BORYS WRÓBEL

Zak³ad Genetyki i Biotechnologii Morskiej,

Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk,

Œw. Wojciecha 5, 81-347 Gdynia

Wydzia³ Chemii Uniwersytetu Gdañskiego,

Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdañsk

e-mail: wrobel@biotech.univ.gda.pl

REPLIKACJA PLAZMIDÓW

WSTÊP

Plazmidy to cz¹steczki kwasu nukleinowe-go zdolne do niezale¿nego dziedziczenia w ko-mórce. Mo¿na je traktowaæ jako wewn¹trzko-mórkowe paso¿yty lub symbionty (jako ¿e cza-sem nios¹ geny nadaj¹ce komórkom korzystny,przynajmniej w pewnych warunkach, feno-typ). W przeciwieñstwie do plazmidów, inneposo¿yty wewn¹trzkomórkowe — wirusy — re-plikuj¹ siê podczas rozwoju litycznego w spo-sób w zasadzie niekontrolowany. Genomy wi-rusowe charakteryzuje te¿ wiêksza „inwazyj-noœæ”, dziêki rekrutacji genów umo¿li-wiaj¹cych nie tylko wydajn¹ replikacjê, ale te¿wyjœcie z komórki gospodarza, ochronê mate-ria³u genetycznego poza komórk¹ i wreszciewnikniêcie do innej komórki.

Materia³ genetyczny wirusów i plazmidówzdolny jest czasem do integracji do genomu go-spodarza. Wówczas plazmidowe czy wirusowegeny s¹ powielane i przekazywane komórkompotomnym ³¹cznie z DNA chromosomalnym.Integracja do genomu gospodarza jest imma-nentn¹ cech¹ w³aœciw¹ transpozonom: ele-mentom genetycznym zdolnym do zmianyswojej lokalizacji w genomie. Mo¿na powie-dziec, ¿e transpozony ró¿ni¹ siê od plazmidówtym, ¿e nie s¹ zdolne do niezale¿nej replikacjiw komórce — musz¹ stanowiæ czêœæ innego re-plikonu, by ulec powieleniu. Ten opis jednaknie do koñca odpowiada prawdzie. Otó¿ nie-które transpozony istotnie fizycznie zmieniaj¹

lokalizacjê w genomie z miejsca donorowegona akceptorowe. Jednak istniej¹ te¿ transpozo-ny, których transpozycja jest replikacyjna —tzn. po jej zajœciu transpozon obecny jest za-równo w miejscu donorowym, jak i akceptoro-wym. Istniej¹ te¿ transpozony nios¹ce sekwen-cje pozwalaj¹ce na zajœcie innego specyficzne-go rodzaju replikacji, replikacji koniugacyjnej.Takie elementy genetyczne — transpozony ko-niugacyjne (SALYERS i wspó³aut. 1995) orazconstiny (HOCHHUT i wspó³aut. 2000) — po-dobnie jak plazmidy koniugacyjne zdolne s¹ doprzejœcia z jednej komórki do drugiej na dro-dze koniugacji. Intermediatem w tym procesiejest koliœcie zamkniêta cz¹steczka transpozo-nu. Transferowi koniugacyjnemu towarzyszyreplikacja, specyficzna o tyle, ¿e potomnecz¹steczki DNA znajduj¹ siê w dwóch ró¿nychkomórkach.

Koniugacja, obok transformacji i transduk-cji, jest jednym z procesów parap³ciowych, nadrodze których mo¿e dochodziæ do horyzon-talnego transferu genów chromosomalnych.Zwi¹zanie w wyniku rekombinacji genu chro-mosomalnego z niezale¿nym elementem gene-tycznym (plazmidem, wirusem, transpozo-nem), pozwala na przejœcie takiego genu z jed-nej komórki do drugiej. Zwi¹zanie genu chro-mosomalnego z plazmidem mo¿e te¿ mieæ innekonsekwencje: jeœli kopia chromosomalna zo-stanie utracona, wtedy plazmid mo¿e staæ siê

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 255–272

obligatoryjnym symbiontem, a granica miêdzyplazmidem a dodatkowym chromosomemmo¿e byæ arbitralna. Czasem nale¿a³oby mówiæo chromosomie pierwszorzêdowym — tym,który zawiera wiêkszoœæ niezbêdnych komór-ce genów — i o chromosomach drugorzêdo-wych. Istniej¹ gatunki bakterii, które na takichchromosomach drugorzêdowych nios¹ genykoduj¹ce rRNA czy enzymy podstawowe dlametabolizmu komórki (KOLSTO 1997).

Mechanizmy molekularne replikacji wieluplazmidów wykazuj¹ du¿e podobieñstwo domechanizmów wykorzystywanych przez wiru-sy. Niewykluczone jest pochodzenie przynajm-niej niektórych plazmidów od wirusów na dro-dze utraty genów warunkuj¹cych wysok¹ in-wazyjnoœæ, a z drugiej strony — pozyskania ge-nów zapewniaj¹cych tak¹ regulacjê replikacji,¿eby powielenie plazmidowego DNA nie sta³osiê nadmiernym obci¹¿eniem metabolicznymdla gospodarza. Mo¿na sobie wyobraziæ te¿ od-wrotny kierunek rozwoju — od niezale¿nie re-plikuj¹cego fragementu genomu do wysoce in-wazyjnego paso¿yta. Koegzystencja kilku repli-konów (wirusowych, plazmidowych, chromo-somalnych) w jednej komórce stwarza mo¿li-woœæ rekrutacji — na drodze rekombinacji — ge-nów replikacyjnych jednych replikonów przezdrugie. Mo¿na spekulowaæ nawet o rekrutacjipewnych genów replikacyjnych pozochromo-somalnych elementów genetycznych do ma-szynerii replikacyjnej chromosomu (WRÓBEL iWÊGRZYN 2002).

Wysoka liczba kopii cz¹steczek o ma³ychrozmiarach mo¿e nie stanowiæ istotnegoobci¹¿enia metabolicznego dla komórki. Du¿erozmiary niektórych plazmidów s¹ konse-kwencja pozyskiwania genów, które mog¹ wpewnych warunkach daæ gospodarzowi ko-rzystny fenotyp, a tak¿e genów zapew-niaj¹cych stabilne przekazywanie do komórekpotomnych oraz systemów zapewniaj¹cych eli-minacje z populacji komórek potomnych po-zbawionych plazmidu. Im jednak wiêkszy roz-miar plazmidu, tym wiêksza presja selekcyjnado utrzymania niskiej liczby kopii i do jej œcis³ejregulacji.

Obecnoœæ identycznych cz¹steczek kwa-sów nukleinowych w jednej komórce mo¿e

prowadziæ do ich rekombinacji i powstaniacz¹steczek multimerycznych. Mutlimery mog¹te¿ byæ skutkiem samego procesu replikacji.Dla zapewnienia stabilnego dziedziczeniacz¹steczek plazmidów konieczne jest zatempozyskanie przez nie genów pozwalaj¹cych narozdzielenie mutlimerów.

Propagacji plazmidu sprzyja pozyskanie ge-nów koniugacyjnych promuj¹cych zetkniêciesiê komórek i koduj¹cych bia³ka uczestnicz¹cew transferze DNA, a przede wszystkim obec-noœæ na danej cz¹steczce plazmidu specyficznejsekwencji pozwalaj¹cej na mobilizacjê. Jeœlitak¹ sekwencjê niesie cz¹steczka ma³ego pla-zmidu, mo¿e dojœæ do jej transferu z wykorzysta-niem produktów genów koniugacyjnych inne-go plazmidu obecnego w tej samej komórce.

Jakie s¹ konsekwencje istnienia dwóch ten-dencji: do pozyskiwania nowych funkcji i dominimalizowania obci¹¿enia metabolicznego?O ile mo¿na sobie pozwoliæ na jak¹œ generaliza-cjê, wiêksz¹ szansê sukcesu ewolucyjnegomaj¹ albo ma³e cz¹steczki (które mog¹ mieæwysok¹ liczbê kopii), albo du¿e cz¹steczki o ni-skiej liczbie kopii. Cz¹steczki ma³e bêd¹ nios³yg³ównie geny zapewniaj¹cych ich regulowan¹replikacjê (liczba kopii nie mo¿e byæ zbytdu¿a), a przy tym ma³o genów „dodatkowych”:genów, które mo¿na usun¹æ z plazmidu bezzniszczenia jego zdolnoœci do niezale¿negodziedziczenia w komórce. Istniej¹ wrêcz ma³eplazmidy, które wydaj¹ siê nie nieœæ ¿adnychgenów poza replikacyjnymi. Oczywiœcie, geny„dodatkowe” w naturalnym œrodkowisku mog¹byæ niezbêdne dla utrzymania plazmidu w po-pulacji komórek w d³u¿szej perspektywie, a za-tem do jego „prze¿ycia” w szerszym sensie.

Niektóre plazmidy zdolne s¹ na drodze ko-niugacji przechodziæ miêdzy doœæ odleg³ymisystematycznie gospodarzami i do wykorzysta-nia w replikacji enzymów bardzo daleko spo-krewnionych gatunków bakterii. Bywa, ¿edu¿e plazmidy nios¹ kilka sekwencji, w któ-rych mo¿e dojœæ do rozpoczêcia syntezy cz¹ste-czek potomnych (origin replikacji, ori). Wprzypadku niektórych plazmidów o szerokimspektrum gospodarzy ró¿ne origin mog¹ byæwykorzystywane w komórkach ró¿nych gatun-ków (DEL SOLAR i wspó³aut. 1996).

PLAZMIDY W KOMÓRACH EUKARIOTYCZNYCH

Mo¿liwoœæ modyfikacji budowy plazmi-dów z u¿yciem technik in¿ynierii genetycznej

oraz modyfikacji genotypu bakterii technikamigenetyki molekularnej pozwoli³a bardzo

256 BORYS WRÓBEL

dog³êbnie zbadaæ molekularne mechanizmyreplikacji i regulacji liczby kopii wielu plazmi-dów bakteryjnych. Sporo wiadomo równie¿ omechanizmach replikacji plazmidów DNA wy-stêpuj¹cych u grzybów, szczególnie u dro¿d¿y.O wiele mniej wiadomo o plazmidach innegoprostego eukariotycznego organizmu modelo-wego — œluzowca Dictyostelium discoideum.

Wiele szczepów grzybów, w tym dro¿dzy, atak¿e wiele gatunków roœlin niesie równie¿ wkomórkach replikony RNA, które przekazywa-ne s¹ komórkom potomnym. Wydaje siê, ¿e wwielu przypadkach s¹ to „oswojone” genomywirusów RNA (ZHANG i BROWN 1993,MORIYAMA i wspó³aut. 1995, RODRIGUEZ-CO-USINO i wspó³aut. 1998, GIBBS i wspó³aut.2000), które utraci³y zdolnoœæ do przetrwaniapoza komórk¹. To samo byæ mo¿e dotyczy wie-lu cytoplazmatycznych i mitochondrialnychplazmidów DNA grzybów (KEMPKEN iwspó³aut. 1992). Choæ mo¿e liczba kopii tych„oswojonych” wirusów w komórce nie jestœciœle regulowana, nie stanowi¹ one na tylewielkiego obci¹¿enia metablicznego dla go-spodarza, by mog³y zostaæ ³atwo wyeliminowa-ne, mimo ¿e nie wydaj¹ siê nieœæ ¿adnej funkcjikorzystnej dla gospodarza. W przypadku bakte-rii niska stabilnoœæ RNA w komórkach byæmo¿e uniemo¿liwia takie „oswojenie” bakteryj-nych wirusów RNA.

Pozachromosomalne DNA w komórkacheukariotycznych mo¿e te¿ byæ wynikiem „usa-modzielnienia siê” fragmentu DNA mitochon-drialnego (SINCLAIR i wspó³aut. 1998) czy chro-mosomalnego. W komórkach wielu gatunkówprostych eukariontów stwierdzono wystêpo-wanie plazmidów nios¹cych geny dla ryboso-

malnego RNA. W przypadku œluzowca D. disco-

ideum i Physarum polycepalum, wszystkiegeny rRNA niesione s¹ na wielkich liniowychplazmidach; u Entamoeba histolytica wszyst-kie geny rRNA znajduj¹ siê na kolistej cz¹stecz-ce DNA (DHAR i wspó³aut. 1996). By podaæjeszcze dwa przyk³ady, ameby z rodzaju Naegle-

ria nios¹ geny rRNA na kilku kolistychcz¹steczkach, a u patogennego grzyba Candi-

da albicans wystêpuj¹ zarówno liniowe, jak ikoliste plazmidy nios¹ce geny rRNA (HUBER iRUSTCHENKO 2001).

