Toxicidad Aguda y Netox Efluentes Uruguay

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INTENDENCIA MUNICIPAL DE MONTEVIDEO (IMM) DEPARTAMENTO DE DESARROLLO AMBIENTAL

LABORATORIO DE CALIDAD AMBIENTAL

SECCION BIOENSAYOS

MINISTERIO DE EDUCACIN Y CULTURA (MEC) INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLGICAS CLEMENTE ESTABLE (IIBCE)

DEPARTAMENTO DE GENTICA TOXICOLGICA Y PATOLOGA CROMOSMICA

FINANCIACIN:

SSSeeecccrrreeetttaaarrriiiaadddooo dddeee MMMaaannneeejjjooo dddeeelll MMMeeedddiiiooo AAAmmmbbbiiieeennttteee pppaaarrraaa AAAmmmrrriiicccaaa LLLaaatttiiinnnaaa yyy EEElll CCCaaarrriiibbbeee ((SSSEEEMMMAAA///EEEMMMSSS))) PPPrrrooogggrrraaammmaaa dddeee PPPooobbbrrreeezzzaaa UUUrrrbbbaaannnaaa yyy MMMeeedddiiiooo AAAmmmbbbiiieeennnttteee

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Evaluacin de la toxicidad aguda y genotoxicidad de efluentes industriales vertidos en las principales cuencas hdricas del Municipio de Montevideo, Uruguay

INFORME FINAL

Contenido

1- INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE 2

2- ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIN 3

3- OBJETIVOS 5

3.1- Objetivo general 5

3.2- Objetivos especficos 5

4- MATERIALES Y MTODOS 6

4.1 - Extraccin de muestras de efluentes industriales 6

4.2 - Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes 6

4.3 - Preparacin de las muestras 6

4.4- Batera de bioensayos para determinacin de toxicidad 6

4.4.1- Ensayo de toxicidad crnica con Selenastrum capricornutum 6

4.4.2- Bioensayo con Daphnia magna 7

4.4.3 - Bioensayo de toxicidad aguda con Hydra atenuatta 8

4.4.4- Bioensayo con Lactuca sativa 9

4.4.5- Bioensayo con Cnesterodon decemmaculatus 9

4.5- Ensayos de genotoxicidad 10

4.5.1- Test de aberraciones cromosmicas 10

4.5.2- Ensayo cometa 11

4.6- Definicin de unidades 12

4.7 - Mtodos estadsticos 14

5- RESULTADOS Y DISCUSIN 15 5.1- Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes 16

5.2- Bioensayos 18

5.3- Ensayos de genotoxicidad 25

5.4- Comparacin entre resultados de bioensayos, ensayos de genotoxicidad y anlisis FQ 27

5.5- Otras actividades realizadas en el marco del proyecto 30

5.5.1- Anlisis mediante Citometra de Flujo de Selenastrum capricornutum 30

5.5.2- Clasificacin celular mediante citometra de flujo de clulas de Hydra attenuata. 31

5.5.3- Actividades acadmicas 32

6- CONCLUSIONES 33

6.1- Bioensayos 33

6.2- Genotoxicidad 35

7- PERSPECTIVAS 35

8- BIBLIOGRAFA 36

9- ANEXO- Anlisis estadsticos 40

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INFORME FINAL 1- INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE INTENDENCIA MUNICIPAL DE MONTEVIDEO (IMM)

LABORATORIO DE CALIDAD AMBIENTAL Camino al Faro s/n Montevideo

SECCIN BIOENSAYOS Dr. Julio Espnola Responsable Proyecto

Ing. Ag. Fernando Lorenzo - Asistente de Investigacin

ANLISIS FISICO-QUMICOS Ing. Qco. Martn Arriola

UNIDAD DE EFLUENTES INDUSTRIALES Lucas Priz 2357- Montevideo

Ing. Qca. Alicia Raffaele

Lic. Hernn Mndez

QF. Mary Yafalin

Bach. Antonet Calero

MINISTERIO DE EDUCACIN Y CULTURA (MEC) INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLGICAS CLEMENTE ESTABLE (IIBCE) Av. Italia 3318 Montevideo DEPARTAMENTO DE GENTICA TOXICOLGICA Y PATOLOGA CROMOSMICA

Dr. Wilner Martnez Lpez - Responsable Proyecto

Lic. Leticia Mndez Acua Asistente de Investigacin

UNIVERSIDAD DE LA REPBLICA FACULTAD DE CIENCIAS Igu 4225 Montevideo

SECCIN OCEANOLOGA

MSc. Federico Viana - Asistente de Investigacin

FACULTAD DE MEDICINA Gral. Flores 2125 - Montevideo

UNIDAD DE MTODOS CUANTITATIVOS

Lic. Gustavo Saona Asistente en Anlisis Estadsticos

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INFORME FINAL 2- ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIN La contaminacin acutica ha aumentado por la adicin de nuevas sustancias a los cursos de agua, principalmente derivadas de procesos productivos, pudiendo tener serias consecuencias tanto sobre la biota circundante como en la salud humana (White et al., 1996; Choi y Meier, 2001). Los txicos presentes en los efluentes industriales pueden tener efectos agudos, muchas veces letales para los organismos expuestos, y/o efectos crnicos (subletales). Entre estos ltimos el dao genotxico representa la afeccin del material gentico de los individuos expuestos, pudiendo ser carcinognico cuando deriva en la formacin de tumores malignos y/o mutagnico, afectando a las generaciones futuras (Moutschen, 1985). Las comunidades humanas que habitan en las mrgenes de arroyos donde son vertidos efluentes industriales y utilizan agua de estos cauces para riego o su consumo, podran resultar expuestas a posibles agentes genotxicos. Generalmente en las ciudades las poblaciones con un mayor riesgo son aquellas de bajos ingresos que habitan en la periferia de la ciudad, instalando asentamientos irregulares en las mrgenes de arroyos urbanos. La exposicin a agentes genotxicos en forma prolongada, en muchos casos durante toda su vida, podra conducir a la produccin de alteraciones genticas en las poblaciones expuestas y en su descendencia, con el consiguiente incremento del riesgo a largo plazo de padecer cncer, malformaciones congnitas o retardo mental (Henderson et al., 2000). AGREGAR CITA DE LA IMM SOBRE INCREMENTO DE CONTAMINACION

En Uruguay las emisiones industriales representan una de las principales fuentes de contaminacin de los recursos hdricos. El departamento de Montevideo constituye la menor de las 19 divisiones poltico-administrativas que conforman nuestro pas, pero concentra gran parte de las industrias y la mayora de las actividades de servicio, as como tambin a casi la mitad de la poblacin del pas (Tabla 1). Por otra parte, resulta altamente significativo el fenmeno de despoblacin de los barrios centrales, con el crecimiento de las zonas perifricas y del rea Metropolitana Externa a la ciudad, que se acrecent en el perodo 1985 a 1996 (Tablas 1 y 2).

Tabla 1- Crecimiento demogrfico de la poblacin montevideana y del resto del pas registrado por los Censos de poblacin de 1963, 1975, 1985 y 1996. Fuente: I.N.E. - Censo General de Poblacin y Vivienda 1996.

rea Geogrfica Censo 1963 Censo 1975 Censo 1985 Censo 1996 Montevideo 1.202.757 1.237.227 1.311.976 1.344.839

Urbano 1.163.623 1.179.986 1.255.106 1.290.919 Rural 39.134 57.241 56.870 53.920

Resto del pas 1.392.753 1.551.202 1.643.265 1.818.924 Total del pas 2.595.510 2.788.429 2.955.241 3.163.763

Tasa media de crecimiento anual por mil rea Tasa

Montevideo 2,34 rea Externa a Montevideo 23,57

Uruguay 6,44

Tabla 2 Crecimiento anual de la poblacin de Montevideo y de todo el pas. Fuente: I.N.E. - Censo General de Poblacin y Vivienda 1996.

El rea rural y suburbana de Montevideo a pesar de representar el 0,1% de la superficie agropecuaria total del pas, genera una proporcin significativa del total de rubros frutcolas, vitcolas y hortcolas. Esta alta concentracin productiva implica explotacin intensiva donde el riego juega un

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INFORME FINAL papel principal (Tabla 3). Coexiste con esta realidad la concentracin en Montevideo del 53% del parque industrial del pas. A nivel departamental el control de efluentes es realizado por la Unidad de Efluentes Industriales y el Laboratorio de Calidad Ambiental de la Intendencia Municipal de Montevideo (IMM). A travs del desarrollo de cursos de entrenamiento y proyectos financiados por el IDRC (Talleres realizados en Montevideo 1998 y 2003 y Argentina 2000 as como los proyectos Aquatox, 2003; LHA, 2001 y RIB, 2002) dicho Laboratorio adquiri experiencia en la evaluacin de la calidad del agua en Montevideo a travs del anlisis de sus efectos biolgicos empleando los bioensayos denominados Lactuca sativa, Allium cepa, Hydra attenuata, Daphnia magna y Selenastrum capricornutum. En ambos proyectos se reafirm la necesidad de incorporar informacin ecotoxicolgica a la normativa ambiental nacional. Los bioensayos constituyen un primer acercamiento al efecto que pueden causar los txicos presentes en los efluentes, pero muchas emisiones industriales contienen sustancias que, careciendo de un efecto agudo, podran reducir la sobrevida a largo plazo de los individuos expuestos (Claxton et al., 1998; Houk, 1992). Entre las conclusiones de los mencionados proyectos se resalt la necesidad de realizar estudios de efectos a mediano y largo plazo, evaluando la capacidad genotxica del ambiente. Lo expresado anteriormente es reforzado por las caractersticas demogrficas que presenta la ciudad de Montevideo, similares a las de pases desarrollados (Tabla 4), y por el importante lugar que ocupan los tumores malignos dentro de las causas de muerte a nivel nacional (Tabla 5).

Tabla 3 - Fuentes de agua empleada para riego en la ciudad de Montevideo.

Fuentes de agua para riego (Montevideo) Aguas subterrrneas 69% Tajamar 21% Cauces naturales sin represar 8% Cauces naturales represados 2%

Tasas de natalidad y mortalidad Tasas anuales por mil 1975 1985 1996

Tasa bruta de natalidad 18.6 16.6 16,7 Tasa bruta de mortalidad 10.9 10.8 11.0

Tasa de mortalidad Infantil 29,7 16.9

Principales causas de muerte (1997) Enfermedades del

aparato circulatorio

Tumores malignos Accidentes y efectos adversos Infecciones respiratorias

y neumonas

34.5 %

25.0 % 4.7 % 3.3 %

Tabla 4- Tasas de natalidad y mortalidad de la ciudad de Montevideo segn los Censos de 1975, 1985 y 1996.

Tabla 5 Principales causas de muerte por % sobre el total de defunciones registradas en el ao 1997. Fuente: Ministerio de Salud Pblica.

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INFORME FINAL

En el presente proyecto se llev a cabo la incorporacin a una batera de bioensayos de toxicidad,

de metodologas que permitieron evaluar los potenciales efectos crnicos (genotxicos) de los efluentes industriales que vierten a las principales cuencas hdricas del Departamento de Montevideo. En las tablas 6 y 7 se caracterizan las mencionadas cuencas y los vertidos industriales a las mismas.

