Tinción gram 2011

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METODOS DE OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOSDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

Observacin microbiana En vivo: exmen en fresco de una suspensin bacteriana, se usa principalmente para visualizar Hongos unicelulares, protozoos y helmintios. Ayuda a observar movimiento y forma de los Mo,s

Preparado coloreado: frotis o extendido que al ser teido permite visualizar la forma, tamao y disposicin de los diferentes tipos de bacterias o la observacin de elementos no habituales (flagelos, cpsula esporas).

Tcnica (observacin in vivo) Colocar parafina o vaselina en los bordes del cubreobjeto. Depositar una gota en el cubreobjetos Cubrir con el cubreobjetos primero desde una arista al total de la superficie. Observacin. Desventajas: falta de contraste y resolucin,

Tcnica ( observacin coloreada) Con un portaobjeto limpio y desgrasado y con el asa y la pipeta se le coloca una gota de agua destilada estril. Se toma con el asa y se coloca en el portaobjeto y se le homogeniza con el agua estril, Se extiende la muestra sin tocar los cuatro bordes del cubreobjetos Se deja que el portaobjeto se seque al aire o se le mantiene a 40 cm de la llaman y se fija La fijacin tiene el objeto de que las bacterias queden adheridas al vidrio.

fijacin Existen dos mtodos: 1. Mtodo de Koch (fsico): Consiste en hacer tres pasajes lentos sobre el mechero dejando enfriar entre cada uno de ellos. 2. Metanol (qumico): Extendido con alcohol metlico por 5 minutos y despues colorear

Colorantes Productos qumicos derivados del Alquitrn, especialmente el benceno La molcula del colorante est formada por dos segmentos el Cromforo y el auxcromo, el primero tiene color y el segundo la afinidad La afinidad esta dada por la disociacin electroltica de este segmento y la formacin de sales insolubles con las protenas, glucoprotenas y lipoproteinas de los tejidos y paredes.

El grupo auxocromo determina que se los clasifique en bsicos o catinicos, cidos o aninicos. Colorantes Bsicos: violeta de Genciana, Fucsina bsica, rojo neutro, etc. Colorantes Acidos: Fucsina cida, eosina Neutros: eosianato de azul de metileno.

Coloracin Simple Son las que emplean un solo colorante y tien todos los elementos por igual. Tcnica: fijar, cubrir, lavar y observar Ventajas: Observ. Rpida y sencilla de la morfologa bacteriana. Desventajas: no es posible diferenciar si la muestra es monoespecfica o mixta.

Compuestas o diferenciales Usan dos colorantes lo que permite teir de distintos modos las diversas clases de bacterias, los mtodos ms empleados son: Tincin de Gram. y de Ziehl-Neelsen En estas coloraciones se usan cuatro componentes de manera progresiva:

1. Colorante principal o primario: colorante bsico que al entrar en contacto con las clulas cargadas negativamente las colorea 2. Mordiente: le da mas intensidad y ms fijacin (sales metlicas, solucin yodada o lugol, taninos y fenol)

3. Agente decolorante: Disolvente orgnico como el alcohol, cido o alcohol acetona 4. Contracolor o colorante secundario: Colorante bsico de distinto color que el primero.

Tincin de Gram Utilizada ms habitualmente Facilita la observacin bacteriolgica Permite diferenciar entre gram positivo y gram negativo.

Fundamento La afinidad por el color depende en gran medida de la composicin qumica de la pared celular Despus de realizar los primeros cuatro pasos, todas las bacterias se ven color violeta. Al finalizar la tcnica las que conservan el color violeta se denominan Gram Positivas Y las que no lo conservan Gram Negativas.

Cont. fundamento Los decolorantes orgnicos utilizados abren los poros de la membrana externa de las bacterias gram negativas (constituidas principalmente por lipoprotenas y lipopolisacridos) y permiten la salida del colorante principal quedando desprovistos de color. Al agregar el contracolor stos quedan teidos de rojo (fucsina o safranina).

Diferencias estructurales

Tcnica1. Una vez fijado el extendido cubrir la superficie con cristal violeta (colorante primario) y dejar en contacto un minuto 2. Lavar con agua abundantemente. 3. Cubrir con Lugol(mordiente) por 1 minuto. 4. Lavar con abundante agua

Cont. Tincin de gram. Inclinar el portaobjeto y dejar gotear el alcohol acetona (decolorante) hasta que el preparado deje de perder color. Lavar con agua Agregar el (contracolor) fucsina bsica por 1 minuto Lavar, secar al aire, observar.

Ventajas y desventajas Es un mtodo rpido y sencillo Permite observar: forma, tamao y disposicin. Hace diferenciacin entre biota mixta o monoespecfica Proporciona orientacin teraputica. Se conservan los preparados. Gram. + vrs. Gram -

Algunas micobacterias y hongos pueden no tomar la coloracin Bacterias sin pared las tie dbilmente (mollicutes) La tcnica es ms laboriosa que la tcnica simple.

Otras tinciones Coloracin de Zielh Nielsen: Bacterias del gnero Mycobacterium, la especie Nocardia, las especies Corynebacterium y ocasionalmente actinomicetos no se tien con la coloracin Gram. Estas bacterias tiene la capacidad de resistir la decoloracin por cidos y alcohol

Cont. Otras tinciones Esta propiedad se debe al alto contenido de lpidos complejos (cidos miclicos) y ceras que poseen algunos microorganismos en su pared celular. Acido Alcohol resistentes (AAR): Mo,s que resisten la decoloracin se ven de color rojo. No Acido Alcohol resistentes (No AAR): No resisten la accin de los decolorantes y se ven de color azul.

Coloracin de Giemsa Utilizada para la diferenciacin intra y extracelular de parsitos en sangre circulante. (plasmodium y especies de Leishmania, Candida, Hisptoplasma capsulatum, y Pneumocystis carinii, inclusiones virales, Mollicutes, Rickettsia y Chlamydia. Se observan tambin los elementos celulares de la respuesta inflamatoria.

La Cpsula: Por sus caractersticas qumicas no se tie con colorantes bsicos para ello se utiliza la Tincin negativa o indirecta. No tie sino que se deposita alrededor resaltando los contornos. Se utiliza Tinta china (suspensin de partculas de carbn coloidal) Molculas grandes que no entran en la cpsula. La utilidad de esta tcnica es que revela cpsulas bacterianas y micticas.

Tincin de endosporas Sin teir se ven como estructuras refringentes intracelulares Con la tincin de gram se ven como zonas incoloras dentro de las clulas teidas Con calor + verde de malaquita y safranina. (El calor permite la penetracin del del colorante).

Tincin de flagelos y cilios Fuera del poder de resolucin del microscopio ptico comn por delgadas. Para verlos se agrega una suspensin coloidal de sales de cido tnico (mordiente) Formara un precipitado que engrosara el tamao de las estructuras Se aplica fucsina cida y se visualizan como estructuras rojas.