tp dosage de l'urée plasmatique

TP N°03TP N°03TP N°03TP N°03

Dosage l’urée plasmatique

République algérienne démocratique et populaire. Université Djillali Liabes

Faculté de Médecine Département de Pharmacie

Année universitaire : 2008 / 2009

Réalisée par:

• GHERMI Mohamed. • BETTAYEB Mohamed Amine. • TAHRI Mahmoud. • CHAREF KHODJA Meriem.

4 ème année pharmacie G05.

TP N 3 DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE)

1 RAFUNIT © - UDL - Pharmacie

L'urée, molécule très hydrosoluble, est la forme principale d'élimination des

déchets azotés du métabolisme des protéines chez l'Homme. La détermination de

l'urée dans le sang longtemps pratiquée pour évaluer la fonction rénale a été

supplantée par celle de la créatinine.

L'urée est le composé azoté le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage dans

l'urine est un témoin du métabolisme protidique permettant de comparer les

pertes quotidiennes l'azote aux apports.

Le dosage de l'urée dans le sang est généralement pratiqué en faisant appel à une

méthode enzymatique (uréase).

IIII---- Intérêt physiopathologiqueIntérêt physiopathologiqueIntérêt physiopathologiqueIntérêt physiopathologique ::::

L'urée est une molécule très hydrosoluble, électriquement neutre. C'est la forme principale d'élimination des déchets azotés du métabolisme des protéines chez l'Homme. La plus grande partie de l'ammoniac (NH3), produit dans le foie par la désamination des acides aminés, est transformée en urée (uréogenèse ou cycle de Krebs-Henseleit), au niveau du foie et du cerveau. L'urée est complètement filtrée par le glomérule et réabsorbée partiellement au niveau du néphron, de façon inversement proportionnelle au débit urinaire. L'urée est la première substance dont l'augmentation dans le plasma a été associée au «mal de Bright». À ce titre, elle fut longtemps utilisée pour apprécier la fonction rénale. La concentration de l'urée sanguine (ou urémie), correspond à un équilibre entre sa production, le volume de diffusion (correspond à l'eau totale, soit environ 60% du poids corporel), et son excrétion urinaire. Étant donné tous les facteurs extrarénaux susceptibles d'influencer l'urémie, pour évaluer la fonction rénale, le dosage de la créatinine dans le sang et dans l'urine lui a été préféré. De même, le calcul de la clairance de l'urée a été remplacé par celui de la clairance de la créatinine. L'urée est le composé azoté le plus abondant de l'urine humaine. Son dosage contribue à l'exploration de la fonction rénale, et chez le sujet sans affection hépatique ou rénale, il est un témoin du métabolisme protidique permettant de comparer les pertes quotidiennes d'azote aux apports prescrits et ainsi de suspecter une mauvaise observance à un régime ou un état hypercatabolique si l'excrétion d'azote est supérieure aux entrées.

TP N 3

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IIIIIIII---- Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)

L'ammoniaque, produit final du catabolisme protéique et toxique pour le

système nerveux central, est éliminé de l'organisme par sa transformation en urée

au niveau hépatique. Cette

cycle de l'urée, constituée de six étapes

mitochondriale et le cytosol de la cellule hépatique

suivants : N-acétylglutamate synthase [NAGS], carba

[CPSI], ornithine transcarbamylase [OTC], argininosuccinate synthétase [ASS],

argininosuccinate lyase [ASL], arginase [ARG]

Certaines de ces enzymes peuvent se retrouver dans d'autres tissus; elles ont

alors un autre rôle. Tout d

l'apparition d'une hyperammoniémie. Celui

délétère touchant un gène codant pour une des enzymes impliquées ou d'une

inhibition d'une des enzymes causée par l'accu

endogène (aciduries organiques) ou exogène (valproate). Dans le cas d'un

dysfonctionnement d'origine génétique, il est important de caractériser

précisément l'étape défectueuse dans un but thérapeutique et de conseil génétiq

DOSAGE DE L’UREE PLASMATIQUE (AZOTEMIE)

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Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée)Métabolisme de l’urée (Cycle de l’urée) ::::


central, est éliminé de l'organisme par sa transformation en urée

au niveau hépatique. Cette élimination est réalisée par une voie métabolique, le

cycle de l'urée, constituée de six étapes enzymatiques réparties entre la matrice

mitochondriale et le cytosol de la cellule hépatique, ces 6 enzymes sont les

acétylglutamate synthase [NAGS], carbamylphosphate synthétase I


ate lyase [ASL], arginase [ARG].


