Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los adipocitos Pere Domingo Unidad de Enfermedades Infecciosas Hospital de la Santa creu i Sant Pau Universitat

Toxicidad de Efavirenz y Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los adipocitosLopinavir/r sobre los adipocitos

Pere DomingoPere DomingoUnidad de Enfermedades InfecciosasUnidad de Enfermedades InfecciosasHospital de la Santa creu i Sant PauHospital de la Santa creu i Sant PauUniversitat Autònoma de BarcelonaUniversitat Autònoma de [email protected]@santpau.cat

Pere DomingoPere DomingoUnidad de Enfermedades InfecciosasUnidad de Enfermedades InfecciosasHospital de la Santa creu i Sant PauHospital de la Santa creu i Sant PauUniversitat Autònoma de BarcelonaUniversitat Autònoma de [email protected]@santpau.cat

Contenido

•Implicaciones,consecuencias y visibilidad de la lipoatrofia

•Fármacos y lipoatrofia (EFV vs. LPV/r)

•Mecanismos patogénicos en la lipoatrofia

•El papel de la mitocondria

•EFV, LPV/r y adipocitos in vitro

•EFV, LPV/r y adipocitos ex vivo

33

Implicaciones de la lipoatrofia

• Calidad de vida

• Efectos psicológicos– Baja autoestima– Disminución de la autoconfianza– Ansiedad y depresión

• Efectos sociales– Daño en la calidad de la relaciones

sociales– Alienación social– Dificultad para encontrar ropa adecuada

• Efectos físicos (ej, dolor al sentarse)

• Disfunción sexual

• Descenso de la adherencia

O’Donovan CA et al, 7th IWADRL Nov 2005, Dublin, #34; James J et al, Dermatol Surg 2002; 28:979-986Santos CP et al, AIDS 2005;19(S4):S14-S21; Reynolds NR et al, AIDS Care Oct 2006; 18(7):663-73

44

33 3.14 3.55 3.66

Todos los estudios, principalmente hombres

2.682.77

9.11

7.11 7.22

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Estudios en VIH,Controles sanos voluntarios*

Adultos VIH+, Lipoatrofia clinicamente evidente al

comienzo*

Gra

sa e

n l

as e

xtre

mid

ades

(kg

)

*Todos los estudios utilizaron DEXA para medir la grasa.1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr. 1999;69:1162–1169; 2. Carr A et al. AIDS. 1998;12:F51–F58; 3. Moyle G et al. CROI 2005. Abstract 44LB; 4. McComsey GA et al, Clin Infect Dis. 2004;38:263–270; 5. Martin A et al. AIDS. 2004;18:1029–1036; 6. Milinkovic A et al. Antivir Ther. 2007;12:407–415; 7. Carr A et al. Lancet. 2004;363:429–438; 8. Slama L. Antivir Ther. 2007,in press.

La lipoatrofia se hace clínicamente evidente después de perder el 40%-50% de la grasa en la extremides

Mujer Hombre Hombre

55

Mínima ganancia en la grasa en las extremidades 48 semanas después del cambio de los NRTI

Importancia del diagnóstico temprano: La lipoatrofia es difícil de revertir

• Otros estudios dieron resultados similares

1. Engelson ES et al. Am J Clin Nutr. 1999;69:1162–1169; 2. Moyle GJ et al. AIDS. 2006;20:2043–2050;3. Carr A et al. AIDS. 1998;12:F51–F58.

Lim

b f

at (

kg)

3.412.95

8.1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Normal 1 Pacientes lipoatróficos al comienzo 2

Pacientes tras el cambio de análogos 2

6

EFVLPV/r

-5

-10

-15

0

5

10

15

20

48 960 Weeks

Ca

mb

io %

de

la

med

ian

a d

esd

e la

ba

sal

ACTG 5142 Grasa en las extremidades

LPV/r + EFV

+18

+9.8

+1.4

.013

.007

<.001

P Value

EFV 188 171LPV/r 191 166LPV/r + EFV 197 173

ACTG 5142: Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre la grasa periférica: LPV/r < EFV

Haubrich R et al. 14th CROI 2007; Los Angeles. Abstract #38.

