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TranslationsstrategienHans-Georg Kräusslich, Abteilung Virologie
http://virology.hyg.uni-heidelberg.de
15.5.2007
Mechanismen eukaryontischer TranslationCap-abhängige InitiationIRES-Elemente und cap-unabhängige InitiationVirale Strategien zur Modulation der TranslationTranslationsinhibition als zellulärer Abwehrmechanismus,virale Verteidigungsmechanismen
Aufbau eukaryontischer mRNA
ORF AAAAAAUG stopcap5‘UTR 3‘UTR
5‘cap: Bindung von InitiationsfaktorenKurze 5‘UTR (50-100 nt)Monocistronisch: ein ORF3‘UTR, PolyA
Prokaryontische mRNA: polycistronisch
SDSDSD
Virale Translationsstrategien
Viren nutzen den kompletten Translationsapparat der Wirtszelle
ABER
Kodierungskapazität muss möglichst effizient genutzt werden
Funktionell polycistronische mRNA
Virale Translation soll bevorzugt werden
Host cell shutoff
Translation
InitiationCap abhängiggeschwindigkeitsbestimmend
Elongation
Termination
Gesteuert von Translationsfaktoren
Aufbau des Translations-InitiationsKomplexes
Initiator-tRNA
43S Präinitiations-Komplex
Initiations-Komplex
Ribosom 40S UE
© Flint et al. Principles of Virology
Ternärer Komplex
Cap-Bindung
Translations-Initiation
Komplex gleitet entlang derRNA auf der Suche nach einemStartcodon (‚Scanning‘)
GTP Hydrolyse löst Dissoziation des Komplexes aus
Helikase
© Flint et al. Principles of Virology
Üblicherweise wird1. AUG genutzt
Translationshemmend wirken...
Fehlen der cap-Struktur
Ausgeprägte RNA-Sekundärstruktur (bes. 5‘-Ende)
Lange 5‘ UTR
Schlechter Kontext des AUG (Kozak-Regel)Optimal: GCCACCAUGGnur 5% der euk. mRNA haben optimalen Kontext(Regulation)
Translations-Initiation bei Poliovirus
+Strang RNA, kein cap, 5‘ Ende verknüpft mit VPgLange 5‘ UTRAusgeprägte Sekundärstruktur am 5‘ Ende7 nicht genutzte AUG in der 5‘ UTR
Translationsinitiation am 5‘ Ende und scanning bis zum Initiator-AUG ist unwahrscheinlich
Effiziente Translation von Poliovirus RNA bei vollständiger Abschaltung der Translation zellulärer mRNAs
Mechanismus?
VPg741 nt
AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG
Hypothese: 5‘ unabhängiges Binden ribosomaler Untereinheiten
an interne RNA-Strukturen
AAAAAAORF A ORF Bcap
5‘UTR von Protein B> nur Protein A wird translatiert
5‘UTR von Poliovirus> Proteine A und B werden translatiert
Testsystem zum Nachweis (Bicistronische mRNA):
AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG
40S-Komplex
Internal Ribosomal Entry Site (IRES)
Inhibierung der Proteinsynthese in Poliovirus-infizierten Zellen
Mechanismus: Zerstörung von eIF-4GCap-unabhängige Initiation bei Poliovirus © Flint et al. Principles of Virology
In Poliovirus-infizierten Zellen wird die zelluläre, Cap-abhängige Translation vollständig abgeschaltetPoliovirus RNA wird weiterhin effizient translatiert
IRES-abhängige TranslationIRES-tragende RNA nutzen ebenfalls Translationsinitiations-faktoren:
Typ 1/2 IRES: eIF2, eIF1/3, eIF4A, eIF4B(Picorna) Kein eIF4E (kein Cap!)
