Upload
vukien
View
215
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
MVDr. Kateřina Nedbalcová, Ph.D.Mgr. Lucie Pokludová, Ph.D.MVDr. Jiří BurešMVDr. Tomáš Krejčíprof. MVDr. Alfred Hera, CSc.
VÝZKUMNÝ ÚSTAVVETERINÁRNÍHOLÉKAŘSTVÍ, V.V.I.
CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Vyšetření citlivosti/rezistencebakteriálních patogenů prasat
k antimikrobiálním látkámstanovením minimálníchinhibičních koncentrací
201445
1
Certifikovaná metodika č. 45/2014
Vyšetření citlivosti/rezistence bakteriálních patogenů prasat
k antimikrobiálním látkám stanovením minimálních inhibičních
koncentrací
Autoři:
MVDr. Kateřina Nedbalcová, Ph.D., Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.,
Hudcova 296/70, Brno
Mgr. Lucie Pokludová, Ph.D., Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv,
Hudcova 232/56a, Brno
MVDr. Jiří Bureš, Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv, Hudcova
232/56a, Brno
MVDr. Tomáš Krejčí, LabMediaServis, s.r.o., Vítězná 92, 544 01 Huntířov
prof. MVDr. Alfred Hera, CSc., Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv,
Hudcova 232/56a, Brno
Certifikovaná metodika byla vypracována v rámci projektu Ministerstva zemědělství
ČR NAZV KUS, číslo grantu QJ 1210119 a projektu Ministerstva školství, mládeže a
tělovýchovy ČR LO1218. Výsledky projektu LO1218 byly získány za finanční podpory
MŠMT v rámci programu NPU I.
ISBN 978-80-86895-51-2
2
I) Cíl metodiky
Cílem vypracování certifikované metodiky je zavedení standardní metodiky stanovení
kvantitativní úrovně citlivosti mikroorganismů k antimikrobiálním látkám stanovením
minimálních inhibičních koncentrací (MIC) do široké veterinární laboratorní praxe, kde
nejsou zcela zharmonizovány metody stanovení a interpretace výsledků citlivosti pro
spektrum veterinárně významných patogenů. Ve veterinárních laboratořích je v současné době
používaná jednoduchá kvalitativní disková difúzní metoda, která není v některých případech
dostatečně citlivá a u některých patogenů se její využití ke stanovení citlivosti/rezistence
k antimikrobiálním látkám doslova nedoporučuje. Pro zavedení metody stanovení MIC
antimikrobiálních látek do praxe ve veterinárních laboratořích nejsou v současnosti pro tyto
laboratoře cenově dostupné sety ke stanovení MIC s veterinárními antimikrobiálními látkami
nebo je jejich cena vzhledem k nákupu v zahraničí velmi vysoká.
Pro splnění cíle metodiky byly vyvinuty a následně jsou vyráběny sety pro stanovení MIC u
respiračních a enterálních patogenů prasat, které mohou výrazně zvýšit úroveň veterinární
diagnostiky bakteriálních rezistencí u terapeuticky používaných antimikrobik. Údaje o stavu a
vývoji rezistence bakteriálních původců infekcí jsou nezbytné pro predikci účinnosti
antimikrobiálních látek v úvodní antibiotické léčbě a v určení pozice jednotlivých látek jako
léků volby a léků alternativních v terapii infekcí. Jsou proto rozhodujícím podkladem pro
vytváření objektivních a na farmaceutickém průmyslu nezávislých doporučených postupů pro
antibiotickou léčbu.
3
II) Vlastní popis metodiky
Předkládaná metodika představuje komplexní postup pro stanovení citlivostí/rezistencí
bakteriálních patogenů prasat od odběru vzorků k bakteriologickému vyšetření až po
interpretaci výsledků. Stanovení MIC antimikrobiálních látek k bakteriálním patogenům bude
ve veterinární oblasti výrazným přínosem zejména zavedením zlatého standardu, tj.
mikrodiluční metody pro testování a hodnocení citlivosti u veterinárních patogenů především
z důvodů získání vyšší úrovně dosažených výsledků, které bude možné použít k vyhodnocení
šíření rezistencí v bakteriálních populacích.