Tout dysfonctionnement de cette voie métabolique entraînera

l'apparition d'une hyperammoniémie. Celui-ci peut être le résultat d'une mutation


inhibition d'une des enzymes causée par l'accumulation d'un composé d'origine



précisément l'étape défectueuse dans un but thérapeutique et de conseil génétiq

SMATIQUE (AZOTEMIE)

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central, est éliminé de l'organisme par sa transformation en urée

ion est réalisée par une voie métabolique, le

enzymatiques réparties entre la matrice

, ces 6 enzymes sont les

mylphosphate synthétase I



ysfonctionnement de cette voie métabolique entraînera

ci peut être le résultat d'une mutation


mulation d'un composé d'origine



précisément l'étape défectueuse dans un but thérapeutique et de conseil génétique.



IIIIIIIIIIII---- Dosages de l’urée dans l’organismeDosages de l’urée dans l’organismeDosages de l’urée dans l’organismeDosages de l’urée dans l’organisme :::: 1111---- Etape préEtape préEtape préEtape pré----analytiqueanalytiqueanalytiqueanalytique ::::

aaaa---- Urée sanguineUrée sanguineUrée sanguineUrée sanguine :::: L'urée étant très diffusible, sa concentration est identique dans le plasma et les globules rouges. Les résultats obtenus à partir du plasma, du sérum, ou du sang sont équivalents. Le prélèvement est de préférence effectué chez le sujet à jeun. Le sang est recueilli dans des tubes avec ou sans anticoagulant. Le fluorure de sodium est à éviter car il inhibe l'uréase utilisée dans les techniques enzymatiques contrairement à l'iodoacétate qui ne l'affecte pas.

bbbb---- Urée urinaireUrée urinaireUrée urinaireUrée urinaire : : : : Le dosage est effectué, soit sur un échantillon des urines de 24 heures, soit sur une miction. Étant donné la consommation possible de l'urée par des germes possédant une uréase, les urines peuvent être conservées pendant 7 jours à+4°C ou 1 mois à -20°C.

2222---- Techniques de dosagesTechniques de dosagesTechniques de dosagesTechniques de dosages :::: aaaa---- Techniques chimiquesTechniques chimiquesTechniques chimiquesTechniques chimiques ::::

� Méthode à l’hypobromiteMéthode à l’hypobromiteMéthode à l’hypobromiteMéthode à l’hypobromite de Nade Nade Nade Na:::: L'urée est traitée par une solution alcaline d'hypobromite de sodium, ce qui donne un dégagement d'azote qui est mesuré dans l'uréomètre et comparé à l'azote dégagé, dans les mêmes conditions, par une solution d'urée de titre connu. La défécation du sérum est effectuée par une solution d'acide trichloracétique. L'appareillage était représenté par l'uréomètre d'Yvon et une cuve à mercure. Cette technique, applicable aussi bien au sérum qu'à l'urine n'est plus utilisée depuis longtemps, mais c'est elle qui a donné le nom d'azotémie au taux d'urée dans le sang.

� Méthode à la diacétyl monoximeMéthode à la diacétyl monoximeMéthode à la diacétyl monoximeMéthode à la diacétyl monoxime (DAM):(DAM):(DAM):(DAM): L'urée réagit à chaud avec la DAM, en présence d'ions ferriques, pour former une coloration rose qui peut être sensibilisée et stabilisée par des adjuvants tels que le thiosemicarbazide, cette coloration peut être dosée par mesure de l’absorbance à 520 nm (dosage colorimétrique). Cette méthode est souvent utilisée après déprotéinisation, mais elle peut aussi être utilisée directement. La parfaite proportionnalité entre l'absorbance et le taux de l'urée autorise l'emploi de 2 ou 3 étalons seulement.

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• Le seuil de détection est de 10 P

• Une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la

concentration d’urée est tracée

• La courbe d’étalonnage de l’urée est une droite pour une gamme

de concentrations comprise entre 0 et 30 ppb.

• La réaction chimique est la suivante


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Le seuil de détection est de 10 PP

Une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la

concentration d’urée est tracée :

La courbe d’étalonnage de l’urée est une droite pour une gamme

de concentrations comprise entre 0 et 30 ppb.