Con el asesoramiento de la Unidad de Efluentes Industriales de la IMM, se seleccionaron once ramos industriales considerados prioritarios, distribuidos en las cuencas hdricas del departamento, cuyos vertidos finales se realizan a cursos de agua e infiltracin a terrenos de zonas suburbanas. As mismo, se analizaron algunos efluentes cuya disposicin final va primariamente a colector, pero que a travs de by pass llegan finalmente a cursos de agua.

Tabla 6 Caractersticas de las principales cuencas hdricas del Departamento de Montevideo.

Cuenca Area (Km2) Longitud del curso principal (Km) Urbanizacin % Efluentes industriales Cuerpo receptor final

Miguelete

113

21,5

41%

30%

Baha de Montevideo

Pantanoso 66,4 16 40% 24% Baha de Montevideo Carrasco 213 3 31% sin dato Ro de la Plata

AO 2002 CUENCA TV N de INDUSTRIAS CAUDAL (m3/da) G y A (kg/da) DBO5 kg/da SST (kg/da) Amonio (kg/da) CrT (kg/da) S (kg/da) Pb (kg/da)

Miguelete A 8 880 30 133 78 67 0,37 0,88 0,054 Pantanoso A 7 1005 37 177 151 147 0,01 1,31 0,014 Carrasco A 1 10 0,25 1,45 1,40 0,049 0,002 0,011 0,003

Las piedras A 1 500 19 675 145 15 0 0,35 0

Tabla 7 Vertidos industriales en las principales cuencas hdricas del Departamento de Montevideo. TV- tipo de vertido. A- arroyos. G y A- grasas y aceites. SST- slidos suspendidos totales. CrT- cromo total.

3- OBJETIVOS

3- OBJETIVOS 3.1- Objetivo general Evaluar el impacto a nivel biolgico de fuentes fijas de contaminacin industrial que vierten sobre cuencas hdricas del Departamento de Montevideo.

3.2- Objetivos especficos

3.2.1 - Evaluar mediante una batera de bioensayos la posible toxicidad y genotoxicidad producida por efluentes industriales con disposicin final a cursos de agua y terrenos, en zonas suburbanas de la ciudad de Montevideo.

3.2.2 - Generar informacin cientfica relevante para incidir en la normativa a travs de las

revisiones realizadas por el grupo Interinstitucional GESTA.

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INFORME FINAL

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INFORME FINAL 4- MATERIALES Y MTODOS 4.1- Extraccin de muestras de efluentes industriales

(Unidad de Efluentes Industriales IMM)

Las muestras de efluentes de las industrias a ser analizadas fueron tomadas en recipientes de plstico sin cmara de aire. Se tom una muestra de 10 litros que luego de homogeneizada y fragmentada en recipientes de plstico de menor volumen fue almacenada a una temperatura de 4 C hasta la realizacin de los ensayos (entre los 3 a 5 das posteriores a la toma de la muestra). 4.2- Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes

(Laboratorio de Calidad Ambiental - IMM)

A partir de una alcuota de cada efluente se realiz su caracterizacin fisicoqumica que incluy los siguientes parmetros: oxgeno disuelto, conductividad, salinidad, pH, DBO5, DQO, grasas y aceites, slidos suspendidos totales, slidos sedimentables 1 hora, sulfuros, fsforo, amonio, cromo, plomo, cadmio y cobre. 4.3- Preparacin de las muestras Previo a la realizacin de los ensayos se realiz el pre-filtrado (filtro con dimetro de poro (fdp) de 8 m) y el filtrado de las muestras (fdp: 0,22 m). Debido a que la filtracin de la muestra podra alterar la toxicidad de la misma, ya que las sustancias txicas podran quedar retenidas en el filtro, la mayora de los bioensayos se realizaron por duplicado con la muestra con y sin filtrado previo. 4.4- Batera de bioensayos para determinacin de toxicidad

(Laboratorio de Calidad Ambiental IMM y Seccin Oceanologa Facultad de Ciencias) Se realizaron cinco (5) bioensayos (Hydra atenuatta, Selenastrum capricornutum, Daphnia magna, Lactuca sativa y Cnesterodon decemmaculatus), representando cada uno a organismos pertenecientes a diferentes niveles trficos. Los cuatro primeros fueron realizados en el Laboratorio de Calidad Ambiental de la IMM y el de C. decemmaculatus en la Seccin Oceanologa de la Facultad de Ciencias, Universidad de la Repblica.

4.4.1- Ensayo de toxicidad crnica con Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata).

Principio El gnero y la especie de Selenastrum capricornutum fueron modificados formalmente a Pseudokirchneriella subcapitata (Hindak, 1990). Sin embargo, para mantener consistencia con la literatura que la refiere, se emplear en este procedimiento su nombre original: Selenastrum capricornutum.

Figura 1 Selenastrum capricornutum

Selenastrum capricornutum es una alga verde (clorofita) unicelular con forma de media luna y un volumen aproximado de entre 40 y 60 mm3, que puede encontrarse en sistemas acuticos epicontinentales eutrficos u oligotrficos (Figura 1).

7


INFORME FINAL Este mtodo puede ser utilizado por s mismo o como parte de una batera para estimar la potencial fitotoxicidad de aguas dulces superficiales o subterrneas, aguas servidas y otro tipo de muestras lquidas, tales como: elutriados o lixiviados, agua intersticial de sedimentos o cualquier compuesto puro soluble en agua. La prueba es especialmente adecuada para ser practicada en laboratorios que cuenten con una infraestructura bsica, siendo un ensayo sencillo y de bajo costo. Presenta alta sensibilidad a metales, compuestos orgnicos y especialmente a Herbicidas. El hipercrecimiento de la poblacin muestral respecto al control negativo puede interpretarse como indicativo de un exceso de oferta de nutrientes (fsforo, nitrgeno y oligoelementos) que se presentan en sistemas acuticos eutrficos. Cuando las clulas son expuestas a muestras que contienen contaminantes txicos, su reproduccin se ve afectada, alterando la tasa de crecimiento de la poblacin de las algas. El efecto de inhibicin de la poblacin causada por los agentes txicos en una muestra luego de 72 horas de exposicin, bajo condiciones de temperatura controlada (24 2 C), se determina comparndolo con el crecimiento normal observado en un sistema libre de agentes contaminantes conocido como control. Dependiendo del nmero de concentraciones y rplicas preparadas para el desarrollo del experimento, se determina la CI50 (concentracin de inhibicin media), LOEC (concentracin mnima a la cual se observa efecto) y NOEC (concentracin a la cual no se observa efecto). El protocolo de prueba con el alga Selenastrum capricornutum realizado es una modificacin del mtodo estndar publicado por la Agencia de Proteccin Ambiental de Canad (Environment Canada, 1992 EPS1/RM/25). Los cambios introducidos (Blaise et al., 2000) corresponden al uso de volmenes reducidos (2,6 mL en viales de borosilicato de vidrio de 20 mL) y la cuantificacin de las clulas mediante una cmara de conteo (Neubauer) utilizando un microscopio ptico .

4.4.2 - Bioensayo con Daphnia magna var Straus

Principio Dentro del grupo de cladceros, las especies del gnero Daphnia son las ms utilizadas como organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia distribucin geogrfica, el importante papel que cumplen al interior de la comunidad zooplanctnica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproduccin partenogentica (lo cual asegura una uniformidad de respuesta) y el corto ciclo de vida con la produccin de un alto nmero de cras, han hecho de este grupo un ideal para la evaluacin de toxicidad, de carcter universal. El gnero Daphnia se ubica dentro del orden cladcera de la clase crustcea, y especies como D. magna , D. pulex y D. similis, son utilizadas extensivamente en pruebas de toxicidad, por lo cual existe una extensa informacin sobre las tcnicas de cultivo, los

requisitos de temperatura, luz y nutrientes, as como su respuesta a muchos txicos.

Figura 2 Daphnia magna

Especficamente, los ensayos de toxicidad con D. magna (Figura 2) permiten determinar la letalidad potencial de sustancias qumicas puras, aguas residuales domsticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterrneas, agua potable y agua de poro de sedimentos, entre otros. En las pruebas de toxicidad con D. magna, neonatos menores de 24 horas de edad son

7


INFORME FINAL expuestos a la muestra o compuesto a probar, por un perodo de 48 horas, al trmino del cual se cuantifica el nmero de organismos muertos. Con estos resultados se establece la proporcin o porcentaje de

mortalidad producida (Norma ISO 6341 (1989-10-01)).

4.4.3 - Bioensayo de toxicidad aguda (efectos letales) con Hydra atenuatta

Principio Los plipos de agua dulce del gnero Hydra son microinvertebrados de la clase Hydrozoa de amplia distribucin geogrfica y se caracterizan por ser animales pluricelulares, cuyas clulas se disponen en dos capas: la epidermis y la gastrodermis, separadas por una mesoglea gelatinosa, la cual encierra una cavidad digestiva continua que se comunica directamente con el exterior a travs de una abertura o boca (Figura 3). Algunas de las clulas intersticiales de la epidermis dan origen a los rganos caractersticos de defensa y ataque. Los ms conocidos son los nematocistos, que corresponden a los miembros ms simples de esta clase. En el extremo inferior presentan un pednculo con una base que se adhiere a diferentes superficies; en el extremo anterior se encuentra la boca, rodeada de cinco tentculos (Campbell & Bode, 1983). Su tamao vara de 5 a 20 mm de longitud, y de 2 a 3 mm de espesor . La especie H. atenuatta es empleada como organismo de prueba por la facilidad de su cultivo en laboratorio, su rpida reproduccin, su estructura primaria (ectodermo, mesodermo y endodermo), que favorece el intercambio intra e intercelular aumentando su potencial para la deteccin de txicos, as

como el presentar cambios morfolgicos fcilmente reconocibles bajo condiciones progresivas de intoxicacin (Trottier et al., 1997). Los ensayos de toxicidad con H. atenuatta permiten determinar subletalidad y letalidad potencial de sustancias qumicas puras, aguas residuales domsticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterrneas, agua potable y agua de poro de sedimentos, entre otros. Las pruebas de toxicidad con H. atenuatta tienen una duracin mxima de 96 h, tiempo durante el cual los organismos son expuestos al txico o muestran problemas. Durante el ensayo, diariamente se hace un examen microscpico y se registran los cambios morfolgicos producidos. La exposicin de los organismos a compuestos txicos da lugar a una serie de cambios morfolgicos (efectos subletales) y, dependiendo de la concentracin, puede producir la muerte de los individuos (efectos letales) (Trottier et al., 1997; Blaise et al., 1997). Los resultados de las pruebas permiten, adems de la estimacin de la LC50 y la EC50, establecer la LOEC, la NOEC y la TOEC (Blaise & Kusui, 1997) (ver definicin de unidades, pg.12).

