UNIVERSIDADE SALGADO DE OLIVEIRA – UNIVERSOCampus de Niterói

Controle de QualidadeControle de QualidadeCromatografia Liquida de alta eficiênciaCromatografia Liquida de alta eficiência

Professora: Roberta Katlen FuscoAlunos:Ana Maria Motta Janine SimeãoDayane Marins Kariny Santos Evelyn Castro Ricardo José Fabiane Barros Silvânia Almeida Iasminy Barros Viviana Soares

Junho/2012

Cromatografia liquida de alta Cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE)eficiência (CLAE)

Pode ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de analise, vem tendo destaque devido a facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação de espécies químicas.

Trata-se de um método físico-químico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis (fase móvel e estacionária).

Utiliza colunas fechadas que contêm partículas muito finas que proporcionam separações muito eficientes, são utilizadas altas pressões para forçar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da análise.

Tipos de CromatografiaTipos de Cromatografia

A classificação dos métodos cromatográficos pode ser quanto ao mecanismo de separação, quanto a técnica empregada e em relação ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificação mais popular é a que leva em consideração o tipo de superfície na qual ocorre a separação, sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.

Diferenças entre a CLAE e a Diferenças entre a CLAE e a cromatografia líquida cromatografia líquida

clássica (CLC)clássica (CLC) A cromatografia líquida clássica utiliza-se de um equipamento barato no qual o empacotamento da coluna é descartado, pois parte da amostra pode se adsorver de forma irreversível; a coluna deve ser cheia a cada separação acarretando desperdício de material e de mão-de-obra; o analista deve ser experiente; a eluição é feita pela ação da gravidade tornando o processo demorado; a quantificação e detecção são feitas pela análise manual das frações individuais, o que requer muito tempo devido ao grande número de frações coletadas, também pode ser usada alguma técnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, análise química ou registro gravimétrico e os resultados são registrados em forma de cromatograma, um gráfico da concentração da amostra versus o número da fração.

Na cromatografia líquida de alta eficiência a coluna é fechada, podendo ser utilizada inúmeras vezes; as colunas utilizadas são bastante eficientes, mas oferecem resistência à vazão da fase móvel necessitando aplicação de sistemas de bombas de alta pressão, isso faz com que a velocidade da eluição aumente. As análises são mais precisas, pois a vazão da fase móvel é facilmente controlada. A injeção é feita com microsseringas ou através de válvulas de injeção e diversos tipos de detectores podem ser utilizados. Este método não necessita tanta experiência do operador; tem alta resolução, sensibilidade e reprodutibilidade, mas dispõe de equipamentos caros e de alto custo de manutenção e operação.

Comparação da CLAE com a Comparação da CLAE com a cromatografia gasosa (CG)cromatografia gasosa (CG)

Na cromatografia gasosa as amostras devem ser voláteis, para que possam passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estáveis. A amostra não deve interagir com a fase móvel, por este motivo que a fase móvel é um gás inerte tendo como função somente carregar a amostra volatilizada. Neste método os equipamentos são mais baratos e o tempo de análise é reduzido.

Na CLAE as amostras não precisam ser voláteis nem termicamente estáveis, basta que sejam solúveis na fase móvel, por isso tem uma maior aplicação. Este método possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variação tanto na fase móvel como na fase estacionária, o que ocorre não na CG, pois a fase móvel é sempre um gás inerte.

  Vantagens e Vantagens e desvantagensdesvantagens

O Processo O Processo CromatográficoCromatográfico

Na cromatografia líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos individuais.

As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos:

1) Forças de dispersão de London ou Forças de Van der Waals;2) Interações de dipolo induzido;3) Ligações de hidrogênio;4) Interações dielétricas;

5) Interações eletrostáticas e coulombianas.

Fases – Fases Móveis (FM)Fases – Fases Móveis (FM)

Para que um solvente possa ser utilizado como fase móvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fácil purificação; deve dissolver a fase móvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificação; não deve dissolver a fase estacionária; deve ser compatível com o detector; não ser tóxico e deve ter baixa viscosidade, pois isso irá interferir diretamente na eficiência da separação, devido ao fato de solventes viscosos além de dificultarem a transferência de massa entre a fase móvel e a fase estacionária, também influenciarem na intensidade da vazão.

Uma fase móvel adequada é indispensável para a HPLC, por isso é necessário examinar fatores que determinam sua escolha, como a polaridade desta, que determina seu poder de eluição juntamente com a polaridade da fase estacionária e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separação for com fase normal, o poder de eluição aumenta com o aumento da polaridade, se a separação for em fase reversa, o poder de eluição diminui com o aumento da polaridade. Outros fatores que também devem ser considerados são o ponto de ebulição, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxidez.

Fases - Fases - Fases Estacionárias Fases Estacionárias (FE)(FE)

Devem ter alta resolução entre os componentes da amostra, devem ser de fácil introdução na coluna, ter diâmetro uniforme, partículas porosas ou peliculares e serem sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos.

As partículas da fase estacionárias podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: macropartículas, quando apresentam diâmetro entre 20 e 40μm; intermediárias, quando tem entre 20 e 10μm; micropartículas, de 3 a 10μm.