Rejony pozwalaj¹ce na replikacjê dot¹dzbadanych „plazmidów rDNA” zbli¿one s¹ wbudowie do sekwencji replikacyjnych wystê-puj¹cych na chromosomalnym DNA. W przy-padku kilku gatunków tworzenie siê tych poza-chromosomalnych elementów genetycznychzaobserwowano de novo. Wydaje siê, ¿e wpewnych warunkach œrodowiskowych czy roz-wojowych mo¿e byæ korzystna mo¿liwoœæzwiêkszenia liczby genów dla rRNA (SINCLAIR iwspó³aut. 1998) przez zwiêkszenie liczby ko-pii nios¹cych je pozachromosomalnych ele-mentów genetycznych. Co interesuj¹ce, u dro-¿dzy zwiêkszenie liczby kopii takich „plazmi-dów rDNA” jest zwi¹zane ze starzeniem siê ko-mórek (SINCLAIR i wspó³aut. 1998, ROTHSTEIN iGANGLOFF 1999). Ogólnie, u grzybów akumu-lacja pozachromosomalnego kolistego DNAwydaje siê przynosiæ efekty podobne do starze-nia siê komórek. Trudno jeszcze powiedzieæ,czy to zjawisko dotyczy innych eukariontów(w tym ssaków), w komórkach których rów-nie¿ obserwujê siê wystêpowanie takichcz¹steczek (SINCLAIR i wspó³aut. 1998).

REPLIKACJA DNA

Do inicjacji replikacji DNA konieczne jestpo pierwsze utworzenie grupy 3’OH, która bê-dzie mog³a byæ wykorzystywana przez replika-cyjn¹ polimerazê DNA do rozpoczêcia syntezynici potomnej, a po drugie — dostarczenie apa-ratu enzymatycznego niezbêdnego do zajœciareakcji polimeryzacji do miejsca rozpoczêciasyntezy (origin replikacji).

U¿ywane w replikacji polimerazy DNA nies¹ w stanie rozpocz¹æ syntezy kwasu deoksynu-kleinowego z u¿yciem wy³¹cznie wolnych nu-kleotydów. Replikacyjne polimerazy DNA s¹zdolne natomiast do³¹czaæ kolejne nukleotydydo wolnej grupy hydroksylowej. Taka grupa

mo¿e pochodziæ z odcinka RNA (primera, star-tera) zsyntetyzowanego przez polimerazê RNAna nici matrycowej DNA, czy powstaæ po prze-ciêciu jednej z nici dwuniciowego DNA. Ist-niej¹ równie¿ polimerazy DNA, które s¹ w sta-nie wykorzystaæ do rozpoczêcia syntezy DNAwoln¹ grupê OH seryny lub treoniny terminal-nego bia³ka starterowego. Ten ostatni mecha-nizm wykorzystywany jest w replikacji linio-wych cz¹steczek DNA niektórych wirusów iplazmidów oraz w replikacji koñców linio-wych chromosomów niektórych bakterii(HINNEBUSCH i TILLY 1993, VOLFF i ALTEM-BUCHNER 2000).

Replikacja plazmidów 257

„Problem koñców” jest podstawowy dla re-plikacji liniowych cz¹steczek DNA. Jeœli repli-kacja odbywa siê z u¿yciem starterów RNA, tonawet gdyby zosta³y utworzone na samychkoñcach chromosomów, nie ma mo¿liwoœcizsyntetyzowaæ kopii DNA tego fragmentu ma-trycy, do którego jest komplementarny primer.W rezultacie w kolejnych rundach replikacji li-niowe chromosomy replikuj¹ce siê w ten spo-sób ulegaj¹ skróceniu. W komórkach eukario-tycznych obecnoœæ telomerazy, enzymuprzed³u¿aj¹cego koñce chromosomów, zapo-biega ich skracaniu siê przy kolejnych po-dzia³ach komórkowych. Innym sposobem roz-wi¹zania „problemu koñców” jest u¿yciecz¹steczek DNA o kowalencyjnie zamkniêtychkoñcach lub, jak wspomniano wy¿ej, bia³ek ter-minalnych (Ryc. 1).

REPLIKACJA LINIOWYCH CZ¥STECZEK

Plazmidy wykorzystuj¹ce w replikacjibia³ko terminalne wystêpuj¹ zarówno u bakte-rii, jak i grzybów i roœlin (MEINHARDT iwspó³aut. 1990, 1997). Do ich replikacji nie-zbêdna jest obecnoœæ kodowanej przez pla-zmid polimerazy DNA, która mo¿e rozpocz¹æsyntezê z u¿yciem grupy OH seryny lub treoni-ny bia³ka terminalnego (Ryc. 1A). Istniej¹ te¿ li-

niowe plazmidy, których replikacja rozpoczy-nana jest nie z koñców, ale z wnêtrza cz¹stecz-ki. Sama inicjacja przebiega jak inicjacja repli-kacji wed³ug modelu theta (patrz poni¿ej).Konsekwencj¹ rozpoczynania syntezy z wnê-trza cz¹stczki jest jednak „problemem ko-ñców”. Mo¿e on zostaæ rozwi¹zany dziêki wy-korzystaniu bia³ka terminalnego dla replikacjisamych zakoñczeñ. Tak siê dzieje w przypadkuliniowych chromosomów i plazmidów niektó-rych gatunków bakterii, w tym u wielu z rodza-ju Streptomyces (HINNEBUSCH i TILLY 1993,VOLFF i ALTEMBUCHNER 2000). Nie jest jednakdo koñca jasne, czy mimo obecnoœci bia³ek ter-minalnych, proces replikacji tych plazmidówprzebiega z wykorzystaniem bia³ka jako prime-ra do syntezy DNA, czy z u¿yciem innego me-chanizmu (BAO i COHEN 2001).

Innym rozwi¹zaniem zasadniczego proble-mu w replikacji cz¹steczek liniowych jest ko-walencyjne zamkniêcie koñców (HINNEBUSCHi TILLY 1993, VOLFF i ALTEMBUCHNER 2000). Ta-kie plazmidy wystêpuj¹ u grzybów, jeden zo-sta³ te¿ opisany u bakterii Klebsiella oxytoca,wiele — u bakterii z rodzaju Borrelia (CASJENS1999). Nota bene, u Borrelia zazwyczaj rów-nie¿ chromosomy s¹ liniowe.

W istocie liniowa dwuniciowa cz¹steczka ozamkniêtych koñcach jest to¿sama z kolist¹ jed-noniciow¹ cz¹steczk¹ kwasu nukleinowego

258 BORYS WRÓBEL

Ryc. 1. Replikacja liniowych plazmidów.

(A) Replikacja z u¿yciem bia³ka terminalnego (wype³nione elipsy). Zwi¹zanie bia³ka (szare elipsy) do koñcówpozwala na rozpoczêcie syntezy nici potomnych (szare). Po zakoñczeniu replikacji, bia³ka pozostaj¹ zwi¹zane dokoñców 5´ DNA. (B) Replikacja inicjowana ze œrodka cz¹steczki o kowalencyjnie zamkniêtych koñcach prowa-dzi do powstania dwuniciowego kolistego intermediatu, bêd¹cego dimerem dwuniciowych liniowych cz¹ste-czek. Szare strza³ki znacz¹ miejsce rozdzia³u tego dimeru na potomne cz¹steczki liniowe. (C) Niektóre plazmidylinowe z kowalencyjnie zamkniêtymi koñcami koduj¹ bia³ko replikacyjne przecinaj¹ce DNA w pobli¿u koñców.Powsta³a w wyniku naciêcia grupa 3’ OH wykorzystywana jest do rozpoczêcia replikacji. Najpierw syntetyzowa-na jest kopia koñców, co umo¿liwia przemianê strukturaln¹ i zmianê cz¹steczki matrycowej (w œrodku). Syntezaprzebiega a¿ do dojœcia do powsta³ego w analogiczny sposób dwuniciowego rejonu na drugim koñcu.

sk³adaj¹ca siê z dwóch wzajemnie komplemen-tarnych rejonów. Produktem replikacji, inicjo-wanej jak replikacja typu theta (patrz poni¿ej),jest zatem tak¿e kolista cz¹steczka, w którejobie te uprzednio sparowane ze sob¹ po³ówkisparowane s¹ teraz z nici¹ potomn¹. Innymis³owy, produkt jest dimerem dwóch liniowychcz¹steczek potomnych po³¹czonych ze sob¹koñcami, po rozdzieleniu z u¿yciem specjalne-go enzymu produktem s¹ dwa liniowe plazmi-dy o koñcach zamkniêtych. Nie jest do koñca ja-sne, czy w³aœnie ten sposób replikacji wykorzy-stywany jest przez plazmidy i chromosomy Bo-

rellia (HINNEBUSCH i TILLY 1993, CASJENS 1999,VOLFF i ALTEMBUCHNER 2000).

Replikacja linowych cz¹steczk z zamkniêty-mi koñcami niektórych plazmidów (oraz wiru-sów) jest inicjowana poprzez utworzenie wol-nej grupy 3´ OH w wyniku naciêcia DNA wokolicach koñców. Replikacja przebiega naj-pierw a¿ do koñca nienaciêtej nici. Powsta³yfragment jest zatem komplementerny do po-przedzaj¹cego go rejonu na przed³u¿anej nici.Sparowanie tych dwóch rejonów pozwala roz-pocz¹æ syntezê z wykorzystniem jako matrycyprzeciêtej uprzednio nici (Ryc. 1C). Taki w za-rysach model replikacji zaproponowany zosta³w przypadku liniowego plazmidu o kowalen-cyjnie zamkniêtych koñcach wystêpuj¹cego upatogenicznego grzyba Rhizoctonia solani

(MIYASHITA i wspó³aut. 1990).

REPLIKACJA CZ¥STECZEK KOLISTYCH —MECHANIZM THETA

W przypadku kolistych cz¹steczek DNA re-plikacja mo¿e przebiegaæ na jeden z trzech spo-sobów: wed³ug mechanizmu theta, mechani-zmu odrzucenia jednej z nici lub wreszcie wgmechanizmu tocz¹cego siê ko³a (Ryc. 2). Repli-kacja wed³ug mechanizmu theta zosta³a pozna-na najdok³adniej w przypadku kilku plazmi-dów bakterii Gram-ujemnych. Rozpoczyna siêod lokalnego rozplecenia nici rodzicielskich,syntezy starterowego RNA i inicjacji syntezyDNA z u¿yciem tego startera.

Enzymatyczna synteza kwasów nukleino-wych zawsze przebiega w kierunku 5´-3´(przed³u¿any jest koniec 3´). Replikacje typutheta na obu niciach katalizuje jeden kompleksenzymatyczny sk³adaj¹cy siê z dwóch podze-spo³ów enzymów (JACHYMCZYK 1995). Obapodzespo³y syntetyzuj¹ nici potomne w miarêjak kompleks przesuwa siê w stosunku do ma-

trycy, sukcesywnie rozplatanej. W stosunku dojednej nici matrycowej kierunek ruchu kom-pleksu odpowiada kierunkowi syntezy. Jednaniæ potomna, tzw. prowadz¹ca, powstaje za-tem w sposób ci¹g³y. Synteza drugiej musi byæprzerywana (jest to niæ opóŸniona), gdy¿ w sto-sunku do drugiej nici matrycowej kompleks re-plikacyjnych przesuwa siê w kierunku prze-ciwnym (3´-5´). Prawdopodobnie dziêki zapê-tleniu tej nici mo¿e byæ mo¿liwy w stosunkudo niej lokalny ruch polimerazy w kierunku3´-5´. Na zapêtlonej nici matrycowej co chwilêsynteyzowany jest starterowy RNA i rozpoczy-nana jest synteza fragmentu DNA. Po ich wyko-rzystaniu, primery s¹ degradowane, tak wiêcsynteza danego odcinka potomnego DNA ko-ñczy siê po dotarciu do pocz¹tku (koñca 5´)uprzednio powsta³ego fragmentu nici potom-nej. Wtedy nastêpuje translokacja aparatu en-zymatycznego wzglêdem matrycy i rozpoczê-cie syntezy z wykorzystaniem nastêpnego pri-mera.

Replikacja typu theta (DEL SOLAR iwspó³aut. 1998) mo¿e rozpocz¹æ siê z jednegolub kilku origin na tej samej cz¹steczce i mo¿ebyæ jednokierunkowa — kiedy zostaje utworzo-ny tylko jeden kompleks replikacyjny, a zatemreplikacja rozpoczyna siê i koñczy w tym sa-mym rejonie — albo dwukierunkowa, gdy two-rzone s¹ dwa kompleksy i matryca rozplatanajest w dwie przeciwne strony. Gdy cz¹steczkajest kolista, produkty poœrednie replikacji przy-pominaj¹ greck¹ literê theta — st¹d nazwa — alew podobny sposób, jak wspomniano, mo¿eprzebiegaæ replikacja cz¹steczek liniowych.Wed³ug tego mechanizmu replikuj¹ siê zatemnie tylko koliste, ale i liniowe chromosomybakterii, a tak¿e, w istocie, chromosomy orga-nizmów wy¿szych. W ten sposób replikuj¹ siête¿ niektóre plazmidy wystêpuj¹ce w komór-kach eukariotycznych.

