Transcripción  en  eucariontes  

Diferentes tipos de RNA polimerasas

!   1. RNA Polimerasa I sintetiza RNA ribosomal (rRNA) 5.8S, 18S y 28S. !   2. RNA Polimerasa II sintetiza RNAs mensajeros (mRNA), RNAs pequeños nucleolares (snoRNA), micro RNAs (miRNA), RNAs pequeños interferentes (siRNA) y la mayoría de RNAs pequeños nucleares (snRNA). !   3. RNA polimerasa III sintetiza RNAs de transferencia (tRNAs), rRNA 5S y algunos RNAs pequeños nucleares (snRNAs).

!   En plantas hay RNA Polimerasa IV y V involucradas en la síntesis de ciertos siRNAs y silenciamiento epigenético.

La Topología del DNA eucarionte impone mayor limitación al acceso de la RNA polimerasa y factores de transcripción

Organización nuclear eucarionte

Territorios cromosómicos Nucleolo

Fábricas transcripcionales

Poros nucleares

Complejos ribo-nucleoprotéicos nucleares

Territorios cromosómicos nucleares

Chakalova et al., 2005

Fábricas transcripcionales

INTERFASE METAFASE TRANSCRIPCIÓN ACTIVA

TRANSCRIPCIÓN INACTIVA

REPLICACIÓN

B A

EUCROMATINA VS HETEROCROMATINA

Transcripción

Proteínas modificadoras de Histonas

Remodeladores de cromatina

Factores de Transcripción y RNA polimerasa

Otros Remodeladores de cromatina

Promotores Basales eucariontes Clase II (RNA pol II) para mRNAs

Bacteria Eucariontes INICIO

Complejo cerrado

Unión Holoenzima

Complejo abierto

Síntesis de RNA

Escape del promotor

Unión TBP

Cambio conformacional Unión TFIIB

Unión RNA pol II y TFIIF

Complejo de pre-inicio

Unión TFIIE y TFIIH

Complejo de inicio

Escape del promotor

Liberación de Sigma

Fosforilación de CTD De RNA pol II y liberación De varios factores TFII

Síntesis de RNA

Factores Basales de transcripción Clase II (TFII) TFIID: TBP (proteína de unión a caja TATA) y factores accesorios TFIIA: Estabiliza la unión de TFIID TFIIB: Ayuda a posicionar al complejo de factores y la RNA pol II sobre el promotor TFIIF: Proporciona la ocupación de 30 pb, tiene actividad de helicasa para abrir la doble cadena en el sitio +1

TFIIE: Recluta a TFIIH y regula sus actividades de helicasa y cinasa

TFIIH: Complejo de 9 subunidades: actividad de helicasa para abrir la doble hélice e iniciar transcripción; actividad de cinasa para fosforilar el Dominio Carboxilo Terminal (CTD) de la RNA pol II y permitir escape del promotor; actividad de exonucleasa para reparar errores en NER

La unión de TBP a un sitio TATA distorsiona la cadena y permite el reconocimiento del sitio +1 por las tres polimerasas eucariontes

La RNA polimerasa II - 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kDa

RNA pol bacteriana

cola que se fosforila (CTD)

Esquema General del Complejo Transcripcional Eucarionte

TFs: Factores basales de transcripción; TFI (RNA pol I), TFII (RNA pol II), TFIII (RNA pol III) TAFs: Factores de transcripción accesorios (facilitan la unión de TFs) Activadores: Proteínas que unen secuencias distantes en el DNA llamadas “enhancer” o “intensificador” y estimulan la transcripción Represores: Proteínas que unen secuencias distantes en el DNA llamadas “silencer” o “silenciador” y reprimen la transcripción MEDIADOR: Complejo MULTI-proteico que comunica a los Activadores/Represores con TFs/TAFs para REGULAR los niveles de Transcripción (NO se une directamente al DNA) PIC: Complejo de pre-inicio de la transcripción

Unidades transcripcionales Clase I (Transcritos por RNA pol I)

