da) -gelöst in ddH2O- getaucht und gefriergetrocknet. Diese

Hybridscaffolds wurden mit VSNHA und VSMHA gekennzeichnet.

Zur Herstellung TGF-β1-haltiger Scaffolds wurden Scheiben beider Faserstärken wie

oben beschrieben zunächst mit Hyaluronsäure augmentiert und in einem zweiten

Schritt zusätzlich mit 200 ng TGF-β1 (R&D, Minneapolis, USA), gelöst in 20 μl 0,1%

BSA in 4 mM HCl, welches ebenfalls durch Gefriertrocknung fixiert wurde. Diese

Hybridscaffolds wurden mit VSNTGF und VSMTGF gekennzeichnet.

Als Kontrolle dienten Scaffolds beider Faserstärken, auf die weder TGF-β1, noch

Hyaluronsäure aufgetragen wurde. Sie erhielten lediglich den Träger (20 μl

0,1%-iges BSA in 4 mM HCl), welcher ebenfalls mittels Gefriertrocknung fixiert

wurde. Diese Kontrollscaffolds wurden mit VSN und VSM gekennzeichnet.

Zusätzlich wurde eine weitere Kontrollgruppe nanofibröser Scaffolds ohne weitere

Zusätze hergestellt. Hier sollte das chondrogene Differenzierungspotential durch

Zugabe des Wachstumsfaktors TGF-β1 ins Medium dargestellt werden. Diese

Scaffolds wurden mit VSP gekennzeichnet.

2.7.3 Scaffoldcharakterisierung

Scaffoldmorphologie

Die Ultrastruktur unbesiedelter, nicht-augmentierter Scaffolds unterschiedlicher

Faserstärke wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Hierfür

wurden die Scaffolds auf Objektträgern aus Aluminium befestigt und mit


Gold/Palladium beschichtet. Aufgrund Fehlens organischer Substanzen konnte auf

eine Fixierung und Dehydrierung verzichtet werden. Bilder wurden an einem Hitachi

S400 Rasterelektronenmikroskop bei 3 kV erzeugt.

Zellmigration

Mit Hilfe eines Migrationsassays sollte überprüft werden, ob die Scaffolds per se

bzw. die Augmentation mit Hyaluronsäure und TGF-β1 eine chemotaktische Wirkung

i.S.e. Rekruitments auf die MSCs haben.

Hierfür wurden 3x104 MSCs der dritten Passage mit 40 μl serumfreiem Diätmedium

(1 g/l Glucose, 0,5% BSA, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml

Streptomycin) vermischt und als Tropfen auf den Polycarbonatfilter

(Porendurchmesser: 8 μm) einer speziellen Chemotaxis 96-well-Platte pipettiert. Die

in Diätmedium getränkten Scaffolds befanden sich im Well unterhalb des Filters. Für

eine Positivkontrolle wurden die Wells mit Kultivierungsmedium befüllt, für die

Negativkontrolle mit Diätmedium. Nach 24 h und 48 h wurden die Zellen 3 min mit

eiskaltem Ethanol/Aceton (1:1 v/v) fixiert. Anschließend wurden die Zellen von der

Oberseite des Filters entfernt und die migrierten Zellen auf der Unterseite des Filters

mit einem Schnellfärbesystem (Hemacolor®: rot) angefärbt. Nach dreimaligem

Spülen mit PBS wurden lichtmikroskopisch drei repräsentative Gesichtsfelder je Well

ausgezählt.

Release von TGF-beta1

Mit dem Quantikine® Human TGF-β1 Kit der Firma R&D Systems (Minneapolis,

USA) wurde die quantitive und zeitliche Freisetzung von TGF-β1 aus VSNTGF und

VSMTGF Scaffolds untersucht.

Hierfür wurden Scaffolds gleicher Faserstärke (n=2) in ein Eppendorfröhrchen mit

1500 μl PBS überführt und bei 37 °C inkubiert. Nach 1 h, 2 h, 4 h, 12 h, 24 h, 36 h,

48 h, 72 h, 120 h und 168 h wurden nach vorsichtigem Schwenken 100 μl Proben

gewonnen und bei -20 °C gelagert.

Der Versuch wurde mit und ohne vorherige Aktivierung von latentem TGF-β1

ausgeführt. Die Proben der nanofibrösen Scaffolds wurden 1:2 mit PBS verdünnt, die


Proben der mikrofibrösen 1:4. Für die Aktivierung wurden je 100 μl Probe mit 20 μl

1 N HCl, vermischt und 10 min inkubiert. Durch Zugabe von 20 μl 1,2 N NaOH und

0,5 M HEPES wurde die Probe neutralisiert. Die Standardreihe wurde lt. Protokoll

hergestellt. In jedes Well der ELISA-Platte wurden 50 μl Assay-Verdünnung

vorgelegt. Anschließend wurden die Standardreihe und die Proben aufgetragen. Das

TGF-β1 hat während einer Inkubationszeit von 2 h an einen für TGF-β1 spezifischen

mAK gebunden, mit dem die Platte beschichtet war. Alle ungebundenen Bestandteile

wurden durch dreimaliges Abspülen der Platte mit Waschpuffer entfernt.

Anschließend wurden 100 μl TGF-β1 Konjugat (horseradish Peroxidase gebunden

an polyklonalen AK gegen TGF-β1) jedem Well hinzugefügt. Dieser AK konnte nun

an das, an den AK der Platte gebundene, TGF-β1 binden. Nach 2 h Inkubation

erfolgte eine erneute Waschung, wobei der überschüssige AK vollständig entfernt

wurde. Je Well wurden nun 100 μl Substratlösung (bestehend aus Farbreagenz I und

Farbreagenz II zu gleichen Teilen) hinzugegeben und 30 min unter Ausschluss von

Licht inkubiert. Hierbei hat sich das Farbreagent (Tetramethylbenzidin) an die

horsradish Peroxidase gebunden. Nach 30 min wurde der Vorgang gestoppt durch

Zugabe von 100 μl Stopplösung. Die Platte wurde nun an einem Plattenlesegerät

(Lucy 3, Anthos, Heerhugowaard, Netherlands) ausgelesen. Hierbei wurde optisch

der Farbumschlag gemessen und bezogen auf den Farbumschlag der Standardreihe

ausgewertet. Es wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

2.7.4 Zellversuch

Besiedlung der Scaffolds

Zur Besiedlung der unterschiedlichen Scaffolds wurden Zelllinien mit

nachgewiesenem Differenzierungspotential bis Passage 4-6 amplifiziert.

Ausschließlich VSP wurde 24 h in HBSS inkubiert. 1,35x105 Zellen wurden in 25 μl

chondrogenes Induktionsmedium (2.2.1), ohne Zusatz von Induktoren wie TGF-β1, je

Scaffold aufgenommen. Die Besiedlung fand in einer mit Poly(2-Hydroxyethyl)-

Methacrylat beschichteten 96-well-Platte statt. Über einen Zeitraum von 2 h wurde

alle 20 min 20 μl des o.g. Mediums hinzugegeben, um die Zellen vor Austrocknung

zu schützen, aber weiterhin einen möglichst direkten Kontakt zum Scaffold zu


gewährleisten. Anschließend wurden die Wells mit 150 μl Medium aufgefüllt. Nach 1-

2 Tagen erfolgte eine Umsiedlung der Scaffolds in eine 24-Well-Platte. Bei allen

Versuchen wurde mit den Scaffolds auch das Medium überführt. Auf diese Weise

sollte verhindert werden, dass die in den Scaffolds enthaltenen Induktoren

Hyaluronsäure und TGF-β1 sukzessive ausgewaschen werden.

Histologie

Besiedelte Scaffolds wurden nach 21 und 28 Tagen in vitro Kultur geerntet, in

Cryomolds überführt und querdiagonal in Tissue Tec eingebettet und bei -20 °C

eingefroren. Nach Aushärtung wurden die Scaffolds am Kryotom mit einer Dicke von

16 μm für Alzianblaufärbungen und 10 μm für Kollagen Typ II Färbungen

geschnitten. Die Schnitte wurden 24 h luftgetrocknet und anschließend über Nacht

bei 59 °C inkubiert um eine bessere Adhärenz am Objektträger zu gewährleisten.

Die Färbungen im Detail und deren Auswertung erfolgten wie in 2.5.3 und 2.5.4

beschrieben.

Genexpression

Für die Isolierung der RNA wurde das NucleoSpin®RNA II Kit von Machery-Nagel

(Düren, Germany) verwendet und lt. Protokoll durchgeführt (siehe auch 2.6.1).

Hierbei wurden je Erntezeitpunkt n=3 besiedelte Scaffolds verwendet.

Für die Messung der RNA-Konzentration je μl wurde ein Nanodrop

Spectrophotometer ND-1000 der Firma Peq Lab (Erlangen, Germany) verwendet.

2 μl Probe wurden auf die Messoberfläche pipettiert. Durch Herabführen eines

Hebels wurde die Probe zwischen den optischen Fasern des Spektralphotometers

aufgespannt. Durch die Oberflächenspannung des Tropfens entstand eine

Flüssigkeitssäule, die den Messweg für das Spektralphotometer darstellt. Die Daten

wurden im ND-1000 Data Viewer.vi von Thermo (Waltham USA) dargestellt. Die

Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm.

Reverse Transkription

Im Anschluss an die Messung erfolgte wie unter 2.6.2 beschrieben eine RT.


2.7.5 Realtime PCR

Im Gegensatz zur unter 2.6.3 beschriebenen PCR ist mittels Realtime PCR eine

semiquantitative Messung der PCR-Produkte möglich. Wie bei der PCR besteht auch

die Real-time PCR aus drei sich wiederholenden Schritten: Denaturierung, Annealing

und Elongation. Die Quantifizierung findet durch Messung von Fluoreszenz statt.

Hierfür wird eine TaqMan Sonde verwendet, die komplementär an die zu

amplifizierende DNA bindet. Durch ihre 3‘→5‘ Polymeraseaktivität und die 5‘→3‘

Exonukleaseaktivität wird während der Synthese des Gegenstranges das 5‘-Ende

der Sonde abgebaut. Am 5‘-Ende ist ein Reporter-Fluoreszensfarbstoff kovalent

gebunden, am 3‘-Ende ein Quencher-Farbstoff. Die Fluoreszenz des Quencher-

Farbstoffes unterdrückt die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes durch

strahlungsfreie Energieübertragung (Fluorescence Resonance Energy Transfer =

FRET). Durch den Abbau entfernen sich Reporter und Quencher voneinander. Die

Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes wird nicht mehr durch den Quencher

unterdrückt (siehe Abbildung 2.1).

