TRANSGENESI IN M. musculus

Creazione di animali geneticamente modificati per:

- conferma di gene candidato responsabile patologia umana

- studio della funzione e della regolazione genica

- modelli animali per lo studio delle malattie umane

- modelli animali sperimentali: per la correzione del difetto genetico (“rescue” fenotipico), per messa a punto terapia farmacologica

Un organismo si considera transgenico quando il gene esterno è:

• integrato nel suo genoma;• espresso correttamente e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale;• integrato nella linea germinale e quindi trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.

TRANSGENESI IN M. musculus

KNOCK INIntroduzione di sequenza genica (può appartenere alla stessa specie o può derivare da specie differenti) da esprimere nel topo.

L’inserzione di un gene esogeno può contemporaneamente determinare l’inattivazione del gene endogeno attraverso il suo inserimento.

KNOCK OUTIntroduzione di sequenza genica per l’abolizione della funzione genica endogena

METODI DI TRASFERIMENTO GENICO

3) Metodi:

- Microiniezione nel pronucleo maschile in oocita fecondato- Trasferimento nucleare di cellula con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. -Trasferimento genico in cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti

4) Tipi di inserzione:- ectopica- mirata

1) Trasferimento genico diretto:

-Trasfezione DNA libero con microiniezione

2) Trasferimento tramite vettori (adenovirus, virus adeno associati, retrovirus): infezione virale

TRANSGENESI IN M. musculus

Inserzione ectopica: effetto di posizione

Influenza di elementi di regolazione endogeni (enhancer, silenziatori)

Influenza struttura cromatina (eterocromatina, DNA ipermetilato)

Controllo di espressione del transgene

Uso di promotori costitutivi (es: promotore + enhancer di SV40) per geni sempre attivi e molto espressi

Uso di promotori inducibili specifici per tipo cellulare o stadio di sviluppo

Uso di proteine di fusione rilevabili facilmente

Inserzione mirata

Inserimento nel genoma in una posizione occupata da sequenza omologa

TRANSGENESI IN M. musculus

- Gene da esprimere fuso con cDNA proteina GFP

- Gene da esprimere fuso con peptidi target di anticorpi fluorescenti.

DNA esogeno

DNA genomico

Produzione di organismo Knock-in o Knock-out per ricombinazione omologa

Produzione di organismo Knock-out per ricombinazione

Produzione di organismo Knock-out/in per ricombinazione

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

Accoppiate con maschi vasectomizzati

Oocita fecondato

Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

Si microiniettanomolti oociti

Trasferimento genico tramite trasferimento nucleare

Riprogrammazione delnucleo che ripercorreràl’intero sviluppo

fecondato

Metodi per produzione di topi transgenici

- Microiniezione nel pronucleo: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico (comprese cellule germinali)

- Trasferimento nucleare: se l’inserimento riesce, tutto l’animale che ne deriva è transgenico

- Trasfezione (o elettroporazione) di cellule Embrionali Staminali (ES) e reimpianto in blastocisti, l’animale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali sono transgenizzate)

Mutagenesi di cellule ES

NO è una CHIMERA!!!

Zigote Mutazione genetica due popolazioni cellulari Mosaico

Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari ChimeraZigote 2 (cellule ES)

Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo KO

Si controlla il corretto inserimento attraverso la metodica della selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovirVettore con:gene tk (timidino-chinasi) (tk+ ) dell’Herpes virus (tk HSV),gene della Neomicina resistenza = neoR

Gene endogeno inattivato per inserzione mirata del gene neoR

Tk = pathway di recupero dei nucleotidi: converte la timidina libera in monofosfato per la sintesi DNA

G418: analogo della neomicinaGanciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito

Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir

Gcv Gcv-P Gcv-PPP

Incorporazione DNA

Terminazione catenarottura DNA

Tk HSV Tk mammifero

Selezione positiva-negativa con G418 e ganciclovir

Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

Mutagenesi di ES con inserzione mirata per produzione topo ko

Cellule ES con mutazione impiantate in blastociti di madre surrogata

Produzione di topo ko (in omozigosi) successivo a mutazione mirata

Aguti

Fenotipo ko =Coda arricciata

1) Ricombinazione omologa nelle cellule staminali embrionali (topo marrone)

2) Selezione con G418 e gancyclovir

3) Iniezione delle cellule transgeniche in una blastocisti e impianto in unamadre pseudogravida (topo nero)

4) Progenie chimerica

5) Incrocio di eterozigoti per ottenere topo omozigote

CREAZIONE TOPO KnockOut

ESEMPI DI MODELLI MURINI DI PATOLOGIE UMANE OTTENUTI CON METODI TRANSGENETICI

Malattia Gene Metodo

Fibrosi cistica CFTR Inattivazione da inserzione mirata

Beta talassemia Beta globina Inattivazione da inserzione mirata

Malattia di Gaucher GBA Inattivazione da inserzione mirata

Sindrome dell’X fragile

FMR1 Inattivazione da inserzione mirata

Sindrome da prioni

umana

PRNP Integrazione del gene murino mutante della proteina prionica

Atassia spinocerebellare I

SCA1 (atassina) Integrazione del gene umano espanso

I topi sono sempre un buon modello?

Mutazioni spontanee in topi, patologie spesso diverse dalle umane

Topo NOD: diabetico ma senza obesità. Assomiglia al diabete insulino-dipendente umano

Topo mdx: mutazione nonsenso nel gene mdx, distrofia molto più lievedella DMD

Modelli per malattie con perdita di funzione: identificazione ortologo e creazione topo knock-out. Produzione di: alleli nulli (assenza completa di funzione), mutazioni leaky, (inattivazione geni con funzione simile)Differenza nel fenotipo possibile per presenza di geni modificatori in differenti ceppi murini

Modelli per malattie umane con acquisto di funzione: topo knock-in (es inserimento di oncogeni, geni con triplette espanse)

I topi sono sempre un buon modello?

Differenze nelle vie biochimiche

Differenze nei percorsi di sviluppo

Durata della vita media (esordio tardivo nell’uomo)

Differenze nel contesto genetico