eIF4G oder Spaltprodukt
Typ 3 IRES: eIF2, eIF3(HCV) Kein eIF4A/4B/4E/4G
Darüber hinaus gibt es spezifische IRES-Bindungsfaktoren,die vermutlich modulierend wirken (RNA-Chaperone):
La: Regulator von Pol IIIPTB: Poly-Y-Trakt BindungsproteinPCBP: Poly-C Bindungsprotein
Ein Primärtranskript mehrere TranslationsprodukteGenetische Ökonomie
AAAA
Polyprotein
Initiation an verschiedenen Startcodons:•Reinitiation
•leaky scanning•Internal ribosomal entry
•Ribosomal shunting
Prozessierung
Überlesen vonStopcodonsLeseraster-
Wechsel•splicing
•RibosomalFrameshifting•RNA editing
Genomorganisation von Poliovirus und Prozessierung des Polyproteins zu den viralen Proteinen
© Flint et al. Principles of Virology
Synthese aller Proteine als Polyprotein, Prozessierung durch 2 virale Proteasen2A: Trennung Struktur- und Nicht-Strukturproteine3C: Alle weiteren Prozessierungen
Genomorganisation und Polyprotein-Prozessierung von Flaviviren
© Flint et al. Principles of Virology
Synthese aller Proteine als Polyprotein, Prozessierung durch zelluläre und virale Proteasen:Prozessierung der Strukturproteine: Signal-PeptidaseProzessierung der Nicht-Strukturproteine: NS3
Re-Initiation
© Flint et al. Principles of Virology
Influenza B Virus:
z.B. CauliflowerMosaic Virus:
100%25%
21 AUG Codons
Ein ‚Reinitiationsfaktor‘ (TAV) von CaMV interagiert mit der Translationsmaschinerie der Zelle
Park et al., Cell 2001
Überlesen von Startcodons (leaky scanning)
AUG AUGcap UAC
MetScanning Translationsstart am 1.AUG
aug AUGcap UAC
Met
Translationsstart
Ungünstiger Sequenzkontext (‚Kozak-Regeln‘)-> AUG wird ‚überlesen‘
Leaky scanning
‚Überspringen‘ von Startcodons (ribosome shunting)
AUG AUGcap UAC
MetScanning Translationsstart am 1.AUG
AUG AUGcap UAC
Met
Translationsstart
Transport des Initiations-komplexes vom cap zum AUG nicht linear entlang der RNA
Ribosomales frameshifting
Pausieren des Ribosoms (bewirkt durch benachbarte Pseudoknoten-oder stem-loop-Strukturen) an einer ‚slippery sequence‘ oberhalb des stop-codons
das Ribosom ‚rutscht‘ bei der Translation in das –1 oder +1 Leseraster
Effizienz abhängig vom Sequenzkontext der ‚slippery site‘Variiert zwischen 2% und 20% Regulationsmöglichkeit
ORFORF (-1)
CUCAGCAGGGUUUGGAGU
pseudoknot
2% frameshifting
12% frameshiftingUUUUUUMutieren
Hefevirus L-A:
Sekundärstrukturen stromabwärts von frameshift Stellen
Struktur des Pseudoknoten amgag-pro Übergang von MMTV
Ribosomales frameshifting – Rous Sarkom Virus
‚slippery sequence‘
gag
pol
gag ORF
pol ORF AAA UUU AUA
ACA AAU UUA UAG
. AC G . .
© Flint et al. Principles of Virology
RNA editing
Veränderung der mRNA Sequenz durch:Einfügen zusätzlicher Nukleotide (während der Transkription)Veränderung einzelner Basen in situ (posttranskriptionell)
mRNA Sequenz korreliert nicht mit der kodierenden Sequenz im Genom
Führt zu:LeserasterwechselC-terminale Extension (stop > Aminosäure)Änderung der Aminosäuresequenz
Modell des co-transkriptionellen RNA editing: Paramyxoviren
Masern-virus
Mumps-virus RNA-Pol pausiert an einem Übergang
Cn-Un im template
Der Pol-mRNA-Komplex verrutscht um 1-2 Basen entlang des templates(‚Stottern‘; vgl. PolyA-Synthese)
Dadurch werden zusätzliche Basen indas Transkript eingefügt
Die Stabilität der entstehenden RNA-Duplexe bestimmt, um wieviele BasenDie RNA-Pol verrutscht:Masernvirus: -1 BaseMumsvirus: -2 Basen
© Flint et al. Molecular Virology
Posttranskriptionelles RNA editing: Hepatitis delta satellite virus
Replikations-Intermediat
dsRNA AdenosinDeaminase
Editing(50%)
I: Basenpaarung mit C(U > C)
Transkription
Kleines delta Antigen:Genomreplikation
