Transportul activ Cand transportul unei substane este dependent
de transportul altei substane, afirmam ca transportul este cuplat.
Exista dou categorii de transport cuplat: antiport (contratransport
sau difuzia de schimb, substanele sunt transportate n sens opus) i
simport (cotransport, ambele specii chimice sunt transportate n
acelasi sens) Teoretic, transportul cuplat poate fi pasiv ca n
cazul unor ionofori care realizeaz de exemplul contratransportul
K+/H+ (nigericina). n realitate, n membranele naturale vii,
diferenta (gradientul) electrochimic este mentinut prin procese
consumatoare de energie iar simportul sau antiportul unor compui n
sensul gradientului electrochimic este posibil numai n condiiile n
care celula mentine activ acest gradient. n acest caz putem spune
ca transportul este cuplat secundar cu energia (transport activ
secundar). Pe de alta parte, o serie de transportori proteici
realizeaz procese de transport cuplate direct cu consumul de
energie (in speta cu hidroliza legaturilor macroergice ale ATP). n
acest caz transportorii sunt cuplati primar cu energia
(transportori activ primar sau pompe primare)Transportul activ
primar In transportul activ primar sunt implicate proteine care
cupleaza translocarea unei substane (ioni sau molecule), impotriva
gradientului chimic, cu o sursa de energie. Aceste surse de energie
pot fi : 1. Hidroliza ATP, iar n acest caz transportorii proteici
se numesc "pompe (ionice) activate de ATP". Astfel de pompe cuplate
cu activitatea ATP hidrolazica (ATPazica) sunt exemplificate cel
mai bine de Na+-K+-ATPaza, care funcioneaz ca transportor activ al
ionilor de Na+ dintr-un compartiment intracelular
(cu concentraie mica de Na+) spre compartimentul extracelular
(cu concentraie ridicata de Na+) la schimb cu ionii de K+ care sunt
translocati dinspre o concentraie redusa din fluidul extracelular
spre o concentraie de K+ ridicata din compartimentul intracelular
(citosolic). Aceasta pompa este una dintre sursele majore de
mentinere a potentialului electrochimic transmembranar. 2. Razele
luminoase. Proteinele a caror funcie transportoare este energizata
sub aciunea luminii se numesc pompe (ionice) activate de lumina.
Pompele activate de lumina se intalnesc n membranele unor bacterii
(de exemplu proteinele numite halorodopsina i bacteriorodopsina).
Pompele ATPazice Transportorii primari de tipul ATPazelor
indeplinesc roluri vitale pentru celula i sunt raspanditi n toate
organismele vii (procariote i eucariote: celule vegetale i animale
deopotriva). Pompele activate de ATP pot fi impartite n patru clase
n funcie de caracteristicile lor structural-functionale: P-ATPaze,
V-ATPaze, F-ATPaze i proteine de tip ABC. A. P-ATPazele sunt o
clasa de transportori inruditi genetic i structural. Ele includ
antiportorul Na+-K+-ATPaza (al carui rol a fost explicat mai sus),
antiportorul K+-H+-ATPaza (implicat n generarea aciditatii din
stomac prin transportul de protoni spre exteriorul celulei, n
cavitatea stomacala, la schimb cu ionii de K+ care patrund n
celula) i Ca2+-ATPaza (prezenta n membrana celular i membrana
reticului endoplasmic, transporta ionii de Ca2+ din citosol spre
exteriorul celulei sau spre interiorul RE, mentinand concentraia
Ca2+ din citosol la un nivel redus, astfel ca acesti ioni pot
actiona ca semnale celulare).
P-ATPazele sunt astfel denumite (P) deoarece translocarea
ionilor de o parte pe alta a membranei implica o modificare
temporara, covalenta, a proteinei, cu transferul fosfatului de pe
ATP la gruparea carboxilica a acidului glutamatic (Glu) sau
aspartic (Asp) din situsul activ. Se formeaza o legtur cu energie
inalta. ntr-o etap ulterioara, fosfatul anorganic (Pi) este
eliberat, la fel i ionul, proteina revenind la starea initiala.