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Prinzips der TaqMan-Sonde. R=Reporter, Q=Quencher, 3´=3´-Ende des Basenstranges, 5´=5´-Ende des Basenstranges.


Proportional mit der Menge des PCR-Produktes nimmt die Reporter-Fluoreszenz zu.

Die Zykluszahl, bei der die Reporter-Fluoreszenz erstmals über das Grundrauschen

ansteigt, nennt man Ct-Wert (Cycle Threshold). Trägt man die Kurve linear auf erhält

man eine sigmoidale Kurve mit einer exponentiellen Phase und einem Plateau. Da

zwischen dem Ct-Wert und dem Logarithmus der eingesetzten bekannten Menge

einer Standardverdünnungsreihe eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung

besteht, kann er zur Quantifizierung herangezogen werden. Durch Auftragen des

Logarithmus gegen den Ct-Wert kann eine Standardkurve konstruiert werden.

Abbildung 2.2. Standardkurve der Realtime PCR. Hier beispielhaft die Standardkurve des internen Standards Gapdh.

Um eine Vergleichbarkeit zwischen den Proben gewährleisten zu können, wurde die

Expression eines internen Standards gemessen (hier GAPDH). Die Darstellung der

Ergebnisse erfolgte durch Anwendung des Statistikprogrammes Sigma Plot 2000.

Bei der Wahl der Primer wurde die Internetplattform „National Center for

Biotechnology Information“ (NCBI, Bethesda, USA. http://www.ncbi.nlm.nih.gov),

sowie die Datenbank „Ensembl“ (http://www.ensembl.org/index.html) verwendet. Es

wurde darauf geachtet, dass die Primer mindestens um eine Intronsequenz

auseinander lagen, um kontaminierende genomische DNA von spezifischen


Amplifikaten unterscheiden zu können. Die Primer wurden von der Firma Tib MolBiol

(Tib MolBiol, Berlin, Germany) hergestellt.

Tabelle 2.3. Primer und Sonden zur Verwendung bei der Realtime PCR. Aufgelistet sind die für das Markergen spezifischen Primer mit den dazugehörigen Sequenzen, Annealingtemperaturen und Zyklenanzahl.

Gen →Forward Primer

←Reverse Primer

Annealing Temp. °C Zyklen

Collagen 1 →ACCgATggATTCCAgTTCgAgTA

←CTCCggTgTgACTCgTgC

59°C 50

Collagen 1 TM 6FAM-CTgACCTTCCTgCgCCTgATgT--BBQ

Collagen 2 →CgggTgAgAACggATCTCC

←gACCACgggCACCAgTg

59 50

Collagen 2 TM 6FAM-CCTggTgAAAgAggACggACTggC--BBQ

Gapdh →gAAggTgAAggTCggAgTC

←gAAgATggTgATgggATTTC

51 50

Gapdh TM 6FAM-CAAgCTTCCCgTTCTCAgCC--BBQ

Primeretablierung

Zu Beginn wurde eine PCR mit den wie oben beschrieben erstellten Primern

durchgeführt. Die PCR-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des

Peq Gold Gelextraktion Kit (PeqLab, Erlangen, Germany) eluiert. Mit Hilfe des Topo

TA Cloning Kits (Invitrogen, Paisley, UK) wurde die extrahierte DNA kloniert. Nach

Anzucht über Nacht auf einer Agarplatte mit Lb-Medium (Invitrogen, Paisley, UK)


wurden 5 Kolonien gepickt und erneut über Nacht in 4 ml flüssigem Lb-Medium

inkubiert. 2 ml des Mediums wurden für eine Plasmidpreparation verwendet, 2 ml

wurden zentrifugiert. Das Pellet wurde in 300 μl Glycerin gemischt mit 600 μl Lb-

Medium aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Für die Plasmidpreparation wurde

das Nucleo Spin Plasmid Miniprep Kit von Machery Nagel (Düren, Germany)

verwendet. Anschließend erfolgte eine Testrestriktion mit Eco RI (Roche, Grenzach-

Wyhlen, Germany). 2 μl Plasmid RNA wurden mit 1 μl Enzym und 2 μl Puffer H mit

DEPC-H2O auf 20 μl aufgefüllt. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C wurde

für eine Erfolgskontrolle ein Gel laufen gelassen (siehe 0). Der Rest der Plasmid

RNA wurde für die Standardreihe der Realtime PCR verwendet.

Durchführung der Realtime PCR

Auf einer 96-well-Platte wurden je well 10 μl Maxima Mastermix, bestehend aus

0,4 μl Primer forward, 0,4 μl Primer reverse, 0,4 μl TaqMan-Sonde und 3,8 μl DEPC-

H2O, zu 5 μl Probe hinzupipettiert (die Probe wurde zuvor 1:5 mit DEPC-H2O

verdünnt). Für die Standardverdünnungsreihe wurden sieben Konzentrationen von

0,2 ng/μl in 10er Potenzen absteigend bis 0,2 fg/μl verwendet. Anschließend wurde

die Platte verschlossen und in den iCycler gestellt. Das Programm des iCyclers

begann mit einer zweiminütigen Initialisierung bei 95 °C. Es folgten 40 Sek.

Denaturierung bei 95 °C, 40 sek. Annealing bei 55-65 °C (siehe Tabelle 2.3), 40 Sek.

Elongation bei 72 °C und einer Termination für eine Minute bei 95 °C. Es wurden 50

Zyklen durchgeführt.

2.7.6 DNA-Quantifizierung

Um das Zellwachstum auf den Scaffolds zu quantifizieren wurde eine Analyse der

cDNA-Konzentration vorgenommen. Nach 1-3, 21 und 28 Tagen wurde hierfür

jeweils eines der unterschiedlichen Scaffolds in ein Eppendorfröhrchen überführt und

bei -20 °C eingefroren. Die DNA wurde mit Hilfe des NuceolSpin®Tissue Kits von

Macherey-Nagel (Düren, Germany) aufgereinigt. Die Messung der DNA-

Konzentration wurde mittels Quant-iT™PicoGreen®dsDNA Kits (Invitrogen, Paisley,

UK) durchgeführt, bei dem die die doppelsträngige DNA mittels eines

Fluoreszenzfarbstoffes angefärbt wird.


Zur Aufreinigung der DNA wurde je ein Scaffold in 200 μl T1-Puffer aufgenommen

und mit 25 μl Proteinase K und 200 μl B3-Puffer vermischt. Die Probe wurde 10-

15 min bei 70 °C inkubiert (da der Schmelzpunkt der Scaffolds bei 60 °C liegt haben

sich diese zu einem großen Teil aufgelöst). Dann wurden 180 μl T1-Puffer und 25 μl

Proteinase K hinzugegeben und 1 h bei 56 °C inkubiert und mechanisch lysiert. Um

Messfehler durch vorhandene RNA auszuschließen, wurden die Proben 5 min bei

RTemp mit 20 μl RNase A (20mg/ml) inkubiert. Nach gründlicher Durchmischung der

Proben wurde 200 μl B3-Puffer hinzugegeben und 10 min bei 70 °C inkubiert. Um die

DNA-Bindung an die Siliziummembran vorzubereiten, wurden 210 μl hinzugegeben

und gut durchmischt. Die Proben wurden in die NucleoSpin®Tissue Röhrchen

überführt und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Hierbei bindet die DNA an die

Siliziumfilter im Röhrchen, welche durch Zugabe von 500 μl und 600 μl BW-Puffer

gewaschen und jeweils für 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert wurde. Die aufgereinigte

DNA wurde nun in Eppendorfröhrchen überführt, mit 100 μl BE-Puffer 1 min inkubiert

und für 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben bei

-20 °C eingefroren und aufbewahrt.

Zur Messung der DNA-Konzentration wurde eine 200fache Verdünnung der DMSO-

Lösung in 1xTE hergestellt. Die Arbeitslösung wurde unter Ausschluss von Licht

gelagert, um einen photooxidativen Abbau zu verhindern. Um eine Standardkurve zu

erstellen, wurde eine Stammlösung von 2 μg/ml doppelsträngiger DNA in 1xTE-

Puffer hergestellt, indem der lambda-DNA-Standard (100μg/ml) 50fach verdünnt

wurde. Eine Standardkurve mit Konzentrationen von 1 ng/ml bis 1 μg/ml wurde

erstellt. Die Proben wurden mit TE-Puffer auf 1 ml aufgefüllt. 1 ml der Arbeitslösung

des Quant-iT™Pico GreenReagenz wurden jeder Probe hinzugefügt. Nach einer

Inkubation von 2-5 min unter Ausschluss von Licht wurde die Fluoreszenzemission

an einem Plattenlesegerät (BertholdTech Mithras, Bad Wildbad, Germany)

gemessen. Für die Auswertung wurde der Leerwertes der Standardkurve von den

Proben subtrahiert und die Proben wurden bezogen auf die Standardkurve

ausgewertet.

3.1 Mesenchymale Stammzellen 45

2.7.7 Statistische Auswertung

Statistischen Auswertungen erfolgten per JMP statistical software (JMP, Cary NC,

USA) anhand 1-factor ANOVA, 2-factor-ANOVA und Students-t-test. Signifikanz

wurde bei p<0,05 definiert.

3 Ergebnisse

3.1 Mesenchymale Stammzellen

3.1.1 Morphologie und Zellkultur

Eine Isolierung von Zellen aus humanem Knochenmark war in 15 von 16 Proben

erfolgreich. Nach Isolierung konnten plastikadhärente Zellen mit einer

spindelförmigen fibroblastoiden Morphologie nachgewiesen werden. Zu Anfang der

2D in vitro Kultur bildeten sich Kolonien um einzelne Zellen, welche später

konfluierten. Dabei hing die Proliferationsgeschwindigkeit von der initialen

Besiedlungsdichte ab: je mehr Zellen adhärent waren, umso schneller proliferierten

sie. Wurden sie im Verlauf zu dünn ausgesiedelt, verlangsamte sich die Proliferation

deutlich. Von o.g. 15 Isolaten wurden für die Differenzierungsversuche und die

anschließenden Scaffoldversuche vier Proben zufällig ausgewählt.