Z pewnymi wyj¹tkami, plazmidy bakteryj-ne replikuj¹ce siê z u¿yciem mechanizmu thetanios¹ gen koduj¹cy plazmidowe bia³ko replika-cyjne, bia³ko Rep. Du¿¹ grupê plazmidów repli-kuj¹cych siê weg³ug mechanizmu theta stano-wi¹ tzw. plazmidy iteronowe. Nale¿¹ do tej gru-py np. plazmid p³ciowy F bakterii Escherichia

coli, a tak¿e plazmidy pSC101, RK2 i R6K. Wpobli¿u origin replikacji plazmidów z tej grupyznajduje siê zawsze kilka (zazwyczaj nieiden-tycznych) powtórzeñ charakterystycznej dladanego plazmidu kilku-kilkunastonukleotydo-wej sekwencji. Do tych powtórzeñ — iteronów— wi¹¿e siê kodowane przez plazmid inicjato-

Replikacja plazmidów 259

rowe bia³ko replikacyjne. Bia³ka inicjatoroweró¿nych plazmidów iteronowych wykazuj¹ po-dobieñstwo, co mo¿e sugerowaæ ich wspólnepochodzenie ewolucyjne. Ogólny mechanizmreplikacji plazmidów iteronowych przypomi-na te¿, nota bene, mechanizm inicjacji replika-cji chromosomu bakteryjnego: w pobli¿u bak-teryjnego origin replikacji znajduj¹ siê powtó-rzenia pozwalaj¹ce na zwi¹zanie siê bia³ka ini-cjatorowego chromosomalnej replikacji —bia³ka DnaA.

W okolicy iteronów znajduje siê zazwyczajrejon DNA bogaty w pary A-T, gdzie dochodzido lokalnego rozplecenia nici DNA. To rozple-cenie u³atwione jest równie¿ dziêki ujemnemusuperskrêceniu cz¹steczki plazmidu. Utrzyma-nie ujemnego superskrêcenie DNA (niedobórhelikalnych opleceñ jednej nici DNA wokó³drugiej) w komórce wymaga nak³adu energii.Rozplecenie DNA w jednym miejscu prowadzipoza tym rejonem do wzrostu liczby opleceñ,u³atwionemu dziêki wczeœniejszemu wprowa-

dzeniu ich niedoboru. Zmiana struktury DNApowodowana przez zwi¹zanie bia³ek replika-cyjnych do origin dodatkowo zmniejsza ener-giê konieczn¹ do pocz¹tkowego rozplecenia.

Wiele plazmidów iteronowych w pobli¿uiteronów niesie te¿ sekwencje wi¹¿¹ce bia³koDnaA gospodarza, które mo¿e wspó³uczestni-czyæ z plazmidowym bia³kiem replikacyjnymw wi¹zaniu innych bia³ek gospodarza niezbêd-nych do rozpoczêcia replikacji DNA: helikazy(której funkcj¹ jest dalsze rozplatanie matry-cy), primazy i wreszcie polimerazy DNA. Do-kladny mechanizm molekularny procesu budo-wania kompleksu replikacyjnego jest ró¿ny wszczegó³ach dla ró¿nych plazmidów.

Nie wszystkie plazmidy replikuj¹ce siêwed³ug mechanizmu theta s¹ plazmidami ite-ronowymi. Jeden z dok³adniej zbadanych napoziomie molekularnym plazmidów, plazmidR1, w pobli¿u origin niesie jedynie dwa miej-sca wi¹¿¹ce jego bia³ko inicjacyjne (bia³koRepA). Do tych miejsc, oddalonych od siebie o

260 BORYS WRÓBEL

Ryc. 2. Replikacja plazmidów kolistych.

(A) Model theta. Nici potomne zosta³y zaznaczone na szaro; niæ opó¿niona lini¹ przerywan¹. Gdy replikacja jestjednokierunkowa (po lewej), miejsce origin jest te¿ miejscem zakoñczenia syntezy. W replikacji dwukierunko-wej typu theta (po prawej) synteza koñczy siê w rejone (pogrubione linie) le¿¹cym naprzeciw origin. (B) Repli-kacja wg modelu odsuwanej nici przypomina replikacjê typu theta, ale syntetyzowane s¹ jedynie nici pro-wadz¹ce (szare). (C) Replikacja typu sigma rozpoczynana jest od reakcji transestryfikacji w miejscu dso (dwatrójk¹ty). Pozwala to rozpocz¹æ replikacjê. Najpierw powstaje kopia czêœci dso. Po stworzeniu nici potomnej,synteza jest kontynuowana a¿ powstanie w pe³ni nowa kopia dso (dwa szare trójk¹ty). Teraz mo¿liwe jest zajœcieczterech kolejnych reakcji transestryfikacji. Cztery sekwencje DNA bior¹ce udzia³ w tym procesie przedstawio-ne s¹ na rysunku obok siebie, w kolejnoœci. Wolna grupa OH tyrozyny podjednostki bia³ka replikacyjnego symbo-lizowanej przez czarn¹ elipsê rozcina dso bêd¹ce hybryd¹ starej i nowej nici. Po uwolnieniu koñca 3´starej nicimo¿e zajœæ reakcja bêd¹ca odwróceniem reakcji inicjacyjnej, co prowadzi do zamkniêcia odsuniêtej nici w ko-list¹ cz¹steczkê. W trzeciej reakcji transestryfikacyji rozcinane jest nowozsyntetyzowane miejsce dso (dwa szaretrójk¹ty). Tym samym ta sama podjednostka bia³ka, która wziê³a udzia³ w inicjacji (szara elipsa) zostaje zwi¹zana zkrótkim odcinkiem DNA zsyntetyzowanym na koñcu. W wyniku czwartej reakcji uwalniana jest tyrozyna drugiejpodjednostki (czarna elipsa) i zostaje zamkniêta niæ potomna. Na jednoniciowej matrycy powstaje druga niæ po-tomna po inicjacji w miejscu ssi.

8 skrêtów helisy, wi¹¿e siê kompleks dwóchcz¹steczek RepA. Powoduje to utworzenie pê-tli DNA o rozmiarze oko³o 100 bp, utrzymywa-nej u podstawy przez dimer RepA. Kolejnecz¹steczki bia³ka inicjacyjnego wi¹¿¹ siê w re-jonie pêtli. W zasadzie przypomina to nieco ini-cjacjê replikacji plazmidów iteronowych:wi¹zanie bia³ka inicjacyjnego powoduje po-wstanie zagiêcia DNA, a w pobli¿u znajduje siêsekwencja wi¹¿¹ca bia³ko DnaA i sekwencjabogata w pary AT, gdzie dochodzi do lokalnegorozplecenia nici. DnaA byæ mo¿e wspó³uczest-niczy z RepA w dostarczeniu do origin bia³ekreplikacyjnych gospodarza, podobnie jak to siêdzieje w przypadku plazmidów iteronowych.

Natomiast zupe³nie inny jest mechanizminicjacji replikacji plazmidów o budowie ori-

gin zbli¿onej do origin plazmidu ColE2 E. coli

(TAKECHI i ITOH 1995). Plazmidy te nios¹ genkoduj¹cy bia³ko replikacyjne o aktywnoœci po-limerazy RNA, które rozpoznaje bardzo krótk¹,kilkunastonukleotydow¹, sekwencjê, i syntety-zuje w tym miejscu primer. W innej grupie pla-zmidów, plazmidów podobnych do plazmidupAMβ1 (s¹ to plazmidy o szerokim zakresie go-spodarzy nale¿¹cych do bakterii Gram-dodat-nich), do syntezy startera wykorzystywana jestpolimeraza RNA gospodarza (transkryptaza),natomiast ich plazmidowe bia³ko inicjacyjneprawdopodobnie nacina starter w odpowied-niej pozycji (DEL SOLAR i wspó³aut. 1998).Wreszcie, plazmidy podobne do plazmidu Co-lE1 (wystêpuj¹ce u enterobakterii) w ogóle niewymagaj¹ do replikacji bia³ek kodowanychprzez plazmid: polimeraza RNA gospodarzatworzy, na matrycy plazmidowego DNA, inicja-torowy RNA. Primer powstaje w wyniku naciê-cia cz¹steczki tego RNA przez jedn¹ z RNaz go-spodarza (DEL SOLAR i wspó³aut. 1998).

W przypadku tych trzech grup plazmidówpowstanie primera nie oznacza jeszcze zbudo-wania kompleksu replikacyjnego. Pozwala je-dynie na rozpoczêcie syntezy jedynie nici pro-wadz¹cej, przez komórkow¹ polimerazê DNAzwan¹ polimeraz¹ I. W przypadku plazmiduColE1 synteza z u¿yciem polimerazy I przebie-ga tylko na jednej nici, a¿ ods³oniête zostaniena drugiej nici tzw. miejsce budowania primo-somu (ang. primosome assembly site, pas; miej-sce to te¿ nazywane jest jednoniciowym miej-scem inicjacji, ang. single-strand initiation, ssi).Jest to sekwencja DNA zdolna do wi¹zania ko-mórkowego bia³ka PriA. Zwi¹zanie bia³ka PriAdo DNA pozwala na drodze oddzia³ywañ z in-nymi bia³kami gospodarza na utworzenie w

miejscu pas w³aœciwego kompleksu replikacyj-nego. W pobli¿u pas plazmidy z grupy ColE1nios¹ te¿ miejsce wi¹zania komórkowegobia³ka DnaA, co stwarza alternatywn¹ drogê dowymiany polimeraz i rozpoczêcia syntezy niciopóŸnionej. Sekwencje budowania primoso-mu (ssi) znajduj¹ siê równie¿ w pobli¿u origin

innych plazmidów z grupy ColE2 (gdzie rów-nie¿ prawdopodobnie pozwala na rozpoczêciesyntezy nici opóŸnionej), a tak¿e plazmidu R1 iplazmidów iteronowych, gdzie wydaj¹ siê byæwa¿ne dla powstawania starterów na niciopóŸnionej lub wiod¹cej (NOMURA i wspó³aut.1991).

MECHANIZM ODSUWANEJ NICI

Nie wszystkie plazmidy iteronowe repli-kuj¹ siê wed³ug mechanizmu theta. Bardzo cie-kawy jest mechanizm replikacji plazmidu o sze-rokim spektrum gospodarzy, RSF1010 (HONDAi wspó³aut. 1991). Na replikacjê RSF1010 w ko-mórkach ró¿nych gatunków bakterii byæ mo¿epozwala to, ¿e plazmid ten sam koduje helikazê(RepA) i primazê (RepB). Do jego replikacji niejest zatem konieczne zapewnienie silnego od-dzia³ywania miêdzy bia³kiem wi¹¿¹cym itero-ny a bia³kami gospodarza na pierwszych eta-pach inicjacji replikacji.

Bia³ko inicjatorowe plazmidu RSF1010,RepC, oddzia³ywuje z jednej strony z iterona-mi, a z drugiej prawdopodobnie z RepA, co po-zwala na zwi¹zanie siê tego ostatniego w rejo-nie lokalnego rozplecenia DNA w miejscu bo-gatym w pary A-T w pobli¿u iteronów. Aktyw-noœæ helikazy RepA prowadzi do powiêkszeniajednoniciowych obszarów DNA w rejonie ori-

gin, a dziêki temu do ods³oniêcia rejonów ssi

na obu niciach. Do tych rejonów wi¹¿e siê pla-zmidowa primaza RepB. Do tego etapuw³¹cznie wykorzystywane s¹ jedynie bia³ka ko-dowane przez plazmid. Po zsyntetyzowaniuprimera polimeraza replikacyjna gospodarzarozpoczyna syntezê, ale jedynie nici pro-wadz¹cej. W tym aspekcie replikacja plazmiduRSF1010 przypomina replikacjê liniowych pla-zmidów rozpoczynan¹ z koñców: druga niæ ro-dzicielska pozostaje jednoniciowa, a¿ zrepliku-je j¹ drugi kompleks replikacyjny — ten, któryrozpocz¹³ syntezê w drug¹ stronê. Na margine-sie, wed³ug podobnego mechanizmu repliko-wany jest tak¿e mitochondrialny i chloropla-stowy DNA (JACHYMCZYK 1995).