ARN ribosomal 18S, 28S, 5.8S

Los promotores de Clase III (RNA pol III) se distinguen por ubicarse dentro de la región que se transcribe (entre +41 y +87) Unidades transcripcionales de tRNAs y rRNA 5S, otros snRNAs El complejo de RNA pol III es el mas grande y pesa 700 kDa

Unidades transcripcionales Clase III (Transcritos por RNA pol III)

ELONGACIÓN Bacteria Eucariontes

ELONGACIÓN Eucariontes

Modificación del extremo 5’ del RNA

Modificación del extremo 3’ del RNA Remoción de intrones

mRNA

1. Capping

1)  La fosfatasa remueve un fosfato del 5´ 2) Una guanil transferasa

agrega GMP 3) Una metil transferasa

agrega el grupo metilo

Adición de “cap” (7mGpppN) en el extremo 5’

¿Para qué el 5’ Cap?

1. Le da estabilidad al mRNA en el extremo 5’ (evita corte por exonucleasas de RNA). 2. Permite la exportación nuclear del mRNA, o en su caso la retención en el núcleo. 3. Posibilita el inicio de la traducción en mRNAs eucariontes. 4. Promueve la degradación de mRNAs cuando están las señales celulares apropiadas.

Corte en la unión exón-intrón; junta dos exones Dos reacciones de trans-esterificación Catalizadas por RNA; RIBOZIMA

2. Remoción de intrones (splicing)

Existen secuencias específicas en los límites exón-intrón y una Adenina en contexto de secuencia que promueve la catálisis

R= purinas Y= pirimidinas

Los snRNAs forman parte de partículas ribonucleoprotéicas (snRNPs): U1, U2, U4, U5, U6 Además participan otras proteínas como BBP y U2AF

Una molécula de RNA (snRNA) es responsable del corte: actividad RIBOZIMA

3. Poliadenilación en extremo 3’ TERMINACIÓN

Proteínas específicas reconocen las secuencias de poliadenilación

TERMINACIÓN

El RNA es cortado y la enzima Poli-A polimerasa (PAP) agrega Adeninas (50-250)

TERMINACIÓN

Proteínas de unión a la cola de poli A se unen (PABP)

TERMINACIÓN

Pueden existir cortes alternativos de intrones/exones en el pre-mRNA (Splicing altenativo) y sitios alternativos de poliadenilación

Un gen

5 mRNAs maduros 5 proteínas diferentes

Fuente de variabilidad genética, dependiendo de tejido, desarrollo, etc.

El receptor de exporte nuclear dirige la salida del mRNA del núcleo al citoplasma

La salida del mRNA es coordinada por proteínas unidas a la molécula: CBC: Complejo de proteínas de unión al “5’ Cap” EJC: Complejo de “splicing” de intrones PABP: Proteína de unión a cola de poli A

Inhibidores de la transcripción eucarionte

+ N H

Sar L-Pro L-meVal

D-Val L-Thr

O

Sar L-Pro L-meVal

D-Val L-Thr

O

O O C C N NH2

O O CH3 CH3

Acridina

Actinomicina D

Se intercala entre bases G y C

a-amanitina

Es un octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides. Inhibe la transcripción de la RNA polimerasa II eucarionte.

Procariontes Eucariontes 1. Todas las especies de RNA son sintetizadas por la misma especie de RNA polimerasa.

1. Hay 3 diferentes RNA polimerasas responsables de la transcripción de diferentes moléculas de RNA

2. El mRNA se traduce durante la transcripción.

2. El mRNA es procesado antes de ser transportado a citoplasma (adición de CAP, cola de poliA, splicing

3. Los genes son segmentos contiguos de DNA alineados ininterrumpidamente con el RNA traducido a proteína.

3. Los genes frecuentemente se interrumpen por intrones.

4. Los mRNAs son frecuentemente policistrónicos (operones)

4. Los mRNAs son monocistrónicos

5. La RNA polimerasa solo requiere a sigma para reconocer el promotor

5. Las RNA polimerasas requieren múltiples factores de transcripción adicionales para reconocer el promotor.

6. No hay procesamiento co- y post-transcripcional del mRNA

6. El mRNA sufre procesamiento extenso durante y después de la transcripción

Resumen