UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

LABORATORIO 1 DETERMINACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Curso: Alimentacin y Nutricin Humana

Profesor: Ana Aguilar

Integrantes: Bonifacio De La Cruz, Raisa Cern Velsquez, Luz Mara Villalobos Salas, Hel

2013 - I

I. INTRODUCCIN

Los antioxidantes en los alimentos son sustancias qumicas cada vez ms apreciados por sus beneficios o capacidad de cuidar la salud de nuestras clulas y del sistema inmunolgico. Los alimentos ricos en antioxidantes naturales nos protegen frente a los radicales libres que producen un dao oxidativo, que son los causantes de los procesos de envejecimiento y enfermedad de las clulas.Es ideal agregar los antioxidantes a travs de nuestra alimentacin cotidiana. Entre los ms conocidos tenemos a los tocoferoles, el cido ascrbico, los flavonoides, antocianinas, carotenoides, cidos fenlicos, etc. Varios de estos compuestos estn presentes en diferentes vegetales y frutas que ingerimos en nuestra dieta. La proporcin de compuestos antioxidantes vara de un alimento a otro.La actividad antioxidante de un alimento est influenciada por la temperatura, la composicin del alimento, su estructura y disponibilidad de oxgeno. Los mtodos desarrollados para medir esta actividad antioxidante se basa en la capacidad que tienen para atraer radicales libres generados ya sea en fase acuosa o lipdica.

Los objetivos de esta prctica son: Conocer una tcnica de determinacin de la capacidad antioxidante en la quinua blanca y quinua de colores; comparar la capacidad antioxidante de la quinua blanca y quinua de colores.

II. REVISIN DE LITERATURA2.1 Antioxidantes Segn Youngson, R (2003). Los antioxidantes son compuestos cuya funcin primordial en nuestro organismo es protegernos del dao oxidativo que causan molculas conocidas como radicales libres, entre otras. Dicho dao oxidativo es el responsable de importantes enfermedades de carcter degenerativo del sistema circulatorio, enfermedades cardiovasculares, cataratas, envejecimiento precoz y cncer, todas las cuales hoy son la principal causal de muerte en nuestra sociedad.2.2 Radicales libres Segn Youngson, R (2003).Los radicales libres pueden originarse en las clulas del cuerpo de diversos modos. Las radiaciones externas incluyendo la luz ultravioleta, los rayos X y los rayos ganma procedentes del material radioactivo son una potente fuente de radicales libres. Dichas radiaciones actan rompiendo enlaces entre los tomos, dejando los radicales con sus electrones desapareados para propagar su dao. Los radicales libres se producen en el curso de varios procesos de enfermedad. En el ataque cardiaco, por ejemplo, cuando se suspende el suministro de oxgeno y glucosa al musculo cardiaco lo que cauda dao real al msculo es el gran nmero de radicales producidos.2.3 Efecto de los antioxidantes en los radicales libres Segn Challen y Block (2008). El cuerpo emplea antioxidantes para reducir los radicales libres y el dao que estos pueden causar. Los antioxidantes donan electrones a estos radicales libres poniendo fin a la reaccin en cadena estabilizando as al tomo, que ha estado intentado encontrar una pareja para su electrn desparejado.Se dispone de pruebas de fuertes pruebas donde los efectos lesivos del exceso de radicales libres puedes ser limitados o incluso prevenidos tomando grandes dosis de sustancias antioxidantes como la vitamina C y la vitamina E. El beta caroteno, la provitamina A antioxidantes, ha demostrado tambin ser una importante arma contra los radicales libres. El beta caroteno es el compuesto de las zanahorias su color naranja, y es convertido por el hgado en vitamina A (Youngson, R 2003)2.4 Descripcin de algunos mtodos para determinar capacidad antioxidanteSegn Valderrama, J (2002). Los mtodos desarrollados para determinar la actividad antioxidantes se basan en la capacidad que tienen para captar radicales libres generados ya sea en fase acuosa o lipidica.Se han propuesto entre otros mtodos de deteccin en fase orgnica homognea (test de DPPH, 2,2 difenil- 1 picril hidracilo), en fase acuosa (test TAA,valor antioxidante total); en sistemas de membrana(peroxidacion de linoleato,LH/LUV test), actividad antirradical del xido nitroso(test NO).2.4.1 DPPH( test de 2,2 difenil- 1 picril hidracilo) Este mtodo se basa en la reduccin del radical por los antioxidantes de la muestra .El radical es estable y tiene una coloracin purpura que se pierde progresivamente mientras se aade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes. La decoloracin del radical se determina a 515nm y la cuantificacin se realiza empleando soluciones patrn de cido ascrbico o trolox(Guevara,R 2009).2.4.2 Mtodo FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power). Guevara, R (2009) menciona que en este mtodo se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basa en el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe3+ a Fe2+ que es menos antioxidante. El complejo frrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro es reducido al complejo ferroso coloreado.Se trata de un mtodo espectrofotomtrico ya que se mide la absorbancia del Fe2+. As, cuanto ms antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la reduccin y mayor la concentracin de Fe2+ y ms alta la seal de absorbancia. El complejo va a poder ser reducido por productos con potenciales redox menores a 0,7 V (potencial redox del Fe3+ -TPTZ).