7

ACTG 5142: La prevalencia de lipoatrofia fue menor con Kaletra que con EFV

0%0%

17%

0%

9%

32%

21%

10%

7%0%

10%

20%

30%

40%

50%

Basal 48 semanas 96 semanas% d

e p

ac

ien

tes

co

n li

po

atr

rofi

a (

>2

0%

p

érd

ida

de

gra

sa

pe

rifé

ric

a)

EFV+2 ITIAN LPV/r +2 ITIAN LPV/r+EFV

EFV 188 171LPV/r 191 166LPV/r + EFV 197 173

Valores de P a 96s LPV/EFV vs LPV: 0,023LPV/EFV vs EFV: <0,001LPV vs EFV: 0,003

Haubrich R et al. Haubrich R et al. AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18AIDS. 2009 Jun 1;23(9):1109-18 ..

Evolución de la lipoatrofia (> 20% de pérdida de grasa en las extremidades)

8

ACTG 5142. La prevalencia de lipoatrofia fue menor con LPV/r que con EFV independientemente de los análogos utilizados

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

d4T AZT TDF

EFV

Kaletra

51%n=4

1

33%n=43

16%n=73 12%

n=676%

n=50

40%n=63


Porcentaje de pacientes con lipoatrofia por subgrupos, semana 96

9

ACTG 5142. La prevalencia de lipoatrofia fue menor con LPV/r que con EFV independientemente de la definición de lipoatrofia elegida

0

10

20

30

40

50

>10% >20% >30% >40%

EFV Kaletra

% p

acie

nte

s

32%28%

40%

17%20%

10%13%

4%

p=0,0027 p=0,0004 p=0,0016 p=0,0008


10

Estudio transversal alemán. Resultados: Características de los pacientes

LPV/r EFV

Nº de pacientes 139 165

Edad en años 44.7 45.6

Duración media del tratamiento [años]

3.4 3.6

Adeherencia autoreferedia [%] > 95 > 95

El 45% estabán tomando TDF, 28% AZT/3TC y 12% ABC/3TC

Alta concordancia entre las opiniones de los pacientes y de los médicos

Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul Van Lunzen J et al. IAS Ciudad del Cabo Jul 2009 #CDB111 2009 #CDB111

11

Estudio transversal alemán. El porcentaje de pacientes que reportan haber pérdido grasa en las piernas fue menor con Kaletra que con EFV

21

32

0

10

20

30

40

50

Kaletra EFV

p < 0,05

% p

acie

ntes

que

rep

orta

n pé

rdid

a de

gra

s en

las

pier

nas

El 79 % de los pacientes tratados con Kaletra no reportó signos de pérdida de grasa en las piernas frente a sólo 68% entre los tratados con EFV.


13

Estudio transversal alemán. Entre los tratados con TDF/3TC o FTC también hubo menos pacientes que notaron pérdida de grasa en las piernas en el grupo de Kaletra que en el de EFV

10

22

0

10

20

30

40

50

Kaletra EFV

p < 0,05

% p

acie

ntes

que

rep

orta

n pé

rdid

a de

gra

s en

las

pier

nas


1414

Causas de la lipoatrofia

Virus VIH

PacientePacienteGenética/AmbienteGenética/Ambiente

Lipoatrofia

HAART

15

Mecanismos fisiopatológicos de la lipodistrofia a nivel celular

• Disfunción mitocondrial• Proliferación mitocondrial y

morfología alterada2

• Ciclo celular y diferenciación adipocitaria alterada• Descenso del tamaño de los

adipocitos1-3

• Apoptosis aumentada4

• Sustitución de los adipocitos por tejido fibrosos3

• Mediadores proinflamatorios• Infiltración de macrófagos2,3

• Expresión de IL-6 y TNF - aumentada3

X 400

Control1

X 200

PatientAumento del número de adipocitos pequeños1

Patient

X 400

Incremento del número de macrófagos3

1. Bastard JP, et al. Lancet 2002: 359: 1028-312. Nolan D, et al. AIDS 2003; 17: 121-33. Jan V, et al. Antivir Ther 2004; 9: 555-644. Domingo P, et al. AIDS 1999; 13: 2261-7