Pentru ca aceste proteine adopta dou stari conformaionale diferite
(denumite E1 i E2), ele au mai fost numite i E1.E2.ATPaze. Mai jos
va fi detaliaa structura i functionarea antiportorului
Na+-K+-ATPaza: Na+-K+-ATPaza Este un complex proteic membranar larg
raspandit n celulele eucariote. Se estimeaza ca circa 25% din
totalul ATP citosolic din celulele umane n repaus este consumat de
pompele de sodiu n vreme ce n celulele nervoase acest procent
atinge 70% din ATP total. Na+-K+-ATPaza este un tetramer compus din
patru subuniti, dou subuniti alfa (~113 kD) care sunt responsabile
pentru transportul propriu-zis al ionilor i de legarea ATP,
continand situsul de fosforilare, i dou subuniti mai mici, beta
(~35 kDa). Subunitile beta sunt glicoproteine necesare activitii
complexului, facilitand localizarea membranara i activarea
subunitilor alfa (Fig. 3.10). Transportul cationilor decurge prin
intermediul unui ciclu de modificri conformaionale (Fig. 3.10 b)
datorate fosforilarii de la nivelul situsului activ din subunitatea
alfa: Pompa cu ATP legat (starea conformaionala E1), capteaza 3
ioni de Na+ de pe fata citosolic. ATP este hidrolizat, fosfatul
este transferat unei grupri carboxil din situsul de fosforilare
aflat pe fata citosolic a pompei, cu eliberare de ADP. Prntr-o
modificare conformaionala (starea E2) a carui mecanism este inca
incert, pompa expune ionii de Na+ pe fata extracelular, unde ei
sunt eliberati. Pompa leag 2 ioni de K+ din mediul extracelular,
iar subunitatea alfa este defosforilata. ATP se leag din nou iar
pompa se reorienteaza eliberand ionii de K+ n citosol. Cu ATP legat
de subunitatea alfa, pompa (E1~ATP) este pregatita s lege ionii de
Na+ iar ciclul se repeat
B. V-ATPazele au fost initial identificate la eucariote i mai
exact, n membrana vacuolelor (V) din celulele vegetale. Ulterior
V-ATPazele au fost descrise i la bacterii. Ele funcioneaz ca pompe
primare ce transporta protoni (in majoritatea cazurilor) sau ioni
de Na+. Ele contribuie la realizarea gradientilor transmembranari
de protoni. C. F-ATPazele se deosebesc de celelalte pompe ATPazice
prin faptul ca sunt capabile nu numai de hidroliza ATP ci i de
sinteza ATP, reprezentand enzime care contribuie la procesul de
fosforilare (F) oxidativ (sinteza ATP cuplata cu respiratia).
F-ATPazele sunt prezente la eucariote, exclusiv n membrana
mitocondriala i cloroplastidiala interna, n membranele bacteriilor
i arhebacteriilor (unde poarta numele de A-ATPaze). Desi funcia
principala este de a genera ATP pe seama gradientului
telectrochimic transmembranar susinut n urma respiraiei, la unele
bacteriui funcia s este predominat hidrolazica, generand potential
electrochimic pe baza consumului de ATP. n laborator (in vitro)
F-ATPazele pot functiona n ambele directii depinzand de condiiile
experimentale. Majoritatea F-ATPazelor sunt pompe de protoni dar
exista i F-ATPaze dependente de Na + descoperite exclusiv la unele
bacterii patogene, anaerobe. Mai jos vom exemplifica F-ATPazele cu
complexul F1F0-ATP sintetazic prezent n membrana mitocondriala
intern la celulele eucariote Desi prezint o anumita diversitate de
izoforme, F-ATPazele cuprind complexe multimerice compuse din dou
parti: Complexul F1- hidrofil, orientat spre citosol i constituit
din 3 subuniti alfa i 3 beta (33), cate o subunitate gama (), delta
() i epsilon (); Complexul F0 (zero) hidrofob, puternic atasat
membranei lipidice, cu 1 subunitate a, una b i un numr variabil
(10-13) de subuniti c.