Hodnoty MIC jednotlivých antimikrobiálních látek bakteriálních izolátů budou stanovovány
zcela v souladu se standardizovanými metodikami Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI, 2013a,b), European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST,
2014) a Comité de l’Antibiogramme de la Société Francaise de Microbiologie (CA-SFM,
2014) pomocí originálních setů se speciálním výběrem testovaných antimikrobiálních látek,
který umožňuje testování rezistencí především veterinárních antimikrobik užívaných k léčbě
nemocí prasat a jejichž generika jsou v ČR registrována. Na mikrotitrační destičce s 96
jamkami - 12 sloupců (1-12) a 8 řádků (A-H) jsou ve sloupcích dvojkové ředící řady dvanácti
navržených antimikrobiálních látek, u jedenácti antimikrobiálních látek (sloupce 1-11) je na
destičce 8 ředění (řádky A-H) a u jedné antimikrobiální látky (sloupec 12) je 7 ředění (řádky
B-H) a v řádku A je jamka s médiem bez antimikrobiální látky sloužící jako pozitivní kontrola
růstu testovaných bakterií. Počáteční koncentrace jednotlivých antimikrobiálních látek na
destičce jsou rozdílné a jsou voleny tak, aby hodnoty MIC vyšetřovaných bakterií zahrnovaly
rozmezí breakpointů citlivosti/rezistence podle závazných mezinárodních metodik CLSI,
4
EUCAST a CA-SFM a rozmezí hodnot MIC bakteriálních kmenů povinně testovaných
v rámci kontroly kvality (Tab. 1).
Tab. 1: Set ke stanovení MIC antimikrobiálních látek u bakteriálních patogenů prasat
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AMX AMC EFT TET SXT ENR FFC GEN COL TUL TIL TIA
32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
0,5 0,5 0.5 0.5 0.5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
0,25 0,25 0.25 0.25 0.25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
Koncentrace antimikrobálních látek v tabulce mg/l; koncentrace pro amoxicilin/kyselina klavulanová odpovídá
koncentraci amoxicilinu; koncentrace pro trimethoprim/sulfamethoxazol odpovídá koncentraci trimethoprimu
AMX amoxicilin
AMC amoxicilin/klavulanová kyselina 2/1
EFT ceftiofur
TET tetracyklin
SXT trimethoprim/sulfamethoxazol 1/19
ENR enrofloxacin
FFC florfenikol
GEN gentamicin
COL kolistin
TUL tulathromycin
TIL tilmikosin
TIA tiamulin
PKR pozitivní kontrola růstu
Sety budou vyráběny ve třech modifikacích, které se budou lišit ve složení živného média, v
němž budou ředěny antimikrobiální látky:
1. Set ke stanovení MIC k antimikrobiálním látkám u růstově nenáročných bakterií –
CAMHB (Cation Adjusted Mueller-Hinton Broth)
2. Set ke stanovení MIC k antimikrobiálním látkám u růstově náročných bakterií –
CAMHB s 5 % lyzované koňské krve
5
3. Set ke stanovení MIC k antimikrobiálním látkám u růstově náročných bakterií –
VFM (Veterinary Fastidious Medium)
Sety skladovat zamrazené při teplotě – 80 °C. Po rozmrazení a temperování setu na kultivační
teplotu je nutné provést inokulaci destičky do 1h. Rozmrazené sety se nesmí opětovně
zamrazit (riziko degradace antimikrobiálních látek). Při skladování setů v -80 °C je exspirace
6 měsíců ode dne výroby.
Kontrola kvality setů do doby exspirace je na pracovišti výrobce setů sledována pravidelným
týdenním testováním kontrolních kmenů, které jsou přesně definovány a jejich hodnoty MIC
k antimikrobiálním látkám jsou uvedeny v laboratorních standardech CLSI, EUCAST a CA-
SFM. Stanovené hodnoty MIC jednotlivých antimikrobik musí být v rozmezí definovaných
hodnot MIC referenčních kmenů dle CLSI, EUCAST a CA-SFM.