La réaction chimique est la suivante :

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Une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la

La courbe d’étalonnage de l’urée est une droite pour une gamme

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• Le facteur

doit être rigoureusement identique et constante pour toutes les

solutions étalons

Cette méthode est désormais abandonnée.Cette méthode est désormais abandonnée.Cette méthode est désormais abandonnée.Cette méthode est désormais abandonnée.

bbbb---- Techniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiques

L'urée est principalement dosée par des méthodes ba

préliminaire de l'uréase

Les techniques enzymatiques utilisées par moins de 20% des

laboratoires il y a 30 ans sont

�� Uréase/glutamate déshydrogénase, Uréase/glutamate déshydrogénase, Uréase/glutamate déshydrogénase, Uréase/glutamate déshydrogénase,

Elles exploitent le schéma réactionnel

Dans les conditions opératoires choisies, la vitesse de disparition du

NADH est proportionnelle à la concentration d'urée dans

l'échantillon. La lecture est effectuée à 340 nm.

Cette technique peut être effectuée en cinétique ou en point final.

�� Technique électrochimiqueTechnique électrochimiqueTechnique électrochimiqueTechnique électrochimique

L'uréase dégrade l'urée en NH

mesure la cinétique de la variation de la conductivité avec une

électrode sélective de

�� Technique réflectométriqueTechnique réflectométriqueTechnique réflectométriqueTechnique réflectométrique

Les plaques sont constituées de plusieurs couches réactionnelles sur

un support

l'hydrolyse de l'urée en

l'ammoniac et du gaz carbonique. Une

permet de déterminer par réflectométrie la concentration en

ammoniac produit.

Cette méthode analytique à l'avantage d'être spécifique, rapide et

d'éviter l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la

déprotéinisation.


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Le facteur clé de ce dosage est la température de chauffage qui


solutions étalons.

Cette méthode est désormais abandonnée.Cette méthode est désormais abandonnée.Cette méthode est désormais abandonnée.Cette méthode est désormais abandonnée.

Techniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiquesTechniques enzymatiques ::::

L'urée est principalement dosée par des méthodes basées sur l'action

préliminaire de l'uréase suivie de réactions auxiliaires différentes.


aboratoires il y a 30 ans sont aujourd'hui très largement majoritaires.

Uréase/glutamate déshydrogénase, Uréase/glutamate déshydrogénase, Uréase/glutamate déshydrogénase, Uréase/glutamate déshydrogénase, mesure à 340 nmmesure à 340 nmmesure à 340 nmmesure à 340 nm ::::

Elles exploitent le schéma réactionnel suivant :



l'échantillon. La lecture est effectuée à 340 nm.

hnique peut être effectuée en cinétique ou en point final.

Technique électrochimiqueTechnique électrochimiqueTechnique électrochimiqueTechnique électrochimique ::::

L'uréase dégrade l'urée en NH4+ qui fait varier la conductivité. On

cinétique de la variation de la conductivité avec une

électrode sélective de conductivité.

Technique réflectométriqueTechnique réflectométriqueTechnique réflectométriqueTechnique réflectométrique ::::


en polyester. La méthode analytique est basée sur

l'hydrolyse de l'urée en présence d'uréase pour donner de

l'ammoniac et du gaz carbonique. Une réaction colorimétrique


ammoniac produit.


l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la

déprotéinisation.

SMATIQUE (AZOTEMIE)

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clé de ce dosage est la température de chauffage qui


sées sur l'action

suivie de réactions auxiliaires différentes.


aujourd'hui très largement majoritaires.



hnique peut être effectuée en cinétique ou en point final.

qui fait varier la conductivité. On

cinétique de la variation de la conductivité avec une


en polyester. La méthode analytique est basée sur

présence d'uréase pour donner de

colorimétrique





�� Méthode colMéthode colMéthode colMéthode colorimétrique de Berthelotorimétrique de Berthelotorimétrique de Berthelotorimétrique de Berthelot ::::

Les ions ammonium produits par l'action de l'uréase réagissent en

milieu alcalin avec l'hypochlorite de Na, en présence de

nitroprussiate de Na, pour former une monochloramine qui dans un

2ème temps réagit avec deux phénols pour former un indophénol

responsable du développement de la coloration verte mesurée à

580nm.

�� Technique de référenceTechnique de référenceTechnique de référenceTechnique de référence ::::

Une technique utilisant le couple uréase/glutamate-déshydrogénase

a été proposée par le Center for Disease Control (CDC) comme

technique de référence pour le dosage de l'urée sanguine.

IVIVIVIV---- Application au TP (Echantillon N°105)Application au TP (Echantillon N°105)Application au TP (Echantillon N°105)Application au TP (Echantillon N°105) :::: 1111---- RéactifRéactifRéactifRéactif ::::

R1 : Nitroprussiate de Na (catalyeur) + Uréase.

