CHƯƠNG IVCÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN

XUẤT ENZYM TỪ VI SINH VẬT

MỤC TIÊU

• Nắm được những phẩm chất ưu việt của enzym được áp dụng trong sản xuất

• Nắm được các nguồn thu nhận enzym từ đó đưa ra kết luận về nguồn cung cấp hữu hiệu nhất là vi sinh vật

• Nắm được công tác về giống và các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

NỘI DUNG

I. Tổng quan về enzym1. Tính chất ưu việt của enzym.2. Các nguồn nguyên liệu để thu enzym.3. Khả năng sử dụng enzym tư vsvII. Qui trình sản xuất enzym từ vsv1. Tuyển chọn giống.2. Cải tạo giống.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym4. Chuẩn bị môi trường

1. Tính chất ưu viêt của enzym:

- Có tính chuyên hóa cao

- Cường lực xúc tác lớn

- Tác dụng trong một điều kiện êm dụi

- Enzym không độc hại

2. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym trong tự nhiên

* Động vật:

- Tụy tạng chứa nhiều enzym amylaza, maltaza, proteaza, esteraza, lipaza,

- Dạ dày chứa nhiều enzym pepxin, xellulaza, renin

- Gan là cơ quan chứa rất nhiều enzym .

- Ruột chứa chủ yếu là enterokinaza có khả năng phá vỡ các liên kết peptid

Không thể thu nhận enzym từ động vật ở quy mô công

nghiệp được vì thời gian nuôi quá dài và không kinh tế.

* Thực vật

• Trong chè có nhiều enzym oxy hóa khử như polyphelonoxydaza

• bromelain từ dứa

• amylaza từ malt

• Plazmin: làm tiêu máu đông trong họ ficus (sung, vả….)

• Trong các họ đậu có chứa ureaza

• papain trong đu đủ

Thu enzym từ thực vật cũng không kinh tế vì tốn diện tích đất trồng và mất nhiều chi phí cho phân bón và công sức chăm sóc.

* Vi sinh vật

+ Từ vi sinh vật có thể thu nhận được nhiều loại enzym khác nhau trong đó có những loại mà không thể thu nhận được từ động vật hoặc thực vật

+ Bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy hoặc dùng tác nhân điều chỉnh người ta có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật theo ý muốn.

+ Vi sinh vật có khả năng sinh sản và phát triển nhanh, vượt xa các enzym từ các nguồn khác

+ Vi sinh vật có khả năng sinh sản , phát triển và tổng hợp enzym trên môi trường dinh dưỡng đơn giản, dễ kiếm, và rẻ tiền

Loại enzym Vi sinh vật Sử dụng

Amylaza

Bacillus Subtilis, Bacillus Stearotheroophilus. Asp. Niger

Asp. oryzae

Bia và rượu (phân hủy tinh bột thành đừong lên men, sản xuất nha), bánh mì, bánh

ngọt

GlucoamylazaAsp. Niger

Asp. OryzaeEndomycopsis bispora

Sản xuất glucoza, bia (làm giảm hàm lượng dextrin)

PectinazaAsp. Niger

Asp. OryzaeSclerotinia libertina

Sản xuất và làm trong dịch quả, các chế phẩm rau cho dinh dưỡng trẻ sơ sinh.

Các xellulaza Trichodema virideCông nghiệp thực phẩm (làm tan thành tế

bào thực vật ở rau), rượu (thu nhận đường từ xellulaza).

Invectaza Saccharomyces serevisiaeDịch hóa đường để làm kẹo, sản xuất mật

ong nhân tạo.

Các proteaza

Bacillus Subtilis, Bacillus Cereus,Bacillus Stearotheroophilus,Streptomyces griseus,Asp. Oryzae.

Bổ sung vào bột giặt để loại protein, làmmềm thịt, chất trợ tiêu hóa, dùng trong công

nghệ làm phim.

Enzym làm đông sữa Mucor pusillus Sản xuất phomát

Keratinaza Streptomyces Fradiac Ngành da (khử lông)

β-galactozidaza Asp. Niger, Pen. NotatumBảo quản thực phẩm (loại O2), Xác định

glucoza (chuẩn đoán bệnh đái đường

3. Tuyển chọn giống

Mỗi loại enzym có thể thu nhận được từ nhiều chủng vi sinh

vật khác nhau và ngược lại một loại vi sinh vật cũng có khả

năng sinh nhiều loại enzym.