Figura 3 Hydra atenuatta

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INFORME FINAL 4.4.4 - Bioensayo con Lactuca sativa Principio El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (L. sativa) es una prueba esttica de toxicidad aguda (120 horas de exposicin, 5 das), en la que se pueden evaluar los efectos fitotxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinacin de las semillas y en el desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento (Figura 4). Como puntos finales para la evaluacin de los efectos fitotxicos, se determina la inhibicin en la germinacin y la inhibicin en la elongacin de la radcula y del hipocotilo. Es importante destacar que durante el perodo de germinacin y los primeros das de desarrollo de la plntula ocurren numerosos procesos fisiolgicos en los que la presencia de una sustancia txica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayora de las semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicacin de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en semillas o plntulas en general. El xito o aptitud de una plntula para establecerse en un ambiente determinado es relevante para garantizar la supervivencia de la especie. La evaluacin del desarrollo de la radcula y del hipocotilo constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.

Figura 4 Cultivo de Lactuca sativa

Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas acuticos, la informacin generada a partir de esta prueba de toxicidad proporciona datos acerca del posible efecto de los contaminantes en las comunidades vegetales cercanas a las mrgenes de cuerpos de agua contaminados, siendo tambin una especie interesante de considerar por su importancia desde el punto de vista hortcola. Por otra parte, es de fcil y rpida germinacin, por lo que es posible desarrollar la prueba en pocos das. El ensayo se desarrolla a 22 2 C; como agua de dilucin se utiliza agua dura reconstituida (APHA, 1992). Se realizan tres rplicas y en cada una de ellas se colocan 20 semillas. El efecto medido es la inhibicin de la elongacin de la radcula e hipocotilo, e inhibicin en la germinacin. Cada punto final se evala comparando el efecto generado en los organismos expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control negativo sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de muestra. Se utiliza como control positivo Zn (II) (Dutka et al., 1989).

4.4.5 - Bioensayo con Cnesterodon decemmaculatus Los peces han sido ampliamente empleados en estudios de ecotoxicidad pues suelen manifestar la mayor complejidad biolgica de las bateras de bioensayos, por tratarse de un vertebrado. En esta experiencia se ha empleado a la madrecita de agua (C. decemmaculatus ) (Figura 6), un pez poeclido que frecuenta aguas continentales de nuestra regin. Su uso en bioensayos se ha desarrollado principalmente en Argentina y ms recientemente en nuestro pas (Di Marzio et al., 1994, 1998; Viana et al., 2003).

9


INFORME FINAL El bioensayo presenta caractersticas agudas, pues los organismos se exponen a la sustancia problema por un perodo de 96 horas, y estticas, porque durante el mismo no se realiza el recambio de las diferentes soluciones. A tales efectos fueron utilizados organismos juveniles de hasta 12 mm. sin discriminar su sexo. Para el ensayo se emplearon recipientes plsticos de primer uso sumergidos en un bao termostatizado a temperatura de 20 1 C. El fotoperodo se mantuvo a 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los organismos empleados provinieron de un estanque situado en el campo de la Universidad, aclimatados por ms de 10 das a las condiciones del ensayo, en agua blanda reconstituida, con una conductividad de 200 S/cm, y saturacin de oxgeno por burbujeo. En el acuario de aclimatacin se control la mortalidad del lote, siendo esta inferior al 2 %. Los peces fueron alimentados con una racin diaria de alimento en escamas, y la misma fue suspendida 24 horas antes de iniciado el ensayo (Figura 5).

Figura 5 - Bioensayo esttico de toxicidad aguda Figura 6- Cnesterodon decemmaculatus

con C. decemmaculatus. Arriba: hembra; abajo: macho. 4.5- Ensayos de genotoxicidad

(Departamento de Gentica Toxicolgica y Patologa Cromosmica- IIBCE)

Se emplearon dos metodologas de deteccin de genotoxicidad: el test de aberraciones cromosmicas (AC) y el ensayo cometa en clulas de mamfero mantenidas en cultivo. Estos dos mtodos evalan distintos tipos de dao a nivel del genoma. Previo a la realizacin de los ensayos de genotoxicidad se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad con el fin de determinar aquellas diluciones de los efluentes que no impedan el crecimiento y desarrollo del cultivo celular. De esta manera, slo fueron consideradas para la realizacin de los ensayos de genotoxicidad aquellas diluciones en donde los cultivos mostraron una viabilidad mayor al 90%.

4.5.1- Test de aberraciones cromosmicas (AC) El test de AC ha sido ampliamente utilizado para evaluar genotoxicidad (Albertini et al., 2000; Galloway, 2000), dado que es bien conocida la relacin existente entre la produccin de aberraciones cromosmicas y el inicio de la transformacin oncognica y la muerte celular (Obe et al., 1992 y 2002). Por otra parte, en el Departamento de Gentica Toxicolgica y Patologa Cromosmica (IIBCE) se posee amplia experiencia en este test empleando clulas mantenidas en cultivo (Folle et al., 1995, 1996, 1998; Martnez-Lpez et al., 1996, 1998, 2000).

En el presente trabajo, se expusieron clulas de una lnea celular de hmster Chino (CHO), ampliamente utilizada en ensayos de genotoxicidad, a diferentes diluciones de los efluentes industriales. Luego de 20 horas se realizaron los extendidos cromosmicos empleando tcnicas citogenticas estndar. El anlisis microscpico de las aberraciones cromosmicas fue realizado

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INFORME FINAL en 100 metafases completas (18 a 22 centrmeros) de clulas CHO para cada una de las diluciones analizadas. Los tipos de AC observados fueron agrupados en discontinuidades (fracturas cromosmicas y de cromtida, gaps) e intercambios (cromosomas dicntricos, translocaciones, cuadrirradiales, trirradiales, delecciones intersticiales, duplicaciones delecciones, cromosomas en anillo).

Dado que el anlisis de las AC requiere la presencia de clulas en proceso de divisin, en aquellos casos en que la proliferacin celular se vio afectada por accin de las sustancias contenidas en los efluentes industriales no fue posible realizar este anisis.

4.5.2- Ensayo cometa Este ensayo permite medir el dao producido sobre la molcula de ADN a nivel de clulas individuales, permitiendo la visualizacin directa de las lesiones con una elevada sensibilidad (Tice et al., 1990). Por este motivo, en los ltimos aos ha sido ampliamente utilizado en estudios de genotoxicidad tanto in vitro como in vivo (Belpaeme et al., 1996, 1998; Ralph y Petras,1998; Tice et al., 2000). Consiste en una electroforesis en microgel de clulas lisadas embebidas en agarosa. En las clulas que presentan dao gentico, los fragmentos de ADN producidos dentro del ncleo de la clula migran hacia el polo positivo de la cuba electrofortica y al ser visualizadas al microcopio ptico la imagen que presentan se asemeja a la de un cometa (Singh et al., 1988). Cuanto mayor es el dao gentico, ms grande es la cola del cometa (Figura 7).

En el desarrollo del presente proyecto se trataron cultivos de clulas CHO (por duplicado) con diferentes diluciones de la muestra y, luego de 20 hs de exposicin, se realizaron los preparados segn el protocolo diseado por Singh et al. (1988). Luego de ser teidos con bromuro de etidio se visualizaron en un microscopio de fluorescencia. Se realiz el anlisis de 50 clulas en cada una de las 2 preparaciones obtenidas por dilucin (1 de cada rplica).

La cuantificacin del dao gentico mediante el ensayo cometa se llev a cabo de dos maneras: (1) anlisis visual; (2) medicin del parmetro denominado momento de la cola (tail moment), el cual representa el producto de la intensidad de fluorescencia emitida por la cola del cometa por la longitud de la cola del cometa (distancia entre el borde de la cabeza (ncleo) y el extremo distal de la cola) (Figura 8).

En el anlisis visual se tomaron en cuenta 4 categoras definidas del siguiente modo: se consider de grado 0 a las clulas que no presentaban migracin; de grado 1 a las que la longitud de la cola del cometa era menor que el dimetro del ncleo; de grado 2 cuando la longitud de la cola del cometa era igual al dimetro del ncleo; grado 3 cuando dicha longitud era mayor al dimetro del ncleo; y por ltimo de grado 4 cuando el ncleo se ve reducido y el largo de la cola del cometa es ms del doble del dimetro del ncleo. Posteriormente se calcul el ndice de dao (ID), sumando los productos de la cantidad de clulas en cada clase por el nmero de la clase (rango 0 400).

Para la captura, anlisis de imgenes y medicin del parmetro tail moment (Figura 8), se emple un software especfico de anlisis del Ensayo Cometa. Los datos presentados corresponden al promedio de los valores de tail moment obtenidos del anlisis de 100 clulas en cada dilucin (50 clulas por rplica).

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Figure 7 . Grados de dao gentico considerados

en el anlisis visual.

Grado 2 Grado 0 Grado 1

Grado 3 Grado 4

Figure 8 Imagen obtenida mediante software de anlisis de imgenes. La lnea celeste indica el final de la cola del cometa. Las curvas celeste y roja (parte inferior) representan el perfil de intensidad de fluorescencia en la cabeza (ncleo celular) y la cola del cometa respectivamente.

4.6- Definicin De Unidades Para las pruebas de toxicidad se utilizaron las siguientes unidades:

LC50: Concentracin Letal 50 % - Corresponde a la concentracin del efluente a la cual se produce la muerte del 50 % de la poblacin expuesta.

EC50: Concentracin efectiva 50% - Corresponde a la concentracin del efluente a la cual se produce un cambio (definido como punto final) en el 50% de la poblacin expuesta. IC50: Concentracin de Inhibicin 50 %- Corresponde a la concentracin del efluente a la cual se

produce un efecto inhibitorio del 50 % de la poblacin expuesta.

UT: Unidades de Toxicidad - Corresponde a la inversa de la LC/EC/IC50, de acuerdo al algoritmo UT = 100 / LC/EC/IC50 Las unidades de toxicidad (UT) resultan ms convenientes para la visualizacin de los resultados dado que a diferencia de la LC/EC/IC50 se incrementa, en forma directamente proporcional a la toxicidad. TER: Tasa de emisiones txicas Otra forma de expresin de resultados de gran utilidad para el caso de emisiones, es aquella que adems de considerar la toxicidad de las muestras simples obtenida para cada bioensayo, incluye en el clculo el caudal de la fuente emisora. La ventaja de la aplicacin de esta unidad es que al considerar el caudal permitir evaluar el impacto sobre el cuerpo receptor. A iguales unidades de toxicidad la tasa de emisin txica al ambiente vara en forma proporcional al caudal vertido. Es as que efluentes industriales muy txicos pero con escaso caudal no generan tanto impacto sobre el cuerpo receptor, como s lo hacen efluentes poco txicos pero con alto volumen de vertido. La desventaja de esta unidad se basa en que el clculo de la misma debe hacerse para cada ensayo y/o punto final en particular no permitiendo la evaluacin integrada de varios ensayos en un mismo resultado.