2.4.3 Mtodo del ABTS cido 2,2-azinobis (3- etilbenzotiazoln)-6-sulfnico).Segn Guevara, F (2009). El radical ABTS se genera a partir de su precursor el cido 2,2 azinobis (3-etilbenzotiazoln)-6-sulfnico (ABTS) (). El radical catinico obtenido es un compuesto de color verde-azulado, estable y con un espectro de absorcin en el UV-visible. Es un radical artificial que no mimetiza bien la situacin in vivo, termodinmicamente puede ser reducido por compuestos que tengan un potencial redox menor que el del ABTS (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical, muchos compuestos fenlicos con un potencial ms bajo. El punto final de la reaccin lo marca la sustancia antioxidante empleada, fijando tiempos cortos o muy elevados que pueden interferir en los resultados finales, lo cual, es un inconveniente.La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en muestras hidrosolubles como liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso(Guevara, F 2009).

2.5. Quinua 2.5.1. Concepto de grano de quinuaLa quinua se denomina pseudocereal por su alto contenido de carbohidratos, principalmente de almidn (50- 60%) que hace que se emplee como un cereal; sin embargo, normalmente su grasa es ms alta que la de estos y su protena mayor.La quinua supera a los dems cereales en el contenido de las vitaminas B2, E y A, mientras el contenido de B3 es menor. A continuacin se presenta en el cuadro 1 la cantidad de vitaminas de la quinua con respecto a otros nutrientes (ROMO,et al.2006).

Cuadro 1. Cantidad de vitaminas (mg/100g) de la quinua y otros alimentos.

Fuente: ERPE, et al.(2001).Dentro de los compuestos presentes en la quinua tenemos los minerales que tienen capacidad antioxidante como los siguientes segn ROMO,et al. en el 2006: Cobre: Acta como antioxidante protegiendo las clulas de los efectos txicos de los radicales libres y facilita la fijacin del calcio y del fsforo. Manganeso: Tiene un papel tanto estructural como enzimtico. Est presente en distintas enzimas (superoxido dismutasa, la Mn-catalasa). Debido a que participa del complejo enzimtico superxido dismutasa, junto con el cobre y el cinc, los complementos que contienen manganeso y los citados minerales, se ha visto que aumentan la capacidad antioxidante del organismo. Selenio: El seleniofrena el efecto nocivo de los radicales libresya que forma parte de la glutation peroxidasa, una enzima antioxidante propia del organismo. sta asegura la destruccin del perxido de hidrgeno, que se forma como consecuencia de la oxidacin. Zinc: Este mineral es de gran importancia para el hombre por suspropiedades antioxidantes, su accin protectora ante los radicales libres, su capacidad de favorecer la formacin del ADN,etc.A continuacin en el Cuadro 2 se presentar la relacin general de minerales que posee la quinua con sus respectivas cantidades que aporta.

