Disiapkan dari sebuah a l g RNA cetakan,dan kemudian aRNA
disintesis dari cDNA oleh ambion.alil amino aRNA kit.gen 3D manusia
oligo chip 25k dihibridasi ke CY 5(PMBC yang dimurnikan) dan CY3
(PMBC yang distimulasi + ekstrak CP 15%:cp+PBMC) atau CY 3 (PBMC
yang distimulasi tanpa ekstrak CP :cp-PBMC)dikotori/dilubangkan dan
disiapkan untuk setiap aRNA dan kemudian di scan pada ScanArray
lite.untuk deteksi pebedaan dan signifikan nya ekspresi gen. data
mentah dinormalisasikan dan dianalisis dengan program software Java
TreeView 1.1.6 dan Clustert 3.0 . 2.9 Kuantifikasi dari mRNA dengan
menggunakan REAL time PCR Total RNA selular dari PBMC (2 106) yang
dikultur sebagai persen atau absen tertinggi dari 0.06 % atau
0,125% ektrak papaya yang diisolasi menggunakan KIT isolasi RNA
dengan kemurnian tinggi berdasarkan rekomendasi pembuat/pengarang.
Kualitas dan kuantitas dari total RNA diperkirakan dengan
spektrifotometer nanodrop (ND-1000, Thermo Fisher Scientific Inc.,
MA, USA).. cDNA disintesis dari 1 gr dari total RNA menggunakan KIT
transcriptor cDNA untaian pertama (Roche Diagnostics).tingkatan
dari ekspresi CCL2, CCL7, CCL8, dan SERPINB2 yang dideteksi dengan
RT-PCR menggunakan LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics)
dengan primer spesifik. Kondisi reaksi nya adalah 95 C/10 min; 35
cycles of 95 C/30 s dan 60 C/20 s. TaqMan probe (Universal
ProbeLibrary, Roche Diagnostics) digunakan untuk deteksi spesifik
produk PCR. Amplifikasi dan deteksi dari penyelidikan TaqManyang
ditampilkan dengan LightCycler ST300 (Roche Diagnostics).gen HPRT
manusia digunakan bersamaan dengan gen hosekeeping untuk
menormalisasikan tingkatan ekpresi antar sempel. 3.1 Penghambatan
proses proliferasi terhadap berbagai jenis bentuk sel tumor dengan
ekstrak pepaya Semenjak ekstrak CP meningkatkan produksi sitokin
anti tumor,seperti IL-12p40, IL-12p70, IFN- and TNF- ,sel kanker
hati (HepG2).sel kamker paru (PC14),sel kanker epitel pancreas
(Panc-1)dan sel kanker mesothelioma (H2452) dalam perlakuan dosis
yang tergantung (Fig.1A)sebagai tambahan , ekstrak papaya dihambat
dengan respons proliferative dari haematopiotik,bentuk sel termasuk
limpoma sel T (jurkat),leukemia sell plasma (ARH77), Burkitt's
lymphoma (Raji),dan limfoma sel besar anaplastik (karpas-299) (Fig
1.B).kami juga menemukan bahwa proliferasi dari bentuk/jenis sel
yang diuji,dihambatnya dengan cara yang sama dengan pengamatan
perbadaaan signifikan statistic antara solid dan hematopoetik sell
tumor. Untuk mendeterminasi penghambatan lain dari repons
proliferasi yang diasosiasikan dengan penurunan viabilitas sel,kami
mengevaluasi induksi potensial dari apoptosis dan kematian sel
dalam sel limfoma T jurkat, yang ditunjukan dalam Fig. 1C, level
dari annexin V- atau 7AAD- sel Jurkat positif yang diturunkan
dengan perlakuan dosis tergantung,persentase dari annexin
V-negative sel ditunjuksn dalam line chart (lower panel).untuk
mengkuonfirmasi hasil diatas,kita mengukur aktivitas dari caspase-3
and -7,yang mana efektor caspase yang menginduksi apoptosis sel.