Abbildung 3.1: Kulturverlauf primärer Zellen aus humanem Knochenmark. A: 14 Tage nach der Isolation. B: 24 Tage nach der ersten Passage.

Präsentation spezifischer Oberflächenmarker

Die Untersuchung auf spezifische Oberflächenmarker wurde durchgeführt, um

festzustellen ob es sich bei den isolierten Zellen um Vorläuferzellen der

46 3 Ergebnisse

mesenchymalen Zelllinie handelte und nicht um andere ebenfalls im Knochenmark

vorkommende Zellen, wie z.B. hämatopoetische Vorläuferzellen. Es konnte auf diese

Weise die Homogenität der vorhandenen Zelllinie dargestellt werden.

Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchung wurden in einem Dot

Plot dargestellt.

Abbildung 3.2: Exemplarische Darstellung eines Dot Plots der Isotypkontrolle FITC. R1 und R4 einfachpositiver, R2 doppeltpositiver und R3 doppeltnegativer Sektor. Jeder Punkt entspricht einer gemessenen Zelle.

Für die Veranschaulichung der Fluoreszenzsignale wurde eine logarithmische

Darstellung gewählt. Die Fluoreszenzsignale der einzelnen Marker wurden auf die in

der Negativkontrolle gemessene Eigenfluoreszenz der Zellen bezogen.

Tabelle 3.1: exemplarische Darstellung einer FACS-Analyse.

Isotypkontrolle FITC

Isotypkontrolle PE


CD13, 97.2 %

CD29, 97,1%

CD34, 6,1%

CD44, 96,9%

CD49d, 55,0%

CD54, 81,3%

CD73, 96,2%

CD90, 98,5%

CD106, 63,1%

CD133, 1,6%

CD140b, 88,5%

CD166, 92,9%

CD271, 2,0%

CD45, 0,3%

Die isolierten und im Monolayer kultivierten Zellen zeigten in der FACS-Analyse ein

überwiegend einheitliches Muster an Oberflächenmarkern. Hämatopoetische

Oberflächenmarkern wie CD34 (0,2-6%) und CD45 (0,0-2,8%) zeigten sich kaum.

Die Expression von mesenchymalen Oberflächenmarkern wie CD44 (83,1-96,6%)

und CD90 (83,5-98,5%) war hingegen deutlich. Ebenfalls nachweisbar waren die

Oberflächenmarker CD13 (83,5-97,2%), CD29 (77,8-97,1%), CD73 (79,5-96,2%) und

CD166 (58,6-93,6%). Nur eine geringe Expression wiesen CD133 (0,5-2,6%) und

CD271 (0,0-3,4%) auf. Uneinheitlich war die Expression von CD49d (11,9-63,3%),

CD54 (51,2-82,6%), CD106 (5,8-62,1%) und CD140b (43,1-88,5%).

48 3 Ergebnisse

3.2 Differenzierung primärer Zellen

3.2.1 Histologischer Nachweis der Differenzierungsfähigkeit

Da die Präsentation von spezifischen Oberflächenmarkern nicht ausreicht, um eine

Zelle sicher als Vorläuferzelle der mesenchymalen Zelllinie zu identifizieren, ist der

Nachweis der Pluripotenz nötig. Mit Hilfe von Differenzierungsversuchen unter

Verwendung unterschiedlicher Induktionsmedien wurden die Vorläuferzellen in die

adipogene, chondrogene und osteogene Zelllinie ausdifferenziert. Insgesamt wurden

n=4 Isolationen vollständig in alle drei Zelllinien differenziert.

Adipogene Differenzierung

Im adipogenen Induktionsmedium konnte eine rasche Konfluenz der flächig

wachsenden Zellen beobachtet werden.

Nach 14 Tagen konnten vereinzelt Sudan III positive Zellen dargestellt werden. Nach

21 Tagen stieg die Anzahl der Sudan III positiven Zellen und vereinzelt konnten

Sudan III positive Zellaggregate gefunden werden.

Abbildung 3.3: Sudan III Färbung primärer Zellen im adipogenen Differenzierungsversuch. (A) uninduziert, (B) nach 14 Tagen und (C) nach 21 Tagen.

Osteogene Differenzierung

Im osteogenen Induktionsmedium fand sich ebenfalls eine rasche Konfluenz der

Zellen, die eine große morphologische Variabilität aufwiesen. Im Gegensatz zu

3.2 Differenzierung primärer Zellen 49

uninduzierten Zellen fand sich eine zunehmende Expression der alkalischen

Phosphatase im Induktionsmedium mit zunehmender Kultivierungsdauer.

Abbildung 3.4: Färbung der alkalische Phosphatase primärer Zellen im osteogenen Differenzierungsversuch. (A) uninduziert, (B) nach 14 Tagen und (C) nach 21 Tagen.

Chondrogene Differenzierung

Mit Hilfe der Alzianblaufärbung konnte für Chondrozyten typische saure sulfatreiche

Proteoglycanmatrix in den MMBs nachgewiesen werden. Dabei fand sich kein

Unterschied zwischen oberflächlichen oder tiefer liegenden Zellen. In der

Negativkontrolle hingegen waren nur wenige hellblau gefärbte Areale zu sehen.

(siehe Abbildung 3.5). Die Zellenmorphologie änderte sich von einer anfänglich

länglichen zu einer sphärischen im Verlauf der 3D Kultur. Nach außen waren die

MMBs abgegrenzt durch flache, dicht beieinander liegende, deutlich blau angefärbte

Zellen, die eine Art Hülle zu bilden schienen.

Abbildung 3.5: Alzianblaufärbung eines MMB. Uninduziert nach 3 Tagen (A), induziert nach 21 Tagen (B) und 28 Tagen (C)

50 3 Ergebnisse

Mittels Anti-Kollagen Typ II Immunhistochemie konnte nach 21-tägiger chondrogener

Induktion eine zarte Expression von Kollagen Typ II ausschließlich in den

Randbereichen nachgewiesen werden, nach 28 Tagen Induktion fast im gesamten

Volumen der MMBs (siehe Abbildung 3.6 A, B, C).

Abbildung 3.6: Anti-Kollagen Typ II Immunhistochemie (FITC Gegenfärbung = grün; Kernfärbung durch DAPI = blau). Uninduziert (A), sowie induziert nach (B) 21 Tagen und (C) 28 Tagen.

3.2.2 Genexpression

Um das Differenzierungspotential auf Genexpressionsebene darstellen zu können,

wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.

Nachweis der adipogenen Differenzierung

Die adipogene Differenzierung der MSCs resultierte in der Expression spezifischer

adipogener Gene (PPARγ und AP2/FABP). In allen Isolationen konnte im Verlauf der

adipogenen Monolayer-Differenzierung ein Anstieg der Expression beider Gene

relativ zu Gapdh festgestellt werden. Einzig bei PPARγ fiel die Konzentration nach

initialem Anstieg in zwei Isolationen leicht wieder ab.

3.2 Differenzierung primärer Zellen 51

Abbildung 3.7: Durchschnittliche Genexpression im Verlauf der adipogenen Differenzierung (n=4).

Nachweis der osteogenen Differenzierung

Für den Nachweis der osteogenen Differenzierung im Monolayer wurde die

Expression der charakteristischen Markergene Alkalische Phosphatase, Osteopontin,

RunX, Osterix und Osteocalcin gemessen (siehe Abbildung 3.8). Durchschnittlich

stiegen die Marker Alkalische Phosphatase, RunX und Osterix mit zunehmender

Dauer der osteogenen Induktion relativ zu Gapdh an, Osteopontin und Osteocalcin

fielen hingegen nach initialem Anstieg wieder ab. Nach 21 Tagen osteogener

Induktion fand sich die höchste relative Genexpression für Alkalische Phosphatase,

die niedrigste für Osteocalcin relativ zu Gapdh.

52 3 Ergebnisse

Abbildung 3.8: Durchschnittliche Genexpression im Verlauf der osteogenen Differenzierung (n=4)

Nachweis der chondrogenen Differenzierung

Zum Nachweis einer chondrogenen Differenzierung im dreidimensionalen System

wurde die Expression knorpeltypischer Markergene wie Aggrecan und Kollagen

Typ II untersucht (siehe Abbildung 3.9). In allen Proben konnte ein deutlicher Anstieg

der relativen Genexpression von Kollagen Typ II und Aggrecan mit zunehmender

Dauer der chondrogenenInduktion festgestellt werden.


Abbildung 3.9: Durchschnittliche Genexpression im Verlauf chondrogener Differenzierung (n=4).


3.3.1 Rasterelektronenmikroskopie

Es konnten erfolgreich rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen nanofibröser

sowie mikrofibröser Scaffolds angefertigt werden.

54 3 Ergebnisse

Abbildung 3.10: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen. (A) nanofibröses und (B) mikrofibröses Scaffold.

Rasterelektronenmikroskopisch fand sich sowohl in nano- als auch mikrofibrösen

Scaffolds eine zufällige Anordnung der Fasern, wobei die Faserdicke, die

Faserdurchmesserkonstanz und die sich daraus ergebenden Porengröße in sich

variierten. So konnten in nanofibrösen Scaffolds z.T. mikrofibröse Fasern

nachgewiesen werden und ebenso in mikrofibrösen Scaffolds z.T. nanofibröse

Fasern.

3.3.2 Migrationspotential

Weder für VSN oder VSM, noch deren Augmentations Design mit HA oder TGF-β1

konnte eine chemotaktische Wirkung auf die MSCs im in vitro Migrationsassay

nachgewiesen werden. In der Positivkontrolle hingegen kam es zu einer deutlichen

Migration: nach 24 h migrierten im Mittel 3099 Zellen und nach 48 h 3313 Zellen

durch die Membran. In der Negativkontrolle kam es zu keiner Migration.


Abbildung 3.11: Migrationsassay der unterschiedlichen Scaffoldtypen

3.3.3 Release von TGF-β 1

Aus TGF-β1 haltigen Scaffolds (VSNTGF und VSMTGF) konnte unabhängig von

Faserstärken ein Release von TGF-β1 über den gemessenen Zeitraum von 168 h

nachgewiesen werden. Eine Veränderung der gemessenen TGF-β1-Konzentration,

durch eine Aktivierung von latentem TGF-β1, konnte nicht festgestellt werden.