Pro set ke stanovení MIC k antimikrobiálním látkám u růstově nenáročných bakterií
s CAMHB se jako referenční kmeny použijí Escherichia coli – ATCC 25 922 a
Staphylococcus aureus – ATCC 29213 (Tab. 2 a 3). Pro set ke stanovení MIC
k antimikrobiálním látkám u růstově náročných bakterií s CAMHB + 5 % lyzované koňské
krve se jako referenční kmeny použijí Streptococcus pneumoniae – ATCC 41619 (Tab. 4) a
Mannheimia haemolytica – ATCC 33396 (Tab. 5) pro interpretaci výsledků u tulathromycinu.
Pro set ke stanovení MIC k antimikrobiálním látkám u růstově náročných bakterií s VFM se
jako referenční kmen použije Actinobacillus pleuropneumoniae – ATCC 27090 (Tab. 6).
Stanovené rozmezí hodnot MIC testovaných kontrolních kmenů (mg/l) je vyznačeno
v tabulkách (Tab. 2, 3, 4, 5 a 6) šedou barvou. Pokud u některých antimikrobiálních látek není
6
pro některý z kontrolních kmenů vyznačeno šedé rozmezí hodnot MIC, není testování této
látky relevantní pro určitý bakteriální druh (antimikrobiální látka není účinná nebo vhodná
pro léčbu onemocnění tímto mikroorganismem) nebo nejsou k dispozici dostupná data.
Tab. 2: Rozmezí MIC u kmene Escherichia coli – ATCC 25 922
AMX AMC EFT TET SXT ENR FFC GEN COL TUL TIL TIA
A 32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
B 16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
C 8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
D 4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
E 2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
F 1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
G 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
H 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
≤ ≤ ≤
Tab. 3: Rozmezí MIC u kmene Staphylococcus aureus – ATCC 29213
AMX AMC EFT TET SXT ENR FFC GEN COL TUL TIL TIA
A 32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
B 16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
C 8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
D 4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
E 2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
F 1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
G 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
H 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
≤ ≤ ≤ ≤ ≤
7
Tab. 4: Rozmezí MIC u kmene Streptococcus pneumoniae – ATCC 41619
AMX AMC EFT TET SXT ENR FFC GEN COL TUL TIL TIA
A 32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
B 16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
C 8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
D 4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
E 2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
F 1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
G 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
H 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
≤ ≤ ≤ ≤ ≤ ≤
Tab. 5: Rozmezí MIC u kmene Mannheimia haemolytica – ATCC 33396
AMX AMC EFT TET SXT ENR FFC GEN COL TUL TIL TIA
A 32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
B 16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
C 8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
D 4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
E 2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
F 1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
G 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
H 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
8
Tab. 6: Rozmezí MIC u kmene Actinobacillus pleuropneumoniae – ATCC 27090
AMX AMC EFT TET SXT ENR FFC GEN COL TUL TIL TIA
A 32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
B 16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
C 8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
D 4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
E 2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
F 1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
G 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
H 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
≤ ≤ ≤
9
IIa) Odběr vzorků k bakteriologickému vyšetření a transport vzorků do laboratoře
Odběr klinických vzorků se provádí in vivo nebo post mortem. Místo odběru vzorků je
zvoleno podle klinických příznaků onemocnění. In vivo je možné provést u respiračních obtíží
nasální výtěr, případně výtěr dutiny ústní a mandlí, u enterálních onemocnění se odebírají
vzorky trusu nebo rektální výtěry. V případě dermatitid stíráme postižené místo. Post mortem
se odebírají změněné části postižených orgánů – plic, srdce a osrdečníku u respiračních
infekcí a vzorky střev u enterálních infekcí. U systémových onemocnění (H. parasuis nebo S.
suis) je vhodné odebrat vzorky nebo stěry ze všech patologicky změněných orgánů – mozek,
plíce, slezina, játra, ledviny, vzorky kloubní tekutiny a stěry pohrudnice a pobřišnice.
Odebrané klinické vzorky se po odběru uloží do chladícího boxu a co nejrychleji, nejpozději
však do 24 hodin, se dopraví do laboratoře k dalšímu zpracování. Stěry je vhodné uchovávat a
transportovat na tamponech s transportním médiem z důvodu krátkodobého přežívání bakterií
ve vnějším prostředí. Jestliže není možné klinický materiál přepravit do laboratoře během 24
hodin po odběru, je nutné vzorky zamrazit a do laboratoře je dopravit v tomto stavu.