Khả năng sản sinh enzym của các chủng vi sinh vật không giống

nhau và khác nhau ngay cả trong cùng một chủng khi ta thay đổi

điều kiện của môi trường.

Tìm kiếm

Phân lập

4. Cải tạo giống

Gây đột biến:

+ Làm mất đi cơ chế điều hòa hoạt tính enzyme bằng sản phẩm cuối cùng: làm hỏng trung tâm dị lập thể.

+ Làm sai hỏng cơ chế điều hòa tổng hợp enzym:

- Làm hỏng gen điều hòa

- Làm mất khả năng gắn kết của O với chất ức chế.

5. Các yếu tố ảnh hưởng tối sự tổng hợp enzym

Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các môi

trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành

enzym và thành phần enzym được tạo thành cũng khác nhau.

Ví dụ:

Nuôi Asp. Oryzae

+ trên môi trường cám mì sẽ thu được

+ trên môi trường Kzapek +Nitrat + tinh bột

amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza

α – amylaza

5.1. Môi trường dinh dưỡng:

5.2. Độ ẩm

Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường bán rắn: 53 — 65%

5.3. pH môi trường:

Mỗi loại vi sinh vật có dải pH tối thích riêng, và mỗi enzym được tổng hợp ở một dải pH tối thích khác nhau:

Saccharomyces cerevisae: 3,5 – 5

Asp. Oryzae: 4,5 – 6,5

Candida famata: 7 - 8

4,5-5,0-amylaza, pectinaza

6,0-6,5- proteaza

5.4. Nhiệt độ

Thường vi sinh vật có dải nhiệt độ tối thích: 22 – 320C.

Vi khuẩn cao hơn 32 – 350C

Vi khuẩn suối nước nóng 50 – 700C

5.5. Oxy:

Trong lên sản xuất acid glutamic: 25 - 30 m3 (không khí)/m3/phút

Trong lên men acid citric: 45 – 50 m3 (không khí)/m3/h

5.6. Thời gian nuôi cấy

6. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

6.1. Thành phẩn môi trường:cacbon, nitơ, hydro. Oxy và các chất khoáng như: Mg, Fe, Ca, p, K....

Các chất kích thích tố sinh trưởng: chủ yếu là vitamin

6.2. Khử trùng môi trường

• Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC • 1-Thùng chứa; 2-Bơm; 3- Bộ đun nóng; 4- Bộ giữ; 5- Bộ lấy mẫu; 6-

Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi; 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát; 8- Thiết bị lên men.

I.1. Lên men bề mặt:

I. Phương pháp lên men

Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bắn rắn hoặc môi trường lỏng

Đối tượng : VSV kỵ khí, bán kỵ khí và hiếu khí

* Quy trình công nghệ:

Môi trường

Phối trộn Hấp Làm ẩm

Đánh tơi và làm nguội

Gieo mốc giống

Vào thiết bị nuôi

Vào phòng nuôi

nuôi mốc Canh trường.

*Khử trùng môi trường

• Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC • 1-Thùng chứa; 2-Bơm; 3- Bộ đun nóng; 4- Bộ giữ; 5- Bộ lấy mẫu; 6-

Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi; 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát; 8- Thiết bị lên men.

* Công tác chuẩn bị giống

+ Cấy giống trong phòng thí nghiệm

Lượng dịch trong bình Nồng độ,%

pH Nhiệt độ, oC Thời gian,h

Trong ống nghiêm 10ml 13-14 - 25 – 32 24

90 ml trong bình 250 ml 13-14 - 25 – 32 18-24

900 ml trong bình 2 lít 13-16 - 25 – 32 18-24

9 lít trong thùng 10 lít 15-18 - 25 – 32 15-18

Sơ đồ nuôi cấy giống.1.Thùng gây men 150 l cấp 1 chứa 100 l dịch; 2.Thùng đường hóathêm và xử lý dich đường; 3 và 4. Hai thùng gây men cấp II có dungtích bằng dung tích thùng đường hóa thêm và đều bằng 10% so với thùng lên men.