Fiecare dintre aceste subuniti au un rol bine definit n
complexul F-ATPazic astfel : subunitile i contin situsurile
catalitice de legare a ATP/ADP i Pi ; subunitile , i constituie
suportul subunitilor catalitice, cu rol de legare a complexului
hidrosolubil F1 de complexul membranar F0; subunitile a i b ale
complexului F0 constituie un canal pentru scurgerea ionilor de H+
(sau Na+) ; subunitile c ancoreaza intreg complexul ATPazic n
membrana i constituie motorul" acestuia, avand capacitatea de a se
roti n curul unui ax central imaginar. Elucidarea functionarii
complexului F1F0-ATP sintetazic (sau ATPazic) a reprezentat una
dintre cele mai mari provocari i surprize din istoria biologiei
celulare. S-a constatat ca el reprezint o masinarie rotativa,
asemenea unei mori de apa. Curgerea de protoni n sensul
gradientului de pH (analoaga curgerii apei) determina rotirea
subunitilor c care, la rndul lor conduc la rotirea subunitilor
catalitice din complexul F1, miscare intermediaa de subunitile de
sprijin, , i . Rotirea subunitilor catalitice i provoaca modificri
conformaionale la nivelul acestora i adoptarea a trei stari: T, L i
O. n starea T, subunitatea beta leag slab ADP i Pi, n starea L,
legarea devine mai puternica iar n final, n starea O este
sintetizat ATP care este ulterior eliberat Exista un raport intre
numrul de protoni ce traverseaz complexul i numrul de molecule de
ATP formate. n principiu, cu cat este mai mare gradientul de pH
(pH), cu atat sinteza de ATP decurge mai eficient. Pe de alta
parte, n absenta unui gradient de pH (parte a potentialului
electrochimic transmembranar) F-ATPaza va functiona n sensul
hidrolizei ATP cu exportul protonilor din citosol i generarea
diferentei de pH (acid la exterior).
D. Proteinele transportoare de tip ABC ("ATP-binding Cassette)
au fost relativ recent descoperite i reprezint o clasa de proteine
localizate atat n membrana plasmatic cat i n membranele organitelor
celulare. Ele mediaza translocarea unor substrate variate: ioni,
molecule organice (lipide, acizi biliari, conjugati glutationici i
glucuronici, peptide mici), compui de sinteza (medicamente,
droguri). Majoritatea proteinelor ABC utilizeaz energia furnizata
de hidroliza ATP (transport activ) ns unele pot forma canale
membranare specifice (de exemplu proteina CFTR, reglatorul de
conductanta transmembranara al fibrozei cistice care este un canal
de clor). Aceste proteine sunt prezente la toate organismele vii,
de la bacterii la om (din cele peste 1000 de proteine ABC
identificate, 48 sunt tipic umane). Mutatii ale genelor ce codific
aceste proteine ABC au fost asociate cu numeroase maladii genetice
(ex. fibroza cistica). Avand posibilitatea de a lega i transporta
medicamente din i inspre interiorul celulei, proteinele ABC sunt
raspunzatoare pentru esecul majoritatii tratamentelor medicale
asupra bolnavilor de cancer care manifesta rezistenta la o serie de
substane citotoxice (utilizate n chimioterapie), n rezistenta unor
forme de malarie, n dificultatea tratarii SIDA. Aceste proteine ABC
capabile de transportul medicamentelor i apariia rezistentei la
tratamentele medicamentoase se numesc proteine MDR (Multi-drug
resistance). Un alt rol atribuit transportorilor de tip ABC este de
facilitare a miscarii flip-flop (difuzie transversala) a lipidelor
membranare i de aceea aceste grup de proteine ABC se mai numesc
flipaze dependente de ATP. n general, aceste translocaze de lipide
transporta lipide din stratul intern, pe fata extern a bistratului
membranei cuplat cu transportul altor compui (acizi biliari,
medicamente).
Structura tipica a unei proteine de tip ABC const din cel puin 2
domenii transmembranare (TMD, Transmembrane domains) i minimum 2
domenii de legare a ATP (ABC). Regiunile TMD ancoreaza proteina n
membrana formand un por prin care trec o varietate remarcabila de
substane Domeniul de legare al ATP este orientat spre fata
citoplasmica i la nivelul ei se elibereaza energia ATP (Fig. 3.12).