Obwohl beide Scaffolddesigns mit der gleichen Menge an TGF-β1 geladen wurden,

fand sich grundsätzliche eine höhere TGF-β1 Abgabe auf mikrofibrösen Scaffolds,

wobei nach einem initialen Anstieg innerhalb der ersten 4-12 h ein deutlicher Abfall

nach etwa 48-72 h gemessen wurde. Die Abgabe aus VSNTGF fiel hingegen rasch

innerhalb der ersten 10 h und verbleibt auf einem niedrigen Niveau bis zum

Endpunkt der Messung.

56 3 Ergebnisse

Abbildung 3.12: Release von TGF-β1 über einen Zeitraum von 168 in einer 1:2 Verdünnung nanofibröser Scaffolds, sowie einer 1:4 Verdünnung mikrofibröser Scaffolds gemessen mittels ELISA (durchschnittliche Werte in pg/ml inkl. Standardfehler).

3.3.4 Histologie

Entsprechend der rasterelektronenmikroskopischen Bilder stellten sich die

unterschiedlichen Faserstärken der nano- und mikrofibrösen Scaffolds auch

lichtmikroskopisch dar. Die unterschiedlichen Augmentationen wirkten sich nicht auf

das morphologische Erscheinungsbild aus. Die randständige Kompaktierung der

nanofibrösen Scaffolds sowie die zentrale Zerreißung muss als Artefakt der

Schneidetechnik gewertet werden. Grundsätzlich lagen die Zellen oberflächlich und

bildeten einen Zellrasen. Im Zentrum der Scaffolds konnten nur wenige Zellen

gefunden werden.

Vereinzelt fanden sich Alzian-Blau positive Zellen in VSNTGF (siehe Abbildung 3.13

A+B). Ein immunhistochemischer Nachweis von Kollagen Typ II positiven Zellen

gelang hingegen in keinem Scaffolddesign.


Abbildung 3.13: Alzianblaufärbung (A+B) nanofibröser Scaffolds mit TGF-β Augmentation, sowie immunhistochemische Kollagen Typ II Färbung eines (C) mikrofibrösen und (D) nanofibrösen Scaffolds, jeweils mit TGF-β1 Augmentation nach 21 Tagen (A, C, D) und 28 Tagen (B)

3.3.5 DNA-Quantifizierung

Scaffolds augmentiert mit HA (VSNHA und VSMHA) konnten im Vergleich zu den

anderen Scaffolddesigns und unabhängig von Faserstärke eine höhere initiale

Effizienz der Besiedlung demonstrieren. Dies war signifikant in der Gruppe

nanofibröser Scaffolds (p<0,05). Die Augmentation mit TGF-β1 (VSNTGF und

VSMTGF) hatte hingegen keinen signifikanten proliferativen Effekt auf die MSCs. Die

niedrigsten cDNA Werte fanden sich für Scaffolds, die kontinuierlich eine TGF-β1-

Supplementierung durch das Medium erhielten.

58 3 Ergebnisse

Abbildung 3.14: Durchschnittliche cDNA-Konzentration in ng/ml auf (A) nanofibrösen Scaffolds und (B) auf mikrofibrösen Scaffolds im Verlauf über insgesamt 28 Tage in vitro Kultur.

3.3.6 Realtime PCR

Kollagen Typ I Expression

Mittels Realtime PCR wurde semiquantitativ die Konzentration von Gapdh -als

interner Standard- sowie die Konzentration von Kollagen Typ I und Kollagen Typ II

gemessen. Die Ergebnisse der Kollagen Primer wurden auf den internen Standard

bezogen. Gapdh konnte in 57 von 58 Proben erfolgreich gemessen werden.

In allen Scaffolddesigns konnte die Expressoin von Kollagen Typ I mittels rtPCR

nachgewiesen werden. Diese Beobachtung war unabhängig von Scaffolddesign oder

verwendetem Medium (VSP). Die höchsten Werte konnten, wenn auch nicht

statistisch signifikant, in TGF-β1 haltigen Scaffolds nachgewiesen werden (VSNTGF

und VSMTGF). Während die Konzentration auf den mit TGF-β1 und/oder HA

augmentierten Scaffolds nach 21 Tagen wieder abzufallen schien, fand sich in

Scaffolds mit Induktionsmedium (VSP) eine Plateauphase nach initialem Anstieg.


Abbildung 3.15: Durchschnittliche Kollagen Typ I Expression auf (A) nanofibrösen und (B) mikrofibrösen Scaffolds nach 1, 21 und 28 Tagen in vitro Kultur.

Kollagen Typ II Expression

Die höchste Kollagen Typ II Expression konnten in Scaffolds festgestellt werden die

kontinuierlich mit chondrogenem Induktionsmedium supplementiert wurden (VSP).

Diese Beobachtung war im Vergleich zu den anderen Scaffolddesigns signifikant

(p <0,05). Trotzdem fand sich auch in den übrigen Scaffolddesigns ein Anstieg der

Kollagen Typ II Expression zumindest bis Tag 21 der in vitro Kultur. Dabei schienen

TGF-β1 haltige Scaffolds unabhängig von der Faserstärke eine höhere Expression

zu ermöglichen als Scaffolds mit und ohne HA (p>0,05).

60 3 Ergebnisse

Abbildung 3.16: Durchschnittliche Kollagen Typ II Expression auf (A) nanofibrösen Scaffolds, (B) mikrofibrösen Scaffolds nach 1, 21 und 28 Tagen in vitro Kultur.

3.3.7 PCR

Zusätzlich zur Bestimmung von Kollagen Typ I und II mittels rtPCR wurde die

Expression von Markern der osteogenen (Alkalische Phosphatase, Osteocalcin und

Osteopontin) sowie chondrogenen (Aggrecan) Differenzierung relativ zu Gapdh

mittels PCR bestimmt.

Osteogene Marker

Die Expression des Markes Osteopontin sank relativ zu Gapdh signifikant nach 21

Tagen in vitro Kultur unabhängig von Scaffoldtyp, Augmentation oder kontinuierlicher

Supplementierung mit chondrogenen Induktoren. Wenn auch nicht signifikant, fand

sich für alle Scaffolddesigns tendenziell ein Anstieg der Marker Alkalische

Phosphatase und Osteopontin. Die Bande der osteogenen Marker in diesen

Versuchen war jedoch deutlich schwächer als die der Versuche mit osteogenem

Induktionsmedium (siehe Abbildung 3.17).


Abbildung 3.17: Durchschnittliche Genexpression osteogener im Verlauf der Differenzierung von Zellen auf (A) nanofibrösen Scaffolds (VSN, VSNHA, VSNTGF), (B) mikrofibrösen Scaffolds (VSM, VSMHA, VSMTGF) und (C) VSP

chondrogene Marker

Für Scaffolds mit kontinuierlicher Supplementierung chondrogener Induktoren per

Medium (VSP) fand sich eine konstant hohe relative Expression von Aggrecan relativ

zu Gapdh. Im Gegensatz hierzu stieg die relative Expression von Aggrecan in allen

nanofibrösen Scaffolds (VSN, VSNHA, VSNTGF) nach 28 Tagen an. Die relative

Expression von Aggrecan in mikrofibrösen Scaffolds (VSM, VSMHA, VSMTGF)

zeigte einen umgekehrten Verlauf, nach einem initialen Anstieg fielen die Werte nach

28 Tagen (siehe Abbildung 3.18).

62 3 Ergebnisse

Abbildung 3.18: Durchschnittliche Genexpression von Aggrecan auf (A) nanofibrösen und (B) mikrofibrösen Scaffolds


4 Diskussion

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines biokompatiblen, bioaktiven und

biomimetischen Scaffolds, das im Anschluss an eine Mikrofrakturierung zur

Defektabdeckung verwendet werden soll. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der

Scaffolds in vitro auf die mesenchymalen Stammzellen untersucht. Besonderes

Augenmerk wurde hierbei auf das Migrationspotential, die Zelladhärenz und –

proliferation, die Abgabe von TGF-β1 durch das Scaffold, sowie die chondrogene

Differenzierung der MSCs gelegt.

4.1 Mesenchymale Stammzellen

Die Isolierung von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark ist mittels vieler

verschiedener Methoden möglich und die meisten hiervon sind erfolgreich

(HEGEWALD et al. 2004; KASSEM 2004; WAGNER u. HO 2007). Hierbei finden

sowohl simple, als auch aufwändige Verfahren Verwendung. In der vorliegenden

Arbeit wurde eines der simpleren Verfahren angewendet. Es konnten erfolgreich aus

15 von 16 Proben MSCs isoliert werden, mit einem durchschnittlichen Alter der

humanen Spender von 72,87 Jahren. Von diesen 15 isolierten Proben wurden vier

Proben zufällig ausgewählt, erfolgreich differenziert und klassifiziert und

anschließend zur Besiedlung der Scaffolds verwendet. Studien haben gezeigt, dass

die Anzahl der MSCs im Knochenmark bei steigendem Alter des Patienten

exponentiell abnimmt (CAPLAN 1994), ebenso wie die Selbsterneuerungs- und

Proliferationskapazität (QUARTO et al. 1995; D'IPPOLITO et al. 1999;

INDRAWATTANA et al. 2004). Ungeachtet dessen konnten trotz eines hohen

Durchschnittsalters der humanen Knochenmarkspender MSCs isoliert, amplifizert

und differenziert werden. In vivo konnte gezeigt werden, dass die Erfolge von

knochenmarkstimulierenden Techniken bei jüngeren Patienten (human) größer sind

als bei älteren (STEADMAN et al. 2003; KNUTSEN et al. 2004; KREUZ et al. 2006).

Zum Zeitpunkt dieser Arbeit lagen noch keine Studien bezüglich der MSCs

Konzentration im Knochenmark in Abhängigkeit zum Alter des Spenders/Patienten

beim Tier vor.