INFORME FINAL INDICE PEEP (Potential Ecological Effects Probe) Este ndice fue desarrollado y utilizado originalmente en el marco del Plan de Accin del ro St. Lawrence para poder comparar el efecto txico de los efluentes industriales vertidos sobre el referido curso. La aplicacin del algoritmo permite unificar el resultado de varios ensayos de toxicidad con diversos puntos finales en un nico valor, logrando una equilibrada ponderacin de los efectos txicos sobre varios niveles trficos, adems de que considera tambin el caudal del efluente. La suma de estas dos cualidades aporta relevante informacin sobre el impacto del mismo sobre el cuerpo receptor. Frmula terica del clculo del ndice PEEP (P): P = log 10 [1 + n ( suma de Ti /N) Q] Donde n = nmero de puntos finales que exhiben respuesta txica N = nmero total de puntos finales Ti = Resultados obtenidos en cada bioensayo, expresado en Unidades de Toxicidad

(UT = 100/ LC/EC/IC50) Q = caudal en m3/hora El resultado obtenido, un nmero entero entre 0 y 10, define una escala que permite comparar la magnitud del impacto de diversos efluentes sobre un cuerpo receptor. Si bien la tasa de emisiones txicas (TER) nos da una idea del posible impacto ecolgico que tiene la descarga de un efluente, ya que considera el caudal vertido, presenta la desventaja de que los resultados se obtienen considerando aisladamente la toxicidad sobre cada uno de los organismos expuestos. Sin embargo, el ndice PEEP nos permite integrar los resultados de toxicidad, a la vez que considera los caudales vertidos. Si bien una idea ms acabada del efecto ecotoxicolgico debe considerar el caudal del cuerpo hdrico receptor que lamentablemente a los efectos de este trabajo no se pudo obtener, informacin cientfica manejada por la EPA a partir de los trabajos de Eagleson et al. (1990), consideran que los resultados de ensayos biolgicos de 3 niveles trficos realizados en el laboratorio, alcanzan una predictibilidad del efecto en los ecosistemas del orden del 88%. En el presente trabajo se adapt el ndice PEEP original, calculndolo en base a los cuatro o cinco bioensayos de acuerdo a los datos disponibles que fueron: inhibicin de la reproduccin de S. capricornutum, inhibicin del crecimiento y germinacin de L. sativa, ensayo letal con H. atenuatta, ensayo letal con D. magna y ensayo letal con C. decemmaculatus. NOEC ("No-Observed-Effect Concentration") - Concentracin Sin Efectos Observados Es la concentracin mayor en una serie de diluciones que no presenta diferencias significativas en los efectos biolgicos respecto del control. LOEC ("Lowest-Observed-Effect Concentration)- Concentracin Mnima con Efectos Observados. Es la concentracin mnima de una serie de diluciones que presenta diferencias significativas en los efectos biolgicos respecto del control. Finalmente se calific la calidad del agua de las estaciones de muestreo utilizando el ndice de Toxicidad (Bulich, 1982 y Coleman & Quereshi, 1985), que define categoras de toxicidad en relacin a los valores de LC/EC50 obtenidos. (Tabla 8). Dicho ndice se utiliza de rutina en la calificacin de los resultados obtenidos por el Sistema Internacional Microtox.

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INFORME FINAL LC/EC 50 INDICE CATEGORA

1 a 25 1 Muy Txica 26 a 50 2 Txica 51 a 75 3 Moderadamente Txica 76 a 99 4 Levemente Txica 100 o + 5 No Txica

Tabla 8 - Indice y categoras toxicolgicas.

4.7 - Mtodos estadsticos En todos los tests estadsticos se consider como significativo un valor p menor a 0,05. Determinacin del bioensayo ms sensible. Descriptivos para LC/EC/IC50%, UT y Categoras Toxicolgicas. El bioensayo agudo ms sensible se determin mediante ANOVA de dos factores (bioensayo como factor fijo y muestra como bloque). Se utiliz el test de Tukey B para los contrastes a posteriori debido a que algunas muestras no fueron analizadas por todos los bioensayos, presentando tamaos de muestra distintos (Zar, 1996). Para la determinacin del bioensayo ms sensible se consider el total de muestras analizadas con el bioensayo de C. Descenmaculatus (incluyndose: 8145, 8327, 8466 y 8712) para lo cual se trabaj con los valores lmite y promedio de los casos donde la LC/IC 50% no fue determinada en forma precisa. Para el clculo de la EC/IC50% en los bioensayos de D. magna e H. atenuatta se utilizaron tres mtodos estadsticos, segn la calidad de los datos experimentales obtenidos, dos paramtricos: Probit anlisis, Moving Average y uno no paramtrico: trimmed Spearman-Karber. Los dos estadsticos primeramente nombrados realizan la transformacin del dato en arco seno. Estas transformaciones se realizaron utilizando el Programa desarrollado en lenguaje Basic por Charles E. Stephan, U.S. EPA, y revisado por Richard G. Clements, U.S. EPA, Washington, DC para correr en programa DOS. Para el clculo de la EC50% de los ensayos con S. capricornutum y L. sativa se utiliz el sistema estadstico: A Linear Interpolation Method for Sublethal Toxicity: The Inhibition Concentration (ICp) Approach (Version 2.0) June 1993 U.S. Environmental Protection Agency Environmental Research Laboratory Duluth, MN 55804. Anlisis de la concordancia entre los bioensayos con y sin filtrado previo de la muestra. Los bioensayos que se efectuaron con efluente filtrado y no filtrado fueron analizados para determinar la equivalencia de los resultados en ambas situaciones. Para ello, se realiz un test de Student para muestras apareadas, se determin el coeficiente de correlacin de Pearson (CCP) y el coeficiente de concordancia (CC) (Lin, 1989; Zar, 1996). Si bien el test de Student y el CCP son dos mtodos estadsticos frecuentes en la bsqueda de equivalencias entre ensayos el CC es el ndice ms adecuado de la reproducibilidad de los resultados aun con bajos tamaos de muestra (Lin, 1989). Se consideran correlaciones y concordancias estadsticamente relevantes a partir de un valor de 0,7. Anlisis estadstico en ensayos de genotoxicicdad. Con el fin de explorar la relacin dosis-respuesta se ajust un modelo de regresin de Poisson por el mtodo de mxima verosimilitud (Edler 1992, Venables y Ripley 1999). Se consideraron como estadsticamente relevantes los modelos con cocientes de verosimilitud (LRT) significativos (p


INFORME FINAL El ensayo cometa fue analizado mediante un anlisis de varianza de dos factores (diluciones como factores fijos y rplicas como bloques) empleando un Modelo Lineal Generalizado (MLG) para datos con distribucin Gamma y mediante una funcin de ligamiento inversa (Lah et al., 2005; Venables and Ripley, 1999). En los casos donde el anlisis de varianza fue significativo se determin que dosis difera del control negativo mediante la construccin de intervalos de confianza al 95%. Comparacin entre resultados de bioensayos y parmetros fsico-qumicos Se efectu un anlisis de correlacin mediante el coeficiente no paramtrico de Spearman entre los bioensayos y las variables fsico-qumicas (Zar, 1996). Se consideraron para el anlisis los bioensayos ms sensibles de H. atenuatta, D. magna y L. sativa (en todos los casos fue el ensayo no filtrado), y S. capricornutum y C. decemmaculatus. En el caso en que se emple un efluente combinado (8287/8) se tom el valor promedio de los resultados de los anlisis fsico-qumicos para la exploracin de sus efectos en los bioensayos. 5- RESULTADOS Y DISCUSIN En el desarrollo del presente proyecto se realiz el anlisis de 29 muestras: 22 procedentes de efluentes industriales, 3 de origen pluvial y 1 de vertedero municipal. Las muestras procedentes de efluentes industriales correspondieron a 11 ramos industriales diferentes. En una de las curtiembres, adems del efluente final, se analizaron muestras de los vertidos producidos en las etapas de pelambre, curtido y tintado (Tabla 9).

Fecha de Tipo Caudal N Origen extraccin vertido (m

3/da)

1 7107 Curtiembre 7 17-8-04 C 1600 2 7217 Frigorfico 1 5-10-04 A 500 3 7515 Curtiembre 2 1-2-05 C 25 4 7521 Curtiembre 3 3-2-05 C 55 5 7561 Curtiembre 4 17-2-05 C 600 6 7563 Curtiembre 5 22-2-05 C 15 7 7568 Curtiembre 8 24-2-05 C 550 8 7574 Curtiembre 6 5-3-05 A 30 9 7579 Curtiembre 9 5-3-05 A 25 10 8145 Curtiembre 1 30-8-05 I 50 11 8175 Pinturera 6-9-05 I 60 12 8227 Metalrgica 13-9-05 A 40 13 8254 Qumica 1 20-9-05 A 130 14 8287/88 Refinera 27-9-05 A 900 m3/h 15 8327 Textil 4-10-05 A 140 16 8363 Aceitera 18-10-05 A 700 17 8396 Maltera 25-10-05 A 700 18 8439 Qumica 2 8-11-05 I 5 19 8440 Grasera 8-11-05 A 50 20 8466 Frigorfico 2 15-11-05 A 650 21 8532 Gas natural 20-12-05 A 25 22 8534 Pozo Vertedero 21-12-05 ---- ---- 23 8603 Pluvial Alaska I 10-1-06 A ---- 24 8636 Pluvial Alaska II 17-1-06 A ---- 25 8673 Pluvial Alaska III 31-1-06 A ---- 26 8710 Curtiembre 9 - curtido 14-2-06 C ---- 27 8711 Curtiembre 9 - efluente 14-2-06 C 1600 28 8712 Curtiembre 9 - pelambre 14-2-06 C ----

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INFORME FINAL 29 8713 Curtiembre 9 - tintado 14-2-06 C ----

Tabla 9 - Total de muestras analizadas.

C: vertido a colector; I: infilracin a terreno; A: vertido a curso de agua.

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Evaluacin de la toxicidad aguda y genotoxicidad de efluentes industriales vertidos en las principales cuencas hdricas del Municipio de Montevideo, Uruguay INFORME FINAL

5.1- Caracterizacin fisicoqumica de los efluentes

N Registro

Tipo Industria

pH DBO5 (mg/l)

DQO (mg/l)

Grasas y

Aceites (mg/l)

Sulfuros (mg/l)

Slidos Sediment.

(1 hora) ml/l

Slidos Susp.

Totales (mg/l)

Fsforo T (mg/l P)

CF (ufc/100

ml)

Cromo (mg/l)

Plomo (mg/l)

Cadmio (mg/l)

Cobre (mg/l)

Amonio (mg/l)

Lmite decreto 253/79 y modificativos para

infiltracin a terreno

5,5 - 9,0 s/lm 200 s/lm s/lm 3 0,3 0,05 1 s/lm

8145 Cur 7,6 2.000 5.900 900 1 680 23 3.100.000 12


INFORME FINAL Del total de muestras de origen indutrial estudiadas 17 (77,3%) incumplen con la normativa en los niveles de emisin de algn parmetro fsico-qumico (FQ) (Tabla 10). Las industrias que presentan un mayor nmero de parmetros (6) por encima de los lmites estipulados en la normativa, corresponden a los rubros de Grasera (8440) y Qumica (8254) (Tabla 11). Los parmetros FQ en los que ms se incumple fueron DBO y el cromo ambos en un 47,1% (8/17). Muestra Rubro N Parmetros

8363 Aceitera 1 1 fsforo total 8145 Curtiembre 1 2 GyA; cromo 7515 Curtiembre 2 1 cromo 7521 Curtiembre 3 5 pH; DBO5; sulfuros; SS; cromo 7561 Curtiembre 4 1 sulfuros 7563 Curtiembre 5 1 cromo 7574 Curtiembre 6 2 pH; amonio 7107 Curtiembre 7 4 DBO5; GyA; sulfuros; cromo 7568 Curtiembre 8 2 DBO5; cromo 7579 Curtiembre 9 2 cromo; plomo 7217 Frigorfico 1 5 DBO5; sulfuros; fsforo total ; CF; amonio 8440 Grasera 1 6 DBO5; sulfuros; SST; fsforo total; CF; amonio 8396 Maltera 1 5 DBO5; SST; fsforo total; CF; amonio 8227 Metalrgica 1 2 pH; SST 8254 Qumica 1 6 DBO5; GyA; SST; CF; cromo; amonio 8439 Qumica 2 1 Slidos totales 8327 Textil 1 3 pH; DBO5; CF

Tabla 11 - Resumen de los parmetros fsico-qumicos en los cuales las industrias presentan niveles por encima de los lmites establecidos en la normativa. GyA: Grasas y Aceites; SS: slidos sedimentados; SST: slidos suspendidos totales. N: cantidad de parmetros en los que se incumple con la normativa.

