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19/11/2015
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TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS
Verónica Fernández Mancebo2015
TRANSCRIPCIÓN:
•Es la síntesis de una cadena de ARN
•Representa a una de las hebras de ADN (hebra codificante)y es complementaria a la que le sirvió como molde
PROCARIOTAS EUCARIOTAS
MOLÉCULAS conteniendo el material genético por Organismo
UNA UNICA MOLECULA (genóforo)
VARIOS (HASTA 190) (cromosomas)
Ubicación del material genético (ADN)
LIBRE EN EL CITOSOL(nucleoide)
DENTRO DEL NUCLEO FORMANDO LA CROMATINA (ADN-PROT)
Copias del material genético
HAPLOIDES (UNA UNICA
COPIA)
MAYORIA DIPLOIDES (DOS COPIAS DE CADA CROMOSOMA)
Transcripción y Traducción
ACOPLADAS EN EL CITOSOL
TRANSCRIPCION EN EL NUCLEO Y
TRADUCCION EN EL CITOPLASMA
Intrones en los genes NO SI, INTERRUPEN LOS EXONES
Diferencias para ir recordandoRecordando… Recordando…
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CROMATINA
Complejo de ADN-proteínas
Proteínas -> histonas (peq ricas en K y R)->no-histonas (polimerasas, factores de transcr, etc.)
Nucleosoma: Unidad estructural repetida que forma la cromatina
(146pb que envuelve un octámero de histomas)
Recordando…
Los nucleosomas compactan el ADN eucariota, en
varias veces su tamaño, permitiendo que quepa en el
núcleo del al células
Los nucleosomas se conectan por espaciadores
de ADN que se llamanADN de unión o internucleosoma
Recordando…
La Topología del ADN eucariota impone mayor limitación al acceso de la ARN polimerasa y factores de transcripción
Recordando…
- Heterocromatina
- Eucromatina (transcripción)
Recordando…
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Las Histonas se modifican por la acción
de otras proteínas
Las proteínas Remodeladorasdesagregan el
nucleosoma liberando las Histonas de la
cromatina
El complejo de transcripción puede
unirse al ADN e iniciar la transcripción
Recordando…
Otros Remodeladores de cromatina
Recordando…
Terminación: escasa regulación
•ARN polimerasas (I, II y III)
Síntesis de ARN en eucariotas:
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•Utiliza promotores y tiene un importante uso de “enhancers” (potenciadores)
•Factores de transcripción (interaccionan con ADN y otros factores)
•Poca regulación en el punto de terminación
•Los ARN transcriptos primarios son ampliamente procesados
Síntesis de ARN en eucariotas:
•ARN polimerasas (I, II y III)
La síntesis comienza cuando la ARN-polimerasase ubica en el punto de inicio (Inr)
Promotor Unidad de transcripción
+1 (Inr)-1
upstream(-)
downstream(+)
5’3’
3’5’
ADN
EXPRESIÓN
ARN transcripto primario ARN maduro
transcripción Procesamiento
Las 3 ARN-polimerasas nucleares de eucariotas
ARN pol IIARN pol I ARN pol III
•Transcribe ARN ribosomal (nucleolo)
•Está formada por 13 subunidades
•Necesita la acción de 2 elementos de control (UCE y Core)
Core promoter
Punto de inicio
–170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20Upstream control element
UBF1UBF1
SL1
?
ARN polimerasa I
Existen muchas (cientos) copias de la unidad de transcripción (todos el mismo promotor)
•Sintetiza el 80-90% del ARN total de una célula
•Produce un único ARN transcripto primario
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Espaciador no transcripto Xenopus (Caudy et al 2002)
Formación del complejo de iniciación
ARN polimerasa I
Levadura
Mamífero
Procesamiento del pre-rRNA•Los cortes son en lugares específicos en una secuencia específica
•Parece estar ayudada/catalizada por ARN pequeños nucleolares (snoARNs).
•snoRNAs se asocian a proteínas (snoRNP) (ej. fibrillarina)
5S: sintetizado por ARNpol-III(nucleoplasma) y migra hacia el nucleolo para ensamblarse. No sufre modificaciones
Metilaciones (Met): • Sufre varias metilaciones
Por ej 18S: 4Met
• Posiciones conservadas de los
metilos (en el 2’ de
determinadas ribosas).
Terminación
*Elemento a unos ~1000 bp hacia el 3‘ del ARNr maduro
*Involucra un elemento 18 pb presente en copias múltiples (AGGTCGACCA/TT/ANTCCG) y un elemento rico en T hacia el 5’ del terminador.