10
IIb) Laboratorní zpracování vzorků, izolace a identifikace původce onemocnění
V diagnostické laboratoři se provádí kultivační vyšetření z klinických vzorků obvyklým
způsobem na neselektivním agarovém médiu, např. krevní agar. Inkubace probíhá při teplotě
34 °C - 37 °C po 18 h – 24 h (doba inkubace může být podle potřeby prodloužena). Pokud je
předpoklad, že původce onemocnění je A. pleuropneumoniae nebo H. parasuis, je nutná
kultivace z klinického materiálu na krevním agaru v přítomnosti kmene S. aureus. Následná
izolace původce z primokultivací se provádí podle druhů bakterií, které jsou podle
předpokladu původci onemocnění, na selektivních i neselektivních agarových médiích. Vždy
je nutná přesná identifikace druhu původce onemocnění (prováděná biochemickými,
molekulárně diagnostickými a jinými povinnými nebo doporučovanými testy), protože
provedení stanovení MIC antimikrobiálních látek a interpretace výsledků vyšetření, zda se
jedná o izolát citlivý nebo rezistentní k dané antimikrobiální látce, úzce souvisí
s vyšetřovaným bakteriálním druhem.
11
IIc) Stanovení minimální inhibičních koncentrací antimikrobiálních látek
1. Veterinární sety pro stanovení MIC u růstově nenáročných bakterií
Stanovení MIC u růstově nenáročných bakterií se provádí na destičkách s CAMHB.
1.1. Příprava inokula
Bakteriologickou kličkou se odebere 3 – 5 bakteriálních kolonií kultivovaných na
neselektivním agarovém médiu (inkubovaných při teplotě 34 °C - 37 °C po dobu 18 h – 24 h
(pokud není požadován delší čas inkubace) do sterilního bujónu nebo fyziologického roztoku.
Denzita suspenze se bujónem nebo fyziologickým roztokem upraví na zákal 0,5 McFarlanda,
který na fotometru (vlnová délka 625 nm, kyveta s optickou dráhou 1 cm) odpovídá
absorbanci 0,08 – 0,13 nebo je možné použít jiný vhodný ověřený nefelometr nebo denzitu
alternativně vyhodnotit vizuálně podle zákalového standardu McFarland. Bakteriální
suspenze o denzitě 0,5 McFarlanda (odpovídá 5 x 108 CFU pro E. coli ATCC 25 922) se dále
naředí na finální koncentraci inokula v jamce mikrotitrační desky 5 x 105 CFU.
Příklad postupu:
1 ml inokula o denzitě 0,5 MCFarlanda se naředí 9 ml sterilního fyziologického roztoku
(odpovídá 5 x 107 CFU pro E. coli ATCC 25 922), po přenesení 5 µl takto naředěného
inokula do jamky mikrotitrační desky s obsahem 100 µl bujónu je dosažena finální
koncentrace inokula v jamce 5 x 105 CFU.
12
1.2. Naočkování mikrotitračních destiček
Rozmražené mikrotitrační destičky se musí naočkovat do 15 min. po standardizaci suspenze
inokula. Do každé jamky destičky obsahující 100 µl zředěné antimikrobiální látky v bujónu se
přidá maximálně 5 µl suspenze zředěného inokula. (Multikanálovou pipetou přesně 5 µl nebo
inokulátorem – ježkem).
Ihned po naočkování se ověří skutečná denzita inokula. Z jamky pozitivní kontroly růstu se
odebere 10 µl bakteriální suspenze, která se následně zředí v 10 ml bujonu nebo
fyziologickém roztoku. Z tohoto ředění se přenese 100 µl kultury na vhodnou agarovou půdu,
která se inkubuje přes noc. Zkouška se považuje za vyhovující, pokud na agarové půdě
vyroste 20 – 80 kolonií.
Ověření bakteriální čistoty: Z jamky bez antimikrobiální látky (pozice 12A na destičce) se
odebere 100 µl, které se kultivují na neselektivním agarovém médiu při 34 – 37 °C po dobu
18 – 24 hodin.
Před inkubací se mikrotitrační destičky uzavřou těsnícím víčkem nebo lepící fólií.