Cuadro 2. Cantidad de minerales (mg/100g) presentes en la quinua.

Fuente: ERPE, et al.(2001).2.5.2. VariedadesA. Quinua blancaLa quinua blanca es un grano pequeo de forma redonda semiaplanado de color blanco amarillento, rico en protenas, carbohidratos y la mayor cantidad de aminocidos esenciales que cualquiera de los ms importantes cereales del mundo, destacando lalisina que es uno de los ms escasos en los alimentos de origen vegetal y que est presente en el cerebro humano (REYES, E.2006).B. Quinua negraLa variedad negra tiene un alto contenido de litio lo cual la hace un buen regulador del estrs y depresin, como tambin lisina que estimula a las clulas cerebrales.Tiene protenas, grasas, carbohidratos y minerales, y otros aminocidos como la lisina, isoleucina, treonina, triptofano y valina, cuyo balance aumenta la calidad de la protena.El grano de quinua tiene diversas formas de uso para combatir las afecciones hepticas, las anginas y la cistitis (REYES, E.2006).C. Quinua RojaLa variedad Pasankalla que posee alto valor nutricional, excelente calidad de grano para la transformacin agroindustrial; presentan como ventaja principal su color natural, proporcionando un atractivo adicional al plato en relacin con la quinua blanca. Su textura es crujiente al masticarla, resultando ms aromtica y con mayor contenido de fibra que la quinua de color blanco (REYES, E.2006).III. MATERIALES Y MTODOS 3.1. Muestra alimenticia Quinua blanca y Quinua de colores.

3.2. Materiales Tubos de ensayo Tubo falcon Micropipeta de 20-200 l Micropipeta de 100-1000 l

3.3. Reactivos Metanol 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

3.4. Equipos Agitador orbital Balanza analtica Centrfuga Espectrofotmetro Vortex

3.5. Procedimiento Tomar 5 g de muestra y aadir 25 ml de metanol y a continuacin homogenizar. Colocar en un tubo falcon protegido de la luz y agitar por 15 minutos en un agitador orbital. Centrifugar el homogenizado por 15 min a 4000 RPM.

Ajustar el espectrofotmetro a cero con metanol y asegurar que la absorbancia inicial de la solucin DPPH a 515 nm sea alrededor de 1.1. Del sobrenadante se toma 2 alicuotas de 150 microlitros, agregarles 2850 l de la solucin DPPH en viales plstico y permitir que la muestra reaccione que serian T1 y T2 (tratamientos) Correr un blanco con 150 l de metanol puro para obtener un factor de correccin.(debido a la dilucin) Transferir los tratamientos de la solucin a las cubetas y realizar la lectura en el espectrofotmetro a 515 nm.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1. Resultados

Cuadro 3. Cantidad de capacidad antioxidante de los compuestos hidrosolubles presentes en la quinua blanca y de colores.Absorbanciad(Absorbancia)*mol de trolox (TE/mL)Promedio mol de troloxmol de trolox (TE/5 g de muestra)mol de trolox (TE/5 g de muestra)g de trolox (TE/ g de muestra)

Quinua Blancamesa 1 (A)t10.9470.0190.028770.030950.00460.000946.4734

t20.9420.0240.03312

Mesa 3 (B)t10.8960.0700.073110.063110.00950.001994.7744

t20.9190.0470.05311

Quinua de ColoresMesa 2 (C)t10.9040.0620.066150.060940.00910.001891.5108

t20.9160.0500.05572

Mesa 4 (D)t10.8610.1050.103530.100920.01510.0030151.5608

t20.8670.0990.09831

*Diferencia de absorbancia del blanco con respecto a la muestra de las dos variedades de quinua.

Figura 1. Relacin de los g de trolox (TE/ g de muestra) con respecto a los dos variedades de quinua.