+ Nhân giống trong sản xuất

*Các thông số kỹ thuật cần theo dõi:

• Chất làm xốp như trấu (10 – 20%).

• Quá trình nuôi cấy kéo dài từ 33-48h

• Cần giữ t0 = 28 – 320C

• Giữ Ψphòng = 96 – 100%

• Cung cấp không khí vô trùng

• Trạng thái tế bào vi sinh vật

• pH, mức độ tạp nhiễm…

*Ưu và nhược điểm của phương pháp

+ Ưu điểm:• Cho nồng độ enzym cao hơn so với phương pháp nuôi cấy chìm• Có thể sấy khô nhanh chóng môi trường (dạng khô) mà không ảnh

hưởng đến hoạt lực của enzym.• Tránh được sự nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường• Tốn ít năng lượng.

- Nhược điểm:• Khó cơ giới hóa• Hiệu suất thấp• Tốn nhiều lao động• Tốn nhiều mặt bằng (diện tích)

I.2. Lên men chìm

Là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dịch thể

Đối tượng nuôi cấy là các chủng vi sinh vật hiếu khi, bán hảo khí và kỵ khí

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu + thanh trùng chuẩn bị chế phẩm amylaza

Đường hóa dịch cháo

Nuôi giống

các cấp Lên men

Thu hối sản phẩm

Quy trình công nghệ:

* Các thông số cần theo dõi và diều chỉnh:

- Nhiệt độ

- pH

- Áp suất

- Bọt khí

- Độ tạp nhiễm

- Cung cấp không khí vô trùng

- Thời gian kết thúc quá trình lên men

- ….

*Các phương pháp lên men chìm

I.2.1. Lên men gián đoạn:

Thùng lên men gián đoạn.1.ruột gà làm lạnh cần 0,4-

0,5m2/m3 thùng; 2.Ống dẫn dịch đường và men giống; 3.Ống tháo

sản phẩm; 4.Ống thoát CO2; 5.Cửa quan sát và vệ sinh; 6.Đầu

ống nối hệ thống vệ sinh 7 với phía trong thùng; 8. Van lấy mẫu; 9. Đầu ống nối hệ thống sục khí hoặc CO2 và hơi thanh trùng.

2.2.2. Lên men liên tục

Sơ đồ lên men liên tục

2.2.3. Lên men cải tiến (bán liên tục)

Sơ đồ lên men bán liên tục

*Ưu điểm của phương pháp:

+ Tiết kiệm diện tích.

+ Dễ cơ giới hóa, tự động hóa

+ Sử dụng hợp lý chất dinh dưỡng, tránh lãng phí.

+ Thu enzym ít tạp chất

+ Đảm bảo vệ sinh, vô trùng nên ít nhiễm vi sinh vật lạ.

*Nhược điểm:

- Nồng độ enzym thấp, cần làm đặc canh trường khi tách nên giá

thành cao

- Tốn năng lượng

- Nếu không đảm bảo vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt.

Tách và tinh chế enzym

1. Chiết enzym: Là công đoạn loại enzym ra khỏi canh trường sau lên men

+ Đối với enzym ngoại: Sử dụng nước cất pha loãng canh trường rồi loại bỏ sinh khối

+ Đối với enzym nội bào thì phải tiến hành phá vỡ tế bào bằng một trong các phương pháp sau:

- Phương pháp đồng hóa (nghiền trong máy đồng hóa)

- Nghiền với bột thủy tinh, cát….

- Làm lạnh đông và tan giá lặp di lặp lại nhiều lần

- Nhờ tác động của siêu âm

- Dùng áp suất thẩm thấu cao

2. Tách enzym

Là công đoạn tinh chế và thu hồi enzym ra khỏi hỗn hợp sau khi chiết

II.2.1. Thu hồi enzym kỹ thuật

• Phương pháp dùng nhiệt để cô đặc:

300C - 20g/lit

400C – (30-50)g/lit + chất bảo quản sấy phun với nhiệt độ

không vượt quá 700C.

• Phương pháp dùng dung môi hữu cơ để kết tủa enzym: etylic, izopropylic, axeton ….