Replikacja plazmidów 261

MECHANIZM TOCZ¥CEGO SIÊ KO£A

Jak wspomniano wy¿ej, jednym z najbar-dziej istotnych etapów inicjacji replikacji jestutworzenie wolnej grupy OH, koniecznej dorozpoczêcia syntezy potomnej cz¹steczki DNA.W przypadku plazmidów replikuj¹cych siê wgmechanizmu tocz¹cego siê ko³a wolna grupaOH powstaje w wyniku reakcji transestryfika-cji, w której bierze udzia³ kodowane przez pla-zmid bia³ko Rep (DEL SOLAR i wspó³aut. 1998,KHAN 2000). Reakcja zachodzi w obrêbie pla-zmidowej sekwencji dso (ang. double strandorigin). Po zwi¹zaniu Rep w tym rejonie, zosta-je utworzone wi¹zanie fosfodiesterowe miê-dzy grup¹ OH jednej z tyrozyn tego bia³ka aokreœlonym nukleotydem wchodz¹cym wsk³ad sekwencji dso. Synteza nici potomnej roz-poczyna siê od uwolnionej w ten sposób grupy3’OH poprzedzaj¹cego nukleotydu i jest konty-nuowana nieco poza miejsce na komplemen-tarnej do niej nici rodzicielskiej, naprzeciwktórego dosz³o do ciêcia inicjatorowego. Po-wstaje w ten sposób drugi dso (Ryc. 2C). Wmiarê syntezy przeciêta niæ rodzicielska jestodsuwana. Jej koniec 5’ pozostaje przy tymzwi¹zany z bia³kiem inicjatorowym.

Jednym z najdok³adniej poznanych plazmi-dów replikuj¹cych siê wed³ug tego mechani-zmu jest plazmid pT181, wyizolowany z komó-rek Staphylococcus aureus. Bia³ko inicjatoro-we pT181, RepC, buduje dimery. Obie podjed-nostki maj¹ po jednej tyrozynie, która mo¿eulec estryfikacji. Po zsyntetyzowaniu nici po-tomnej do jednej tyrozyny dimeru zwi¹zanajest niæ rodzicielska, ale wolna jest katalitycznatyrozyna drugiej podjednostki. Pozwala to nazajœcie czterech kolejnych reakcji transestryfi-kacji w procesie terminacji replikacji(Ryc. 2C). Pierwsza reakcja zachodzi napo³¹czeniu starej nici z now¹. Ich rozdzieleniepolega na po³¹czeniu tyrozyny drugiej podjed-nostki bia³ka Rep z nowo zsyntetyzowan¹nici¹. Uwolniony koniec 3’ starej nici (ten, odktórego rozpoczê³a siê synteza) mo¿e zostaæ za-tem powi¹zany z koñcem 5’ tej samej rodziciel-skiej cz¹steczki. Jest to ten sam koniec, któryzosta³ zwi¹zany z RepC podczas inicjacji.

Zatem druga reakcja transestryfikacji pole-ga na uwolnieniu tyrozyny podjednostki RepC,która wziê³a udzia³ w inicjacji i zamkniêciu wkolist¹ jednoniciow¹ cz¹steczkê uprzednio od-suniêtej nici rodzicielskiej. Na tym etapie di-mer RepC jest ponownie zwi¹zany jedn¹ z tyro-zyn z DNA, teraz z nici¹ potomn¹, a wolna jest

druga tyrozyna. Mo¿e zajœæ zatem trzecia reak-cja transestryfikacji z wykorzystaniem nowo-zsyntetyzowanego miejsca dso. Czwarta pro-wadzi do zamkniêcia nici potomnej. Dimerbia³ka RepC nie mo¿e zostaæ u¿yty do kolejnejinicjacji, gdy¿ pozostaje zwi¹zany do fragmen-tu DNA pochodz¹cego z przed³u¿enia nici po-tomnej poza miejsce inicjacji. Nota bene, jest tojeden ze sk³adników mechanizmu regulacji re-plikacji tego plazmidu (RASOOLY i RASOOLY1997).

Produktami na tym etapie s¹: dwuniciowakolista cz¹steczka potomna plazmidu — w sk³adktórej wchodzi matrycowa niæ rodzicielska —oraz koliœcie zamkniêta druga niæ macierzysta.Na matrycy tej jednoniciowej cz¹steczki po-wstaje druga niæ potomna, a tym samym drugadwuniciowa cz¹steczka potomna plazmidu.Do zajœcia tej fazy replikacji konieczna jestobecnoœæ jednoniciowego miejsca inicjacji(ang. single strand initiation ssi, inaczej, singlestrand origin, sso). Synteza drugiej nici potom-nej nie mo¿e zostaæ rozpoczêta wczeœniej, jako¿e ssi zostaje ods³oniête dopiero po odsuniêciuprawie ca³ej nici macierzystej.

Do inicjacji z ssi potrzebne s¹ wy³¹czniebia³ka komórkowe (KHAN 2000). W przypadkuniektórych plazmidów replikuj¹cych siêwed³ug mechanizmu tocz¹cego siê ko³a do re-jonu ssi wi¹ze siê ta sama polimeraza RNA go-spodarza, która zaanga¿owana jest w procestranskrypcji. Zsynyntetyzowany przez tran-skryptazê primer wyd³u¿any jest najpierwprzez polimerazê I DNA, a dopiero potemprzez polimerazê replikacyjn¹. Inne plazmidynatomiast wydaj¹ siê zawieraæ rejony ssi, doktórych wi¹¿¹ siê bia³ka primosomalne gospo-darza, w przypadku zatem tych plazmidów pri-mer mo¿e byæ syntetyzowany nie przez tran-skrypcyjn¹ polimerazê RNA, a primazê(SEEGERS i wspó³aut. 1995). Ró¿na zdolnoœæ ssi

ró¿nych plazmidów do rekrutacji aparatu enzy-matycznego ró¿nych gatunków bakterii jest za-sadnicza dla zakresu gospodarzy, w którychdane plazmidy mog¹ wystêpowaæ — ma to za-tem du¿e znaczenie dla procesów horyzontal-nego transferu genów, w tym przenoszenia siêcech opornoœci na antybiotyki.

Mechanizm tocz¹cego siê ko³a wykorzysty-wany jest te¿ przez niekóre plazmidy podczasszczególnego procesu replikacji, jakim jest re-plikacja koniugacyjna (LANKA i WILKINS 1995,LLOSA i wspó³aut. 2002). W procesie koniugacji— procesie parap³ciowym bakterii — a tak¿epodczas szczególnego rodzaju koniugacji, jaki

262 BORYS WRÓBEL

zachodzi miedzy komórkami Agrobacterium ikomórkami roœlinnymi — transferowi mate-ria³u genetycznego z jednej komórki do drugiejtowarzyszy replikacja. Innymi s³owy, po zajœciukoniugacji obie komórki nios¹ materia³, któryuleg³ przekazaniu. Transfer rozpoczyna siê,gdy po zetkniêciu siê os³on dwóch komórek,cz¹steczka DNA zostaje naciêta w komórcedawcy. W miarê jej replikacji w tej¿e komórcewed³ug modelu tocz¹cego siê ko³a, odsuwana

niæ rodzicielska transportowana jest do komór-ki biorcy. Po zakoñczeniu transportu w komór-ce biorcy na tej jednoniciowej matrycy docho-dzi do zbudowania primosomu i zsyntetyzowa-nia nici potomnej. Geny koduj¹ce funkcje istot-ne dla replikacji koniugacyjnej wykazuj¹ ho-mologie do genów replikacyjnych plazmidówreplikuj¹cych siê „wegetatywnie” wed³ug mo-delu tocz¹cego siê ko³a (WATERS i GUINEY1993).

EWOLUCJA MODU£ÓW REPLIKACYJNO-REGULACYJNYCH

Aby nie stanowiæ nadmiernego obci¹¿eniametabolicznego dla komórki, tempo tworzeniapotomnych cz¹steczek plazmidu musi byæ re-gulowane. Zatem, chocia¿ liczba kopii danegoplazmidu w komórce mo¿e zale¿eæ od warun-ków œrodowiskowych, plazmidy nios¹ systemykontrolne, które dziêki pêtlom sprzê¿eniazwrotnego pozwalaj¹ na utrzymanie w sta³ychwarunkach wzrostowych sta³ej liczby kopiiplazmidu na komórkê. U bakterii z zasady loso-wy jest wybór czasteczek, które ulegaj¹ replika-cji dla podwojenia liczby cz¹steczek plazmido-wych z ka¿dym podwojeniem liczby komórek.Negatywna kontrola replikacji i losowy dobórcz¹steczek do powielenia prowadzi do tego, ¿eprzy braku selekcji dwa plazmidy nios¹ce takiesame modu³y regulacyjno-replikacyjne nie s¹ wstanie stabilnie koegzystowaæ w tej samej ko-mórce bakteryjnej. Po wprowadzeniu dwóchplazmidów o bardzo zbli¿onej budowie rejo-nów (modu³ów) replikacyjnych dojdzie z cza-sem do ich segregacji w populacji komórek go-spodarza — powstan¹ dwie linie komórkowe, zktórych ka¿da bêdzie nios³a inny plazmid. Tozjawisko nazywa siê niekompatybilnoœci¹ (nie-

zgodnoœci¹) plazmidów, a plazmidy o du¿ympodobieñstwie sekwencji replikacyjnych i re-gulacyjnych tworz¹ grupy niekompatybilno-œci. Warto zauwa¿yæ, ¿e do niekompatybilnoœciplazmidów mo¿e te¿ prowadziæ wysokie podo-bieñstwo innych rejonów, np. rejonów roz-dzia³u kopii plazmidowych.

Jednak mo¿na sobie wyobraziæ, ¿e w sytu-acji presji selekcyjnej na utrzymanie obu pla-zmidów w jednej komórce korzystne ewolu-cyjnie bêd¹ takie zmiany w sekwencjach ko-duj¹cych bia³ka replikacyjne i regulacyjneoraz w sekwencjach, które te bia³ka wi¹¿¹,¿eby przy zachowaniu funkcjonalnoœcimodu³ów replikacja obu plazmidów by³a re-gulowana niezale¿nie. Taki mechanizm ewo-lucyjny mo¿e prowadziæ do utworzenia grupyplazmidów o podobnej budowie rejonów re-plikacyjnych i zbli¿onym sposobie regulacjireplikacji, ale niestanowi¹cych grupy niekom-patybilnoœci. Takie grupy podobnych plazmi-dów tworz¹ np. plazmidy ColE1-podobne czyColE2-podobne. Jak wspomniano byæ mo¿ewspólne pochodzenie ewolucyjne maj¹ te¿plazmidy iteronowe.

REGULACJA LICZBY KOPII PLAZMIDÓW W KOMÓRKACH BAKTERYJNYCH

¯eby zachowaæ okreœlone stê¿enie w ko-mórce, plazmidy musz¹ mieæ mechanizmy po-zwalaj¹ce im „zmierzyæ” w³asne stê¿enie. Ta-kim mechanizmem w przypadku poznanychdo tej pory plazmidów jest synteza inhibitora,którego stê¿enie w komórce zale¿y od stê¿eniaplazmidu. Dotychczas poznano dwa typy regu-lacji inicjacji replikacji plazmidowego DNA wkomórkach prokariotycznych przez inhibito-ry: mechanizm wykorzystuj¹cy antysensownyRNA i ewentualnie bia³ko inhibitorowe (DELSOLAR i ESPINOSA 2000) oraz mechanizm, w

którym inhibitorami s¹ iterony (CHATTORAJ2000).

KONTROLA REPLIKACJI PLAZMIDÓWKODUJ¥CYCH ANTYSENSOWNY RNA

Systemy kontroli inicjacji replikacji oparteo antysens (DEL SOLAR i ESPINOSA 2000) s¹ sze-roko wykorzystywane przez plazmidy o ró¿-nym mechanizmie replikacji, ale wykazuj¹cychpodobn¹ w zarysach strukturê rejonu regula-

Replikacja plazmidów 263

cyjnego: dwa skierowane w przeciwne stronypromotory reguluj¹ce syntezê, w jedn¹ stronê— RNA, którego synteza jest niezbêdna do zajœ-cia replikacji (RNA inicjatorowego) — i wdrug¹, na matrycy drugiej nici DNA — RNA zwa-nego kontrtranskrybowanym albo antysen-sownym RNA (ctRNA, asRNA). Konsekwencj¹komplementarnoœci matryc jest komplemen-tarnoœæ produktów transkrypcji, a tym samymmo¿liwoœæ ich oddzia³ywania.

Wa¿ne jest przy tym, ¿eby synteza ctRNA za-chodzi³a stale i na znacznie wy¿szym poziomieni¿ synteza RNA inicjatorowego — RNA, z któ-rego powstaje primer albo na matrycy któregopowstaje bia³ko replikacyjne. Okres pó³trwa-nia w komórce ctRNA musi byæ te¿ niski, abyjego stê¿enie w komórce by³o proporcjonalnedo stê¿enia plazmidu.

