TINCION GRAM

Inés Gómez PadillaLaboratorio Multidisciplinario 3

La tinción de Gram. Fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana.

La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas

Gram positivo Gram negativo

• La tinción de Gram. requiere cuatro soluciones:

1.       Primer colorante un colorante básico (+) que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El mas utilizado es el cristal violeta.

2.       Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes usados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo, una sol. diluida de yodo.

3.       Agente decolorante: Es un disolvente orgánico; por ejemplo alcohol acetona (1:1).

4.       Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina.

 

Cristal-violeta

Lugol

Alcohol-acetona

Safranina

Tinción de Gram

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).

El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

• La capa de peptidoglicano es mucho más gruesa

• Secretan exo-enzimas y realizan digestión extracelular

PARED CELULAR DE LAS GRAM POSITIVAS

• Ac. Teicóico y el peptidoglicano son factores pirogénicos y quimiotácticos

• Los polisacáridos permiten la serotipificación de cepas bacteriana

Gram positivo

• La membrana citoplasmática es igual a la de las Gram positivas

• En el espacio periplásmico se

almacenan enzimas degradativas

PARED CELULAR DE LAS GRAM NEGATIVAS

• Los Lipopolisacaridos (LPS) actúan como endotoxinas

• Los LPS constituyen los Antígenos O

(Ag somático)

Gram negativo

• Tienen una membrana externa

adicional • Importante barrera de permeabilidad

DIFERENCIAS ENTRE GRAM (+) Y (-)

GRAM + GRAM -

La pared de las G+ consta de sólo una capa de 10 a 80 nm de espesor de peptidoglicano

La pared de las G- consta de una capa de 2 a 3 nm de espesor de peptidoglicano, el periplasma y una membrana externa de 7 a 8 nm de espesor con lipoproteínas y lipopolisacáridos de estructura similar a la membrana celular.

TINCION DE GRAM FROTIS FIJADO CON

CALOR

CUBRIRLO CON CRISTAL VIOLETA

TODAS LAS CELULAS SE TIÑEN DE AZUL-VIOLETA CUBRIRLO CON

LUGOL

TODAS LAS CELULAS SE TIÑEN DE AZUL-NEGRO

DECOLORAR CON ALCOHOL - ACETONA

GRAM-POSITIVAS RETIENEN EL COMPLEJO COLORANTE

GRAM-NEGATIVAS SE DECOLORAN

CUBRIRLO CON SAFRANINA- COLORANTE DE CONTRASTE

GRAM-POSITIVAS LAS CELULAS APARECEN AZUL-VIOLETA

GRAM-NEGATIVAS LAS CELULAS APARECEN ROJAS

TEORÍA STEARN Y STEARN

1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.

2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

3. Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.

4. Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.

5. En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.

6. Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.

7. La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.

8. El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.

TEORÍA DE LIBENSON Y MCLLROY

La permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloración.

Bacillus Enterobacteria

Bacillus + E. coli