Trattamento di patologie umane in cui il farmaco è ... · Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie Terapia Genica Trattamento di patologie

Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

Terapia Genica

Trattamento di patologie umane in cui il farmaco è materiale genetico


Storia clinica della terapia genica

• E’ cominciata nel 1990 con trattamento ex vivo di pazientiaffetti da immunodeficienza combinata (SCID-ADA).

• Ad oggi, più di 300 protocolli clinici sono stati approvati, tutti su cellule somatiche.

• Più di 3000 pazienti sono stati trattati.• Ad oggi manca una chiara evidenza di efficacia terapeutica• Pochi studi sono in fase clinica II o III.

I vettori attuali non sono ancora adatti allo scopo


Caratteristiche del vettore ideale• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina

terapeutica (a livelli adeguati).• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o

post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno.• Amministrabile direttamente nel paziente.• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Ben tollerato.• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.• Facile da produrre in maniera riproducibile.

Sebbene il vettore ideale non esista, tutte queste caratteristiche sono presenti, individualmente, nei vari vettori oggi disponibili


Strategia generale perla costruzione di un vettore virale

• I genomi virali contengono sia geni che sequenze regolatorie che agiscono in cis

– sequenze responsabili della replicazione e della incapsidazione

• La maggior parte delle sequenze che agiscono in cis si trovano al di fuori dei geni virali

– si sfrutta questa segragazione per progettare vettori virali ricombinanti.

• I geni virali e le sequenze che agiscono in cissono separate su diverse molecole

– i prodotti dei geni virali agiscono in trans• i geni virali possono essere forniti in un virus

helper, in un plasmide o essere stabilmente integrati nel DNA della cellula “packaging”

– le sequenze “cis “ sono associate al gene terapeutico ed introdotte nella stessa cellula

• produzione di particelle trasducenti difettive nella replicazione


Ciclo vitale di un retrovirus• RNA genomico, 2 copie.• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in

DNA a doppio filamento nel citoplasma dellacellula infetta.

• (Il DNA è anche convertito in forma circolare, che però non sembra essere un intermedio della replicazione).

• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato èchiamato provirus.

• L’apparato della cellula ospite trascive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.

• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione


Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus

• Il genoma tipico contiene 3 “geni”– gene ⇒ regione codificante che dà origine

a più di una proteina• I tre geni sono

– gag (componenti del core nucleoproteico)– pol (replicazione e ricombinazione)– env (componente della membrana esterna)

• Per l’espressione di pol deve essere ignorato un codone di stop

– soppressione da parte di un glutamil-tRNA se la fase di lettura è la stessa di gag

– slittamento del ribosoma se la fase di lettura è diversa da gag

• ��L’efficienza del processo è del 5%– la quantità di gag prodotta è 20 volte

superiore a quella di pol


Vettori retrovirali

3 Componentiseparate

1U3 R U5 U3 R U5Gene terapeutico

U3 R U5 U3 R U5

Env

1

2 3Gag-Pol

Gag-Pol2

p

p Env3 Titoli di 107 unità

trasducenti (t.u.)/ml

p VSV-G3

oppure

Titoli di 1010 unitàtrasducenti (t.u.)/ml


Vettori Retrovirali: situazione attuale e prospettive future• Pro

– efficiente trasduzione ex vivo di cellule in attiva replicazione• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche

– notevole esperienza clinica ex vivo• efficace terapia genica di due bambini affetti da imunodeficienza

– integra garantendo espressione prolungata, ma a basso livello

• Contro– integrazione random

• attivazione di oncogeni• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione

– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)

• Sviluppi futuri: vettori lentivirali


Vettori lentivirali• I lentivirus hanno un genoma più complesso

– oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori.

• Originariamente derivati da HIV-1 per trasdurre linfociti– “pseudotipizzazione” con VSV-G espande il trofismo– vettori “pseudotipizzati” con VSV-G possono essere

somministrati direttamente in vivo• efficiente trasduzione di neuroni e cellule della glia del sistema nervoso

centrale di roditori e primati

• Vettori ibridi derivati da lentivirus non umani (SIV, FIV)– virus originale non infettivo per gli esseri umani

• la reale efficacia in vivo deve essere ancora dimostrata


Vettori lentivirali• Trasporto attivo del complesso di pre-integrazione

attraverso i pori nucleari– possibilità di trasdurre anche cellule quiescenti

• efficaci nel trasdurre cellule quiescenti ex vivo• trasduzione diretta in vivo potrebbe soffrire di alcune limitazioni

– barriere tissutali nel caso della mucosa resporatoria– condizione intracellulare (necessità di replicazione) nel caso degli epatociti

– devono ancora essere definiti il potenziale reale ed i limiti della trasduzione diretta in vivo mediata da vettori lentivirali

• Limite comune a vettori retro- e lentivirali– la fase a RNA obbligatoria nel ciclo vitale impone determinati

limiti nella cassetta di espressione, tra cui la mancanza di introni e di segnali di poliadenilazione.