W jaki sposób dochodzi do zahamowaniareplikacji na skutek dzia³ania ctRNA? W przy-padku plazmidów ColE1-podobnych, od-dzia³ywanie antysensownego RNA z RNA ini-cjatorowym powoduje tak¹ zmianê strukturytego ostatniego, ¿e nie mo¿e ju¿ zostaæ prze-kszta³cony w primer. W przypadku innych pla-zmidów ctRNA oddzia³uje z RNA matrycowymdla powstania bia³ka inicjatorowego i hamujejego translacjê. Tu nale¿¹ np. plazmidy z grupyColE2 oraz plazmidy podobne do R1. Powsta-wanie bia³ka replikacyjnego mo¿e zostaæ zaha-mowane na skutek indukcji degradacji tegoRNA przez komórkowe RNazy (plazmid R1)czy poprzez zablokowanie miejsc wa¿nych dlazwi¹zania rybosomu (plazmidy ColE2). Innysposób regulacji powstawania inicjatora za-chodzi w przypadku replikuj¹cego siê wed³ugmechanizmu tocz¹cego siê ko³a plazmidupT181. Tu oddzia³ywanie ctRNA z rejonem napocz¹tku RNA matrycowego dla bia³ka replika-cyjnego prowadzi do powstania elementustrukturalnego powoduj¹cego zakoñczenietranskrypcji i tym samym powstanie krótszej,niefunkcjonalnej matrycy.

Plazmidy podobne do R1 i ColE1 opróczctRNA koduj¹ te¿ bia³ka inhibitorowe. W przy-padku plazmidu R1 bia³ko inhibitorowe (CopB)ogranicza transkrypcjê genu rep. Czêœæ plazmi-dów ColE1-podobnych koduje natomiast bia³ko(nazwane Rom) zwiêkszaj¹ce wydajnoœæ od-dzia³ywania RNA inhibitorowego i RNA inicjato-rowego. W przypadku obu tych plazmidówbia³ka inhibitorowe nie s¹ zasadniczym elemen-tem reguluj¹cym, na co wskazuj¹ matematycznemodele bior¹ce pod uwagê stê¿enia obu inhibi-torów (RNA i bia³ka) w komórkach nios¹cych te

plazmidy. Zaproponowano natomiast, ¿e ta do-datkowa pêtla regulacyjna mo¿e odgrywaæ rolê,gdy liczba kopii plazmidów w komórce z jakichœpowodów spada — albo jest niska bezpoœredniopo wnikniêciu cz¹steczki plazmidu do komórki.W takich warunkach wa¿ne jest chwilowe zwiê-kszenie tempa inicjacji replikacji. Byæ mo¿e do-datkowe pêtle regulacyjne odgrywaj¹ te¿ rolê wdostosowaniu liczby kopii plazmidów do warun-ków wzrostowych komórek. Tak siê dzieje praw-dopowodbnie w przypadku plazmidów ColE1-podobnych. Stanowi¹ one wiêksze obci¹¿eniemetaboliczne dla komórek rosn¹cych w ubogiejpo¿ywce po usuniêciu genu koduj¹cego Rom(ATLUNG i wspó³aut. 1999).

Istniej¹ jednak plazmidy koduj¹ce bia³koweregulatory odgrywaj¹ce zasadnicz¹ rolê w regu-lacji. Jaka jest ró¿nica miêdzy systemami oparty-mi g³ównie na ctRNA, a tymi, w których rolê re-gulacyjn¹ spe³nia zarówno RNA, jak i bia³ko ? Wpierwszym systemie, RNA inicjatorowe jest syn-tetyzowane stale, na niskim poziomie w porów-naniu z syntez¹ ctRNA. Inaczej jest w regulacjireplikacji plazmidów podobnych do plazmidupMV158, a tak¿e w replikacji grupy plazmidówzbli¿onych w budowie do pIP501 (DEL SOLAR iESPINOSA 2000). Tu synteza matrycy dla bia³kainicjatorowego zachodzi z silnego promotora ijest pod negatywn¹ kontrol¹ plazmidowegobia³ka regulacyjnego. W sytuacji, gdy poziomtego bia³ka jest niski (np. po wnikniêciu plazmi-du do komórki na drodze koniugacji), zniesie-nie negatywnej kontroli syntezy Rep pozwalana szybkie osi¹gniêcie charakterystycznej dladanego plazmidu liczby kopii. Warto zauwa¿yæ,¿e plazmidy podobne do pMV158 i pIP501 s¹plazmidami o bardzo szerokim spektrum go-spodarzy i s¹ zdolne do mobilizacji, tzn. chocia¿same nie koduj¹ bia³ek koniecznych dla koniu-gacji, w obecnoœæi innego plazmidu który je ko-duje, mog¹ ulec transferowi (DEL SOLAR iESPINOSA 2000).

KONTROLA PRZEZ ITERONY

Plazmidy iteronowe nios¹ zwykle dodatko-we iterony w pobli¿u promotora genu rep. Po-zwala to na autoregulacjê poziomu bia³ka Repw komórce na poziomie transkrypcji. W przy-padku niektórych plazmidów, te same iteronyodgrywaj¹ rolê w inicjacji replikacji oraz regu-lacji transkrypcji genu rep. Bia³ko Rep innychplazmidów mo¿e wystêpowaæ w dwóch for-mach: w jednej wi¹¿e iterony „replikacyjne”, a

264 BORYS WRÓBEL

w drugiej te w pobli¿u promotora rep. Naprzyk³ad Rep plazmidu F i pSC101 tworzy di-mery i w tej formie preferencyjnie wi¹¿e itero-ny w pobli¿u w³asnego genu. ¯eby mo¿liweby³o zwi¹zanie siê w rejonie origin potrzebnyjest rozpad dimerów na podjednostki(CHATTORAJ 2000).

Zdolnoœæ Rep do dimeryzacji pozwala nietylko na ograniczenie jego nadmiernej syntezy,ale przede wszystkim, na regulacjê liczby kopiiprzez kajdankowanie (ang. handcuffing). Wprocesie tym regulacyjn¹ rolê spe³nia stê¿enieiteronów w komórce. Wprowadzenie dodatko-wych iteronów, czy to na innym plazmidzie,czy to nawet na tym samym, ale poza rejonemreplikacyjnym, prowadzi do spadku liczby ko-pii. Stê¿enie bia³ka Rep nie jest limituj¹ce wprzypadku wielu plazmidów iteronowych, takwiêc dodatkowe iterony nie dzia³aj¹ hamuj¹cona replikacjê po prostu wymiareczkowuj¹cbia³ko inicjacyjne. Wydaje siê raczej, ¿e kiedywzrasta liczba kopii plazmidów, cz¹steczkibia³ka Rep zwi¹zane do jednego rejonu replika-cyjnego oddzia³uj¹ z cz¹steczkami zwi¹zanymido origin drugiego plazmidu. Prowadzi to dosparowania dwóch cz¹steczek plazmidu

(utworzenia struktury kajdanek) i do zahamo-wania replikacji obu cz¹steczek plazmido-wych. Zahamowana jest przy tym tak¿e tran-skrypcja genu rep na skutek autoregulacji. Do-piero powiêkszenie objêtoœci komórki pozwa-la na rozpad kajdanek. Po inicjacji replikacji do-chodzi do odwi¹zania bia³ka Rep od iteronów ido czasowej indukcji genu rep. Zwi¹zaniebia³ka Rep do obu origin prowadzi jednakszybko do zahamowania transkrypcji i ponow-nego utworzenia kajdanek. Innymi s³owy, Repjest pozytywnym regulatorem replikacji jedy-nie przy stê¿eniu iteronów ni¿szym ni¿ opty-malne dla danego plazmidu.

Nie jest jasne, w jaki sposób kajdankowaniehamuje replikacjê. Byc mo¿e utworzenie struk-tury kajdanek zapobiega utworzeniu w miejscuorigin kompleksu inicjacyjnego. W przypadkuniekórych plazmidów wy¿sze stê¿ênie komór-kowych bia³ek DnaA czy DnaB (helikazy) od-wraca efekt kajdankowania, byæ mo¿e zwiêk-szaj¹c szanse raczej na powstanie kompleksuinicjacyjnego replikacji ni¿ struktury kajdanek.Zwiêkszyæ szansê utworzenia kompleksu repli-kacyjnego mo¿e te¿ zwiêkszenie ujemnego su-perskrêcenia plazmidowego DNA.

REGULACJA REPLIKACJI PLAZMIDÓW EUKARIOTYCZNYCH

Gdy liczba kopii plazmidu jest niska w ko-mórce — czy to na skutek nierównomiernegorozdzia³u cz¹steczek potomnych plazmidu dokomórek potomnych, czy to bezpoœrednio pownikniêciu jednej cz¹steczki plazmidu do ko-mórki — regulacja replikacji plazmidu niezale-¿nie od regulacji replikacji DNA chromosomal-nego pozwala zwiêkszyæ wydajnoœæ inicjacji.Ale czêœæ plazmidów eukariotycznych wyko-rzystuje origin replikacji o budowie zbli¿onejdo origin chromosomalnych. Na przyk³ad pla-zmidy dro¿d¿owe, podobne do plazmidu 2�nios¹ sekwencje przypominaj¹ce origin dro-¿dzowe (ang. autonomous replicating sequen-ces, ARS). ARS s¹ aktywne jedynie podczas fazyS cyklu komórkowego, i w ten sposób zapew-niaj¹ jednokrotn¹ replikacjê chromosomów.Origin replikacji plazmidów podobnych do 2�równie¿ s¹ aktywne tylko raz podczas cyklu ko-mórkowego (FARRAR i WILLIAMS 1988).

Oprócz origin plazmid 2� niesie 4 geny ko-duj¹ce bia³ka (Ryc. 3A). Dwa z nich, REP1 iREP2, wi¹¿¹ prawdopodobnie otoczkê j¹drakomórkowego oraz plazmidowe DNA w tzw.rejonie STB, le¿¹cym miêdzy trzecim genem,

RAF a origin. System REP1-REP2-STB jest nie-zbêdny do prawid³owego przekazywania pla-zmidu do komórek potomnych, niemniej niejest to system doskona³y. Jako ¿e origin replika-cji jest aktywne tylko raz w cyklu, nierówno-mierny rozdzia³ cz¹steczek plazmidu prowadzido sta³ego obni¿ania siê liczby kopii w czêœci li-nii komórek potomnych.

Na przywrócenie wysokiej liczby kopii(oko³o 100 na komórkê) pozwala kodowanaprzez czwarty gen plazmidu 2� rekombinazaFLP. Bia³ko to wi¹¿e siê z dwoma rejonamiobecnymi na plazmidzie, podobnymi w se-kwencji. Jedno z tych miejsc znajduje siê w po-bli¿u origin, miêdzy genami RAF a REP2, dru-gie zaœ w rejonie miêdzy genami FLP i REP1(Ryc. 3A). Po zajœciu inicjacji dwukierunkowejreplikacji w rejonie origin bia³ko FLP katalizujereakcjê rekombinacji miêdzy swoimi miejsca-mi wi¹zania. Badania sugeruj¹, ¿e katalizowanaprzez FLP rekombinacja zachodzi w dimerze,powsta³ym podczas replikacji albo na skutekwczeœniejszej rekombinacji miêdzy dwomacz¹steczkami plazmidu (Ryc. 3B). Rekombina-cja wewn¹trz¹steczkowa w replikuj¹cym di-

Replikacja plazmidów 265

merze doprowadza do powstania tzw. struktu-ry „pince-nez” (PETES i WILLIAMSON 1994). Dal-sza replikacja cz¹steczki o tej strukurze prowa-dzi do przed³u¿enia obecnego w niej liniowe-go ³¹cznika (Ryc. 3B), przy czym kolejne reak-cje rekombinacji pozwalaj¹ na utworzenie po-tomnych kolistych cz¹steczek plazmidu.

FLP znajduje siê pod negatywn¹ kontrol¹REP1 i REP2, które wi¹¿¹ plazmidowe DNArównie¿ w innych rejonach ni¿ STB i na tej dro-dze powoduj¹ zahamowanie transkrypcji pla-zmidowych genów (FARRAR i WILLIAMS 1988,VAN DER SAND i wspó³aut. 1995), a tak¿e byæ

mo¿e blokuj¹ miejsca wi¹zania bia³ka FLP ogra-niczaj¹c mo¿liwoœæ rekombinacji. Wed³ugtego modelu regulacji, dopiero znacz¹cy spa-dek liczby kopii plazmidu powoduje, ¿e rejonSTB zostaje przynajmniej czêœciowo uwolnio-ny od bia³ek REP1 i REP2, co powoduje aktywa-cjê znajduj¹cego siê w pobli¿u genu RAF.Bia³ko RAF jest pozytywnym regulatorem tran-skrypcji genu FLP (VAN DER SAND i wspó³aut.1995). Po zajœciu amplifikacji plazmidu, wzrostliczby kopii matrycy powoduje wzrost stê¿eniaREP1 i REP2 w komórce i ponowne zahamowa-nie transkrypcji plazmidowych genów.