Grosses delta Antigen:Inhibiert Genomreplikation
Assoziation der RNA mit HDV env
+19 AS
© Flint et al. Molecular Virology
Unterdrückung der Termination
RNA pseudoknot
stop
Mo-MLVSindbis Virus
Amber -> GlnSuppression in 4-10% der Transkripte
Reguliert die relativen Mengen Gag (Strukturproteine): Pol (Enzyme)
(ca. 10%)
Opal stop
RNA PolHelikasePotease
capping
P123 + P4: -Strang SynthetaseP1+ P2 + P3 + P4: +Strang SynthetaseRelative Menge von Protease (P2) zu Polymerase (P4) reguliert die RNA Synthese
© Flint et al. Principles of Virology
Virale Translationsstrategien (mehrere Proteine von einer mRNA)
Polyproteinsynthese
Picornaviruses Flaviviruses Alphaviruses Retroviruses
Leaky scanning
Sendai virus P/C mRNA Influenza B RNA 6
Reinitiation
Influenza B RNA 7 CMV gp48 mRNA
Suppression derTermination
Alphavirus nsP4 Retrovirus Gag-Pol
Ribosomales frameshifting
Coronavirus orf1a-1b Retrovirus Gag-Pol
Internal ribosomal entry Picornavirus Flavivirus
AUG AUG
stop stop
IRES
Maximale Nutzung einer RNA Sequenz zur Translationverschiedener Proteine: Sendai-Virus P/C/V Gen
Leaky scanning: Proteine C‘, P, CZunehmende Effizienz der Startcodons von 5‘ nach 3‘(ACG; AUG, Kontext; AUG Kontext
Ribosome shunting: Proteine Y1, Y2Expression dieser Proteine variiert in verschiedenen ZellinienRegulation des ‚ribosome shunting‘ durch zelluläre Faktoren???
RNA editing: Protein V, WEinfügen eines nicht im template enthaltenen Guanosins
Leserasterwechsel V-Protein
Maximale Nutzung einer RNA Sequenz zur Translationverschiedener Proteine: Sendai-Virus P/C/V Gen
© Flint et al. Principles of Virology
Regulation der Translation
Host-cell shutoff
Interferon-induzierte zelluläre Abwehrstrategie
virale Verteidigungsmechanismen
Inhibierung der Proteinsynthese in Poliovirus-infizierten Zellen
Mechanismus: Zerstörung der eIF-4G Untereinheitcap-unabhängige Initiation bei Poliovirus
© Flint et al. Principles of Virology
Inaktivierung des zellulären eIF4F-Komplexes durch virale Faktoren
© Flint et al. Principles of Virology
Modelle für Initiationskomplexe an capoder IRES Elementen
Keine eIF4E-Bindung
© Flint et al. Principles of Virology
Hemmung der Wirts-Proteinsynthese durch Stören der eIF4G-PABP Interaktion
Aneinanderlagerung beider Enden der mRNAInteraktion von eIF4G und PABP stimuliert die Translation
Rotavirus:Virales NSP3 bindet an eIF4G und blockiert Interaktion eIF4G:PABP
Inhibition der Translation zellulärer mRNARotavirus mRNA: cap, aber kein polyANSP3 bindet an das 3´Ende der viralen mRNAund ersetzt PABP in der Stimulierung der Translation viraler mRNA
Inhibierung der Translationsinitiation alszellulärer Abwehrmechanismus
Protein kinase, RNA activated (Pkr)
Phosphorylierung vonPkr-Substratenu.a. eIF2α> Block der Initiation
Virale dsRNAaktiviert Pkr
Interferoninduziert dieSythese von Pkr(und RNaseL)
© Flint et al. Principles of Virology
Wirkung der eIF2a Phosphorylierung auf das katalytische Recycling in der Initiation
AktiviertePkr
peIF2α bindet irreversibel an eIF2BMenge an freiem eIF2B nimmt abKein eIF2*GTP recyclingTranslationsinititation wird inhibiert
Recycling von eIF2*GTP
eIF2*GTP bringt tRNAizum Initiationskomplex
© Flint et al. Principles of Virology
PKR
Virale Strategien zur Inhibierung der eIF2α-Phosphorylierung
PKR
+
PKR P
P
PP
eIF2αP
eIF2αdsRNA
PKR-bindendeProteineHHV8: vIRF-2Vaccinia K3LEBV SMHCV NS5a
eIF2α-Dephospho-rylierungHSV-1 γ34.5
Bindung an dsRNAHSV-1 Us11Vaccinia E3LReovirus σ3
PKR-bindende RNAAdeno VA RNAIEBV EBER RNAHIV TAR?
Aktivierung des zellulären PKR-Inhibitors I-P58IPK
Influenza
Verhindern der eIF2αPhosphorylierungHCMV