Adenovirus• Capside icosaedrico

– formato da 3 proteine• esone, pentone e fibra

• Sono stati caratterizzati più di50 diversi sierotipi diadenovirus umani.

• Meccanismo di infezione:

– 1) legame del virus alla sua cellula bersaglio• interazione ad alta affinità tra il dominio “knob” della fibra ed il

recettore sulla superficie della cellula

– 2) internalizzazione• interazione tra il pentone di Adeno e le integrine αvβ3 e αvβ5 (per il

sierotipo 5) sulla superficie della cellula.


10

Struttura genomica edespressione genica degli Adenovirus

20 30 40 50 60 70 80 90 100ITR-ΨΨΨΨ

E1 MLP Geni “Late” (L1-L5)

E4

VA

E210 map units = 3.6 kb

ITR


E1

10

Struttura genomica dei vettori Adenovirali di prima generazione

20 30 40 50 60 70 80 90 100ITR-ΨΨΨΨ

TransgeneMLP Geni “late” (L1-L5)

E4

VA

E210 map units = 3.6 kb

ITR

E1

Cellule 293

ITR-ΨΨΨΨ

E3

Principalmentesierotipi 2 e 5


Vettori Adenovirali: vantaggi

• Sono ben conosciuti perchè studiati da molto tempo.• Non ci sono evidenze significative di integrazione. • Sono i vettori più efficienti, specialmente per cellule

quiescenti e per somministrazione diretta in vivo.• I vettori di prima generazione possono essere cresciuti

a titolo elevato in maniera relativamente semplice e riproducibile.


Caratteristiche negative dei vettori Adenovirali di prima generazione

I gene a valle di E1 vengono espressi a basso livello, causando:• lisi immuno-mediate delle cellule trasdotte

– espressione del transgene terapeutico di breve durata

• tossicità dopo somministrazione sistemica:– imfiammazione e necrosi epatica– danno endoteliale

ITR-ΨΨΨΨ

TransgeneE1 MLP Geni “Late” (L1-L5)

E4

VA

E2

ITRE3


Caratteristiche negative dei vettori Adenovirali di seconda generazione

ITR-ΨΨΨΨ

TransgeneE1 MLP Late genes (L1-L5)

E4

VA

E2

ITRE3

I gene a valle di E1 vengono espressi a basso livello, causando:• lisi immuno-mediate delle cellule trasdotte

– espressione del transgene terapeutico di breve durata

• tossicità dopo somministrazione sistemica:– imfiammazione e necrosi epatica;– danno endoteliale;– tossicità acuta dose-dipendente (letale per un paziente mancante di OTC)


293

Helper

ΨΨΨΨ Vettori Adenovirali dipendentida helper (Helper-Dependent: HD)

ITR ITRtransgeneΨΨΨΨ


loxP

Helper

293 Cre

ΨΨΨΨ Vettori Adenovirali dipendentida helper (Helper-Dependent: HD)

ITR ITRtransgeneΨΨΨΨ

loxP


Espressione prolungata del transgene dopo somministrazione con vettore dipendente da helper

4045

50

5560

65

7075

8085

Hem

atoc

rit

0 14 28 42 56 70

Days after virus injection

40

4550

5560

6570

75

8085

0 14 28 42 56 70Days after virus injection

3x105

1x106

3x107

1x107

3x106

PBS

1st generation Helper-dependentVettore di

prima generazioneVettore dipendente da

virs helper (HD)

Em

atoc

rito

Giorni dopo l’iniezione Giorni dopo l’iniezione


Espressione prolungata del transgene dopo somministrazione con vettore dipendente da helper

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

Hem

atoc

rit

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250Days after virus injection

3 x 1051 x 106

7 x 107

3 x 107

1 x 107

3 x 106

PBS

225 365 575

Em

atoc

rito

Giorni dopo l’iniezione del vettore


Vettori Adenoviraliproblemi e prospettive future

• Immunogenicità del vettore– vettori di prima generazione: alta

• facilità di produzione

– vettori HD: bassa (dovuta alle proteine del capside)• produzione tecnicamente complessa e poco riproducibile