266 BORYS WRÓBEL

Ryc. 3. Replikacja plazmidu 2µ.

(A) Rejony koduj¹ce bia³ka plazmidu zosta³y zaznaczone czarnymi strza³kami. Zaznaczony zosta³ te¿ rejon STBoraz IR — odwróconych powtorzeñ (inverted repeats), miejsc rekombinacji, z których jedno le¿y w pobli¿u ori-

gin. Dziêki takiemu usytuowaniu, rekombinacja z udzia³em IR, która pozwoli na amplifikacjê plazmidu (panel B),mo¿e zajœc wkrótce po inicjacji replikacji dimeru plazmidowego. Na panelu (B) IR zaznaczono jako grotystrza³ek, ich kolory odpowiadaj¹ kolorom IR macierzystych dla rekombinacji lub replikacji w poprzednich eta-pach. Miejsca syntezy DNA zaznaczone zosta³y otwartymi trójk¹tami. W miarê wyd³u¿ania liniowego ³¹cznika wstrukturze „pince-nez” (PN) powstaj¹ nowe powtórzenia. Skutkiem zachodzenia rekombinacji z ich udzia³emjest powstawanie kolejnych cz¹steczek potomnych, a wiêc amplifikacja plazmidu mimo braku inicjacji. StrukturaPN za ka¿dym razem mo¿e zostaæ odtworzona, z krótszym ³¹cznikiem. (wg PETESA i WILLIAMSONA 1994)

Plazmid 2µ jest w³aœciwie jedynym plazmi-dem eukariotycznym, którego regulacja repli-kacji zosta³a dok³adniej zbadana. Jego obec-noœæ stwierdzono w wiêkszoœci szczepów dro-¿dzy piekarskich (FARRAR i WILLIAMS 1988), coœwiadczy o skutecznoœci ewolucyjnej tego spo-sobu replikacji. Warto nadmieniæ, ¿e obecnoœæ2µ nie daje tym szczepom ¿adnej przewagi se-lekcyjnej, a wrêcz przeciwnie — ograniczawzrost komórek. W komórkach innych gatun-ków dro¿d¿y (BLAISONNEAU i wspó³aut. 1997)równie¿ zosta³y znalezione koliste cz¹steczkiDNA o podobnej budowie — wszystkie nios¹sekwencje ARS, a tak¿e dwa rejony o zbli¿onejsekwencji, które mog¹ braæ udzia³ w rekombi-nacji, oraz 3–4 rejony koduj¹ce bia³ka. Zawszejedno z tych bia³ek wykazuje podobienstwo dorekombinazy FLP plazmidu 2µ.

Badania przesiewowe doprowadzi³y dostwierdzenia obecnoœci pozachromosomal-nych elementów genetycznych u oko³o 10%przebadanych szczepów dro¿d¿y (FUKUHARA1995). Du¿¹ grupê tych elementów stanowi¹plazmidy RNA. Otrzymane wyniki sugeruj¹równie¿ obecnoœæ w wielu szczepach dro¿d¿yliniowych plazmidów replikuj¹cych siê z u¿y-ciem bia³ek terminalnych. U dro¿d¿y te linio-we plazmidy znajduj¹ siê prawdopodobnie wcytoplazmie, chocia¿ doniesiono te¿ o linio-wym mitochondrialnym plazmidzie dro¿d¿-owym (BLAISONNEAU i wspó³aut. 1999). Nato-miast u grzybów nitkowatych, przeciwnie, pra-wie wszystkie wykryte do tej pory plazmidywystêpuj¹ w mitochondriach (GRIFFITHS 1995;MEINHARDT i wspó³aut. 1990, 1997), a przy tymobecnoœæ tych plazmidów jest powszechna.Liczba kopii tych plazmidów jest w zasadziesta³a w stosunku do liczby mitochondriów i zregu³y s¹ stabilnie dziedziczone — nie s¹ jednakznane dok³adne mechanizmy molekularne,dziêki którym replikacja jest regulowana i za-pewniany jest nielosowy rozdzia³ cz¹steczekpotomnych (GRIFFITHS 1995).

W wiêkszoœci przypadków koñce linio-wych plazmidów grzybów nitkowatych s¹zwi¹zane z bia³kiem, chocia¿ u jednego z gatun-ków wykryto równie¿, jak wspomniano, obec-noœæ liniowego plazmidu z kowalencyjnie za-mkniêtymi koñcami (Ryc. 1C). U innych grzy-bów niktowatych wystêpuj¹ plazmidy koliste(GRIFFITHS 1995). Mechanizm ich replikacjinie jest jasny. Niektóre, byæ mo¿e replikuj¹ siêwed³ug modelu tocz¹cego siê ko³a, obecnoœæczasem genu odwrotnej transkryptazy zaœ su-geruje, ¿e podczas replikacji nios¹cych go pla-

zmidów dochodzi najpierw do przepisania in-formacji genetycznej na RNA, a pó¿niej, w wy-niku odwrotnej tranksrypcji, tworzone s¹ po-tomne cz¹steczki DNA. Nie jest wykluczone, ¿ewiêkszoœæ plazmidów grzybowych (RNA iDNA, liniowych i kolistych) pochodzi z „oswo-jonych” wirusów.

Pozostaje pytanie, dlaczego plazmidy s¹ takczêsto obecne w izolatach grzybów. W warun-kach laboratoryjnych, jeœli obserwuje siê jakiœzwi¹zany z ich obecnoœci¹ fenotyp, raczej wy-daj¹ siê przynosiæ wiêcej szkody ni¿ po¿ytku.Przede wszystkim powoduj¹ szybsze starzeniesiê komórek, chocia¿ znany jest te¿ plazmid,który wydaje siê dawaæ fenotyp przeciwny —przed³u¿enia ¿ycia (GRIFFITHS 1995). Mo¿liwe,¿e plazmidy przynosz¹ nios¹cym je szczepomkorzyœæ selekcyjn¹ w naturalnym œrodowisku.Wysuniêto np. hipotezê, ¿e ich obecnoœæ jest wjakiœ sposób zwi¹zana z w³aœciwoœciami pato-genicznymi grzybów paso¿ytniczych (GRI-FFITHS 1995).

Jak wykazano, plazmidy u Neurospora s¹przenoszone horyzontalnie (GRIFFITHS iwspó³aut. 1990, COLLINS i SAVILLE 1990). Z dru-giej strony, podczas rozmna¿ania p³ciowegomog¹ zostaæ utracone (ARAGANOZA i wspó³aut.1994, GRIFFITHS 1995). Byæ mo¿e „oswojonewirusy” obni¿aj¹ podatnoœæ szczepówrosn¹cych w naturalnych warunkach na bar-dziej wirulentne elementy pozochromosomal-ne (plazmidy czy wirusy), w mechanizmie po-dobnym do niekompatybilnoœci plazmidówbakteryjnych. Jest to zgodne z obserwacj¹, ¿eplazmidy z tej samej rodziny nie wystêpuj¹ wtych samych izolatach. Równoczeœnie, jeœli„oswojony” element okaza³by siê bardzo nieko-rzystny, mo¿liwa by³aby jego eliminacja pod-czas rozwoju p³ciowego.

Wirusowe pochodzenie maj¹ te¿ byæ mo¿ej¹drowe plazmidy wystêpuj¹ce u œluzowców zrodzaju Dictyostelium (LEITING i wspó³aut.1990). Liczba kopii ma³ych plazmidów œlu-zowców dochodzi do 300 na komórkê, wiêk-sze maj¹ mniejsz¹ liczbê kopii, ale mog¹ stano-wiæ 2–5% ca³kowitego DNA w komórkach(FARRAR i WILLIAMS 1988, SHAMMAT iwspó³aut. 1998). Z czterech do tej pory grupplazmidów scharakteryzowanych u tych orga-nizmów (Ddp1, Ddp2, Dpp1 i Dpp3) najlepiejzosta³a poznana grupa plazmidów podobnychdo Ddp2 (SHAMMAT i wspó³aut. 1998,GONZALES i wspó³aut. 1999). Z jednym pozna-nym wyj¹tkiem, nios¹ one tylko jeden gen, na-zwany rep, chocia¿ wydaje siê, ¿e jego produkt

Replikacja plazmidów 267

odgrywa rolê raczej nie bezpoœrednio w repli-kacji, ale w regulacji transkrypcji i w regulacjiliczby kopii (SHAMMAT i wspó³aut. 1998).Równie¿ geny niesione przez plazmid Ddp1nie wydaj¹ siê odgrywaæ roli bezpoœrednio w

replikacji, czêœæ z nich jest istotna jednak doregulacji liczby kopii dla utrzymania siê pla-zmidu w komórce (RIEBEN i wspó³aut. 1998) —plazmidy Dictyostelium s¹ bardzo stabilniedziedziczone.

WYKORZYSTANIE PLAZMIDÓW REPLIKACYJNYCH W TRANSFERZE GENÓW DOORGANIZMÓW WY¯SZYCH

Wprowadzanie transgenu na samodzielniereplikuj¹cej siê cz¹steczce DNA jest najczêst-szym sposobem modyfikacji genetycznej mi-kroorganimów. Co prawda, czasem celowowprowadza siê do komórek danego gatunkuplazmidy niezdolne do replikacji w tych akuratkomórkach. Celem wówczas jest rekombinacjado chromosomu gospodarza. Takie konstruktynazywane s¹ integracyjnymi. W przypadkubakterii, najczêsciej wykorzystywane biotech-nologicznie s¹ plazmidy nios¹ce origin po-chodz¹ce z plazmidów z grupy ColE1, choc cza-sem wykorzystuje siê te¿ plazmidy iteronowe(np. pSC101 czy RK2). Plazmidy oparte na re-plikonie 2µ s¹ najszerzej wykorzystywanymi wprzemyœle biotechnologicznym wielokopijny-mi wektorami dro¿d¿y S. cerevisiae (VAN DERSAND i wspó³aut. 1995, LUDWIG i BRUSCHI1991).

Plazmidy wykorzystuje siê równie¿ do bio-technologicznego i terapeutycznego transferugenów do organizmów wy¿szych. W przypad-ku wiêkszoœci zastosowañ, plazmidowe DNAniesie wy³¹cznie sekwencje pozwalaj¹ce na ichreplikacjê w komórkach bakteryjnych, zaœ pownikniêciu do komórek roœlinnych i zwierzê-cych materia³ genetyczny albo ulega integracjido chromosomu gospodarza, albo stopniowejeliminacji. Jedynie w niektórych tkankachzwierzêcych, szczególnie w tkance miêœnio-wej, plazmidowy DNA pozbawiony zdolnoœcido replikacji mo¿e siê utrzymywaæ przez kilkamiesiêcy (HARTIKKA i wspó³aut. 1996). Niezawsze zreszt¹ celem terapeutycznego transfe-ru genów jest d³ugotrwa³e utrzymywaniewprowadzanego materia³u genetycznego wkomórkach. Jednym z zastosowañ plazmidówprodukowanych w bakteriach jako wektorówdo organizmów wy¿szych jest technika szcze-pionek DNA. Istotna jest tu jedynie czasowa,wysoka ekspresja wprowadzanych genów dlauzyskania odpowiedzi immunologicznej. W in-nych zastosowaniach, np. w terapii chorób ge-netycznych, spowodowanych brakiem okre-œlonego bia³ka w komórkach, d¹¿y siê do utrzy-mania ekspresji jak najd³u¿ej. Jednym z propo-

nowanych sposobów na jej zapewnienie jestzastosowanie plazmidów, które zdolne by by³ydo replikacji równie¿ w docelowych komór-kach zwierzêcych.

Pozachromosomalne wektory replikacyj-ne, wed³ug ich proponentów, maj¹ przynajm-niej trzy zalety. Po pierwsze, w przeciwien-stwie do wektorów integracyjnych (nios¹cychczêsto sekwencje czy geny sprzyjaj¹cych zajœ-ciu rekombinacji), wprowadzenie konstruk-tów replikacyjnych niesie mniejsze ryzyko in-tegracji do jakiegoœ wa¿nego rejonu chromoso-mu. Warto zauwa¿yæ te¿, ¿e integracja do chro-mosomu mo¿e mieæ niekorzystne konsekwen-cje dla regulacji wprowadzanych genów. Iwreszcie, mo¿liwoœæ zwiêkszenia liczby kopiiwprowadzanego plazmidu (i jej regulacji)mog³aby pozwoliæ na osi¹gniêcie nie tylko sta-bilnej, ale te¿ wysokiej ekspresji.