R2 : Hypochlorite de Na + NaOH.

[Etalon] = 0,5 g/l0,5 g/l0,5 g/l0,5 g/l.

2222---- EchantillonEchantillonEchantillonEchantillon :::: Sérum (N°105N°105N°105N°105).

Faire une dilution au 1/31/31/31/3.

3333---- Méthode et mode opératoireMéthode et mode opératoireMéthode et mode opératoireMéthode et mode opératoire :::: La méthode utilisée est celle de la méthode colorimétrique de Berthelot.

Les différentes étapes sont résumées dans le tableau suivant :

BlancBlancBlancBlanc EtalonEtalonEtalonEtalon EchantillonEchantillonEchantillonEchantillon

Eau distilléeEau distilléeEau distilléeEau distillée 20 µl / /

EtalonEtalonEtalonEtalon / 20 µl /

EchantillonEchantillonEchantillonEchantillon / / 20 µl

R1R1R1R1 2 ml 2 ml 2 ml

Laisser à T° ambiante pendant 10mn.Laisser à T° ambiante pendant 10mn.Laisser à T° ambiante pendant 10mn.Laisser à T° ambiante pendant 10mn.

R2R2R2R2 2 ml 2 ml 2 ml

Bien mélanger pendant quelques minutes puis lecture au

spectrophotomètre à λ=580 nmλ=580 nmλ=580 nmλ=580 nm.



4444---- RésultatsRésultatsRésultatsRésultats :::: Les résultats obtenus sont les suivants :

ETALONETALONETALONETALON ECHANTILLONECHANTILLONECHANTILLONECHANTILLON

DODODODO 0,450 0,670

[Urée] = ��

�� é�� (dilution)-1

[Urée] = �,��

�,�� 0,5 � 3

[Urée] ≈ 1 g/l ≈ 16,67 mmol/l16,67 mmol/l16,67 mmol/l16,67 mmol/l.

5555---- Interprétation des résultatsInterprétation des résultatsInterprétation des résultatsInterprétation des résultats :::: Avant tous, on citera les valeurs normales de l’urémie et celle de l’uréurie.

Urémie N Urémie N Urémie N Urémie N

(mmol/l)(mmol/l)(mmol/l)(mmol/l)

Urémie N Urémie N Urémie N Urémie N

(g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

NouveauNouveauNouveauNouveau----né (< 4 jours)né (< 4 jours)né (< 4 jours)né (< 4 jours) 1,5 - 8,0 0,09 - 0,48

NouveauNouveauNouveauNouveau----né (> 4 jours)né (> 4 jours)né (> 4 jours)né (> 4 jours) 1,0 - 4,2 0,06 - 0,25

Nourrisson et enfant jusqu'à Nourrisson et enfant jusqu'à Nourrisson et enfant jusqu'à Nourrisson et enfant jusqu'à

5555----6 ans6 ans6 ans6 ans

1,6 - 6,5 0,10 - 0,40

Enfant de Enfant de Enfant de Enfant de plus de 7 ans et plus de 7 ans et plus de 7 ans et plus de 7 ans et

adulteadulteadulteadulte

2,5 - 7,5 0,15 - 0,45

En ce qui concerne le taux urinaire, les valeurs normales sont comprises

entre 300 et 500 mmol/24 h (soit 18 à 30 g/24 h).300 et 500 mmol/24 h (soit 18 à 30 g/24 h).300 et 500 mmol/24 h (soit 18 à 30 g/24 h).300 et 500 mmol/24 h (soit 18 à 30 g/24 h).

• RemarqueRemarqueRemarqueRemarque ::::

Dans les pays anglo-saxons, le dosage de l'urée dans les liquides

biologiques est exprimé non par molécule d'urée mais par

concentration d'azote uréique exprimée en g/L, qu'il faut multiplier par

deux pour obtenir l'urée plasmatique en g/L.



�� InterprétationInterprétationInterprétationInterprétation :

Les valeurs obtenues (16,67 mmol/l – 1g/l) sont supérieurs à (2x) les valeurs

usuelles ce qui pourrait résulter de deux mécanismes essentielles que sont :

� Par défaut d'excrétion rénalePar défaut d'excrétion rénalePar défaut d'excrétion rénalePar défaut d'excrétion rénale ::::

L'hyperurémie est alors nette, souvent supérieure à 16 mmol/L.

Elle est accompagnée d'une baisse de l'élimination urinaire de l'urée.

