C. PangaultC. PangaultLaboratoire Hématologie

CHU RennesINSERM U917 MICA

Nouveaux outils biologiques en Hématologie

TRANSCRIPTOME : TRANSCRIPTOME : APPORT DE LA GENOMIQUE APPORT DE LA GENOMIQUE 

DANS LDANS L’’ANALYSE DES ANALYSE DES HEMOPATHIESHEMOPATHIES

DES  Clinique21 janvier 2010

I I -- GGéénnééralitralitéés sur le gs sur le géénomenome

L’être humain

1013 cellules 

Même patrimoine génétique

3,1 x 109 paires de bases

Taille de différents génomes

Drosophile (10)

Levure (1)

E. Coli (0,3)Génome Humain (200)

: = Annuaire téléphoniquede 1000 pages (Paris)

Publication de la séquence du génome humain : Science et Nature, 2001

30 000 gènes Séquences

répétées

Introns

2 % ADN codant

Autre : séquences régulatrices, etc.

Génome

mRNA

Gènes

Protéome Métabolome

Proteines

Métabolites

Phénotype

Transcriptome

Transcriptome

Yeoh EJ, Cancer Cell, mars 2002

LAL pédiatriques

Protéome 11000 11500 12000

11608.13

050

100150200

uA

11605.61

050

100150200

uA

11605.830

50100150200

uA

11602.70

050

100150200

uA

11602.90

050

100150200

uA

11604.86

050

100150200

uA

11607.96

050

100150200

uA

11605.22

050

100150200

uA

11000 11500 12000

• 2D-Gel

• Spectrométrie de masse

Réseau d’interaction fonctionnelle

Métabolome

KEGG metabolic pathway database

II II -- Les Puces Les Puces àà ADNADN

Questions posées …

• Classification des tumeurs pronostic• Compréhension de la biologie de la tumeur

comparaison avec le tissu normal• Prédiction de la sensibilité à une drogue• …

Objectif : Traitement Traitement àà la carte du cancerla carte du cancer

Analyse du transcriptomeRT‐PCR : 

1 gène, 10 échantillons

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

abcdefghijklmno

XG-14

A

Microarray :  lames de verres, miniaturisation

1 échantillon, 30 000 gènes 

ou 1,4 M d’exons

Macroarray:  membrane nylon, marquage radioactif

1 échantillon, 200 à 10 000 gènes

Protocoles adaptés aux très petites quantités de cellules (Microdissection laser) 1‐100 cellules

RQ‐PCR: 

1 ou plusieurs gènes, 1 à 96 – 384 échantillons

Microarrays:  Microarrays:   Plusieurs technologies / Plusieurs fournisseurs

Dépôt de cDNA ou Dépôt/synthèse in situ d’oligonucléotides

Hybridation des cRNA fluorescents (1 ou 2 couleurs)

Puces expression Affymetrix : La mesure de l’expression utilise 11 à 20 paires de carrés (1 probeset).Les différents oligonucléotides (sondes) d’un probeset ne sont pas dans des carrés contigus mais sont dispersés sur la puce.

PM (perfect match)MM (missmatch)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 probeset = 14 pairesde sondes correspondant à

1 gène

ADNc : GATCGGGATTCGACATGACATTTGACCATCATGGTCAGCATCGAGGA

GACATTTGACCAACATGGTCAGCATGATCGGGATTCAACATGACATTTGA

Intégration informatique des signaux :  les niveaux d’expression dès gènes reflétés par la puce sont une donnée absolue. C’est le rapport des niveaux observés entre la condition test et la condition référence (ou témoin) qui est exploitable. On parle de facteur de régulation ou « fold change »

AFFY : AFFY :

1- Analyses non supervisées= sans à priori de groupe, comment se classent les échantillons et les gènes?

• Classification hiérarchique • PCA = ACP• ….

Création de clusters ‐> Découverte de classes

Analyses des données

2- Analyses supervisées

= connaissant deux groupes d’échantillons, quels gènes les séparent? = Probabilité pour qu’un échantillon appartienne à une classe définie avant l’analyse ?

• Mann Whitney• t‐Student• SAM• …

‐> Prédiction de classe

3- Définition de signatures moléculaires= Ensemble de gènes exprimés de manière coordonnée qui reflètent 

un aspect particulier de la biologie cellulaire, tels que le linéage 

cellulaire, le stade de différenciation ou l’activation de voies de 

régulation.

Comment comprendre ces signatures? Annotations fonctionnelles

Ingenuity Systems

Gene Ontology (GO) analysis

Quelques exemples ….