1.3. Inkubace mikrotitračních destiček
Naočkované destičky musí být vloženy do inkubátoru do 15 minut po inokulaci. Pokud se pro
testovaný bakteriální druh neuvádí jinak, mikrotitrační destičky pro růstově nenáročné
mikroorganismy se inkubují aerobně při teplotě 34 °C - 37 °C po dobu 18 – 20 hodin.
13
1.4. Kontrola kvality výsledků
Kvalita výsledků se kontroluje paralelně s testovaným mikroorganismem stanovením MIC
antimikrobiálních látek u referenčních kmenů stejným způsobem, jakým je prováděna
kontrola kvality vyrobených setů (viz bod. II).
1.5. Odečítání výsledků
Výsledky se odečítají po dosažení dostatečného nárůstu mikroorganismu (usazenina nebo
zřetelný zákal) a po ověření bakteriální čistoty a příslušné koncentrace inokula. Zjištěná
hodnota MIC představuje nejnižší koncentraci antimikrobiální látky, která plně inhibuje
viditelný růst testovaného mikroorganismu.
14
2. Veterinární sety pro stanovení MIC u růstově náročných bakterií – Staphylococcus
hyicus, Streptococcus spp., Pasteurella multocida
Stanovení MIC u izolátů P. multocida se provádí na destičkách s CAMHB. Destičky
s CAMHB s přídavkem lyzované koňské krve se použijí při stanovení MIC izolátů S. hyicus,
Streptococcus spp. a také při opakovaném provedení stanovení MIC u izolátů P. multocida, u
kterých v CAMHB nebyla vyhovující pozitivní kontrola růstu v jamce bez antimikrobiální
látky.
2.1. Příprava inokula
Bakteriologickou kličkou se odebere 3 – 5 bakteriálních kolonií kultivovaných na
neselektivním agarovém médiu (inkubovaných při teplotě 34 °C - 37 °C po dobu 18 h – 24 h
(pokud není požadován delší čas inkubace) do sterilního bujónu nebo fyziologického roztoku.
Denzita suspenze se bujónem nebo fyziologickým roztokem upraví na zákal 0,5 McFarlanda,
který na fotometru (vlnová délka 625 nm, kyveta s optickou dráhou 1 cm) odpovídá
absorbanci 0,08 – 0,13 nebo je možné použít jiný vhodný ověřený nefelometr nebo denzitu
alternativně vyhodnotit vizuálně podle zákalového standardu McFarland. Bakteriální
suspenze o denzitě 0,5 McFarlanda (odpovídá 5 x 108 CFU pro E. coli ATCC 25 922) se dále
naředí na finální koncentraci inokula v jamce mikrotitrační desky 5 x 105 CFU.
Příklad postupu:
1 ml inokula o denzitě 0,5 MCFarlanda se naředí 9 ml sterilního fyziologického roztoku
(odpovídá 5 x 107 CFU pro E. coli ATCC 25 922), po přenesení 5 µl takto naředěného
15
inokula do jamky mikrotitrační desky s obsahem 100 µl bujónu je dosažena finální
koncentrace inokula v jamce 5 x 105 CFU.
2.2. Naočkování mikrotitračních destiček
Rozmražené mikrotitrační destičky se musí naočkovat do 15 min. po standardizaci suspenze
inokula. Do každé jamky destičky obsahující 100 µl zředěné antimikrobiální látky v bujónu se
přidá maximálně 5 µl suspenze zředěného inokula. (Multikanálovou pipetou přesně 5 µl nebo
inokulátorem – ježkem).
Ihned po naočkování se ověří skutečná denzita inokula. Z jamky pozitivní kontroly růstu se
odebere 10 µl bakteriální suspenze, která se následně zředí v 10 ml bujonu nebo
fyziologickém roztoku. Z tohoto ředění se přenese 100 µl kultury na vhodnou agarovou půdu,
která se inkubuje přes noc. Zkouška se považuje za vyhovující, pokud na agarové půdě
vyroste 20 – 80 kolonií.
Ověření bakteriální čistoty: Z jamky bez antimikrobiální látky (pozice 12A na destičce) se
odebere 100 µl, které se kultivují na neselektivním agarovém médiu při 34 – 37 °C po dobu
18 – 24 hodin.