• Immunità preesistente– prospettive: sierotipi alternativi

• Trofismo promiscuo– prospettive: modificazione del trofismo naturale

• re-direzionamento verso le cellule desiderate (“targeting”)


Immunità pre-esistente

Anticorpi neutralizzanti presenti nella popolazione possono diminuire l’efficacia della somministrazione del vettore

L’uso di sierotipi alternativi hapermesso la risomministrazionein modeli animali.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

25136

311847

211223142230

15, 171016291311

23, 27198

24, 25, 289, 20, 26, 32, 35

negative

Sier

otip

o

Percentuale di bambini tra 3 e 6 annicon anticorpi neutralizzanti controi vari sierotipi di Adenovirus


Virus Adeno Associati (AAV)

• Parvovirus, inizialmente scoperti come contaminanti di preparazioni di Adeno, richiedono la presenza di un virus helper (per esempio, Adenovirus) per l’infezione produttiva– ad oggi sono stati caratterizzati 6 sierotipi

• la maggior parte deli studi si è concentrata su AAV-2

• Ad oggi non sono stati associati a nessuna patologia– caratteristica ideale per derivare un vettore di terapia genica

• Il genoma del virus naturale integra preferenzialmente in un sito specifico del genoma umano (AAVS1 nel cromosoma 19 q13.3-qter)


Struttura genomica deiVirus Adeno Associati

Cap

ITRITR (145 nt)

Rep

Replicazione del DNAIntegrazione

Rescue

Proteine del capside:VP1, VP2, VP3

IntegrazioneIncapsidazioneRescue


Ciclo vitale dei Virus Adeno Associati

Integrazionesito-specifica

Fase di latenza

Ad

Rescue

Fase litica

Replicazione

Ad


Vettori AAV: struttura e produzione

• 1) Plasmide esprimente i geni rep e cap• 2) Adenovirus helperoppure• 2bis) Plasmide esprimente i geni di Adenovirus

con funzione helper

ITRITR (145 nt)

Promotore-Transgene (max 4.5 kb)


Vettori AAV:situazione attuale e prospettive future

• Pro– efficiente trasduzione in vivo di cellule sia quiescenti che in attiva

replicazione– espressione prolungata del transgene

• descritte sia forme episomali che integrate– bassa immunogenicità

• Contro– la massima capacità di impaccamento è 4,5 kb– con il sistema di produzione attuale si ottengono preparazioni a titolo

relativamente basso e contaminate da virus

• Sviluppi futuri:– miglioramento dei sistemi di produzione– aumento dell’efficienza di integrazione sito-specifica


Vettori non virali

• Il vettore è molto semplice: DNA– puro (“naked DNA”) – complessato con molecole che ne aumentano la penetrazione nelle cellule

• tipicamente lipidi cationici

• L’iniezione diretta di DNA nel muscolo induce espressione genica– prima evidenza ottenuta nel 1990

• Sviluppo di risposta immune dopo iniezione di DNA codificante antigeni eterologhi– prima evidenza ottenuta nel 1993


Vettori non-viralisituazione attuale e prospettive future• Pro

– teoricamente, non ci sono limiti alla taglia del trasgene– facili da produrre– buona efficienza di trasduzione ex vivo– non ci sono evidenze significative di integrazione

• Contro– bassa efficienza di trasduzione in vivo– espressione del trasgene transiente

• Sviluppi futuri– miglioramento dell’efficienza di trasduzione– aumento della durata dell’espressione


Terapia Genicasituazione attuale e prospettive future

• Sperimentazione clinica iniziata nel 1990– eccessivo ottimismo

• Valutazione generale da parte del NIH nel 1995– LA TERAPIA GENICA NON FUNZIONA

• il potenziale terapeutico con i mezzi allora a disposizione era stato sovrastimato;

• le basi scientifiche nel settore non erano sufficientemente solide;• occorreva lavorare molto sulla costruzione di nuovi vettori, sulla efficienza

della loro somministrazione e sulla regolazione dell’espressione del transgene

• 1995-2002: generazione e ottimizzazione di vettori di TG– prime evidenze (anche se preliminari) di efficacia terapeutica per la

emofilia B (vettori AAV) e per la X-SCID (vettori retrovirali)

• Prospettive future– il continuo miglioramento dei vettori disponibili si tradurrà in un aumento

dei successi in campo clinico

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