16

Investigación para esclarecer el papel de Kaletra en la lipoatrofia

Mitocondria Adipocito Individuo

•Estudio 613 •ACTG 5142 •Dr. van Lunzen

•Dr. Esplugues •Dr. Domingo

T. Adiposo

Dr. A. CarrDr. Domingo

1717

Estructura mitocondrial • AND mitocondrial (mtDNA)

– 16 kb, 2-10 copias/mitocondria en la matriz

– La replicación está controlada por genes mitocondriales• La DNA polymerasa-γ mitocondrial es la

enzima requerida para la replicación del mtDNA

• La inhibición de la mtDNA polymerasa-γ conduce a la depleción del mtDNA

– Transcripción – proteínas mitocondriales• Polimerasa del RNA (mtRNA) y factores de

transcripción

• La apoptosis es parte del proceso natural celular y se incrementa durante la disfunción mitocondrial

• En el contexto de la disfunción mitocondrial– Se incrementa la apoptosis celular– Puede aparecer hiperlactatemia

Mitocondria. Estructura interna

HIV

Membrana interna

Membrana externa

Cristae

Matriz

Adipocito TEM

Chan DC, Cell June 2006; 125;7:1241-1252 McBride HM, Current Biology July 2006;16:R551-R560

1818

1. Kakuda TN. Clin Ther. 2000;22(6):685–708; 2. Birkus G et al. Antimicrob Agents Chemother. 2002;46:716–723.

Toxicida inducida por los análogos: Toxicida inducida por los análogos: Inhibición de la Inhibición de la mtDNA Polymerasa-γ

• Metodos2

• Células humanas tratadas con NRTIs

• Southern blot para cuantificar mtDNA

Los ensayos enzimáticos con NRTIs demuestran la inhibición de la

mtDNA polymerasa- 1,2: zalcitabina (ddC) > didanosina (ddI) > stavudina > zidovudina (ZDV) > lamivudina = abacavir = tenofovir

• Resultados• El grado de inhibición de la DNA

polymerase- inhibition varia con los NRTI

• Algunos NRTIs inhiben la mtDNA polymerasa-

19

Disfunción mitocondrial y apoptosis

Reactive oxygen speciesMPTP

Disfunción cadena respiratoria

Depleción DNAmt, ...

21

Inhibición aguda de la respiración mitocondrial por EFV

100 (μM)6 8 10 12 14 16 18 20

0

50

100

ControlEFV 25uM

Tiempo (min)

Co

nce

ntr

aci

ón

de

oxíg

eno

(M

)

Time (min)

Ox

yg

en

co

nc

en

tra

tio

n

0

20

40

60

80

100

%

**

***

*** *** ***

5 10 15 25 50 100

Efects of EFV (M) on respiration rate

Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

%

MetOHATV RTV LPV

5050 2525 1616 MMMM

Data not shownData not shown

** P< 0.01*** P< 0.001

** P< 0.01*** P< 0.001

% o

f c

on

tro

l%

of

co

ntr

ol

% o

f c

on

tro

l%

of

co

ntr

ol

22

Fig.3

Intracellular ATP levels

0

2

4

6

8

10

12

14

16

ATP

(nm

ol/m

g pr

otein

)

Control EFV10

EFV25

*

**

EFV50 µM

La inhibición de la función mitocondrial resulta en una reducción dosis dependiente del ATP intracelular

Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984Blas-García A, et al. 15th CROI. Boston, 2008 #984

23

FA ligand activated transcription factors

Preadipocyte

PPARγ C/EBPα

Organelle reconstitution

Stem cell mitosis

PPARδC/EBPβ/δSREBP1/ADD1

Adipoblast

mitosis

E2F, pRbp130/p107

Matureadipocyte

Immatureadipocyte

Lipogenic gene induction

LPL, HSL, aP2, perilipin DGAT, GLUT4

TG storage

TNF-α

TNF-α

Adipocyte differentiation: a highly regulated process

Gregoire FM, Physiological Reviews July 1998; 78(3):783-809Gregoire FM, Physiological Reviews July 1998; 78(3):783-809