Quanto menor for a partícula, maior será a eficiência da separação, melhorando assim o processo de difusão das moléculas da amostra dentro e fora das partículas. Elas podem ser de formato esférico, também chamado de regular, e de formato irregular, sendo que as regulares são mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutível da coluna e por esse motivo são mais caras.

De acordo com a natureza das fases móvel e estacionária pode-se classificar o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa.

Cromatografia em fase normal: a fase estacionária utilizada é polar e a fase móvel é apolar, em relação à eluição, os solutos mais apolares são eluídos primeiramente, enquanto que os polares são retidos pela fase estacionária e são eluídos depois.

Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar, portanto os compostos polares são eluídos primeiro e os mais apolares eluídos posteriormente.

Principais técnicas de CLAE Principais técnicas de CLAE Cromatografia de partição

Nesta fase a fase estacionária é líquida. Este processo é baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases líquidas

O método consiste de uma fase líquida (estacionária) que por adsorção física é retida na superfície da coluna empacotada geralmente com sílica e de uma fase móvel, também líquida, que passa sobre esta fase estacionária sendo uma destas polares e a outra apolar. Esse mecanismo de separação baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra da fase móvel e estacionária. Os componentes da amostra que são mais solúveis na fase móvel são eluidos primeiro enquanto os que têm maior afinidade com a fase estacionária são seletivamente retidos por ela.

Desvantagens: O inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionaria e móvel que pode acarretar a deterioração da coluna, levando a não reprodutibilidade nas separações repetidas. Pode ser resolvido de duas maneiras:

1° Saturando a fase móvel com a fase estacionaria por meio de uma pré-coluna, colocada antes do injetor que tenha uma alta percentagem de fase estacionaria.

2° Utilizado materiais que contenham a fase estacionaria quimicamente ligada a um suporte solido.

Cromatografia de Cromatografia de absorçãoabsorção

A forma mais clássica da cromatografia líquida e devido a recentes adaptações tornou-se o mais importante membro dos métodos de HPLC. O mecanismo de separação se baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária).

O equilíbrio estabelecido é :

Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e serão fortemente retidos.

Cuidados a serem Cuidados a serem tomadostomados

Antes de ser iniciar o processo cromatográfico, a câmara, contendo a mistura de solvente, já deve estar saturada de seus vapores,

O solvente não deve correr até o bordo superior do papel (cuidado com o número de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distância. De preferência até uns 2 a 3 cm do bordo superior.

EquipamentosEquipamentos

As principais características que devem ser levadas em consideração na escolha de um equipamento para CLAE são:

a) Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos, servir a distintas técnicas cromatográficas e realizar o máximo de operações, tais como, gradiente de fase móvel, coleta das frações, reciclagem de frações, etc., necessárias às análises sofisticadas.

b) Rapidez: Para se conseguir análises rápidas, deve-se obter as melhores condições de CLAE, isto é, fase móvel de baixa viscosidade, bomba de alta pressão e colunas com partículas de pequeno diâmetro (grande área de superfície, que ajuda os processos de separação).

c) Reprodutibilidade e Estabilidade: características essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parâmetros de operação, como vazão, temperatura, pressão e composição da fase móvel.

d) Sensibilidade: Um bom equipamento, mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra, deve gerar sinais de intensidade apreciável.

Aplicações

A identificação dos componentes de uma amostra é feita através da comparação dos cromatogramas obtidos com padrões, nestes padrões o componente em questão é eluído nas mesmas condições da amostra a ser analisada, tendo a formação de um pico em um determinado tempo chamado de tempo de retenção, sendo assim os componentes são identificados pelo tempo de retenção. Os cromatogramas são gráficos do tempo em minutos pela resposta do detector.

Cromatograma típico da separação dos tocoferóis em amora-preta (Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de fluorescência a 290nm de excitação e de 330nm de emissão.

Os padrões são obtidos comercialmente e são analisados em diferentes concentrações, formando assim uma curva de calibração, esta trata-se de um gráfico da concentração do componente pela área do pico obtido. Através desta pode-se quantificar os componentes da amostra quando se obtém a área dos picos.

A cromatografia líquida de alta eficiência tem uma ampla aplicação na análise de alimentos na quantificação de compostos. Alguns exemplos mais comuns são: Vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis, antocianinas, carotenóides, compostos fenólicos, lipídios, açúcares, hidrolisados protéicos.

Referências Bibliográficas

RUTZ, Josiane Kuhn. Avanços na cromatografia líquida. 2009. 41f. Trabalho acadêmico (Seminário em Alimentos) - Bacharelado em Química de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

BARBOSA, Nádia Rezende. et al. Cromatografia líquida de alta eficiência aplicada ao controle da qualidade de cis-permetrina em loção capilar. 2008. v.34, n.1, p.19-25. HU Revista, Juiz de Fora.

COLLINS, Carol H. et al. Fundamentos de cromatografia, Ed. Unicamp, 2007.

A importância da cromatografia. Revista Controle de Contaminação - Editora Nova Técnica Editorial

(www.engenhariaearquitetura.com.br)Cromatografia liquida de alta eficiência – HPLC(http://pfarma.com.br/farmaceutico-industrial/130-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia)

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