Tierschutzgerechtes Töten von Labornagern:

CO2 ist erlaubt, aber ist es noch vertretbar?

N. Marquardt

Institut für Pharmakologie und Toxikologie, FB Veterinärmedizin

marquardt.nicole@vetmed.fu-berlin.de

12. September 2013

Einführung

Unsere Studie

Mäuse*, Ratten und Hamster

Stammes und Speziesunterschiede

Ergebnisse

Fazit

Gliederung

* in Kürze erscheinende Dissertation „Vergleich der Belastungen durch Kohlendioxid (CO2), Isofluran und

Sevofluran in der Phase der Narkoseeinleitung bei Mäusen – ein Beitrag zum Refinement von

Tierversuchen“. Marquardt, 2013. Fachbereich Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin.

Einführung

Deutschland 2011

> 2,4 Mio. Labornager

2 036 606 Mäuse

Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz

Versuchstierzahlen

Berlin 2012

> 427 000 Labornager

396 984 Mäuse

Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin

Versuchtierrichtlinie 2010/63/EU Anhang IV

Kohlendioxid (CO2)

Überdosis eines Betäubungsmittels

CO2-Euthanasie

Die Verwendung von CO2 zur Euthanasie ist weit verbreitet, jedoch umstritten.

Es ist bekannt, dass CO2

Aversion

Reizung der Schleimhäute, Schmerzen

Azidose

Dyspnoe

Lungenödem und –blutungen

Angst

verursachen kann.

Inhalationsanästhetika

sie können die Schleimhäute irritieren.

sie sind hinsichtlich der Stressbelastung noch nicht ausreichend charakterisiert.

Inhalationsanästhetika werden als Alternative vorgeschlagen, aber …

Sind sie wirklich die bessere Wahl?

Unsere Studie

Unsere Studie

Umfassende Untersuchung der Stressbelastung Verhalten einschl. Vokalisationen Stresshormone (Adrenalin und Noradrenalin) und Glukose Atembewegungen Organpathologische Untersuchung

Stressrelevanter Zeitraum Start Narkoseeinleitung bis Erreichen der chirurg. Toleranz max. 300 s

Stressarme Applikation Habituation und Simulation des Heimatkäfig

Verschiedene Narkosegase in unterschiedlichen Dosen CO2, Isofluran und Sevofluran

Spezies- und Stammesunterschiede

Mäuse: NMRI und C57Bl/6 Ratten: Wistar und Sprague Dawley (SD) Syrischer Goldhamster

Nur überzählige Tiere oder Kontrolltiere

Unsere Studie

Versuchsablauf

Narkosekammer

Verwirbelungsplatte

in Anlehnung an

Corbach 2006

Behandlung Einfüllrate [Kammer-vol/min]

Abkürzung Tiere

100% CO2

20% CO2 20 M

40% CO2 40 R H

60% CO2 60 M R

100% CO2 100 M R

2% Isofluran

71% (M)

59% (R,H)

Iso 2% M

5% Isofluran Iso 5% M R H

4,8% Sevofluran Sevo 4,8% M

8% Sevofluran Sevo 8% M R

Luft = Kontrolle 100% air M R H

M Mäuse 2 x 8 x 16

R Ratten 2 x 6 x 16

H Hamster 2 x 6

Tiere und Behandlung

Einleitung

Tiefe Narkose

Tod

Chirurgische Toleranz: Verlust des Zwischenzehen-reflexes

Bewusstseinsverlust: Verlust des Stellreflexes

Atemstillstand und Herz-/Kreislauf-Versagen

Narkosestadien

Analgesie

Exzitation

Tole

ran

z

1. Stufe

2. Stufe

3. Stufe

Asphyxie

Reflextestung

Ergebnisse

Wirksamkeit

Chirurgische Toleranz (CT) in < 300s

CT in <300s

[%] CO2 20 CO2 40 CO2 60

CO2 100

Iso 2% Iso 5% Sevo 4,8%

Sevo 8%

NMRI 25 -- 100 93,8 62,5 100 62,5 87,5

C57Bl/6 31,3 -- 93,8 100 87,5 100 81,3 100

CT in <300s

[%] CO2 20 CO2 40 CO2 60

CO2 100

Iso 2% Iso 5% Sevo 4,8%

Sevo 8%

NMRI 25 -- 100 93,8 62,5 100 62,5 87,5

C57Bl/6 31,3 -- 93,8 100 87,5 100 81,3 100

Wistar -- 100 100 100 -- 100 -- 100

SD -- 100 100 100 -- 100 -- 100

Hamster -- 100 -- -- -- 100 -- --

Chirurgische Toleranz (CT) in < 300s

Wirksamkeit

Konzentrationsverläufe

ab 25% CO2: intranasale Noxe bei Ratten, Stimulation von Aδ- und C-Fasern

Kammer-Konzentrationen von CO2 und Zeitpunkt der Bewusstlosigkeit

Mäuse

0 50 100 150 200 250 300

Co

nce

ntr

atio

n o

f C

O2 [%

]