4.2. Discusin

Segn Repo, Encina (2008) el Mtodo utilizado para analizar la capacidad antioxidante de compuestos hidrosoluble es el que emplea el DPPH8. Este mtodo utiliza un radical estable para medir el efecto antioxidante de un extracto de la muestra, adems utilizaron este mtodo para determinar 15 variedades de quinua la capacidad antioxidante y algunos resultados fueron: Pasankalla (138,91 g trolox/g) y finalmente la variedad PIQ031179 (117,49 g trolox/g). En nuestro anlisis en laboratorio de la capacidad antioxidante de compuestos hidrosolubles las cantidades que se determinaron fueron 94,77 y 46,47 g de trolox para el caso de la quinua blanca y para el caso del anlisis de la quinua de colores fue de 151.56 y 91,51 g trolox/g, estos datos los ms altos de cada prueba se podran semejar a los datos citados anteriormente, es decir nuestra quinua blanca a pesar que se encuentra lejos podra decirse que tiene un valor antioxidante cercano a la del cdigo PIQ031179 y la de colores cercano a la variedad pasankalla, aunque se estima que existe mrgenes de error en nuestros datos ya que solo se dejo en agitacin por 15 minutos y no 30 minutos segn las indicaciones establecidas en el procedimiento del mtodo empleado.

Segn Repo, Encina (2008); tambin determinaron la capacidad antioxidante de dos variedades de Kaiwa dando valores entre 91,45 g trolox/g como mnimo en una de sus variedades y como mximo 1253,67 g trolox/g en otra. Con respecto a los valores obtenidos en la prctica con quinua blanca y de colores, estos son bajos, teniendo menor capacidad antioxidante que la Kaiwa.

Segn Repo, Encina (2008); asimismo ellos analizaron la capacidad antioxidante de la kiwicha proporcionando valores entre 556,49 g trolox/g de una variedad A00298 y 660,37 g trolox/g de la A0011, comparndolos con la capacidad antioxidante de la quinua blanca y quinua de colores estos son mucho menores.

Segn Prez, J; Saura F (2007). Ciertos compuestos no antioxidantes presentes en alimentos vegetales, como algunos aminocidos y cidos urnicos, pueden actuar como interferencias, proporcionando resultados sobreestimados. De lo expuesto se puede predecir que los valores establecidos en los resultados de la practica podran mostrar un margen de error por las interferencias descritas; por lo cual sera necesario que al evaluar la capacidad antioxidante de una muestra, se debera evaluar inicialmente el contenido de estas interferencias antes de aplicar el mtodo.

El ensayo se fundamenta en la medicin de la capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical DPPH, esta medicin puede hacerse espectrofotomtricamente siguiendo el decaimiento de la absorbancia a 515 nm. La reaccin de estabilizacin se considera que transcurre principalmente mediante un mecanismo TE (Prez, J; Saura F 2007). En este mtodo se considera los gramos de muestra necesarias para captar una gramo de radical ,por lo cual mientras ms antioxidantes tenga la muestra menor ser su valor TE (Tiempo necesario para captar el radical )

Segn Pulido et al., (2003), respecto a la expresin de resultados de capacidad antioxidante, se puede observar cmo en tres de los mtodos que empleo- FRAP, ABTS, ORAC, los resultados se expresan en mol Trolox/g ms. El Trolox es un anlogo hidrosoluble de la vitamina E y se debe sealar, en primer lugar, que su eleccin como estndar de capacidad antioxidante es arbitraria. Por otro lado, tambin hay que remarcar que, aunque distintos mtodos expresen sus resultados en equivalentes Trolox, los valores no son comparables entre s, al estar basados estos mtodos en diferentes reacciones de los antioxidantes; por ejemplo, los valores de FRAP suelen ser considerablemente superiores a los de ABTS. En este sentido, las comparaciones entre resultados de capacidad antioxidante slo se pueden hacer para un mismo mtodo y para muestras obtenidas con los mismos disolventes; sin embargo resulta interesante que al evaluar la capacidad antioxidante de una muestra, siempre se deben combinar dos o ms mtodos al estar basados en distintos fundamentos y verficar la capacidad antioxidante en cada uno de ellos. En el presente trabajo se utiliz el mtodo DPPH como estndar de capacidad antioxidante y el disolvente metanol, con lo cual se procedi a comparar los resultados de la capacidad antioxidante de la quinua blanca y la quinua de colores.