64 4 Diskussion


Zur Herstellung nano- und mikrofibröser Scaffolds verwendeten wir in dieser Arbeit

PCL, ein synthetisches Polymer, welches gute Verarbeitungseigenschaften aufweist

und gleichzeitig biokompatibel und biodegradierbar ist. Letztere Eigenschaften

wurden sowohl für Menschen als auch im Tiermodell bewiesen (CAO et al. 2003;

SHAO et al. 2006; LI et al. 2009). Auch wenn synthetische Polymere wie PCL per se

keine intrinsische Bioaktivität zeigen, wirken sich die biomechanischen

Eigenschaften im Vergleich zu natürlichen aber auch anderen synthetischen

Polymeren positiv aus (CAO et al. 2003; LI et al. 2006a). Idealerweise sollte die

Degradierungskinetik eines Kunstimplantates mit der sukzessiven Regeneration

eines chondralen Defektes synchron ablaufen. Daher sollte das anvisierte Material

eine langsame Zersetzungskinetik besitzen, um einem frühen Verlust der

strukturellen Integrität durch körpereigene Abbaukräfte entgegen zu wirken; dies ist

insbesondere für Scaffolds mit großer Angriffsfläche wie z.B. nanofibröse Konstrukte

relevant. PCL ist somit ein geeigneter Kandidat, da es im Gegensatz zu PGA,

PLGA5050, PLGA8515 und PDLLA einen langsamen Polymerabbau aufweist

(ZONG et al. 2003; LI et al. 2006a). So konnte gezeigt werden, dass Scaffolds aus

PCL in der Lage sind, die charakteristischen mechanischen Eigenschaften über bis

zu sechs Monate beizubehalten, bis die vollständige Metabolisierung nach etwa zwei

Jahren abgeschlossen ist (HUTMACHER et al. 2001; SHAO et al. 2006). Scaffolds

aus PLA und PLGA schrumpften hingegen innerhalb der ersten Wochen aufgrund

eines frühen Polymerabbaus (LI et al. 2003; ZONG et al. 2003). Zudem ist die

langsame Abbaugeschwindigkeit des PCL für Wachstum und Rekonstruktion von

Knorpelgewebe geeignet, da es die Mechanoinduktion von Zellen zu einem

entsprechenden Phänotyp zulässt (CAO et al. 2003) und mehr mechanische und

strukturelle Stabilität für Zellwachstum gewährleistet (LI et al. 2003; SHAO et al.

2006).

Zur Herstellung der fibrösen Scaffolds wurde die Technik des Elektrospinnings

angewendet, wobei durch Modifikation der Flussrate und Spannung Fasern mit

Durchmessern im Mikro- und Nanometerbereich erzeugt werden konnten. Auf die

4.3 Einfluss der Faserstärke 65

Anordnung der Fasern und Porengröße konnte kein Einfluss genommen werden, sie

war zufällig. So fanden sich Mikrofasern in nanofibrösen Scaffolds und Nanofasern in

mikrofibrösen Scaffolds.

4.3 Einfluss der Faserstärke

In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt von Scaffolds unterschiedlicher

Faserstärke auf das Differenzierungspotential von MSCs untersucht. Grundlage

hierfür sind Studien, die belegen, dass Biomaterialien, die eine Oberflächenstruktur

im Nanometerbereich haben, biologisch bevorzugt werden (WEBSTER et al. 2000;

WEBSTER et al. 2001; LI et al. 2006b). Dabei spielen die Oberfläche, deren

Rauigkeit und Struktur, das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen sowie die

Steifigkeit bzw. Elastizität des Scaffolds eine wesentliche Rolle (ZHANG L u.

WEBSTER TJ 2009). So zeigten unsere Versuche, dass die relative Expression von

Aggrecan offensichtlich nicht signifikant durch die An- oder Abwesenheit von

Wachstumsfaktoren (TGF-β1) oder Molekülen der hyalinen Matrix (Hyaluronsäure)

beeinflusst wurde, sondern dass sie vielmehr der ultrastrukturellen Beschaffenheit

der Scaffolds unterlag: Nanofasern begünstigten die Expression von Aggrecan mit

zunehmender Dauer der Kultur, wohingegen Mikrofasern eher einen gegenteiligen

Effekt hatten. Zudem begünstigten Nanofasern im Vergleich zu Mikrofasern auch die

Expression von Kollagen Typ II, auch wenn TGF-β1 sicherlich der entscheidende

Effekt zukommt. Demnach kann festgestellt werden, dass nanofibröse PCL Scaffolds

biomimetisch im Kontext der Knorpelhomöostase sind. Dies schlussfolgerten u.a.

auch die Arbeitsgruppen um LI et al. (2005a; 2006b) und HUTMACHER et al. (2001).

Diese Feststellung wird aber auch durch die Beobachtung untermauert, dass MSCs

in nanofibrösen PCL Scaffolds eine niedrigere Proliferationsrate aufwiesen als in

mikrofibrösen Scaffolds, was insofern relevant ist, als dass eine mitotische Aktivität

chondrogener Zelllinien immer dann beobachtet werden kann, wenn Abweichungen

von der strukturellen Integrität der genuinen hyalinen Matrix zu finden sind, oder aber

Reparationsvorgänge stattfinden (LI et al. 2006b). Die nanofibrösen Scaffolds

66 4 Diskussion

signalisierten den MSCs also offenbar ein intaktes chondrogenes und somit

biomimetisches Milieu.

4.4 Einfluss der Wachstumsfaktoren

4.4.1 Einfluss von TGF-β1

Da synthetische Polymere per se keine intrinsische Bioaktivität besitzen,

kombinierten wir die nano- und mikrofibrösen PCL Scaffolds u.a. mit TGF-β1, einem

potenten, intrinsisch chondrogenen Faktor (PEDROZO et al. 1998; DEFAIL et al.

2006). Diverse Arbeiten konnten eine TGF-β1 induzierte chondrogene

Differenzierung von MSCs belegen (HAYES et al. 2001; HUANG et al. 2002;

INDRAWATTANA et al. 2004; KISIDAY et al. 2010), wobei dieser Vorgang sowohl

dosis- als auch zeitabhängig zu sein scheint (BOSNAKOVSKI et al. 2006). Die

Ergebnisse unserer Arbeit deuten ebenfalls einen Zusammenhang zwischen

zeitabhängiger TGF-β1 Substitution und der Expression von Kollagen Typ II an. Eine

initiale Freisetzung von TGF-β1 aus den Scaffolds begünstigte dabei durchaus schon

eine Induktion entlang der chondrogenen Zelllinie, war jedoch insuffizient über einen

Zeitraum länger als 21 Tage. LI et al. (2005b) konnten sogar zeigen, dass MSCs auf

PCL Scaffolds mit kontinuierlicher TGF-β1 Supplementation per Medium nicht nur

Kollagen Typ II exprimierten, sondern auch eine zonale Morphologie entwickeln. Es

konnte eine superfiziale Zone mit flachen Zellen, eine mittlere Zone mit runden Zellen

und eine tiefe Zone mit kleinen flachen Zellen, ähnlich dem Aufbau hyalinen

Knorpels, beobachtet werden. Interessanterweise hatte die Freisetzung von TGF-β1

aus den Scaffolds keinen Einfluss auf die Expression von Aggrecan, diese unterlag

eher der strukturellen Beschaffenheit der unterschiedlichen Konstrukte. Wir konnten

auch keinen chemotaktischen Effekt von TGF-β1 nachweisen, auch wenn für TGF-β1

eine solche Wirkung auf MSCs beschrieben worden ist (CENTRELLA et al. 1994;

HUNZIKER u. ROSENBERG 1996; RIPAMONTI et al. 1997). Der zugrunde liegende

Mechanismus basiert auf einer hoch-affinen Interaktion mit einem heteromeren

Rezeptorkomplex, der zwei strukturell abhängige Serinethreonin Kinasen umfasst.

4.4 Einfluss der Wachstumsfaktoren 67

Hierbei werden die Signale mittels Smad-Signalweg transduziert, was zu einer

Aktivierung der sox9 Transkription führt (ATTISANO u. WRANA 2002;

HATAKEYAMA et al. 2003). Eine andere Studie hingegen zeigte, dass TGF-β1

alleine keine Migration bewirken kann, sondern nur in Kombination mit anderen

Additiven wie z.B. konditioniertem Serum (ZHANG et al. 2009). Der Mechanismus

der TGF-β1-vermittelten Rekrutierung von MSCs wird kontrovers diskutiert, sicher

scheint jedoch eine dosisabhängige Wirkung. Wird eine hohe TGF-β1 Dosis von 200

ng/ml appliziert, kann dies zwar eine Chemotaxis induzieren, aber auch eine

Aktivierung von Entzündungszellen bewirken, die wiederum in einer Fibrose und

Osteophytenbildung resultiert (VAN BEUNINGEN et al. 1994; VAN BEUNINGEN et

al. 1998; CAI et al. 2007). Wurden aber Microspheres mit einer solch hohen Dosis an

TGF-β1 beladen, anstelle der üblichen Dosis von 20 ng/ml, konnte keine

Osteophytenbildung beobachtet werden, da TGF-β1 sukzessive in konstant geringen

Mengen abgegeben wurde (HOLLAND et al. 2003). Die ideale Konzentration an

TGF-β1 und deren Freisetzungskinetik bleibt letztendlich ungeklärt. Konsens besteht

hingegen, dass TGF-β1 keinen proliferativen Effekt auf die MSCs hat (MACKAY et

al. 1998; BARRY et al. 2001; LI et al. 2005b). Auch unsere Ergebnisse bestätigen,

dass die Zellzahl unter Einfluss von TGF-β1 konstant bis leicht abfallend ist.

4.4.2 Einfluss von HA

Hyaluronsäure ist eines der wichtigsten GAGs und verantwortlich für die

Matrixhomöostase hyalinen Knorpels. Hyaluronsäure interagiert mittels

transmembraner Rezeptoren mit Zellen und steuert auf diese Weise

Zelldifferenzierung, -metabolismus und matrixsynthese (SCHAGEMANN et al. 2008).

Daher war Hyaluronsäure ein potentieller Kandidat, um die begrenzten biologischen

Eigenschaften synthetischer PCL Scaffolds zu optimieren. Auch wenn in unserer

Studie Hyaluronsäure weder auf mikrofibrösen noch auf nanofibrösen Scaffolds

einen signifikanten chondrogenen Effekt hatte, wirkte sich die Freisetzung doch

positiv auf die initiale Besiedlungsdichte aus. Zudem hatte Hyaluronsäure im

Gegensatz zu TGF-β1 einen tendenziell hemmenden Effekt auf die Expression von

Kollagen Typ I, also einen indirekt chondrogenen Effekt. Überdies konnten KUJAWA

et al. (1986) zeigen, dass Hyaluronsäure in der Lage ist, eine chondrogene

68 4 Diskussion

Differenzierung mesenchymaler Zellen zu induzieren. Molekulargewicht (Mw) und

Konzentration spielten hierbei eine große Rolle. Die Untersuchungen ergaben ein

ideales Mw von 2 x 105 Da und 4 x 105 Da - bei einem höheren Mw konnte hingegen

eine Inhibierung der Chondrogenese beobachtet werden. Eine mögliche Ursache für

dieses Phänomen war eine Blockierung der Aggregation der Zellen, die jedoch

unabdingbar ist für deren Differenzierung. Die Erkenntnisse von KUJAWA et al.

