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—5分钟快速、高效克隆
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分子克隆的传统方法
Topoisomerase (EASY)克隆原理
EASY 克隆策略
EASY 克隆的几个细节
无缝拼接基因克隆
Some slides are copied from several web sites.
Thanks to all of these unknown contributors!
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分子克隆的传统方法 TRANSGEN
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分子克隆的传统方法
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连接和环化
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• 常规的连接是一个三分子共同反应的过程。
• TA克隆中粘性末端仅有一个碱基,因此较高的DNA浓度和较
高T4连接酶浓度是获得较高连接效率的前提。
• 环化过程恰恰与连接过程相反,过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间 相互作用促进串连体(concatemer)形成。
• 通常情况下, 克隆效率(连接产物转化效率,而不是克隆阳性率)低于0.1% 。
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Topoisomerase (EASY)克隆原理 TRANSGEN
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拓扑异构酶的功能
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http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8f/DNA_replication_en.svg
Vaccina Topoisomerase as Cloning Tool
• Specific DNA cleavage and binding by vaccinia virus DNA topoisomerase I. S Shuman and J Prescott . J. Biol. Chem., Vol. 265, Issue 29,
17826-17836, Oct, 1990
• Site-specific interaction of vaccinia virus topoisomerase I with duplex DNA. Minimal DNA substrate for strand cleavage in vitro. S Shuman .
J. Biol. Chem., Vol. 266, Issue 17, 11372-11379, Jun, 1991
• Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. S Shuman J. Biol. Chem., Vol. 269,
Issue 51, 32678-32684, 12, 1994
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连接反应成为一个双分子作用的过程
EASY 克隆原理
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Mary R. Stahley and James T. Stivers Biochemistry.2010 April 6: 49(13):2786-2795 Reversible DNA cleavage and ligation by topoisomerase IB and DNA strand exchange. The native strand (black) is cleaved during the first transesterification
reaction, and can dissociate from the Topo-DNA covalent complex. Another DNA strand with a 5-OH (red) can associate and attack the DNA-protein
phosphotyrosyl bond, resulting in DNA rearrangements.
TOPO载体反应动态平衡
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vector
P
vector
P
PCR product
传统TA载体和TOPO载体稳定性、自连率的比较
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EASY 克隆
利用 Vaccina Virus Topoisomerase (TOPO) ,与载体结合(牛痘病毒的拓扑异构酶)
酶特点 由314个氨基酸组成
识别5’-C/TCCTT-3’
具有限制性内切酶(nick enzyme)和连接酶的功能
工作所需缓冲液条件宽泛
不需要外界提供能量
>80%的连接反应在2分钟之内即可完成
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EASY 克隆过程: 三个简单步骤
制备PCR产物 1. 1 ml TOPO载体 + 1~4 ml PCR产物
2. 室温孵育5分钟 3. 转化 TRANSGEN
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TOPO载体的3大优点
操作简单:载体+片段
反应快速:酶本身具有的特性
连接高效:连接反应成为双分子作用过程
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EASY 克隆策略 TRANSGEN
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无杂带无引物二聚体
PCR
产物
无杂带有引物二聚体(纯化) PCR Purification Kit
均有或有杂带(胶回收) Gel Extraction Kit
连接 转化
(一)对片段的处理
胶回收 PCR产物回收
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(二)载体的选择 EASY 克隆和T4 DNA Ligase克隆比较 (TOPO载体和普通TA载体比较)
EASY 克隆 T4 DNA 连接酶克隆
PCR产物 无需纯化可直接用于克隆 (若无杂带和引物二聚体)
需要纯化 (PCR缓冲液抑制连接)
反应时间/温度 5分钟/室温 (20oC~37oC) 过夜(12~16小时)/12~16oC
操作 载体 + 片段 载体 + 片段 + 缓冲液
+ T4 连接酶 + 水