*Factor de finalización de la transcripción (TTF-I) que se une a dichos elementos y detiene la elongación de la Pol I
*El factor de liberación PTRF interacciona con TTF-I y con la Pol I, disociando el complejo de transcripción pausado
*TTF es específico para Pol I y no tiene efecto para Pol II
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•Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) (nucleoplasma)
•Está formado por 14 subunidades
•Es la polimerasa con menor producción de ARN
•Los promotores pueden estar tanto en la región 5’ (snARN, ej U6) como 3’ (de Tipo 1: 5S y de Tipo 2: tARN)
ARN polimerasa III
Oct PSE TATA5’
A CTipo 1
A BTipo 2
3’ Punto de inicio
A C
TFIIIA
Punto de inicio
TFIIIC
TFIIIB
Punto de inicio
A B
TFIIIC TFIIIC
TFIIIB
TFIIIB
TFIIIB
TBP
TIPO 1 (ej 5S) TIPO 2 (ej alg tARN)
TBP
Requiere de varios tipos de factores: TFIII-A, TFIII-B y TFIII-C
Intrones
*Una endonucleasa corta en los extremos. Seproducen dos medias-moléculas de tRNA [5’OH y3’PO4 cíclico (2’-3’)]
*La reacción de la ligasa de tARN, tiene lugar entres pasos:
a)Fosforilación del 5’OH con el gamma-PO4del GTP.
b)Formación de un intermediario activado dela ligasa (ligasa-AMP) que transfiere el AMPcíclico al 5’PO4 del sustrato.
c)El PO4 cíclico se abre dando 2’PO4 y 3’OH.Se da la formación del 5’-3’-fosfodiester yel AMP cíclico se libera.
*La fosfotransferasa dependiente de NAD (nico-tinamida adenina dinucleótido) transfiere el2’PO4 al NAD
Procesamiento del pre-tRNA(ARN pol III)
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Extremo 5’: endonucleasa ribonucleasa P (RNasa P) (enzima-RNP)
Extremo 3’: Cambio de U del extremo por CCA (3’ )
•Agregado de grupos metilos e isopentilos a residuos de purinas
•Metilación de los 2’OH de la ribosa
Codón de Tyr: 5’-UAC-3’
Anticodón: 5’-GUA-3’
•Conversión de U a residuos de dihidro-U (D),
pseudo-U (Ψ) o ribotimidinas (T, metiluridinas)
Terminación
* Ocurre en un elemento poli-T (5-6 ) localizadas en una región rica en G/C hacia el 3’
*el 3’ es heterogéneo y no precisa formar looppara finalizar.
ARN POLIMERASA II•Transcribe los genes estructurales (prot) a ARNm (y hnARN) (nucleoplasma). Es la enzima que transcribe la más diversa población de ARNs.
•Múltiples subunidades
•Se observan 3 grupos de promotores: genéricos, específicos e inducibles.
•Promotores genéricos: secuencia mínima necesaria con la cual la polimerasa puede iniciar la transcripción. No depende de secuencias reguladas por tejidos. Son de baja eficiencia
•Al menos 8 factores de transcripción (TFII A,B,C,D,E,F,H,J)
•Condiciones generales para la síntesis de ARN
Inr (región iniciadora) puede ser descrita como Py2CAPy5
TATA box: secuencia consenso de 8pb a unos ~25pb, rodeado de secuencias ricas en GC. Lo contienen la gran mayoría de los promotores. Se une TFIID/TBP
TAF: TBP-associated factors
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URS1, UAS = elementos de control
Um6 = represorSin3 = fijaciónRpd3 = desacetilasaGcn4 = activadorGcn5 = acetilasa
Punto de inicioTATA
TFAs
TFIIA
TFIIB
TFIIF ARN Polimerasa II
TF
IIE
TF
IIJ
TF
IIH
PPP
PPP
P [YSPTSPS]n
Las proteínas del potenciador se unen a las del promotor induciendo la
transcripción
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Modelo de amplificosoma (amplificador del interferón β). El heterodímero cJun/ATF-2, IRF-3, IRF-7 y NF-κB un heterodímero (p50 y p65) se unen a los cuatro elementos de control en elamplificador. La unión cooperativa de estos factores de transcripción es facilitada por HMGI, que se une al surco menor del DNA. Las proteínas cJjun, ATF-2, p50 y p65 parecen interactuar de manera directa con un HMGI unido adyacente a ellas. La curvatura de la secuencia amplificadora debída a la unión HMGI es decisiva para la formación de un amplificosoma. Proteínas curvadoras del DNA diferentes actúan de manera similar en otros amplificadores.
Estructura general de los factores de transcripción
LBD dominio de unión al ligando
Cro: homodímero. Cada subunidad (66 aa) posee tres hélices α y tres hojas β antiparalelas. El dímero se mantiene unido por la asociación de dos hebras β antiparalelas, entre las que se situa el eje de simetría binario
Factores HTH(hélice-giro-hélice)
Los residuos forman puentes de hidrógeno con las bases del surco mayor. Los contactos no polares entre estas hélices
estabilizan el conjunto.