2424

PPAR- gene expression relative to ACTB housekeeping gene at baseline and at 2 weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in adipocytes

COX-1 gene expression relative to ACTB housekeeping gene at 6 weeks of ZDV/3TC or d4T/3TC twice-daily in monocytes

• 20 HIV- volunteers received dual NRTI therapy for 6 weeks (ZDV/3TC or d4T/3TC )

• In the absence of mtDNA depletion, thymidine analogue NRTIs down-regulate:

– Adipocyte differentiation factors (nuclear transcription factor PPAR-)

– Transcription of mitochondrial chain respiratory subunits (COX-1, Cox-2, and Cyt b)

• Negative regulatory effects impede adipogenesis and respiratory chain complexes (eg. Complex IV via COX1 inhibition)

• NRTI effects on peripheral mononuclear blood cells suggest a possible role in other tissues

Mallon PW et al. J Infect Dis. 2005;191:1686–1696.

Mechanisms of NRTI-Induced Mitochondrial Toxicity

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.0

P = 0.003

PP

AR

-γ :

AC

TB

1.8

CO

X1

: A

CT

B

1.6

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

P = 0.01P = 0.005

0Baseline Week 6 Week 12 Follow up*

* Median = 66 weeks

Baseline Week 2

25

Effect of EFV and LPV/r on differentiating

adipocytes

Control(No drug)

0.5 μM 2 μM 4 μM

Massive cell death - no

image available

10 μM

0.5 μM 2 μM 4 μM 10 μM

EFAVIRENZ

KALETRA

Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01

Control(No drug)

EFAVIRENZ

KALETRA

2 μM 4 μM 20 μM

2 μM 4 μM 20 μM

Effect of EFV and LPV/r on mature

adipocytes

26

Effect of EFV and LPV/r on gene expression

0.5 2 4 0.5 4 20 40EFV (μmol/l) LPV/r (μmol/l)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

***

***

* **

#

#

Control 10

Adipogenesis (PPARγ)Adipogenesis (PPARγ)L

og

mtD

NA

co

py

nu

mb

er

Lo

g m

tDN

A c

op

y n

um

be

r

0.5 2 4 0.5 2 4 10

Lo

g m

tDN

A c

op

y n

um

be

r

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

ControlLPV/r (μmol/l)EFV (μmol/l)

10

Mitochondrial DNAMitochondrial DNA

*P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001 vs. control, # EFV vs. LPV/r*P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001 vs. control, # EFV vs. LPV/r

Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01Diaz-Delfín J, et al. 10th IWADRL. London, 2008 #P-01

27

EFV increases pro-inflammatory cytokines and reduces adiponectin c/w LPV/r in human adipose cellsEFV:

4 µM - increase in levels of MCP-1 (5.3-fold), IL-5 (4.2-fold), IL-8 (18.7-fold), PAI-1 (5.7-fold) and HGF (5.5-fold)

Significant reduction of adiponectin and leptin (17% and 19% of levels vs controls respectively)

LPV/r:

No induction of MCP-1, IL-8 and PAI-I

Minor but significant reduction in release of adiponectin and leptin (71% and 76% of levels vs controls, respectively)

HGF and IL-6 were induced to a similar extent in response to LPV/r and to EFV

mRNA:

Adiponectin mRNA significantly decreased with [EFV] ≥2 µM and [LPV/r] ≥ 4 µM (EFV inhibition of mRNA significantly worse).

Leptin mRNA significantly decreased with [EFV] ≥2 µM and [LPV/r] ≥ 10 µM

Conclusions:

In human adipocytes in culture, EFV causes a higher release of pro-inflammatory cytokines and a more profound impairment in the release of adiponectin compared to LPV/r.