Před inkubací se mikrotitrační destičky uzavřou těsnícím víčkem nebo lepící fólií.
2.3. Inkubace mikrotitračních destiček
Naočkované destičky musí být vloženy do inkubátoru do 15 minut po inokulaci. Mikrotitrační
destičky pro Staphylococcus hyicus, Streptococcus spp. a Pasteurella multocida se inkubují
v teplotě 35 °C po dobu 18 – 24 hodin.
16
2.4. Kontrola kvality výsledků
Kvalita výsledků se kontroluje paralelně s testovaným mikroorganismem stanovením MIC
antimikrobiálních látek u referenčních kmenů stejným způsobem, jakým je prováděna
kontrola kvality vyrobených setů (viz bod. II).
2.5. Odečítání výsledků
Výsledky se odečítají po dosažení dostatečného nárůstu mikroorganismu (usazenina nebo
zřetelný zákal) a po ověření bakteriální čistoty a příslušné koncentrace inokula. Zjištěná
hodnota MIC představuje nejnižší koncentraci antimikrobiální látky, která plně inhibuje
viditelný růst testovaného mikroorganismu.
17
3. Veterinární sety pro stanovení MIC u růstově náročných bakterií – Actinobacillus
pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis
Stanovení MIC u izolátů Actinobacillus pleuropneumoniae a Haemophilus parasuis se
provádí na destičkách s VFM.
3.1. Příprava inokula
Bakteriologickou kličkou se odebere 3 – 5 bakteriálních kolonií kultivovaných na
čokoládovém agaru (inkubovaných při teplotě 34 °C - 37 °C po dobu 18 h – 24 do sterilního
bujónu nebo fyziologického roztoku. Denzita suspenze se bujónem nebo fyziologickým
roztokem upraví na zákal 0,5 McFarlanda, který na fotometru (vlnová délka 625 nm, kyveta
s optickou dráhou 1 cm) odpovídá absorbanci 0,08 – 0,13 nebo je možné použít jiný vhodný
ověřený nefelometr nebo denzitu alternativně vyhodnotit vizuálně podle zákalového standardu
McFarland. Bakteriální suspenze o denzitě 0,5 McFarlanda se dále naředí na finální
koncentraci inokula v jamce mikrotitrační desky 5 x 105 CFU.
Příklad postupu:
670 µl inokula o denzitě 0,5 MCFarlanda se naředí 6 ml sterilního fyziologického roztoku
(odpovídá 5 x 107 CFU pro A. pleuropnemoniae ATCC 27090), po přenesení 5 µl takto
naředěného inokula do jamky mikrotitrační desky s obsahem 100 µl bujónu je dosažena
finální koncentrace inokula v jamce 5 x 105 CFU.
18
3.2. Naočkování mikrotitračních destiček
Rozmražené mikrotitrační destičky se musí naočkovat do 15 min. po standardizaci suspenze
inokula. Do každé jamky destičky obsahující 100 µl zředěné antimikrobiální látky v bujónu se
přidá maximálně 5 µl suspenze zředěného inokula. (Multikanálovou pipetou přesně 5 µl nebo
inokulátorem – ježkem).
Ihned po naočkování se ověří skutečná denzita inokula. Z jamky pozitivní kontroly růstu se
odebere 10 µl bakteriální suspenze, která se následně zředí v 10 ml bujonu nebo
fyziologickém roztoku. Z tohoto ředění se přenese 100 µl kultury na vhodnou agarovou půdu,
která se inkubuje přes noc. Zkouška se považuje za vyhovující, pokud na agarové půdě
vyroste 20 – 80 kolonií.
Ověření bakteriální čistoty: Z jamky bez antimikrobiální látky (pozice 12A na destičce) se
odebere 100 µl, které se kultivují na čokoládovém agaru při 34 – 37 °C po dobu 18 – 24
hodin.
Před inkubací se mikrotitrační destičky uzavřou těsnícím víčkem nebo lepící fólií.
3.3. Inkubace mikrotitračních destiček
Naočkované destičky musí být vloženy do inkubátoru do 15 minut po inokulaci. Mikrotitrační
destičky se inkubují v teplotě 35 °C v prostředí 5 % ± 2 % CO2 po dobu 20 – 24 hodin.