(1986) widersprechen in Teilen unseren Ergebnissen, da wir Hyaluronsäure mit

einem Mw von 1.65 x 106 Da zur Augmentierung der Scaffolds verwendeten, und

trotzdem einen indirekten chondrogenen Effekt vermuteten, was durch eine Arbeit

von HEGEWALD et al. (2004) gestützt wird. Die Kollegen wiesen für kommerziell

erhältliche Präparate wie Ostenil® und Hylartil® mit hohem Mw (2-3 x 106 Da) eine

chondrogene Wirkung auf equine MSCs nach. Gesichert ist hingegen, dass der

chondrogene Effekt durch die Interaktion zwischen Hyaluronsäure und seinem auf

MSCs vorkommenden Rezeptor CD44 vermittelt wird. Die Wichtigkeit dieser

Interaktion für die Regulierung von Proliferation, Matrixsynthese und Chondrogenese

konnte bereits in diversen Studien nachgewiesen werden (MALESKI u. KNUDSON

1996; ISHIDA et al. 1997; SCHAGEMANN et al. 2010). Den u.a. von ERGELLET et

al. (2007) beschriebenen chemotaktischen Effekt von Hyaluronsäure auf MSCs

konnten wir wiederum nicht reproduzieren.

4.5 Integration der Wachstumsfaktoren

Im Gegensatz zur Wirkungsweise der Hyaluronsäure, die bereits durch eine initiale

Dosis eine Differenzierung der MSCs entlang der chondrogenen Zelllinie begünstigt,

legen unsere Ergebnisse nahe, dass die für die chondrogene Differenzierung

essentielle Expression von Kollagen Typ II von einer kontinuierlichen TGF-β1 Dosis

abhängig zu sein scheint. Diese Annahme wird von Lee et al. (2004a), DEFAIL et al.

(2006), JACLENEC et al. (2008) u. a. gestützt. Die TGF-β1 Augmentation von nano-

und mikrofibrösen PCL Scaffolds per Gefriertrocknung, wie in unserer Arbeit, ist aber

nicht geeignet, eine kontinuierliche Freigabe von TGF-β1 in wirksamer Dosis zu

4.6 Expression osteogener Marker 69

gewährleisten. Alternativ könnte eine kontinuierliche Supplementierung über das

Medium erfolgen, wobei dies logischerweise ausschließlich für in vitro und nicht für in

vivo Versuche geeignet ist. Ein möglicher Lösungsansatz ist die Einbettung von

Wachstumsfaktoren wie TGF-β1 in Microspheres. Der Vorteil gegenüber der

Aufbringung mittels Gefriertrocknung ist die kontinuierliche und kontrollierte Abgabe

über einen definierbaren Zeitraum (LEE et al. 2004a; CAI et al. 2007). Die

Freisetzungskinetik kann dabei über die molekulare Zusammensetzung der

Microspheres (LEE et al. 2004a) und deren Zersetzungskinetik (DEFAIL et al. 2006)

gesteuert werden. Auch wenn auf dieser Basis das ideale Microspheredesign

hergestellt werden kann, so müssen auch potentiell negative Effekte des

Microspherezerfalls, wie Hitze oder die Freisetzung toxischer Abbauprodukte, die

sich sowohl auf die Wachstumsfaktoren, die Scaffoldbeschaffenheit und den Körper

auswirken können, berücksichtigt werden (CAI et al. 2007; O'SHEA u. MIAO 2008).

Letztendlich ist jedoch jeder dieser Ansätze theoretisch, da die komplexe,

multifaktorielle in vivo Homöostase die Zell-Zell- und Zell-Matrixinteraktionen in vitro

nicht zu simulieren sind.

4.6 Expression osteogener Marker

Für den Beleg einer chondrogenen Differenzierung der MSCs ist ein Nachweis der

Expression knorpelspezifischen Marker Kollagen Typ II und Aggrecan essentiell

(RINGE 2006; JAKOBSEN et al. 2009; KISIDAY et al. 2010). Der Nachweis von

Kollagen Typ I aber auch Osteopontin, Osteocalcin und Alkalische Phosphatase

hingegen weist vordergründig auf eine osteogene Differenzierung hin (ENDRES et

al. 2003; RINGE 2006; BERNHARDT et al. 2009). Unsere Versuche zeigten, dass

eine relative Expression von Kollagen Typ I und Osteopontin unabhängig vom

Scaffolddesign evident war und nach 21 Tagen in vitro Kultur abfiel. Desweiteren

fand sich tendenziell ein Anstieg der Marker Osteocalcin und Alkalische Phosphatase

über 28 Tage in vitro Kultur. Auch dies war unabhängig vom Versuchsaufbau und -

wie die vorherigen Beobachtungen zeigten- gleichfalls gültig für Versuche mit

kontinuierlicher Supplementierung chondrogenen Induktionsmediums (VSP), so dass

70 4 Diskussion

geschlussfolgert werden kann, dass eine passagere osteogene Genexpression im

Rahmen der chondrogenen Differenzierung von MSCs auftritt. Da die Banden der

osteogenen Marker in den Scaffolds jedoch deutlich schwächer ausfielen als in

Zellversuchen mit osteogener Induktion, ist es fraglich, ob aufgrund unserer

Beobachtungen von einer passageren osteogenen Differenzierung der MSCs

gesprochen werden kann. So kommt es auch bei der Hypertrophie von MSCs u.a. zu

einer Expression von osteogenen Markern (STEINERT et al. 2003). Um zu

evaluieren, ob es sich um eine passagere osteogene Differenzierung oder aber um

eine Hypertrophie handelt, wäre eine längere Versuchsdauer von Nöten sowie die

Untersuchung anderer Faktoren, die den Verdacht der Hypertrophie bestätigen, wie

z.B. die Expression von Kollagen Typ X.

4.7 Schlussfolgerung

In der vorliegenden Studie wurden mit mesenchymalen Stammzellen besiedelte

Poly-ε-caprolactone Scaffolds in unterschiedlicher Faserstärke und Augmentation auf

ihr chondrogenes Differenzierungspotential untersucht. Weder das Scaffold selbst,

noch die aufgebrachten Wachstumsfaktoren konnten eine Rekrutierung von Zellen

bewirken. Hyaluronsäure verbesserte die initiale Besiedlung der Scaffolds, z.T.

signifikant, unabhängig von der Faserstärke der Scaffolds, während TGF-β1 einen

hemmenden Effekt auf die Proliferationsrate der MSC´s ausübte. Unter Einfluss von

TGF-β1 stieg sowohl die Kollagen Typ I als auch Typ II Konzentration, während

Hyaluronsäure einen hemmenden Einfluss auf die Expression von Kollagen Typ I zu

haben schien. Im Gegensatz zur Kollagen Expression wurde die Expression von

Aggrecan nicht durch TGF-β1 oder Hyaluronsäure beeinflusst, sondern vielmehr

durch die ultrastrukturelle Beschaffenheit des Scaffolds, wobei Nanofasern die

Expression mit zunehmender Dauer der Kultur begünstigt haben. Mikrofasern hatten

einen eher gegenteiligen Effekt. Es kann daher geschlussfolgert werden, dass eine

initiale TGF-β1-Dosis bereits einen Effekt auf die chondrogene Differenzierung hat,

dieser jedoch über einen Zeitraum von 21 Tagen nicht ausreichend ist, während

71

Hyaluronsäure einen längerfristigen chondrogenen Effekt zu haben scheint, auch

wenn hier ebenfalls nur von einer initialen Freisetzung ausgegangen werden kann.

Fazit ist daher, dass das optimale PCL-Scaffold eine nanofibröse Struktur aufweisen

sollte, eine initial hohe Dosis an Hyaluronsäure freisetzt und eine kontinuierliche

Konzentration von TGF-β1 gewährleistet, z.B. durch die Verwendung von

Microspheres.

72 5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Svenja Paul

Chondrogene Differenzierung mesenchymaler Knochenmarkstammzellen mittels

bioaktiver Poly-ε-caprolactone Scaffolds.

Geschädigter hyaliner Knorpel wird durch ein morphologisch, metabolisch und

biomechanisch inkompetentes Narbengewebe ersetzt. Die Folge sind chronische

Schmerzen, Lahmheit und Einschränkungen der Leistungsfähigkeit. Bisher etablierte

regenerative Verfahren sind nicht in der Lage zur Bildung von adäquatem -im

Idealfall hyalinartigem- und langlebigem Ersatzgewebe zu führen. Ziel dieser Arbeit

war es ein Scaffold zu entwickeln, das in vivo zur Defektabdeckung im Anschluss an

eine Mikrofrakturierung (MFX) eingesetzt werden kann und eine Anhaftung mit

anschließender chondrogenen Differenzierung der, durch die MFX

eingeschwemmten, mesenchymalen Stammzellen (MSC) bewirkt und somit die

Regeneration des hyalinen Knorpels unterstützt.

Die Herstellung biomimetischer Scaffolds aus PCL war erfolgreich. Durch

Modifikation der Elektrospinning Variablen Flussrate und Spannung konnten Fasern

unterschiedlicher Stärke im Nano- bis Mikrometerbereich erzeugt werden. Auf die

Anordnung der Fasern sowie Konstanz der Faserdurchmesser konnte kein Einfluss

genommen werden; sie war zufällig. Auch wenn konstatiert werden kann, dass die

hergestellten Scaffolds biomimetisch waren, so konnte keines der Scaffolds Zellen

rekrutieren. Diese Beobachtung fand sich auch für TGF-β1-haltige Scaffolds, auch

wenn diese TGF-β1 über einen Zeitraum von bis zu 170 h freisetzten. Auffällig war,

dass mikrofibröse Scaffolds initial TGF-β1 in hohen Konzentrationen über einen

Zeitraum von bis zu 70 h freisetzten, wohingegen für nanofibröse Scaffolds ein

rascher Abfall der TGF-β1 Konzentration innerhalb der ersten 10 h nachgewiesen

wurde.