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INFORME FINAL 5.2 - Bioensayos El uso de varios bioensayos conformados con especies de distintos niveles trficos produce un significativo incremento de la capacidad de deteccin cuali y cuantitativa de txicos. Los resultados presentados en las siguientes tablas muestran distintas respuestas de sensibilidad de los bioensayos considerados individualmente frente a diferentes efluentes. A continuacin se presentan en las siguientes tablas los resultados obtenidos de las pruebas de toxicidad.

INDUSTRIA

H. atenuatta LC50

D. Magna

LC50

L. Sativa

IC50

S. Capricornutum

EC50

C. decemmaculatus

LC50 N

Registro Rubro F S/F F S/F F S/F F S/F

7107 Curtiembre 7 No 3,42 No 6,59 No 48,09 5,15 No 7217 Frigorfico 1 No 2,97 No 16,49 No No 16,21 No 7515 Curtiembre 2 17,68 6,53 16,91 5,32 69,02 No 100 No 7521 Curtiembre 3 7,79 1,27 3,03 2,61 23,09 No 2,94 No 7561 Curtiembre 4 4,42 3,58 13,23 14,23 No 44,89 4,33 No 7563 Curtiembre 5 No 9,57 No 6,48 No No 23,28 No 7568 Curtiembre 8 No 0,69 No 6,48 No 59,42 4,19 No 7574 Curtiembre 6 40,71 5,05 45,24 21,76 No 100 100,00 No 7579 Curtiembre 9 No S/D No S/D No 79,47 3,24 No 8145 Curtiembre 1 0,76 0,59 0,32 0,37 25,30 36,63 9,61 No

8175 Pinturas No 0,84 No 0,66 100,00 100,00 1,38 100,00

8227 Metalrgica 3,58 4,42 3,00 3,55 15,23 1,31 No 1,51

8254 Ind Qumica 1 0,59 0,50 0,45 0,41 17,13 5,71 No 0.46

8287/88 Refinerra 100,00

100,00

100,00 100,00 No No 100,00 100,00

8327 Textl 41,04 30,46 32,24 13,13 100,00 100,00 34,02 No

8363 Aceitera 100,00

100,00

93,10 57,17 62,53 48,95 100,00 100,00

8396 Maltera 7,98 6,74 62,34 71,69 100,00 100,00 100,00 19,2

8439 Ind Qumica 2 65,34 61,43 100,00 64,48 62,55 44,85 88,53 30,4

8440 Grasera 3,47 2,29 11,67 7,82 25,23 33,00 18,92 6,11

8466 Frigorfico 2 2,75 1,79 13,48 17,76 100,00 100,00 47,65 No

8532 Gas 100,00

100,00

100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 No

8534 Volcadero No 5,42 No 31,10 No 100,00 34,50 10,50

8603 P. Alaska I 6,43 3,37 65,78 34,37 100,00 100,00 100,00 No

8636 P. Alaska II 2,23, 4,11 33,52 41,47 100,00 100,00 100,00 No

8673 P. Alaska III 5,13 4,08 12,88 9,07 48,24 37,06 NO color No

8710 SF Curtido No 0,019 No 0,013 No 13,32 M. Color 1,57

8711 Curtiembre E. Final No 2,29 No 6,10 No 14,34 C.P. 8,50

8712 Pelambre No 0,015 No 0,21 No 13,85 M. Color No

8713 Tintado No 14,99 No 27,89 No 25,99 M. Color 5,30 Tabla 12 - Los resultados de los bioensayos se expresan en unidades LC/EC/IC 50 (dependiendo del

bioensayo considerado). Ver Definicin de Unidades en Materiales y Mtodos). F: muestra filtrada; S/F: muestra sin filtrar.

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INFORME FINAL

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INDUSTRIA CAUDAL H. atenuatta UT

D. mMagna UT

L. sativa UT

S. capricornutum UT

C. decemmeculatusUT PEEP

N Registro Rubro m3/da F S/F F S/F F S/F F S/F 7107 Curtiembre 1 1600 29,24 15,17 2,08 19,42 5,02 7217 Frigorfico 1 500 33,67 6,06 6,17 4,36 7515 Curtiembre 2 25 5,66 15,31 5,91 18,80 1,45 1,00 2,82 7521 Curtiembre 3 55 12,84 78,74 33,00 38,31 4,33 34,01 3,93 7561 Curtiembre 4 600 22,62 27,93 7,56 7,03 2,23 23,09 4,56 7563 Curtiembre 5 15 10,45 15,43 4,30 2,66 7568 Curtiembre 6 550 144,93 15,43 1,68 23,87 5,01 7574 Curtiembre 7 30 2,46 19,80 2,21 4,60 1,00 1,00 2,56 7579 Curtiembre 8 25 1,26 30,86 2,91 8145 Curtiembre 9 50 131,58 169,49 312,50 270,27 3,95 2,73 10,41 4,39 8175 Pinturas 60 119,05 151,52 1,00 1,00 72,46 1,00 4,09

8227 Metalrgica 40 27,93 22,62 33,33 28,17 6,57 76,34 66,23 3,91 8254 Ind Qumica 1 130 169,49 200,00 222,22 243,90 5,84 17,51 4,78

8287/88 Petrolera 900 m3/h 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,00 8327 Textl 140 2,44 3,28 3,10 7,62 1,00 1,00 2,94 3,16 8363 Aceitera 700 1,00 1,00 1,07 1,75 1,60 2,04 1,00 1,00 3,03 8396 Maltera 700 12,53 14,84 1,60 1,39 1,00 1,00 1,00 5,21 3,96 8439 Ind Qumica 2 5 1,53 1,63 1,00 1,55 1,60 2,23 1,13 3,29 1,70 8440 Grasera 50 28,82 43,67 8,57 12,79 3,96 3,03 5,29 16,37 3,61 8466 Frigorfico 2 650 36,36 55,87 7,42 5,63 1,00 1,00 2,10 4,50 8532 Gas 25 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,00 S/N Volcadero 18,45 3,22 1,00 2,90 9,52 S/DQ

8603 P. Alaska I 15,55 29,67 1,52 2,91 1,00 1,00 1,00 S/DQ 8636 P. Alaska II 24,33 2,98 2,41 1,00 1,00 1,00 S/DQ 8673 P. Alaska III 19,49 24,51 7,76 11,03 2,07 2,70 S/DQ 8710 Sub-E. Curtido 5263,16 7692,31 7,51 63,69 S/DQ 8711 Curtiembre E. Final 1600 43,67 16,40 6,97 11,76 5,10 8712 Sub-E. Pelambre 6666,67 476,19 7,22 S/DQ

8713 Sub-E. Tintado 6,67 3,59 3,85 18,87 S/DQ Tabla 13 - Los resultados de los bioensayos estn expresados en UT y PEEP. EN el caso del PEEP se

seleccion el mayor valor de toxicidad entre las opciones de las muestras filtradas y sin filtrar. La utilizacin de las UT ofrece la ventaja de una interpretacin ms adecuada de los resultados obtenidos al presentar una relacin directamente proporcional con la toxicidad de la muestra a diferencia de lo que ocurre con las Unidades LC50 cuya relacin es inversamente proporcional. Esto quiere decir que a menor valor de LC50 mayor es la toxicidad de la muestra, en tanto, para las UT un mayor valor de la misma se corresponde con una mayor toxicidad. En funcin de los valores de UT, las empresas ms contaminantes para cada bioensayo fueron: Qumica 1 (8254), Curtiembre 1 (8145), Metalrgica (8227) y Pintura (8175). Para estas empresas se observ una buena concordancia entre los resultados de muestras filtradas y no filtradas (Tabla 14).

N Rubro H. atenuatta (F) D. magna

(F) L. sativa

(F) S. capricornutum

(F) H. atenuatta

(no F) D. magna

(no F) L. sativa (no F)

C. decemmaculatus(no F)

8254 qu 169,5 200,0 217,4 8145 cur 312,5 270,3 8227 met 6,6 76,3 8175 pin 72,5 Tabla 14 - Efluentes ms txicos respecto de los valores de UT de los distintos bioensayos (F: filtrado; no F:

no filtrado). cur: curtiembre; met: metalrgica; pin: pintura; qu: qumica.


INFORME FINAL La unidad TER definida como la tasa de emisiones txicas, se compone del producto de las UT por el caudal de emisin del efluente. Este hecho introduce un elemento sustancial para la evaluacin del impacto de la toxicidad producida por el efluente. Por esta razn, dos efluentes con el mismo valor de toxicidad tendrn impactos diferentes proporcionales a sus caudales de emisin. Al igual que para las unidades de toxicidad la debilidad que presenta esta medida radica en que debe ser estimada para cada ensayo utilizado no permitiendo la integracin de los resultados obtenidos por varios bioensayos simultneamente. En funcin de los valores TER las empresas ms contaminantes para cada bioensayo fueron: Qumica 1 (8254), Frigorfico 2 (8466), Curtiembres 7 y 8 (7107 y 7568) (Tabla 15).

N Rubro H. atenuatta (F) D. magna

(F) L. sativa

(F) S. capricornutum

(F) H. atenuatta

(no F) D. magna

(no F) L. sativa (no F)

C. decemmaculatus(no F)

8466 fri 23636 8254 qu 28889 759 31707 28261 7107 cur 31068 3327 7568 cur 79710

Tabla 15 - Efluentes ms txicos respecto de los valores de TER de los distintos bioensayos (F: filtrado; no F:

no filtrado). cur: curtiembre; fri: frigorfico; qu: qumica. Segn surge del anlisis de la toxicidad presentado en las tablas 14 y 15, el uso de diferentes unidades de toxicidad, en este caso, UT y TER, identifican diferentes industrias como las de mayor impacto txico. Otra alternativa para la evaluacin del impacto txico de los efluentes es el uso del Potential Ecological Effects Probe. Este ndice rene el resultado de varios ensayos y/o puntos finales de cada ensayo, con lo cual mejora la capacidad umbral de deteccin cuali y cuantitativa de los toxicos potencialmente presentes adems de incluir el valor del caudal de emisin. El resultado final es un valor entero en una escala de 0 a 10 que facilita la interpretacin y la comparacin del impacto de efluentes provenientes de diverso rubros sobre el cuerpo receptor final. Las empresas estudiadas presentaron un valor promedio PEEP de 3,8 (DE= 0,96), un mnimo valor de 1,7 para la industria Qumica 2 (8439) y un mximo de 5,1 que correspondi a la Curtiembre 7 (7107) (Tablas 13 y 16). No se consideraron los efluentes 8287/88 (Refinera) y 8532 (Gas Natural) dado que no presentaron toxicidad para ninguno de los bioensayos realizados.