Tùy theo tính chất của enzym và dung môi hữu cơ mà mỗi một

loại enzym được kết tủa ở một nồng độ dung môi khác nhau.

Ví dụ: proteaza kết tủa trong etanol 76 – 78%,

α- amylaza kết tủa trong etanol 70%,

glucoamylaza kết tủa trong etanol 45% và trong axeton 70%.

•Dùng muối trung tính (diêm tích):(NH4)2SO4, NaCl…. Ví dụ: α- amylaza thường kết tủa trong (NH4)2SO4 ở nồng độ 0,75% độ bão hòa, glucoamylaza ở nồng độ 0,8-0,9% độ bão hòa.

2.2.Thu nhận chế phẩm tinh khiết

Để thu được chế phẩm enzym tinh khiết cần phải loại bỏ

protein không hoạt động bằng cách làm biến tính những

protein này và sau đó mới dung các phương pháp tách chiết

ở trên để thi nhận enzym tinh khiết

CÂU HỎI

• Bài 1: Tại sao nồng độ enzym trong canh trường của lên men bề mặt lại cao hơn trong lên men chìm?

• Bài 2: Bạn hãy phân biệt enzym kỹ thuật và enzym tinh khiết? Lấy ví dụ minh họa

CÂU HỎI

• Bài 1: Có ý kiến cho rằng nếu như không có enzym thì không có phản ứng hóa sinh nào có thể xảy ra trong cơ thể? Bạn có suy nghĩ như thế nào về ý kiến trên? Cho ví dụ minh họa.

• Bài 2: Hai hệ enzym sử dùng nhiều trong các phản ứng hóa sinh là amylaza và proteinaza. Bạn hãy cho biết nhiệt độ tối thích để hai hệ enzym trên hoạt động là bao nhiêu? Lấy ví dụ minh họa?

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan. Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Giáo dục.

• Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục.

• Lương Đức Phẩm. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

• Các webside

Đánh giá chất lượng enzym

1. Phương pháp đánh giá

- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định với một nồng độ enzym xác định

- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm phản ứng với một nồng độ enzym nhất định

Nồng độ enzym cần thiết để làm biến đổi một lượng cơ chất hay thu nhận một lượng sản phẩm nhất định trong

một thời gian nhất định

2. Đơn vị

Đơn vị enzym quốc tế (ký hiệu UI): là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn ( ở pHopt, t0opt đối với enzym cần xác định)

Đơn vị Katal (Kat): Là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một mol cơ chất trong một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.

1UI=10-6/60 Kat = 16,67 nKat (nanoKat)

Hoạt độ riêng của chế phẩm enzym: Là số đơn vị

UI hoặc số đơn vị Kat ứng với 1 ml chế phẩm (nếu

là dung dịch) hoặc 1 mg chế phẩm (nếu là bột)

Hoạt độ phân tử: Số phân tử cơ chất được

chuyển hóa bởi một phân tử enzym trong

một đơn vị thơi gian

3. Những chú ý khi đánh giá chất lượng enzym • Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một

giới hạn thích hợp nhất đủ thừa để bão hòa enzym nhưng không quá cao đến mức kìm hãm enzym.

• Với những enzym cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho chất này vào enzym trước khi cho cơ chất vào phản ứng.

• Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pHopt và cố định, pH thường thay đổi phụ thuộc vào cơ chất và thành phần dung dịch đệm

- Nhiệt độ dùng xác định hoạt độ phải nhỏ hơn nhiệt độ tối ưu của enzym để đề phòng sự kìm hãm của enzym ở nhiệt độ cao.

- Thời gian xác định hoạt độ thường 5-30 phút. Nhưng cũng có trường hợp kéo dài đến 24h nếu hoạt độ của enzym quá thấp. trong thời gian dài phải cho những chất diệt

khuẩn để tránh hiện tượng tạp nhiễm

Enzym không tan

Enzym không tan hay còn gọi là enzym cố định là enzym nằm trong một không gian bị giới hạn. Sự giới hạn linh hoạt của enzym đạt được bằng cách đưa nó vào một pha cách li, tách rời khỏi pha dung dịch tự do và ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ chất. Pha chứa enzym thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là polymer cao phân tử ưu nước

1. Ưu điểm của enzym không tan

• Giảm giá thành vì có thể dùng lặp đi lặp lại được nhiều lần một lượng enzym xác định.