Fig 1D menunjukan bahwa aktivitas dari caspase 3/7 pada sel
jurkatyang diinduksi selama 24 jam perlakuan ekstrak papaya. Data
ini disimpulkan bahwa 1 dari mekanisme rumit dalam penghambatan
proliferasi sel tumor adalah berasosiasi dengan induksi kematian
sel,temasuk apoptosis.
pepaya juga sacara umum doiketahui sebagai pawpaw.dimana ada
beberapa laporan yang diterbitkan bahwa efek dari pawpaw yaitu
sebvagai terapi
kanker,pawpaw asimina triloba dari family annonaceae amerika
utara adalh spesies yang berbeda. sebagian ekstrak dari beberapa
tanaman seperti Astragalus
membranaceus (Fabaceae), Anemarrhena asphodeloides (Liliaceae)
dan Stellaria barbata (Lamiaceae)telah didemonstrasikan untuk
melihatkan tumor yang spesifik,prnghambat pertumbuhan yang
meningkatkan against solid dan haematopoietic cell lines.tidak ada
deskripsi yang menjelaskan efek penghambatan pertumbuhasn tumor
dari ekstrak anggota lain dari genus Cariaceae. 3.2 produksi
sitokin dari induksi PBMC oleh ekstrak pepaya Untuk mengevaluasi
aktivitasi potensial immunodulatory dari ekstrak papaya pada PBMC
manusia, kami juga selanjutnya memperkirakan profile dari produksi
sitokin PBMC oleh ELISA.seperti yang ditunjukan dalam produksi
Fig.2A , IL-2 dan IL-4 dalam supernatant yang dikultur yang
direduksi selama 24jam dari kultur dmenggunakan ekstrak
pepaya.semenjak ada hasil positif dari pengamatan bahwa ekstrak
pepaya dapat menginduksi kematian sel PBMC,yang sama efek nya pada
sel tumor.kami menganalisis viabilitas sel PBMC dengan flow
cytometry. Meskipun produksi IL-2 dan IL-4 diturunkan dalam
poerlakuan dosis yang tergantung, persentase dari sel annexin
V-negative tersisa tidak berubah dibawah kondisi pengujian yang
sama (Fig.2B a).tambahan,kami mengkonfirmasi bahwa incorporasi
3[H]-thymidine dari PBMC yang diaktifkan adalah tidak berpengaruh
selama kultur 72 jam (Fig.2B b). kami selanjutnya menguji tipe
sitokin Th1 lain yang relevan dengan imunitas anti tumor seperti
IL-12p40, IL12p70, IFN- , or TNF- yang tidak secara signifikan
dipengaruhi oleh penambahan ekstrak pepaya. Dari catatan .ekstrak
pepaya juga tidak memberikan efek pada viabilitas dari PBMC yang
tidak terstimulasi (CP control, 96.7% vs. CP 0.2%, 96.5%).Shan et
al mendemonstrasikan sebelkumnya bahwa ekstrak Cinnamomum cassia
(Lauraceae) meningkatkan repons proliverasi dari PBMC dan produksi
dari igG3(Shan et al., 1999a)..meraka juga melaporkan bahwa ekstrak
dari tipe tanaman lain termasuk Astragalus membranaceus, Codonopsis
pilosula (Campanulaceae), Epimedium brevicornum (Berberidaceae),
Oldenlandia diffusa (Rubiaceae), Rhizoma typhonii (Araceae) and
Schisandra chinensis (Schisandraceae), tidak memiliki efek pada
proliferasi sel. Selebihnya meraka mendemonstrasikan efek
Acanthopanax gracilistylus (Araliaceae) menghambat komplek
3[H]-thymidine dari PBMC yang diaktifkan conA slema kultur 72 jam.
Walaupun demikian TNF ditingkatkan oleh stimulasi monosit dengan
LPS selama 24jam (Shan et al., 1999b).dalam penelitian kami,eksttak
pepaya direduksi kebanyakan dari IL-2 dan IL-4 dimana produksi dari
anti tumor dihubungkan dengan sitokin seperti IL-12p40, IL-12p70,
IFN- and TNF- yang ditingkatkan tanpa penghambtan pertumbuhan .
hasil kami menunjukan bahwa ekstrak pepaya ditampilkan tidak toksik
untuk sel normal sebagai pembanding efeknya pada sel tumor.
Diketahui bahwa p40,sebuah subunit dari IL-12p70 diproduksi oleh
antigen presenting cell (APCS) seperti monosit atau sel
dendrite.hal ini juga menunjukan bahwa produksi , IL12p70 dari sel
dendrite adalah tergantung pada interaksi CD40-40L,sedangkan
produksi p40 tidak. (Cella et al., 1996)..berdasarkan laporan
senbelumnya,hal ini dianggap bahwa ekstrak pepaya dapat
dimodifikasi tidak hanya aktifasi dari APC.tetapi juga interaksi
dari T-ACP atau sel T-B dengan nama CP extract modifies both innate
and acquired immunity.