V. CONCLUSIONES La capacidad antioxidante de compuestos hidrosolubles de la quinua blanca fue de 94.77 g de trolox.

La capacidad antioxidante de compuestos hidrosolubles de la quinua de colores fue de 151.56 g de trolox.

Tanto la quinua de colores como la quinua blanca, demostraron tener capacidad antioxidante, siendo la quinua de colores mucho mayor que la quinua blanca.

Se estima que los dos valores menores obtenidos de cada muestra se deba a errores de los propios analistas.

El tiempo de exposicin en el ltimo paso de anlisis fue de tan solo 15 minutos no logrando as una eficiencia en nuestro anlisis por lo tanto nuestros datos generales obtenidos no fueron los exactos.

VI. BIBLIOGRAFA

CHALLEM, JACK ; BLOCK,MELISSA(2008) .Antioxidantes Naturales.Guias practicas de Salud.Ediciones Nowtilus .Madrid .Disponible en http://books.google.com.pe/books?id=LXgrFVfozsYC&printsec=frontcover&dq=antioxidantes&hl=es&sa=X&ei=bdFhUYpt6sHgA-i1gaAF&ved=0CDEQ6AEwA. Visitado el 04 de abril del 2013.

ERPE, et al. 2001. En: Manual de produccin de quinua de calidad en el Ecuador. Quito. Disponible en la pg. web: URL. www.ecuarural.gov.ec/ecuagro/paginas/PRODUCTOS/MANUALES/manual_quinua.htm. Visitado el 02 de abril del 2013.

GUEVARA FONSECA. (2009) Flavonoides y sus acciones antioxidantes. Rev Fac Med UNAM Vol. 52 No. 2

PREZ, J; SAURA F (2007). Metodologa para la evaluacin de capacidad antioxidante en Frutas y Hortalizas. Ubicado en http://www.horticom.com/pd/imagenes/71/429/71429.pdf , Visitado el 06 de abril del 2013.

PULIDO, R.; BRAVO, L.; SAURA-CALIXTO, F. (2000). Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing/ antioxidant power assay. Journal of Agriculture and Food Chemistry.

REYES, E.2006.Componente nutricional de diferentes variedades de quinuade la regin andina. Disponible en la pg. Web: www.revistaavances.co/objects/docs/Avances_5/a5_art12_quinua.pdf. Visitado el 06 de abril del 2013.

REPO, C Y ENCINA, C. 2008.Determinacin de la capacidad antioxidante y Compuestos fenlicos de cereales andinos: quinua (chenopodium quinoa), kaiwa (chenopodium pallidicaule) y Kiwicha (amaranthus caudatus). Disponible en la pg. Web: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1810-634X2008000200002&script=sci_arttext. Visitado el 04 de abril del 2013.

ROMO,et al.2006. Potencial nutricional de harinas de quinua (chenopodium quinoa w) variedad piartal en los andes colombianos. Disponible en la pg. Web: http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol4/13.pdf . Visitado el 04 de abril del 2013. VALDERRAMA, JOSE O. (2002).Actividad antioxidante de emulsiones. Informacin Tecnolgica .Editorial del Norte .La serena-Chile. Disponible en http://books.google.com.pe/books?id=XjpYk7--EBgC&pg=PA4&dq=metodos+para+determinacion+de+capacidad+antioxidante&hl=es-419&sa=X&ei=1MtgUZCVILLx0wGgxYGQCQ&ved=0CC8Q6AEwAA#v=onepage&q=metodos%20para%20determinacion%20de%20capacidad%20antioxidante&f=false. Visitado el 05 de abril del 2013. YOUNGSON ,ROBERT (2003).Antioxidantes y radicales libres .Editorial EDAF.Madrid ,Disponible en http://books.google.com.pe/books?id=SNthxQBeHkUC&printsec=frontcover&dq=antioxidantes&hl=es&sa=X&ei=bdFhUYpt6sHgA-i1gaAF&ved=0CDcQ6AEwAg. Visitado el 04 de abril del 2013.