0

20

40

60

80

100

CO2 20

CO2 60

CO2 100

[s]

Ratten

Hamster

0 50 100 150 200 250 300

Co

nce

ntr

atio

n o

f C

O2 [%

]

0

20

40

60

80

100

CO2 40

CO2 60

CO2 100

[s]

Konzentrationsverläufe

ab 25% CO2: intranasale Noxe bei Ratten, Stimulation von Aδ- und C-Fasern

Kammer-Konzentrationen von CO2 und Zeitpunkt der Bewusstlosigkeit

Latenz bis zum Erreichen der CT

La

ten

cy to

re

ach

ST

[s]

0

50

100

150

200

250

300

**

NMRI C57Bl/6

Median, 0,25 und 0,75-Perzentile Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method * p<0,05

Mäuse

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Latenz bis zum Erreichen der CT

La

ten

cy to

re

ach

ST

[s]

0

50

100

150

200

250

300

**

*

*

Wistar SD Hamster

Ratten Hamster

CO2 40

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Median, 0,25 und 0,75-Perzentile Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method * p<0,05

NMRI C57Bl/6 Wistar SD Hamster

La

ten

z b

is E

rre

ich

en

CT

[s]

0

50

100

150

200

250

*

*Iso5%, Sevo 8%

Sevo 8%

NMRI C57Bl/6 Wistar SD Hamster

La

ten

z b

is E

rre

ich

en

CT

[s]

0

50

100

150

200

250

*

*

*CO2 40

CO2 60

CO2 100

Speziesunterschiede Mäuse – Ratten Hamster - Ratten

Stammesunterschiede Mäuse Ratten

Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method bzw. Mann-Whitney-Ranksummentest

CO2 40

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Latenz bis zum Erreichen der CT

Verhalten

Gehen, Laufen Putzen Rearings (A und B)

Hochspringen

Kontroll-Gruppen

Luft

Verhalten

Narkosegas-Gruppen

Gehen, Laufen (1A)

Putzen Rearings Hochspringen

Schwanken, Ataxie Hypotoner Gang (1B)

Exzitationen Opisthotonus (2A und B)

Running excitement Klonus

Änderung der Häufigkeit

1

2

A

B

CO2

Iso/Sevo

Verhalten CO2 Iso/Sevo

Gehen, Laufen

Putzen kein Putzen

Rearings

Hochspringen

Schwanken, Ataxie

Hypotoner Gang kein hypot. G.

Exzitationen Running excitement, Klonus, Opisthotonus

keine Exzit.

keine Änderung geringere bzw. höhere Frequenz vergl. mit der Luftkontrolle Two way ANOVA

Kein eindeutiges Schmerz- oder Stress-anzeigendes Verhalten

Keine Vokalisationen

Mäuse

Verhalten

Verhalten CO2 Iso/Sevo

Gehen, Laufen

Putzen kein Putzen

Rearings

Hochspringen

Schwanken, Ataxie

Hypotoner Gang kein hypot. G.

Exzitationen Running excitement, Klonus, Opisthotonus

H: keine Exzit.

R:

Ratten Hamster

Verhalten

keine Änderung geringere bzw. höhere Frequenz vergl. mit der Luftkontrolle Two way ANOVA

Kein eindeutiges Schmerz- oder Stress-anzeigendes Verhalten

Einzelne 50-70 kHz-Vokalisationen bei Ratten, aber keine 22 kHz-Arlarmrufe

Mikroskopische Untersuchung

In Zusammenarbeit mit dem

Institut für Veterinär-Anatomie

Normal

Gestaute Kapillaren

Blutaspiration

Blutung in Alveolarsepten/-raum

CO2

Iso/Sevo

Luft

Mikroskopische Untersuchung

Normal Atelektase

CO2 kollabierte Lungenabschnitte

Absorptionsatelektase

Mikroskopische Untersuchung

Keine Dekapitation: „weniger Blut“ im Vergleich zu Mäusen

Keine Unterschiede zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen

CO2

Iso/Sevo

Luft

Mikroskopische Untersuchung

Adrenalin im Plasma

Mäuse

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Median, 0,25 und 0,75-Perzentile Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method * p<0,05