• Enzym không lẫn trong các sản phẩm do đó tránh được ảnh hưởng không tốt của nó đối với sản phẩm.

• Có thể làm ngừng nhanh chóng các phản ứng khi cần thiết.

• Enzym không tan bền hơn enzym tan do đó kết hợp tận dụng các yếu tố nhiệt độ, pH….

• Dùng enzym cố định có thể dễ dàng thay thế các quá trình lên men bằng các phản ứng enzym ngoài tế bào

2. Nhược điểm

• Enzym không tan có hoạt độ riêng nhỏ hơn enzym tan

3. Một số tính chất của enzym không tan • Enzym không tan có hoạt độ riêng nhỏ hơn enzym

tan• Enzym không tan cũng tuân theo quy luật Michaelis

Menten (sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzym). Tuy nhiên do có hiện tượng cạnh tranh giữa cơ chất và chất mang, do hiện tượng khuyếch tán nên cũng có những sai khác đáng kể về tốc độ phản ứng của enzyme: Khi cơ chất và chất mang tích điện cùng dấu thì Km không tan > Km tan, nếu tích điện trái dấu thì ngược lại (Km – hằng số Michaielis)

- Enzym không tan có tính bền nhiệt hơn enzym tan- Enzym không tan có sự dịch chuyển pH tối ưu sang miền kiềm hoặc axit hơn so với enzym tan. - Enzym không tan có thời gian bảo quản lâu hơn và bền với các chất kìm hãm cũng như các tác nhân gây biến tính

Phương pháp sản xuất enzym không tan

1. Gắn liên kết đồng hóa trị

1.1. Gắn phân tử enzym vào chất mang không hòa tan

Yêu cầu về chất mang:- Có độ hòa tan thấp và bền vững với tác động cơ, nhiệt và hóa học.- Các chất mang không gây tác động kìm hãm enzym.- Không hấp phụ phi chọn lọc đối với protein.- Nên háo nước vì chất mang kỵ nước có thể gây ức chế với enzym được mang.- Việc gắn sẽ có hiệu quả hơn nếu chất mang và enzym có điện tích trái dấu

* Những chất mang thường dùng

Chất mang hữu cơ: như là polypeptit, polysaccarit, các dẫn xuất của xenlulo (DEAE – xenlulo: Dietyl animoetyl xenlulo, CM – xenlulo: Cacboxyl metyl xenlulo), dẫn xuất của dextran (DEAE – sephadex, CM – sephadex) hoặc agaroza (aga khác với agaroza, trong thành phần của agaroza có gốc sunfat)

Chất mang vô cơ: So với chất mang hữu cơ thì

chất mang vô cơ bền hơn về nhiệt, cơ học, hóa

học, vi sinh vật và đặc biệt không thay đổi cấu

hình của khuôn khi thay đổi tính chất của môi

trường xung quanh. Các chất mang vô cơ như:

silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt….

1.2. Gắn các enzym với nhau

• Người ta có thể gắn các enzym lại với nhau nhờ các tác nhân đa hay lưỡng chức để tạo thành những đại phân tử enzyme không hòa tan

ví dụ thu dẫn xuất tripxin không tan bằng cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% để liên kết các phân tử enzyme

Ưu điểm

• Ít tổn thất enzym

• Tăng khả năng chống chịu của enzym đối với các yếu tố biến tính nên đưa vào sản xuất được.

Nhược điểm của phương pháp này là số enzym cố định ít

2.“Gói” enzym trong khuôn gel

• Các gel được hình thành trong sự polymer hóa tổng hợp

• Các enzym bị nhốt trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp

• Gói trong bao vi thể

• Phương pháp tiền polymer

3. Phương pháp hấp phụ vật lí

• Chất hấp phu và enzym được trộn lẫn với nhau trong một khoảng thời gian cho phép sự hấp phụ xảy ra trong nhờ tương tác của các liên kết ion, kị nước, hydrogen….

Nhược điểm là quá trình giải hấp phụ enzym dễ dàng xảy ra bởi sự thay đổi pH, nhiệt độ và thành phần ion