Jednymi z pierwszych wektorów stosowa-nych do wprowadzenia genów do komórekzwierzêcych by³y wektory nios¹ce sekwencjereplikacyjne pochodz¹ce z polyomawirusaSV40 (CRAENENBROECK i wspó³aut. 2000).Sztuczne plazmidy nios¹ce replikon SV40 re-plikuj¹ siê jednak w sposób niekontrolowany,co prowadzi do œmierci komórek. Wykorzystu-je siê je do osi¹gniêcia wysokiej, czasowej eks-presji wprowadzanych genów w hodowanychkomórkach. Genomy poliomawirusów, opróczgenów koduj¹cych bia³ka otoczki wirusowej,koduj¹ te¿ bia³ko niezbêdne do replikacji —zwane du¿ym antygenem T. To wirusowebia³ko replikacyjne po zwi¹zaniu siê w pobli¿uorigin powoduje rozplecenie nici w rejoniebogatym w pary A-T. Antygen T wi¹¿e siê te¿ zbia³kiem RPA gospodarza, które stabilizuje jed-noniciowe odcinki DNA powstaj¹ce w wynikuaktywnoœci helikazy. W kolejnym etapie inicja-cji do wirusowego DNA wi¹¿e siê primaza go-spodarza. Koniecznoœæ oddzia³ywanie du¿egoantygenu T z primaz¹ gospodarza jest prawdo-podobnie czynnikiem ograniczaj¹cym spek-trum gospodarzy polyomawirusów.

W przeciwieñstwie do plazmidów nio-s¹cych modu³ replikacyjny SV40, plazmidy

268 BORYS WRÓBEL

nios¹ce sekwencje ludzkiego polyomawirusaBKV wydaj¹ siê replikowaæ tylko jeden raz pod-czas cyklu komórkowego. Byæ mo¿e zatemznajd¹ zastosowanie w otrzymywaniu stabilniezmodyfikowanych genetycznie linii komórko-wych. Podobne zastosowanie zaproponowanodla wektorów nios¹cych sekwencje replikacyj-ne mysiego wirusa polyoma (CAMENISCH iwspó³aut. 1996). Fakt, ¿e obecnoœæ antygenu Tw komórkach mo¿e u³atwiaæ ich transformacjenowotworow¹ ogranicza jednak zastosowaniawektorów opartych na polyomawirusach docelów terapeutycznych.

Historycznie, polyomawirusy by³y grupo-wane w rodzinê papovawirusów razem z papil-lomawirusami, z którymi s¹ prawdopodobniedaleko spokrewnione ewolucyjnie (SHADAL iVILLARREAL 1993, BELNAP i wspó³aut. 1996).Jednym z przedstawicieli papillomawirusów,którego sekwencje replikacyjne s¹ wykorzysty-wane do otrzymania sztucznych plazmidówzdolnych do replikacji w komórkach zwierzê-cych, jest wirus BPV-1 (bydlêcy wirus brodaw-czaka). W jego replikacji bior¹ udzia³ wirusowebia³ka E1 i E2. E1 wykazuje aktywnoœæ helikazypodobnie jak du¿y antygen T polyomawiru-sów. Wi¹¿e te¿ RPA i primazê gospodarza(CRAENENBROECK i wspó³prac. 2000). Nato-miast E2 modyfikuje wi¹zanie E1 do DNA, byæmo¿e wspomaga te¿ wi¹zanie bia³ek replikacyj-nych gospodarza. E2 wydaje siê te¿ byæ g³ów-nym bia³kiem regulacyjnym wirusa, a oprócztego odgrywa rolê w dziedziczeniu plazmidu:przywi¹zuje genom wirusa do chromatyny go-spodarza. Mimo tego, ¿e replikacja plazmidównios¹cych sekwencje replikacyjne BPV-1 niejest zwi¹zana z cyklem komórkowym, liczbakopii takich konstruktów utrzymuje siê na wmiarê sta³ym poziomie w mysich i ludzkich li-niach komórkowych. Byæ mo¿e te wektoryznajd¹ zastosowanie w terapii genowej.

Innym wirusem, którego sekwencje repli-kacyjne znajd¹ byæ mo¿e zastosowanie do kon-strukcji terapeutycznych plazmidów jest her-peswirus Epstein-Barra (EBV). Podobnie jakBKV, ten wirus jest powszechny u ludzi — la-tentna infekcja dotyczy 90% populacji, do zaka-¿enia dochodzi we wczesnym dzieciñstwie. Doutrzymania siê genomu tego wirusa w komór-

kach oprócz sekwencji origin wystarcza obec-noœæ genu EBNA1 (CRAENENBROECK iwspó³prac. 2000). Nie jest jasne, czy produktEBNA1 bierze udzia³ bezpoœrednio w inicjacjireplikacji. Byæ mo¿e sprowadza do origin

bia³ka replikacyjne gospodarza, ale mo¿liwete¿, ¿e jego g³ówna funkcja le¿y w wi¹zaniu ge-nomu wirusowego do chromatyny gospoda-rza. Niestety, origin EBV nie jest aktywne w ko-mórkach gryzoni, co ogranicza jego zastosowa-nie do terapii genowej: testowanie wektorówna zwierzêtach laboratoryjnych jest koniecznew pocz¹tkowych etapach opracowywania tera-peutyku. Mimo to, rejon replikacyjny EBV jestwykorzystywany w badaniach maj¹cych nacelu stabilny transfer genów do komórek ludz-kich (WADE-MARTINS i wspó³aut. 2000). U¿yciewektorów opartych na EBV pozwala na wpro-wadzanie bardzo d³ugich odcinków DNA; tech-nikê tê nazwano wrêcz technik¹ sztucznychepisomalnych chromosomów (VOS 1999).

Tak jak p³ynna jest granica miêdzy plazmida-mi i chromosomami bakteryjnymi, tak od tech-niki sztucznych episomalnych chromosomówniedaleko do techniki sztucznych chromoso-mów, w których rejon replikacyjny pochodzi zchromosomu gospodarza. Taka cz¹steczka musinieœæ te¿ rejon centromerowy (zapewniaj¹cystabilne dziedziczenie) oraz telomery (by zapo-biec stopniowemu skracaniu siê konstruktupodczas kolejnych replikacji). Dro¿d¿owesztuczne chromosomy zbudowano ju¿ w latach80. (BROWN i wspó³aut. 2000). Niedawno po-dobne techniki zastosowano do konstrukcjisztucznych mysich i ludzkich chromosomów.Ma³a stabilnoœæ takich konstruktów w ludzkichkomórkach sprawia, ¿e ich zastosowanie w ce-lach terapeutycznych stoi jeszcze pod znakiemzapytania. Praktyczne problemy sprawiaj¹szczególnie telomery sztucznych chromoso-mów (BROWN i wspó³aut. 2000, VOS 1999). St¹dpropozycje wykorzystania zakoñczeñ po-chodz¹cych z wirusów — miêdzy innymi adeno-wirusa, który u¿ywa bia³ka terminalnego (VOS1999). Takie konstrukty przypomina³yby linio-we chromosomy bakteryjne. Naturalnie, wpo-mniana technika episomalnych, kolistych,sztucznych chromosomów pozwala w jeszczeinny sposób rozwi¹zaæ „problem koñców”.

PODSUMOWANIE

Plazmidy odgrywaja ogromn¹ rolê w ewo-lucji bakterii. Horyzontalny transfer genów jest

jednym ze Ÿróde³ zmiennosci mikroorgani-zmów, warto te¿ zauwa¿yæ, ¿e samo „przejœcie”

Replikacja plazmidów 269

jakiegoœ genu na niezale¿ny replikon pozwalana ewolucjê takiego genu niezale¿nie od ewo-lucji jego chromosomalnej kopii. To sprawia,¿e badania plazmidów s¹ bardzo istotne dla ba-dania zmiennosci mikroorganizmów i maj¹ogromne znaczenie praktyczne (m.in. klinicz-ne). Niezale¿ne replikony wykorzystywane sate¿ do modyfikowania mikroorganizmów docelów biotechnologicznych.

Mo¿liwoœci praktycznych zastasowañ by³yzawsze wielkim stymulantem w badaniach pla-zmidów. Ale drugim czynnikiem sprzyjaj¹cymich prowadzeniu jest fakt, ¿e w wiêkszoœciprzypadków obecnoœæ plazmidów nie jest nie-zbêdna dla prze¿ycia gospodarza. Mo¿na sobiezatem pozwoliæ na daleko id¹ce modyfikacjeich budowy z u¿yciem technik in¿ynierii gene-tycznej. Manipulacje te s¹ u³atwione w przy-padku ma³ych cz¹steczek plazmidowych — wy-korzystuj¹c ró¿nice w rozmiarze, mo¿na wpraktyce takie cz¹steczki ³atwo oddzieliæ odchromosomów gospodarza.

Analiza replikacji plazmidów i jej kontrolidoprowadzila do prze³omowych odkryæ do-tycz¹cych regulacji ekspresji genów w ogóle(np. z u¿yciem antysensownego RNA) i do po-znania ogólnych mechanizmów rz¹dzacychprocesem replikacji. Zdolnoœæ niektórych pla-zmidów do replikacji w komórkach odleg³ychsystematycznie gatunków doprowadzila do po-stawienia pytañ dotyczacych interakcji miedzybia³kami symbiontów a bia³kami gospodarza.Jako ¿e plazmidy mimo tego, ¿e s¹ niezale¿ny-mi replikonami wykorzystuj¹ enzymy replika-cyjne gospodarza, badania replikacji plazmi-dów pomog³y zrozumieæ wiele aspektów repli-kacji DNA chromosomalnego, a tak¿e innychposo¿ytów wewn¹trzkomórkowych — wiru-sów. Pozwoli³y tym samym na dok³adniejszezrozumienie bodaj¿e najbardziej podstawowe-go procesu biologicznego, jakim jest replikacjamateria³u genetycznego.

REPLICATION OF PLASMIDS

S u m m a r y

One of the characteristics that differentiatesplasmids from other extrachromosomal genetic ele-ments, transposons and viruses, is the controlled repli-cation that allows stable inheritance in dividing cells.At the same time, the mechanism of replication ofsome plasmids is very similar to that of some viruses,and indeed some plasmids might have viral origin. Inthe case of other plasmids, their replication mecha-nism is similar to that used by the host. On the onehand, therefore, the study of plasmid replication maygive hints as to the origin of a particular group of theseextrachromosomal elements. On the other, the re-search on replication of plasmids helped to solve basicquestions pertaining to this basic molecular process ingeneral. The first basic problem of any process of DNAreplication is that of priming, since none of thereplicative polymerases can start DNA synthesis usingjust free nucleotides. Plasmids use three strategies tosolve this problem. Some linear plasmids code for areplication protein which provides an OH group towhich the first nucleotide of the copy molecule can beattached by a plasmid-coded DNA polymerase. An-other strategy is to bring the host primase to the originof replication. This enzyme synthesizes a short RNAmolecule the 3´OH end of which can be elongated bythe DNA polymerase of the host. The mechanism ofreplication of such plasmids shows many similaritiesto that of the host chromosome. Some plasmids, it maybe added, code for their own primase. Finally, at theorigin of replication of other plasmids, for instancethose replicating using the rolling-cycle mechanism,one of the parent DNA strands becomes cleaved toprovide a free 3’OH group. Research on plasmid repli-

cation provided many answers not only to basic ques-tions on replication in general: it was also very impor-tant for understanding the mechanisms of gene regula-tion. Plasmid replication needs to be controlled so thatthe metabolic burden on the host is not excessive.There are two known mechanisms used to control thereplication of bacterial plasmids. In one, the role of aregulator is played, actually, by the plasmid DNA se-quences in the origin region. This is the mechanism ofplasmid handcuffing, named after the appearance oftwo plasmid molecules brought together when suchregions from two plasmids interact indirectly, themechanism by which replication is repressed. As theinteraction is reversible, when plasmid concentrationin the growing and dividing cell drops, the moleculescan separate and replicate. In a different mechanismof replication regulation, the role of the regulator isplayed by small molecules (RNA, and sometimes also aprotein) the concentration of which depends onplasmid copy number and which inhibit the synthesisof another molecule coded for a plasmid (usually aprotein, sometimes RNA) that is important for replica-tion initiation. Indeed, it was thanks to the research onregulation of plasmid replication that the mechanismof regulation by small RNA molecules (antisense RNA)has been first described in detail. The reason for such ahistorical importance of research on plasmid replica-tion is that it is easier to achieve the genetic modifica-tion of plasmids than modification of the host ge-nome. Moreover, the effects of a modification of an el-ement which is not necessary for survival of the cellcan be observed and interpreted with less difficulty.For the same reasons of easy manipulation, introduc-

270 BORYS WRÓBEL

tion of artificial plasmids into the cells is the mainmethod of genetic modification. Such molecules maynot be replicative in the target host, and thus either areeliminated from the cells with time, or integrate intothe host chromosomes. In the case of a majority of bio-technological applications, however, the plasmidsused are replicative, and therefore it is important to be

able to control their copy level in the cells. Replicativeelements are being also considered for use in therapy.Thus, the research on plasmid replication remains ofvital importance.