Pla

sm

a a

dre

na

line

[n

g/m

l]

0

10

20

30

40

50

60*

NMRI C57Bl/6

*

Noradrenalin im Plasma

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Median, 0,25 und 0,75-Perzentile Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method * p<0,05

Mäuse

Pla

sm

a n

ora

dre

na

line

[n

g/m

l]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

NMRI C57Bl/6

* *

Adrenalin im Plasma

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Median, 0,25 und 0,75-Perzentile Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method * p<0,05

Pla

sm

a a

dre

na

line

[n

g/m

l]

0

10

20

30

40

50

60

*

*

*

Wistar SD Hamster

Ratten

Hamster

Noradrenalin im Plasma

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Median, 0,25 und 0,75-Perzentile Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method * p<0,05

Ratten

Hamster

Pla

sm

a n

ora

dre

na

line

[n

g/m

l]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

*

* *

Wistar SD Hamster

NMRI C57Bl/6 Wistar SD Hamster

Ad

ren

alin

[n

g/m

l]

0

10

20

30

40

50

60 *

*CO2 60

CO2 100

NMRI C57Bl/6 Wistar SD Hamster

Ad

ren

alin

[n

g/m

l]

0

10

20

30

40

50

60

*

*

CO2 100, CO2 60

CO2 100

Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method bzw. Mann-Whitney-Ranksummentest

CO2 40

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Adrenalin im Plasma

Speziesunterschiede Mäuse – Ratten

Stammesunterschiede Mäuse Ratten

NMRI C57Bl/6 Wistar SD Hamster

No

rad

ren

alin

[n

g/m

l]

0

20

40

60

80

100

120

140

**

*

*

CO2 40

Iso 5%

CO2 100

CO2 60

NMRI C57Bl/6 Wistar SD Hamster

No

rad

ren

alin

[n

g/m

l]

0

20

40

60

80

100

120

140

*

*

alle Narkosegase

CO2 100, Sevo 8%

Kruskal-Wallis-Analyse gefolgt von Dunn‘s Method bzw. Mann-Whitney-Ranksummentest

CO2 40

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Noradrenalin im Plasma

Speziesunterschiede Mäuse – Ratten Hamster - Ratten

Stammesunterschiede Mäuse Ratten

Zusammenfassung

CO2 40, CO2 60, CO2 100, Iso 5 und Sevo 8 erzeugten zuverlässig die CT innerhalb 300s.

Sevo 8 wirkte am langsamsten, Iso 5 und CO2 60 gleich schnell und CO2 100 am schnellsten.

Die Änderungen des Verhaltens lassen keine eindeutigen Aussagen zur Stressbelastung zu.

Das Verhalten unter CO2-Exposition war „ruhiger“ als das Verhalten unter Iso/Sevo-Exposition bei Mäusen und Hamstern.

Wir fanden pathologische Veränderungen in der Kontroll- und in allen Behandlungsgruppen.

CO2-Exposition führte zu höheren Adrenalin- und Noradrenalin-konzentrationen als Iso/Sevo-Exposition.

Woher kommt der Stress?

Zusammenfassung

Aversion (Approach-Avoidance Test u.a.)

CO2 Warnsignal Ratte: Schwelle 0,5% CO2 Maus: Schwelle ca. 0,066% CO2

Angst und Panik

Reizung von Nozizeptoren

Azidose lebensbedrohlicher Zustand

Dyspnoe

Stress durch CO2

Fazit

Fazit

Trotzdem die Euthanasie mit CO2 weitverbreitet ist,

sie erlaubt ist,

sie von außen betrachtet sanft und friedlich erscheint,

sie am schnellsten geschieht,

wird die Narkoseinduktion mit CO2 von einem massiven

Anstieg der Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin

begleitet.

Unterstützung

Dahlem Research School Innovationsfonds 2009

ZEBET Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch

FK 3-1328-429

DIAGNOSTICS BY HPLC & LC-MS/MS

Bundesinstitut für Risikobewertung

FEM - Forschungseinrichtung für experimentelle Medizin

Danke!

• Prof. Dr. H. Fink

• Dr. B. Bert, Dr. Silke Dietze

• Lena Menken und Alexandra Wistel (Approach-Avoidance Test)

• Carmen Bohnwagner, Carola Kapfer, Jagoda Kuschka

• alle anderen Mitarbeitern

• Prof. Dr. J. Plendl

• Dr. H. Hünigen

• Karin Briest-Forch

Institut für Veterinär-Anatomie

Institut für Pharmakologie und Toxikologie

Für Ihre Aufmerksamkeit!