N Promedio Mediana Media Geomtrica DE Mnimo Mximo PEEP 20 3,80 3,95 3,67 0,96 1,70 5,10

Tabla 16 - Valores de PEEP para los bioensayos. DE: desvo estndar

El comportamiento de este ndice mostr una aceptable reproducibilidad en relacin a la aplicacin del mismo durante el desarrollo del proyecto Los bioensayos como herramienta para la evaluacin de la toxicidad de los efluentes industriales en Uruguay. Informe final proyecto IDRC ejecutado durante el ao 2002, para una distribucin de industrias similar (Figuras 9 y 10).

21


INFORME FINAL

Figura 9 - ndices PEEP para cada uno de los efluentes. Ao 2002

0

1

2

3

4

5

6

curti

embr

e

lane

ra

petro

quim

ica

carn

ica

carn

ica

curti

embr

e

curti

embr

e

lact

ea

carn

ica

mal

teria

chac

inad

os

carn

ica

curti

embr

e

carn

ica

labo

rato

rio

pesq

uera

lane

ra

quim

ica

carn

ica

text

il

licua

do d

e ga

s

olea

gino

sa

text

il

lact

ea

pint

urer

ia

lact

ea

olea

gino

sa

pesq

uera

pint

urer

ia

Ramo industrial

ndi

ce P

EEP

Comparativo Toxicidad Industrias

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

Ac

eit

era

Fri

go

rfi

co

1

Fri

go

rfi

co

2

Ga

s

Gra

ser

a

Ind

Qu

mic

a 1

Ind

Qu

mic

a 2

Ma

lte

ra

Me

tal

rgic

a

Pe

tro

lera

Pin

tura

s

Te

xt

l

Cu

rtie

mb

re 1

Cu

rtie

mb

re 2

Cu

rtie

mb

re 3

Cu

rtie

mb

re 4

Cu

rtie

mb

re 5

Cu

rtie

mb

re 6

Cu

rtie

mb

re 7

Cu

rtie

mb

re 8

Cu

rtie

mb

re 9

Cu

rtie

mb

re 1

0 (

E.

Fin

al)

I. PEEP

Figura 10 - Indices PEEP para cada uno de los efluentes. Ao 2005

De la observacin de los valores medios de LC50%, IC/EC50% y UT resulta que los bioensayos se ordenan desde un mximo de sensibilidad a un mnimo de la siguiente forma (Tablas 17 a 20; Figuras 11 y 12): H. atenuatta, D. magna, C. decemmaculatus, S. Capricornutum y L. sativa.

N Promedio Mediana Media Geomtrica DE Mnimo Mximo H. atenuatta 18 28,33 7,11 9,72 37,36 0,59 100,00

D. magna 18 39,29 24,58 16,78 37,78 0,32 100,00 S. Capricornutum 22 49,73 34,26 24,65 43,31 1,38 100,00

L. sativa 16 65,52 65,79 53,86 35,18 15,23 100,00 Tabla 17 - Valores de LC50% e IC/EC50% para los bioensayos empleando muestras filtradas.

N Promedio Mediana Media Geomtrica DE Mnimo Mximo

H. atenuatta 28 17,02 3,83 3,50 31,72 0,02 100,00 D. magna 28 23,83 11,10 7,68 29,25 0,01 100,00

C. decemmaculatus 12 31,96 9,50 10,52 41,87 0,50 100,00 L. sativa 24 58,62 48,52 41,02 36,83 1,31 100,00

Tabla 18 - Valores de LC50% e IC/EC50% para los bioensayos empleando muestras no filtradas.

22


INFORME FINAL N Promedio Mediana Media Geomtrica DE Mnimo Mximo

D. magna 18 36,32 4,51 5,96 86,03 1,00 312,50 H. atenuatta 18 29,84 14,19 10,29 46,31 1,00 169,49

S. Capricornutum 22 11,22 2,92 4,06 17,31 1,00 72,46 L. sativa 16 2,40 1,52 1,86 1,89 1,00 6,57

Tabla 19 - Valores de UT para los bioensayos empleando muestras filtradas.



C. decemmaculatus 12 34,61 10,64 9,50 61,95 1,00 217,39 L. sativa 24 6,18 2,06 2,44 15,39 1,00 76,34

Tala 20 - Valores de UT para los bioensayos empleando muestras no filtradas.

22161818N =

bioensayos filtrados

SelenastrumLactucaDaphniaHydra

UT

100

75

50

25

012242828N =

bioensayos no filtrados

CnesterodonLactucaDaphniaHydra

UT

150

125

100

75

50

25

0

Figura 11 - Grfico de cajas y lneas de Figura 12 - Grfico de cajas y lneas de los

valores de UT para los bioensayos valores de UT para los bioensayos filtrados. no filtrados.

.

Los valores medios del ndice TER tambin determinan el mismo orden de los bioensayos, mantenindose H. atenuatta como la ms sensible y de mayor valor TER, y L. sativa como la menos sensible (Tabla 21 y 22).

N Promedio Mediana Media Geomtrica DE Mnimo Mximo H. atenuatta 15 6716,60 1117,32 1109,75 9035,63 7,65 23636,36

D. magna 15 5440,07 1122,87 857,31 9072,99 5,00 28888,89 S.capricornutum 19 4938,75 700,00 677,33 8719,49 5,65 31067,96

L. sativa 13 338,02 198,18 163,05 351,85 7,99 1119,46 Tabla 21 - Valores de TER para los bioensayos provenientes de muestras filtradas.



C. decemmaculatus 11 18970,32 3645,83 3023,47 29965,99 16,45 101910,83

L. sativa 20 2758,16 812,81 556,48 4098,98 11,15 12012,01 Tabla 22 - Valores de TER para los bioensayos provenientes de muestras no filtradas.

23


INFORME FINAL En la clasificacin de las categoras toxicolgicas se encuentra que la mayora de los bioensayos sealan un predominio de muestras muy txicas, con la excepcin de L. sativa (Tabla 23 y 24; Figuras 13 y 14).

H. atenuatta D. magna L. sativa S. capricornutum Total Muy Txica 12 (66,6 %) 9 (50,0 %) 3 (18,8 %) 10 (45,5 %) 34 (45,9 %)

Txica 2 (11,1 %) 3 (16,7 %) 3 (18,8 %) 3 (13,6 %) 11 (14,9 %) Moderadamente Txica 1 (5,6 % 2 (11,1 %) 3 (18,8 %) 0 (0,0 %) 6 (8,1 %)

Levemente Txica 3 (16,7 %) 4 (22,2 %) 7 (43,6 %) 9 (40,9 %) 23 (31,1 %) Total 18 (100 %) 18 (100 %) 16 (100 %) 22 (100 %) 74 (100 %)

Tabla 23 - Categoras Toxicolgicas en muestras filtradas.

H. atenuatta D. magna L. sativa C. decemmaculatus Total Muy Txica 23 (82,1 %) 19 (67,9 %) 5 (20,8 %) 8 (66,7 %) 55 (59,8 %)

Txica 1 (3,6 %) 4 (14,3 %) 8 (33,3 %) 1 (8,3 %) 14 (15,2 %) Moderadamente Txica 1 (3,6 %) 3 (10,7 %) 1 (4,2 %) 0 (0,0 %) 5 (5,4 %)

Levemente Txica 3 (10,7 %) 2 (7,1 %) 10 (41,7 %) 3 (25,0 %) 18 (19,6 %) Total 28 (100 %) 28 (100 %) 24 (100 %) 12 (100 %) 92 (100 %)

Tabla 24 - Categoras Toxicolgicas en muestras no filtradas.

0%

25%

50%

75%

100%

Hydra Daphnia Lactuca Selenastrum

Bioensayo

% d

e C

T

Muy Txica Txica Moderadamente Txica Levemente Txica

Figura 13 - Distribucin porcentual de las categoras toxicolgicas (% de CT) para los bioensayos filtrados.

0%

25%

50%

75%

100%

Hydra Daphnia Lactuca CnesterodonBioensayo

% d

e C

T

Muy Txica Txica Moderadamente Txica Levemente Txica

Figura 14 - Distribucin porcentual de las categoras toxicolgicas (% de CT) para los bioensayos no filtrados.

Del ANOVA para los bioensayos filtrados resulta que H. atenuatta es el ms sensible pero no difiere significativamente de D. magna (Tablas 25 y 26; Figura 15). A su vez, D. magna y S. capricornutum estn en un siguiente nivel de sensibilidad y no difieren entre s. Luego S. capricornutum y L. sativa forman un tercer grupo sin diferencias significativas.

Fuente de Variacin Factor Tipo IV SC Gl CM F Valor-p Bioensayo filtrado Fijo 15963,762 3 5321,254 8,742 < 0,001

Muestra Aleatorio 77959,254 24 3248,302 5,337 < 0,0001 Error 27999,84 46 608,692

Tabla 25 - Anlisis de varianza para los bioensayos H, atenuatta, D. magna, S. capricornutum y L. sativa, con muestras filtradas.

Bioensayo filtrado N Promedios de los conjuntos homogneos A B C

H. atenuatta 18 28,3278 D. magna 18 39,2883 39,2883

S. capricornutum 22 49,725 49,725 L. sativa 16 65,52

Tabla 26 - Comparacin mltiple, test de Tukey B, para los bioensayos H, atenuatta, D.

magna, S. capricornutum y L. sativa, con muestras filtradas.

24

Evaluacin de la toxicidad aguda y genotoxicidad de efluentes industriales vertidos en las principales cuencas hdricas del Municipio de Montevideo, Uruguay INFORME FINAL

Hydra Daphnia Lactuca Selenastrum

Bioensayo filtrado

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100In

dica

dor

Figura 15 - Intervalos de confianza al 95% para

los bioensayos filtrados, el indicador fue la DL50% o IC/EC50.

Hydra Daphnia Lactuca Cnesterodon

Bioensayos no filtrado

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Indi

cado

r

Figura 16 - Intervalos de confianza al 95% para los

bioensayos no filtrados, el indicador fue la DL50% o IC50%.

.En el ANOVA para los bioensayos no filtrados nuevamente H. atenuatta resulto el ms sensible pero sin diferir significativamente de D. magna y C. decemmaculatus (Tablas 27 y 28; Figura 16). El bioensayo con L. sativa fue significativamente distinto de los restantes.

Fuente de Variacin Factor Tipo IV SC Gl CM F Valor-p Bioensayo no filtrado Fijo 23757,617 3 7919,206 15,06 < 0,0001

Muestra Aleatorio 69090,042 28 2467,501 4,692 < 0,0001 Error 33654,723 64 525,855

Tabla 27 - Anlisis de varianza para los bioensayos H. atenuatta, D. magna, C. decemmaculatus y L. sativa, con muestras no filtradas.