Die Besiedlung der Scaffolds mit MSCs war in allen Fällen erfolgreich, wobei die in

VSNHA und VSMHA enthaltene Hyaluronsäure eine teils signifikante Steigerung der

initialen Besiedlung erbrachte. Die niedrigsten cDNA Werte fanden sich in Scaffolds

73

mit einer kontinuierlichen TGF-β1-Supplementierung (VSP), sodass davon

ausgegangen werden muss, dass TGF-β1 einen hemmenden Effekt auf die

Proliferationsrate der MSCs hat. So ist es auch erklärbar, warum Scaffolds, die

sowohl TGF-β1 als auch Hyaluronsäure enthielten, niedrigere cDNA Werte als

hyaluronsäurehaltige Scaffolds, aber höhere als VSP aufwiesen. TGF-β1 schien

zudem die Expression von Kollagen Typ I und II zu bewirken, was sich in hohen

Konzentrationen in TGF-β1-haltigen Scaffolds sowie VSP widerspiegelte. Dabei hatte

die kontinuierliche Supplementierung von TGF-β1 einen teils signifikanten Einfluss

auf die Expression dieser beiden Marker. Die Anwesenheit von Hyaluronsäure

schien hingegen einen hemmenden Einfluss auf die Expression von Kollagen Typ I

zu haben.

Die relative Expression von Aggrecan wurde offensichtlich nicht durch die An- oder

Abwesenheit von Wachstumsfaktoren (TGF-β1) oder Molekülen der hyalinen Matrix

(Hyaluronsäure) beeinflusst. Sie unterlag vielmehr der ultrastrukturellen

Beschaffenheit der Scaffolds. So konnte gezeigt werden, dass Nanofasern die

Expression von Aggrecan mit zunehmender Dauer der Kultur begünstigen und

Mikrofasern eher einen gegenteiligen Effekt haben. Diese Beobachtung fand sich

auch für die Expression von Kollagen Typ II. Die Expression osteogener Marker

konnte hingegen für alle Scaffolddesigns unabhängig von Faserstärke oder An- und

Abwesenheit bestimmter Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. Und deren

Verlauf ähnelte dem des VSP Versuchs, sodass gefolgert werden muss, dass eine

passagere Expression osteogener Genprodukte im Rahmen der chondrogenen

Differenzierung zu finden ist.

Vor dem Hintergrund der vorliegenden Ergebnisse schlussfolgern wir, dass ein

nanofibröses Scaffold augmentiert mit Hyaluronsäure einen chondrogenen Effekt auf

MSCs ausübt und eine Differenzierung entlang der osteogenen Zelllinie hemmt. Dies

ist umso erstaunlicher, als dass davon ausgegangen werden muss, dass die

Freisetzung und folglich auch die Konzentration von Hyaluronsäure innerhalb

weniger Tage deutlich absinkt. Demnach hat bereits eine initiale Dosis an

Hyaluronsäure einen entscheidenden Effekt auf die spätere chondrogene

74 5 Zusammenfassung

Differenzierung der MSCs. Der Effekt von TGF-β1 ist komplexer. So scheint die

Expression von Kollagen Typ II von einer kontinuierlichen TGF-β1 Dosis abhängig zu

sein, wohingegen die Expression von Kollagen Typ I sowohl bei kontinuierlicher als

auch passagerer Supplementierung von TGF-β1 nach einem initialen Anstieg wieder

abfällt. Das bedeutet, dass bereits eine initiale Freisetzung von TGF-β1 aus den

Scaffolds eine Induktion entlang der chondrogenen Zelllinie begünstig, dies jedoch

über einen Zeitraum länger als 21 Tage nicht ausreichend ist. Theoretisch sollte

demnach das ideale Scaffold eine nanofibröse Struktur aufweisen, welche eine initial

hohe Dosis an Hyaluronsäure freisetzt und eine kontinuierliche Konzentration von

TGF-β1 gewährleistet. Letzteres wäre z.B. durch eine Kombination mit TGF-β1-

haltigen Microspheres möglich.

75

6 Summary

Svenja Paul

Chondrogenic Differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells by

bioactive Poly-ε-caprolactone Scaffolds.

Injured hyaline cartilage is replaced by morphologically, metabolically and

biomechanically incompetent replacement tissue. The consequences are chronic

pain, lameness and limitations of capability. Previously established regenerative

procedures are not capable to lead to adequate –ideally hyaline-like- and long-lasting

replacement tissue. The object of this paper was the development of a scaffold for

the defect coverage following a microfracture (MFX) and an attachment with

subsequent chondrogenic differentiation of the mesenchymal stem cells, which are

washed in by MFX and therefore supports the regeneration of hyaline cartilage.

The development of a biomimetic PCL-Scaffold was successful. By modification of

the elektrospinning variable flow rate and voltage it was possible to create nano- and

microfibers. We had no influence on the adjustment and constancy of the

fibrediameter, it was randomly. Though we state that the manufactured Scaffolds

were biomimetic they were not able to recruit cells. This observation was also seen in

the TGF-β1 containing Scaffolds, though they released TGF-β1 over a period of up to

170 h. Noticeable was that microfibrous Scaffolds initially released high TGF-β1

concentrations over a period of 70 h, whereas nanofibrous Scaffolds showed a rapid

decrease of the TGF-β1 concentration within the first 10 h.

The cell-seeding of the Scaffolds with MSCs was successful in all cases, though the

hyaluronic acid contained in VSNHA and VSMHA showed a partially significant

increase of the initial cell-seeding. The lowest cDNA-concentration was seen in the

Scaffolds with continuous TGF-β1 supplementation (VSP), so it can be assumed that

TGF-β1 has an inhibiting effect on the proliferation of the MSCs. That explains why

Scaffolds containing both, TGF-β1 and hyaluronic acid, showed lower cDNA

concentrations than Scaffolds only containing hyaluronic acid, but higher

concentrations than VSP. TGF-β1 seemed furthermore to induce the Collagen Type I

76 6 Summary

and Type II expression, which is shown in the high concentrations in TGF-β1

containing Scaffolds and VSP. Although the continuously supplementation of TGF-β1

had a partly significant Influence on the expression of both of these markers. In

contrast the presence of hyaluronic acid seemed to have an inhibitory effect on the

expression of Collagen Type I.

The relative expression of Aggrecan was obviously not influenced by the pre- or

absence of growthfactors (TGF-β1) or molecules of the hyaline matrix (hyaluronic

acid). Rather it is bound to the ultrastructural composition of the scaffolds. So it was

shown that nanofibers promote the expression of Aggrecan with increasing time of

culture, whereas microfibers rather have an opposite effect. This observation was

also found for the expression of Collagen type II. However the expression of

osteogenic markers was demonstrated for all scaffolddesigns independent from

fibrestrenght or pre- and absence of particular growthfactors. And the course is

similar to the VSP-experiment, so that it can be concluded that a transient expression

of osteogenic genproducts within the chondrogenic differentiation is found.

Against this background of the present results we conclude that a nanofibrous

Scaffold augmented with hyaluronic acid has a chondrogenic effect on MSCs and is

inhibiting an osteogenic Differentiation. This is more surprising as we can assume

that the release and therefore the concentration of hyaluronic acid within a few days

significantly decreases and so already an initial dose of hyaluronic acid has an

essential effect on the chondrogenic differentiation of the MSCs later on. The effect

of TGF-β1 is more complex. It seems that the expression of Collagen Type II is

dependent on a continuous TGF-β1 dose, whereas the expression of Collagen Type I

decreases after an initial increase in a continuous as well as in a transient

supplementation of TGF-β1. This means that already an initial release of TGF-β1

from the scaffolds promotes an induction along the chondrogenic Zellline, which is

not sufficient over a period of time longer than 21 days. Theoretically the ideal

scaffold should have a nanofibrous structure, which releases a high initial dose of

hyaluronic acid and ensures a continuous concentration of TGF-β1. The latter would

be possible e.g. with a combination of TGF-β1 containing microspheres.

7.2 Geräte 77

7 Anhang

7.1 Verbrauchsmaterialien

Biosphere Filter Tips 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl,

1000 µl

Sarstedt, Nümbrecht, Germany

Cryo 1°C Freezing Container Nalgene™ Labware, Rochester, USA

Cryomolds Sakura Tissue Tek, Zoeterwuede, Netherlands

Culture Slides BD Falkon, Franklin Lakes, USA

Eppendorf Tube Eppendorf, Hamburg, Germany

Kryoröhrchen 2 ml TPP, Trasadingen, Switzerland

Masterclear cap strips Eppendorf, Hamburg, Germany

Milipore Express-Plus (Flaschenfilter) Millipore, Billerica, USA

Minisart (Spritzenfilter) Sartorius, Göttingen, Germany

Objektträger Superfrost Plus Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany

Perfusionssyringe 50 ml BD Plastipak™, Franklin Lakes, USA

Pipettetierhilfe Eppendorf Research 0,5-10 µl, 2-

20 µl, 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl

Eppendorf, Hamburg, Germany

Pipettierhilfe Thermo Finnpipette 1-10 μl, 10-

100 μl, 100-1000 μl

Thermo, Waltham, USA

Spritzen 5 ml, 10 ml BD Discardit II, Franklin Lakes, USA

Urinbecher Sarstedt, Nümbrecht, Germany

Zellkulturflasche mit Filter (75 cm², 150 cm²,

300 cm²)