Ce défaut d'excrétion (insuffisance rénale) peut avoir plusieurs

origines :

- Origine prérénale : il peut s'agir d'une oligurie que l'on rencontre

dans les insuffisances cardiaques ou les cirrhoses ascitiques, ou d'une

déshydratation extracellulaire due à une fuite hydrosodée consécutive à

une diarrhée et/ou des vomissements.

- Origine rénale : les néphropathies aiguës (glomérulonéphrites,

pyélonéphrites), ou chroniques entraînent l'installation d'une

insuffisance rénale de façon brutale ou progressive.

- Origine post-rénale : l'insuffisance rénale est liée à la présence d'une

obstruction au niveau de l'appareil urinaire (c'est le cas, par exemple,

d'un cancer ou d'un adénome prostatique).

� Par formation excessive d'uréePar formation excessive d'uréePar formation excessive d'uréePar formation excessive d'urée ::::

Un régime trop riche en protéines, ou un hypercatabolisme protidique

(fièvres et infections aiguës, dénutrition associée à une myolyse

importante, ou traitement par des corticoïdes) sont à l'origine d'une

augmentation de l'urée sanguine, qui s'accompagne, la fonction rénale

étant normale, d'une augmentation parallèle de son excrétion urinaire.

�� Autres variationsAutres variationsAutres variationsAutres variations ::::

� Variations physiologiquesVariations physiologiquesVariations physiologiquesVariations physiologiques ::::

• Les variations de l'urée dans les liquides biologiques sont très

dépendantes des apports alimentaires.

• Les nouveau-nés de plus de 4 jours et les nourrissons présentent

des concentrations d'urée plasmatiques inférieures d'environ

40% par rapport aux concentrations observées chez les adultes.

• Les valeurs élevées observées à la naissance correspondent à

l'épisode d'insuffisance rénale néonatale.

• La concentration d'urée dans le sang augmente avec l'âge. Ainsi,

après 50 ans une urémie à 8 mmol/L n'est pas considérée comme

pathologique.

• Chez la femme, l'urémie est inférieure de 25% à celle de

l'homme.Elle est abaissée au cours de la grossesse, du fait de

l'augmentation de l'espace liquidien.



� Diminution de l’urémieDiminution de l’urémieDiminution de l’urémieDiminution de l’urémie ::::

Elle ne s'observe que rarement :

• Dans les carences importantes en protéines alimentaires (ou les

malabsorptions digestives).

• Dans les insuffisances hépatiques graves avec un effondrement •

de l'uréogenèse.

• En cas de déficit enzymatique au niveau du cycle de

l'uréogenèse.

Dans tous les cas, l'excrétion urinaire de l'urée est abaissée.

VVVV---- Applications pratiquesApplications pratiquesApplications pratiquesApplications pratiques :::: 1111---- Intérêt de la mesure conjointe de l'urée Intérêt de la mesure conjointe de l'urée Intérêt de la mesure conjointe de l'urée Intérêt de la mesure conjointe de l'urée et la créatinine et la créatinine et la créatinine et la créatinine

sanguinesanguinesanguinesanguine ::::

Le dosage de l'urée en pratique clinique n'a d'intérêt qu'associé à celui

de la créatinine dans le cas d'une insuffisance rénale dont on souhaite

savoir si elle est fonctionnelle ou organique. En effet, le rapport

urée/créatinine plasmatique molaire normal est d'environ 50. Lorsque ce

rapport U/C plasmatique devient supérieur à 100, l'élévation

disproportionnée de l'urée sanguine par rapport à celle de la créatinine doit

faire rechercher soit une hyperproduction d'urée, soit une insuffisance

rénale fonctionnelle (l'urée, petite molécule facilement diffusible est

réabsorbée passivement dans la médullaire rénale dans toutes les situations

à débit urinaire faible).

2222---- Intérêt du dosage de l'urée urinaireIntérêt du dosage de l'urée urinaireIntérêt du dosage de l'urée urinaireIntérêt du dosage de l'urée urinaire

La mesure de la concentration peut servir au diagnostic différentiel

entre une insuffisance rénale organique et une insuffisance rénale

fonctionnelle. De plus, elle permet de calculer l'osmolarité des urines et son

rapport avec l'osmolarité du plasma.

La mesure de l'excrétion uréique urinaire des 24 heures permet d'évaluer

l'observance d'un régime protidique prescrit. Ce recueil devra être validé

par la comparaison avec la créatininurie des 24 heures.

Un apport protidique normal se situe entre 1 et 2 g/kg/24 h, ce qui

correspond, pour un sujet de 60 kg, à 335 à 670 mmol d'urée excrétée par 24

heures.

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