Nu se cunoaste modalitatea prin care energia este convertita de
situsul ABC pentru a fi utilizat n transport i nici mecanismul
exact al transportului Fig. 3.12 Structura transportorilor de tip
ABC n sectiune transversala (A) i dispunerea peptidelor n spatiu
(B)
Transportul activ secundar Transportorii activi secundari
cupleaza miscarea unei substane impotriva gradientului de
concentraie la schimb cu transportul altui ion n sensul
gradientului sau de concentraie. Transportul activ secundar este
intotdeauna un proces de co-transport: fie de tip simport (ex.
simportorii de Na+/glucoza i Na+/aminoacizi) sau antiport (ex.
antiportorul Na+/H+). Activitatea acestor transportori nu este,
asadar, direct energizata de ATP ci indirect, prin functionarea
unor pompe primare de ATP care genereaza gradienti electrochimici.
Acesti gradienti constituie apoi motorul pentru transportorii
secundari. Cinetica transportului activ secundar este similara cu
cea a difuziei facilitate. La concentraii foarte mari de substrat,
transportul este franat de lipsa unui numr suficient de proteine
capabile s lege substratul existent. Dou exemple importante merita
s fie amintite aici: Simportorul Na+/glucoza Transportorii
secundari ai hexozelor sunt proteine transmembranare localizate n
principal n celulele intestinale i renale. O semnificatie deosebita
o au transportorii hexozelor (glucoza, galactoza) de la polul
apical al celulelor din invelisul inestinal intern. Simportorul
Na+/glucoza (prescurtat, SGLUT) faciliteaza preluarea specifica a
unei molecule de glucoza (si galactozei) din lumenul (cavitatea)
intestinal(a) unde monozaharidele apar ca urmare a procesarii
digestive a hranei. Glucoza este transportata din exteriorul
celulei spre interior, unde concentraia acesteia este mult mai mare
(impotriva gradientului de concentraie) la schimb cu 2 ioni de
sodiu. Acest transport este posibil numai cu consum de energie iar
forta motrice a functionarii simportului este gradientul chimic de
Na+ stabilit n urma functionarii pompelor primare dependente de ATP
(Fig. 3.13). Glucoza este ulterior descarcata n sange de unde
ajunge la toate celulele organismului, asigurand nutritia
lor.Antiportorul Na+/H+O parte din echilibrul ionic al celulelor
este mentinut i cu ajutorul unei clase de proteine care transporta
ionii de sodiu la schimb cu protoni. Acestia sunt antiportorii
Na+/H+ (sau prescurtat Nha) care sunt prezenti n membrana plasmatic
a celulelor bacteriene, la celulele vegetale i animale. Forta
motrice pentru functionarea acestor antiportori il reprezint
gradientul de pH generat n urma activitii lantului respirator sau n
urma functionarii unor pompe primare de H+. Astfel, 2 protoni sunt
introdusi n citosol (in sensul gradientului de concentraie) la
schimb cu 3 ioni de sodiu care sunt expulzati impotriva
gradientului de concentraie. Acest antiport are o semnificatie
deosebita n cursul adaptarii la condiii saline, cnd concentraia de
saruri (NaCl sau NaHCO3/Na2CO3) din mediul extern este foarte mare.
Celula bacteriana i vegetala au tendinta de a mentine concentraia
intern de ioni de sodiu n limite normale tocmai prin activitatea
intensa a acestor antiportori. In celulele animale, antiportorii de
Na+/H+ sunt distribuiti predominant la nivelul polului apical al
celulelor renale implicate n formarea urinei. Aceste celule au
capacitatea de a recupera Na+ din urina (la nivelul membranei
apicale) printr-un mecanism activ secundar de simport Na+/H+.
Preluarea sodiului este posibila datorita aciditatii mediului
intern celular care constituie motorul de deplasare a ionilor de
sodiu spre interior (impotriva gradientului de concentraie) Ionii
de sodiu sunt mai departe transportati spre sange pentru a se
asigura tonicitatea acestuia prin polul bazal printr-un antiportor
secundar Na+/HCO3-. Mecanismele de transport ale Na+, K+, H+, apei,
glucozei sunt ns mult mai subtile la acest nivel, celulele renale
avand capacitatea de a orienta migrarea acestor compui pentru
asigurarea unui echilibru chimic, electric i de pH intre sange i
urina (Fig. 3.14). Orice dezechilibru genetic i metabolic la acest
nivel declanseaza boli ale rinichiului numite nefropatii i boli ale
sistemului cardiovascular (ex. hipertensiune).IMPORTANT 3.3.