Bioensayo no filtrado N Promedios de los conjuntos homogneos

A B H. atenuatta 28 17,0155

D. magna 28 23,82929 C. decemmacultaus 16 25,80438

L. sativa 24 58,62 Tabla 28 - Comparacin mltiple, test de Tukey B, para los bioensayos H. atenuatta, D. magna, C.

decemmacultaus y L. sativa, con muestras no filtradas. Del anlisis de correlacin entre muestras filtradas y no filtradas resultan valores para el coeficiente de Pearson mayores a 0,9 y coeficientes de concordancia mayores a 0,8 (Tablas 29 y 30). Particularmente los coef. de concordancia elevados (CC>0,8) indican una equivalencia entre los valores obtenidos para una muestra por ambos mtodos.

Bioensayos N CCP IC95%

H. atenuatta (F) & H. atenuatta (no F) 18 0,973 0,928 0,990 D. magna (F) & D. magna (no F) 18 0,922 0,798 0,971

L. sativa (F) & L. sativa (no F) 14 0,976 0,924 0,993 Tabla 29 - Correlacin de Pearson entre los bioensayos filtrados (F) y no filtrados (no F).

Bioensayos N CC IC95%

H. atenuatta (F) & H. atenuatta (no F) 18 0,968 0,912 0,988 D. magna (F) & D. magna (no F) 18 0,894 0,739 0,959

L. sativa (F) & L. sativa (no F) 14 0,969 0,907 0,990 Tabla 30 - Coeficiente de Concordancia (Lin, 1989 ) entre los bioensayos filtrados (F) y

no filtrados (no F).

5.3- Ensayos de genotoxicidad

25


INFORME FINAL Fueron realizados el test de aberraciones cromosmicas y el ensayo cometa para 28 muestras provenientes de 11 ramos industriales diferentes.

Diluciones N Muestra 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125% 1,56% 0,78% 0,39% 0% LOEC

7107 (P) NC 36 * 32 * 30 * 31 * --- --- --- 5 3,1257217 NC 12 9 12 11 --- --- --- 4 7515 (P) NC 21* 23* 18* 16* --- --- --- 6 3,1257521 (P) NC 19* 18* 16* 14 --- --- --- 5 6,25 7561 12 14 10 11 12 --- --- --- 6 7563 13 12 14 10 12 --- --- --- 5 7568 NC NC 12 16* 14* --- --- --- 6 3,1257574 NC 18* 14 17* 16* --- --- --- 7 3,1258145 NC NC NC NC NC NC --- --- 6 8175 --- --- 7 8 7 6 5 6 5 8227 --- --- 8 9 7 8 7 6 6 8254 --- --- 10 9 10 7 8 5 6 8287 8 9 8 7 9 8 9 6 7 8327 9 8 6 7 8 6 9 6 8 8363 10 10 9 8 7 --- --- --- 6 8396 6 6 7 7 6 6 5 7 5 8439 9 6 9 7 6 7 8 7 6 8440 8 8 6 7 8 6 7 6 6 8466 10 11 12 7 8 --- --- --- 7 8532 (P) NC 16 14 14 12 13 11 9 7 8539 NC 7 10 8 9 8 6 7 8 8603 NC 12 12 20# 10 --- --- --- 7 8636 NC NC 13 11 14 --- --- --- 8 8673 NC 11 12 9 8 --- --- --- 6 8710 (P) NC NC 35* 31* 30* 21* --- --- 7 1,56 8711 (P) NC NC 21* 20* 23* 18* --- --- 6 1,56 8712 NC NC NC NC NC NC --- --- 7 8713 NC NC 10 12 10 9 --- --- 6

Tabla 31 - Frecuencia de aberraciones cromosmicas encontradas en 100 clulas analizadas al azar. NC: no clulas. (#) en este caso se observ un nmero mayor a lo previsto de clulas endoreduplicadas (clulas que duplicaron su material hereditario pero no alcanzaron la divisin celular), lo que puede ser debido a una carencia de nutrientes durante el cultivo celular en este punto experimental. (P): se indican las muestras que presentaron un buen ajuste al modelo de Poisson (p


INFORME FINAL

Fig. 17 Aberraciones cromosmicas encontradas en el anlisis de las

muestras procedentes de curtiembres (Flechas: Gaps y fracturas de cromtida).

En relacin al anlisis de las aberraciones cromosmicas se observ un predominio de las aberraciones cromosmicas de tipo cromtida (Figura 17). La mayora de los agentes qumicos no radio-mimticos inducen alteraciones cromosmicas de tipo cromtida, es decir que las lesiones primarias inducidas por estos agentes mutagnicos requieren que la clula pase por la fase de duplicacin celular para convertir esta lesin en una aberracin cromosmica. Se observ que 7 muestras (7107, 7515, 7521, 7568, 7574, 8710 y 8711), todas procedentes de curtiembres, produjeron un aumento estadsticamente significativo (p


INFORME FINAL

Diluciones N

muestra 0% 0,195% 0,39% 0,78% 1,56% 3,125% 6,25% 12,5% 25% 50%

7515 0,85 ND ND ND ND 3,73 * 1,06 3,11 * 1,03 7521 0,53 ND ND ND ND 2,13 * 1,75 * 2,61 * 0,98 * 0,89 *7561 0,89 ND ND ND ND 1,67 * 0,60 * 1,55 * 0,88 1,52 7563 0,68 ND ND ND ND 3,31 * 2,11 * 0,69 0,53 0,61 7568 1,29 ND ND ND ND 1,30 1,05 1,49 1,51 6,15 *8145 1,93 2,63 2,73 2,01 1,54 1,17 1,41 ND ND ND 8175 0,96 1,67 * 0,75 0,67 0,80 0,65 0,88 1,10 * ND ND 8227 0,71 1,17 * 1,15 1,09 0,98 1,73 * 2,34 * ND ND ND 8254 0,55 0,47 0,51 0,67 0,70 0,61 ND ND ND ND 8287 0,72 ND 0,85 0,86 0,85 0,75 1,43 * 0,53 ND 0,95 8327 0,71 ND 1,57 * 2,87 * 1,35 * 1,06 0,88 0,80 0,93 0,72 8363 0,63 ND ND ND ND 0,72 0,33 0,61 0,70 0,59 8396 0,59 ND ND 0,84 0,63 0,64 0,56 0,80 0,59 0,62 8439 0,77 ND ND ND 1,66 * 0,92 1,47 * 2,47 * 1,51 * 0,40 8440 0,71 ND ND 1,30 1,16 ND 2,00 1,25 1,27 0,51 8466 0,93 ND ND 0,57 0,49 0,68 0,99 1,09 1,09 0,83 8532 0,64 ND ND 0,78 0,49 0,46 0,61 0,53 0,54 0,80 8539 0,69 ND ND 0,62 0,70 0,68 0,67 0,73 0,63 0,66 8603 0,63 ND ND ND ND 0,72 0,45 0,36 0,75 0,65 8636 0,65 ND ND ND ND 0,49 0,58 0,83 * 1,81 * 2,53 *8673 1,64 ND ND ND ND 1,14 1,32 * 0,47 0,93 5,10 *8710 0,40 ND ND ND ND 0,59 * 0,41 0,80 * 1,46 * ND 8711 0,51 ND ND ND 0,63 0,54 0,46 0,57 ND ND 8713 0,51 ND ND ND ND 0,60 * 0,45 0,64 0,65 * 2,29 *

Tabla 32 - Resultados del ensayo cometa. Los datos presentados corresponden al promedio de los valores de tail moment de 100 clulas en cada dilucin- (50 clulas de cada rplica) analizadas al azar. ND: no existen datos. (*) Diluciones que presentaron diferencias estadsticamente significativas con respecto al control negativo (Anlisis de varianza (MLG)), ver anexo Tabla 3).

En el ensayo cometa, en 14 de las 24 muestras analizadas se encontraron diferencias estadsticamente significativas entre al menos una de las diluciones y el control negativo (7515, 7521, 7561, 7563, 7568, 8175, 8227, 8287, 8327, 8439, 8636, 8673, 8710 y 8713). Las mismas se distribuyen de la siguiente manera: 7 muestras provenientes de curtiembres, 1 pinturera, 1 metalrgica, 1 refinera, 1 textil, 1 industria qumica y 2 de origen pluvial (Tabla 32, anexo 1 - Tabla 3). Los resultados provenientes de ambos ensayos de genotoxicidad coincidieron en 4 de las muestras analizadas y slo en un caso el ensayo de las aberraciones cromosmicas present genotoxicidad cuando el ensayo cometa no. Por otro lado, tanto en el test de aberraciones cromosmicas como en el ensayo cometa pudo observarse un incremento del grado de genotoxicidad en el rubro curtiembres. De todos modos, el ensayo cometa permiti determinar dao gentico en un mayor nmero de industrias que el obtenido mediante el test de aberraciones cromosmicas. Este hecho puede ser debido a que el ensayo cometa es ms sensible que el test de aberraciones cromosmicas a la hora de detectar dao gentico, debido a que busca la presencia de lesiones a nivel del ADN y no de la estructura cromosmica en s misma. 5.4- Comparacin entre resultados de bioensayos, ensayos de genotoxicidad y anlisis FQ Para realizar un anlisis comparativo de los resultados obtenidos entre los bioensayos y los ensayos de genotoxicidad se gener una tabla que indica la categora toxicolgica y la presencia de

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INFORME FINAL genotoxicidad (Tabla 34). Los valores de la categora toxicolgica se tomaron de muestras no filtradas en aquellos casos en que hubo un doble procesamiento (filtrado y no filtrado). De la comparacin de ambos tipos de ensayos resulta que siempre que el ensayo de aberraciones cromsomicas mostr un efecto positivo, los bioensayos de H. atenuatta, D. magna y C. decemmaculatus fueron muy txicos (CT=1; Tabla 33). El bioensayo de L. sativa mostr resultados desde muy txico a moderadamente txico (1


INFORME FINAL Las variables FQ que presentaron correlaciones significativas con los bioensayos fueron: DBO, DQO, grasas y aceites, y amonio (Tabla 34).

H. atenuatta D. magna L. sativa C.decemmaculatus S.capricornutum pH rs -0,225 0,008 0,279 -0,114 -0,147

Valor-p 0,249 0,967 0,187 0,675 0,514 N 28 28 24 16 22

DBO rs -0,48 -0,55 -0,702 -0,905 -0,428 Valor-p 0,011 0,003


INFORME FINAL El estudio de correlacin entre las variables FQ y los bioensayos (Tabla 34) debe considerarse como exploratorio de posibles relaciones. Debido a que no todas las muestras tienen la medicin de todas las variables y en muchos casos los valores de la misma estuvieron en el lmite de deteccin de la tcnica (considerndose para el anlisis el valor umbral). Sin embargo, se destaca la correlacin observada entre el amonio en H. atenuatta que ya ha sido observado en otros estudios y tambin en este caso con C. decemmaculatus. La DBO fue la variable que se correlacion con todos los bioensayos. 5.5 Otras actividades realizadas en el marco del proyecto 5.5.1- Anlisis mediante Citometra de Flujo de Selenastrum capricornutum

La Citometra de Flujo es una poderosa herramienta que permite realizar el recuento de partculas o clulas marcadas con una sustancia fluorescente que se encuentran suspendidas en una columna lquida a una velocidad de 6.000 eventos por segundo. En este sentido, la aplicacin de esta tecnologa para el recuento de algas que poseen clorofila como colorante fluorescente, ha permitido realizar el recuento de todo el ensayo en un tiempo breve y con una gran precisin debido a que es posible manejar valores absolutos del recuento de algas y no estimaciones realizadas a travs del empleo de una cmara cuenta glbulos (Figura 18).