LITERATURA

ARAGONOZA M. T., MIN J., HU Z., AKINS R. A., 1994. Distri-

bution of seven homology groups of mitochon-

drial plasmids in Neurospora: evidence for wide-

spread mobility between species in nature. Curr.Genet. 26, 62–73.

ATLUNG T., CHRISTENSEN B. B., HANSEN F. G. , 1999. Role

of the Rom protein in copy number control of pla-

smid pBR322 at different growth rates in Escheri-

chia coli K-12. Plasmid 41, 110–119.BAO K., COHEN S. N., 2001. Terminal proteins essential

for the replication of linear plasmids and chromo-

somes in Streptomyces. Genes. Dev. 15,1518–1527.

BELNAP D. M., OLSON N. H, CLADEL N. M, NEWCOMB W. W.,BROWN J.C., KREIDER J. W., CHRISTENSEN N. D., BAKER

T. S., 1996. Conserverd features in papillomavirus

and polyomavirus capsids. J. Mol. Biol. 259,249–263.

BLAISONNEAU J., SOR F., CHERET G., YARROW D., FUKUHARA

H., 1997. A circular plasmid fromt the yeast Toru-

laspora delbrueckii. Plasmid 38, 202–209.BLAISONNEAU J., NOSEK J., FUKUHARA H., 1999. Linear

DNA plasmid pPK2 of Pichia kluyveri: distinction

between cytoplasmic and mitochondrial linear

plasmids in yeast.Yeast 15, 781–791.BROWN W R., MEE P. J., SHEN M. H., 2000. Artificial chro-

mosomes: ideal vectors? Trends Biotech. 18,218–223.

CAMENISCH G., GRUBER M., DONOHO G., VAN SLOUN P.,WENGER R. H., GASSMANN M., 1996. A polyoma-ba-

sed episomal vector efficiently expresses exoge-

nous genes in mouse embryonic stem cells. Nucle-ic Acids Res. 24, 3707–3713.

CASJENS S., 1999. Evolution of the linear DNA replicons

of the Borrelia spirochetes. Curr. Opin. Microbiol.5, 529–534.

CHATTORAJ, D. K., 2000. Control of plasmid DNA repli-

cation by iterons: no longer paradoxical. Mol.Microbiol. 37, 467–476.

COLLINS R. A., SAVILLE B. J., 1990. Independent transfer

of mitochondrial chromosomes and plasmids du-

ring unstable vegetative fusion in Neurospora.Nature 345, 177–179.

CRAENENBROECKK., VANHOENACKER P., HAEGEMAN G.,2000. Episomal vectors for gene expression in

mammalian cells. Eur. J. Biochem. 267,5665–5678.

DARQUET A. -M., CAMERON B., WILS P., SHERMAN D.,CROUZET J., 1997. A new DNA vehicle for nonviral

gene delivery: supercoiled minicirlce. Gene Thera-py 4, 1341–1349.

VAN DER SOLAR G., ESPINOSA M., 2000. Plasmid copy

number control: an ever growing story. Mol.Microbiol. 37, 492–500.

VAN DER SOLAR, G., GIRALDO R., RUIZ-ECHEVARRIA M.J.,ESPINOSA M., DIAZ-OREJAS R., 1998. Replication and

control of circular bacterial plasmids. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 62, 434–464.

VAN DER SOLAR, G. ALONSO J.C, ESPINOSA M., DIAZ-OREJAS

R., 1996. Broad-hoast range plasmid replication:

an open question. Mol. Microbiol. 21, 661–666.DHAR S. K., CHOUDHURY N. R., MITTAL V., BHATTA-

CHARYAA., BHATTACHARYAS., 1996. Replication ini-

tiates at multiple dispersed sites in the ribosomal

DNA plasmid of the protozoan parasite Entamae-

ba histolytica. Mol. Cell. Biol. 16, 2314–2324.FARRAR, N. A., WILLIAMS K L., 1988. Nuclear plasmids in

the simple eukaryotes Saccharomyces cerevisiae

and Dictyostelium discoideum. Trends Genet. 4,343–348.

FUKUHARA H., 1995. Linear DNA plasmids of yeast.

FEMS Microbiol. Lett. 131, 1–9.GIBBS M. J., KOGA R., MORIYAMA H., PFEIFFER P., FUKUHARA

T., 2000. Phylogenetic analysis of some large do-

uble-stranded RNA replicons from plants suggests

they evolved from a defective single-stranded RNA

virus. J. Gen. Virol. 81, 227–233.GONZALES C. M., SPENCER T. D., PENDLEY S. S, WELKER D.

L., 1999. Dgp1 and Dfp1 are closely related pla-

smids in the Dictyostelium Ddp2 plasmid family.

Plasmid 41, 89–96.GRIFFITHS A. J., KRAUS S. R., BARON R., COURT D. A., MYERS

C. J., BERTRAND H. 1990. Heterokaryotic transmis-

sion of senescence plasmid DNA in Neuospora.Curr. Genet. 21, 479–484.

GRIFFITHS A. J., 1995. Natural plasmids of filamentous

fungi. Microbiol. Rev. 59, 673–685.HARTIKKA J., SAWDEY M., CORNEFERT-JENSEN F., MARGALITH

M., BARNHART K., NOLASCO M., VAHLSING H. L., MEEK

J., MARQUET M., HOBART P., NORMAN J., MANTHORPE

M., 1996. An improved plasmid DNA expression

vector for direct injection into skeletal muscle.

Hum. Gene Ther. 7, 1205–1217HINNEBUSCH J., TILLY K., 1993. Linear plasmids and

chromosomes in bacteria. Mol. Microbiology 10,917–922.

HOCHHUT B., MARRERO J., WALDOR M. K., 2000. Mobiliza-

tion of plasmids and chromosomal DNA media-

ted by the SXT element, a constin found in Vibrio

cholerae O139. J. Bacteriol. 182, 2043–2047.HONDA Y., SAKAI H., HIASA H., TANAKA K., KOMANO T.,

BAGDASARIAN M., 1991. Functional division and re-

construction of a plasmid replication origin: mo-

lecular dissection of the oriV of the broad-ho-

Replikacja plazmidów 271

st-range plasmid RSF1010. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88, 179–183.

HUBER D. H., RUSTCHENKO E., 2001. Large circular and

linear rDNA plasmids in Candida albicans. Yeast18, 261–271.

JACHYMCZYK W., 1995. Replikacja DNA. [W:] Genetyka

molekulanra. WÊGLEÑSKI P. (red.) WydawnictwoNaukowe PWN, Warszawa, 59–105.

KEMPKEN F., HERMANNS J., OSIEWACZ H. D., 1992. Evolu-

tion of linear plasmids. J. Mol. Evol. 35, 502–513.KHAN S. A., 2000. Plasmid rolling-circle replication: re-

cent developments. Mol. Microbiol. 37, 477–484.KOLSTO A. -B., 1997. Dynamic bacterial genome orga-

nization. Mol. Microbiol. 24, 241–248.LANKA E., WILKINS B. M., 1995. DNA processing reac-

tions in bacterial conjugation. Annu. Rev. Bio-chem. 64, 141–169.

LEITING B., LINDNER I. J., NOEGEL A. A.,1990. The extra-

chromosomal replication of Dictyostelium disco-

ideum plasmid Dpd2 requires a cis-acting ele-

ment and a plasmid-encoded trans-acting factor.

Mol. Cell. Biol. 7, 3727–3736.LLOSA M., GOMIS-RÜTH F. X., COLL M., CRUZ F. (2002) Bac-

terial conjugation: a two-step mechanism for

DNA transport. Mol. Microbiol. 45, 1–8.LUDWIG D. L, BRUSCHI C. V., 1991. The 2m plasmid as a

nonselectable, stable, high copy number yeast

vector. Plasmid 25, 81–95.MEINHARDT F., KEMPKEN F., KAMPER J., ESSER K., 1990. Li-

near plasmids among eukaryotes: fundamentals

and application. Curr. Genet. 17, 89–95.MEINHARDT F., SCHAFFRATH R., LARSEN M., 1997. Micro-

bial linear plasmids. Appl. Microbiol. Biotechnol.47, 329–336.

MIYASHITA S., HIROCHIKA H., IKEDA J. E. HASHIBA T., 1990.Linear plasmid DNAs of the plant pathogenic fun-

gus Rhizoctonia solani with unique terminal

structures. Mol. Gen. Genet. 220, 165–171.MORIYAMA H., NITTA T., FUKUHARA T., 1995. Do-

uble-stranded RNA in rice: a novel RNA replicon

in plants. Mol. Gen. Genet. 248, 364–369.NOMURA N., MASAI H., INUZUKA M., MIYAZAKI C., OHTSUBO

E., ITOH T., SASAMOTO S., MATSUI M., ISHIZAKI R., ARAI

K., 1991. Identification of eleven single-strand ini-

tiation sequences (ssi) for priming of DNA replica-

tion in the F, R6K, R100 and ColE2 plasmids. Gene108, 15–22.

PETES T. D., WILLIAMSON D. H., 1994. A novel structural

form of the 2 micron plasmid of the yeast Saccha-

romyces cerevisiae. Yeast 10, 1341–1345.RASOOLY, A. R., RASOOLY, R. S., 1997. How rolling circle

plasmids control their copy number. TrendsMicrobiol. 5, 440–446.

RIEBEN W. K., GONZALES C. M., GONZALES S. T.,PILKINGTON K. J., KIYOSAWA H., HUGHES J.E., WELKER

D. L., 1998. Dictyostelium discoideum nuclear pla-

smid Ddp5 is a chimera related to the Ddp1 and

Ddp2 plasmid families. Genetics 148, 1117–1125.

RODIRUGEZ-COUSINO N., SOLORZANO A., FUJIMURA T,ESTEBAN R., 1998. Yeast positive-stranded virus-li-

ke RNA replicons, 20S and 23S RNA terminal nuc-

leotide sequences and 3´end secondary structures

resemble those of RNA coliphages. J. Biol. Chem.273, 20363–20371.

ROTHSTEIN R., GANGLOFF S., 1999. The shuffling of a

mortal coil. Nat. Genetics 22, 4–6.SALYERS A. A., SHOEMAKER N.B., STEVENS A M., LI L.-Y.,

1995. Conjugative transposons: an unusual and

diverse set of integrated gene transfer elements.

Microbiol. Rev. 59, 579–590.VAN DER SAND S. T. , GREENHALF W., GARDNER D. C.,

OLIVER S. G., 1995. The maintenance of self-replica-

ting plasmids in Saccharomyces cerevisiae: ma-

thematical modelling, computer simulations and

experimental tests. Yeast 11, 641–658.SHADAN F. F., VILLARREAL L. P., 1993. Coevolution of per-

sistetly infecting small DNA viruses and their

hosts linked to host-interactive regulatory doma-

ins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4117–4121.SEEGERS J. F., ZHAO A. C., MEIJER W. J., KHAN S. A., VENEMA

G., BRON S., 1995. Structural and functional analy-

sis of the single-strand origin of replication from

the lactococcal plasmid pWV01. Mol. Gen. Genet.249, 43–50.

SHAMMAT I. M., GONZALES C. M., WELKER D. L., 1998. Dic-tyostelium discoideum nuclear plasmid Dpd6 is a

new member of the Dpd2 family. Curr. Genet. 33,77–82.

SINCLAIR D., MILLS K., GUARENTE L., 1998. Aging in Sac-

charomyces cerevisiae. Annu. Rev. Microbiol. 52,533–560.

TAKECHI S., ITOH T., 1995. Initiation of unidirectional

ColE2 DNA replication by a unique priming me-

chanism. Nucl. Acids Res. 23, 4196–41201.VOLFF J. -N., ALTEMBUCHNER J., 2000. A new beginning

with new ends: linearisation of circular chromo-

somes during bacterial evolution. FEMS Micro-biol. Lett. 186, 143–150.

VOS J. M., 1999 Therapeutic mammalian artificial epi-

somal chromosomes. Curr. Opin. Mol. Ther. 1,204–215.

WADE-MARTINS R., WHITE R. E., KIMURA H., COOK P. R.,JAMES M.R., 2000. Stable correction of a genetic de-

ficiency in human cells by an episome carrying a

115 kb genomic transgene. Nat. Biotechnol. 18,1311–1314.

WATERS V. L., GUINEY D. G., 1993. Processes at the nick

region link conjugation, T-DNA transfer and rol-

ling circle replication. Mol. Microbiol. 9,1123–1130.

WRÓBEL B., WEGRZYN G., 2002. Evolution of lambdoid

replication modules. Virus Genes, 24, 163–171.ZHANG M., BROWN G. G., 1993. Structure of the maize

mitochondrial RNAb and its relationship with

other autonomously replicating RNA species. J.Mol. Biol. 230, 757–765.

272 BORYS WRÓBEL