克隆阳性率 ++++ ++/+++
克隆数 ++/+++ ++++
连接大片段 +/++,++++(T5) ++/+++
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T粘性末端克隆载体
适合粘性末端PCR产物(Taq扩增)的连接
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适合平末端PCR产物(Pfu扩增)的连接
平末端克隆载体
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零背景克隆载体
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通过自杀基因表达与否筛选阳性重组子。
当载体与片段连接成功,自杀基因无法正确表达,包含重组子的细胞可以正常生长。
当载体与片段连接不成功,自杀基因正确表达,包含载体的细胞无法生长,即“Zero”背景。
简单:只需加入片段即可;
快速:仅需要5分钟反应时间;
高效:阳性率接近于100%;
无需蓝白斑筛选;
适用于长片段克隆 —— 目前已成功的最长片段为10 kb
零背景克隆载体
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EASY 克隆的几个细节 TRANSGEN
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(一)外源片段的准备
引物设计:引物不能磷酸化。
PCR注意事项
延伸设置为72℃ 10~20分钟。
目的:保证扩增片段完整,有效降低扩增背景;
使用Taq系列DNA聚合酶扩增时,该步骤为加A反应;
Taq系列DNA聚合酶扩增(如EasyTaq, TransTaq-T等),使用TA克隆载体;
Pfu系列DNA聚合酶扩增(如EasyPfu, FastPfu等),使用Blunt克隆载体;
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胶回收片段
EB和紫外照射(UV短波长)对dsDNA造成损伤导致克隆效率降低, 阳性率减少, 突变率增加
建议
使用新鲜电泳液
尽量减少紫外照射时间
不用短波紫外线(254 nm), 用长波紫外线(366 nm)
使用EB替代染料[但有些替代品会使迁移率发生变化]
Most translumonators use 302 nm
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Gel stained with EB (for UV Light) or SYBR Green I (for Blue Light)
紫外照射降低克隆数
Treatment Colony Forming(Unit/mg pUC19) Fold Decrease
None (control) 3.4 ± 1.4 x 108
0 sec 302 nm Ultraviolet Light 2.5 ± 1.3 x 108
30 sec 302 nm Ultraviolet Light 7.5 ± 1.5 x 106 33
60 sec 302 nm Ultraviolet Light 5.0 ± 1.6 x 105 500
120 sec 302 nm Ultraviolet Light 6.1 ± 1.4 x 103 41,000
0 min 480 nm Blue Light 3.2 ± 1.3 x 108
2 min 480 nm Blue Light 2.6 ± 1.7 x 108
4 min 480 nm Blue Light 2.6 ± 1.7 x 108
8 min 480 nm Blue Light 2.3 ± 1.4 x 108
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(二)克隆反应设置
摩尔比:EASY 克隆DNA的工作浓度广泛
通常产物在琼脂糖凝胶上可见时,
加入1 μl 即可
反应温度:TOPO酶的工作温度为20℃~37℃,
最适反应温度为25℃
反应时间:5~30分钟
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(三)克隆感受态细胞的选择 名称 适用范围
Trans10
(Top10) 适用于毒基因的克隆 具有硫链霉素抗性
Trans5α
(DH5α) 普遍使用
Trans1-T1
(Mach1-T1) 具有T1、T5噬菌体抗性, 在液体培养基中生长速度快
Trans109
(JM109) 同源重组率低,适合含有重复序列的基因克隆
Trans110
(JM110) 不会对质粒进行甲基化修饰
Trans1-Blue
(XL1-Blue) 适合转化去甲基化的DNA
Trans2-Blue
(XL10-Gold)
适用于大质粒DNA和重组产物的转化 降低片段大小的偏爱性,可用于文库构建
具有四环素、氯霉素抗性
TransStbl3
(Stbl3) 适用于慢病毒及其它逆转录病毒载体的复制
TransDB3.1
(DB3.1) 适用于转化和扩增包含ccdB基因的质粒载体
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(四)其它注意事项
基因特殊结构
原因
具有高AT、高GC、反向重复序列的基因不容易连接
建议
调整、摸索连接体系和条件;
尝试不同的载体(不同的骨架对片段偏好性不同)
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Easy 克隆常见问题及解决方法
• 克隆数少(感受态细胞效率正常范围内) • 菌落多为淡蓝色或Fish Eye(白边蓝芯) • 克隆阳性率低 • PCR鉴定重组子失败
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克隆数少
• PCR产物不新鲜 • DNA浓度低 • 胶回收片段 • 基因特殊结构 • 毒基因 • 载体过期
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(1)PCR产物不新鲜: Why:
3`-A 容易脱落, 导致T/A克隆效率低
Suggestion:
PCR产物立即使用效果最好; 或将PCR产物置于4℃,保存1~2天内使用; 不要冷冻PCR产物
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(2)目的片段浓度很低:
Why:无法保证有效碰撞
Suggestion: 浓缩DNA
(3)克隆胶回收片段
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(4)毒基因: Why:
其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 Suggestion:
选用正确的载体 使用Top10 鉴定不同大小的克隆
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菌落多为淡蓝色或 Fish Eye Why:
插入片段没有影响LacZ基因读码框
a. 插入片段小(小于400 bp)
b. 插入片段的结构特殊
Suggestion:
不要丢弃平板!