19
3.4. Kontrola kvality výsledků
Kvalita výsledků se kontroluje paralelně s testovaným mikroorganismem stanovením MIC
antimikrobiálních látek u referenčních kmenů stejným způsobem, jakým je prováděna
kontrola kvality vyrobených setů (viz bod. II).
3.5. Odečítání výsledků
Výsledky se odečítají po dosažení dostatečného nárůstu mikroorganismu (usazenina nebo
zřetelný zákal) a po ověření bakteriální čistoty a příslušné koncentrace inokula. Zjištěná
hodnota MIC představuje nejnižší koncentraci antimikrobiální látky, která plně inhibuje
viditelný růst testovaného mikroorganismu.
20
IId) Interpretace výsledků
Interpretace výsledků do kategorií citlivosti vyžaduje použití tzv. klinických breakpointů
antimikrobiálních látek. Vyšetřovaný kmen bakterie lze kategorizovat za předpokladu, že
příslušné breakpointy jsou použity v definovaném fenotypovém systému. Breakpointy
rozdělují izoláty na citlivé a rezistentní (Tab. 7).
Tab. 7: Breakpointy antimikrobiálních látek
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AMX AMC EFT TETa SXT ENRb FFCc GENd COLe TULf TIL TIAg
32 32 32 32 32 16 32 64 32 128 128 PKR
16 16 16 16 16 8 16 32 16 64 64 32
8 8 8 8 8 4 8 16 8 32 32 16
4 4 4 4 4 2 4 8 4 16 16 8
2 2 2 2 2 1 2 4 2 8 8 4
1 1 1 1 1 0,5 1 2 1 4 4 2
0,5 0,5 0.5 0.5 0.5 0,25 0,5 1 0,5 2 2 1
0,25 0,25 0.25 0.25 0.25 0,125 0,25 0,5 0,25 1 1 0,5
Breakpointy jednotlivých antimikrobiálních látek jsou na rozhraní bílé (citlivé kmeny) a barevné (rezistentní
kmeny) části příslušného sloupce vyznačeném silnější čarou
a Tetracyklin – breakpoint platí pouze pro injekční aplikaci b Enrofloxacin – pro Streptococcus suis jsou kmeny citlivé do MIC ≤0,5 mg/l a rezistentní od MIC ≥1 mg/l c Florfenikol – breakpoint pro platí pouze pro premixy d Gentamicin – berakpoint neplatí pro A. pleuropneumoniae e Kolistin – platí pouze pro Enterobacteriaceae; pro Pseudomonas spp. jsou kmeny citlivé do MIC ≤4 mg/l a
rezistentní od MIC ≥8 mg/l f Tulathromycin – pro A. pleuropneumoniae jsou kmeny citlivé do MIC ≤64 mg/l g Tiamulin – breakpoint platí pouze pro A. pleuropneumoniae
Breakpointy pro EFT, TET, ENR, FFC, TUL, TIL, TIA vychází z veterinárních kriterií (většinou stanovených
pro respirační patogeny prasat) - CLSI (2013b)
Breakpointy pro COL vychází z interpretačních kriterií - EUCAST
Breakpointy pro COT, GEN vychází z veterinárních kriterií odvozených z humánních interpretačních standardů
(nejsou stanoveny pro jednotlivé druhy zvířat) - CLSI (2013b)
Breakpointy pro AMX, AMC vychází z interpretačních kritérií CA-SFM (2014)
21
III. Srovnání „novosti postupů“
Set ke stanovení MIC bakteriálních izolátů z prasat obsahuje speciálně vybrané testované
antimikrobiální látky a umožňuje testování citlivosti/rezistence bakteriálních izolátů
k veterinárně specifickým antimikrobiálním látkám, které jsou užívány k léčbě infekčních
onemocnění prasat a jejichž generika jsou v ČR registrována. V současné době je k testování
rezistencí těchto specifických veterinárních antimikrobik možné využít pouze omezenou
nabídku setů zahraniční výroby, které většinou vzhledem k zastoupení antimikrobik ne zcela
odpovídají potřebám testování v České republice. Vývoj a výroba nového setu ke stanovení
rezistencí bakteriálních patogenů prasat reaguje na aktuální potřebu veterinárních
diagnostických laboratoří a nabízí řešení problému, které může zahraničním výrobkům
konkurovat kvalitou provedení, originalitou a především cenovou dostupností.