Figura 18 - Recuento de algas (Selenastrum carpicornutum) mediante citometra de flujo provenientes de cultivos expuestos a diluciones crecientes de un efluente industrial proveniente del sector Curtiembre. La regin (R1) que contiene puntos de color verde corresponde a las poblaciones de algas.

Concentracin efectiva 50% Intervalo de Confianza al 95% Indice de toxicidad N

Registro Citometra Cmara Citometra Cmara Citometra Cmara

7107 5,1473 5,1468 5,1356 5,1596 5,0307 5,2872 (I) (I)

7217 16,2115 20,5046 7,9448 32,3496 13,0258 25,1535 (I) (I)

7515 > 100 > 100 (V) (V)

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INFORME FINAL

7521 2,1251 (*) 2,9433 0,2962 (**) 0,6041 (**) -- --

7561 4,1365 4,3327 3,8464 4,5207 4,0689 4,6288 (I) (I) Tabla 35 - Anlisis comparativo del recuento de algas (Selenastrum capricornutum) mediante Citometra

de Flujo y Cmara Cuenta Glbulos (Neubauer). (*) Concentracin efectiva 25%, (**) Desvo estndar.

En la Tabla 35 se muestran valores de recuento de algas provenientes del ensayo crnico empleando Selenastrum capricornutum realizados mediante citometra de fluljo y cmara Neubauer. Se destaca la buena correlacin existente entre ambas tcnicas para el pequeo nmero de muestras analizadas. Finalmente, se destaca una marcada tendencia hacia una correlacin directa entre los ensayos de toxicidad, la prueba de genotoxicidad y la calificacin a travs de los parmetros fsico-qumicos. Sin embargo, la falta de concordancia entre los ensayos fsico-qumicos, los bioensayos y el ensayo Cometa en relacin al efluente proveniente del rubro matadero, podra explicarse por la elevada concentracin de amonio que no presenta un efecto genotxico. La utilizacin de la citometra de flujo para el recuento de algas empleadas en el bioensayo con Selenastrum capricornutum ha determinado un avance tcnico en nuestro proyecto permitiendo realizar su anlisis en un tiempo menor. Estudios comparativos empleando la tcnica de uso corriente (se estn llevando a cabo con el fin de validar el uso de la citometra de flujo para el recuento de algas empleadas en el bioensayo antes mencionado. Por otro lado, resulta de inters poder confirmar, empleando un mtodo cuantitativo poderoso como lo es la citometra de flujo, los resultados obtenidos mediante el recuento empleando una cmara Neubauer. 5.5.2- Clasificacin celular mediante citometra de flujo de clulas de Hydra attenuata. Aplicacin del ensayo cometa para estudios de genotoxicidad en clulas de este organismo. Durante el desarrollo del Proyecto Watertox coordinado por el IDRC de Canad, se determin que el bioensayo con Hydra attenuata se presenta como uno de los mas sensibles y confiables, dentro de una batera de ensayos que incluyen, Daphnia magna, Lactuca sativa, Selenastrum capricornutum y Allium cepa (Environmental Toxicology, vol. 15, 2000, Special Issue).

En tal sentido, en el marco del presente proyecto nos planteamos la posibilidad de poner a punto una metodologa que permitiera realizar un anlisis de genotoxicidad en clulas provenientes de organismos expuestos a efluentes industriales. El ensayo cometa ha sido aplicado a clulas de Hydra atenuatta expuestas a sustancias txicas, y si bien algunos autores sugieren la utilizacin de este ensayo para evaluar efecto genotxico sobre las clulas de estos organismos, los datos son an muy escasos y sus resultados presentan una enorme variabilidad en cuanto al efecto genotxico. Este hecho ha sido interpretado como debido a que la aplicacin del ensayo se est llevando a cabo en un pool de clulas de Hydra atenuatta de diferentes orgenes embrionarios, y por ende, con diferentes niveles de exposicin a las sustancias txicas. Por tanto, nos hemos planteado la posibilidad de realizar una clasificacin de los distintos grupos celulares presentes en Hydra attenuata mediante citometra de flujo para poder luego aplicar el ensayo cometa a un grupo homogneo de clulas de este organismo. A continuacin en la Figura 19 se presenta el anlisis citomtrico de distintas poblaciones celulares de Hydra attenuata en relacin a la incorporacin de un pigmento fluorescente proveniente de la fuente de alimentacin, un micro-crustceo denominado Artemia salina.

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INFORME FINAL

Figura 19 Anlsis citomtrico de las distintas poblaciones de clulas de Hydra atenuatta. En diferentes colores se representan las distintas poblaciones celulares. En los grficos superiores se compara la distribucin de las distintas poblaciones celulares de Hydra atenuatta en relacin a un parmetro fluorescente (FL2- fluorescence 2 channel) y al tamao celular (SSC- side scatter) tanto en el cultivo de este organismo como en el agua donde el mismo habita. En los grficos inferiores se muestra una secuencia de mediciones citomtricas partiendo de un nmero diferente de individuos (100, 50 y 25 de izquierda a derecha), de modo de poder demostrar qu poblaciones celulares corresponden a clulas de Hydra attenuatta y qu poblaciones corresponden a clulas provenientes de Artemia salina (grfico de la derecha).

La investigacin se encuentra en curso abocada a determinar el origen de estos diferentes grupos celulares as como el ingreso de la pigmentacin a los mismos. Existen numerosas evidencias en la naturaleza que la pigmentacin pude ser transferida a las clulas de los organismos a travs de la alimentacin. Un ejemplo muy conocido es el caso del Salmn, el cual naturalmente es incoloro pero adquiere un tinte rojizo debido a los pigmentos asimilados durante su alimentacin. En este sentido, dado el enorme inters en aplicar el test de Hydra attenuata en ensayos de toxicidad aguda, resulta importante la eventualidad de contar con un ensayo de genotoxicidad empleando este mismo bioindicador. 5.5.3- Actividades acadmicas

Las actividades que se detallan a continuacin no fueron previstas originalmente en el proyecto pero fueron consideradas de gran importancia para un mejor desarrollo del mismo.

1) Presentacin de la metodologa de trabajo del proyecto, as como resultados preliminares de la evaluacin conjunta de la toxicidad aguda y genotoxicidad de 2 efluentes industriales en ECOTOX 2004 llevado a cabo en Octubre 2004 (Brasil). Dicha actividad fue apoyada econmicamente por el SEMA-IDRC, la Comisin Sectorial de Investigacin Cientfica (CSIC) de la Universidad de la Repblica y el Programa de Desarrollo de las Ciencias Bsicas de Uruguay (PEDECIBA).

Esta actividad permiti establecer importantes contactos con diversos centros de la regin. Deseamos destacar especialmente la vinculacin con el FEPAM (Fundaao Estadual de Pesquisa Ambiental) de Porto Alegre quien nos ha asesorado permanentemente en la puesta en marcha de los test de genotoxicidad aplicados al estudio de los efluentes industriales.

2) Realizacin de una estada tcnica de 4 meses sobre Ensayo Cometa en la Universidad de Ulm (Alemania) a cargo del Prof. Gnter Speit, reconocido experto mundial en la materia (Abril 2005 Agosto 2005).

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INFORME FINAL La Lic. Leticia Mndez del Departamento de Gentica Toxicolgica del IIBCE realiz un entrenamiento sobre el Ensayo Cometa empleando las preparaciones obtenidas del procesamiento de 8 muestras provenientes de efluentes industriales, mayoritariamente del rubro Curtiembres. Adems de haber tenido la oportunidad de discutir los resultados obtenidos en estas 8 muestras analizadas mediante Ensayo Cometa, ha tenido la oportunidad de familiarizarse con los ltimos avances en la realizacin de la misma as como con la obtencin de medidas cuantitativas, previstas a llevar a cabo en nuestro proyecto luego de adquirido un sistema de captura y anlisis de imgenes.

La Lic. Mndez ha realizado, a su vez, una estada tcnica de entrenamiento en la empresa MetaSystems (GMBH Alemania) en un software diseado para anlisis de cometas empleando las imgenes obtenidas en el Laboratorio del Prof. Speit con el fin de poder realizar medidas cuantitativas tales como Porcentaje de ADN migrado y el denominado Momento de la Cola o Tail Moment, parmetros que permiten estimar de manera objetiva el dao gentico producido por el agente al que han sido expuestas las clulas CHO en nuestro estudio.

3) Realizacin de una estada tcnica de 2 semanas en el Laboratorio de Radiobiologa de la Comisin Nacional de Energa Atmica de Buenos Aires, Argentina (Agosto 2005).

La Lic. Ins Prsper (Becaria del Departamento de Gentica Toxicolgica) realiz un entrenamiento en el uso del software para captura y anlisis de imgenes provenientes del ensayo cometa adquirido en el marco del presente proyecto.

4) Aplicaciones de la Citometra de Flujo en Ecotoxicologa. VII Jornadas Rioplatenses sobre Citometra de Flujo. Biosidus. Buenos Aires, Argentina. Octubre 30, 2004.

Se presentaron resultados preliminares acerca de las actividades cientficas mencionadas en los items 5.5.1 y 5.5.2.

5) Curso sobre Biomarcadores de genotoxicidad y susceptibilidad gentica. Realizado en el marco del Congreso LatinoAmericano de Mutagnesis, Carcinognesis y Teratognesis Ambiental (ALAMCTA) realizado en Mendoza (Argentina) en Noviembre 1 4, 2005. Durante el mencionado curso se presentaron las metodologas bsicas empleadas para estudios de genotoxicidad as como aquellas tcnicas empleadas para evaluar genotoxicidad de muestras provenientes de efluentes industrials y muestras de sangre provenientes de personas expuestas a sustancias agrotxicas.

6- CONCLUSIONES El presente trabajo conjuntamente con: Los bioensayos como herramienta para la evaluacin de la toxicidad de los efluentes industriales en Uruguay, informe final proyecto IDRC (2002), son los dos nicos antecedentes cientficos que aportan informacin sistemtica y relevante sobre los efectos txicos de los efluentes industriales en Uruguay. Los resultados obtenidos en este trabajo se alinean con los anteriores permitiendo concluir que las metodologas utilizadas presentan una buena reproducibilidad, permitiendo la generacin de informacin confiable (referido a la aplicacin de ensayos biolgicos) para evaluar el impacto txico de los efluentes industriales. Por otro lado, se han llevado a cabo, por primera vez en el pas, ensayos de genotoxicidad para efluentes industriales en clulas de mamfero. 6.1- Bioensayos La aplicacin de bioensayos en forma de batera de varios niveles trficos es una herramienta metodolgicamente correcta y segura para evaluar toxicidad frente al uso de ensayos individuales o de un solo nivel trfico. Ver Tablas 14 y 17 a 20 y Figuras 11 y 12. Sobre la definicin de los ensayos a incluir en dicha batera y siguiendo los lineamientos internacionales de integrarla con tres niveles trficos, podemos aclarar que para la informacin procesada en este trab

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