TPP, Trasadingen, Switzerland

Zellkulturschale (22,1 cm²) TPP, Trasadingen, Switzerland

Zellkulturtestplatte (24 well, 48 well, 96 well) TPP, Trasadingen, Switzerland

Zellschaber TPP, Trasadingen, Switzerland

Zentrifugenröhrchen konisch (15 ml, 50 ml) TPP, Trasadingen, Switzerland

7.2 Geräte

Autoklav 2540EL Systec, Wettenberg, Germany

78 7 Anhang

Beckmann GPR Centrifuge Beckmann Instruments GmbH, München,

Germany

Brutschrank HERAcell® Heraeus Holding, Hanau, Deutschland

Brutschrank Nuaire US Airflow Nuaire, Plymouth, USA

Modular Flow (FACS) DAKO, Cambridgeshire, UK

Feinwaage TE 1502S Sartorius, Göttingen, Germany

Fluoreszenzmikroskop Axioplan 2 mit Axio Cam

MRc5

Carl Zeiss, Jena, Germany

Inversionsmikroskop Leitz Diavert Leitz, Wetzlar, Germany

iCycler Bio-Rad, Hercules, USA

Kammer Sub Cell GT WIDE Mini Bio Rad, Hercules, USA

Cryostat Reichert & Jung Frigocut 2800 Leica, Bensheim, Germany

Magnetrührer VWR VMS-C7 VWR, Darmstadt, Germany

Mikroskop Axiovert 40C mit Axiocam MRC Zeiss Carl Zeiss, Jena, Germany

Mikroskop Philips EM400 Philips, Eindhoven, Netherlands

Nano drop Spectrophotometer ND-1000 Peq Lab, Erlangen, Germany

PH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin, Germany

Photometer Bio Mate 3 Thermo, Waltham, USA

Rüttler IKA-VIBRAX-VXR IKA Labortechnik, Staufen, Germany

Nuaire Biological Safety Cabinet Class II Nuaire, Plymouth, USA

Stickstofftank Arpege 40 Air Liquide Air Liquide, Düsseldorf, Germany

Thermal Cycler Bio Rad My Cycler Bio Rad, Hercules, USA

Thermal Cycler MJ Research PTC-200 MJ Research, San Francisco, USA

Thermo Forma -86°C ULT Freezer Thermo, Waltham, Germany

Thoma Zählkammer Brand, Wertheim, Germany

Transformator Power Pac Basic Bio Rad, Hercules, USA

Vortexer K-550GE Bender&Hobein AG, Zürich. Switzerland

Wärmeschrank KS-15 Edmund Bühler GmbH, Hechingen, Germany

Wasserbad Bachofer, Reutlingen, Germany

Zentrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg, Germany

Zentrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg, Germany

7.4 Reagenzien 79

Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Holding, Hanau, Germany

Zentrifuge Combi Spin PeqLab, Erlangen, Germany

Lucy 3 Platereader Anthos, Heerhugowaard, Netherlands

Berthold 96 BertholdTechnologies, Bad Wildbad, Germany

7.3 Software

Corel Draw Corel, Ottawa, Canada

Image J NIH, Bethesda, USA

JMP statistical software JMP, Cary NC, USA

ND-1000 Data Viewer.vi Thermo, Waltham, USA

Sigma Plot Systat, Erkrath, Germany

Summit 4.3 DAKO, Cambridgeshire, UK

Zeiss Axio Vision 3.0.6 Zeiss, Oberkochen, Germany

7.4 Reagenzien

10x Magnesium Puffer Fermentas, St. Leon, Germany

12/21/1-C-6-s (AGC/Proteoglycan) Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa,

USA

25 mM MgCl2 Fermentas, St- Leon, Germany

4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany

Aceton Roth, Karlsruhe, Germany

Agarose NEEO Ultra-Qualität Roth, Karlsruhe, Germany

Alzian blau Sigma, München, Germany

Antikörper CD13 PE BD Bioscience, Franklin Lakes, USA

Antikörper CD133 PE MACS (Miltenyi Biotec), Bergisch-Gladbach,

Germany

Antikörper CD271 MACS (Miltenyi Bitec), Bergisch-Gladbach,

Germany

Antikörper CD34 PE BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA

Antikörper CD45 FITC BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA

Antikörper PE labeled CD106 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA

80 7 Anhang

Antikörper PE labeled CD140b BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA




Antikörper PE labeled CD49d BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA




Antikörper PE Mouse IgG1 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA

Antikörper rabbit antimouse (FITC mouse IgG1

Isotyp Kontrolle)

BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA

Ascorbinsäure (L-Ascorbic Acid) Sigma, München, Germany

Azeton Fisher Scientific

Borsäure Roth, Karlsruhe, Germany

Bromphenolblau Merck, Darmstadt, Germany

BSA Sigma, München, Germany

Chloroform Fisher Scientific

DEPC H2O (RNase-, DNase-frei) Invitrogen, Paisley, UK

Dexamethason (Fortecortin) MERCK, Darmstadt, Germany

di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck, Darmstadt, Germany

DMSO Sigma, München, Germany

dNTP Mix 2,5 mM Fermentas, St. Leon, Germany

Dulbeccos modifies eagel medium Invitrogen, Paisley, UK

EDTA Bochrom, Berlin, Germany

EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat Roth, Karlsruhe, Germany

Ethanol Roth, Karlsruhe Germany

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe, Germany

Fast Ruler Middle Range DNA Ladder Fermentas, St.Leon-Roth, Germany

Fetales Kälberserum (FKS) Invitrogen, Paisley, UK

Ficoll Sigma, München, Germany

7.4 Reagenzien 81

Formaldehyd 37% Merck, Darmstadt, Germany

HBSS Invitrogen, Paisley, UK

HCl Roth, Karlsruhe, Germany

Heamatoxylin Solution Gill No.3 Sigma München, Germany

Hemacolor® Merck, Darmstadt, Germany

Heparin Rationpharm, Ulm, Germany

HEPES Roth, Karlsruhe, Germany

Hyaluronat Acros Organics, NJ, USA

IBMX Sigma, München, Germany

II-II6B3-s (Coll II) Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa,

USA

Indomethacin Sigma, München, Germany

Insulin Sigma, München, Germany

ITS-plus premix BD, Franklin Lakes, USA

Kaliumchlorid zur Analyse Merck, Darmstadt, Germany

Kaliumhydrogenphosphat zur Analyse Merck, Darmstadt, Germany

L-Glutamin PAA, Pasching, Austria

LiCl Sigma, München, Germany

L-Proline Sigma, München, Germany

M-38 Supe (Coll I) Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa,

USA

Maxima Probe/qPCR Mastermix 2x Fermentas, St. Leon, Germany

MEM NEAA Invitrogen, Paisley, UK

Methanol Roth, Karlsruhe, Germany

N,N-dimethylformamide Fisher Scientific

NaOH Roth, Karlsruhe, Germany

Natriumacitat Sigma, München, Germany

Natriumchlorid zur Analyse Merck, Darmstadt, Germany

PCR-Primer: Agga Eurogentec Oli Gold™

PCR-Primer: Aggs Eurogentec Oli Gold™

PCR-Primer: aP2F Eurogentec Oli Gold™

82 7 Anhang

PCR-Primer: aP2R Eurogentec Oli Gold™

PCR-Primer: HuAPl TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: HuAPr TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: Hu-Col2a1L TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: Hu-Col2a1R TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: Huosteopont l Eurogentec Oli Gold™

PCR-Primer: Huosteopont r Eurogentec Oli Gold™

PCR-Primer: HuOsterixl TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: HuOsterixr TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: HuRunX2l TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: HuRunX2r TIP Molbio, Berlin, Germany

PCR-Primer: PPARgammaF Eurogentec Oli Gold™

PCR-Primer: PPARgammaR Eurogentec Oli Gold™

Penicillin/Streptomycin PAA, Pasching, Austria

Poly-ε-caprolacton Sigma, München, Germany

Poly(2-Hydroxyethyl)-Methacrylat Sigma, München, Germany

Primer Coll 1 TM TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Coll 1f TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Coll 1r TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Coll 2 TM TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Coll 2f TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Coll 2r TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Gapdh fwd TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Gapdh rev TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer Gapdh TM TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer TaqMan Collagen 1 TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer TaqMan Collagen 2 TIP Molbio, Berlin, Germany

Primer TaqMan Gapdh TIP Molbio, Berlin, Germany

Sodium-Pyruvate Solution PAA, Pasching, Austria

SudanIII Färbelösung Sigma, München, Germany

7.5 Kits 83

Taq-Polymerase Fermentas, St. Leon, Germany

TGF-β 1 R&D, Minneapolis, USA

TGF-β 3 R&D, Minneapolis, USA

Tissue Tec O.C.T. Compound Sakura Tissue-Tek, Zoeterwuede, Netherlands

Tris-Base Roth, Karlsruhe, Germany

Trypsin-EDTA PAA, Paschin, Austria

Vectashield Vector Inc., Burlingame, USA

β-Glycerophosphat Sigma, München, Germany

β-Mercaptoethanol Sigma, München, Germany

7.5 Kits

Alkalische Phosphatase Kit Sigma, München, Germany

NucleoSpin RNA II Machery Nagel, Düren, Germany

NucleoSpin Tissue (250) Machery Nagel, Düren, Germany

Quantikine® Human TGF-β1 R&D, Minneapolis, USA

Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Invitrogen, Paisley, UK

Revert Aid H Minus Frost Strand cDNA Synthesis

Kit

Fermentas, St.Leon-Roth, Germany

84

8 Literaturverzeichnis

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Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses.

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Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.


Danksagung 105

Danksagung

Ich bedanke mich bei Dr. med. Jan Schagemann für die fachliche Betreuung, die

freundliche und hilfreiche Unterstützung sowie für die kritische Korrektur und die

stets aufmunternden Worte.

Bei Priv.-Doz. Dr. Jan Kramer und Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Rohwedel möchte ich

mich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes bedanken. Mein besonderer Dank gilt

hier den Technischen Assistentinnen Barbara Andresen und Alexandra Tiedtke, die

stets ein offenes Ohr und eine helfende Hand für mich hatten. Auch Dr. rer. nat. Silke

Erdmann hat durch Ihre hilfsbereite Art meine Arbeit sehr unterstützt.

Bei Ralf Haller möchte ich mich für die Geduld und Hilfsbereitschaft bedanken und

für die aufmunternden Worte, durch die der Alltag und die kleinen Frustrationen der

in vitro Kultur auszuhalten waren.

Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Tochter Hannah bedanken für ihre Geduld

und Genügsamkeit, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ebenso wie

bei den zahlreichen Babysittern (Renate Paul, Klemens Thiede sowie Andrea und

Peter Gerstenkorn).

Ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern Renate Paul und Klaus Müller, die mir

mein Studium und die Promotion ermöglicht haben. Meiner Mutter danke ich

besonders für die vielen Stunden, in denen sie sich meine Sorgen und Nöte

angehört, mich aufgebaut und motiviert hat. Sie ist in der Phase der Promotion

immer eine große Stütze gewesen.

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Tierärztliche Hochschule Hannover · Knorpelgewebe aufweisen (FOSSUM 2007). Biomechanische Eigenschaften Die Zusammensetzung und Anordnung der EZM verleiht dem hyalinen Knorpel seine