Metody vyšetření citlivosti/rezistence patogenů k antimikrobiálním látkám a v neposlední
řadě také interpretace zjištěných výsledků nejsou v současné době jednotné a neposkytují
proto relevantní výsledky pro klinickou veterinární praxi. V předkládané metodice je
navrženo komplexní harmonizované řešení metod vzorkování, vyšetření a interpretace
výsledků rezistence/citlivosti bakteriálních patogenů prasat s významem pro humánní i
veterinární oblast. Realizací těchto metod bude dosažena potřebná úroveň výsledků ke
sledování a vyhodnocení šíření rezistencí k antimikrobiálním látkám v bakteriálních
populacích.
22
IV. Popis uplatnění certifikované metodiky
Metodika je určena pro veterinární diagnostické laboratoře - certifikovaná veterinární
antibiotická střediska, veterinární nebo výzkumné laboratoře, Státní veterinární ústavy a
soukromé veterinární laboratoře. Je možné její uplatnění v systému celonárodního
monitoringu citlivosti/rezistence vybraných veterinárních patogenů k antimikrobiálním
látkám vyhodnoceného na základě harmonizovaných standardních postupů. V konečném
důsledku se uplatnění metodiky projeví ve zkvalitnění terapie infekčních bakteriálních
onemocnění prasat vhodnou volbou léčiv.
23
V. Ekonomické aspekty
Náklady na zavedení postupů uvedených v metodice jsou minimální (0 – 5 tis. Kč), protože
jejich provedení nevyžaduje žádné speciální přístrojové vybavení bakteriologické laboratoře,
je možné s využitím běžných přístrojů a pomůcek (termostat, pipety) a spotřebního materiálu.
Ekonomický přínos pro laboratoře bude představovat zisk z provedených vyšetření. Za
předpokladu vyšetření v jedné laboratoři cca 500 vzorků ročně při ceně za jedno vyšetření
kolem 500,- Kč, by se zisk 20 % z tržeb mohl pohybovat kolem 50 tis. pro jednu laboratoř.
V konečném důsledku budou uživatelé výsledků vyšetření chovatelé prasat, kterým se sníží
zlepšením diagnostiky ekonomické náklady na léčbu a prevenci onemocnění. Za
předpokladu, že by cílenou léčbou bylo zabráněno úhynům u 0,01 % porážených chovných
zvířat ročně (26356 ks) s průměrnou hmotností 110 kg a při průměrné výkupní ceně 33,- Kč/
kg ž. hm., by celkový zisk v hodnotě 10 % činil pro chovatele přibližně 9 567 tis. Kč. Zdroj
dat: Český statistický úřad, Zemědělství (odhadnutý celkový počet zvířat ročně vychází
z údajů za 1., 2. a 3. čtvrtletí 2014).
24
VI. Seznam použité a související literatury
CLSI, 2013a. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests
for Bacteria Isolated from Animals; Informational Supplement. Vet 01-A4, vol. 33, No. 7.
Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne 2013: 73 pp.
CLSI, 2013b. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility
Tests for Bacteria Isolated from Animals; Informational Supplement. Vet 01-S2, vol. 33, No
8. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne 2013: 63 pp.
EUCAST - Antimicrobial wild type distributions of microorganisms. Version 5.13. [Database
online]. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, [cit. 2014-11-14].
available in www: <http://217.70.33.99/Eucast2/>
CA-SFM 2014. Comité de l’Antibiogramme de la Société Francaise de Microbiologie.
Recommandations 2014. Lyon, France 2014: 122 pp.
25
Oponenti:
prof. MVDr. Alois Čížek, CSc. – Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno
MVDr. Petr Šatrán, Ph.D. – Státní veterinární správa ČR, Praha
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i.Hudcova 296/70
621 00 BrnoCzech Republic
Tel.: +420 5 3333 1111; www.vri.cz; e-mail: [email protected]