Proteínas con Homeodominios
Interacción entre el Homeodominio y el ADN
doble hebra (21 pb). La hélice 3 ocupa el surco mayor del ADN, mientras
que el brazo N-terminal (en amarillo) se une al
surco menor.
RatónRana
DrosofLevad
3D
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Dedos de zinc (C2H2) Dedos de Zinc C4
GL1 (monómero) Receptor de GC (homodímero)
Dedo de Zinc C6 (homodímero) Zn2Cys6
Saccharomyces cerevisiae
Las proteínas con Leu zipper (homo o heterodímeros) básicos
Modelo propuesto para la interacción de una proteínacon Leu-zipper a su secuencia blanco (palindrómica) del
ADN. El zipper se estabilizada por interacciones hidrofóbicas y de van der Waals entre leucinas.
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Hélice-lazo-hélice (homo o heterodímeros) básicos Mecanismos de acción de los represores
-Indirecta, modificando el estado de la cromatina (desacetilación de histonas)
-Directa:a) competitividad con el sitio de fijación del activadorb) Interacción directa con el dominio de activación de los activadores bloqueandolos. c) competitividad por el sitio de fijación de los factores generales de transcripción delos activadores
Algunos represores eucariontes puedeninhibir la transcripción por mecanismosdiferentes a la desacetilación de histonas.En los tres mecanismos, el represor inhibe laactivación o interfiere directamente laformación del complejo de iniciación. Ademásalgunos represores interactúan con proteínas“correpresoras”, que a su vez interactúan confactores de transcripción generales.
Procesamiento del pre-mARN - Implica una condensación de un grupo trifosfato y varias
metilaciones.
- Juega un importante papel en la iniciación de la síntesis de
la proteína
La caperuza
- Protege al ARNm de la degración mientras se está
sintetizando el transcripto
- Involucrado en exportación ARNm al citoplasma
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GTP-Met + + pp + p*
CAP
cap0
cap1
cap2
1) Da estabilidad al ARNm en el citoplasma
2) Colabora con la exportación del ARNm
3) Está implicada en la traducción
4) Consecuencia práctica (purificación)
5) Excepción: las histonas
La cola de poli(A)
Complejo actuante: CPSF, CstF, CF (I yII), PAP y PABP. Remoción de los intrones(corte-empalme o “Splicing”)
-Las reacciones son por transesterificación-La remoción de los intrones no es secuencial.-Involucra partículas de snRNP y otros factores independientes
Formación del “spliceosoma”
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El splicing es mediado por RNPs nucleares
U1: ARN pequeño nuclear (snARN) que forma parte de la partícula snRNP U1, que reconoce el sitio donante (sitio 5’ de “splicing”)
Esquemáticamente:
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1) Un solo ADN que utiliza diferentes puntos de inicio y finalización de la transcripción, alterando el patrón de “splicing”
2) Existe un solo transcripto de ARN que es empalmado de más de una manera. Los exones son sustituidos, agregados o ignorados.
“Splicing” alternativo
La diferenciación sexual en la mosca de la fruta, está regulada por una proteína llamada “sex-lethal” (sxl).
El embrión hembra expresa la proteína Sxl funcional mientras que en los embriones machos expresan una proteína Sxl no-funcional.
Diferenciación sexual en Drosophila“Splicing” alternativo
*La secuencia lider (SL) provee un exon
extra en el 5’ del transcripto
*Es el mismo mecanismo que en el cis-splicing
por transesterificación (pero se genera una
molécula de ARN con forma de “Y”)
*Esencial en Trypanosoma
- La región que codifica para la SL es muy
parecida al U1 (que falta)
- Cap 4 (2,2,7-trimetil guanosina y están
metilados los 4 nts sgtes)
*Trans-splicing alternativo (LYT1: nuclear y
secretada)
“Trans-splicing” - Agregado de SL “Editado” del ARNmEjemplo en mamíferos con la proteína ApoB.
-No hay evidencia que exista otro gen u otro exón-Ocurre una desaminación (C �U), por la citosina desaminasa
(4563 aa) (2153 aa)
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Editado usando ARN guías
Mecanismo
Esencial para Trypanosomátidos
•ARN polimerasas y esquema de sus promotores
•Procesamiento de los pre-ARNr
•Modificaciones en los pre-ARNt
•Maduración de los pre-ARNm:
•Cap
•poli(A)
•cis splicing (simple, alternativo)
•trans splicing
•Editado
•Esquema de los controles en la expresión génica
Resumen:
¿Preguntas? ¿Dudas?