Man glaubt, was man sieht. Man sieht, was man glaubt.

Redensart

Man sieht nur, was man weiß. Goethe

Noch Fragen?

Approach-Avoidance Test

zur Messung des Meideverhaltens und der Aversivität Konflikt zwischen Belohnung und Gasexposition Verlassen jederzeit möglich

Test basiert auf Studie von Makowska et al. 2009 C57Bl/6 und NMRI-Mäuse Belohnung: gesüßte Kondensmilch Videoaufnahme zur Verhaltensanalyse

Latenz bis zum Verlassen, Fresszeit u. -menge, Rearings, Laufen, Narkosestadium

Substanzen

CO2, Isofluran, Sevofluran in unterschiedlichen Dosierungen,

Luftkontrolle

Gewöhnung an die Doppelkäfige und die Belohnung

Training auf ein Zeichen in den unteren Käfig zu gehen

Gewöhnung an den Luftstrom

Trainingsziel: mind. 120 s im unteren Käfig, Belohnung auffressen

Versuch

Luftkontrolle niedrige Dosis mittlere Dosis hohe Dosis

Versuch endet, wenn die Maus die Kammer verlässt oder nach max. 240 s

Futterbelohnung ↔ Gasatmosphäre Verlassen jederzeit möglich

Ablauf

Approach-Avoidance Test

Narkosestadium und Gaskonzentration beim Verlassen des Käfigs

CO2

Keine Maus zeigte Ataxie unter CO2-Exposition. Konz. ca. 7-12% CO2

Iso/Sevo

9 von 10 Mäusen zeigten Ataxie unter Isofluran-Exposition. Konz. ca. 1,1% Iso 8 von 9 Mäusen zeigten Ataxie unter Sevofluran-Exposition. Konz. ca. 1,7% Sevo

Im weiteren Verlauf verloren einige Mäuse das Bewusstsein.

Substanz Dosis

niedrig mittel hoch

CO2 0 0 0

Isofluran 1 0 4

Sevofluran 0 0 4

C57Bl/6 Approach-Avoidance Test

Anzahl der Mäuse, die

das Bewusstsein

verloren

Glucose

Blo

od

glu

co

se

[m

mo

l/l]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

**

Wistar NMRI C57Bl/6

median,

0,25 and 0,75-percentile

Kruskal-Wallis-Analysis

followed by Dunn‘s

Method

* p<0,05

rats

mice

CO2 40

CO2 60

CO2 100

Iso 5%

Sevo 8%

Latency to reach surgical tolerance

[s] CO2 40 CO2 60 CO2 100 Iso 5% Sevo 8%

NMRI -- 95 75 / 129

65 61 / 71

102 95 / 124

141 127 / 172

C57Bl/6 -- 80 75 /86

64 61 / 67

95 84 / 102

116 109 / 123

Wistar 136 126 / 150

126 113 / 134

91 85 /99

121 114 /158

193 170 / 217

SD 136 119 / 145

127 120 / 132

104 92 / 111

142 130 / 152

146 136 / 164

Hamster 154 147 / 162

-- -- 134 127 / 138

--

median 0,25 / 0,75-percentile

Formel

cin – c0

cin – c = e

-(Q / V)t

Gaskonzentration in der Kammer zu einem best. Zeitpunkt = -(EXP((-(Einfüllrate in [l/min]/60[s])/Kammervol.[l])*Zeitpunkt [s])) *(Gaskonz.-Umgebungsgaskonz.)+Gaskonz.

Annhame: völlige Durchmischung des Narkosegases mit dem in der Kammer befindlichen Gases während des Einfüllens

Was ist zu tun?

Narkoseeinleitung mit Isofluran oder Sevofluran rasche Anflutung gewährleisten tiefe Narkose aufrechterhalten Arbeitsschutz!

anschließende Tötung mit CO2 oder anderer Methode Tier muss sicher bewusstlos bleiben!

Genaue Dosierungen und Anwendungsformen sowie die Befeuchtung der Gase müssen Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein. Technische Umsetzungen sind im Aufkommen.

Spezies- und Stammes-unterschiede beachten!

Atmung

CO2 Tiefe: Frequenz : früh , später

Dyspnoe Schnappatmung

Atembewegungen im Verlauf der Narkoseeinleitung

Iso/Sevo Tiefe: Frequenz:

Atemdepression