Pathway Architect

Autres applications des « arrays »• CGH (Comparative Genomic Hybridization)

: analyse de variations du nombre de copies d’un gène (gain ou perte) sur ADN

• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

: analyse des variations d’une seule paire de base du génome 

• Séquençage

• Tilling (Targeting Induced Local Lesions in Genome)

: méthode combinant des approches de mutagénèse aléatoire et des méthodes modernes d’analyse de l’ADN permettant l’identification à haut débit de mutation ponctuelle

• miRNA (microRNA)

: analyse de petites séquences ARN ayant un rôle régulateur (répresseur) post‐transcriptionnel 

III III -- Les analyses de transcriptome Les analyses de transcriptome en Hen Héématologie : matologie :

exemples des lymphomes B du exemples des lymphomes B du centre germinatifcentre germinatif

1- Lymphomes B diffus à grandes cellules (DLBCL)

Germinal Center B-likeGC

Activated B Cell-like ABC

= non GC

Modèle cellulaire

Alizadeh et al., Nature, 2000

Patients n=42 DLBCL

Alizadeh et al., Nature, 2000,

Établi sur 42 patients

2 sous‐types avec un pronostic différent :

Rosenwald et al., NEJM, 2002

Validé sur 240 patients

Validation extérieure?Rosenwald et al., NEJM, 2002

274 patients 100 gènes les plus discriminants de la série d’Alizadeh

3 classes : GC, ABC, type 3 Valeur pronostique

Shipp et al. Nature Medecine, 2002

Prédicteur basé sur 13 gènes (≠ Alizadeh)58 patients

’série Alizadeh’ ’série Shipp’

Etude de 90 gènes de la signature Alizadeh : 

Wright et al., PNAS, 2003

Comparaison des 2 séries Rosenwald et Shipp

Calcul d’un score linéaire de prédiction

Application à la routine ?

Tentative de construction d’un « IPI moléculaire »

Par analyse en PCR quantitative de 36 gènes « candidats » sur 66 patients

Lossos et al. NEJM, 2004

6 gènes retenus  = LMO2BCL6FN1BCL2SCYA3CCND2

Détermination d’un score pronostique avec 3 groupes de risque

Algorithmes de classification IHC pour les DLBCL

Pronostic favorable

Pronostic défavorable

152 patientsTissue Microarray TMA

Hans et al., Blood, 2004

+

CD10

GCB

BCL6

MUM1

MUM1/

IRF4

Non-GCB

GCB

Non-GCB

-+

-

+

-

+/-

42 cas27 cas

22 cas

61 cas

BCL2

Groupe 1-

+ CD10

Groupe 1+

-MUM1/IRF4

Groupe 1

Groupe 2

-

+

Pronostic favorable

Pronostic défavorable

Murris et al., J Pathol, 2006

'Ox Phos' : Métabolisme phospho‐oxydatif = Gènes impliqués dans

Phosphorylation oxydativeFct° mitochondrialesChaîne de transport électron

'BCR/Prolif' : Gènes impliqués dansRégulation du cycle cellulaire, réparation ADN, …

'Réponse de l'hôte' :  Gènes impliqués dansActivation T/NKPrésentation antigénique par Monocyte/DC

Monti et al., Blood, 2004

Place du Microenvironnement dans les DLBCL

176 patientsAnalyse non supervisée sur 2000 gènes

‐> Pas de valeur pronostique en survie à 5 ans(signature GC/ABC validée en survie sur ces échantillons)‐> identification de mécanismes pathogéniques et de cibles thérapeutiques potentielles

OxPhos BCR HR

Que deviennent ces signatures à l’ère du Rituximab ?

Lenz et al.,NEJM, 2008

DLBCL traités R-CHOP

181 patients traités CHOP233 patients traités R‐CHOP

Modèle d’analyse multivariée ‐> Prédicteur pronostique : 3 signatures

Patients traités R-CHOP

Lenz et al.,NEJM, 2008

Impact du microenvironnement dans les DLBCL traités R-CHOP

⇒ À l’ère du R-CHOP : influence du microenvironnement tumoral (cellules immunitaires, fibrose et angiogénèse)

2- Lymphomes folliculaires (FL)

RRééponse ponse immunologique 1immunologique 1Bon pronosticBon pronostic

‐> lymphocytes T et macrophages

RRééponse ponse immunologique 2immunologique 2Mauvais pronostic Mauvais pronostic 

‐> macrophages et/ou DC

Dave et al., NEJM, 2004

Expression sur les fractions CD19neg

CD68

Farinha et al. Blood 2005; 106:2169

Foxp3

Carreras et al. Blood 2006; 108:2957

CD8

Alvaro et al. J Clin Oncol 2006; 24:5350

Etudes contradictoires,retrospectives, traitement‐dépendantes,descriptives 

Place du Microenvironnement dans les FL

Place du Microenvironnement dans les FL: importance du traitement

de Jong et al.,Haematologica, 2009

ConclusionConclusionOn peut aujourd’hui analyser notre GENOME :

Affiner le pronostic

Nombreuses nouvelles cibles thérapeutiques potentielles

Demainune puce pan-génomique au diagnostic

un traitement adapté, « à la carte »

On entre dans l’ère de la médecine personnalisée