进行进一步鉴定
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克隆阳性率低 (or 多数克隆不正确)
阳性率低:有引物二聚体 多数克隆不正确: 有杂带等
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PCR鉴定重组子失败 用GSP引物鉴定时没有条带;用通用引物鉴定时, 扩产物既无目的带又无载体自连带;
Suggestion:
预变性95℃10 min
(彻底裂解菌体、释放DNA)
最好用通用引物鉴定
(可判断症结)
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无缝拼接基因克隆 TRANSGEN
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pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit
• 原理:类似于同源重组
• 使用条件:引物设计时在片段末端引入重叠序列
• 应用:可将任意方法线性化后的载体与片段连接
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引物设计方式
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无缝拼接在线引物设计
软件网址:http://soft.transgen.com.cn/
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输入载体序列
选择是否保留酶切位点
输入插入片段的序列
选择插入片段个数
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输入载体序列
选择是否保留酶切位点
选择插入片段个数
输入插入片段的序列
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几种载体构建方法的比较
方法 T4连接酶介导的克隆 EASY克隆 同源重组
原理 利用限制性内切酶切割载体、片段,产生相匹配的末端,然后用T4连接酶连接起来,或使用T4连接酶进行TA克隆
利用拓扑异构酶的双重活性,实现快速连接
利用重组酶,将任意片段与任意载体连接
特点
载体构建连接具有方向性 克隆数多
可用于克隆,也可载体构建 只能进行TA克隆 需要酶切位点 阳性率较低
步骤繁琐,需要回收片段 耗时费力
简单、快速、高效 可以进行平末端克隆
只能连接特定载体(多用于克隆)
连接无方向性 克隆数较少
无法进行文库构建
简单、高效、灵活 连接具有方向性
一次可连接多个片段 拓展功能强大
引物合成成本高
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• 24种内切酶
• 包括:AvrII、BamHI、BglII、BsgI、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PstI、PvuI、SacI、SacII、ScaI、SalI、SmaI、SpeI、SphI、XbaI、XhoI、XmaI
限制性内切酶介绍
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产品特点
One Buffer:FlyCutTM Buffer
5 minute高效酶切
单酶切:1 μl 酶,3 μg 质粒或PCR产物,5-10 min,50 μl体系
无星号活性
无核酸酶活性
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R.Enzyme Transgen’s Enzymes NEB’s Enzymes Thermo’s Enzymes
Transgen NEB Thermo NEB Transgen Thermo Transgen
AvrII + + + + + + + + + +
BamHI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
BglII + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
EagI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
EcoRI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
EcoRV + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
HindIII + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
KpnI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
NcoI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
NdeI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
NheI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
NotI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
PstI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
PvuI + + + + + + + + + + + + + + + + + +
SacI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
SacII + + + + + + + + + +
SalI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
ScaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
SmaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
SpeI + + + + + + + + + +
SphI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
XbaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
XhoI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
XmaI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
不同Buffer中酶活对比
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Star Activity R.Enzyme Trans NEB Thermo
BamHI N N N
BglII N N N
EagI N N N
EcoRI N N N
EcoRV N N N
HindIII N N N
NcoI N N N
NdeI N N N
NheI N N N
NotI N N Y
PstI N N N
SalI N N N
SmaI N N N
SphI N N N
XbaI N N N
XhoI N N N
XmaI N N N
除了Trans-NotI,其他酶在NEB CutSmart Buffer和Thermo Fast Digest Buffer中皆没有*号活性。 TR
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基因定点突变
• 利用PCR实现点突变的传统方法
• Fast Mutagenesis System
• 多点突变简介 TRANSGEN
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• Fast Mutagenesis System是基于PCR原理实现点突变, 它们与传统方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选
• 筛选原理:降解甲基化质粒模板
• 筛选依据:
来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化;
PCR产物没有甲基化。
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筛选方法
体外切割: DpnI 识别序列5’-GmATC-3’(在 DNA序列中, 一般每256 bp 出现一次). 甲基
化模板可被 DpnI 识别、切割,而扩增产物 (发生突变的产物)不会被切割。
体内降解: 原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌(DH5α-T1,即 DMT)降解,
而扩增产物(发生突变的产物)不会被降解。
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Fast Mutagenesis System
♠ 引物部分重叠, 指数扩增.
♠ 两条引物上均有突变点, 高突变率.
♠ 双重筛选: DpnI 体外降解 + DMT体内降解.
PCR with
mutated primers DpnI Transformation
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TransGen:
Fast Mutagenesis System
• Fast Mutagenesis System:
使用FastPfu Fly酶——
扩增速度比Taq更快(4 kb/min)、保真性比Pfu更高(EasyPfu酶的6x), 扩增10 kb左右的质粒只需2个小时!
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Fast MultiSite Mutagenesis System
• 基于无缝连接原理的多点突变试剂盒。
• 本质仍然是无缝连接,只是在扩增片段时,在接头(即序列重叠区)引入突变位点。
• 将≤6个片段无缝拼接。
• 产品组成: 2×TransStart ® FastPfu PCR SuperMix 2×Assembly Mix DMT Enzyme DMT Compenent Cell ddH2O
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多点突变原理
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多点突变原理
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Summary TOPO载体的优点:简单,快速,高效;
EASY 克隆:片段,克隆反应,感受态细胞;
常见问题分析
无缝拼接基因克隆
内切酶
定点突变
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