Domingo P et al, 5th IAS 2009, #TUPEB167

28

Efectos ex vivo de los fármacos antiretrovirales

0

20

40

60

80

100

120

140

NaiveNaive TRU+EFVTRU+EFV

P = NSP = NS

-20

0

20

40

60

80

100

120

NaiveNaive TRU-KALTRU-KAL

P = NSP = NS

AdiponectinaAdiponectina

MCP-1MCP-1

0

5

10

15

20

25

30


P = NSP = NS

0

5

10

15

20

25

30

35

40

NaiveNaive TRU+KAL

29


0

1

2

3

4

5

6

7

8


P = NSP = NS

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

NaiveNaive TRU+KALTRU+KAL

P = NSP = NS

PPARPPARPPARPPAR

TNFTNFTNFTNF

-2

0

2

4

6

8

10

12


P = NSP = NS

0

,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5


P = NSP = NS

30


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000


P = 0,04P = 0,04P = 0,04P = 0,04

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000


P = 0,008P = 0,008P = 0,008P = 0,008

Cyt BCyt BCyt BCyt B

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500


ADNmtADNmtADNmtADNmt

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

2800

3000


31

HIV Infection Contributes to Lipodystrophy HIV Infection Contributes to Lipodystrophy Through Alteration of Gene Expression in Through Alteration of Gene Expression in

Adipose TissueAdipose Tissue

Giralt M et al. Antivir Ther. 2006;11:729–740.

• Compared to HIV-negative controls, ARV-naïve HIV-positive patients had significant

• Decreases in mRNA of COX-2, COX-4, UCP2, C/EBP-, PPAR-γ, GLUT4, LPL, leptin, and adiponectin

• Increases in PGC-1, TNF, and -2 microglobulin

PPAR- mRNA/18SrRNA (x10-4)

COX-2 mRNA/18SrRNA (x10-2)

P<0.0001P=0.0002

P<0.0001

P=0.018

P=0.045

1.5

1.0

0.5

0

TNF- mRNA/18SrRNA (x10-6)

P=0.0004

P=0.00015

2

1

0

3

4P=0.051

P=0.027

P=0.023

P=0.046

P=0.001 P=0.001

Control Naïve LDNon-LD Control Naïve LDNon-LD Control Naïve LDNon-LD

32

EFVLPV/r

-5

-10

-15

0

5

10

15

20

48 960 Weeks

Ca

mb

io %

de

la

med

ian

a d

esd

e la

ba

sal

ACTG 5142 Grasa en las extremidades

LPV/r + EFV

+18

+9.8

+1.4

.013

.007

<.001

P Value

EFV 188 171LPV/r 191 166LPV/r + EFV 197 173

ACTG 5142: Efecto diferente de LPV/r y EFV sobre la grasa periférica: LPV/r < EFV

Haubrich R et al. 14th CROI 2007; Los Angeles. Abstract #38.

33

La toxicidad grasa es bifásica

TiempoTiempoTiempoTiempo

TARcTARcTARcTARc

Gra

sa

su

bcu

tán

eaG

ras

a s

ub

cutá

nea

Gra

sa

su

bcu

tán

eaG

ras

a s

ub

cutá

nea

34

Conclusiones

• Tres factores implicados en la LD– Virus– Huésped– Fármacos

• La patogenia de la lipodistrofia es multifactorial– Mitocondria– Diferenciación – Inflamación

• EFV es más tóxico que LPV/r in vitro.

• A 48 semanas dicha toxicidad no es apreciable ex vivo.

• El curso de la LD es bifásico

35

Agradecimientos

• Hospital de la Santa Creu i Sant Pau

• Mª del Mar Gutierrez

• Mª Gracia Mateo

• Mª Antonia Sambeat

• Angels Fontanet

• Jessica Muñoz

• Jessica Martínez

Biologia U.B.Biologia U.B.

Francesc VillarroyaFrancesc Villarroya

Marta GiraltMarta Giralt

Joan C. DomingoJoan C. Domingo

Julieta DíazJulieta Díaz

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Toxicidad de Efavirenz y Lopinavir/r sobre los adipocitos Pere Domingo Unidad de Enfermedades Infecciosas Hospital de la Santa creu i Sant Pau Universitat