Adeziunea celular 3.3.1. Asocierea celulelor n tesuturi i organe la
organismele pluricelulare Majoritatea celulele organismelor
pluricelulare (plante i animale) sunt organizate n structuri
cooperative numite esuturi, care la rndul lor se asociaz n diverse
combinaii n uniti funcionale de dimensiuni mari numite organe.
Frecvent, celule aparinnd unui anumit tip celular se agreg i
formeaz un esut, pentru a coopera n ndeplinirea unei funcii comune:
muchii se contract; esutul nervos conduce un impuls electric;
esutul xilem n plante transport ap. Diferite esuturi se pot
organiza ntr-un organ cu scopul realizrii unor funcii specifice. De
exemplu, muchii, valvele i vasele sangvine ale inimii funcioneaz
corelat pentru a pompa sngele prin organism (organul numit inima).
Funciile coordonate ale multor tipuri de celule din esuturi, ct i a
multiplelor esuturi specializate, permit organismului s: i)
funcioneze ca un tot unitar; ii) se mite; iii) metabolizeze hrana;
iv) se reproduc; v) desfoare alte activiti eseniale.
Diversitatea i complexitatea morfologic a plantelor i animalelor
sunt exemple ale faptului c organismul ca ntreg este mai important
dect suma prilor individuale. De exemplu, la plante, organizarea
rdcin tulpin - frunze le permite obinerea simultan de energie (de
la lumina solar) i carbon (din CO2), din aerul atmosferic, ap i din
nutrienii din sol. Proprietile mecanice distincte ale oaselor tari,
ncheieturilor flexibile, i ale muchilor contractili permit
vertebratelor s se mite eficient i s prezinte dimensiuni
substaniale. Straturi de celule epiteliale ataate foarte compact,
pot aciona ca bariere reglabile, cu permeabilitate selectiv, care
permit generarea unor compartimente distincte chimic i funcional n
structura unui organism (exemplu stomacul, circuitul sangvin). Din
acest motiv, ntr-un organism se pot desfura simultan funcii
complementare cum sunt digestia i sinteza. De asemenea,
compartimentalizarea permite o reglare mai sofisticat a diverselor
funcii biologice. n multe privine, rolul esuturilor complexe i al
organelor ntr-un organism, este analog cu cel al organitelor i al
membranelor ntr-o celul individual.
In concluzie, prin procesele de transport la nivel membranar
sunt asigurate urmatoarele functii majore: 1. Stabilirea si
mentinerea un gradient electrochimic transmembranar al anionilor si
cationilor cu importanta fiziologica (ex. Na+-K+ ATPaza); 2.
Generarea energiei prin cuplarea potentialului electrochimic
transmembranar cu sinteza ATP (ex. F1Fo-ATP sintetaza); 3.
Asigurarea izotonicitatii celulare cu cea a mediului extern prin
controlul distributiei apei si moleculelor osmotic active (ex.
difuzia simpla, difuzia facilitata); 4. Nutritia celulara prin
transportul unor molecule organice in interiorul celulei, molecule
care vor intra ulterior in ciclurile metabolice celulare (ex.
transportul glucozei); 5. Detoxificarea prin asigurarea unei
concentratii intracelulare scazute al unor compusi toxici de tipul
drogurilor, medicamentelor, metalelor grele si a metabolitilor ca
urmare a exportului lor in afara citoplasmei (ex. proteinele MDR,
V-ATPazele); 6. Secretia unor compusi de importanta fiziologica
pentru organism (ex proteinele ABC care transporta acizii biliari);
7. Semnalizarea intra- si intercelulara prin eliberarea unor
mesageri cu rol in medierea unor raspunsuri la stimuli externi (ex.
Ca2+-ATPaza din RE, proteinele-canal activate de voltaj de la
nivelul sinapselor neuronale si jonctiunilor neuromusculare,
etc)
