Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung Nadja Zfle
pdiatrische Onkologie und Hmatologie, CVK
Folie 2
Transfektionsmethoden Nadja Zfle pdiatrische Onkologie und
Hmatologie, CVK
Folie 3
Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien
Transiente Expression Vorbergehende Expression z. B: Verlust bei
Zellteilung (Verdnnung) Definitionen
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:
Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus)
Folie 8
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:
Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus)
Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt)
Folie 9
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:
Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus)
Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt) Einbringen des
Plasmids durch Transfektion
Folie 10
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:
Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus)
Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt) Einbringen des
Plasmids durch Transfektion Virusproduktion
Folie 11
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer:
Infektion
Folie 12
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion
Reverse Transkription
Folie 13
Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion
Integration Reverse Transkription
Folie 14
Lipofektion Prinzip der Lipofektion: DNA + liposomales Reagenz
Inkubation Liposomen endozytotische Aufnahme Transient vernderte
Zelle
Folie 15
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA
Zellsuspension
Folie 16
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA
Zellsuspension
Folie 17
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension
Kvette zwischen Elektroden positionieren
Folie 18
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension
Spannung und Kapazitt einstellen
Folie 19
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension
Puls auslsen
Folie 20
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellen Puls
auslsen
Folie 21
Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellen
Aufnahme der DNA
Folie 22
CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:
Folie 23
CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:
Folie 24
CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:
Folie 25
CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:
Folie 26
Transfektionsoptimierung am Beispiel der CaPO 4 -Transfektion
Nadja Zfle pdiatrische Hmatologie und Onkologie, CVK
Optimierung 1.Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf
2.Welche Parameter sind wichtig? Zelldichte DNA-Menge CaPO 4 -Menge
pH-Wert des Puffers Inkubationszeit andere (Temperatur der
Reagenzien, Handhabung, Mengenverhltnisse, )
Optimierung 3. Ansatztabelle Nr.Zell- dichte DNACaPO4pH Puffer
Inkuba- tionszeit Transfektions- effizienz 13 * 10 6 20 g250 l7,135
MinIm FACS auswerten 23 * 10 6 30 g250 l7,135 Min 33 * 10 6 40 g250
l7,135 Min 4. Plasmid-DNA Zur Optimierung ein Plasmid mit
Reportergen z.B. GFP gute Auswertbarkeit im FACS
Folie 31
Optimierung Protokoll Tag 0Ausaat 24 h vor der Transfektion
Zellen splitten und mit der gewnschten Zelldichte aussen (z.B. 3*10
6 Zellen auf einer 10 cm Platte)
Folie 32
Optimierung Protokoll Tag 1Transfektion Zutaten pro Ansatz je
ein 10 ml Tube 250 l steriles Wasser DNA (z.B. 40 g fr 3*10 6
Zellen) 500 l HBS 250 l 0,5 M CaCl 2 1 ml Plastikpipette Vortexer
(so nah wie mglich an der Sterilbank oder sogar drunter) Alle
Reagenzien: Raumtemperatur!
Folie 33
Optimierung Protokoll Tag 1 Transfektion 250 l steriles Wasser
250 l CaCl2-Lsung Mischen durch Pipettieren DNA (z.B. 40 g)
Folie 34
Optimierung Protokoll Tag 1 Transfektion 250 l steriles Wasser
250 l CaCl2-Lsung Mischen durch Pipettieren DNA (z.B. 40 g) Krftig
vortexen dabei 500 l 2fach HBS- Lsung dazugeben 1 Tropfen pro
Sekunde!
Folie 35
Optimierung Protokoll Tag 1 Transfektion 250 l steriles Wasser
250 l CaCl2-Lsung Mischen durch Pipettieren Krftig vortexen dabei
500 l 2fach HBS- Lsung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! dann 35
Min. inkubieren bei RT DNA (z.B. 40 g)
Folie 36
Optimierung Protokoll Tag 2 Detoxifikation 24 h nach
Transfektion Mediumwechsel durchfhren warmes Medium!
Folie 37
Optimierung Protokoll Tag 2 Detoxifikation 24 h nach
Transfektion Mediumwechsel durchfhren warmes Medium! Protokoll Tag
3 -Auswertung Auswertung der Zellen im FACS Anteil der lebenden
Zellpopulation, die das GFP produziert? Anteil der berlebenden
Zellen?